СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЯ ПШЕНИЦЫ С НУКЛЕОТИДНОЙ ВСТАВКОЙ В ПРОМОТОРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА VRN-A1 ПРИ ПОМОЩИ ТЕХНОЛОГИИ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА РАСТЕНИЙ CRISPR/CAS9 Российский патент 2022 года по МПК C12N15/82 C12N15/11 C12N9/22 A01H1/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии растений, а именно к способу получения однодольного растения при помощи технологии редактирования генома растений CRISPR/Cas9, путем целенаправленного воздействия на нуклеотидную последовательность консервативного участка промоторной области гена VRN-1A однодольных зерновых культур системами редактирования генома CRISPR/Cas9, в которых используются молекулы РНК-проводника или сконструированный на его основе экспрессионный ДНК-вектор.

Предшествующий уровень техники

Время от посева до колошения имеет важное практическое значение для производителей пшеницы, поэтому значительные усилия селекционеров направлены на сокращение вегетационного периода у культурных сортов пшеницы.

Способность растений пшеницы переходить к репродуктивному развитию зависит от функционирования двух основных систем генов развития - VRN (vernalization - ответ на яровизацию) и PPD (photoperiodic - чувствительность к фотопериоду. У представителей Triticeae чувствительность к яровизации контролируется группой скоординировано функционирующих генов VRN1, VRN2 и VRN3. Важнейшая роль в регуляции ответа на яровизацию принадлежит гену VRN1, кодирующему MADS-box транскрипционный фактор (Trevaskis et al., 2007), который необходим для закладки и поддержания флоральной меристемы в точке роста побега пшеницы. У озимых форм потребность в яровизации связана с тем, что VRN1 гены находятся в рецессивном состоянии и их экспрессия блокирована до наступления периода воздействия пониженных температур. Для перехода озимой пшеницы к репродуктивному развитию необходимо, чтобы уровень транскрипта VRN1 достиг определенного порогового значения (Loukoianov et al.. 2005). Отсутствие потребности в яровизации у яровых сортов связано с существенными изменениями нуклеотидной последовательности промотора или первого интрона гена VRN-A1 (Yan et al. 2004; Fu et al. 2005). Показано, что промотор генов VRN1 содержит консервативные цис-элементы (CArG-, VRN- и G-боксы), представляющие собой мишени для транскрипционных факторов, участвующих в ответе на яровизацию. Известен ряд нуклеотидных модификаций промотора VRN-M (Konopatskaia et al. 2016; Muterko et al. 2016) (Фиг. 1). Наиболее распространенный доминантный аллель Vrn-A1a отличается от рецессивного аллеля vrn-A1 транспозонными вставками повторяющихся последовательностей в VRN-box участке промотора (Фиг. 1). Другие доминантные аллели содержат делеционные фрагменты разной протяженности в различных участках, таких как VRN-box (аллели Vrn-A1b, Vrn-A1d, Vrn-A1e), CArG-box (аллели Vrn-Ale), G-box (аллели Vrn-A1f), а также делеции размером 20 п.н. в участке между -136 и -157 п.н. (аллели Vrn-A1b, Vrn-A1d) или крупную делецию размером 50 п.н. в участке между -62 и -112 п.н. (аллели Vrn-A1f) (Фиг. 1). Помимо делеций, доминантные аллельные варианты Vrn-A1b, Vrn-A1d, Vrn-A1e также могут содержать единичные нуклеотидные замены в VRN-box участке промотора (Фиг. 1). Крупная делеция размером 50 п.н. в участке между -62 и -112 п.н. а также 8 п.н. нуклеотидная делеция в G-box была обнаружена только у аллеля Vrn-A1f яровых диких видов пшеницы секции Timopheevii (Фиг. 1), и не присутствует у представителей современных культурных видов мягкой и твердой пшеницы (Muterko et al. 2016).

Возможность контролировать сроки колошения путем точечного изменения аллелей VRN1 позволит упростить процесс получения новых высокопродуктивных сортов, соответствующих современным требованиям. Примечательно, что в настоящий момент не обнаружены какие либо природные яровые и озимые формы пшеницы с измененной последовательностью промотора VRN1 в области между -113 и -122 п.н., а также отсутствуют искусственные мутантные формы зерновых с модификациями промотора VRN1 в областях между -62 и -120 п.н. Получение растений, несущих новые (или аналогичные диким представителям) аллели генов VRN1, имеющих мутации в регуляторных областях гена на неизменном генетическом фоне, представляет собой техническую проблему, для решения которой необходимо расширение арсенала средств, доступных селекционерам. В качестве решения этой проблемы настоящее изобретение предлагает способ получения однодольного растения с измененной при помощи технологии редактирования генома растений CRISPR/Cas9 последовательностью промотора гена VRN1.

Сущность изобретения

Задачей изобретения является разработка способа получения однодольного растения с нуклеотидной вставкой в промоторной области гена VRN-A1.

Для решения данной задачи предлагается способ, согласно которому получают конструкцию pgRNA-VRNA1#31, смешивают эту конструкцию с вектором, кодирующим последовательность Cas9, переносят эту смесь в клетки пшеницы с помощью генной пушки для внесения мутаций в промоторную область гена VRN-1A и проводят отбор растений-регенерантов с отредактированным геномом.

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к однодольному растению, полученному этим способом.

Использование РНК-проводника, в составе экспрессионного вектора pgRNA-VRNA1#31 в описываемом примере, позволило эффективно внести мутацию путем вставки дополнительного нуклеотида в целевую последовательность консервативного участка промоторной области гена VRN-A1 мягкой пшеницы, не затрагивая гомеологичные варианты гена VRN-1 других элементарных геномов, и в дальнейшем закрепить полученную мутацию в последующем поколении растений, несущих гомозиготные аллели.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Сравнительная характеристика нуклеотидной последовательности доминантных (Vrn) и рецессивных (vrn) аллелей гена VRN-A1, несущих мутации в области промотора, идентифицированных у видов и сортов полиплоидной пшеницы (согласно Konopstskaia et al. 2016; с модификациями).

Фигура 2. Генотипирование целевой нуклеотидной последовательности промоторной области VRN-A1 методом секвенирования по Сэнгеру. Представлены нуклеотилные последовательности аллелей в целевом фрагменте контрольного растения (WT) и растения пшеницы #31-1 с изменениями, а именно вставкой дополнительного нуклеотида в сравнении с WT, которые отмечены стрелкой.

Фигура 3. Генотипирование мутантного аллеля в промоторной области рецессивного гена VRN-A1 относительно целевой последовательности, являющейся мишенью для РНК-проводника vr-31. Представлена последовательность целевой мишени, которой комплементарна последовательность РНК-проводника (заглавные буквы) в которой указана РАМ последовательность и стрелкой указан предпочтительный сайт разрезания ДНК. Красным цветом выделена вставка дополнительного нуклеотида в одном из аллелей у пшеницы #31-1.

Фигура 4. Анализ возможных изменений нуклеотидной последовательности промоторной области генов VRN-1B и VRN-1D у растения пшеницы #31-1 с измененной последовательностью VRN-A1. Представлены результаты секвенирования по Сэнгеру в сравнении с референсными последовательностями (WT) промоторной области генов VRN-1В и VRN-1D, включая фрагмент имеющий сходство с последовательностью РНК-проводника vr-31, использующегося для редактирования генома.

Фигура 5. Характерные примеры генотипирования целевой нуклеотидной последовательности промоторной области VRN-A1 методом секвенирования по Сэнгеру в семенном поколении Т1 растения #31-1. Представлены нуклеотидные последовательности аллелей у растения Т1 не наследующем мутантный аллель (WT), у гетерозиготного растения Т1 с со вставкой дополнительного нуклеотида в одном из аллелей (моноаллель) в сравнении с WT, и гомозиготного растения несущего две аллели VRN-A1 со вставкой дополнительного нуклеотида (биалель). Изменения отмечены стрелкой.

Пример 1

Получение гетерозиготного трансгенного растения мягкой пшеницы #31-1 содержащего дополнительную нуклеотидную вставку в одном из аллелей промоторной области гена VRN-A1 однодольных зерновых путем геномного редактирования с помощью РНК-проводника.

Для получения индивидуального растений с отредактированным геномом требуется взаимодействие комплексов Cas9-РНК-проводник с геномной ДНК. Векторную конструкцию pgRNA-VRNA1#31, полученную на основе вектора pU6-gRNA (Addgene plasmid #53062; http://n2t.net/addgene:53062) и содержащую первую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 и вторую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2. фланкирующую первую последовательность с 3'-конца, смешивали с вектором, кодирующим последовательность нуклеазы Cas9 содержащим ген-селективный маркер bar, и репортерный ген gfp, и переносили в клетки пшеницы с помощью генной пушки для внесения мутаций в промоторную область гена VRN-A1. В качестве эксплантов использовали эмбриогенные каллусы, инициированные из тканей незрелых зиготических зародышей пшеницы ‘Chinese Spring’ (Triticum aestivum L.). В результате генетической трансформации отобрали растение #31-1, демонстрирующее одновременно устойчивость к селективному гербициду и флуоресценцию репортерного гена GFP (оба гена содержатся в экспрессионной кассете совместно с последовательностью Cas9). Наличие вставок последовательностей «инструментов» геномного редактирования, а именно РНК-проводника, находящегося в составе вектора pgRNA-VRNA1#31, и последовательности нуклеазы Cas9 подтвердили ПЦР анализом тотальной ДНК, выделенной из #31-1 (наблюдали амплификацию характерных фрагментов).

Наличие нуклеотидной вставки в промотерной области гена VRN-A1 подтвердили путем генотипирования фрагмента включающего нуклеотидную последовательность, являющеюся мишенью РНК-проводника (Фиг. 2). Для этого фрагмент гена VRN-A1 амплкфицировали с помощью праймеров CTGAATTCTGAAAGGAAAAATTCTGCTCG/ACTGGTACCGAAGGCGTATTGGGGAAC. ПЦР-продукты очищали набором GeneJET PCR Purification Kit (Thermo) и секвенировали с применением секвенирующего праймера TTACCATGACTCGGTGGAG. Дополнительно к этому, для подтверждения избирательности и точности разработанного РНК-проводника проводили анализ аналогичного участка промотора гомеологичнных VRN-1 генов присутствующих в элементарных геномах В и D пшеницы. Для этого предварительно секвенировали фрагмент промоторной области генов Vrn-B1 и Vrn-D1, полученный путем его амплификации с геномной ДНК пшеницы ‘Chinese Spring’ с использованием праймеров CTGAATTCATAGTAGTATAAAAAGGACAATTG/CTGGTACCACCGAATCAACCAAAC AGTG и CTGAATTCGTATAAAAGGAAAATTGTGCTCT/ACTGGTACCATCAACCAAACAGCCC CG, соответственно. Полученные фрагменты очищали набором GeneJET PCR Purification Kit (Thermo) и секвенировали с применением секвенирующего праймера TTACCATGACTCGGTGGAG. Сиквенсы фрагментов Vrn-А1. Vrn-B1 и Vrn-D1 трансгенных растений расшифровывали; последовательности раскладывали на аллели. В качестве контроля (референсная последовательность) использовали геномную ДНК пшеницы ‘Chinese Spring’ (Фиг. 2, Фиг. 4).

Генотиприрование нуклеотидной последовательности растения #31-1 показало наличие вставки дополнительного нуклеотида в сравнении с немодифицированной последовательностью рецессивного гена VRN-A1, присутствующего в геноме ‘Chinese Spring’ (Фиг. 2). Эти изменения возникли в результате функциональной активности РНК-проводника vr-31, поскольку вставка обнаружена в ожидаемом сайте расщепления молекулы ДНК комплексом Cas9-РНК-проводник (Фиг. 3). Анализ аналогичной нуклеотидной последовательности гомеологичных генов Vrn-B1 и Vrn-D1 подтвердил отсутствие каких-либо изменений (Фиг. 4). Таким образом, получено растение пшеницы, несущее аллель с новой нуклеотидной последовательностью промотерной области гена VRN-A1 с дополнительной вставкой. Эта новая нуклеотидная последовательность представлена здесь как SEQ ID NO: 3 в перечне последовательностей.

Пример 2

Получение трансгенного растения мягкой пшеницы #31-1 содержащего гомозиготные мутантные аллели с нуклеотидной вставкой в промоторной области гена VRN-A1 однодольных зерновых.

В результате самоопыления первичного гетерозиготного растения #31-1, получение которого описано в Примере 1 (содержит одну мутантную аллель вследствие геномного редактирования с помощью РНК-проводника vr-31), получили семенное поколение Т1. Индивидуальные растения Т1 проанализировали на наследование мутантной аллели и закрепление мутации. Наследование нуклеотидной вставки в промоторной области гена VRN-A1 подтверждали путем секвенирования фрагмента нуклеотидной последовательности, являющеюся мишенью РНК-проводника, аналогично тому, как описано в Примере 1. Анализ потомства от самоопыления показал наличие трех типов наследования нуклеотидного изменения промоторной области гена VRN-A1 (Фиг. 5). У одного из десяти проанализированных растений Т1 сопоставление нуклеотидных последовательностей не выявило полиморфизм в структуре промоторной области гена VRN-A1 относительно референсной последовательности, указывая на отсутствие наследования привнесенной мутации в результате расщепления. Семь из десяти проанализированных растений Т1 наследовали мутацию в одном из аллелей, сохраняя гетерозиготный статус мутантного варианта VRN-A1 (Фиг. 5), аналогично первичному траксгенвому растению #31-1. Два из десяти проанализированных растений Т1 содержали одинаковые нуклеотидные изменения в обеих аллелях. Это подтверждено характерным хромотографическим распределением нуклеотидных пиков (Фиг. 5). Таким образом, получили гомозиготное растения пшеницы, содержащие мутантные аллели с нуклеотидной вставкой в промоторной области гена VRN-A1 однодольных зерновых, привнесенные геномным редактированием.

Финансирование работ по созданию настоящего изобретения проводилось из средств Соглашения №075-15-2019-1667 от «31» октября 2019 г. о предоставлении из федерального бюджета грантов в форме субсидий в соответствии с пунктом 4 статьи 78.1 Бюджетного кодекса Российской Федерации на осуществление государственной поддержки создания и развития центра геномных исследований мирового уровня «Курчатовский геномный центр» в рамках реализации федерального проекта «Развитие научной и научно-производственной кооперации» национального проекта «Наука».

Список литературы

Fu D, Szucs Р, Yan L, et al. (2005). Large deletions within the first intron in VRN-1 are associated with spring growth habit in barley and wheat. Mol. Genet. Genomics. 273, 54-65.

Konopatskaia I, Vavilova V, Kondratenko EY, et al. (2016). VRN1 genes variability in tetraploid wheat species with a spring growth habit. BMC Plant Biol. 16 (Suppl 3):244.

Loukoianov A, Yan L, Blechl A, et al. (2005). Regulation of VRN-1 vernalization genes in normal and transgenic polyploid wheat. Plant Physiol. 138(4), 2364-2373.

Muterko A, Kalendar R, Salina E (2016). Novel alleles of the VERNALIZATION 1 genes in wheat are associated with modulation of DNA curvature and flexibility in the promoter region. BMC Plant Biol 16(Suppl 1), 9.

Trevaskis B, Hemming MN, Dennis ES, et al. (2007). The molecular basis of vernalization-induced flowering in cereals. Trends Plant Sci. 12. 352-357.

Yan L, Helguera M, Kato K. et al. (2004). Allelic variation at the VRN-1 promoter region in polyploid wheat. Theor. Appl. Genet. 109:1677-1186.

--->

Перечень последовательностей

<110> ФГБНУ ВНИИСБ

<120> СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЯ ПШЕНИЦЫ С НУКЛЕОТИДНОЙ ВСТАВКОЙ В ПРОМОТОРНОЙ

ОБЛАСТИ ГЕНА VRN-А1 ПРИ ПОМОЩИ ТЕХНОЛОГИИ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА РАСТЕНИЙ

CRISPR/CAS9

<160> 3

<210> 1

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 20

GCCAUGGCUAUCAGGUGGUU

<210> 2

<211> 76

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 76

GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC

<210> 3

<211> 700

<212> ДНК

<213> Последовательность промоторной области гена VRN-А1 с нуклеотидной вставкой

<400> 700

TGAAAGGAAAAATTCTGCTCGTTTTTTTGCTCTGTGGTGTGTGTTTGTGGCGAGAGAAAATGATTTGGGGAAAGCAAAATCC

GGAGATTCGCACGTACGATCGTTCGACACGTCGACGCCCGGCGGGCCCGGGGTGGGGCATCGTGTGGCTGCAGGACCGCGGG

GCCCCGCAAAGCGGGCCGGGCCAATGGGTGCTCGACAGCGGCTATGCTCCAGACCAGCCCGGTATTGCATACCGCGCTCGGG

GCCAGATCCCTTTAAAAACCCCTCCCCCCCTGCCGGAATCCTCGTTTTGGCCTGGCCATCCTCCCTCTCCTCCCCTCTCTTC

CACCTCACGTCCTCACCCAACTCACCTGATAGCCATGGCTCCGCCGCCTCGCCTCCGCCTGCGCCAGTCGGAGTAGCCGTCG

CGGTCTGCCGGTGTTGGAGGGTAGGGGCGTAGGGTTGGCCCGGTTCTCGAGCGGAGATGGGGCGGGGGAAGGTGCAGCTGAA

GCGGATCGAGAACAAGATCAACCGGCAGGTGACCTTCTCCAAGCGCCGCTCGGGGCTTCTCAAGAAGGCGCACGAGATCTCC

GTGCTCTGCGACGCCGAGGTCGGCCTCATCATCTTCTCCACCAAGGGAAAGCTCTACGAGTTCTCCACCGAGTCATGGTAAA

TTAAGCACGCGCTGTCTTTAAATTTGTTCCCCAATACGCCTTCG

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к cпособу получения растения пшеницы с нуклеотидной вставкой в промоторной области гена VRN-A1. Также изобретение относится к растению пшеницы с нуклеотидной вставкой в промоторной области гена VRN-A1. Изобретение эффективно для упрощения процесса получения новых высокопродуктивных сортов, соответствующих современным требованиям. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 2 пр.

1. Способ получения растения пшеницы с нуклеотидной вставкой в промоторной области гена VRN-A1, включающий в себя следующие этапы:

получение конструкции на основе вектора pU6-gRNA, содержащей первую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 и вторую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, фланкирующую первую последовательность с 3'-конца,

смешивание этой конструкции с вектором, кодирующим последовательность Cas9,

перенесение этой смеси в клетки пшеницы с помощью генной пушки для внесения мутаций в промоторную область гена VRN-1A и

отбор растений-регенерантов с нуклеотидной вставкой в промоторной области гена VRN-A1, где промоторная область гена VRN-1A имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3.

2. Растение пшеницы с нуклеотидной вставкой в промоторной области гена VRN-A1 для дальнейшего применения в селекционном процессе, полученное способом по п. 1, где растение имеет нуклеотидную последовательность промоторной области гена VRN-1A SEQ ID NO: 3.