Способ удвоения хромосомного набора гаплоидов рапса (Brassica napus L.) Российский патент 2023 года по МПК A01H1/08 A01H4/00 A01H6/20 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использовано для увеличения количества удвоенных гаплоидов, при их получении в культуре изолированных микроспор для создания родительских линий рапса.

Известные способы получения удвоенных гаплоидов в культуре изолированных микроспор у рапса (Doubled Haploid Production in Crop Plants, 2003, pp.185-193, DOI: 10.1007/978-94-017-1293-4 29, Biotechnology & Biotechnological Equipment, 1997, 11:3-4, pp.31-35, DOI: 10.1080/13102818.1997.10818949, Doubled Haploid Technology, 2021, vol. 2288, pp.129-144, https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1335-1_8). Для удвоения хромосомного набора гаплоидных растений исследователи используют колхицин в концентрации 0,05-0,3%, добавляя его в жидкую питательную среду, которой пропитывают вермикулит или заливают проростки на регенерационной питательной среде, с экспозицией 1-7 дней.

Наиболее близкой по технической сущности к заявляемому решению является технология удвоения гаплоидных растений рапса Doubled Haploid Production in Crop Plants, 2003, pp.185-193, DOI: 10.1007/978-94-017-1293-4_29. Удвоение хромосом проводят у развившихся из эмбриоидов проростков при появлении первого настоящего листа, стебля и корня. С регенерационной питательной среды проростки пересаживают в вермикулит, смоченный жидкой питательной средой В5 половинной концентрации с добавлением 0,05% колхицина и культивируют в световой комнате с 16-часовым фотопериодом при 22°С в течение 7 дней. Далее отмывают корни от вермикулита водой и переносят в почвенный субстрат для дальнейшего выращивания. Частота удвоения хромосомного набора у растений составила 50-70%.

Колхицин является веществом с острой токсичностью, вызывает гибель части проростков при удвоении хромосомного набора, и оказывает негативное влияние на здоровье исследователя, поэтому ведется поиск таких же эффективных, но более безопасных веществ для удвоения хромосомного набора.

Заявляемое изобретение направлено на решение проблемы удвоения хромосомного набора гаплоидов рапса, полученных в культуре изолированных микроспор.

Технический результат предлагаемого изобретения - увеличение частоты удвоенных гаплоидов рапса до 55-75% при снижении концентрации удваивающего хромосомный набор вещества до 0,01-0,05% и экспозиции до 2-3 дней.

Для решения указанной проблемы и достижения заявленного результата для удвоения хромосомного набора берут проростки из микроспорогенных эмбриоидов, имеющих 4-5 настоящих листьев, пересаживают их с регенерационной питательной среды в контейнеры с вермикулитом, смоченным жидкой питательной средой В5 с добавлением 0,01-0,05% амипрофосметила, где культивируют в климатической комнате 2-3 дня при температуре 23±2°С с 16-часовым фотопериодом. Затем обработанные проростки пересаживают в торфяной субстрат для дальнейшего выращивания.

Существенными признаками, характеризующими изобретение, является обработка проростков в стадии 4-5 листьев питательной средой В5 с добавлением 0,01-0,05% амипрофосметила длительностью 2-3 дня.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления способа.

Пример 1.

Проростки микроспорогенных эмбриоидов рапса F1 «Джаз» в стадии 4-5 настоящих листьев, пересаживали в нестерильный вермикулит, смоченный жидкой питательной средой В5, содержащей 0,01% амипрофосметила, и культивировали в климатической комнате с 16-часовым фотопериодом при температуре 23°С в течение 3 дней. Затем растения пересаживали в кассеты, заполненные торфяным субстратом. Через 30 дней проводили пересадку в горшки объемом 1 л. Частоту удвоения оценивали на 50-60 день после пересадки в субстрат на поточном цитометре Sysmex CyFlow Cube 8, в качестве красителя использовали DAPI (4', 6-диамидино-2-фенилиндол). Были проанализированы 60 растений, 45 из которых оказались диплоидными и впоследствии дали семенное потомство. 15 гаплоидов были стерильными, семена с таких растений не получены. Частота диплоидизации хромосомного набора при обработке амипрофосметилом составила 75% (таблица 1). В варианте опыта с обработкой проростков жидкой питательной средой В5 с добавлением колхицина в концентрации 0,01% и экспозиции 3 дня частота диплоидизации составила 19%.

Пример 2.

Проростки микроспорогенных эмбриоидов рапса F1 «Джаз» в стадии 4-5 настоящих листьев пересаживали в нестерильный вермикулит, смоченный жидкой питательной средой В5, содержащей 0,05% амипрофосметила, и культивировали в климатической комнате с 16-часовым фотопериодом при температуре 23°С в течение 2 дней. Затем растения пересаживали в кассеты, заполненные торфяным субстратом. Через 30 дней проводили пересадку в горшки объемом 1 л. Частоту удвоения оценивали на 50-60 день после пересадки в субстрат на поточном цитометре Sysmex CyFlow Cube 8, ядра окрашивали красителем DAPI (4', 6-диамидино-2-фенилиндол). Были проанализированы 33 растения, 18 из которых оказались диплоидными, 12 гаплоидными, 3 тетраплоидными. Частота диплоидизации составила 55% (таблица 1). В контрольном варианте без обработки амипрофосметилом частота удвоения хромосомного набора составила 23%.

По сравнению с прототипом использование амипрофосметила для удвоения хромосомного набора гаплоидных растений рапса позволяет получить сравнимую частоту удвоения хромосомного набора на уровне 55-75%, при меньшей концентрации действующего вещества и времени обработки проростков.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу увеличения частоты удвоенных гаплоидов рапса Brassica napus L. Изобретение позволяет эффективно увеличивать частоту удвоения гаплоидов рапса. 1 табл., 2 пр.

Способ увеличения частоты удвоенных гаплоидов рапса по сравнению с необработанным растением рапса, характеризующийся тем, что удвоение хромосомного набора проводят у проростков, полученных в культуре изолированных микроспор из микроспорогенных эмбриоидов, в стадии 4-5 настоящих листьев, пересаживая их в вермикулит, смоченный жидкой питательной средой В5 с добавлением 0,01-0,05% амипрофосметила, и культивируют в климатической комнате с 16-часовым фотопериодом при температуре 23°С в течение 2-3 дней, после чего пересаживают в торфяной субстрат для дальнейшего выращивания.