АГЕНТ, СПОСОБСТВУЮЩИЙ АНГИОГЕНЕЗУ, И МЕТОДЫ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Российский патент 2022 года по МПК C07K14/515 C07K14/00 C07K7/06 A61K47/60 A61P1/00 A61P17/02 A61P31/04 A61P31/16 A61P33/00 A61P35/02 

Родственные заявки

[0001] В настоящей заявке испрашивается приоритет по заявке США №62/446,030, поданной 13 января 2017 г., полное содержание которой включено в настоящий документ путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Изобретение относится к агенту, который обладает улучшенной активностью по сравнению с васкулотидом, и методам использования его. В частности, изобретение относится к способам и применениям стимуляции ангиогенеза для заживления диабетических ран и при других сердечно-сосудистых показаниях к применению, для лечения аллергических заболеваний, астмы и атопического дерматита, а также для лечения гриппа.

Уровень техники

[0003] Было выявлено несколько молекулярных основных факторов для регуляции поддержания сосудистого гомеостаза. Одним из наиболее известных из них является сигнальная ось Tie2/Angiopoietin (Ang). Эта рецепторная система тирозинкиназы (Tie2) и фактора роста белка (Ang) несколько уникальна тем, что два основных фактора роста, Ang1 и Ang2, распространяют анти- или провоспалительные ответы соответственно через один и тот же рецептор, расположенный на эндотелии сосудов. В отличие от большинства рецепторов тирозинкиназ, Tie2 поддерживается в постоянно активном состоянии в нормальных, здоровых эндотелиальных клетках благодаря действиям Ang1. Было обнаружено, что этот рецептор активирует ряд внутриклеточных путей, которые регулируют пролиферацию и выживание эндотелиальных клеток (MAPK и AKT), проницаемость (VE-Cadherin) и межклеточные взаимодействия (ICAM и VCAM), которые во время нормального физиологического состояния слаженно работают для поддержания эндотелиальных клеток в состоянии покоя. Активация этого пути, отмеченная фосфорилированием рецептора Tie2, служит трансдоминантным сигналом; противодействует индуцированию пропотевания жидкости из сосудов вследствие воздействия множества воспалительных факторов, в том числе VEGF, серотонина, брадикинина, гистамина, PAF, тромбина, LPS, септической сыворотки и токсина сибирской язвы (Parikh SM, Virulence 2013). Неоднократно было показано, что быстрое повышение уровня Ang2 приводит к пропотеванию жидкости из сосудов, патологическим проявлениям и смерти после множества различных повреждений. Исследования показали, что именно баланс между уровнями Ang1 и Ang2 циркулирующими в токе крови, определяет основное доминирующее состояние сосудистой активации. Учитывая данный факт, подходы, направленные на модуляцию этого пути, могут иметь терапевтическое применение.

[0004] На сегодняшний день сложная природа Angs мешает их очистке и терапевтическому применению. Таким образом были тщательно изучены альтернативные подходы для модуляции этого пути. К настоящему времени описаны два основных подхода. Первый и гораздо более распространенный подход был сфокусирован на блокировании антагонистического лиганда Ang2. Терапевтические средства в этом классе можно грубо определить как антитела или пептиды, блокирующие Ang2. Второй класс Tie2-направленных модуляторов заимствован из выясненных структурных характеристик Ang1. То есть этот биологически активный Ang1 существует в природе как мультимер, состоящий не менее чем из четырех субъединиц. Предполагается, что субъединицы Ang1 связываются с рецептором Tie2 и при этом образуют кластер смежных рецепторов, эффективное совмещение рецепторов в конфигурацию, которая облегчает трансфосфорилирование. Чтобы имитировать агонистическое действие Ang1 для рецептора Tie2, было разработано несколько больших рекомбинантных белков, которые образуют связь с кластером смежных рецепторов (Zhang et al., 2002; Cho et al., 2004; Han et al., 2016; US Patent No. 8,957,022).

[0005] Васкулотид (также называемый родительским васкулотидом) представляет собой конструктивно разработанное полностью синтетическое соединение, имитирующее действие Ang1. Центральное ядро Vasculotide состоит из низкодисперсного четырехцепочечного полиэтиленгликоля массой 10 кДа. Ковалентное присоединение имеющих высокое сродство Tie2-связывающих пептидов, в частности (-CHHHRHSF-, SEQ ID NO: 6), облегчается посредством реакции активированных малеимидных групп и аминоконцевого цистеина. Эта структура была определена как оптимальная конфигурация для связывания и активации рецептора Tie2. Было показано, что прямая активация Tie2 родительским васкулотидом обеспечивает доминантный сигнал препятствующий пропотеванию жидкости из сосудов в нескольких различных исследованиях in vitro и in vivo, включая доклинические модели аллергии и гриппа (Bourdeau A, et al., BMC Res Notes 2016 and Sugiyama MG, et al., Sci Rep 2015).

[0006] Острое повреждение легких, вызванное гриппом или более тяжелый и связанный с этим диагноз, острый респираторный дистресс-синдром (ALI/ARDS) каждый год приводит к значительным потерям среди населения, непропорционально влияя на молодых и пожилых людей. Частой консервативной особенностью патоген-опосредованного острого респираторного дистресс-синдрома ALI/ARDS является возникновение пропотевания жидкости через сосуды. Терапевтические подходы при лечении ответа на инфекцию инфицированного организма, особенно пропотевания жидкости через сосуды, не должны сопровождаться быстрым развитием резистентности, наблюдаемой у терапевтических средств, специально направленных на постоянно мутирующие патогены. В настоящее время нет терапевтических подходов, одобренных для лечения повреждения легких. Использование агонистов Tie-2, таких как васкулотид, для лечения острого респираторного дистресс-синдрома ALI/ARDS, вызванного гриппом, может обеспечить определенные концептуальные отличия по сравнению с использованием вакцин и/или противовирусных препаратов. Например, современные программы вакцинации против гриппа требуют предварительных знаний о типе штамма, в то время как устойчивость к противовирусным препаратам была хорошо документирована в недавней истории. Кроме того, угроза, исходящая от появляющихся патогенных штаммов или оружия на их основе, потенциально может сделать доступные терапевтические средства совершенно неэффективными. Таким образом, срочно необходимы новые подходы к лечению от патогенов.

Сущность изобретения

[0007] Химический анализ родительского васкулотида показал, что полученный пептидный ПЭГ-конъюгат содержит смесь 5- и 6-членных кольцевых продуктов (Фиг. 1А). Показано, что 5-членное сукцинимидное кольцо является результатом прямого алкилирования малеимида тиольной группой на цистеине, а 6-членное тиазиновое кольцо результатом перегруппировки исходного продукта через свободную аминогруппу на цистеиновом линкере. Эти результаты привели к разработке более простого аналога васкулотида (Mpa-Br), в котором пептид связан с ПЭГ посредством линейного сульфанового фрагмента с образованием активированного тетрамера ПЭГ. В одном случае Mpa-Br получают связыванием пептида T7 с 3-меркаптопропионовой кислотой, ахиральным аналогом цистеина без боковой цепи амина на N-конце, с активированным тетрамером PEG, содержащим бромацетимид (Фиг. 1B). Полученный пептидный ПЭГ-конъюгат дает один продукт, свободный от лабильных кольцевых структур, чувствительных к перегруппировке.

Соответственно, настоящее изобретение относится к соединению формулы (I)

где

n представляет собой целое число в диапазоне от примерно 25 до примерно 100,

каждый X независимо или одновременно представляет собой (C₁-C₂₀)алкилен или (C₂-C₂₀)алкенилен, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими из следующих соединений: галоген, амино, гидрокси, (C₁-C₆)алкил, (C₁-С₆)алкокси, (С₆-С₁₀)арил или (С₅-С₁₀)гетероарил;

каждый Y независимо или одновременно представляет собой (C₁-C₂₀) алкилен или (C₂-C₂₀) алкенилен, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими из следующих соединений: галоген, амино, гидрокси, (C₁-C₆)алкил, (C₁-С₆)алкокси, (С₆-С₁₀)арил или (С₅-С₁₀) гетероарил; и

R представляет собой пептид T7 (SEQ ID NO: 1), пептид GA3 (SEQ ID NO: 2), пептид T4 (SEQ ID NO: 3), пептид T6 (SEQ ID NO: 4) и/или пептид T8 (SEQ ID NO: 5) или их ретро-инверсо пептид;

или его фармацевтически приемлемую соль.

[0009] В одном варианте осуществления соединение стимулирует фосфорилирование Tie2; фосфорилирование MAPK, AKT и/или eNOS; стимулирует миграцию эндотелиальных клеток; стимулирует высвобождение MMP2 из эндотелиальных клеток и защиту их от апоптоза, вызванного отменой сыворотки; стимулирует ангиогенный ответ in vivo в анализе Matrigel; стимулирует заживление ран у субъекта при местном применении к ране субъекта; снижает пропотевание жидкости из сосудов; лечит аллергические заболевания и/или лечит грипп.

[0010] В одном варианте осуществления R представляет собой пептид T7, как показано в SEQ ID NO: 1.

[0011] В одном варианте осуществления в настоящем документе предоставлена фармацевтическая композиция, содержащая соединение, раскрытое в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте осуществления фармацевтически приемлемый носитель подходит для местного введения. В одном варианте осуществления фармацевтически приемлемый носитель подходит для системного введения. В еще одном варианте осуществления фармацевтически приемлемый носитель подходит для интраназального введения, ингаляции или в качестве компонента перфузата.

[0012] Также здесь предоставлен способ получения соединения формулы (I), раскрытого здесь, включающий

(i) реакцию пептида, который представляет собой пептид T7 (SEQ ID NO: 1), пептид GA3 (SEQ ID NO: 2), пептид T4 (SEQ ID NO: 3), пептид T6 (SEQ ID NO: 4) и/или пептид T8 (SEQ ID NO: 5) или его ретро-инверсо пептид с тиоловым соединением формулы (II)

,

для получения соединения формулы (III)

;

(ii) взаимодействие соединения формулы (III) с ПЭГ-тетрамером формулы (IV)

,

для получения соединения формулы (I),

отличающегося тем, что переменные n, X и Y имеют значения, определенные выше, LG представляет собой подходящую замещаемую группу, а PG представляет собой H или подходящую защитную группу.

[0013] В настоящем документе также предложен способ активации рецептора Tie 2, включающий контактирование рецептора Tie 2 с раскрытым в данном документе соединением так, что рецептор Tie 2 активируется. В одном из вариантов осуществления активация рецептора Tie 2 свидетельствует о фосфорилировании остатков тирозина, таких как тирозин 992 (Y992) у человека и Y990 у мышей, рецептора Tie 2 или фосфорилировании MAPK, AKT или eNOS.

[0014] Еще более важным является способ стимулирования ангиогенеза у субъекта, включающий введение соединения, раскрытого в настоящем документе, субъекту, нуждающемуся в этом.

[0015] В другом варианте осуществления ангиогенез, стимулируемый соединением, характеризуется по меньшей мере одним из следующих свойств:

a) привлечение периваскулярных поддерживающих клеток;

b) непроницаемость сосудов, которые в противном случае были бы проницаемы;

c) четко определенная древовидность; а также

d) ингибирование апоптоза эндотелиальных клеток.

[0016] В другом варианте осуществления способ дополнительно включает в себя введение второго ангиогенного агента одновременно или последовательно. В одном варианте осуществления второй ангиогенный агент представляет собой VEGF. В другом варианте осуществления второй ангиогенный агент выбирают из группы, состоящей из PDGF, G-CSF, рекомбинантного человеческого эритропоэтина, bFGF, ингибитора Ang2 и фактора роста плаценты (PLGF).

[0017] В еще одном дополнительном варианте осуществления изобретения субъект, нуждающийся в лечении, имеет одно из следующих клинических состояний: васкуляризация регенеративных тканей, ишемическая болезнь конечностей, церебральная ишемия, васкулярное воспаление, артериосклероз, аваскулярный некроз, стимуляция роста волос и эректильная дисфункция.

[0018] В настоящем документе также предложен способ снижения проницаемости сосудов в месте пропотевания жидкости, включающий введение соединения, раскрытого в данном документе, в необходимое место субъекту, нуждающемуся в этом. В одном варианте осуществления субъект имеет или имел инсульт, дегенерация желтого пятна, отек желтого пятна, нарушение гематоретинального барьера, нарушение гематоэнцефалического барьера, пропотевание жидкости из сосудов вызванное бактериями или нормализация сосудистой сети опухоли.

[0019] В настоящем документе также представлен способ защиты эндотелиальных клеток, включающий введение соединения, раскрытого в настоящем документе, субъекту, нуждающемуся в этом. В одном варианте осуществления субъект имеет или имел травму почки или фиброз почки, инсульт, сосудистую деменцию, дегенерацию желтого пятна или осложнения диабета. В другом варианте осуществления субъект имеет или имел повреждение легкого.

[0020] Еще более важным является способ стимулирования заживления раны, включающий введение соединения, раскрытого в настоящем документе, в рану субъекта, нуждающемуся в этом. В одном варианте осуществления соединение вводят местно или системно. В одном варианте осуществления рана представляет собой диабетическую язву. В другом варианте осуществления рана представляет собой пролежень, пролежневую язву, хирургический разрез, травматическое повреждение ткани, ожог или кожный трансплантат.

[0021] Кроме того, в настоящем документе представлен способ ингибирования роста клеток CFU-G, включающий введение соединения, раскрытого в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом. В одном варианте осуществления способ предназначен для снижения количества эозинофилов и/или базофилов у субъекта, нуждающегося в этом, для лечения атопического дерматита, астмы или аллергического ринита или для лечения состояния, связанного с эозинофилами и/или базофилами, у субъекта, нуждающегося в этом.

[0022] В одном варианте осуществления состояние, связанное с эозинофилами и/или базофилами, представляет собой лейкоз эозинофильного и/или базофильного происхождения. В другом варианте состояние, связанное с эозинофилами и/или базофилами, представляет собой воспалительное заболевание кишечника. В еще одном варианте состояние, связанное с эозинофилами и/или базофилами, представляет собой паразитарную инфекцию.

[0023] В другом варианте осуществления способ ингибирования размножения клеток CFU-G предназначен для снижения уровней воспалительных цитокинов и/или хемокинов, включающих по меньшей мере один из эотаксинов, IL-17, MIG, IL12/IL23 (p40), IL-9, MIP-1a, MIP-1b, RANTES, TNF-α, IL-1β, IL-5, IL-13 и MCP-1. В одном варианте осуществления воспалительный цитокин и / или хемокин включает эотаксин.

[0024] В другом варианте осуществления способ ингибирует индуцированное гистамином пропотевание жидкости из сосудов.

[0025] Кроме того, в настоящем документе представлен способ лечения субъекта, инфицированного гриппом или бактериальной суперинфекцией, ассоциированной с гриппом, включающий введение соединения, раскрытого в настоящем документе, субъекту, нуждающемуся в этом.

[0026] В одном варианте осуществления способ дополнительно включает введение противовирусного агента одновременно или последовательно. В одном варианте осуществления противовирусный агент представляет собой амантадин, римантадин, занамивир, перамивир, вирамидин, рибавирин или осельтамивир. В другом варианте осуществления субъект является человеком, а грипп является человеческим гриппом.

[0027] В одном варианте осуществления соединение вводят местно, системно, интраназально, путем ингаляции или в виде перфузата.

[0028] Также предоставлена композиция, содержащая (a) соединение, раскрытое в данном документе, и (b) противовирусный агент. Кроме того, в настоящем документе представлена композиция, содержащая (a) соединение, раскрытое в данном описании, и (b) ангиогенный агент.

[0029] Далее предоставлен набор, содержащий (a) соединение, раскрытое в данном документе, (b) второй ангиогенный агент и (c) инструкции по применению набора для активации Tie2 и/или для стимуляции ангиогенеза, как описано в настоящем документе.

[0030] Далее предоставлен набор, содержащий (a) соединение, раскрытое в данном документе, (b) противовирусное средство и (c) инструкции по применению набора для лечения субъекта, инфицированного гриппом, и/или для лечения бактериальной суперинфекции у субъекта, инфицированного гриппом.

[0031] Еще более важным является биоматериал, в который включено раскрытое здесь соединение. В одном варианте осуществления биоматериал представляет собой Matrigel, заменитель кожи или сшитый гидрогель гликозаминогликана. В другом варианте осуществления второй агент включен в биоматериал, такой как VEGF, PDGF, G-CSF, рекомбинантный человеческий эритропоэтин, bFGF и фактор роста плаценты (PLGF).

[0032] Другие особенности и преимущества настоящего раскрытия станут очевидными из следующего подробного описания. Следует понимать, однако, что подробное описание и конкретные примеры, хотя и указывают варианты осуществления заявки, даны только в качестве иллюстрации и объем формулы изобретения не должен быть ограничен этими вариантами осуществления, а должен быть представлен в наиболее широкой интерпретация соответствующей описанию в целом.

Краткое описание графических материалов

[0033] Варианты осуществления описаны ниже со ссылкой на графические материалы, на которых:

[0034] На фигуре 1А показана принципиальная схема родительского Васкулотида, полученного путем связывания пептида Т7 с цистеином на N-конце с активированным тетрамером ПЭГ, содержащим Maleimide. Полученный пептидный ПЭГ-конъюгат содержит смесь 5 и 6-членных кольцевых продуктов. Показано, что 5-членное сукцинимидное кольцо является результатом прямого алкилирования малеимида тиольной группой на цистеине, а 6-членное тиазиновое кольцо результатом перегруппировки исходного продукта через свободную аминогруппу на цистеиновом линкере. На фигуре 1В показана принципиальная схема Mpa-Br, полученного в одном варианте путем связывания пептида Т7 с 3-меркаптопропионовой кислотой, ахиральным аналогом цистеина без боковой цепи амина на N-конце, с активированным тетрамером ПЭГ, содержащим бромацетимид.

[0035] На фигуре 2А показано обнаружение связывания родительского васкулотида с гомогенной популяцией рекомбинантных рецепторов Tie2Fc человека в растворе с использованием флуоресцентной спектроскопии триптофана. На фигуре 2C показано обнаружение связывания MPA-Br с популяцией гомогенного рекомбинантного рецептора Tie2Fc человека в растворе с использованием флуоресцентной спектроскопии триптофана. Увеличение интенсивности собственной флуоресценции и результирующие кривые связывания при инкубации человеческого рецептора Tie2Fc с увеличением концентрации лиганда (A, C) (ο) или одного лиганда (□). Образцы возбуждались на длине волны 295 нм. На фигуре 2В показаны кривые насыщения специфически связанного родительского васкулотида с Tie2Fc человека. На фигуре 2D показаны кривые насыщения специфически связанного Mpa-Br с Tie2Fc человека. Для нелинейной регрессии одного сайт-специфического связывания, интенсивность внутренней флуоресценции только родительского васкулотида или только MPABr вычитали из общего связывания. Полученные значения Kd для нормализованного специфического связывания родительского васкулотида и MPA-Br с Tie2Fc человека составляют 102,9 нМ и 2,623 нМ соответственно. На фигуре 2Е показаны кривые связывания родительского васкулотида с человеческим IgGFc. На фигуре 2F показаны кривые связывания MPA-Br с человеческим IgGFc. Не наблюдается насыщения связывания с человеческим IgGFc и родительским васкулотидом или человеческим IgGFc и MPA-Br. На фигуре 2G показана таблица, изображающая константы связывания родительского васкулотида и MPA-Br для различных видов рекомбинантного Tie2FC. Была использована сканирующая флуоресцентная спектроскопия с триптофаном для определения констант связывания родительского васкулотида и MPA-Br для указанных видов рекомбинантного рецептора Tie2Fc.

[0036] На фигуре 3А показан родительский васкулотид и MPA-Br, активирующие рецептор Tie2. Фосфорилированный Tie-2 в клетках HUVEC, обработанных возрастающими дозами родительского васкулотида и MPA-Br. Данные выражены в виде нормализованного среднего ± стандартная ошибка среднего (SEM), однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), апостериорных множественных сравнений по методу Holm-Sidak по отношению к лечению (NT), *р меньше 0,05, **р меньше 0,01. Для наглядности заштрихованная линия отделяет родительское лечение васкулотидом от лечения MPA-Br. На фигуре 3В показаны родительский васкулотид и MPA-Br, активирующие митоген-активируемую протеинкиназу (MAPK). Фосфорилирование MAPK (Erk2) в клетках HUVEC, обработанных родительским васкулотидом и MPA-Br. Данные выражены в виде нормализованного среднего ± стандартная ошибка среднего (SEM), однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) апостериорных множественных сравнений по методу Holm-Sidak по отношению к отсутствующему лечению (NT), *р меньше 0,05, **р меньше 0,0001.

[0037] На фигуре 4А показан фосфорилированный Tie-2 в клетках HMVEC^tert (иммортализованных теломеразой), обработанных родительским васкулотидом и MPA-Br в указанных концентрациях (данные выражены как среднее ± SEM, t-критерий Стьюдента, *p меньше 0,05, **p меньше 0,01, лечебная группа в сравнении с группой обработанной эндотелиальной базальной средой (EBM). На фигуре 4В показан фосфорилированный Tie-2 в первичных микрососудистых эндотелиальных клетках легких мыши, обработанных родительским васкулотидом и MPA-Br в указанных концентрациях (данные выражены как среднее ± SEM, однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) апостериорных множественных сравнений по методу Holm-Sidak, *p меньше 0,05, **p меньше 0,01, ***р меньше 0,001, #р равно 0,06 в лечебной группе по сравнению с группой без лечения (NT).

[0038] На фигуре 5А показаны первичные культивируемые эндотелиальные клетки, полученные из гломерул крысы, на фигуре 5В показаны первичные культивируемые эндотелиальные клетки, полученные из аорты собаки, а на фигуре 5С показаны первичные культивируемые эндотелиальные клетки, полученные из гломерул яванского макака. Клетки стимулировали указанными концентрациями MPA-Br (mBr) в течение 15 минут. Фосфорилированный Tie2 количественно определяли с помощью ИФА, и показанные данные представляют относительную активацию Tie2 (pTie2) при нормализации до общих уровней белка Tie2. Человеческий рекомбинантный ангиопоэтин 1 (Ang1) был включен в качестве положительного контроля. Данные выражены в виде среднего значения ± SEM, t-критерий Стьюдента, *р меньше 0,05, **р меньше 0,01, ***р меньше 0,001 в группе лечения по сравнению с группой без лечения (NT). n равно 3 для крысы, n равно 4 для собаки и n равно 3 для яванского макака.

[0039] На фигурах 6A-6I показаны родительские VT и MPA-Br защищающие мышей после заражения гриппом X31 (H3N2). Мыши были интраназально инфицированы 64HAU X31 в день 0. Указанные дозы родительского VT или MPA-Br вводили внутрибрюшинно каждые 24 часа, начиная с 48 часов после заражения, на протяжении всего исследования. Фракцию выживания контролировали ежедневно (Фигура 6А) до 12 дня. Доля начальной массы тела, измеренная через 5 дней (Фигура 6В) и через 6 дней (Фигура 6C) после заражения. Артериальное насыщение кислородом на 5-й день (Фигура 6D) и на 6-й день (Фигура 6E) после заражения. Температура тела измерялась через 5 дней (Фигура 6F) или через шесть дней (Фигура 6G) после заражения. Оценка активности измеряется на 5-й день (Фигура 6H) и на 6-й день (Фигура 6I) после заражения. Статистика выживания была выполнена с помощью анализа Mantel Cox Log Rank, где ***p меньше 0,001. Все остальные статистические показатели были следующими: #p меньше 0,05 в зависимости от PBS гриппа через однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим ретроспективным анализом Фишера, *p меньше 0,05, **p меньше 0,01, ***p меньше 0,001 и ****p, 0,0001 в зависимости от PBS гриппа через однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с апостериорным критерием Даннета.

[0040] На фигурах 7 A и B показаны крысы Спрэг-Доули, которым вводили указанные дозы родительского VT или MPA-Br посредством инъекции в хвостовую вену в нулевое время. Плазму собирали в указанные моменты времени для облегчения количественной оценки уровней циркулирующего тестируемого агента с помощью ИФА. Графики изображают потерю циркулирующего MPA-Br (Фигура 7А) и родительского VT (Фигура 7В) от системной циркуляции во времени. В таблицах приведены расчетные значения клиренса, объема распределения и конечного периода полураспада для дозы 120 мкг/кг. Одна часть исследования предусматривала доставку MPA-Br в виде одной дозы каждые 24 часа в течение трех последовательных дней (многодозовая MD 120 мкг/кг).

[0041] На фигуре 8 показано, что самцам мышей FVB с выбритой спиной давали указанные количества родительского васкулотида или MPA-Br (через IP) за один час до введения гистамина подкожно. Голубой краситель Эванса (EB), доставляемый через хвостовую вену, вводили сразу же после воздействия гистамина. Стандартизированные кожные биопсии были взяты у мышей с перфузией сердца через тридцать минут после введения гистамина. Поглощение при 620 нм использовали для расчета количества экстравазации красителя EB для всех групп лечения. Данные выражены в виде среднего количества EB ± SEM, однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с апостериорным критерием Даннета относительно контроля с носителем PBS, *p меньше 0,05, **p меньше 0,01, ***p меньше 0,001.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[0042] Термин «(C₁-C_p)алкил», используемый в данном документе, означает насыщенные алкильные радикалы с прямой и/или разветвленной цепью, содержащие от одного до «р» атомов углерода, и включает (в зависимости от типа р) метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, s-бутил, изобутил, трет-бутил, 2,2-диметилбутил, н-пентил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, н-гексил и тому подобное, где переменная p представляет собой целое число, представляющее наибольшее число атомов углерода в алкильном радикале.

[0043] Используемый в данном документе термин «(C₂-C_p)алкенил» означает ненасыщенные алкильные фрагменты с прямой и/или разветвленной цепью, содержащие от двух до «p» атомов углерода, и включает в себя, по меньшей мере, одну углерод-углеродную двойную связь и (в зависимости от типа р) этенил, 1-пропенил, изопропенил, 1-бутенил, 2-бутенил, трет-бутенил, 1-пентенил, 2-метил-1-пентенил, 3-метил-1-пентил, 4-метил-1-пентил, 1-гексенил, 2-гексенил и тому подобное, где переменная p представляет собой целое число, представляющее наибольшее число атомов углерода в алкенильном радикале.

[0044] Термин «(C₁-C_p)алкокси» означает алкильную группу, как определено выше, с присоединенным к ней атомом кислорода. В контексте данного документа, термин означает насыщенные алкильные радикалы с прямой и/или разветвленной цепью, имеющие присоединенный к ним атом кислорода и содержащие от одного до «р» атомов углерода, и включающие (в зависимости от типа р) метокси, этокси, пропокси, изопропокси , н-бутокси, с-бутокси, изобутокси, т-бутокси, 2,2-диметилбутокси, н-пентокси, 2-метилпентокси, 3-метилпентокси, 4-метилпентокси, н-гексокси и тому подобное, где переменная р представляет собой целое число, представляющее наибольшее число атомов углерода в алкоксирадикале.

[004] Используемый в данном документе термин «арил» относится к циклическим группам, которые содержат, по меньшей мере, одно ароматическое кольцо, например, фенил или несколько конденсированных колец, например, нафтил. В варианте осуществления настоящего раскрытия арильная группа содержит 6, 9 или 10 атомов, в составе таких радикалов как фенил, нафтил, инданил, антраценил, 1,2-дигидронафтил, 1,2,3,4-тетрагидронафтил, флуоренил, инданил, инденил и т.п.

[0046] Используемый в данном документе термин «гетероарил» относится к ароматическим циклическим или полициклическим кольцевым системам, имеющим по меньшей мере один гетероатом, выбранный из N, O и S, и по меньшей мере одно ароматическое кольцо. Примеры гетероарильных групп включают, без ограничения, фурил, тиенил, пиридил, хинолинил, изохинолинил, индолил, изоиндолил, триазолил, пирролил, тетразолил, имидазолил, пиразолил, оксазолил, тиазолил, бензофуранил, бензотиофенил, карбазолил, бензоксазолил, пиримидинил, бензимидазолил, хиноксалинил бензотиазолил, нафтиридинил, изоксазолил, изотиазолил, пуринил и хиназолинил, среди прочих

[0047] Используемый в данном документе термин «галоген» относится к атому галогена и включает фтор (F), хлор (Cl), бром (Br) и йод (I).

[0048] Суффикс «ен», добавленный к любой из вышеуказанных групп, означает, что эта группа двухвалентна, то есть вставлена между двумя другими группами.

[0049] Используемый в данном документе ретро-инверсо пептид относится к пептиду, где d-аминокислоты замещены в обратной последовательности. Топология боковой цепи имитирует исходную молекулу (первичную структуру) и, таким образом, обеспечивает связывание.

Соединения изобретения

[0050] В одном варианте осуществления авторы настоящего изобретения предоставляют класс новых агентов, которые обладают улучшенной активностью по сравнению с васкулотидом (VT), и называют один из новых агентов в примерах как «Mpa-Br».

[0051] Соответственно, настоящее изобретение относится к соединению формулы (I)

где

n представляет собой целое число в диапазоне от примерно 25 до примерно 100,

каждый X независимо или одновременно представляет собой (C₁-C₂₀)алкилен или (C₂-C₂₀)алкенилен, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими из следующих соединений: галоген, амино, гидрокси, (C₁-C₆)алкил, (C₁-С₆)алкокси, (С₆-С₁₀)арил или (С₅-С₁₀)гетероарил;

каждый Y независимо или одновременно представляет собой (C₁-C₂₀) алкилен или (C₂-C₂₀) алкенилен, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими из следующих соединений: галоген, амино, гидрокси, (C₁-C₆)алкил, (C₁-С₆)алкокси, (С₆-С₁₀)арил или (С₅-С₁₀) гетероарил; и

R представляет собой пептид T7 (SEQ ID NO: 1), пептид GA3 (SEQ ID NO: 2), пептид T4 (SEQ ID NO: 3), пептид T6 (SEQ ID NO: 4) или пептид T8 ( SEQ ID NO: 5) или его ретро-инверсо пептид;

и/или его фармацевтически приемлемая соль.

[0052] В одном варианте осуществления R представляет собой пептид Т7, причем этот пептид Т7 содержит аминокислотную последовательность: His-His-His-Arg-His-Ser-Phe (SEQ ID NO: 1). В другом варианте осуществления R представляет собой пептид GA3, причем этот пептид GA3 содержит аминокислотную последовательность: Trp-Thr-Ile-Ile-Gln-Arg-Arg-Glu-Asp-Gly-Ser-Val-Asp-Phe-Gln-Arg-Thr-Trp-Lys-Glu-Tyr-Lys (SEQ ID NO: 2). В другом варианте осуществления R представляет собой пептид T4, причем этот пептид T4 содержит аминокислотную последовательность: Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser (SEQ ID NO: 3). В еще одном варианте осуществления R представляет собой пептид Т6, причем этот пептид Т6 содержит аминокислотную последовательность: Lys-Leu-Trp-Val-Ile-Pro-Lys (SEQ ID NO: 4). В еще одном варианте осуществления R представляет собой пептид Т8, причем этот пептид Т8 содержит аминокислотную последовательность: His-Pro-Trp-Leu-Thr-Arg-His (SEQ ID NO: 5).

[0053] T4, T6, T7 и T8 представляют собой связывающие Tie 2 пептиды T4, T6, T7 и T8, описанные в Tournaire, R. et al. (2004) EMBO Reports 5:262-267. GA3 также является Tie 2 связывающим пептидом, описанным в Wu, X. et al. (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 315:1004-1010.

[0054] В одном варианте осуществления n представляет собой целое число от примерно 40 до примерно 70, или от примерно 48 до примерно 65, или примерно 55.

[0055] В другом варианте осуществления X представляет собой независимо или одновременно (C₁-C₁₀)алкилен или (C₂-C₁₀)алкенилен. В другом варианте осуществления X представляет собой независимо или одновременно (C₁-C₆)алкилен или (C₂-C₆)алкенилен. В другом варианте осуществления X представляет собой независимо или одновременно (C₁-C₃)алкилен. В другом варианте осуществления X представляет собой метилен (-CH₂-). В другом варианте осуществления необязательные заместители представляют собой один или несколько галогенов или (С₁-С₃)алкила или СН₃.

[0056] В другом варианте Y независимо или одновременно представляет собой (С₁-С₁₀)алкилен или (С₂-С₁₀)алкенилен. В другом варианте Y независимо или одновременно представляет собой (С₁-С₆)алкилен или (С₂-С₆)алкенилен. В другом варианте осуществления Y представляет собой независимо или одновременно (C₁-C₃)алкилен. В другом варианте Y является этиленом (-CH₂CH₂-). В другом варианте Y является производным тиогликолевой кислоты, 2-меркаптопропионовой кислоты, 4-меркаптомасляной кислоты, 6-меркаптогексановой кислоты, 8-меркаптооктановой кислоты, 11-меркаптоундекановой кислоты, 12-меркаптододекановой кислоты или 16-меркаптогексадекановой кислоты.

[0057] В одном варианте осуществления соединение формулы (I) представляет собой соединение,

где

n представляет собой целое число от 50 до 60 или около 55; а также

R представляет собой His-His-His-Arg-His-Ser-Phe (SEQ ID NO: 1);

или его фармацевтически приемлемую соль.

[0058] В другом варианте осуществления фармацевтически приемлемая соль представляет собой кислотно-аддитивную соль, такую как ацетат, трифторацетат или форму соли HCl. В другом варианте осуществления соединение формулы (I) представляет собой соль, которая является ацетатом или гидрохлоридом.

[0059] В других вариантах осуществления настоящее изобретение также включает димеры и тримеры, в дополнение к тетрамерам соединений формулы (I). В одном варианте осуществления изобретение включает димерные, тримерные и тетрамерные соединения, имеющие формулу

где

W представляет собой независимо или одновременно гидроксизамещенный (C₁-C₂₀)алкил или гидроксизамещенный (C₂-C₂₀)алкенил, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими из следующих соединений: галоген, амин, гидрокси, (C₁-C₆)алкила, (С₁-С₆)алкокси, (С₆-С₁₀)арил или (С₅-С₁₀)гетероарил; или же

W является X-S-Y-C(O)-R,

где n, X, Y и R имеют значения, определенные выше.

[0060] В одном варианте осуществления W представляет собой гидроксизамещенный (С₁-С₁₀)алкил или гидроксизамещенный (С₂-С₁₀)алкенил. В другом варианте осуществления W представляет собой гидроксизамещенный (С₁-С₆)алкил или гидроксизамещенный (С₂-С₆)алкенил. В другом варианте осуществления W представляет собой -CH₂-OH.

[0061] В одном варианте димер имеет следующую структуру

где W представляет собой независимо или одновременно гидроксизамещенный (C₁-C₂₀)алкил или гидроксизамещенный (C₂-C₂₀)алкенил, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими из следующих соединений: галоген, амино, гидрокси, (C₁-C₆)алкил, (С₁-С₆)алкокси, (С₆-С₁₀)арил или (С₅-С₁₀)гетероарил и

n, X, Y и R соответствуют определению выше.

[0062] В другом варианте тример имеет следующую структуру

где W представляет собой независимо или одновременно гидроксизамещенный (C₁-C₂₀)алкил или гидроксизамещенный (C₂-C₂₀)алкенил, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими из следующих соединений: галоген, амино, гидрокси, (C₁-C₆)алкил, (С₁-С₆)алкокси, (С₆-С₁₀)арил или (С₅-С₁₀)гетероарил и

n, X, Y и R соответствуют определению выше.

[0063] В другом варианте осуществления тетрамеры представляют собой соединения формулы (I).

[0064] В одном варианте осуществления соединения, раскрытые в данном документе, проявляют активность агониста Tie 2. Эта активность агониста Tie 2 может быть обнаружена с использованием индикаторов активации Tie 2, которые хорошо известны в данной области. Например, раскрытое здесь соединение может стимулировать фосфорилирование Tie 2 (например, фосфорилирование по тирозиновым остаткам, таким как аминокислотный остаток Y992 человеческого Tie 2).

[0065] Соответственно, в варианте осуществления соединение стимулирует фосфорилирование Tie 2.

[0066] Кроме того, раскрытое здесь соединение может стимулировать фосфорилирование молекулы в нисходящем сигнальном пути Tie 2, такое как фосфорилирование MAPK, AKT (например, фосфорилирование по аминокислотному остатку S473 человеческого AKT) и/или eNOS (например, фосфорилирование по аминокислотному остатку S1177 eNOS). Способность соединения стимулировать фосфорилирование определенных белков может быть выявлена с использованием стандартных методик, хорошо известных в данной области, таких как иммуноблотирование клеточных лизатов, обработанных этим соединением.

[0067] Соответственно, в одном варианте осуществления соединение стимулирует фосфорилирование MAPK, AKT и eNOS.

[0068] В другом варианте осуществления соединение, раскрытое в данном документе, оказывает очевидное воздействие на эндотелиальные клетки. Например, раскрытое здесь соединение может оказывать по меньшей мере один эффект из следующих эффектов на эндотелиальные клетки, выбранные из группы: стимуляция миграции эндотелиальных клеток, стимуляция высвобождения MMP2 из эндотелиальных клеток и защита эндотелиальных клеток от апоптоза, вызванного отменой сыворотки. Необязательно, соединение, раскрытое в настоящем документе, оказывает по меньшей мере два из этих эффектов на эндотелиальные клетки или оказывает все три из этих эффектов на эндотелиальные клетки. Способность соединения оказывать любое из этих эффектов на эндотелиальные клетки может быть определена с использованием анализов, известных в данной области, таких как анализ в камере Бойдена для оценки миграции клеток, зимографический анализ для оценки высвобождения MMP2 или гибели клеток, ИФА для оценки апоптоза, вызванного отменой сыворотки.

[0069] Соответственно, в одном варианте осуществления соединение стимулирует миграцию эндотелиальных клеток; стимулирует высвобождение MMP2 из эндотелиальных клеток и/или защиту эндотелиальных клеток от апоптоза, вызванного отменой сыворотки.

[0070] В одном варианте осуществления соединение, раскрытое в данном документе, оказывает очевидное влияние на ангиогенез, что измерено в анализе ангиогенеза in vitro или in vivo. Один такой анализ представляет собой анализ Matrigel in vivo, в котором Matrigel импрегнируют низкой концентрацией фактора роста и вводят подкожно подопытному животному. Через некоторое время (например, 14 дней) тестируемое животное может быть обработано средством, которое облегчает идентификацию и количественную оценку сосудов (например, FITC-лектин), и пробка Matrigel может быть удалена и исследована на ангиогенный ответ.

[0071] Соответственно, в варианте осуществления соединение, раскрытое в данном документе, стимулирует ангиогенный ответ in vivo в анализе с Matrigel.

[0072] В другом варианте осуществления раскрытое здесь соединение может стимулировать заживление раны у субъекта при местном нанесении на рану субъекта. Способность соединения стимулировать заживление ран можно оценить на животной модели, такой как штамм мыши B6.Cg-m (+/+)Lepr(db)/J(db/db), у диабетического штамма мыши нарушено заживление ран. Мыши может быть нанесена рассеченная рана, соединение, включенное в состав для местного применения, можно наносить на рану, и можно оценить заживление раны. В одном варианте осуществления соединения, раскрытые в данном документе, могут ускорять время закрытия раны и/или могут способствовать увеличению отложения коллагена и неоваскуляризации.

[0073] Соответственно, в варианте осуществления соединение стимулирует заживление раны у субъекта при местном нанесении на рану субъекта.

[0074] В одном варианте осуществления количество молекул ПЭГ в соединении, раскрытом в данном документе, необязательно является числом, которое соответствует молекулярной массе менее чем примерно 21500 дальтон в диапазоне молекулярных масс от примерно 8000 дальтон до примерно 21500 дальтон при молекулярной массе около 12500 дальтон, около 15500 дальтон или около 14400 дальтон.

[0075] В настоящем документе также предлагается фармацевтическая композиция, содержащая соединение, раскрытое в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

[0076] Используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты и тому подобное, которые являются физиологически совместимыми. Необязательно носитель подходит для местного введения или для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). В зависимости от пути введения активное соединение может быть покрыто материалом для защиты соединения от действия кислот и других природных условий, которые могут инактивировать соединение.

[0077] Фармацевтически приемлемые носители могут быть выбраны так, чтобы они подходили для желаемого пути введения. Например, в одном варианте осуществления фармацевтически приемлемый носитель подходит для местного введения. Неограничивающим примером подходящего носителя для местного применения является гель IntraSite (коммерчески доступный от Smith & Nephew). В одном варианте осуществления фармацевтически приемлемый носитель подходит для системного введения. Неограничивающим примером подходящего носителя для системного (например, внутривенного) введения является забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS).

[0078] В еще одном варианте осуществления фармацевтически приемлемый носитель подходит для интраназального введения. В еще одном варианте осуществления фармацевтически приемлемый носитель пригоден для ингаляции. В дополнительном варианте осуществления фармацевтически приемлемый носитель подходит в качестве компонента перфузата.

[0079] Фармацевтические композиции могут включать одну или несколько фармацевтически приемлемых солей. «Фармацевтически приемлемая соль» относится к соли, которая сохраняет желаемую биологическую активность исходного соединения и не вызывает каких-либо нежелательных токсикологических эффектов (см., Например, Berge, S.M. et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Примеры таких солей включают кислые и основные соли. Кислые соли включают в себя соли, полученные из нетоксичных неорганических кислот, таких как соляная, азотная, ортофосфорная, серная, бромистоводородная, йодистоводородная, метафосфорная и тому подобное, а также из нетоксичных органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфокислоты и тому подобное (такие как уксусная кислота). Основные соли включают в себя соли, полученные из щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и тому подобное, а также из нетоксичных органических аминов, таких как N,N'-дибензилэтилендиамин, N-метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и тому подобное.

[0080] Фармацевтическая композиция также может включать фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и т.п.; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (BHA), бутилированный гидрокситолуол (BHT), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и тому подобное; и (3) хелатирующие металлы агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и тому подобное.

[0081] Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут использоваться в фармацевтических композициях, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, путем использования материалов для покрытия, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и путем использования поверхностно-активных веществ.

[0082] Эти композиции могут также содержать, например, консерванты, смачивающие агенты, эмульгирующие агенты и/или диспергирующие агенты. Предотвращение присутствия микроорганизмов может быть обеспечено как с помощью процедур стерилизации, так и путем включения различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабена, хлорбутанола, фенолсорбиновой кислоты и тому подобного. Также может быть желательно включить в композиции изотонические агенты, такие как сахара, хлорид натрия и тому подобное. Кроме того, длительное всасывание инъецируемой фармацевтической формы может быть вызвано включением агентов, которые замедляют всасывание, таких как моностеарат алюминия и желатин.

[0083] Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем включения активного соединения в необходимом количестве в подходящем растворителе с одним или несколькими ингредиентами, перечисленными выше, по мере необходимости, с последующей стерилизационной микрофильтрацией. Композиция может быть составлена в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Носителем может быть растворитель или дисперсная среда, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящие смеси. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Во многих случаях будет предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия.

[0084] Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалом носителя для получения единичной дозированной формы, будет варьироваться в зависимости от субъекта, которого лечат, и конкретного способа введения. Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалом-носителем для получения единичной дозированной формы, обычно будет таким количеством композиции, которое оказывает терапевтический эффект. Как правило, из ста процентов это количество будет составлять от около 0,01 до около 99 процентов активного ингредиента, предпочтительно от около 0,1 до около 70 процентов, наиболее предпочтительно от около 1 до около 30 процентов активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

[0085] Режимы дозировки подбираются так, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ (например, терапевтический ответ). Например, может быть введена одноразовая доза, несколько разделенных доз могут вводиться с течением времени, или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, как указано в зависимости от терапевтической ситуации. Парентеральные композиции могут быть выполнены в виде единичной дозированной формы для простоты введения и однородности дозировки. Используемая здесь единичная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Спецификация для стандартных дозированных форм диктуется и напрямую зависит от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который должен быть достигнут, и (b) ограничений, при приготовлении такого активного соединения в случае индивидуальной чувствительности.

[0086] Для системного введения соединения, раскрытого в настоящем документе, дозировка обычно составляет от 0,00001 до 100 мг/кг и более обычно 0,1-100 мкг/кг массы тела хозяина. Например, дозировки могут составлять 0,1 мкг/кг, 0,5 мкг/кг, 5 мкг/кг, 10 мкг/кг, 30 мкг/кг, массы тела, 0,1 мг/кг массы тела, 0,3 мг/кг массы тела, 0,5 мг/кг массы тела или 1 мг/кг массы тела. Для местного введения примерные дозировочные концентрации составляют от примерно 1 нг/мл до примерно 10 нг/мл.

[0087] Фактические уровни дозировки активных ингредиентов в фармацевтических композициях можно варьировать, чтобы получить количество активного ингредиента, которое эффективно для достижения желаемого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения, без токсического эффекта для пациента. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от множества фармакокинетических факторов, включая активность конкретных используемых композиций или их сложного эфира, соли или амида, пути введения, времени введения, скорости выведения конкретного используемого соединения, продолжительности лечения, приема других лекарств, соединений и/или материалов, используемых в сочетании с конкретными применяемыми композициями, возраста, пола, веса, состояния, общего состояния здоровья и предыдущей истории болезни пациента, которого лечат, и подобных факторов, хорошо известных в медицине. Специалист в данной области сможет определить такие количества на основе таких факторов, как размер субъекта, серьезность симптомов субъекта и определенных условий или выбранного способа введения.

Способы изготовления

[0088] Также в настоящем документе предлагается способ получения соединения формулы (I), раскрытого в данном документе, включающий

(i) реакцию пептида, который представляет собой пептид T7 (SEQ ID NO: 1), пептид GA3 (SEQ ID NO: 2), пептид T4 (SEQ ID NO: 3), пептид T6 (SEQ ID NO: 4) и/или пептид T8 (SEQ ID NO: 5) или его ретро-инверсо пептид с тиоловым соединением формулы (II)

,

получение соединения формулы (III) или его соли

;

(ii) взаимодействие соединения формулы (III) с ПЭГ-тетрамером формулы (IV)

,

получение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли;

отличающегося тем, что переменные n, X и Y имеют значения, определенные выше, LG представляет собой подходящую замещаемую группу, а PG представляет собой H или подходящую защитную группу.

[0089] В одном варианте осуществления подходящей замещаемой группой является галоген, тозилат или мезилат. В дополнительном варианте осуществления замещаемая группа представляет собой бром.

[0090] В одном варианте осуществления подходящей защитной группой является тритил.

[0091] В одном варианте осуществления соединение формулы (III) представляет собой кислую соль, такую как трифторацетат, ацетат или гидрохлорид.

[0092] В некоторых вариантах осуществления пептид (R) сначала связывают с полистирольной смолой. В другом варианте осуществления пептид, связанный с полистирольной смолой, подвергают взаимодействию с тиоловым соединением формулы (II). В дополнительном варианте осуществления соединение формулы (III) связывают с полистирольной смолой, которая отщепляется перед реакцией с соединением формулы (IV).

[0093] В одном варианте осуществления реакцию между соединением формулы (III) и соединением формулы (IV) проводят при рН от примерно 5 до примерно 8, или от примерно 6 до примерно 8, или от примерно 6 до примерно 7, или 6.5.

[0094] В других вариантах осуществления тиоловые соединения формулы (III) используются в качестве нуклеофилов в реакции Майкла с тетрамерными молекулами ПЭГ, как описано выше, и дополнительно содержат ненасыщенные фрагменты. Например, соединения формулы (III) реагируют с такими тетрамерными молекулами ПЭГ

где

Т представляет собой ненасыщенный фрагмент, такой как акрилатный фрагмент или винилсульфоновый фрагмент.

[0095] В другом варианте осуществления акрилатный фрагмент представляет собой

.

[0096] В другом варианте осуществления винилсульфоновая часть представляет собой

.

[0097] В одном варианте осуществления тиольный фрагмент в соединении формулы (III) действует как нуклеофил в реакции Майкла с образованием дополнительных соединений, описанных в данном изобретении, таких как

; или

,

где R и Y описаны выше.

Методы и способы применения

Активация Tie2 и стимуляция ангиогенеза

[0098] Другой аспект относится к способам использования и применениям соединений, раскрытых в данном документе. Как обсуждено здесь, соединения, раскрытые в этом документе, могут быть использованы для активации рецептора Tie 2, либо in vitro, либо in vivo. Таким образом, в варианте осуществления предложен способ активации рецептора Tie-2, включающий контактирование рецептора Tie-2 с раскрытым здесь соединением, таким образом, что рецептор Tie-2 активируется. Также представлено применение соединения, раскрытого в настоящем документе, для активации рецептора Tie 2. Кроме того, предложено применение соединения, раскрытого здесь, для приготовления лекарственного средства для активации рецептора Tie 2. Еще более подробно представлено соединение, раскрытое в данном документе, для активации рецептора Tie 2.

[0099] Активация рецептора Tie 2 может быть подтверждена любым из многочисленных возможных индикаторов активации Tie 2, хорошо известных в данной области, включая, но не ограничиваясь, различными анализами in vitro и in vivo. В одном варианте осуществления, например, активация рецептора Tie 2 подтверждается фосфорилированием остатков тирозина рецептора Tie 2, например, тирозина 992 (Y992) человеческого Tie 2. В другом варианте осуществления, например, активация рецептора Tie 2 подтверждается фосфорилированием MAPK, AKT или eNOS.

[00100] Поскольку было показано, что соединения, раскрытые в данном документе, обладают повышенной величиной ответа и более широким диапазоном доз, чем васкулотид, который, как было показано, обладает ангиогенной активностью (например, см. фигуры 3А, В, 4А, В, 5А-С и 8А), также предоставлен способ стимуляции ангиогенеза у субъекта, включающий введение соединения, раскрытого в настоящем документе, субъекту, нуждающемуся в этом. Также представлено применение соединения, раскрытого в настоящем документе, для стимуляции ангиогенеза у субъекта, нуждающегося в этом. Кроме того, предложено применение соединения, раскрытого здесь, для приготовления лекарственного средства для стимуляции ангиогенеза у субъекта, нуждающегося в этом. Еще более важным является раскрытое в настоящем описании соединение применяемое для стимуляции ангиогенеза у субъекта, нуждающегося в этом.

[00101] В одном варианте осуществления ангиогенез, стимулируемый соединением, характеризуется по меньшей мере одним из следующих свойств:

a) привлечение периваскулярных поддерживающих клеток;

b) непроницаемость сосудов, которые в противном случае были бы проницаемы;

c) четко определенная древовидность; а также

d) ингибирование апоптоза эндотелиальных клеток.

[00102] Привлечение периваскулярных поддерживающих клеток можно продемонстрировать путем обнаружения маркера клеток гладких мышц, например, путем иммуноокрашивания с использованием антител к актину 1 гладких мышц (Sma 1), NG2 или десмину. Сосудистая проницаемость может быть оценена с использованием анализов проницаемости сосудов, общепринятых в данной области, включая анализы in vitro и/или in vivo. Неограничивающим примером анализа проницаемости сосудов in vivo является анализ Майлза с использованием голубого красителя Эванса или FITC альбумина. Используемое здесь определение «непроницаемые» сосуды следует применять, если степень сосудистой проницаемости меньше, чем степень проницаемости сосудов, рост которых стимулировался применением VEGF или другими медиаторами сосудистого воспаления, такими как серотонин или гистамин. Четко определенную древовидность можно продемонстрировать, например, путем визуализации новообразованных сосудов и подсчета количества сосудов и количества узлов в конкретном поле изображения. Четко определенная древовидность обозначена, например, значительным и организованным ветвлением сосудов, таким как ангиогенез, при котором отношение количества сосудов к количеству узлов составляет 1,0:0,5, необязательно 1,0:0,7 или даже 1,0:1,0. Кроме того, динамику потока в новых сосудах можно оценить с помощью микродопплеросонографии.

[00103] При способе стимуляции ангиогенеза сайт может связываться с соединением, раскрытым в данном документе, одиночно или же, сайт может связываться с одним или несколькими дополнительными ангиогенными агентами. Таким образом, в другом варианте осуществления способ ангиогенеза дополнительно включает взаимодействие сайта субъекта со вторым ангиогенным агентом. Неограничивающие примеры дополнительных ангиогенных агентов, которые можно использовать в комбинации с раскрытым здесь соединением, включают в себя VEGF, PDGF, G-CSF, рекомбинантный человеческий эритропоэтин, bFGF и фактор роста плаценты (PLGF). Соответственно, в одном варианте осуществления второй ангиогенный агент представляет собой VEGF. В другом варианте осуществления второй ангиогенный агент выбирают из следующей группы: PDGF, G-CSF, рекомбинантный человеческий эритропоэтин, bFGF, ингибитор Ang2 и фактор роста плаценты (PLGF).

[00104] Учитывая способность раскрытых здесь соединений стимулировать ангиогенез, раскрытые здесь соединения можно использовать в различных клинических ситуациях, в которых желательно стимулирование ангиогенеза. Неограничивающие примеры таких ситуаций включают в себя васкуляризацию регенеративных тканей, ишемическую болезнь конечностей, церебральную ишемию, состояния сосудистого воспаления, включая атеросклероз, аваскулярный некроз, стимуляцию роста волос и эректильную дисфункцию.

[00105] В настоящем документе также предложен способ снижения проницаемости сосудов в месте пропотевания жидкости, включающий введение соединения, раскрытого в данном документе, в необходимое место субъекту, нуждающемуся в этом. Также представлено применение соединения, раскрытого в настоящем документе, для уменьшения сосудистой проницаемости в месте пропотевания жидкости из сосудов у субъекта, нуждающегося в этом. Кроме того, предложено применение соединения, раскрытого здесь, для приготовления лекарственного средства для снижения сосудистой проницаемости в месте пропотевания жидкости из сосудов у субъекта, нуждающегося в этом. Кроме того, предложено соединение, раскрытое в настоящем документе, применяемое для уменьшения сосудистой проницаемости в месте пропотевания жидкости из сосудов у субъекта, нуждающегося в этом.

[00106] В одном варианте осуществления у субъекта есть или имелся инсульт, дегенерация желтого пятна, отек желтого пятна, нарушение гематоретинального барьера, нарушение гематоэнцефалического барьера, пропотевание жидкости из сосудов вызванное бактериями или необходимость в нормализации сосудистой сети опухоли.

[00107] Ранее было показано, что васкулотид оказывает защитное действие на эндотелиальные клетки, например, путем ингибирования апоптоза эндотелиальных клеток. Сообщалось, что способность агониста Tie 2 защищать эндотелиальные клетки в почечной сосудистой сети уменьшает фиброз почки на экспериментальной модели (Kim, W. et al. (2006) J. Am. Soc. Nephrol. 17:2474-2483). Было показано, что MPA-Br индуцирует фосфорилирование Tie2 в HUVEC, HMVEC и в первичных эндотелиальных клетках крыс, собак и яванского макака. В последнее время Thamm K et al., 2016, показали, что VT облегчает острое повреждение почек после трансплантации (у мышей). Это также привело к уменьшению фиброза почек, связанного с трансплантацией, у тех мышей, которые получали VT. Rubig E et al, 2016, показали, что VT снижает степень острого повреждения почек после ишемии-реперфузии. Снижение травм было отмечено увеличением выживаемости, улучшением кровотока в поврежденных почках и уменьшением пропотевания жидкости из сосудов.

[00108] Соответственно, в настоящем документе представлен способ защиты эндотелиальных клеток, включающий введение соединения, раскрытого в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом. Также представлено применение раскрытого здесь соединения для защиты эндотелиальных клеток у субъекта, нуждающегося в этом. Кроме того, предложено применение соединения, раскрытого здесь, для приготовления лекарственного средства защищающего эндотелиальные клетки субъекта, нуждающегося в этом. Еще более важным является раскрытое здесь соединение для защиты эндотелиальных клеток субъекта, нуждающегося в этом.

[00109] Такой способ применения можно использовать в различных клинических ситуациях, неограничивающие примеры которых включают в себя повреждение легких, повреждение почек, фиброз почек, инсульт, сосудистую деменцию, дегенерацию желтого пятна и диабетические осложнения (например, в почках, глазах, коже и/или конечностях).

[00110] Еще более важным является способ стимулирования заживления раны, включающий введение соединения, раскрытого в настоящем документе, в рану субъекту, нуждающемуся в этом. Также представлено применение раскрытого здесь соединения для стимуляции заживления раны у субъекта, нуждающегося в этом. Кроме того, предложено применение соединения, раскрытого здесь, для приготовления лекарственного средства стимулирующего заживление раны у субъекта, нуждающегося в этом. Еще более важным является раскрытое в настоящем описании соединение для применения в стимуляции заживления раны у субъекта, нуждающегося в этом.

[00111] Стимуляция заживления раны может быть подтверждена, например, ускоренным временем закрытия раны по сравнению с заживлением раны в отсутствие соединения, увеличением грануляционной ткани в месте раны по сравнению с грануляционной тканью при отсутствии лечения и/или повышенной неоваскуляризацией раны по сравнению со случаем без лечения.

[00112] В одном варианте осуществления способ или применение стимулирующего заживления раны используют при лечении диабетической язвы.

[00113] В других вариантах осуществления способ использования для стимулирования заживления раны можно применить в различных клинических ситуациях, связанных с ранами, включая, но не ограничиваясь следующими ситуациями - диабетическая язва, пролежневая язва, хирургические разрезы, травматические повреждения тканей, ожоги и кожные трансплантаты.

Состояния, связанные с эозинофилами и/или базофилами

[00114] MPA-Br представляет собой соединение с улучшенным связыванием мишени и фармакокинетикой по сравнению с васкулотидом, которое, как ранее было показано, ингибирует рост CFU-G клеток.

[00115] Соответственно, в настоящем документе представлен способ ингибирования роста CFU-G клеток, включающий введение соединения, раскрытого в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом. Изобретение также обеспечивает применение раскрытого здесь соединения для ингибирования роста CFU-G клеток в животном организме или в клетке при необходимости. Также представлено применение соединения, раскрытого в настоящем описании, для приготовления лекарственного средства для ингибирования роста CFU-G клеток в животном организме или в клетке при необходимости. Кроме того, предложено соединение, раскрытое в настоящем документе, для применения в ингибировании роста CFU-G клеток в животном организме или в клетке при необходимости.

[00116] Используемый в данном документе термин «CFU-G» относится к колониеобразующим элементарным гранулоцитарным клеткам, которые представляют собой тип кроветворных клеток, продуцирующих гранулоциты, такие как эозинофилы, базофилы и нейтрофилы. «Ингибирование роста» в контексте настоящего описания относится к снижению количества колониеобразующих гранулоцитов минимум на 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или более процентов в сравнении с необработанной контрольной пробой.

[00117] MPA-Br представляет собой соединение с улучшенным связыванием и фармакокинетикой по сравнению с васкулотидом, которое, как было ранее показано, приводит к снижению аллергического эффекта в циркулирующих эозинофилах и базофилах без более общей иммуносупрессии Т-клеток, В-клеток, моноцитов или нейтрофилов. Соответственно, настоящее изобретение также обеспечивает способ восстановления эозинофилов и/или базофилов в животном организме или в клетке при необходимости, включающий введение соединения, раскрытого в данном документе. Изобретение также обеспечивает применение раскрытого здесь соединения для восстановления эозинофилов и/или базофилов в животном организме или в клетке при необходимости. Также представлено применение соединения, раскрытого в данном описании, для приготовления лекарственного средства уменьшающего количество эозинофилов и/или базофилов в животном организме или в клетке при необходимости. Далее представлено соединение, раскрытое в настоящем документе, для применяемое для снижения количества эозинофилов и/или базофилов в животном организме или в клетке при необходимости.

[00118] Используемая здесь фраза «снижение количества эозинофилов и/или базофилов» относится к сокращению количества циркулирующих эозинофилов и/или базофилов, как минимум на 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80 процентов в сравнении с количеством циркулирующих эозинофилов и/или базофилов в контрольной пробе. Кроме того, уменьшение количества базофилов приводит к уменьшению количества лаброцитов, таким образом, уменьшение количества базофилов ведет к сокращению количества лаброцитов.

[00119] Эозинофилы и базофилы участвуют в аллергическом ответе. Кроме того, MPA-Br, как было показано в настоящем документе, ослабляет пропотевание жидкости из сосудов после воздействия гистамина на кожу.

[00120] Соответственно, настоящее изобретение также представляет способ лечения аллергического заболевания или реакции в животном организме или клетке, нуждающейся в этом, включающий введение соединения, раскрытого в данном документе. Изобретение также обеспечивает применение соединения, раскрытого в данном описании, для лечения аллергического заболевания или реакции у животного или клетки, нуждающейся в этом. Также предложено применение соединения, раскрытого здесь, для приготовления лекарственного средства для лечения аллергического заболевания или реакции у животного или клетки, нуждающейся в этом. Кроме того, предложено соединение, раскрытое в данном описании, для применения при лечении аллергического заболевания или реакции у животного или клетки, нуждающейся в этом.

[00121] Используемый в данном документе термин «терапия или лечение» означает подход, позволяющий получить полезные или желаемые результаты, включая клинические результаты. Полезные или желательные клинические результаты могут включать, но не ограничиваются такими как, ослабление или улучшение одного или нескольких симптомов или состояний, уменьшение степени заболевания, стабилизированное (то есть не ухудшающееся) состояние заболевания, предотвращение распространения заболевания, задержка или замедление развития заболевания, улучшение или временное смягчение болезненного состояния и ремиссия (частичная или полная), определяемая или не обнаруживаемая.

[00122] В одном варианте осуществления аллергическое заболевание или ответ представляет собой атопическое заболевание. Используемый в данном документе термин «атопическое заболевание» относится к аллергической чувствительности, затрагивающей части тела, не находящиеся в непосредственном контакте с аллергеном, и определяется увеличением уровня IgE в сыворотке животного. В одном варианте осуществления атопическим заболеванием является атопический дерматит/экзема, астма, конъюнктивит, хронический синусит, эозинофильный эзофагит, пищевая аллергия или аллергический ринит/сенная лихорадка. Астму, аллергический ринит и атопический дерматит обычно называют атопической триадой, в которой во многих случаях атопический дерматит проявляется первым (Eichenfield et al., 2003) и обычно сопровождается развитием астмы и/или аллергического ринита. Соответственно, в одном варианте осуществления атопическое заболевание представляет собой атопический дерматит. В другом варианте осуществления атопическим заболеванием является астма.

[00123] В другом варианте осуществления настоящее изобретение также представляет способ лечения состояния, связанного с эозинофилами и/или базофилами в животном организме или клетке, нуждающейся в этом, включающий введение соединения, раскрытого в данном документе. Изобретение также представляет применение раскрытого здесь соединения для лечения состояния, связанного с эозинофилами и/или базофилами, в животном организме или клетке, нуждающейся в этом. Также представлено применение соединения, раскрытого в данном документе, для приготовления лекарственного средства для лечения состояния, связанного с эозинофилами и/или базофилами, в животном организме или клетке, нуждающейся в этом. Кроме того, соединение, раскрытое в настоящем документе, предложено для использования при лечении состояния, связанного с эозинофилами и/или базофилами, у животного или клетки, нуждающейся в этом. В одном варианте осуществления состояние, связанное с эозинофилами и/или базофилами, представляет собой миелодиспластический синдром. В другом варианте осуществления состояние, связанное с эозинофилами и/или базофилами, представляет собой лейкоз эозинофильного и/или базофильного происхождения, такой как хронический миелоидный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, хронический эозинофильный лейкоз, острый эозинофильный лейкоз, хронический миеломоноцитарный лейкоз с эозинофильным лейкозом и острый базофильный лейкоз. В другом варианте состояние, связанное с эозинофилами и/или базофилами, представляет собой воспалительное заболевание кишечника. В еще одном варианте состояние, связанное с эозинофилами и/или базофилами, представляет собой паразитарную инфекцию. В еще одном варианте состояние, связанное с эозинофилами и/или базофилами, представляет собой идиопатический гиперэозинофильный синдром (HES).

[00124] Настоящее изобретение также относится к способу снижения уровней воспалительных цитокинов и/или хемокинов в животном организме или клетке, нуждающейся в этом, включающему введение соединения, раскрытого здесь. Изобретение также обеспечивает применение соединения, раскрытого в данном документе, для снижения уровней воспалительных цитокинов и/или хемокинов в животном организме или клетке, нуждающейся в этом. Также представлено применение соединения, раскрытого в данном описании, для приготовления лекарственного средства, снижающего уровень воспалительных цитокинов и/или хемокинов в животном организме или клетке, нуждающейся в этом. Кроме того, соединение, раскрытое в данном документе, предложено для применения при снижении уровней воспалительных цитокинов и/или хемокинов в животном организме или клетке, нуждающейся в этом. В одном варианте осуществления уровни воспалительного цитокина и/или хемокина представляют собой уровни воспалительного цитокина и/или хемокина в сыворотке. В одном варианте осуществления воспалительные цитокины и/или хемокины содержат по меньшей мере один эотаксин из: IL-17, MIG, IL12/IL23 (p40), IL-9, MIP-1a, MIP-1b, RANTES, TNF-α, IL-1β, IL-5, IL-13 и MCP-1. В другом варианте осуществления воспалительные цитокины и хемокины включают в себя IL-17, MIG, IL12/IL23 (p40), IL-9, MIP-1a, MIP-1b, RANTES, TNF-α, IL-1β, IL-5, IL-13 и MCP-1. В еще одном варианте осуществления воспалительные цитокины и/или хемокины содержат эотаксин. Такие способы и применения используют в терапии при лечении заболеваний и состояний, связанных с повышенной концентрацией воспалительных цитокинов и/или хемокинов.

[00125] В одном варианте осуществления способы и применения дополнительно включают введение или применение иммуномодулятора или кортикостероида в комбинации с соединением, раскрытым в данном документе.

Грипп

[00126] Показано, что MPA-Br, как и Vasculotide, усиливает клинические проявления и увеличивает смертность при гриппе у мышей, но проявляет эффективность при более низких дозировках.

[00127] Соответственно, в данном документе представлен способ лечения субъекта, инфицированного гриппом, включающий введение соединения, раскрытого в настоящем документе, субъекту, нуждающемуся в этом. Также представлено применение соединения, раскрытого в настоящем документе, для лечения субъекта, инфицированного гриппом. Кроме того, предложено применение соединения, раскрытого здесь, для приготовления лекарственного средства для лечения субъекта, инфицированного гриппом. Еще более важным является раскрытое здесь соединение для применения при лечении субъекта, инфицированного гриппом.

[00128] Настоящее изобретение также обеспечивает способ уменьшения пропотевания жидкости из клетки или легочного эндотелия в животном организме, при инфицировании гриппом, включающий введение соединения, раскрытого в данном документе. Изобретение также обеспечивает применение раскрытого здесь соединения для уменьшения пропотевания жидкости из клетки или легочного эндотелия в животном организме, при инфицировании гриппом, Также представлено применение соединения, раскрытого в настоящем документе, для приготовления лекарственного средства уменьшающего пропотевание жидкости из клетки или легочного эндотелия в животном организме, при инфицировании гриппом. Кроме того, предложено соединение, раскрытое в настоящем документе, применяющееся для уменьшения пропотевания жидкости из клетки или легочного эндотелия в животном организме, при инфицировании гриппом,

[00129] Используемый в данном документе термин «грипп» относится к инфекционному заболеванию, вызываемому РНК-вирусами семейства Orthomyxoviridae. Термин грипп также относится к первичной вирусной пневмонии. В одном варианте осуществления грипп представляет собой заболевание, вызываемое вирусом гриппа человека. Вирусы человеческого гриппа можно отличить от вирусов птичьего гриппа (например, птичьего гриппа H5N1) по отсутствию определенных основных аминокислот в их молекулах гемагглютинина; это ограничивает расщепление трипсиноподобными протеазами, которые содержатся в дыхательных путях. Таким образом, человеческий грипп в первую очередь поражает респираторный эпителий, приводя к его повреждению, апоптозу и десквамации (Kuiken and Taubenberger, 2008). Напротив, вирусы птичьего гриппа могут размножаться вне дыхательных путей и атаковать эндотелиальные клетки. Вирусы человеческого гриппа также можно отличить от вирусов птичьего гриппа на том основании, что вирусы человеческого гриппа могут распространяться от человека к человеку, а вирусы птичьего гриппа не могут распространяться от человека к человеку. Неограничивающие примеры вирусов человеческого гриппа включают следующее: H1N1, H3N2, H2N2 и H1N2.

[00130] Используемый в данном документе термин «пропотевание жидкости из легочного эндотелия» означает потерю целостности барьера или повышенную проницаемость микрососудистого эндотелия легкого. Термин «уменьшение пропотевания жидкости из легочного эндотелия» относится к уменьшению пропотевания жидкости из легочного эндотелия минимум на 5, 10, 15, 25, 50, 75 или 100% по сравнению с контролем, который не подвергался лечению, описанными здесь способами и применениями. В одном варианте осуществления пропотевание жидкости из легочного эндотелия измеряется по трансэндотелиальному электрическому сопротивлению (TEER) или флуоресценции меченного флуоресцеином соединения, такого как декстран. Термин «уменьшение пропотевания жидкости из легочного эндотелия» так же означает снижение проницаемости микрососудистого эндотелия легких минимум на 5, 10, 15, 25, 50, 75 или 100% по сравнению с контролем, который не подвергался лечению, описанными здесь способами и методами.

[00131] Низкодозовая инфекция гриппа предрасполагает эндотелий легкого к повышенному пропотеванию жидкости при последующем воздействии бактерий, явление, известное как праймирование, и ранее было показано, что Васкулотид способен устранить повышенное пропотевание жидкости, вызванное праймированием. Ожидается, что MPA-Br, который обладает улучшенным связыванием рецептора Tie 2 и более низкой дозировкой, необходимой в условиях мышиной модели гриппа, обеспечит аналогичную или улучшенную активность при тех же или более низких дозировках.

[00132] Соответственно, настоящее изобретение также представляет способ лечения бактериальной суперинфекции, связанной с гриппом, у животного или клетки, нуждающейся в этом, включающий введение соединения, раскрытого в данном документе. Изобретение также обеспечивает применение соединения, раскрытого в данном документе, для лечения бактериальной суперинфекции, связанной с гриппом, у животного или клетки, нуждающейся в этом. Также предложено применение соединения, раскрытого в настоящем описании, для приготовления лекарственного средства для лечения бактериальной суперинфекции, связанной с гриппом, у животного или нуждающейся в этом клетки. Кроме того, предложено соединение, раскрытое в данном описании, для применения при лечении бактериальной суперинфекции, связанной с гриппом, у животного или нуждающейся в этом клетки.

[00133] Настоящее изобретение также обеспечивает способ увеличения выживаемости и/или снижения смертности у животного или клетки с бактериальной суперинфекцией, связанной с гриппом, включающий введение соединения, раскрытого в данном документе. Изобретение также обеспечивает использование раскрытого здесь соединения для увеличения выживаемости и/или снижения смертности у животного или клетки с бактериальной суперинфекцией, связанной с гриппом. Также представлено применение соединения, раскрытого в настоящем описании, для приготовления лекарственного средства для увеличения выживаемости и/или снижения смертности у животного или клетки с бактериальной суперинфекцией, связанной с гриппом. Кроме того, представлено соединение, раскрытое в настоящем документе, для применения с целью увеличения выживаемости и/или снижения смертности у животного или клетки с бактериальной суперинфекцией, связанной с гриппом.

[00134] Настоящее изобретение также представляет способ уменьшения пропотевания жидкости из клетки или эндотелия легких у животного с бактериальной суперинфекцией, связанной с гриппом, включающий введение соединения, раскрытого в данном документе. Изобретение также обеспечивает использование раскрытого здесь соединения для уменьшения пропотевания жидкости из клетки или эндотелия легких у животного с бактериальной суперинфекцией, связанной с гриппом. Также представлено применение соединения, раскрытого в настоящем описании, для приготовления лекарственного средства чтобы уменьшить пропотевание жидкости из клетки или эндотелия легких у животного с бактериальной суперинфекцией, связанной с гриппом. Кроме того, предложено соединение, раскрытое в настоящем документе, для применения с целью уменьшения пропотевания жидкости из клетки или эндотелия легких у животного с бактериальной суперинфекцией, связанной с гриппом.

[00135] Используемый в данном документе термин «бактериальная суперинфекция» относится к бактериальной инфекции, которая возникает вторично или обычно после первичной инфекции гриппа, включая инфекцию гриппом в низких дозах. Бактериальная суперинфекция также может быть определена как пневмония, возникающая одновременно или после инфицирования гриппом. В одном варианте осуществления бактерией, вызывающей бактериальную суперинфекцию, является грамположительная бактерия, такая как Staphylococcus aureus (S. aureus) или Staphylococcus pneumonia (S. pneumonia). Без подкрепления какой-либо теорией, считается, что грипп праймирует эндотелий легкого, что делает его более подверженным к пропотеванию жидкости, когда возникает вторичная бактериальная инфекция. В результате бактериальные суперинфекции могут вызывать тяжелые повреждения легких после обычных инфекций гриппа.

[00136] Используемое здесь выражение «бактериальная суперинфекция, связанная с гриппом» в одном варианте осуществления относится к бактериальной суперинфекции, которая происходит одновременно или параллельно с инфекцией гриппа. В другом варианте осуществления выражение «бактериальная суперинфекция, связанная с гриппом» относится к бактериальной суперинфекции, которая возникает после или следует за инфицированием гриппом.

[00137] Современное лечение антивирусными агентами не так эффективно, поскольку проходит некоторое время между первыми проявлениями инфекции и лечением, это является проблемой, поскольку пациенты не всегда проходят терапию сразу после появления симптомов. В отличие от снижающейся эффективности противовирусного лечения, ранее было продемонстрировано, что васкулотид эффективен, даже если вводится с задержкой, а MPA-Br также показал эффективность, когда введение было отложено на 48 часов после заражения.

[00138] Соответственно, в варианте осуществления соединение, раскрытое в данном документе, используется или вводится не ранее чем или примерно через 24 часа после заражения. В другом варианте осуществления соединение, раскрытое в данном документе, используется или вводится не ранее чем или примерно через 48 часа после заражения. В еще одном варианте осуществления соединение, раскрытое в данном документе, используется или вводится не ранее чем или примерно через 72 часа после заражения.

[00139] Ранее было показано, что лечение васкулотидом не снижает эффективность противовирусного лечения и увеличивает выживаемость на мышиной модели первичной вирусной пневмонии и острого повреждения легких, вызванного гриппом. Ожидается, что MPA-Br будет иметь аналогичную или лучшую активность при тех же или более низких дозировках. Соответственно, настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения животного или клетки, инфицированной гриппом, включающий введение (а) соединения, раскрытого в настоящем документе, и (b) противовирусного агента животному или клетке, нуждающимся в этом. Изобретение также обеспечивает использование (а) соединения, раскрытого в данном документе, и (b) противовирусного агента для лечения животного или клетки, инфицированной гриппом. Также предоставлено применение (а) соединения, раскрытого в настоящем документе, и (b) противовирусного агента при приготовлении лекарственного средства для лечения животного или клетки, инфицированной гриппом. Кроме того, представлено (а) соединение, раскрытое в данном документе, и (b) противовирусный агент, применяемый при лечении животного или клетки, зараженной гриппом.

[00140] Настоящее раскрытие также представляет способ увеличения выживаемости и/или снижения смертности у животного или клетки, инфицированной гриппом, включающий введение (а) соединения, раскрытого в настоящем документе, и (b) противовирусного агента. Изобретение также обеспечивает использование (а) соединения, раскрытого в данном документе, и (b) противовирусного агента для увеличения выживаемости и/или снижения смертности у животного или клетки, зараженной гриппом. Также предусмотрено использование (а) соединения, раскрытого в данном документе, и (b) противовирусного агента при приготовлении лекарственного средства для увеличения выживаемости и/или снижения смертности у животного или клетки, зараженной гриппом. Кроме того, представлены (а) соединение, раскрытое в данном документе, и (b) противовирусный агент, применяемые для увеличения выживаемости и/или снижения смертности у животного или клетки, зараженной гриппом.

[00141] Настоящее изобретение также относится к способу снижения пропотевания жидкости из клетки или эндотелия легких у животного, инфицированного гриппом, включающему введение (а) соединения, раскрытого здесь, и (b) противовирусного агента. Изобретение также обеспечивает использование (а) соединения, раскрытого в данном документе, и (b) противовирусного агента для уменьшения пропотевания жидкости из клетки или эндотелия легких у животного, зараженного гриппом. Также предусмотрено использование (а) соединения, раскрытого в данном документе, и (b) противовирусного агента при приготовлении лекарственного средства, уменьшающего пропотевание жидкости из клетки или эндотелия легких животного, инфицированного гриппом. Кроме того, представлено (а) соединение, раскрытое в данном документе, и (b) противовирусный агент применяемый для уменьшения пропотевания жидкости из клетки или эндотелия легких животного, инфицированного гриппом.

[00142] Используемый в данном документе термин «противовирусный агент» применяется к лекарственному средству, используемому для лечения вирусных инфекций, вызванных вирусами гриппа. В одном варианте осуществления противовирусный агент представляет собой агент, который подавляет способность вируса размножаться. Примеры противовирусных агентов включают, но не ограничиваются такими: амантадин, римантадин, занамивир, перамивир, вирамидин, рибавирин и осельтамивир (также известный как Тамифлю^®).

[00143] Используемый в данном документе термин «терапия или лечение» означает подход, позволяющий получить полезные или желаемые результаты, включая клинические результаты. Полезные или желательные клинические результаты могут включать, но не ограничиваются такими как, ослабление или улучшение одного или нескольких симптомов или состояний, уменьшение степени заболевания, стабилизированное (то есть не ухудшающееся) состояние заболевания, предотвращение распространения заболевания, задержка или замедление развития заболевания, улучшение или временное смягчение болезненного состояния и ремиссия (частичная или полная), определяемая или не обнаруживаемая. Используемый в данном документе термин «терапия или лечение» также включает предотвращение или замедление бактериальной суперинфекции, вследствие вирусной инфекции гриппа. Примеры положительных результатов лечения гриппа включают увеличение выживаемости, снижение смертности, уменьшение пропотевания жидкости из эндотелия легких, уменьшение потери веса и/или предотвращение гипотермии и улучшение оксигенации артерий.

[00144] Используемый в данном документе термин «увеличение выживаемости» означает увеличение продолжительности жизни животного после заражения гриппом и/или бактериальной суперинфекцией, связанной с гриппом. В одном варианте осуществления термин «увеличение выживаемости» означает увеличение как минимум на 5, 10, 25, 50, 75, 100, 200% времени выживания животного после заражения гриппом по сравнению с животным, которое не лечили описанными здесь способами и методами.

[00145] Используемый в данном документе термин «снижение смертности» означает снижение уровня смертности животного или клетки при гриппе и/или бактериальной суперинфекции, связанной с гриппом, по сравнению с животным, которое не лечили описанными здесь способами и методами. В одном варианте осуществления уровень смертности уменьшается по меньшей мере на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% по сравнению с животным, которое не лечили описанными здесь способами и методами.

[00146] Термин «введение» включает в себя введение агентов, описанных здесь, животному или клетке in vitro или in vivo.

[00147] Используемый в данном документе термин «субъект» или «животное» включает в себя всех представителей животного мира, в том числе людей.

[00148] Термин «клетка» означает одну клетку, а также множество или популяцию клеток. Введение в клетку означает введение in vitro (или ex vivo), а также in vivo.

[00149] Раскрытое здесь соединение может быть введено любым подходящим способом, включая местно, системно, перорально, интраназально или ингаляцией.

[00150] Противовирусный агент также можно вводить любым подходящим способом, включая, без ограничения, местно, системно, перорально, интраназально или путем ингаляции.

[00151] Раскрытое здесь соединение и противовирусный агент можно вводить параллельно (одновременно). В другом варианте осуществления соединение, раскрытое в данном описании, и противовирусный агент могут вводиться последовательно. Раскрытое здесь соединение может быть введено ранее противовирусного средства или противовирусное средство может быть введено до раскрытого здесь соединения. В одном варианте осуществления соединение, раскрытое в данном документе, используется или вводится через или не ранее чем 24 часа после противовирусного агента. В другом варианте осуществления соединение, раскрытое в данном документе, используется или вводится через или не ранее чем 48 часов после противовирусного агента. В еще одном варианте осуществления соединение, раскрытое в данном документе, используется или вводится через или не ранее чем 72 часа после противовирусного агента.

[00152] Введение «эффективного количества» агентов, описанных здесь, определяется как эффективное количество, в дозировках и в периодах времени, необходимых для достижения желаемого результата. Эффективное количество соединения, раскрытого в данном документе, может варьироваться в зависимости от таких факторов, как стадия заболевания, возраст, пол и вес животного. Эффективное количество противовирусного агента также может варьироваться в зависимости от таких факторов, как стадия заболевания, возраст, пол и вес животного.

[00153] Режимы дозирования могут быть скорректированы для обеспечения оптимального терапевтического ответа. Например, несколько разделенных доз можно вводить ежедневно или дозу можно пропорционально уменьшать, как указано в зависимости от терапевтической ситуации. Способ введения (например, in vivo путем инъекции или местного применения или ex vivo в культуре) также влияет на режим дозирования.

[00154] Способы и применения, описанные здесь, включают введение или применение соединения, раскрытого в данном документе, отдельно или как часть фармацевтической композиции, содержащей соединение, здесь раскрытое.

[00155] В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция, содержащая соединение, раскрытое в настоящем документе, для использования способами, описанными в настоящем документе, дополнительно содержит противовирусный агент и/или второй ангиогенный агент, раскрытый в данном документе. Необязательно, композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

[00156] Такие фармацевтические композиции могут быть использованы для внутриочагового, внутривенного, местного, ректального, парентерального, локального, ингаляционного, интраназального или подкожного, внутрикожного, внутримышечного, интратекального, трансперитонеального, перорального и внутримозгового применения. Композиция может быть в жидкой, твердой или полутвердой форме, например пилюли, таблетки, кремы, желатиновые капсулы, капсулы, суппозитории, мягкие желатиновые капсулы, гели, мембраны, тубулы, растворы или суспензии. Композиция также может быть в форме перфузата.

[00157] Фармацевтические композиции, как таковые, могут быть получены известными способами получения фармацевтически приемлемых композиций, которые можно вводить пациентам, и таким образом, чтобы эффективное количество активного вещества было объединено с фармацевтически приемлемым носителем. Подходящие носители описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 2003 - 20^th Edition) и в Фармакопее США: Национальный формуляр (USP 24 NF19) опубликован в 1999 году.

[00158] Исходя из этого, фармацевтические композиции для применения описанными здесь способами и/или методами включают, но не исключительно, активное соединение или вещество в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями и содержатся в изо-осмотическим растворах, забуференных до подходящего pH как у физиологических жидкостей. Фармацевтические композиции могут дополнительно содержать другие агенты, такие как кортикостероиды и иммуномодуляторы.

[00159] Также представлена композиция, содержащая (а) соединение, раскрытое здесь, и (b) противовирусный агент и/или второй ангиогенный агент, раскрытый здесь. Необязательно, композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

[00160] Кроме того, предложен набор, содержащий (а) соединение, раскрытое здесь, и (b) второй ангиогенный агент, раскрытый здесь. В одном варианте осуществления набор дополнительно содержит контейнер. В другом варианте осуществления набор содержит инструкции по применению для стимуляции ангиогенеза у животного или клетки, нуждающейся в этом, и/или для осуществления способов и применений, описанных здесь.

[00161] Кроме того, представлен набор, включающий (а) соединение, раскрытое в данном документе, и (b) противовирусный агент, как описано в настоящем документе. В одном варианте осуществления набор дополнительно содержит контейнер. В другом варианте осуществления набор содержит инструкции по применению для лечения гриппа у животного или нуждающейся в этом клетки и/или для увеличения выживаемости и/или снижения смертности у животного инфицированного гриппом. В других вариантах осуществления набор содержит инструкции по применению для лечения бактериальной суперинфекции, связанной с гриппом, у животного или нуждающейся в этом клетки. В других вариантах осуществления набор предоставляет инструкции по применению для уменьшения пропотевания жидкости из эндотелия легких у животного, инфицированного гриппом.

[00162] Соединение, раскрытое в настоящем документе, и противовирусный агент или второй ангиогенный агент из набора на могут быть использованы одновременно или последовательно. Соединение, раскрытое в данном документе, может быть использовано перед раскрытым в данном документе противовирусным/вторым ангиогенным средством или противовирусное/второе ангиогенное средство может быть использовано до применения соединения, раскрытого в данном документе.

Биоматериалы

[00163] Раскрытые здесь соединения также могут быть включены в биоматериал, который затем может быть имплантирован в локализацию субъекту, чтобы тем самым обеспечить эффекты данных соединений в этой локализации. Биоматериалы, имеющие матричную или каркасную структуру, пригодны для использования. Соединение может быть включено в состав как отдельно, так и в комбинации с одним или несколькими дополнительными агентами, такими как VEGF, PDGF, G-CSF, рекомбинантный человеческий эритропоэтин, bFGF и фактор роста плаценты (PLGF). Неограничивающие примеры подходящих биоматериалов включают в себя Matrigel, кожные заменители и сшитые гликозаминогликановые гидрогели (например, как описано в Riley, C.M. et al. (2006) J. Biomaterials 27:5935-5943). Соответственно, другой аспект относится к композиции биоматериала, в которую включено раскрытое здесь соединение, отдельно или в комбинации с одним или несколькими дополнительными агентами. Упакованный материал, который содержит биоматериал, также включен в состав. Упакованный материал может быть маркирован соответственно использованному биоматериалу.

[00164] Вышеупомянутое изобретение в общем описывается настоящей заявкой. Более полное понимание может быть получено путем ссылки на следующие конкретные примеры. Эти примеры описаны исключительно с целью иллюстрации и не направлены на ограничение области применения данной заявки. Изменения в форме и замене эквивалентов предусматриваются в зависимости от обстоятельств или целесообразности. Несмотря на то, что здесь использовались конкретные термины, они приведены в описательном смысле, не предназначены для ограничения.

[00165] Следующие, неограничивающие примеры, иллюстрируют настоящее раскрытие:

ПРИМЕРЫ

Результаты

Обнаружение родительского васкулотида и MPA-Br, связанного с гомогенной видоспецифической популяцией рекомбинантных рецепторов с использованием флуоресцентной спектроскопии триптофана.

[00166] Аминокислоты триптофан, тирозин и фенилаланин проявляют собственные флуоресцентные свойства при возбуждении на длине волны 280 нм и, в частности, для триптофана при 295 нм. Этот спектр излучения сильно зависит от структурной конформации белка и его растворителя. Что касается структурной конформации, изменения в спектре, которые происходят вследствие связывания лиганда с его рецептором, были использованы в качестве внутреннего маркера для характеристики дозозависимого связывания. С этой целью для характеристики кинетики связывания были использованы собственные флуоресцентные свойства видоспецифичных белков Tie2Fc и изменения спектров излучения в присутствии родительского васкулотида или MPA-Br.

[00167] Дозозависимое увеличение интенсивности собственной флуоресценции наблюдалось при выдерживании в термостате рекомбинантного человеческого рецептора Tie2Fc и лигандов родительского васкулотида или MPA-Br (Фигура 2А, С). В обоих случаях интенсивность флуоресценции носила насыщаемый характер. Специфический сигнал был получен путем вычитания интенсивности флуоресценции, генерируемой одним лигандом из интенсивности рецепторного и лигандного комплекса. Результирующее Kd для нормализованного специфического связывания родительского васкулотида и MPA-Br с Tie2Fc человека составляет 102,9 нМ и 2,623 нМ с использованием нелинейной регрессии одного сайта-специфического связывания (Фигура 2B, D). Идентичные исследования были выполнены для родительского васкулотида и MPA-Br с рекомбинантным мышиным Tie2Fc и только MPA-Br с рекомбинантной Tie2Fc крысы и яванского макака (сырые данные не показаны). Определенные константы диссоциации (Kd) подробно приведены на Фигуре 2G.

[00168] Учитывая, что рекомбинантный рецептор Tie2 представляет собой слитый белок человеческого IgG Fc, была определена способность рекомбинантного человеческого IgG Fc связываться с родительским васкулотидом или MPA-Br. Примечательно, что никакого дозозависимого увеличения интенсивности флуоресценции не наблюдалось ни для одного лиганда (Фигура 2E, F).

Родительский васкулотид и MPA-Br вызывают фосфорилирование Tie2 и MAPK в HUVEC.

[00169] Потенциал активации Tie2 родительского васкулотида и MPA-Br оценивали в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC). Человеческие эндотелиальные клетки пупочной вены, обработанные различными дозами обоих лигандов, показали увеличение активации Tie2 и нисходящей сигнальной молекулы, MAPK (Фигура 3A, B). В целом, MPA-Br проявлял повышенную величину ответа и более широкий диапазон доз, начиная с более низких концентраций, чем родительский васкулотид; значительно активирует Tie2 в дозах от 10 до 100 нг, по сравнению только с одним значимым ответом при 1000 нг/мл для родительского васкулотида. Обработка родительским васкулотидом и MPA-Br показала характерный колоколообразный ответ на дозу для рецептора Tie2. Этот тип реакции на дозу ранее был отмечен для Tie2-лигандов и, по-видимому, является общим признаком, связанным с активацией этой рецепторной тирозинкиназы (Brkovic A, et al., 2007, Sturn DH, et al., 2005, Murdoch C, et al., 2007, Gruber BL et al., 1995 г. и Maliba R, et al., 2008 г.). Стимуляция человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены либо родительским васкулотидом либо MPA-Br приводила к последующей активации митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK). Человеческий рекомбинантный Ang1 использовали в качестве положительного контроля для исследований активации Tie2 и MAPK.

Родительский васкулотид и MPA-Br индуцируют фосфорилирование Tie2 в HMVEC^tert.

[00170] Исследования активации Tie2, подобные тем, которые подробно описаны выше для человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены (HUVEC), были завершены на эндотелиальных клетках микрососудов человека (кожного происхождения), иммортализованных теломеразой (HMVEC^tert). Хорошо известно, что эндотелиальные клетки из разных сосудистых русел или относительные калибры сосудов ведут себя по-разному, и такие исследования, в которых использовались клетки микрососудистого эндотелия человека (HMVEC^tert), облегчали сравнение в человеческих эндотелиальных клетках различного происхождения. Стимуляция HMVEC^tert указанными концентрациями родительского васкулотида или MPA-Br приводила к дозозависимой активации рецептора Tie2 (Фигура 3А). Опять же, дозозависимый эффект был колоколообразный, с MPA-Br, проявляющим статистически значимую агонистическую активность в концентрациях от 0,2 нг/мл до 10 нг/мл. Активация после стимуляции родительским васкулотидом проявлялась в пять раз более высокой концентрацией и варьировала от 1 нг/мл до 100 нг/мл. Относительная величина активации Tie2 была выше для MPA-Br (примерно 3,3 раза) по сравнению с родительским васкулотидом (примерно 2,6 раза) или рекомбинантным Ang1 человека (800 нг/мл). Повышенная агонистическая активность MPA-Br по сравнению с родительским васкулотидом как в HUVEC, так и в HMVEC^tert может быть функцией улучшенных свойств связывания, показанных для человеческого рецептора Tie2 (см. фигура 2G).

Родительский васкулотид и MPA-Br индуцируют фосфорилирование Tie2 в микрососудистых эндотелиальных клетках легких мыши (MLMVEC).

[00171] В нескольких доклинических исследованиях эффективности, подробно описанных здесь, мышей использовали в качестве тестируемого вида. Таким образом, для более конкретной оценки агонистической удельной активности Tie2 родительского васкулотида и MPA-Br была использована система культивирования клеток in vitro с использованием первичных эндотелиальных клеток легкого мыши (MLMVEC). Родительский васкулотид и MPA-Br продемонстрировали специфические для концентрации дозозависимый эффект в форме колокола. Опосредованная MPA-Br активация Tie2 была очевидна при концентрациях от 10 нг/мл до 5000 нг/мл, в то время как родительский васкулотид способствовал активации Tie2 при концентрациях от 100 нг/мл до 5000 нг/мл. Относительные величины индукции для рецептора Tie2 не различались для родительского васкулотида и MPA-Br, хотя статистически значимая активация Tie2 происходила при концентрации MPA-Br в 10 раз ниже, чем в случае родительского васкулотида.

Родительский васкулотид и MPA-Br индуцируют фосфорилирование Tie2 в первичных эндотелиальных клетках у крысы, собаки и яванского макака.

[00172] Первичные клеточные культуры клубочковых эндотелиальных клеток, эндотелиальных клеток аорты собак и клубочковых эндотелиальных клеток яванского макака стимулировали различными концентрациями MPA-Br. Во всех случаях анализы этих клеточных культур показали MPA-Br-зависимое увеличение активации Tie2. Дозозависимый эффект имел характерную форму колокола, отмеченную в исследованиях эндотелиальных клеток человека и мыши, со статистически значимым увеличением фосфорилирования Tie2-рецептора в пределах от 0,2 нг/мл до 50 нг/мл. Во всех случаях человеческий рекомбинантный Ang1 обеспечивал значительное увеличение исходного фосфорилирования Tie2 (по сравнению с отсутствием лечения (NT)).

Родительский васкулотид и MPA-Br снижают заболеваемость и смертность после воздействия гриппа X31 (H3N2)

[00173] У мышей C57Bl/6J, инфицированных вирусом гриппа (H3N2, 64HAU/мышь), развилась потеря веса (Фигура 6B, C), и он начал погибать через 5-7 дней после заражения. Эффективность родительского васкулотида, вводимого в дозе 100 нг/мышь/день, была предварительно исследована (Sugiyama MG et al., 2015) и была признана неэффективной для повышения выживаемости после заражения мышей C57Bl/6J гриппом X31. Введение родительского васкулотида (500 нг, внутрибрюшинно ежедневно - ранее определенное как оптимальное) или MPA-Br (31,25 нг или 200 нг, внутрибрюшинно ежедневно) значительно улучшало общую выживаемость инфицированных мышей (р меньше 0,001) (Фигура 6А). Кроме того, родительский васкулотид и MPA-Br значительно улучшали оксигенацию легких (SpO2), терморегуляцию и оценку активности Фигура 6 D-I). Было несколько измерений, в которых MPA-Br демонстрировал превосходство над родительским васкулотидом. Эти примеры, в частности, включают защиту от истощения (день 6, MPA-Br 200 нг/день, Фигура 6C) и оксигенацию артерий (день 6, MPA-Br 200 нг/день, Фигура 6E). MPA-Br, введенный в количестве 31,25 нг/мышь/день, представляет собой снижение дозы в 16 раз. Во всех конечных этапах исследования MPA-Br, введенный в дозе 31,25 нг/мышь/день, показал себя на том уровне или лучше чем родительский васкулотид. Это также имело место для MPA-Br 200 нг/мышь/день; снижение дозы в 2,5 раза по сравнению с родительским васкулотидом.

Фармакокинетический анализ родительского васкулотида и MPA-Br у самцов крыс Спрег-Доули

[00174] Указанные количества (мкг/кг) родительского васкулотида и MPA-Br вводили внутривенно путем болюсной инъекции самцам крыс линии Спрег-Доули. Были проведены серийные, рассчитанные по времени заборы крови и подготовлены препараты плазмы для проведения запатентованных иммуноферментных анализов, специально разработанных для количественного определения родительского васкулотида или MPA-Br. Оценка количества тестируемого агента во времени способствовала расчету фармакокинетических (ФК) показателей, включая объем распределения, клиренс и конечный период полураспада (Фигура 7A, B). Доза 120 мкг/кг обеспечила наибольшую чувствительность обнаружения в этих исследованиях и поэтому представленные измерения фармакокинетических показателей относятся к этому конкретному уровню дозы. Родительский васкулотид (Фигура 7В) и MPA-Br (Фигура 7А) демонстрировали аналогичный объем распределения и скорости клиренса, однако MPA-Br циркулировал заметно дольше, чем родительский васкулотид (t^1/2 68 мин против 34 мин). Фармакокинетические показатели MPA-Br оценивали в многодозовом (MD) внутривенном введении в дозе 120 мкг/кг один раз каждые 24 часа в течение трех последовательных дней. Этот конкретный подход к дозированию не отличался от разовой дозы 120 мкг/кг внутривенно, что свидетельствует об отсутствии накопления лекарственного средства при ежедневном приеме.

Родительский васкулотид и MPA-Br снижают пропотевание жидкости из сосудов после кожного воздействия гистамина

[00175] Предыдущие исследования подчеркивали обязательную роль Tie2 в противодействии индукции пропотевания жидкости из сосудов после воздействия гистамина. В частности, мыши, которые имеют генетически дефицитный ангиопоэтин 2, естественный антагонист Tie2, при стимуляции гистамином совершенно не показали пропотевание жидкости из сосудов (Benest AV et al., Plos One, 2013). Таким образом, введение специфического агониста Tie2, как родительский васкулотид и MPA-Br было предположено для ингибирования индуцированного гистамином пропотевания жидкости из сосудов. У самцов мышей FVB, которым давали профилактическую дозу родительского васкулотида или MPA-Br за один час до применения кожного гистамина, наблюдалось значительно меньшее пропотевание жидкости из сосудов, чем у мышей, получавших носитель (инертное вещество) по оценке путем экстравазации индикаторного голубого красителя Эванса (Фигура 8А). Примечательно, что лечение родительским васкулотидом, в оптимальной дозе 500 нг/мышь, показало меньшую эффективность при уменьшении вызванного гистамином пропотевания жидкости из сосудов, чем MPA-Br в равной дозе, или в 4 раза меньше (125 нг/мышь).

Способы и материалы

Получение тетрамерного связывающего пептида Tie 2 (T7) с помощью линкера 3-меркаптопропионовой кислоты (Mpa), обеспечивающего аналог васкулотида Mpa-Br.

[00176] Обзор: Производственный процесс получения Mpa-Br требовал нескольких этапов. На первом этапе пептид Т7 и пептид, полученный из 3-меркаптопропионовой кислоты (Мра), получали с использованием методов твердофазного синтеза пептидов (FMOC). Это позволило получить Mpa-His-His-His-Arg-His-Ser-Phe-OH, который включает пептид T7 с 3-меркаптопропионильным линкером на N-конце (SEQ ID NO: 7). За этим последовало расщепление и снятие защиты, очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ и лиофильная сушка посредством лиофилизации конечного продукта для выделения пептида Mpa-T7 в виде соли TFA. На второй стадии проводили конъюгацию Mpa-пептида с (бромацетимидом)₄-PEG10K с последующим двумя уровнями очистки конъюгата PEG. Первая стадия очистки включает хроматографию ОФ-ВЭЖХ с получением соли TFA, конъюгата Mpa-Br. Этот продукт может быть выделен на данной стадии посредством лиофилизации или противоионом TFA, непосредственно замененного на ацетат в солевой форме, посредством ионообменной хроматографии без выделения промежуточного соединения соли TFA. Этот исходный продукт лиофилизировали, чтобы выделить ацетат Mpa-Br в виде легко сыпучего твердого вещества.

Производство Mpa T7-Пептида

[00177] Шаг 1: Синтез на смоле

[00178] Пептидную последовательность Т7 синтезировали на полистирольной смоле Wang (начальная функционализация 1,2 ммоль/г) с вводом смолы 40 г, используя пептидный синтезатор CS Bio. Смолу Wang загружали с Fmoc-Phe-OH, используя 8 экв. аминокислоты и 4 экв. DIC в ДМФА на 4 часа. Тест загрузки Fmoc показал, что загрузка 0,8 ммоль/г была достигнута, что соответствует синтезу в масштабе 45,4 ммоль. Все аминокислоты были поочередно пришиты, используя реагент DIC/Oxyma (3 экв., 136,2 ммоль), 0,5 М Ac₂O/DMF использовали для защиты и 20% пиперидин/DMF для снятия защиты Fmoc. Пробное расщепление было выполнено после завершения пептидной последовательности Т7, и анализ ОФ-ВЭЖХ показал, что последовательность была успешно синтезирована с чистотой 77,5%.

[00179] Связывание Mpa (Sigma-Aldrich, США) со связанным со смолой пептидом T7 осуществляли используя 3 экв. Trt-Mpa-OH в присутствии 3 экв. DIC/Oxyma в DMF в течение 4 часов. После промывки смолы (от DMF, МеОН и МТВЕ) и сушки в течение ночи в вакуумном эксикаторе было получено 124,5 г конечной смолы (масса сорбированного вещества 84,5 г), что соответствует выходу синтеза 89,1%. Пробный анализ расщепления показал, что черновой пептид Mpa-T7 был получен с чистотой 78,5%. Анализ МС-ИЭР подтвердил, что Mpa-пептид образовался (наблюдаемое значение МС = 1044,4).

[00180] Шаг 2: Расщепление и снятие защиты

[00181] Связанный со смолой пептид Mpa-T7 обрабатывали раствором для расщепления следующего состава - TFA/TIS/вода/EDT (92,5: 2,5: 2,5: 2,5), в течение 3 часов. Пептид осаждали антирастворителем (iPr₂O) и отделяли фильтрованием, получая сырой продукт. Связанный со смолой пептид Mpa-T7 расщепляли с получением 31,5 г сырого пептида, что соответствует общему выходу 38% и выходу 91,8%. Анализ неочищенного продукта с помощью ОФ-ВЭЖХ показал, что чистота неочищенного продукта составляла 70,5%.

[00182] Шаг 3: Очистка

[00183] Неочищенный пептид Mpa-T7 (24 г) разбавляли буфером A (15 мМ TEAP) и очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ на колонке Luna C18(3) PREP 250×50 мм Phenomenex с градиентом 5-10% буфера B (20%). MeCN/вода) и скоростью потока 88 мл/мин. Пул продуктов очищенных от TEAP объединяли и разводили в соотношении 1 к 5 0,5% раствора TFA/вода. Половину раствора пептида загружали обратно в колонку для очистки и продукт сначала промывали на колонке с элюированием раствором водой/MeCN (10%), содержащим 0,5% TFA, перед тем как буфер B заменяли 0,1% TFA в MeCN и продукт элюировали, применяя градиент 20-60% B. Эту стадию повторяли с оставшимся раствором пептида, объединяли продукты и лиофилизировали с получением 11,4 г пептида Mpa-T7 в виде соли TFA, что соответствует общему выходу 43,7% на стадии загрузки смолы. Окончательный анализ показал содержание пептида 61% и чистоту ОФ-ВЭЖХ 96,2 %, что соответствует 6,7 г чистого пептида (выход 25,8%).

Производство Mpa-Br конъюгата

[00184] Шаг 1: Конъюгация

[00185] Реакцию конъюгации проводили путем растворения соли TFA пептида Mpa-T7 (2 ммоль) и (бромацетимида)₄-PEG10K (JenKem, США, 0,48 ммоль) в буферном растворе дигидрофосфата натрия (100 мМ, рН 8) содержащем 0,13 М NaCl (120 мл). pH реакционного раствора был равен 6,5 и реакционную смесь перемешивали при 30°C в течение 22 часов. Ход реакции контролировали с помощью ОФ-ВЭЖХ и проводили до превращения приблизительно 58% 4-замещенного тетрамера бромацетимида в полностью конъюгированный продукт. По завершении реакции сырая смесь содержала порядка 30% 3-замещенных и примерно 7% 2-замещенных промежуточных продуктов. Было получено небольшое количество 1-замещенного продукта.

[00186] Шаг 2: Очистка соли Mpa-Br TFA

[00187] Реакционную смесь разбавляли буфером A (вода + 0,1% TFA) в соотношении 1:1 и проводили очистку, собирая фракции по 10 мл, используя колонку Luna C18(3) PREP 250×30 мм с градиентом 10-75% буфера B (MeCN:вода - 60:40 + 0,1% TFA) и скорости потока 42 мл/мин. Продукт, выделенный лиофилизацией на этой стадии, дает соль TFA Mpa-Br с выходом около 45% и чистотой более 99% с помощью ОФ-ВЭЖХ.

[00188] Шаг 3: Mpa-Br противоионный обмен

Конъюгат Mpa-Br с противоионом TFA представляет из себя аморфный материал с воскообразной/тягучей консистенцией. Для того чтобы определить физические характеристики, солевой обмен осуществляли непосредственно из очищенных ОФ-ВЭЖХ фракций соли Mpa-Br TFA, полученных, как описано в шаге 2. Перед лиофилизацией фракции объединяли (примерно 500 мл) и разбавляли водой в соотношении 1:1, раствор загружали в колонку ОФ-ВЭЖХ и отбирали, используя процесс ацетатного обмена в колонке Luna C18(3) PREP 250×30 мм с скоростью потока 42 мл/мин, собирая фракции по 10 мл после следующих этапов: выход колонки на равновесие (0,5М NH₄OAc, содержащим 1% АсОН), загрузка образца с последующим процессом обмена (0,5М NH₄OAc, содержащим 1% АсОН), стадия удаления ацетата аммония (1% АсОН, буфер А и MeCN, буфер В, 10% B) и процесс элюирования (1% AcOH, буфер A и MeCN, буфер B, 10-50% B). Продукты объединяли и лиофилизировали с получением ацетатной соли Mpa-Br в виде свободно сыпучего кристаллического твердого вещества. Анализ показал 100%-ную чистоту с помощью ОФ-ВЭЖХ, соответствующую полностью замещенному пептидному конъюгату Mpa-Br с общим выходом 42,1%. Анализ конъюгата на остаточный бром (Br) с помощью ионной хроматографии подтвердил содержание брома менее 0,1%, что указывает на полное замещение 4-замещенного бромацетимид-ПЭГ тетрамера. Дополнительный анализ ацетатной соли Mpa-Br также проведенный с помощью ИХ, показал, что чистота ацетатной соли Mpa-Br составляет 90,0%.

Флюоресцентная спектроскопия триптофана:

[00189] Взаимодействие лиганда и рецептора. 2-кратную концентрацию каждого лиганда (родительский васкулотид и MPA-Br) готовили в объеме 25 мкл и смешивали с 25 мкл 2-кратной концентраций Tie2Fc-рецептора для получения 1-кратной концентрации лиганда и рецептора в конечном объеме 50 мкл. Концентрации лиганда должны быть достаточно высокими, чтобы достичь насыщения связывания рецептора. Образцы анализировали при температуре окружающей среды с помощью спектрофотометра SpectraMaxM2, установлена длина волны возбуждения 295 нм, начало эмиссии наблюдалось при длине волны 360 нм, а окончание при длине волны 450 нм с установленным интервалом считывания 10 нм и автоматическим микшированием в течение 5 секунд перед считыванием. Данные были скомпилированы с использованием SoftMax и проанализированы с использованием Prism.

[00190] Рецепторы и лиганды. Рекомбинантные рецепторы были приобретены у R&D Systems (рекомбинантный Tie-2Fc человека, R&D Systems), рекомбинантный Tie-2Fc мыши у R&D Systems, рекомбинантный Tie2-FC крысы у R&D Systems и рекомбинантный Tie2-FC яванского макака у SinoBiological. Лиганды были изготовлены компанией Bachem (родительский васкулотид и MPA-Br). Негативный контроль IgG-FC был проведен R&D Systems. Оба рецептора и лиганды были ресуспендированы в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS, GE Life Sciences-HyClone).

Фосфорилирование Tie2 HUVEC:

[00191] Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) высевали на 100-миллиметровые планшеты для тканевых культур в полную базальную питательную среду для выращивания эндотелиальных клеток (EBM)(Lonza) с добавлением «одиночных квот EGM» (Lonza) в атмосфере 20% O₂, 5% CO₂ при температуре 37°C в камере влажности, в соответствии с рекомендациями производителя. Клетки, которые достигли 90% слияния, стимулировали в течение 15 минут с указанными концентрациями родительского васкулотида, MPA-Br или ангиопоэтина-1 (R&D Systems) в полной питательной среде EBM. После 15-минутной стимуляции клетки помещали на лед и дважды промывали в ледяном фосфатно-солевом буфере (PBS). Клеточные лизаты готовили для использования в буфере для лизиса IC12 (1% NP-40, 20 мМ Tris (рН 8,0), 137 мМ NaCl, 10% глицерин, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ активированный ортованадат натрия). Набор для концентрации белка (с помощью BCA) использовали для измерения концентрации белка в каждом лизате в соответствии с инструкциями производителя (Thermo Scientific). Образцы подвергали анализу ИФА, в котором измеряли уровни фосфорилированного Tie2 и общего Tie2 в соответствии с протоколом производителя. Белок весом 20 мкг или 5 мкг из каждого образца загружали в двух экземплярах для отсчетов фосфорилированного Tie2 и общего Tie2 соответственно. Соотношения фосфорилированный Tie2:общий Tie2 были определены для каждого образца. Уровень фосфорилирования Tie2 для всех групп лечения затем нормализовали до уровня группы без лечения (только NT, полная EBM) в каждом эксперименте.

MAPK фосфорилирование HUVEC:

[00192] HUVEC культивировали, как указано выше. Лизаты готовили в (1 мМ ЭДТА, 0,5% Triton Х-100, 6М мочевина, 5 мМ NaF, 100 мМ PMSF, 25 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ ортованадат натрия, рН 7,2-7,4, 1x cOmplete™ mini EDTA свободный от ингибитора протеазы). Набор для определения концентрации белка (с помощью BCA) использовали для измерения концентрации белка в каждом лизате в соответствии с инструкциями производителя (Thermo Scientific). Проводили ИФА образцов, который показывал уровни фосфорилированной MAPK и общей MAPK в соответствии с протоколом производителя (R&D Systems). 20 мкг или 10 мкг белка из каждого образца загружали в двух экземплярах для измерений фосфорилированной MAPK и общей MAPK соответственно. Соотношения фосфорилированная MAPK:общая MAPK, были определены для каждого образца. Уровень фосфорилирования MAPK для всех групп лечения затем нормализовали до уровня группы без лечения (NT, только EBM) в каждом эксперименте.

Фосфорилирование Tie2 HMVEC^tert:

[00193] Микрососудистые эндотелиальные клетки человека (кожного происхождения), иммортализованные обратной транскриптазой/каталитической субъединицей теломеразы человека (tert), Shao и Guo (2004) высевали на 100-миллиметровые планшеты для тканевых культур в полную питательную среду для выращивания эндотелиальных клеток (EBM-2)(Lonza) и культивировали в атмосфере 20% O₂, 5% CO₂ при температуре 37°C во влажной камере. Среда для выращивания состояла из EBM-2, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, 1X pen/strep, 1 мкг/мл гидрокортизона и 100 нг/мл EGF. Клетки, которые достигли 90% слияния, стимулировали в течение 15 минут с указанными концентрациями родительского васкулотида, MPA-Br или ангиопоэтина-1 в плотной питательной среде EBM-2. После 15-минутной стимуляции клетки помещали на лед и дважды промывали в ледяном фосфатно-солевом буфере (PBS). Клеточные лизаты готовили для использования в буфере для лизиса IC12 (1% NP-40, 20 мМ Tris (рН 8,0), 137 мМ NaCl, 10% глицерин, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ активированный ортованадат натрия). Набор для определения концентрации белка (с помощью BCA) использовали для измерения концентрации белка в каждом лизате. Образцы подвергали ИФА, измеряя pYTie2 и общую концентрацию Tie2. 20 мкг белка из каждого образца загружали в каждую лунку, каждый образец тестировали в двух экземплярах. Относительные соотношения pTie2 к общему количеству Tie2 были определены для каждого образца. Уровень фосфорилирования Tie-2 в каждой группе, получавшей лечение, был нормализован относительно группы, получавшей EBM, в каждом эксперименте.

Фосфорилирование Tie2 первичных эндотелиальных клеток легкого мыши

[00194] Первичные эндотелиальные клетки легкого мыши (Cell Biologics) высевали на 100-миллиметровые планшеты для тканевых культур в полную питательную среду для выращивания эндотелиальных клеток (EBM)(Lonza) с добавлением «единичных квот EGM» (Lonza). Клетки, которые достигли 90% слияния, стимулировали в течение 15 минут с указанными концентрациями родительского васкулотида, MPA-Br или ангиопоэтина-1 (R&D Systems) в полной питательной среде EBM. После 15-минутной стимуляции клетки помещали на лед и дважды промывали в ледяном фосфатно-солевом буфере (PBS). Клеточные лизаты готовили для использования в буфере для лизиса IC12 (1% NP-40, 20 мМ Tris (рН 8,0), 137 мМ NaCl, 10% глицерин, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ активированный ортованадат натрия). Набор для концентрации белка (с помощью BCA) использовали для измерения концентрации белка в каждом лизате в соответствии с инструкциями производителя (Thermo Scientific). Проводили ИФА образцов, который показывал уровни фосфорилированной Tie2 и общей Tie2 в соответствии с протоколом производителя (Tie2 мыши, R&D Systems). Белок весом 50 мкг или 5 мкг из каждого образца загружали в трех экземплярах для отсчетов фосфорилированного Tie2 и общего Tie2 соответственно. Соотношения фосфорилированный Tie2:общий Tie2 были определены для каждого образца. Уровень фосфорилирования Tie2 для всех групп лечения затем нормализовали до уровня группы без лечения (NT, только полная EBM) в каждом эксперименте.

Фосфорилирование Tie2 первичных гломерулярных эндотелиальных клеток крысы

[00195] Первичные гломерулярные эндотелиальные клетки крысы (Cell Biologics) выращивали в полной питательной среде для выращивания эндотелиальных клеток крысы /w набор (Cell Biologics) в камере увлажнения с 20% O₂, 5% CO₂ при температуре 37°C и разделяли в соотношении 1:3 после достижения слияния 80-90%. Чтобы исследовать активацию Tie2 MPA-Br в клубочковых эндотелиальных клетках почек крыс, стимулировали 95-100% сливающихся клеток, указанными концентрациями тестируемого агента в содержащей сыворотку среде, в течение 15 минут. Человеческий Ang-1 (R&D Systems) использовали в качестве положительного контроля. Клеточные лизаты собирали с использованием буфера для лизиса IC12 (подробно описано выше), рекомендованного в наборе ИФА для фосфо-Tie-2 человека (R&D Systems), фосфорилированный тирозин Tie2 и общий Tie2 измеряли с использованием ИФА (наборы ИФА для фосфо-Tie2 человека и общего Tie2 человека, R&D Systems) с заменой захватывающего антитела, подтвержденного для крысиного Tie2. Мышиное антитело к Tie2 (BD Pharmingen™) и кроличьи поликлональные антитела TEK (MyBioSource) использовали в качестве захватывающего антитела в pTie2 и в общем анализе Tie2 ИФА соответственно. Уровень фосфорилирования Tie2 для всех групп лечения затем нормализовали до уровня группы без лечения (NT, полная питательная среда для выращивания эндотелиальных клеток крысы) в каждом эксперименте.

Tie2 фосфорилирование первичных эндотелиальных клеток аорты собаки:

[00196] Первичные эндотелиальные клетки аорты собаки (Cell Biologics) выращивали в полной питательной среде для выращивания эндотелиальных клеток собаки /w набор (Cell Biologics) в камере увлажнения с 20% O₂, 5% CO₂ при температуре 37°C и разделяли в соотношении 1:3 после достижения слияния 80-90%. Исследования активации Tie2, выполненные на первичных гломерулярных эндотелиальных клетках яванского макака, проводили в соответствии с подходами, подробно описанными выше для исследований первичных гломерулярных эндотелиальных клеток крыс.

Фосфорилирование Tie2 первичных гломерулярных эндотелиальных клеток яванского макака:

[00197] Первичные гломерулярные эндотелиальные клетки яванского макака (Cell Biologics) культивировали в соответствии с данными, представленными выше для HMVEC^tert. Исследования активации Tie2, выполненные на первичных гломерулярных эндотелиальных клетках яванского макака, проводили в соответствии с подходами, подробно описанными выше для исследований первичных гломерулярных эндотелиальных клеток крыс.

Кожная провокационная проба с гистамином:

[00198] Самцов FVB мышей 10-недельного возраста закупали в Jackson Laboratories. Мышей содержали в виварии на стандартном цикле свет : темнота и давали свободный доступ к еде и воде. В день 0 мышей анестезировали изофлураном и всю дорсальную область брили электробритвой. Остаточные волосы были удалены с помощью крема для депиляции. Остатки крема удаляли стерильной марлей и водой. В день 4 мыши получали либо контрольный носитель (стерильный PBS), родительский васкулотид, либо MPA-Br в виде 200-мкл внутрибрюшинной инъекции. Через один час после введения мышам PBS/родительского Vasculotide/MPA-Br их анестезировали изофлураном, после чего 100 мкл 1% голубого красителя Эванса (содержащегося в стерильном PBS) вводили внутривенно через хвостовую вену. Сразу же после введения голубого красителя Эванса и еще под наркозом делали одну инъекцию PBS (дорсальную, внутрикожную, 50 мкл) и три одинаково расположенные инъекции гистамина (дорсальная, внутрикожная, 1,25 мкг, содержащиеся в 50 мкл). Как только внутрикожные инъекции были завершены, мышей вывели из наркоза и поместили обратно в их клетки на 25 минут.

[00199] Трансперфузия сердца

После 25 минут воздействия гистамина мышей помещали под наркоз соответствующим объемом 2,5% авертина (100 мкл/10 г. массы тела посредством внутрибрюшинной инъекции). После того, как была достигнута стадия глубокой анестезии, мышей закрепили в положении лежа на спине, грудную клетку открыли хирургическим путем, обнажили сердце и в левый желудочек установили катетер, заканчивающийся иглой 23 размера. Как только катетер был надежно закреплен, был произведен разрез в правом предсердии и через катетер под давлением 100 мм рт. ст. ввели 25 мл холодного PBS для вымывания всего внутрисосудистого голубого красителя Эванса. После того, как мышь эффективно перфузировали, спинную кожу удаляли хирургическим путем. Четыре 12-миллиметровых биоптата кожи (1PBS, 3 гистамина) были собраны у каждой мыши по стандартизированной методике. Во всех случаях PBS биопсия, служила в качестве исходного контроля для данной мыши.

[00200] Количественная оценка экстравазации голубого красителя Эванса. Биоптаты кожи помещали в маркированные пробирки, а затем в печь с температурой 60°C на 16 часов для удаления всей влаги. Биоптаты высушенной кожи взвешивали, помещали в пробирки, содержащие 1,5 мл формамида, затем помещали в водяную баню с температурой 60°C на 72 часа. Через 72 часа пробирки центрифугировали при относительной центробежной силе (RCF) 500 и 100 мкл образца удаляли на 96-луночный планшет с плоским дном для микротитрования и проведении анализа при длине волны 620 и 405 нм. Стандартная кривая концентрации голубого красителя Эванса, охватывающая высокие и низкие экспериментальные данные, была построена таким образом, чтобы можно было рассчитать величину экстравазации голубого красителя Эванса (мкг/г кожи).

Исследование гриппа:

[00201] Экспериментальный дизайн. Были приобретены мыши C57BL/6J четырнадцати недельного возраста (Jackson Laboratories). Мышей содержали в виварии на стандартном цикле свет : темнота и давали свободный доступ к еде и воде. Во всех экспериментах мышей седатировали 5%-ным изофлюраном и интраназально инфицировали вирусом гриппа (см. Раздел «Вирус» ниже), разведенным в PBS до конечного объема 80 мкл. После заражения мышей разделили на контрольные и лечебные группы, соответствующие по весу; в каждой группе экспериментального лечения использовали десять мышей, их инфицировали 64 гемоагглютинирующими единицами (HAU) вируса гриппа, что к 7 дню привело к 100% смертности. Следующие группы были исследованы: мыши, которые получали только вирус гриппа (Flu), инфицированные мыши, которые также получали родительский васкулотид (500 нг в 0,1 мл PBS путем внутрибрюшинной инъекции) или MPA-Br (200 нг или 31,25 нг в 0,1 мл PBS путем внутрибрюшинной инъекции). Терапия родительским васкулотидом или MPA-Br начиналась через 48 часов после заражения и проводилась один раз каждые 24 часа на протяжении всего исследования. Контрольные мыши (грипп) получали ежедневную внутрибрюшинную инъекцию 0,1 мл PBS, начиная с 48 часов после заражения, на протяжении всего исследования.

[00202] Вирус. Вирус A гриппа HKx31 (H3N2) был первоначально получен от доктора Tania Watts и размножен в соответствии с Szretter, K.J., Balish, A.L. & Katz, J.M., 2006. Титр вируса из культурального супернатанта определяли, выполняя стандартный налетообразующий анализ в клетках MDCK (клетки Мадни-Дарби почек собаки) или путем измерения агглютинации эритроцитов овцы (единицы гемагглютинина, HAU).

[00203] Пульсоксиметрические измерения. Насыщение артериальной крови кислородом измеряли с помощью устройства и программного обеспечения Mouse Ox Plus (Starr Life Sciences, Oakmont, PA) у бодрствующих (не анестезированных) мышей с использованием зажимов с маленьким воротником для C57BL/6J. У мышей C57BL/6J химический депиляционный крем использовали для удаления волос вокруг основания шеи за несколько дней до заражения. Для измерений SO2 мышам позволяли привыкнуть к зажиму воротника в течение нескольких минут в их клетке перед записью максимального измерения SO2.

Правила оценки активности

[00204] Мышей наблюдали два раза в день, взвешивали один раз в день и присваивали им балл активности от 1 до 5. Чтобы получить оценку 5, мышь должна проявлять нормальное активное и любопытное поведение. Она движется вдоль границы клетки и становится на решетку. Для присвоения оценки 4 мышь должна быть не так активна. Она не встает так часто и предпочитает оставаться в углах клетки. При значении 3 мышь менее активна и когда она часто останавливается и садится при движении. Она остается в углу гнезда. При значении 2 мышь перемещается только при касании и только на короткое расстояние. Она старается прятаться в углу гнезда. Наконец, при значении 1 мышь агонирует. Оценки активности 5-3 считаются приемлемыми. Мыши, имеющие показатель активности 2, тщательно контролировались, и если их активность снижалась ниже 2 баллов, ими жертвовали. Кроме того, мышей, которые испытывают потерю веса более чем на 30%, независимо от приемлемого в других отношениях показателя активности, подвергали эвтаназии.

[00205] Общие методики реакции Майкла

[00206] Активированный тетрамер PEG (такой как винилсульфон или акрилат) (117-118 мг, 1 экв.) и Mpa-пептид (100 мг, 1,5 экв.) добавляли в 50 миллилитровую круглодонную колбу, защищенную от света, и PBS (pH 6,5*, 20 мл) добавляли до конечной концентрации пептида 5 мг/мл. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре, рН проверяли, используя рН-метр и ход реакции контролировали с помощью ВЭЖХ через различные промежутки времени. Реакционную смесь подкисляли до рН 3,5 перед очисткой, используя следующие стадии:

Шаг 1 Flash LC:

Колонка: Обращенно-фазовая C18, Fuji, , 40 г, колонка 30 мкм (по индивидуальному заказу).

Градиентный профиль: 10-100 % B за 63 минуты

Элюенты: Элюент А = 0,1% TFA в воде

Элюент B = 0,1% TFA в 60% ацетонитрила, 40% воды

Обнаружение: УФ (λ = 210 нм / 254 нм)

Температура колонки: КТ

Скорость потока: 40 мл/мин

Шаг 2: препаративная ВЭЖХ:

Колонка: Обращенно-фазовая C18, Daiso Bio C18, , 10 мкм 25 мм × 250 мм (по индивидуальному заказу).

Градиентный профиль: 45-100% B за 77 минуты

Элюенты: Элюент А = 0,1% HFBA в 3% ацетонитриле в воде

Элюент B = 0,1% HFBA в 60% ацетонитрила, 40% воды

Обнаружение: УФ (λ = 210 нм)

Температура колонки: КТ

Скорость потока: 30 мл/мин

Шаг 3: препаративная ВЭЖХ:

Колонка: Обращенно-фазовая C18, Daiso Bio C18, , 10 мкм 25 мм × 25 мм (по индивидуальному заказу).

Градиентный профиль: 40-100 % B за 84 минуты

Элюенты: Элюент А = 0,1% TFA в воде

Элюент B = 0,1% TFA в 60% ацетонитрила, 40% воды.

Выход конъюгата винилсульфон-ПЭГ составляет 48 мг, а конъюгата акрилат-ПЭГ - 15,2 мг, оба в виде солей TFA.

Хотя настоящее изобретение было описано со ссылкой на то, что в настоящее время считается примерами, следует понимать, что изобретение не ограничивается раскрытыми примерами. Напротив, изобретение предназначено для охвата различных модификаций и эквивалентных устройств, включенных в сущность и объем прилагаемой формулы изобретения.

Все публикации, патенты и патентные заявки включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка были специально и индивидуально указаны для включения в качестве ссылки во всей своей полноте.

ЛИТЕРАТУРА

Berge SM, Bighley LD, Monkhouse DC, "Pharmaceutical salts" J Pharm Sci. 1977 Jan; 66(1):1-19.

Bourdeau A, Van Slyke P, Kim H, Cruz M, Smith T, Dumont DJ, "Vasculotide, an Angiopoietin-1 mimetic, ameliorates several features of experimental atopic dermatitis-like disease" BMC Res Notes. 2016 May 28; 9:289.

Brkovic A, Pelletier M, Girard D, Sirois MG, "Angiopoietin chemotactic activities on neutrophils are regulated by PI-3K activation" J Leukoc Biol. 2007 Apr; 81(4):1093-101.

Cho CH, Kammerer RA, Lee HJ, Steinmetz MO, Ryu YS, Lee SH, Yasunaga K, Kim KT, Kim I, Choi HH, Kim W, Kim SH, Park SK, Lee GM, Koh GY, "COMP-Ang1: a designed angiopoietin-1 variant with nonleaky angiogenic activity" Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Apr 13; 101(15): 5547-52.

Eichenfield LF, Hanifin JM, Beck LA, Lemanske RF Jr, Sampson HA, Weiss ST, Leung DY, "Atopic dermatitis and asthma: parallels in the evolution of treatment" Pediatrics. 2003 Mar; 111(3): 608-16.

Gruber BL, Marchese MJ, Kew R, "Angiogenic factors stimulate mast-cell migration" Blood. 1995 Oct 1; 86(7): 2488-93.

Kim W, Moon SO, Lee SY, Jang KY, Cho CH, Koh GY, Choi KS, Yoon KH, Sung MJ, Kim DH, Lee S, Kang KP, Park SK, "COMP-angiopoietin-1 ameliorates renal fibrosis in a unilateral ureteral obstruction model" J Am Soc Nephrol. 2006 Sep; 17(9): 2474-83.

Kuiken T, Taubenberger JK, "Pathology of human influenza revisited" Vaccine. 2008 Sep 12; 26 Suppl 4:D59-66.

Maliba R, Brkovic A, Neagoe PE, Villeneuve LR, Sirois MG, "Angiopoietin-mediated endothelial P-selectin translocation: cell signaling mechanisms" J Leukoc Biol. 2008 Feb; 83(2): 352-60.

Murdoch C, Tazzyman S, Webster S, Lewis CE, "Expression of Tie-2 by human monocytes and their responses to angiopoietin-2" J Immunol. 2007 Jun 1; 178(11): 7405-11.

Parikh SM, "Dysregulation of the angiopoietin-Tie-2 axis in sepsis and ARDS" Virulence. 2013 Aug 15; 4(6): 517-24.

Riley CM, Fuegy PW, Firpo MA, Shu XZ, Prestwich GD, Peattie RA "Stimulation of in vivo angiogenesis using dual growth factor-loaded crosslinked glycosaminoglycan hydrogels" Biomaterials. 2006 Dec; 27(35): 5935-43.

Stypmann J, Van Slyke P, Dumont DJ, Spieker T, Buscher K, Reuter S, Goerge T, "The Synthetic Tie2 Agonist Peptide Vasculotide Protects Renal Vascular Barrier Function In Experimental Acute Kidney Injury" Sci Rep. 2016 Feb 25; 6:22111.

Shao R, Guo X, "Human microvascular endothelial cells immortalized with human telomerase catalytic protein: a model for the study of in vitro angiogenesis" Biochem Biophys Res Commun. 2004 Sep 3; 321(4):788-94.

Sturn DH, Feistritzer C, Mosheimer BA, Djanani A, Bijuklic K, Patsch JR, Wiedermann CJ, "Angiopoietin affects neutrophil migration" Microcirculation. 2005 Jul-Aug; 12(5):393-403.

Sugiyama MG, Armstrong SM, Wang C, Hwang D, Leong-Poi H, Advani A, Advani S, Zhang H, Szaszi K, Tabuchi A, Kuebler WM, Van Slyke P, Dumont DJ, Lee WL, " The Tie2-agonist Vasculotide rescues mice from influenza virus infection" Sci Rep. 2015 Jun 5; 5:11030.

Szretter KJ, Balish AL, Katz JM, "Influenza: propagation, quantification, and storage" Curr Protoc Microbiol. 2006 Dec; Chapter 15: Unit 15G.1.

Thamm K, Njau F, Van Slyke P, Dumont DJ, Park JK, Haller H, David S, "Pharmacological Tie2 activation in kidney transplantation" World J Transplant. 2016 Sep 24; 6(3):573-82.

Tournaire R, Simon MP, le Noble F, Eichmann A, England P, , "A short synthetic peptide inhibits signal transduction, migration and angiogenesis mediated by Tie2 receptor" EMBO Rep. 2004 Mar; 5(3): 262-7.

Van Slyke P, Alami J, Martin D, Kuliszewski M, Leong-Poi H, Sefton MV, Dumont D "Acceleration of diabetic wound healing by an angiopoietin peptide mimetic" Tissue Eng Part A. 2009 Jun; 15(6): 1269-80.

Wu X, Zhao R, Li Z, Yao M, Wang H, Han J, Qu S, Chen X, Qian L, Sun Y, Xu Y, Gu J, "A novel small peptide as a targeting ligand for receptor tyrosine kinase Tie2" Biochem Biophys Res Commun. 2004 Mar 19; 315(4): 1004-10.

Zhang ZG, Zhang L, Croll SD, Chopp M, "Angiopoietin-1 reduces cerebral blood vessel leakage and ischemic lesion volume after focal cerebral embolic ischemia in mice" Neuroscience. 2002; 113(3): 683-7.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Vasomune Therapeutics Inc.

Sunnybrook Research Institute

АГЕНТ, СПОСОБСТВУЮЩИЙ АНГИОГЕНЕЗУ И МЕТОДЫ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

<130> 23632-P52201PC00

<150> 62/446 030

<151> 13.01.2017

<160> 7

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 1

His His His Arg His Ser Phe

1 5

<210> 2

<211> 22

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 2

Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln Arg

1 5 10 15

Thr Trp Lys Glu Tyr Lys

20

<210> 3

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 3

Asn Leu Leu Met Ala Ala Ser

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 4

Lys Leu Trp Val Ile Pro Lys

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 5

His Pro Trp Leu Thr Arg His

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 6

Cys His His His Arg His Ser Phe

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<220>

<221> ПРОЧНЫЙ_ПРИЗНАК

N-конец имеет МрА

<400> 7

His His His Arg His Ser Phe

1 5

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новому агенту для стимуляции ангиогенеза у субъекта, и может быть использовано в медицине. Изобретение позволяет получить химическое соединение, представляющее собой тетрамерную форму пептида His-His-His-Arg-His-Ser-Phe, линейно связанного с фрагментами ПЭГ с образованием указанной мультимерной формы. Изобретение может быть использовано в медицинской практике в качестве агента, стимулирующего ангиогенез и способствующего заживлению ран у субъекта. 16 н. и 25 з.п. ф-лы, 8 ил., 20 пр.

1. Соединение формулы (I):

где

n представляет собой целое число от 50 до 60 или около 55; а также

R представляет собой His-His-His-Arg-His-Ser-Phe (SEQ ID NO: 1);

или его фармацевтически приемлемая соль, предназначенное для активации рецептора Tie 2 и/или стимуляции ангиогенеза.

2. Фармацевтическая композиция для активации рецептора Tie 2 и/или стимуляции ангиогенеза, содержащая эффективное количество соединения по п. 1.

3. Фармацевтическая композиция по п. 2, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель, пригодный для ингаляции и/или местного, системного, перорального, интраназального или парентерального введения.

4. Способ получения соединения по п. 1, включающий

(i) реакцию пептида, который представляет собой пептид T7, состоящий из SEQ ID NO: 1, с тиоловым соединением формулы (II)

получение соединения формулы (III) или его соли

(ii) взаимодействие соединения формулы (III) с ПЭГ-тетрамером формулы (IV)

с получением указанного соединения или его фармацевтически приемлемой соли;

где переменные n, X и Y соответствуют указанным в п. 1, LG представляет собой подходящую замещаемую группу, выбранную из галогена, тозилата или мезилата, а PG представляют собой H или подходящую защитную группу, такую как тритил.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что подходящая заменяемая группа представляет собой галоген.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что галоген представляет собой бром.

7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что PG означает тритил.

8. Способ активации рецептора Tie 2 у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту соединения по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 2 или 3.

9. Способ местной стимуляции ангиогенеза у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту соединения по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 2 или 3.

10. Способ по п. 9, отличающееся тем, что соединение формулируют для ингаляции и/или местного, системного, перорального, интраназального или парентерального введения.

11. Способ по п. 9 или 10, дополнительно включающее введение субъекту второго ангиогенного агента.

12. Способ по п. 11, где вторым ангиогенным агентом является фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF).

13. Способ по п. 11, где второй ангиогенный агент выбран из группы, состоящей из PDGF, G-CSF, рекомбинантного человеческого эритропоэтина, bFGF, ингибитора Ang2 и фактора роста плаценты (PLGF).

14. Способ по любому из пп. 9-13, отличающееся тем, что ангиогенез стимулируют в клинической ситуации, выбранной из группы, состоящей из васкуляризации регенеративных тканей, ишемической болезни конечностей, церебральной ишемии, состояния сосудистого воспаления, артериосклероза, аваскулярного некроза, стимуляции роста волос и эректильной дисфункции.

15. Способ уменьшения проницаемости сосудов в месте пропотевания жидкости из сосудов у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту соединения по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 2 или 3.

16. Способ по п. 15, где проницаемость сосудов снижается в клинической ситуации, выбранной из группы, состоящей из инсульта, макулярной дегенерации, макулярного отека, лимфатического отека, разрушения гематоретинального барьера, разрушения гематоэнцефалического барьера, пропотевания жидкости из сосудов, вызванного бактериями, и нормализации сосудистой сети опухоли.

17. Способ защиты эндотелиальных клеток у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту соединения по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 2 или 3.

18. Способ по п. 17, где эндотелиальные клетки защищены в клинической ситуации, выбранной из группы, состоящей из повреждения почек, такого как острое повреждение почек, фиброза почек, инсульта, дегенерации желтого пятна, сосудистой деменции и осложнений диабета.

19. Способ по п. 17, где эндотелиальные клетки защищены в клинической ситуации повреждения легких.

20. Способ стимуляции заживления раны у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту соединения по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 2 или 3.

21. Способ по п. 20, где соединение формулируют для ингаляции и/или местного, системного, перорального, интраназального или парентерального введения.

22. Способ по п. 20 или 21, где рана представляет собой диабетическую язву.

23. Способ по п. 20 или 21, где рана выбрана из группы, состоящей из пролежня, пролежневой язвы, хирургического разреза, травматического повреждения ткани, ожога и кожного трансплантата.

24. Способ ингибирования размножения клеток CFU-G у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту соединения по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 2 или 3.

25. Способ по п. 24, где CFU-G клетки представляют собой эозинофилы и/или базофилы.

26. Способ лечения состояния, связанного с эозинофилами и базофилами, у субъекта, нуждающегося в этом, где указанное состояние выбрано из атопического дерматита, астмы и аллергического ринита, включающий введение субъекту соединения по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 2 или 3.

27. Способ лечения состояния, связанного с эозинофилами и базофилами, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту соединения по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 2 или 3.

28. Способ по п. 27, отличающееся тем, что состояние, связанное с эозинофилами и базофилами, выбрано из лейкоза эозинофильного и базофильного происхождения, воспалительного заболевания кишечника и паразитарной инфекции.

29. Способ снижения уровней одного или более воспалительных цитокинов и хемокинов у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту соединения по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 2 или 3, где один или более воспалительных цитокинов и хемокинов выбирают из эотаксина, IL-17, MIG, IL12/IL23 (p40), IL-9, MIP-1a, MIP-1b, RANTES, TNF-α, IL-1β, IL-5, IL-13 и MCP-1.

30. Способ по п. 29, где воспалительный цитокин и хемокин представляет собой эотаксин.

31. Способ по любому из пп. 24-30, где соединение вводят местно, системно, интраназально или ингаляционно.

32. Способ по любому из пп. 8-31, где субъект является человеком.

33. Способ лечения животного, инфицированного пневмонией, где пневмония выбрана из первичной вирусной пневмонии и бактериальной пневмонии, которая возникает одновременно с инфекцией гриппа или после нее, включающий введение субъекту соединения по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 2 или 3.

34. Способ по п. 33, где противовирусный агент вводят животному одновременно или последовательно с указанным соединением.

35. Способ по п. 34, где противовирусный агент представляет собой амантадин, римантадин, занамивир, перамивир, вирамидин, рибавирин или осельтамивир.

36. Способ по любому из пп. 33-35, где животное является человеком, а грипп является человеческим гриппом.

37. Композиция для лечения первичной вирусной пневмонии, содержащая (а) соединение по п. 1 и (b) противовирусный агент.

38. Набор для лечения гриппа, содержащий (а) соединение по п. 1, (b) противовирусный агент и (с) инструкции по применению набора для лечения животного или клетки, инфицированной гриппом.

39. Композиция по п. 37, где противовирусный агент представляет собой амантадин, римантадин, занамивир, перамивир, вирамидин, рибавирин или осельтамивир.

40. Набор по п. 38, где противовирусный агент представляет собой амантадин, римантадин, занамивир, перамивир, вирамидин, рибавирин или осельтамивир.

41. Биоматериал, полученный смешиванием коммерческого Matrigel или сшитого гидрогель гликозаминогликана с соединением по п. 1 и дополнительным вторым биологически активным соединением, выбранным из группы, состоящей из VEGF, PDGF, G-CSF, рекомбинантного человеческого эритропоэтина, bFGF, ингибитора Ang2 и фактора роста плаценты (PLGF), для имплантации субъекту для стимуляции ангиогенеза у субъекта.