Способ изоляции микроспор для получения удвоенных гаплоидов семейства Brassicaceae в культуре микроспор in vitro Российский патент 2023 года по МПК C12N15/82 

Изобретение относится к области получения удвоенных гаплоидов в культуре изолированных микроспор in vitro для семейства Brassicaceae.

Семейство Капустные (Brassicaceae) представлено перекрестно опыляемыми культурами. Традиционно сорта создаются с помощью скрещивания чистых линий, полученных путем длительного инбридинга. Для ускорения селекционного процесса в настоящее время применяются биотехнологические методы. Получение удвоенных гаплоидов (DH-растений) в культуре микроспор in vitro является передовой технологией создания выровненного материала для селекции и генетических исследований. Особенно этот метод актуален для перекрестноопыляемых сельскохозяйственных культур, ввиду сокращения временных (с 8-10 лет до одного года) и экономических затрат в несколько раз по сравнению с традиционными методами селекции [Ferrie, Möllers, 2011; Forster, Thomas, 2005].

На данный момент клеточная технология получения удвоенных гаплоидов в культуре микроспор in vitro разработана [Dunwell, 2010; Lichter, 1982; Pechan, Keller, 1988] и активно применяется в селекционных программах многих культурных растений, но для ряда культур она не разработана или имеет низкую эффективность, которая не позволяет применять технологию в промышленном масштабе.

Протокол получения удвоенных гаплоидов в культуре микроспор in vitro состоит из большого числа этапов, каждый из которых имеет большое влияние на конечный результат [Ferrie, Caswell, 2011; Maluszynski и др., 2003; Touraev, Brian P., Jain, 2009]. Одним из таких этапов является пробоподготовка.

На эмбриогенность культуры клеток значительное влияние оказывают: стадия развития микроспор, степень их отзывчивости к эмбриогенезу, чистота препарата и др. [Pechan, Keller, 1988]. В процессе культивирования, микроспоры не перешедшие на эмбриогенный путь развития погибают и выделяют токсины, препятствуя развитию живых микроспор в эмбриоиды [Chun, Park, Na, 2011]. Также помимо погибших микроспор, загрязняющими и токсичными агентами являются любые другие органические элементы, попадающие в препарат при пробоподготовке. Перед пробоподготовкой проводится рекогносцировочный анализ стадии развития микроспор в зависимости от длины бутона. Для ряда культур диапазон линейной длины бутонов с подходящими стадиями развития микроспор варьируется в пределах 1 мм [Bhatia и др., 2018], когда как для других культур диапазон может сужаться до 0.3 мм [Kozar, Domblides, 2021a] что технически осложняет этап отбора бутонов, особенно учитывая тот фак, что в процессе роста и развития растения этот линейный диапазон может меняться.

В стандартных протоколах получения удвоенных гаплоидов в культуре микроспор in vitro изоляция микроспор происходит с помощью разбивки бутонов, погруженных в питательную среду: в бюксах с магнитами на магнитной мешалке[Kozar, Domblides, 2021b]; путем сжатия бутонов поворотным движением в пробирках с помощью поршня (шприца) [Corral-Martínez и др., 2021]; путем растирания бутонов пестиком в ступке [Chun, Park, Na, 2011]; путем раздавливания бутонов стеклянной палочкой в пробирке [Shmykova и др., 2021] или путем измельчения бутонов в блендере [Babbar и др., 2004].

Все из перечисленных видов изоляции микроспор основаны на полном механическом разрушении тканей бутонов и пыльников с дальнейшей фильтрацией. Такая изоляция микроспор подходит для культур семейства Brassicaceae, которые имеют высокую отзывчивость к эмбриогенезу, что подразумевает низкую концентрацию погибших микроспор в культуре, и соответственно, низкую концентрацию токсинов в культуре по сравнению с культурами, где значительная часть микроспор погибает при культивировании. С другой стороны, высокий потенциал отзывчивости микроспор в целом снижает чувствительность метода к различным факторам, в том числе и к чистоте препарата. Поэтому для хорошо отзывчивых к эмбриогенезу генотипов метод изоляции микроспор играет не значительную роль, когда как для мало отзывчивых культур метод изоляции оказывает существенное влияние.

Нами предлагается новый метод изоляции микроспор, который заключается в индивидуальном препарировании бутонов поперечным разрезом скальпеля, после чего половинки бутонов погружают в стерильные пробирки с питательной средой и взбалтывают на ротационном шейкере в течение 10-60 секунд, в зависимости от генотипа и культуры (подбирается эмпирически). При таком методе изоляции микроспор минимизируется механическое воздействие на ткани бутонов, что препятствует разрушению соматических клеток и тканей и попаданию их элементов в препарат, соответственно повышается чистота препарата. Помимо уменьшения механического воздействия на ткани бутонов показано, что поскольку пыльники при таком способе изоляции не измельчаются, а разрезаются пополам, ткани не разрушенного пыльника играют роль «сита» и выход в питательную среду тетрад и крупной зрелой пыльцы ограничен, что позволяет увеличить относительную концентрацию эмбриогенных стадий развития микроспор в препарате. Помимо этого, «сито» из структур пыльника позволяет пролонгировать диапазон подходящих линейных размеров бутонов, что для некоторых культур является критическим фактором результативности технологии. В совокупности эти факторы позволяют увеличить эффективность технологии получения удвоенных гаплоидов в культуре микроспор in vitro, а для ряда генотипов, где использование стандартного протокола не приводило к положительному результату, такой способ выделения микроспор позволяет получить первые эмбриоиды.

Таблицы №1-4 Влияние метода выделения микроспор на выход эмбриоидов для культуры микроспор in vitro у различных культур семейства Brassicaceae. Стандартный метод - метод выделения с помощью разбивки бутонов, погруженных в питательную среду в бюксах с магнитами на магнитной мешалке; новый метод - метод выделения с помощью индивидуального препарирования бутонов поперечным разрезом скальпеля и взбалтывания разрезанных бутонов на ротационном шейкере в питательной среде.

Таблица №1 рапс яровой сорт «Ратник» р-р бутонов, мм Стандартный метод эмбриоидов, шт Новый метод эмбриоидов, шт 2.5-3.0 0 378±7,2 3.1-3.6 295±34 522,7±67,1 3.7-4.2 0 37,3±15,0

F_теор. =4,7; F_факт. =209,5; F_теор. < F_факт. (Р_0,05 =5,8*10^-9)

Таблица №2 капуста краснокочанная с/о №428 р-р бутонов, мм Стандартный метод Новый метод эмбриоидов, шт эмбриоидов, шт 3.6-3.9 0 11±1,5 4.0-4.5 0 16±1,4 4.6-5.0 0 0

F_теор. =6; F_факт. =312; F_теор. < F_факт. (Р_0,05 =2,1*10^-6)

Таблица №3 капуста белокочанная сорт «Парус» р-р бутонов, мм Стандартный метод Новый метод эмбриоидов, шт эмбриоидов, шт 4.0-4.4 2,3±0,7 5,7±2 4.5-4.9 7±2,6 10±3,5 5.0-5.4 8,7±0,6 23±2 5.5-5.9 0 2±1

F_теор. =4,5; F_факт. =53; F_теор. < F_факт. (Р_0,05 =1,8*10^-6)

Таблица №4 горчица сарептская сорт «Сударушка» р-р бутонов, мм Стандартный метод Новый метод эмбриоидов, шт эмбриоидов, шт 2.5-2.8 6,3±2,8 16±4,5 2.9-3.2 15,7±6,4 22,7±6,2 3.3-3.6 1,7±0,57 11,3±3,5

F_теор. =4,5; F_факт. =13; F_теор. < F_факт. (Р_0,05 =2,1*10^-3)

Список литературы

1. Shmykova N. и др. Haploid embryogenesis in isolated microspore culture of carrots (Daucus carota l.) // Life. 2021. Т. 11. № 1. С. 1–17.

2. Dunwell J. M. Haploids in flowering plants: Origins and exploitation // Plant Biotechnol. J. 2010. Т. 8. № 4. С. 377–424.

3. Chun C., Park H., Na H. Microspore-derived embryo formation in radish (Raphanus sativus L.) according to nutritional and environmental conditions // Hortic. Environ. Biotechnol. 2011. Т. 52. № 5. С. 530–535.

4. Babbar S. B. и др. Isolated microspore culture of Brassica: An experimental tool for developmental studies and crop improvement // Indian J. Biotechnol. 2004. Т. 3. № 2. С. 185–202.

5. Bhatia R. и др. Modification of important factors for efficient microspore embryogenesis and doubled haploid production in field grown white cabbage (Brassica oleracea var. capitata L.) genotypes in India // Sci. Hortic. (Amsterdam). 2018. Т. 233. № October 2017. С. 178–187.

6. Corral-Martínez P. и др. Doubled Haploid Production in High- and Low-Response Genotypes of Rapeseed (Brassica napus) Through Isolated Microspore Culture. , 2021. С. 129–144.

7. Ferrie A. M. R., Caswell K. L. Isolated microspore culture techniques and recent progress for haploid and doubled haploid plant production // Plant Cell. Tissue Organ Cult. 2011. Т. 104. № 3. С. 301–309.

8. Ferrie A. M. R., Möllers C. Haploids and doubled haploids in Brassica spp. for genetic and genomic research // Plant Cell. Tissue Organ Cult. 2011. Т. 104. № 3. С. 375–386.

9. Forster B. P., Thomas W. T. B. Doubled haploids in genetics and plant breeding // Plant Breed Rev. 2005. Т. 25. № 57–88.

10. Kozar E., Domblides E. Protocol of European Radish (Raphanus sativus L.) Microspore Culture for Doubled Haploid Plant Production // When the Menorah Fades. , 2021a. С. 217–232.

11. Kozar E., Domblides E. Protocol of European Radish (Raphanus sativus L.) Microspore Culture for Doubled Haploid Plant Production BT - Doubled Haploid Technology: Volume 2: Hot Topics, Apiaceae, Brassicaceae, Solanaceae / под ред. J. M. Segui-Simarro. New York, NY: Springer US, 2021b. С. 217–232.

12. Lichter R. Induction of Haploid Plants From Isolated Pollen of Brassica napus // Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 1982. Т. 105. № 5. С. 427–434.

13. Maluszynski M. и др. Doubled haploid production in crop plants: a manual. : Springer Science & Business Media, 2003.

14. Pechan P. M., Keller W. A. Identification of potentially embryogenic microspores in Brassica napus // Physiol. Plant. 1988. Т. 74. № 2. С. 377–384.

15. Touraev A., Brian P. F., Jain S. M. Advances in Haploid Production in Higher Plants / под ред. B. P. Alisher Touraev, S. Mohan Jain, Forster. : Springer, 2009.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ изоляции микроспор для получения удвоенных гаплоидов семейства Brassicaceae в культуре микроспор in vitro, заключающийся в индивидуальном препарировании бутонов поперечным разрезом скальпеля, последующем погружении половинок бутонов в стерильные пробирки с питательной средой и взбалтывании на ротационном шейкере в течение 10-60 секунд. Изобретение позволяет минимизировать механическое воздействие на ткани бутонов. 4 табл.

Способ изоляции микроспор для получения удвоенных гаплоидов семейства Brassicaceae в культуре микроспор in vitro, заключающийся в индивидуальном препарировании бутонов поперечным разрезом скальпеля, последующем погружении половинок бутонов в стерильные пробирки с питательной средой и взбалтывании на ротационном шейкере в течение 10-60 секунд.