Способ получения удвоенных гаплоидов моркови в культуре изолированных микроспор in vitro Российский патент 2021 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использовано в ускорении селекционного процесса, в частности при получении гомозиготных растений моркови с целью их использования в качестве чистых линий для производства F₁-гибридов, может быть востребовано селекционными компаниями, образовательными учреждениями биотехнологического и сельскохозяйственного профиля.

Известны способы производства удвоенных гаплоидов моркови: культивирование неоплодотворенных семязачатков, культивирование пыльников, культивирование микроспор.

Методы производства удвоенных гаплоидов моркови в культуре неоплодотворенных семязачатков и в культуре пыльников являются технологически сложным из-за небольшого размера бутонов и пыльников. Но, несмотря на это, методы являются распространенными, и во многих публикациях именно их рекомендуют для производства удвоенных гаплоидов моркови (Acta Physiol Plant 31(6), 2009, P. 1139-1145. https://doi.org/10.1007/s11738-009-0332-l), (In Vitro Cell.Dev.Biol. -Plant 50, 2014, P. 376-383. DOI 10.1007/s11627-014-9597-1), (In Vitro Cell.Dev.Biol. -Plant 51(2), 2015, P. 135-142. https://doi.org/ 10.1007/s11627-015-9665-1), (Acta horticulturae 1153(1153), 2017, P. 55-60. DOI: 10.17660/ActaHortic.2017.1153.9). Основной недостаток этих методов - возможность регенерации растений не только из клеток микроспор, но и из соматических тканей пыльника или нуцеллуса. Полученные растения-регенеранты необходимо дифференцировать, разделять удвоенные гаплоиды и клоны исходного донорного растения.

Метод производства удвоенных гаплоидов моркови в культуре изолированных микроспор позволяет исключить неопределенность происхождения эмбриоидов, которые при культивировании пыльников могут развиваться как из микроспор, так и из соматических тканей.

В настоящее время описаны способы производства гаплоидных растения моркови, которые наиболее близки к нашей работе (J App1 Genet, 51(2), 2010, P. 141-147. https://doi.org/10.1007/BF03195722), (Plant Cell Tissue Organ Cult 112, 2013, P. 275-287. https://doi.org/10.1007/s11240-012-0235-5), (Монахос С.Г., Чистова A.B. Создание удвоенных гаплоидов моркови столовой (D. carota L.) в культуре изолированных микроспор: уч. -метод, пособие. М.: Грифон, 2017. - 32 с.).

Способ Plant Cell Tissue Organ Cult 112, 2013, P. 275-287. https://doi.org/10.1007/s11240-012-0235-5 включает в себя следующие действия: Посев семян моркови в июле, уборку корнеплодов в ноябре и хранение при 2…4°С в течение 4 месяцев. Посадку яровизировавшихся корнеплодов в пленочные тоннели в марте, сбор зонтиков для введения микроспор в культуру в апреле. Сбор зонтиков с определенным размером бутонов (максимум 0,8…1.4 мм длиной) и морфологией (плоское соцветие), соответствующих поздней одноядерной или ранней двуядерной стадии развития микроспор утром. Поверхностную стерилизацию бутонов в чайных ситечках 75% этанолом 30 секунд и 10% гипохлоритом натрия 15 минут, с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной водой. Раздавливание бутонов пестиком в жидкой среде В5, содержащей 13% сахарозы (рН=5.8). Фильтрование через нейлоновые фильтры с диаметром пор 50 мкм в 10-и мл пробирки. Трехкратную очистку суспензии микроспор путем центрифугирования при 1,000 rpm в течение 5 мин. с последующим удалением надосадочной жидкости, добавлением 8 мл свежей среды В5, ресуспензированием микроспор. После последнего центрифугирования и удаления надосадочной жидкости ресуспензирование микроспор в жидкой среде NLN, содержащей 0,1 мг/л 2, 4-D, 0,1 мг/л NAA, 13% сахарозы (рН=5.8). Доведение плотности суспензии микроспор до 1,5×10⁵…2,5×10⁵ микроспор на 1 мл среды. Культивирование суспензии микроспор по 3 мл в чашках Петри 60×15 мм с добавлением 50 мкл 1% активированного угля в темноте при температуре 33°С в течение 2 суток с последующим инкубированием в темноте при 25°С. Пересадку эмбриоидов семядольной стадии развития на питательную среду MS, содержащую 3% сахарозы и 6,5 г/л агара (рН=5.8) и культивирование при 25°С и 16-и часовом фотопериоде. Адаптация к условиям теплицы в горшках с вермикулитом.

Наиболее близким к изобретению по совокупности существенных признаков является способ (Монахос С.Г., Чистова А.В. Создание удвоенных гаплоидов моркови столовой (D. carota L.) в культуре изолированных микроспор: уч. -метод, пособие. М.: Грифон, 2017. - 32 с.), он включает в себя следующие действия: Посев семян моркови в поле в начале июня, уборку корнеплодов в октябре и хранение при 2…4°С в течение 3 месяцев. Посадку яровизировавшихся корнеплодов в отапливаемую теплицу в конце января, сбор зонтиков для введения микроспор в культуру в апреле. Сбор зонтиков определенного размера (диаметром 4,5…5,5 см) и морфологии (плоское или слегка вогнутое соцветие, крайние зонтички которого выдвигаются в стороны), соответствующих тетрадам или поздней одноядерной стадии развития микроспор утром. Поверхностную стерилизацию зонтичков в чайных ситечках 2% гипохлоритом натрия с добавлением трех капель Tween 20 в течение 10 минут, с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной водой. Раздавливание зонтичков пестиком в открытом чайном ситечке с периодическим омыванием жидкой средой В5, содержащей 13% сахарозы и 5% маннитола (рН 5,8). Фильтрование через нейлоновые фильтры с диаметром пор 41 мкм в 15-и мл пробирки. Трехкратную очистку суспензии микроспор путем центрифугирования при 800 rpm в течение 4 мин. с последующим удалением надосадочной жидкости, доведением объема до 10 мл свежей средой того же состава, ресуспензированием микроспор. После последнего центрифугирования и удаления надосадочной жидкости - ресуспензирование микроспор в жидкой среде NLN, содержащей 0,1 мг/л 2, 4-D, 0,1 мг/л NAA, 13% сахарозы (рН 5,8). Доведение плотности суспензии микроспор до 4×10⁴ микроспор на 1 мл среды. Культивирование суспензии микроспор по 3 мл в чашках Петри 60×15 мм с добавлением 100 мкл 1% активированного угля в темноте при температуре 32°С в течение 2 суток с последующим инкубированием в темноте при 24°С. Пересадку эмбриоидоподобных структур на питательную среду В5 без регуляторов роста, содержащую 20 г/л сахарозы. Адаптацию полученных растений к условиям теплицы в кассетах с торфом.

Основной недостаток известных способов: недостаточно высокий выход растений-регенерантов, высокая доля гаплоидных растений среди регенерантов.

Из анализа известных аналогичных решений выявлено, что технической проблемой в области селекции является необходимость расширения арсенала средств, для ускорения селекции и массового получения гомозиготных растений.

Технический результат предлагаемого изобретения - ускорение селекционного процесса при создании F₁-гибридов за счет повышения вероятности удвоения числа хромосом и частоты эмбриогенеза в культуре изолированных микроспор моркови.

Для решения указанной проблемы и достижения заявленного результата в способе получения удвоенных гаплоидов моркови в культуре изолированных микроспор in vitro, включающем изолирование микроспор, культивирование их на питательной среде. При этом изолирование микроспор ведут путем измельчения поверхностно стерилизованных в 2% гипохлорите натрия с добавлением Твин 20 в течение 15 минут и трехкратно промытых в стерильной дистиллированной воде зонтичков пестиком в открытом чайном ситечке с периодическим омыванием жидкой средой В5 с добавлением 130 г/л сахарозы и дополнительным включением 75 г/л маннитола (рН 5,9), оптимизируют плотность полученной суспензии до 5×10⁴ микроспор/мл и культивируют на питательной среде NLN с добавлением 130 г/л сахарозы, 0,2 мг/л 2,4-D, 0,2 мг/л NAA, 200 мг/л активированного угля и 400 мг/л гидролизата казеина (рН 5,8) при температуре 33°С в течение 5 суток с последующим культивированием при 25°С в темноте до формирования эмбриоидов.

Существенными признаками, характеризующими изобретение являются: Поверхностная стерилизация зонтичков, а не бутонов, ускоряет введение отобранного растительного материала в культуру in vitro, что снижает негативное влияние на экспланты. Увеличение продолжительности поверхностной стерилизации до 15 минут снижает риск контаминации. Добавление повышенной концентрации маннитола в питательную среду для выделения микроспор способствует удвоению числа хромосом (Journal of Experimental Botany, 52(359), 2001, P. 1227-1238, https://doi.org/10.1093/jxb/52.359.1227) и исключает необходимость использования более токсичных антимитотических агентов. Оптимизированная плотность суспензии микроспор, оптимизированный и дополненный гидролизатом казеина состав состав питательной среды для культивирования микроспор и режим высокотемпературной обработки позволяют индуцировать большее число микроспор к эмбриогенезу и производить большее количество эмбриоидов.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления способ. Примеры конкретного выполнения способа.

Предложенный способ был опробован на 5 гибридах моркови. Опыты проводились в условиях ООО «Селекционная станция им. Н.Н. Тимофеева» г. Москва.

Способ получения удвоенных гаплоидов моркови в культуре изолированных микроспор in vitro, включал: Посев семян моркови в поле в начале июня, уборку корнеплодов в октябре и хранение при 2…4°С в течение 3 месяцев. Посадку яровизировавшихся корнеплодов в отапливаемую теплицу в конце января, сбор зонтиков для введения микроспор в культуру в апреле. Сбор зонтиков определенного размера (диаметром 4,5…5,5 см) и морфологии (плоское или слегка вогнутое соцветие, крайние зонтички которого выдвигаются в стороны), соответствующих тетрадам или поздней одноядерной стадии развития микроспор утром. Поверхностную стерилизацию зонтичков в чайных ситечках 2% гипохлоритом натрия и добавлением Твин 20 из расчета 1 капля на 100 мл стерилизующего раствора в течение 15 минут, с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной водой. Раздавливание зонтичков пестиком в открытом чайном ситечке с периодическим омыванием жидкой средой В5, содержащей 13% сахарозы и 7,5% маннитола (рН 5,9). Фильтрование через нейлоновые фильтры с диаметром пор 41 мкм в 15-и мл пробирки. Трехкратную очистку суспензии микроспор путем центрифугирования при 800 rpm в течение 8 мин. с последующим удалением надосадочной жидкости, доведением объема до 10 мл свежей средой того же состава, ресуспензированием микроспор. После последнего центрифугирования и удаления надосадочной жидкости - ресуспензирование микроспор в жидкой среде NLN, содержащей 0,2 мг/л 2, 4-D, 0,2 мг/л NAA, 13% сахарозы и 400 мг/л гидролизата казеина (рН 5,8). Доведение плотности суспензии микроспор до 5×10⁴ микроспор на 1 мл среды. Культивирование суспензии микроспор по 10 мл в чашках Петри 90×15 мм с добавлением 200 мкл 1% активированного угля в темноте при температуре 33°С в течение 5 суток с последующим инкубированием в темноте при 25°С. Пересадку эмбриоидоподобных структур на питательную среду В5 без регуляторов роста, содержащую 20 г/л сахарозы. Адаптацию полученных растений к условиям теплицы в кассетах с торфом.

Эффективность регенерации растений оказалась высокой и составила от 4 до 49 растений в пересчете на одно соцветие (табл. 1). При этом спонтанное удвоение хромосом произошло у 100% полученных растений-регенерантов.

По сравнению с прототипом предложенный способ позволяет увеличить выход удвоенных гаплоидов в культуре изолированных микроспор и ускорить селекционный процесс при создании F1-гибридов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения удвоенных гаплоидов моркови в культуре изолированных микроспор in vitro. В способе, предусматривающем изолирование микроспор, культивирование их на питательной среде, поверхностную стерилизацию зонтичков проводят в 2% гипохлорите натрия с добавлением Твин 20 в течение 15 минут с последующим трехкратным промыванием в стерильной воде, изолирование микроспор ведут путем измельчения зонтичков в жидкой питательной среде В5 с добавлением 130 г/л сахарозы и дополнительным включением 75 г/л маннитола, оптимизируют плотность полученной суспензии до 5×10⁴ микроспор/мл и культивируют на питательной среде NLN с добавлением 130 г/л сахарозы, 0,2 мг/л 2,4-D, 0,2 мг/л NAA, 200 мг/л активированного угля и 400 мг/л гидролизата казеина при температуре 33°С в течение 5 суток с последующим культивированием при 25°С в темноте до формирования эмбриоидов. Изобретение позволяет увеличить выход удвоенных гаплоидов в культуре изолированных микроспор. 1 табл.

Способ получения удвоенных гаплоидов моркови в культуре изолированных микроспор in vitro, включающий изолирование микроспор, культивирование их на питательной среде, отличающийся тем, что изолирование микроспор ведут путем поверхностной стерилизации зонтичков в 2% гипохлорите натрия с добавлением Твин 20 в течение 15 минут с последующим трехкратным промыванием в стерильной воде, измельчением в жидкой питательной среде В5 с добавлением 130 г/л сахарозы и дополнительным включением 75 г/л маннитола, оптимизации плотности полученной суспензии до 5×10⁴ микроспор/мл и культивирования на питательной среде NLN с добавлением 130 г/л сахарозы, 0,2 мг/л 2,4-D, 0,2 мг/л NAA, 200 мг/л активированного угля и 400 мг/л гидролизата казеина при температуре 33°С в течение 5 суток с последующим культивированием при 25°С в темноте до формирования эмбриоидов.