СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА Советский патент 1971 года по МПК C12P13/08 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения L-лизина.

Известен способ получения L-лизина культивированием штамма Corynebacterium glutamicum М-901 в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и аминокислоты, в которых нуждается штамм для синтеза лизина, а именно гомосерин, или треонин-J+ метионин, или треонин -(- цистин, или треонин -|- гомоцистин. Аминокислоты обычно вводятся в питательную среду в виде различных белковых гидролизолитов.

Для повышения выхода L-лизина на стандартных средах предложено использовать мутанты, полученные из штаммов Corynebacterium glutamicum АТСС 14296 и М-901 АТСС 13287 ультрафиолетовым облучением, например Corynebacterium glutamicum М-901-2347 АТСС 21253, Corynebacterium glutamicum М-901-2279 АТСС 2154, Corynebacterium glutamicum М-901-2234 АТСС 21255, Corynebacterium glutamicum КУ 9494 АТСС 21299, Corynebacterium glutamicum КУ 10092 АТСС 21300. Эти мутанты отличаются от родительского штамма повьш1енными питательными требованиями.

Мутант АТСС 21253 требует дополнительно лейцин, АТСС 21254 - гистидин, АТСС 21255 - изолейцин -f- валин, по сравнению с мутантом АТСС 13287 АТСС 21299 требует

гистодин, АТСС 21300 лейцин по сравнению со штаммом АТСС 14296.

Ниже приведены сравнительные данные по питательным требованиям известных и предложенных штаммов.

По предлагаемому способу пригодны как синтетические, так и природные питательные среды, содержащие источники углерода, азота, минеральные соли и необходимые аминокислоты.

В качестве источника углерода можно использовать углеводы (фруктозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу, крахмал, гидролизаты крахмала, глицерин, сорбит, органические кислоты (например уксусная и т. п.). Эти вещества можно использовать как в отдельности, так и в смеси одно с другим. В качестве источника азота можно использовать различие неорганические или органические соединения, например мочевину, аммониевые соли (хлорид, сульфат, нитрат, ацетат, фосфат), или природные вещества, содержащие азот, например, кукурузную барду, дрожжевые или мясные экстракты, пептон, рыбную муку, бульоШтаммПитательные требования Гомосерин или треоиин + ме Corynebacterium тионин, или треонин + циста glulamicum тионин, или треонин + гомо М-901 АТСС 13282 (исходстеин. ный штамм) Гомосерин или лейцин, или Corynebacterium треонин -Ь метионин -{- лей glutamicum М-901 2347 цин, или треонин -|- цистатио АТСС 21253 нин + лейцин, или треонин -)+ гомоцистеин + лейцин. Гомосерин -г гистндин или тре Corynebacterium онин + метионин + гисти giutamicum дин, или треонин + цистатио М-901 Nb 2279 нин + гистидин, или трео АТСС 21254 иин + гомоцистеин -р гисгидин Гомосерин + изолецин + валин Corynebacterium или треонин + метионин -|glutamicum+ изолейцин + валин, или М-901 № 2234 треонин -|- цистатионин + АТСС 21255 + изолейцин + валин. Corynebacterium glutamicum АТСС 1429G (исходный штамм) Corynebacterium Треонин + гистидин glutamicum КУ9494 АТСС 21299 Corynebacterium Треонин -|- лейцин glutamicum КУ10092 АТСС 21300 ны, гидролизат казеина и т. п. Указанные вещества могут применяться как в отдельности, так и в комбинации одно с другим. К числу минеральных солей относятся сульфат магния, фосфаты, натрия и калия, сульфаты железа и марганца, хлориды марганца и кальция, углекислый кальций, хлористый натрий и т. п. Однако нри использовании такого сырья, как меласса, которое содержит некоторое количество неорганических веществ, ферментацию ведут без добавления их в среКроме того, для продуцирования L-лизина в среду необходимо добавлять соответствующие аминокислоты, необходимые для роста микроорганизма. Можно использовать аминокислоты или смеси аминокислот, полученные из природных веществ. Предпочтительно применять различные виды белковых гидролизатов, например Миеки (торговое наименование гидролизата глутена или соевой муки, из которых удалена глутаминовая кислота), микробные гидролизаты, гидролизаты сои, пщеничной клейковины и т. п. Необходимое количество гидролизатов значительно меньще, чем количество исходных щтаммов. Это условие для предлагаемого способа. рН 5-8,5 (лучше при рН около 7,0). ПосЛе выращивания при этих условиях в течение 2- 5 дней в культуральной жидкости накапливается значительное количество L-лизина. По окончании ферментации L-лизин отделяют от культуральной жидкости обычными способами, например обработкой ионообменной смолой, экстракцией растворителями, осаждением металическими солями, хроматографией и т. п. Одной из важных особенностей предлагаемого способа является то, что попутно получают лишь небольшое количество L-валина, в то время как при использовании исходных щтаммов получают значительные количества этого вещества. Пример 1. Среду, содержащую 5 г/дкл мелассы (глюкоза), 0,05 г/дкл кислого фосфата калия, 0,05 г/дкл дикалийфосфата, 0,3 е/дкл мочевины и 4 г/дкл Миеки, инокулируют Corynebacterium glutamicum М-901-2234 АТСС 21255 и выращивают при аэробном встряхивании при 30°С в течение 24 час. 3 л среды, содержащей 18 г/дкл мелассы (глюкоза), 4 г/дкл сульфата аммония и 1,5 г/дкл Миеки, помещают в ферментер емкостью 5 л и стерилизуют. 500 мл засевной культуры высевают в ферментационную среду. При выращивании подают 3 л/мин воздуха, перемешивание ведут со скоростью 4QO об/мин, при температуре , рН среды 6,8-7,0 (с помощью аммиачной воды). После 70 час выращивания концентрация L-лизина в культуральной среде составляет 48,7 мг/мл (в виде гидрохлорида), выход по сахару составляет 27,OVo- Концентрация попутного L-валина составляет менее 0,3 мг/мл. При выращивании в таких условиях исходного штамма АТСС 13287 концентрация L-лизина составила 37,2 мг/мл, концентрация L-валина 1,8 мг/мл. По окончании выращивания культуральную среду отфильтровывают и обрабатывают сйльнокислой катионообменной смолой обычным способом. Пример 2. 3л культуральной среды, соержащей 16 г/дкл сахарозы, 0,15 г/дкл кисого фосфата калия, 0,05 г/дкл дикалий-фосата, 4 г/дкл сульфата калия, 0,05 г/дкл ульфата магния, 0,002 г/дкл сульфата маранца, 0,02 г/дкл сульфата железа, ЗОуДил иотина, 120у/мл метионина 30 у/мл треоина, 50 у/мл лейцина и 100 у/мл цистина, омещают в чашечный ферментер емкостью л и стерилизуют. 500 мл зародышевой кульуры Corynebacterium glutamicum М-901-2347 ТСС 21253, полученной предварительным ыращиванием (пример 1), инокулируют в ерментационную среду. Выращивание ведут ак, как описано в примере 1, После 70 час выращивания концентрация Lйзина в среде составляет 54,6 мг/мл (в виде

В контрольном опыте при выращивании в тех же условиях исходного штамма Согупеbacterium glutamicum АТСС 13287 и без использования лейцина в исходной ферментационной среде концентрация L-лизина составляет 42,1 мг/мл, концентрация попутного L-валина составляет 1,7 мг/мл.

Пример 3. Выращивание ведут, как описано в примере 1, но в качестве зародыщевого щтамма применяют Corynebacterium glutamicum М-901-2279 АТСС 21254. Получают культуральную среду, содержащую 50,7 мг/мл L-лизина (в виде гидрохлорида).

Выход по сахару 28,1о/о.

Пример 4. Выращивание ведут, как описано в примере 1, но в качестве зародыщева щтамма применяют Corynebacterium glutamicum КУ9494 АТСС 21299. Получают культуральную жидкость, содержащую 53,2 мг/мл L-лизина (в виде гидрохлорида).

Пример 5. Выращивание ведут, как описано в примере 1, но в качестве зародыщевого щтамма применяют Corynebacterium glutamicum КУ 10092 АТСС 21300. Получают культуральную л идкость, содержащую 51,6 мг/мл L-лизина (в виде гидрохлорида).

Предмет изобретения

Способ получения L-лизина культивированием щтамма Corynebacterium glutamicum в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азога, минеральные соли и необходимые аминокислоты, например в виде белкового гидролиза га, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода продукта, используют мутанты, полученные из щтаммов Corynebacterium glutamicum М-901 АТСС 13287 и АТСС 14296 ультрафиолетовым облучением, например Corynebacterium glutamicum M-90I-2347 АТСС 21253, Corynebacterium glutamicum М-901-2279 АТСС

21254, Corynebacterium glutamicum М-901-2234 АТСС 21255, Corynebacterium glutamicum КУ 9494 АТСС 21299, Corynebacterium glutamicum КУ 10092 АТСС 21300.