Способ создания удвоенных гаплоидов кабачка Cucurbita pepo L. в культуре изолированных семязачатков Российский патент 2024 года по МПК A01H4/00 

Заявляемое изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, представляет собой способ производства удвоенных гаплоидов кабачка Cucurbita реро L. путем гиногенеза в культуре изолированных семязачатков.

Известны способы создания удвоенных гаплоидов кабачка путем гиногенеза в культуре изолированных семязачатков, однако они обладают невысокой эффективностью (Genetic Manipulation in Plant Breeding, 1986, pp.295-298, DOI: 10.1515/9783110871944-048, Plant cell, tissue and organ culture, 1998, 52, pp.117-121, DOI: - нет, Scientia horticulturae, 2007, 115, pp.1-6, DOI: 10.1016/j.scienta.2007.07.008, Vegetable crops of Russia, 2022, 5, pp.5-14, DOI: 0.18619/2072-9146-2022-5-5-14). Частота формирования гиногенных семязачатков варьируется от 12,5 до 48,8% у наиболее отзывчивых образцов в зависимости от способа создания удвоенных гаплоидов кабачка. Один из лучших результатов морфогенетической индукции семязачатков кабачка показан у Vegetable crops of Russia, 2022, 5, pp.5-14, DOI: 0.18619/2072-9146-2022-5-5-14, согласно которым процент сформированных эмбриоидов у наиболее отзывчивого образца в среднем достигал 55.

Наиболее близкой по методике к заявляемому решению является технология производства удвоенных гаплоидов тыквы Vegetable crops of Russia, 2011, 10, pp.28-31, DOI: 10.18619/2072-9146-2011-1-28-31. Сбор завязей осуществляют за 1-2 суток до цветения. Стерилизацию проводят в 0,1%-ном растворе сулемы в течение 10 мин. с последующим многократным промыванием в стерильной дистиллированной воде. Изолированные семязачатки инокулируют на твердую индукционную питательную среду СВМ (Gemes Juhasz et al., 2002), содержащую 50 г/л сахарозы, 0,2 мг/л тидиазурона, 0,0001 мкМ эпибрассинолида, или 2 мг/л 2,4-D, 7 г/л агара. Инкубирование проводят при температуре 25°С, фотопериоде 16 ч - день, 8 ч - ночь. Проростки пересаживают на регенерационную питательную среду MS (Murashige Т., Skoog F., 1962), содержащую 3 г/л фитагеля. Максимальное количество полученных эмбриоидов составляет 9 шт. /завязь.

Заявляемое изобретение направлено на решение проблемы низкой частоты эмбриогенеза в культуре изолированных семязачатков кабачка Cucurbita реро L.

Технический результат предлагаемого изобретения - повышение частоты эмбриогенеза до 98% в культуре изолированных семязачатков кабачка Cucurbita реро L.

Для достижения заявленного результата завязи стерилизуют в 2%-ном растворе гипохлорита натрия NaOCl в течение 10 минут. Изолированные семязачатки инокулируют на питательную среду СВМ, содержащую 50 г/л сахарозы, 2 мг/л 2,4-D и 3 г/л фитагеля, по 10 шт. на чашку Петри диаметром 90 мм, культивируют в темноте при температуре 33°С в течение 7 суток, затем переносят в климатическую камеру и культивируют при температуре 24°С, 16-часовом фотопериоде. Через 14 суток осуществляют пересадку эмбриоидов на регенерационную питательную среду MS, содержащую 30г/л сахарозы, 3 г/л фитагеля. Пересадку на свежую питательную среду осуществляют каждые 28 суток до образования проростков. За счет соблюдения условий культивирования и обработок частота образования эмбриоидов повышается до 98%.

Существенными признаками, характеризующими изобретение, являются: поверхностная стерилизация завязей в 2%-ном растворе гипохлорита натрия NaOCl в течение 10 минут, низкая плотность размещения инкубируемых семязачатков (10 штук на чашку Петри диаметром 90 мм), наличие увеличенной продолжительности температурной обработки при температуре 33°С в течение 7 суток в темноте, использование фитагеля (3 г/л) в качестве желирующего компонента при культивировании изолированных семязачатков кабачка на индукционной питательной среде, ограниченный период инкубирования семязачатков на индукционной питательной среде (2 недели) с последующей пересадкой на регенерационную питательную среду, пересадка на свежую питательную среду каждые 28 суток.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления способа

Пример 1

Отбор завязей 3 образцов кабачка осуществляли за 1 сутки до цветения в фазе ярко-окрашенного венчика. С завязей удаляли околоцветник и промывали под проточной водой. Поверхностную стерилизацию завязей проводили в растворе гипохлорита натрия (NaOCl) (2%) с добавлением 1-2 капель Tween 20 в течение 10 мин с последующим трехкратным промыванием в стерильной дистиллированной воде в течение 1, 5, 10 мин. Семязачатки изолировали с использованием стереомикроскопа и инокулировали на твердую индукционную питательную среду СВМ, содержащую 50 г/л сахарозы, 2 мг/л 2,4-D и 3 г/л фитагеля, рН среды 5,8 до автоклавирования, по 10 штук на чашку Петри диаметром 90 мм. Экспланты инкубировали при температуре 33°С в темноте в течение 7 суток, затем переносили в климатическую комнату и культивировали при температуре 24°С, 16-часовом фотопериоде. Через 14 суток экспланты переносили на регенерационную питательную среду MS, содержащую 30 г/л сахарозы и 3 г/л фитагеля, рН среды 5,8 до автоклавирования. Поверхностная стерилизация с использованием 2%-го раствора гипохлорита натрия (NaOCl) в течение 10 минут, низкая плотность размещения инкубируемых семязачатков (10 штук на чашку Петри диаметром 90 мм), увеличенная продолжительность температурной предобработки 33°С в течение 7 суток, использование 3 г/л фитагеля в качестве желирующего агента, ограниченная продолжительность инкубации семязачатков на индукционной питательной среде - 14 суток - с последующей пересадкой на регенерационную питательную среду MS, пересадка на свежую питательную среду каждые 28 суток позволяет повысить частоту образования эмбриоидов в культуре изолированных семязачатков до 98%.

Описанным выше способом была увеличена частота эмбриогенеза у следующих образцов кабачка: Z1, Z2, Z3.

В таблице 1 представлена средняя частота эмбриогенеза 3 образцов кабачка Cucurbita реро L.: Z1, Z2, Z3: 1 вариант - среднее число эмбриоидов, сформированных из 10 семязачатков, культивируемых в чашке Петри диаметром 90 мм на индукционной питательной среде СВМ, содержащей 50 г/л сахарозы, 2 мг/л 2,4-D и 3 г/л фитагеля, при температурной обработке 33°С в темноте в течение 7 суток с последующей пересадкой на регенерационную питательную среду MS через 14 суток; 2 вариант - среднее число эмбриоидов, сформированных из 10 семязачатков, культивируемых в чашке Петри диаметром 90 мм на индукционной питательной среде СВМ, содержащей 50 г/л сахарозы, 2 мг/л 2,4-D и 3 г/л фитагеля без температурной обработки 33°С в темноте в течение 7 суток с последующей пересадкой на регенерационную питательную среду MS через 14 суток.

Частота образования эмбриоидов достоверно различается при инкубировании семязачатков при температурной обработке 33°С в темноте в течение 7 суток (вариант 1) и без температурной обработки (вариант 2) у всех образцов на 5%-ном уровне значимости. Частота эмбриогенеза в варианте 1 существенно превзошла частоту образования эмбриоидов в варианте 2 для всех образцов. Средняя частота образования эмбриоидов образца Z1 составила 9,8 и 5,6 шт./ч.Петри, образца Z2 - 7,3 и 4,7 шт./ч.Петри, образца Z3 - 4 и 0,3 шт./ч.Петри с и без температурной обработки соответственно.

По сравнению с прототипом предложенный способ позволяет повысить частоту образования эмбриоидов до 98% в культуре изолированных семязачатков кабачка за счет стерилизации завязей в растворе гипохлорита натрия (NaOCl) (2%) в течение 10 минут, инкубирования изолированных семязачатков при плотности размещения 10 шт. на чашку Петри диаметром 90 мм на питательной среде СВМ, содержащей 3 г/л фитагеля, при температуре 33°С в темноте в течение 7 суток с последующей пересадкой на регенерационную питательную среду через 14 суток.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу увеличения частоты эмбриогенеза в культуре изолированных семязачатков кабачка Cucurbita pepo L. Изобретение позволяет эффективно увеличивать частоту эмбриогенеза в культуре изолированных семязачатков кабачка Cucurbita pepo L. 1 табл., 1 пр.

Способ увеличения частоты эмбриогенеза в культуре изолированных семязачатков кабачка Cucurbita pepo L., характеризующийся тем, что завязи стерилизуют в 2%-ном растворе гипохлорита натрия в течение 10 минут, изолированные семязачатки инкубируют при низкой плотности размещения в чашке Петри по 10 штук на чашку Петри диаметром 90 мм на индукционной питательной среде СВМ, содержащей 50 г/л сахарозы, 2 мг/л 2,4-D, 3 г/л фитагеля, при температуре 33°С в темноте в течение 7 суток, далее изолированные семязачатки культивируют в климатической комнате при температуре 24°С, 16-часовом фотопериоде 14 суток, после чего переносят на регенерационную питательную среду MS, содержащую 30 г/л сахарозы, 3 г/л фитагеля, и культивируют до образования гаплоидных эмбриоидов и проростков из неоплодотворенных яйцеклеток, пересадку на свежую питательную среду осуществляют каждые 28 суток.