АВТОМАТИЗИРОВАННАЯ РЕАКТОРНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ СИНТЕЗА С КОНТУРОМ РЕЦИРКУЛЯЦИИ Российский патент 2022 года по МПК C07K1/04 C07K1/06 C12M1/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к автоматизированной системе реакторов для проведения твердофазного пептидного синтеза, и более конкретно, к синтезатору пептидов в твердой фазе, автоматизированному посредством реактора с контуром рециркуляции жидкости, позволяющим проводить в реальном времени измерение химических веществ в реакторе посредством измерительных ячеек.

Пептиды представляют собой цепи связанных аминокислот, являющиеся базовыми элементами для большинства живых организмов. Следовательно, исследование пептидов и белков и возможность синтеза пептидов и белков представляют собой большой интерес в биологических науках и медицины.

Твердофазный пептидный синтез возник в 1963 г., когда Р.Б. Меррифилд опубликовал статью о синтезе последовательности, состоящей из четырех аминокислот, с использованием твердофазного способа (RB MERRIFIELD, Solid Phase Peptide Synthesis I, the synthesis of a tetrapeptide, J. Am. Chem. Soc. 1963, 85 (14), pp. 2149-2154).

Со времени его введения в 1963 г. Меррифилдом твердофазный синтез значительно уменьшил ограничения пептидного синтеза, известные для гомогенной фазы. Меррифилд выдвинул идею комбинирования методологии с использованием активированных сложных эфиров вместе с заякориванием первой аминокислоты на нерастворимой полимерной матрице. Этот новый режим синтеза, таким образом, позволил избегать нежелательных реакций, поскольку при иммобилизации одного из партнеров на твердой фазе, одна единственная сторона аминокислоты является доступной для присоединения. Другим преимуществом иммобилизации аминокислоты на нерастворимом полимере является то, что это позволяет использовать избыток реагента в растворе. Избыток реагента больше не рассматривается как примесь для конечного продукта и позволяет достигать близкой к 100% эффективности присоединения. Преимуществом, определенно в самой большой степени следующим из твердофазного синтеза, является то, что исключены все стадии очистки между каждыми присоединениями, поскольку желательный продукт остается прикрепленным к нерастворимому полимеру вплоть до получения желательного пептида. Затем пептид отделяют от полимера посредством химического отщепления. Прогресс, достигнутый в твердофазной пептидной химии, внес вклад в разработку многочисленных твердых подложек, а также в разработку новых химических составов для активации и защиты аминокислот. В настоящее время используют две главных стратегии для твердофазного пептидного синтеза. Эти две стратегии основаны на использовании двух типов так называемой ортогональной временной защиты, Fmoc/Boc, для защиты функциональной аминогруппы. Основное различие между двумя типами защитных групп связано с режимом снятия защиты. Снятия защиты группы Fmoc достигают в основной среде, в то время как снятия защиты группы Boc достигают в кислой среде. В настоящее время наиболее широко используют стратегию Fmoc/tBu, поскольку при конечном отщеплении пептида от твердой подложки используют концентрированную TFA (трифторуксусную кислоту), в то время как стратегия Boc/Bnl требует использования концентрированной фтористоводородной кислоты, которая является намного более опасной и сложной в обращении. Хотя снятие этих двух типов защиты осуществляют в соответствии с двумя различными протоколами, протокол, используемый для присоединения различных аминокислот, является сходным. Поэтому твердофазный пептидный синтез состоит из последовательности присоединений и снятий защиты до получения желательного пептида, который будет затем отделяться от полимера посредством химического отщепления.

В ходе твердофазного пептидного синтеза методы, позволяющие оценить эффективность присоединения или снятия защиты, основаны на колориметрических тестах, которые не являются количественными. Для того чтобы иметь возможность количественного анализа пептидной цепи, молекулу необходимо отделить от твердой подложки, чтобы затем анализировать ее с использованием обычных методов RMN, HPLC и масс-спектроскопии. Этот способ, состоящий из отщепления молекулы от подложки перед получением возможности анализировать ее, не удовлетворяет целям понимания явлений, являющихся причиной проблем, возникающих в ходе синтеза так называемых сложных последовательностей.

Несмотря на то, что масс-спектроскопия может обеспечивать высокопроизводительный анализ, одним из главных недостатков использования стандартных спектроскопических способов для онлайн мониторинга является то, что это требует солюбилизации исследуемого образца, а значит, освобождения от его твердой подложки. Поэтому определение соединения, как правило, осуществляют в конце синтеза.

Поэтому использование такой стратегии отщепления и анализа в качестве средств для контроля качества синтеза имеет несколько недостатков. Во-первых, она является деструктивной, поскольку образцы расходуются, а кроме того, могут происходить вторичные реакции с реагентами для отщепления, приводящие к сложностям в определении пептидных продуктов масс-спектроскопией из-за усложнения получаемых спектров.

В множестве патентов в уровне техники предпринимали попытки проведения анализа в реальном времени синтеза пептидов в ходе его реализации.

В патентной заявке WO2012056300 испрашивается охрана способа мониторинга в реальном времени твердофазного пептидного синтеза (SPPS) в окружающей атмосфере для характеризации пептидных промежуточных соединений или продуктов в режиме онлайн. Описанное техническое решение позволяет осуществлять мониторинг в реальном времени для отслеживания процесса ступенчатых реакций SPPS с использованием источника света, блока электрораспыления и масс-спектрометра. Однако использование этих аналитических методов имеет значительные недостатки, а именно, отбор проб, диспергированных в растворителе, что также подразумевает разрушение указанных образцов, в отличие от способа по изобретению. Это называется способом деструктивного анализа. Кроме того, упомянутое решение не является количественным и не дает возможности узнать, была ли смола надлежащим образом промыта между различными стадиями (промывка после присоединения или отмывка от пиперидина), а позволяет лишь узнать, присоединена ли аминокислота к смоле, или же снята ли защита аминокислоты на смоле.

В патентной заявке WO 2017049128 описана система управления твердофазным пептидным синтезом с использованием детекторов, позволяющих позднее контролировать реакции посредством модификации процесса, такого как удаление реагента. Используемые детекторы проводят измерения в жидкой фазе на протяжении зоны детекции в системе, и могут быть сгенерированы один или более сигналов, соответствующих текучим средам. Для этой цели в патентной заявке WO2017049128 используют помещенный ниже по потоку от реактора детектор электромагнитных излучений для детекции текучей среды на выходе из реактора для того, чтобы получить сигнал. Таким образом, параметры можно модулировать до или во время процесса реакции твердофазного пептидного синтеза. Недостатком этого способа является то, что контроль осуществляют ниже по потому от реактора, а не в реакторе или не в контуре рециркуляции. Кроме того, этим способом осуществляют мониторинг снятия защиты, но не присоединения, и, наконец, этот метод не позволяет проводить многопроходный анализ в реальном времени и, в отличие от системы по изобретению, это решение подразумевает большой избыток реагентов и растворителей, что потребляет много реагентов и совсем не является экономически целесообразным.

Деструктивные аналитические способы колориметрического или спектрофотометрического типа имеют тот недостаток, что являются необратимыми. Кроме того, они создают модифицированные продукты и, что даже более значимо, они снижают выход конечного пептида, поскольку их осуществляют на аликвотах смолы-пептида. Однако эти способы широко используют, поскольку они являются быстрыми и не требуют никаких дорогостоящих приборов.

Недеструктивные аналитические способы также можно использовать в периодических процессах. Например, можно упомянуть мониторинг реакций посредством инфракрасного излучения, основанный на появлении или исчезновении функциональных групп, который можно использовать для мониторинга твердофазного химического синтеза, в частности, в области органического синтеза, и для мониторинга присоединения и снятия защиты во время пептидного синтеза. Инфракрасная и рамановская спектроскопии представляют собой широко используемые методы детекции и характеризации продуктов реакции, поскольку они позволяют проводить прямой анализ продуктов на твердых подложках. Можно упомянуть также разработку методов FT-IR (инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье, или ИКПФ-спектроскопии), позволяющих получать спектр инфракрасного поглощения, излучения, фотопроводимости или рамановского рассеяния твердого, жидкого или газообразного образца.

Тем не менее, использование этих методов для твердофазных реакций ограничено, в частности, из-за их высокой стоимости и из-за их способности измерять только одно отдельное место в образце.

Разработка новых системы и способа недеструктивного мониторинга и анализа в реальном времени, способных быстро и одновременно получать информацию о большом числе образцов, но которые могли бы также мониторить все реагенты в реакторе для сборки, составляет реальную необходимость, в частности, поскольку, в отличие от существующих способов, это позволило бы осуществлять общее управление синтезом и постадийный мониторинг твердофазного пептидного синтеза для оптимального контроля времени реакции, использования растворителей, реагентов и значительного уменьшения стоимости. Кроме того, новый способ детекции в реальном времени позволил бы исключить благоприятствование побочным реакциям посредством остановки стадии, как только реакция завершилась.

Настоящее изобретение предлагает такую систему и такие способы и устраняет ограничения, упомянутые выше.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к реакторной системе для проведения твердофазного пептидного синтеза, содержащей: входную трубу (1), предназначенную для введения смолы, входную трубу (2), предназначенную для введения растворителя для синтеза и промывки, входную трубу (3), предназначенную для введения средства снятия защиты подаваемой аминокислоты, входную трубу (4), предназначенную для введения реагентов, реактор для сборки (9) и контур рециркуляции (10) жидкости из реактора, содержащий по меньшей мере одну измерительную ячейку (11) для непрямой количественной оценки продвижения реакции на твердой фазе.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления измерительная ячейка (11) представляет собой спектрофотометрическую измерительную ячейку, а предпочтительно, измерительная ячейка (11) представляет собой ячейку для измерения посредством рамановской спектроскопии, а еще более предпочтительно, измерительная ячейка (11) представляет собой ячейку для измерения в ближней инфракрасной области.

Спектроскопия в ближней инфракрасной области, также называемая спектроскопией NIR, представляет собой используемый в химии метод количественного и качественного анализа. В этом методе используется спектр, расширенный до длин волны 700-2500 нм (λ), т.е. между волновыми числами 14286 и 4000 см^-1 (v).

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления реакторная система для проведения твердофазного пептидного синтеза дополнительно содержит в реакторе для сборки (9) систему фильтрации.

Система фильтрации по изобретению преимущественно представляет собой систему фильтрации, изготовленную из спеченного материала из нержавеющей стали и/или фильтрующего листа.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления реакторная система для проведения твердофазного пептидного синтеза дополнительно содержит реактор (5) для предварительной активации аминокислот и/или растворения порошков и вход (6), соединяющий реактор (5) с реактором для сборки (9).

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления реакторная система для проведения твердофазного пептидного синтеза дополнительно содержит входную трубу для дополнительного растворителя (7) и входную трубу для дополнительного реагента (8) на реакторе для предварительной активации (5).

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления реакторная система для проведения твердофазного пептидного синтеза дополнительно содержит в контуре рециркуляции (10) по меньшей мере одну ячейку для измерения проводимости.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления реакторная система для проведения твердофазного пептидного синтеза дополнительно содержит в контуре рециркуляции (10) по меньшей мере одну ячейку для измерения коэффициента поглощения ультрафиолета.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления реакторная система для проведения твердофазного пептидного синтеза дополнительно содержит в контуре рециркуляции (10) ячейку для измерения посредством рамановской спектроскопии.

Эти измерительные ячейки могут быть дополнительными к измерительным ячейкам, уже присутствующим в контуре рециркуляции.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления реакторная система для проведения твердофазного пептидного синтеза дополнительно содержит самозаполняющийся насос на уровне входной трубы (7), предназначенной для введения растворителя для синтеза.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления реакторная система для проведения твердофазного пептидного синтеза дополнительно содержит датчик уровня для измерения уровня смол и/или жидкости в реакторе.

Датчик уровня позволяет проводить непрерывное измерение уровня жидкостей, присутствующих в реакторе, а значит, осуществлять в реальном времени мониторинг промывки для оптимизации ее эффективности и для уменьшения используемого объема растворителя.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления реакторная система для проведения твердофазного пептидного синтеза дополнительно содержит в реакторе для сборки (9) датчик давления.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления реакторная система для проведения твердофазного пептидного синтеза дополнительно содержит в реакторе для сборки (9) ячейку для измерения проводимости на дне реактора.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления реакторная система для проведения твердофазного пептидного синтеза дополнительно содержит в реакторе для сборки (9) ячейку для измерения pH на дне реактора.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления реакторная система для проведения твердофазного пептидного синтеза дополнительно содержит устройство для диспергирования растворителя, расположенное в конце линии, на уровне реактора (9).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу твердофазного пептидного синтеза, включающему следующие стадии:

a) присоединение при перемешивании в реакторе для сборки и запуск контура рециркуляции,

b) мониторинг в реальном времени стадии присоединения по измерению детектора в контуре рециркуляции для количественной оценки химических веществ смеси,

c) промывку реактора для сборки,

d) снятие защиты посредством введения растворителя для синтеза и средства снятия защиты в реактор и запуск перемешивания в реакторе и в контуре рециркуляции,

e) мониторинг в реальном времени стадии снятия защиты в реакторе по измерению детектора,

f) промывку от средства снятия защиты,

g) мониторинг в реальном времени стадии промывки (f) концентрации средства снятия защиты в реакторе по измерению детектора.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, перед стадией присоединения в реакторе для сборки, способ включает предварительную стадию предварительной активации аминокислоты в реакторе для растворения, мониторинга в реальном времени стадии предварительной активации в реакторе по измерению детектора, введения предварительно активированной смеси в реактор для сборки.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения мониторинг в реальном времени стадии присоединения проводят по измерению детектора, выбранного из детектора ближней инфракрасной области, кондуктометра, детектора УФ, детектора рамановской спектроскопии и/или детектора pH.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения мониторинг в реальном времени стадии предварительной активации проводят посредством кондуктометра, детектора УФ, детектора рамановской спектроскопии и/или детектора pH.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения мониторинг в реальном времени стадии промывки проводят по измерению детектора, выбранного из детектора ближней инфракрасной области, кондуктометра, детектора УФ, детектора рамановской спектроскопии и/или детектора pH.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения мониторинг в реальном времени стадии предварительной активации проводят по измерению детектора, выбранного из детектора ближней инфракрасной области, кондуктометра, детектора УФ, детектора рамановской спектроскопии и/или детектора pH.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения промывку на стадии (i) проводят посредством перколяции.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения перколяцию проводят с контролем уровня посредством датчика типа радара.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения концентрацию средства снятия защиты измеряют в реальном времени на выходе реактора. Это измерение проводят во время перколяции для мониторинга ее развития и остановки введения растворителя и завершения сливания.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению датчика уровня для определения высоты жидкости в реакторе относительно высоты слоя смолы для стадии перколяции, чтобы оптимизировать промывку в реальном времени и минимизировать потребление растворителя.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению системы перколяции в способе мониторинга в реальном времени по изобретению для фильтрации растворителя. Мониторинг в реальном времени во время применения системы перколяции проводят посредством датчика, в частности, датчика типа радара, таким образом обеспечивая возможность мониторинга реакции и контроля количеств растворителей и реагентов в реальном времени для ограничения их стоимости.

Изобретение также относится к способу и процессу мониторинга в реальном времени химической реакции, включающему реакторную систему по изобретению, блок управления (13), контролируемый посредством программного обеспечения, делающего возможной автоматизацию реакторной системы, благодаря усовершенствованному контролю в режиме онлайн в реакторе для сборки и в контуре рециркуляции. Этот способ мониторинга в реальном времени преимущественно используют для реакций пептидного синтеза, более предпочтительно, твердофазного пептидного синтеза.

Преимущественно, изобретение относится к устройству, содержащему компьютеризованные средства для осуществления способа по изобретению. В соответствии с другим из его аспектов, способ по изобретению по меньшей мере частично осуществляют компьютеризованными средствами, предусмотренными в системе по изобретению.

Блок управления (13) содержит блок управления реакторной системы по изобретению. Этот блок преимущественно встроен в систему по изобретению. Более предпочтительно, этот блок управления включает в себя фиксированный (например, системы PC, Macintosh или Unix) и/или мобильный (например, типа смартфона/планшета) компьютеризированный терминал, снабженный одной или более единицами программного обеспечения/приложениями, адаптированными для того, чтобы обеспечить автоматизированное регулирование управления системой по изобретению с использованием данных, предоставленных различными датчиками. Таким образом, как только измерительные ячейки, или же датчики, системы пептидного синтеза по изобретению включаются и получают данные от различных датчиков, программное обеспечение/приложение запускает управляющие сигналы внутри электронного блока и останавливает или нет текущую стадию.

Без ограничения этим, указанные адаптированные программное обеспечение/приложения системы по изобретению могут также собирать информацию о природе и количестве реагентов и растворителей, используемых для пептидного синтеза, с целью управления запасами указанных реагентов и растворителей. Интеграция посредством этих адаптированных единиц программного обеспечения/приложений в течение данного будущего периода может обеспечивать интеграцию временного элемента для поддержания запасов реагентов и растворителей на уровнях, необходимых для гарантии хорошего продвижения всех стадий синтеза в желательное время, но не являющихся финансово невыгодными.

В соответствии с настоящим изобретением, в равной мере упоминаются измерительные ячейки и датчики. Например, инфракрасный датчик или инфракрасная измерительная ячейка представляет собой устройство инфракрасного обнаружения, детектирующее длины волн инфракрасного диапазона.

Устройство и способ по изобретению имеют многочисленные преимущества по сравнению с уже существующими решениями.

Использование реактора с усовершенствованным контролем в режиме онлайн внутри него и/или в рециркуляционном контуре позволяет осуществлять мониторинг каждой стадии реакции, чтобы точно знать, когда стадия завершилась. С этой системой получают значительную экономию времени. Кроме того, операторы также меньше подвергаются воздействию опасных реагентов, поскольку необходимо отбирать меньше образцов. Реакторная система и способ синтеза по изобретению также позволяют останавливать реакцию, как только она завершится, ограничивая вторичные реакции и оптимизируя чистоту синтезированного пептида.

Мониторинг можно также проводить, благодаря датчикам проводимости и температуры, в дополнение к датчикам ближней инфракрасной области даже внутри реактора, но он будет предпочтительно проводиться в жидкой фазе, поскольку, благодаря контуру рециркуляции на реакторе, можно размещать многочисленные датчики в дополнение к датчикам FTNIR (спектроскопии в ближней инфракрасной области с преобразованием Фурье), такие как датчики для измерения проводимости и УФ.

Другим преимуществом системы и способа по изобретению является то, что используют одну единственную калибровку для всех защищенных Fmoc природных аминокислот. Система и способ по изобретению позволяют также проводить точную количественную оценку средства снятия защиты и высвобождения дибензофульвенов во время стадий снятия защиты защищенных Fmoc аминокислот, чтобы узнать, когда реакция завершилась.

Система и способ по изобретению позволяют также осуществлять мониторинг промывки и уменьшения концентраций реагентов вплоть до пороговой, чтобы узнать, когда промывка завершилась. Благодаря этому усовершенствованному контролю в режиме онлайн, возможно не только мониторить развитие реакций, но и использовать его для автоматизация.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения является возможным выбирать, какие измерительные ячейки определяют конец стадии, когда достигнут порог или когда установлена стабилизация. Таким образом, реактор может функционировать автоматически в течение нескольких стадий, в соответствии с результатами онлайн мониторинга.

Благодаря датчику типа радара, способному определять высоту жидкости в реакторе относительно высоты слоя смолы, и благодаря мониторингу в контуре рециркуляции, реактор может функционировать автоматически, и, таким образом, это приводит к более эффективной промывке смолы, посредством функционирования в соответствии с режимом перколяции.

Преимущественно, в системе и способе по изобретению используют способ перколяции для отмывки растворителя и для оптимизации мониторинга в режиме онлайн по использованному количеству реагентов и растворителей.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, при использовании блока или способа для перколяции, жидкость вводят сверху реактора на смолу с таким же расходом, как и расход на выходе из реактора, благодаря контролю высоты жидкости, которая должна оставаться постоянной в реакторе в течение всей промывки.

Этот режим промывки включает заполнение слоя смолы и системы распределения для входа жидкости сверху реактора для хорошего распределения жидкости на поверхности смолы. Этот режим промывки является наиболее эффективным и позволяет значительно уменьшить потребление растворителя по сравнению с другими существующими способами. В реакторе также контролируют температуру, чтобы иметь возможность изменять температуру между двумя различными стадиями за несколько минут.

Настоящее изобретение уменьшает затраты, необходимые для закупки исходных продуктов и обработки остаточной жидкости, значительно снижая количество фактически потребляемых реагентов, растворителей и жидких отходов (органического растворителя), разрушительных для окружающей среды.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

Настоящее изобретение станет лучше понятным из нижеприведенного подробного описания и прилагаемых фигур, которые приведены в качестве иллюстрации и поэтому не являются ограничивающими настоящее изобретение и на которых:

Фиг. 1 представляет собой схематический вид, показывающий реакторную систему синтеза (14) для проведения твердофазного пептидного синтеза с контуром (10) рециркуляции жидкости из реактора, обеспечивающим возможность измерения в реальном времени динамики химических веществ в автоматическом пептидном синтезаторе по настоящему изобретению.

Числовые позиции на фиг. 1 обозначают следующие элементы: входная труба (1), предназначенная для введения смолы, входная труба (2), предназначенная для введения растворителя для синтеза, необязательно, вводимого самозаполняющимся насосом. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления реактор (5) для предварительной активации аминокислот и/или растворения порошков соединен с реактором (9) для сборки посредством входной трубы (6), входная труба (3), предназначенная для введения средства снятия защиты аминокислоты, вводимого самозаполняющимся насосом, и входная труба (4), предназначенная для введения растворителя, соединены с реактором (9) для сборки, дополнительная входная труба (8), предназначенная для введения реагентов, и входная труба, предназначенная для введения растворителя, соединены с реактором (5) для предварительной активации. Контур (10) рециркуляции жидкости из реактора, содержащий по меньшей мере один детектор (11), предпочтительно спектрофотометрическую ячейку для измерения в ближней инфракрасной области, блок управления (13), контролируемый программным обеспечением, обеспечивающим возможность автоматизации реакторной системы, благодаря усовершенствованному контролю в режиме онлайн в контуре рециркуляции. Трехходовой клапан (12) на выходе датчиков в контуре рециркуляции реактора (9) для сборки позволяет, в зависимости от потребностей, переходить в режим сливания или нет.

На фиг. 2 представлена кривая калибровки пиперидина в УФ (390 нм) для количественной оценки посредством инфракрасного излучения.

На фиг. 3 представлена кривая калибровки пиперидина между 0,01% и 35 об.%.

На фиг. 4 представлена кривая калибровки пиперидина между 0,01% и 1 об.%.

На фиг. 5 представлен мониторинг в жидкой фазе и с течением времени присоединения гистидина к пептиду-смоле. Наблюдение исчезновения реагентов и образования продукта (DICU).

На фиг. 6 представлен мониторинг стадии снятия защиты гистидина.

На фиг. 7 представлены отмывки пиперидина после снятия защиты гистидина.

На фиг. 8 представлено исчезновение средства снятия защиты с течением времени для фиксированного расхода при перколяции.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Ниже описаны предпочтительные варианты осуществления и реализации системы и способа по изобретению. Это описание приведено также со ссылкой на прилагаемые фигуры.

Реактор для синтеза представляет собой реактор из нержавеющей стали емкостью 25 литров. На дне реактора помещено устройство фильтрации, чтобы удерживать смолу и выпускать растворители. Это устройство фильтрации изготовлено из спеченного материала из нержавеющей стали, однако, может состоять из фильтрующего листа или любой другой системы фильтрации, известной специалисту в данной области техники.

Реактор имеет перемешивающую лопасть для как можно лучшего смешивания смолы и жидкости. Эта перемешивающая лопасть может вращаться в обоих направлениях вращения. Сверху реактора присутствуют несколько входов, из которых один вход предназначен для введения смолы, а один вход предназначен для введения растворителя для синтеза (DMF), вводимого самозаполняющимся насосом. Расход при введении, а также введенный объем измеряют и оценивают количественно посредством датчика массового расхода. Расход может составлять в диапазоне от 35 л/ч до 600 л/ч. Растворитель можно нагревать или охлаждать, по мере необходимости, перед вводом в реактор посредством теплообменника. Для правильной очистки реактора между каждой стадией синтеза, в конце линии, на уровне реактора, находится устройство для диспергирования растворителя. Это устройство функционирует корректно между 20 и 1000 л/ч. Входная труба, предназначенная для введения средства снятия защиты аминокислоты, также может быть помещена сверху реактора для сборки. Это делают с помощью самозаполняющегося насоса, расход которого составляет от 20 до 1000 л/ч. Расход при введении, а также введенный объем измеряют и оценивают количественно посредством датчика массового расхода. Средство снятия защиты можно предварительно смешивать или не смешивать с растворителем для синтеза перед введением в реактор. Входная труба для дополнительного растворителя, объем и расход которого контролируют датчиком массового расхода, также может быть помещена сверху реактора для сборки.

В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, сверху реактора для сборки помещена входная труба для впуска азота с целью сделать реактор инертным или продуть реактор азотом.

В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, реактор для сборки может быть оборудован различными датчиками:

• датчиком для спектроскопии в ближней инфракрасной области,

• датчиком уровня (типа радара) для измерения уровня смолы или жидкости в реакторе,

• датчиком давления,

• ячейкой для измерения проводимости на дне реактора, предназначенной для измерения проводимости в любой момент синтеза в твердой-жидкой фазе,

• pH-метром на дне реактора для измерения pH в любой момент синтеза в твердой-жидкой фазе.

Контур рециркуляции жидкости из реактора для сборки позволяет проводить в реальном времени измерение динамики химических веществ в реакторе посредством измерительных ячеек, представляющих собой ячейку для измерения проводимости, ячейку ближней инфракрасной области (оптический путь от 1 мм до 30 мм) и ячейку УФ (оптический путь от 0,5 мм до 10 мм). Для данной стадии, поток жидкости в этот контур возникает несколько раз, и расход при рециркуляции можно корректировать в соответствии со стадиями, если реакции являются медленными или быстрыми.

После того как стадия завершена, жидкость из реактора сливают через спеченный материал, пропуская через измерительные ячейки контура рециркуляции, которые могут поэтому давать информацию о жидкой фазе на выходе из реактора.

В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, реактор для сборки соединен с другим реактором, который можно использовать для растворения порошков или для предварительной активации аминокислот перед введением в реактор. Этот реактор представляет собой стеклянный реактор с двойной рубашкой емкостью 10 л. Его снабжен мешалкой, обеспечивающей возможность растворения порошков. Он, необязательно, имеет датчик проводимости и датчик давления. Сверху имеется вход для введения порошков. Входная труба для растворителя позволяет, как и в реакторе для сборки, вводить растворитель посредством самозаполняющегося насоса, в диапазоне между 20 и 1000 л/ч. Расход и объем введения измеряют датчиком массового расхода. Последняя входная труба присутствует для введения растворителя или средства присоединения (агента реакции присоединения).

Сборкой управляют посредством программного обеспечения, обеспечивающего возможность автоматизации установки благодаря усовершенствованному контролю в режиме онлайн.

Пример. Функционирование установки

В ходе твердофазного синтеза его начинают посредством введения смолы в реактор через предназначенный для нее вход. Добавляют заданный объем растворителя для синтеза при заданном расходе через предназначенный для него вход. Перемешивают смесь смолы-растворителя, затем, когда смола набухнет, растворитель сливают через выход на дне реактора. Повторно запускают эту операцию несколько раз. В то же самое время, растворяют/или предварительно активируют аминокислоту или линкер в реакторе для растворения в DMF. Их перемешивают. Средство присоединения либо добавляют, либо нет. Если да, то стадию предварительной активации отслеживают, предпочтительно, благодаря ячейке для измерения проводимости.

После завершения предварительной активации вводят смесь в реактор для сборки. Запускают перемешивание в реакторе для сборки и запускают контур рециркуляции. Инфракрасное измерение в контуре рециркуляции позволяет количественно определить химические вещества смеси. Концентрация реагентов уменьшается, а концентрация промежуточных продуктов реакции увеличивается в жидкой фазе до стабилизации. После достижения стабилизации стадию завершают, затем реактор для сборки сливают через контур рециркуляции, который, благодаря трехходовому клапану на выходе датчиков, позволяет переход в режим сливания.

После того как стадия присоединения завершена, растворитель для синтеза вводят в реактор с заданными объемом и расходом. Смесь растворителя-смолы перемешивают и запускают контур рециркуляции. Когда становятся стабильными сигналы проводимости в реакторе и/или сигналы в контуре рециркуляции, запускают сливание реактора. Эту стадию проводят несколько раз, предпочтительно, по меньшей мере три раза, до достижения желательных остаточных концентраций в реакторе.

После завершения этой стадии промывки смолы запускают стадию снятия защиты. Растворитель для синтеза и средство снятия защиты вводят в реактор через предназначенные для них входные трубы. Затем запускают перемешивание в реакторе, а также контур рециркуляции. В реальном времени отслеживают стадию снятия защиты в реакторе посредством измерительных ячеек в режиме онлайн.

Проводимость увеличивается в реакторе вплоть до стабилизации, указывающей на завершение реакции. Количественную оценку веществ в реакторе можно проводить, предпочтительно, посредством инфракрасной ячейки. В этом случае возможен мониторинг образования дибензофульвена и потребления средства снятия защиты, в данном случае – пиперидина.

Увеличение коэффициента поглощения УФ выявляет образование дибензофульвена, а его стабилизация указывает на завершение стадии снятия защиты. Количественную оценку этого вещества посредством УФ можно проводить, если стабилизации УФ недостаточно для интерпретации сигналов.

После завершения этой стадии проводят сливание реактора. За этим следует стадия вымывания средства снятия защиты (промывки). Эту стадию промывки можно осуществлять двумя способами.

В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, стадию промывки осуществляют посредством введения последовательных порций промывочного растворителя, в данном случае – DMF, перемешивания и контура рециркуляции, затем сливания. В каждой порции инфракрасная ячейка измеряет концентрацию пиперидина в реакторе. Когда инфракрасное измерение показывает достижение порога пиперидина, проводят последнее сливание.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления, стадию промывки можно также проводить, и неожиданно, посредством перколяции, благодаря системе, включающей:

- распределение однородного промывочного растворителя на слое смолы,

- измерение уровня жидкости и коррекцию расхода на основании измерения уровня жидкости подходящим датчиком.

Добиваются оптимизации объемов промывки DMF. Расход при введении DMF равен, предпочтительно, расходу при сливании реактора, так что уровень жидкости в реакторе поддерживается постоянным и наиболее близким к уровню слоя смолы. Измерение концентрации средства снятия защиты, например, пиперидина, проводят в реальном времени на выходе из реактора. После достижения порога средства снятия защиты введение промывочного растворителя останавливают и завершают сливание.

После промывки смолы повторно запускают те же самые стадии, вплоть до завершения сборки пептида, а именно, предварительной активации или растворения аминокислот, присоединения аминокислоты на смоле, промывки смолы, снятия защиты аминокислоты, промывки смолы.

Использование контура рециркуляции на реакторе для сборки, содержащего измерительную ячейку, в частности, для измерения в ближней инфракрасной области, имеет многочисленные преимущества по сравнению с решениями из уровня техники. В частности, отслеживание химических веществ может быть количественным, прямым и непрямым, в соответствии с той стадией, на которой находится сборка пептида.

Во время присоединения и промывки после присоединения система позволяет проводить количественную оценку аминокислот, защищенных группой типа Fmoc (Fmoc-ак), независимо от их статуса активации, Fmoc-ак-OH, Fmoc-ак-OBt, Fmoc-ак-Oxyma или Fmoc-ак-DIC, и надежна, какая бы ни была аминокислота, в присутствии или в отсутствие HOBt, Oxyma, DIC, DICU или воды, диизопропилмочевины (DICU) в присутствии средств присоединения, например, HOBt, Oxyma, DIC, Fmoc-ак; суммы HOBt (1-гидроксибензотриазола) + Fmoc-ак-OBt в присутствии DIC, DICU и Fmoc-ак; суммы Oxyma + Fmoc-ак-oxyma в присутствии DIC, DICU и Fmoc-ак; суммы DIC (N,N’-диизопропилкарбодиимида) + Fmoc-ак-DIC.

Можно также мониторить, без количественной оценки, если необходимо, динамику всех веществ, присутствующих или нет (образование, исчезновение или стабилизацию концентрации веществ), в присутствии других средств присоединения в среде: DIC (N’N’-диизопропилкарбодиимида) + Fmoc-ак-OH, Fmoc-ак-Obt, Fmoc-ак-Oxyma, Fmoc-ак-DIC.

Калибровка пиперидина для количественной оценки посредством инфракрасного излучения

Калибровочную кривую необходимо получить до того, как можно будет создать способ количественной оценки посредством инфракрасного излучения.

Авторы изобретения выбрали произвольным образом использование уже существующего способа количественной оценки, хорошо известного специалисту в данной области для пиперидина, а именно, способа количественной оценки УФ-спектрометром.

Этот способ непрямой, причем пиперидин в DMF дериватизируют с использованием DNFB, затем анализируют посредством УФ-спектрометрии при 390 нм после 30 минут дериватизации. В качестве неограничивающего примера, спектрофотометром, применимым по изобретению, является спектрофотометр от компании Thermo Scientific, названный Genesys 10S UV-Vis.

После 30 минут дериватизации концентрацию пиперидина измеряют при 390 нм.

Кривая калибровки пиперидина представлена на фиг. 2.

После того, как была получена калибровочная кривая в УФ, приготовили образцы пиперидина с различными известными концентрациями между 0,01% и 35% по объему пиперидина в DMF. Для получения повышенной точности при низких значениях пиперидина приготовили несколько образцов между 0,01% и 1% пиперидина.

Затем эти образцы пропускали в измерительную ячейку (кювету) инфракрасного спектрометра (Manufacturer Bruker под коммерческим наименованием Matrix-F), идентичного или нет спектрометру системы по изобретению.

Чтобы иметь способ правильной количественной оценки пиперидина посредством инфракрасного излучения, реальные образцы также необходимо пропускать через ячейку, т.е. образцы, поступающие со стадий снятия защиты и промывки после снятия защиты. Они содержат, в частности, дибензофульвены, следы реагентов (Fmoc-ак, DIC, DICU, HOBt, Oxyma), в дополнение к пиперидину в DMF.

Поскольку количественная оценка посредством инфракрасного излучения представляет собой количественную оценку на основании спектральных полос, а не высокоточной длины волны, ее можно использовать во время калибровки для того, чтобы иметь образцы, близкие к реальным растворам при синтезе.

Количественная оценка в ближней инфракрасной области представляет собой многопараметрическую калибровку с использованием разрешения матрицы и статистических способов. Эти способы интегрированы непосредственно в программное обеспечение для управления инфракрасным спектрометром.

Реальные образцы после снятия защиты и промывки после снятия защиты пропускали через инфракрасную ячейку и анализировали их параллельно посредством УФ-спектрометрии, чтобы определить реальную концентрацию пиперидина в образцах.

После пропускания образцов через ячейку NIR (для измерения в ближней инфракрасной области) при известных концентрациях пиперидина можно запускать многопараметрический анализ и определять наилучший способ количественной оценки, предложенный программным обеспечением. Этот способ затем необходимо протестировать и проверить, пропуская другие образцы с известными концентрациями и наблюдая, действительно ли предложенная калибровочная кривая позволяет количественно оценить пиперидин с желательной допустимой погрешностью.

В случае пиперидина получали две калибровочные кривые, поскольку диапазон измерения является очень широким (от 0,01% до 35% пиперидина) и точность при низком содержании пиперидина должна быть важной.

Образцы с известными концентрациями пиперидина анализировали способом инфракрасной количественной оценки.

На фиг. 3 представлена калибровочная кривая, где образцы с известными концентрациями пиперидина анализировали способом инфракрасной количественной оценки между 0,01% и 35% пиперидина.

На фигуре 4 представлена кривая калибровки пиперидина между 0,01% и 1% пиперидина.

Эти результаты позволяют валидировать кривые калибровки пиперидина посредством инфракрасного излучения.

Мониторинг различных веществ, присутствующих в системе

Изобретение предлагает неограничивающий пример мониторинга и количественных оценок, посредством инфракрасного излучения, различных веществ во время различных стадий пептидного синтеза.

Мониторинг стадии присоединения гистидина на данных пептиде-смоле

Аминокислоту и HOBT растворяют в реакторе для растворения. Затем их вводят в реактор для сборки, а также DIC. Запускают перемешивание и запускают контур рециркуляции.

Инфракрасный анализ с течением времени можно наблюдать на фиг. 7.

Стабилизация сигналов происходит спустя примерно 2 часа. Конечная концентрация веществ и, в частности, Fmoc-ак-* (соответствующей гистидину), близка к ожидаемой концентрации. Присоединение завершается. Можно проводить сливание реактора.

DMF вводят в реактор для сборки. Тогда запускают перемешивание и запускают контур рециркуляции. Таким образом, добавляют количество пиперидина, необходимое для снятия защиты. Измерение сигналов посредством инфракрасного излучения в контуре рециркуляции можно наблюдать на фиг. 8.

Это показывает потребление пиперидина и высвобождение дибензофульвенов в реакторе для сборки. Происходит снятие защиты. После того, как наблюдают стабилизацию сигналов, реакция больше не развивается. Затем реактор сливают.

После завершения снятия защит, динамику концентрации пиперидина можно мониторить во время периодической промывки.

Результаты представлены на фиг. 9.

Для этого заданное количество DMF вводят в реактор для сборки. Запускают перемешивание, а также контур рециркуляции. Посредством инфракрасного измерения количественно определяют количество пиперидина, присутствующего в реакторе. При каждой стабилизации концентрации пиперидина реактор сливают. Пока полученное значение для пиперидина не станет достаточно низким, промывку запускают снова, пока не получат желательную концентрацию.

Оптимизация времени промывки системы посредством перколяции

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, реакторная система для химического синтеза соединена с системой перколяции, чтобы также оптимизировать время промывки и количества используемого промывочного растворителя.

По смыслу настоящего изобретения, перколяция означает, что растворитель, в частности, промывочный растворитель, пропускают через неподвижный слой, такой как смола, для проведения экстракции.

Перколяцию проводят на смоле, например, смоле из гидрохлорида 4-метилбензгидриламина или любой другой смоле, известной специалисту в данной области техники (для подтверждения или приведения другого примера), просто расположенной в неподвижном слое на системе фильтрации и распределенной равномерно и горизонтально на ее поверхности, чтобы избежать какого-либо предпочтительного пути промывочного растворителя через слой смолы.

Промывочный растворитель, такой как DMF, вводят посредством системы распределения, позволяющей избежать возмущения слоя смолы, так что он остается горизонтальным на своей поверхности.

Уровень жидкости над смолой контролируют как можно более близким к слою смолы, без его возмущения, чтобы уменьшить количество используемого промывочного растворителя, ограничивая явления повторного смешивания.

Расход промывочного растворителя оптимизируют благодаря определению кинетики переноса подлежащих удалению веществ между твердой фазой (смолой) и жидкой фазой (промывочным растворителем).

Таким образом, избыточно высокий расход не позволил бы веществам диффундировать и повлек бы за собой избыточное потребление промывочного растворителя, а избыточно низкий расход позволил бы веществам диффундировать, но повлек бы за собой слишком длительное время промывки.

Следующий пример показывает, что, в зависимости от расхода промывки, эффективность промывок не является одинаковой.

Эксперимент проводят в стеклянном реакторе диаметром 10 см, оборудованном спеченным материалом, содержащим слой смолы высотой 10 см, на котором связан пептид. Стремятся уменьшить концентрацию средства снятия защиты, осуществляя перколяцию с промывочным растворителем. Слой смолы является однородным и горизонтальным, предпочтительного пути нет, и промывочный растворитель распределяется так, чтобы слой смолы оставался горизонтальным на поверхности.

В следующей таблице можно видеть влияние промывочного растворителя на эффективность промывки посредством перколяции.

Расход промывочного растворителя (мл/мин) мл промывочного растворителя Время промывки (мин) 50 930 20 80 1000 12 190 1050 6 300 1200 4

При расходе перколяции 50 мл/мин, для достижения оптимальной промывки, необходимо 930 мл промывочного растворителя, то есть 20 минут промывки максимум.

При расходе перколяции 300 мл/мин, для достижения такой же оптимальной промывки, необходимо 1200 мл промывочного растворителя (+20% дополнительного растворителя по сравнению с расходом 50 мл/мин), то есть 4 минуты промывки (-79% времени по сравнению с расходом 50 мл/мин).

Видно, что при избыточно высоком расходе необходимо больше промывочного растворителя для достижения такого же порога промывки, но более короткое время промывки.

Результаты перколяции в системе по изобретению

В следующем примере показана промывка посредством перколяции в реакторе по изобретению с высотой слоя смолы 5,6 см.

Анализ в режиме онлайн в контуре рециркуляции позволяет дать точную количественную оценку удаления средства снятия защиты, в данном случае – пиперидина.

На фиг. 8 показано исчезновение средства снятия защиты с течением времени для фиксированного расхода перколяции.

Имея описанное таким образом настоящее изобретение, понятно, что его можно модифицировать многочисленными способами. Такие варианты не следует рассматривать как отклонение от сути и объема изобретения, и все модификации, которые были бы очевидны специалисту в данной области техники, подразумеваются включенными в объем нижеследующей формулы изобретения.

Настоящее изобретение относится к автоматизированной системе реакторов для проведения твердофазного пептидного синтеза, и более конкретно, к синтезатору пептидов в твердой фазе, автоматизированному посредством реактора с контуром рециркуляции жидкости, позволяющим в реальном времени измерять химические вещества в реакторе посредством измерительных ячеек. Реакторная система для проведения твердофазного пептидного синтеза содержит реактор (9) для сборки, входную трубу (1), предназначенную для введения смолы в реактор (9) для сборки, входную трубу (2), предназначенную для введения растворителя для синтеза и промывки в реактор (9) для сборки, входную трубу (3), предназначенную для введения средства снятия защиты подаваемой аминокислоты в реактор (9) для сборки, входную трубу (4), предназначенную для введения реагентов в реактор (9) для сборки, вход (6), предназначенный для введения в реактор (9) для сборки аминокислоты, которая предварительно активирована, контур (10) рециркуляции жидкости из реактора (9) для сборки, содержащий по меньшей мере одну спектрофотометрическую измерительную ячейку (11) для измерения в ближней инфракрасной области для непрямой количественной оценки продвижения реакции на твердой фазе, причем реактор (9) для сборки выполнен с возможностью промывки от средства снятия защиты растворителем посредством блока перколяции, выполненного с возможностью распределения растворителя на поверхности слоя смолы и оптимизации промывки на основании результатов измерения уровня растворителя в реакторе (9) относительно высоты слоя смолы. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 1 пр., 8 ил.

1. Реакторная система для проведения твердофазного пептидного синтеза, содержащая:

- реактор (9) для сборки,

- входную трубу (1), предназначенную для введения смолы в реактор (9) для сборки,

- входную трубу (2), предназначенную для введения растворителя для синтеза и промывки в реактор (9) для сборки,

- входную трубу (3), предназначенную для введения средства снятия защиты подаваемой аминокислоты в реактор (9) для сборки,

- входную трубу (4), предназначенную для введения реагентов в реактор (9) для сборки,

- вход (6), предназначенный для введения в реактор (9) для сборки аминокислоты, которая предварительно активирована,

- контур (10) рециркуляции жидкости из реактора (9) для сборки, содержащий по меньшей мере одну спектрофотометрическую измерительную ячейку (11) для измерения в ближней инфракрасной области для непрямой количественной оценки продвижения реакции на твердой фазе,

причем реактор (9) для сборки выполнен с возможностью промывки от средства снятия защиты растворителем посредством блока перколяции, выполненного с возможностью распределения растворителя на поверхности слоя смолы и оптимизации промывки на основании результатов измерения уровня растворителя в реакторе (9) относительно высоты слоя смолы.

2. Реакторная система для проведения твердофазного пептидного синтеза по п. 1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит в реакторе (9) для сборки систему фильтрации.

3. Реакторная система для проведения твердофазного пептидного синтеза по п. 2, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит реактор (5) для предварительной активации аминокислот и/или растворения порошков, причем вход (6) соединяет реактор (5) с реактором (9) для сборки.

4. Реакторная система для проведения твердофазного пептидного синтеза по п. 5, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит в контуре (10) рециркуляции ячейку для измерения проводимости.

5. Реакторная система для проведения твердофазного пептидного синтеза по п. 3, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит в контуре (10) рециркуляции ячейку для измерения коэффициента поглощения ультрафиолета.

6. Реакторная система для проведения твердофазного пептидного синтеза по п. 3, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит в контуре (10) рециркуляции ячейку для измерения посредством рамановской спектроскопии.

7. Способ твердофазного пептидного синтеза, осуществляемый в реакторной системе для проведения твердофазного пептидного синтеза по любому из пп. 1-6, включающий следующие стадии:

a) введение смолы и растворителя для синтеза и промывки в реактор для сборки и их перемешивание;

b) введение аминокислоты, которая предварительно активирована, в реактор для сборки и перемешивание смеси;

c) присоединение аминокислоты на смоле при перемешивании смеси в реакторе для сборки и запуск контура рециркуляции,

d) мониторинг в реальном времени стадии присоединения по измерению детектора в контуре рециркуляции для количественной оценки химических веществ смеси,

e) сливание реактора для сборки через контур рециркуляции,

f) снятие защиты посредством введения растворителя и средства снятия защиты аминокислоты в реактор и запуск перемешивания в реакторе и в контуре рециркуляции,

j) мониторинг в реальном времени стадии снятия защиты в реакторе по измерению детектора,

h) промывку от средства снятия защиты аминокислоты,

i) мониторинг в реальном времени стадии промывки (h) концентрации средства снятия защиты в реакторе по измерению детектора,

причем детектор представляет собой детектор ближней инфракрасной области,

причем промывку на стадии (h) проводят посредством перколяции.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что он включает следующие стадии:

j) стадию предварительной активации для получения аминокислоты, которая предварительно активирована, в реакторе для растворения,

k) мониторинг в реальном времени стадии предварительной активации в реакторе для растворения по измерению кондуктометра.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что концентрацию средства снятия защиты измеряют в реальном времени на выходе реактора.