Ссылка на родственные заявки

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет по § 119(e) 35 U.S.C. в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США № 62/443447, поданной 6 января 2017 года, и заявкой на выдачу патента США № 62/538181, поданной 28 июля 2017 года, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном ее объеме.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

В существующих технологиях по превращению крахмала в простые сахара используют множественные реакции биотрансформации со способами глубокой очистки после каждой биотрансформации. Хотя способы биотрансформации относительно недороги из-за применения иммобилизированных ферментов и систем непрерывного производства, последующая обработка оказывает существенное влияние на стоимость.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к бесклеточным системам, способам, композициям и наборам для ферментативного превращения полимерной глюкозы, такой как крахмал (например, амилоза и/или амилопектин), гликоген или любое их частично гидролизированное производное, такое как мальтодекстрин или целлодекстрин (которые можно применять взаимозаменяемо с термином целлюлоза), в пентозные (например, рибозу, арабинозу или ксилулозу) или гексозные (например, аллюлозу, глюкозу или фруктозу) сахара. С помощью способов по настоящему раскрытию реализуют пути получения сахара в бесклеточных реакциях (например, в однореакторной (единой) бесклеточной реакции) для превращения крахмала и/или целлюлозы/целлодекстрина в гексозные и/или пентозные сахара. В отличие от способов, которые обычно предусматривают фосфорилирование субстратов, таких как глюкоза, в глюкозо-6-фосфат и предусматривают использование высокоэнергетических источников фосфата, таких как АТФ и фосфоеноилпируват, в описанных в настоящем документе способах обычно заменяют высокоэнергетические источники фосфата, например, недорогим неорганическим фосфатом (P_i). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, α-глюканфосфорилазу (также называемую крахмалфосфорилазой) (ЕС 2.4.1.1) применяют для превращения крахмала в глюкозо-1-фосфат, который затем превращают в глюкозо-6-фосфат посредством фосфоглюкомутазы (ЕС 5.4.2.2, 5.4.2.5 или 5.4.2.6). В соответствии с другими вариантами осуществления, целлодекстринфосфорилазу (также называемую целлюлозофосфорилазой или β-(1-4) глюканфосфорилазой) (ЕС 2.4.1.49) применяют для превращения целлюлозы/целлодекстрина в глюкозо-1-фосфат, который затем превращают в глюкозо-6-фосфат посредством фосфоглюкомутазы (ЕС 5.4.2.2, 5.4.2.5 или 5.4.2.6). Последующая одна или несколько ферментативных реакций конкретного пути получения сахара, представленного в настоящем документе, в значительной степени зависят от специфики продукта. Сахарофосфатазу (EC 3.1.3.-) применяют для превращения в конечный продукт. Таким образом, такая термодинамика реакции, т. е. фосфорилирование субстрата - десфосфорилирование продукта, способствует получению продукта.

Кроме того, описанные в настоящем документе реакции ферментативного превращения, являются фактически необратимыми, таким образом, поддерживая высокие выходы требуемых гексозных и пентозных сахаров. В отличие от этого, в обычных способах биотрансформации для превращения крахмала или целлюлозы/целлодекстрина в аллюлозу, например, используют три отдельных процесса, два из которых являются обратимыми, причем конечная концентрация продукта определяется термодинамикой используемых ферментов. Например, крахмал превращают в глюкозу, глюкозу подвергают изомеризации во фруктозу, а фруктозу подвергают эпимеризации в аллюлозу. Изомеризация глюкозы в фруктозу характеризуется выходом примерно 45%, поэтому необходима существенная последующая обработка для получения чистого продукта и возвращения в цикл не подвергшегося каталитической реакции субстрата. Аналогично, эпимеризация фруктозы в аллюлозу характеризуется выходом ~20%, что снова нуждается в существенной последующей обработке для получения очищенного продукта и возвращения в цикл не подвергшегося каталитической реакции субстрата. Способность напрямую преобразовывать крахмал в представляющий интерес продукт в бесклеточных системах, описанных в настоящем документе, снижает затраты за счет сокращения последующей обработки и потери субстрата.

Предпочтительно, многие из ферментов, применяемых в способах, представленных в настоящем документе, являются термостабильными, что (1) обеспечивает термическую инактивацию молекул с нежелательной активностью, содержащихся в клеточных лизатах, в которых осуществляют процесс превращения, и (2) уменьшает вероятность загрязнения микроорганизмами, отрицательно влияющих на циклы производства. Ферменты в этих путях превращения можно выделить из термофильных, мезофильных или психрофильных организмов и/или, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, можно сконструировать для увеличения (или уменьшения) термостабильности таких ферментов. Термофильный организм (термофил) активно размножается при высоких температурах в диапазоне от 41°C до 122°C (от 106°F до 252°F). Мезофильный организм (мезофил) активно размножается при умеренных температурах в диапазоне от 20°C до 45°C (от 68°F до 113°F). Психрофильный организм (психрофил) активно размножается при низких температурах в диапазоне от -20°C до 10°C (от -4°F до 50°F).

Таким образом, некоторые аспекты настоящего раскрытия относятся к способам получения сахара (например, аллюлозы, глюкозы, фруктозы, сорбита, рибулозы, рибозы и/или арабинозы), при этом способ предусматривает (а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного термостабильного фермента пути получения сахара, описываемого в настоящем документе, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты, (b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов, (c) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит термостабильные ферменты пути получения сахара, (d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует нежелательные природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (с), с получением инактивированного нагреванием лизата и (е) инкубирование реакционной смеси в присутствии субстрата (например, крахмала, гликогена или любого его частично гидролизированного производного) и источника фосфата (например, неорганического фосфата) с получением сахара.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, бесклеточный способ получения сахара (например, аллюлозы, глюкозы, фруктозы, сорбита, рибулозы, рибозы и/или арабинозы) предусматривает (а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента пути получения сахара, описываемого в настоящем документе, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты, причем по меньшей мере один из ферментов пути получения сахара является термостабильным, (b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов, (с) необязательно, нагревание одного или нескольких клеточных лизатов со стадии (b) до температуры, которая инактивирует нежелательные природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько термостабильных ферментов со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата, (d) объединение клеточных лизатов со стадий (b) и (с) с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит ферменты пути получения сахара, причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным, и (е) инкубирование реакционной смеси в присутствии субстрата (например, крахмала, гликогена или любого его частично гидролизированного производного) и источника фосфата (например, неорганического фосфата) с получением сахара.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, бесклеточный способ получения сахара (например, аллюлозы, глюкозы, фруктозы, сорбита, рибулозы, рибозы и/или арабинозы) предусматривает (а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного термостабильного фермента пути получения сахара, описываемого в настоящем документе, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты, (b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов, (с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, (d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует нежелательные природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата, (е) добавление к инактивированному нагреванием лизату по меньшей мере одного очищенного фермента пути получения сахара и (е) инкубирование реакционной смеси в присутствии субстрата (например, крахмала, гликогена или любого его частично гидролизированного производного) и источника фосфата (например, неорганического фосфата) с получением сахара.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, бесклеточный способ получения сахара (например, аллюлозы, глюкозы, фруктозы, сорбита, рибулозы, рибозы и/или арабинозы) предусматривает (а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента пути получения сахара, описываемого в настоящем документе, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты, причем по меньшей мере один из вышеупомянутых ферментов является термостабильным, (b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов, (с) необязательно нагревание одного или нескольких клеточных лизатов со стадии (b) до температуры, которая инактивирует нежелательные природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата, (d) объединение клеточных лизатов со стадий (b) и (c) с получением смеси клеточных лизатов, (е) добавление к смеси клеточных лизатов по меньшей мере одного очищенного фермента пути получения сахара и (f) инкубирование реакционной смеси в присутствии субстрата (например, крахмала, гликогена или любого его частично гидролизированного производного) и источника фосфата (например, неорганического фосфата) с получением сахара.

Некоторые аспекты настоящего раскрытия относятся к бесклеточным способам получения аллюлозы, предусматривающим (а) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии α-глюканфосфорилазы (также называемой крахмалфосфорилазой), фосфоглюкомутазы, фосфоглюкоизомеразы, аллюлозо-6-фосфатэпимеразы и аллюлозо-6-фосфатфосфатазы с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют ферменты, причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным, (b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата, (с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природную молекулу с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько термостабильных ферментов со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата и (d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии крахмала, гликогена или любого его частично гидролизированного производного и источника фосфата (например, неорганического фосфата) с получением аллюлозы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один очищенный фермент добавляют к клеточному лизату до или после стадии (с). Следует понимать, что клетки можно лизировать любыми способами, включая механический, химический, ферментативный, осмотический или термический лизис. Таким образом, стадию лизирования и стадию нагревания (инактивации нагреванием) можно объединить в одну стадию нагревания клеток до температуры, которая лизирует клетки и инактивирует природную молекулу с ферментативной активностью.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, бесклеточные способы предусматривают (а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, аллюлозо-6-фосфатэпимераз и аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты, причем по меньшей мере один из вышеупомянутых ферментов является термостабильным, (b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов, (с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и аллюлозо-6-фосфатфосфатазу, (d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природную молекулу с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько термостабильных ферментов со стадии (с), с получением инактивированного нагреванием лизата и (е) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала, гликогена или любого его частично гидролизированного производного и источника фосфата (например, неорганического фосфата) с получением аллюлозы.

В соответствии с другими вариантами осуществления, бесклеточные способы предусматривают (а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, аллюлозо-6-фосфатэпимераз и аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты, причем по меньшей мере один из вышеупомянутых ферментов является термостабильным, (b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов, (с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, (d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природную молекулу с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько термостабильных ферментов со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата, (е) добавление к инактивированному нагреванием лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, аллюлозо-6-фосфатэпимераз и аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей α-глюканфосфорилазы, фосфоглюкомутазы, фосфоглюкоизомеразы, аллюлозо-6-фосфатэпимеразы и аллюлозо-6-фосфатфосфатазы, и (f) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала, гликогена или любого его частично гидролизированного производного и источника фосфата (например, неорганического фосфата) с получением аллюлозы.

Согласно некоторым аспектам настоящего раскрытия, может быть предпочтительным применение целлюлозы/целлодекстрина в качестве исходного субстрата. Таким образом, некоторые аспекты настоящего раскрытия относятся к бесклеточным способам получения аллюлозы, предусматривающим (а) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии целлодекстринфосфорилазы, фосфоглюкомутазы, фосфоглюкоизомеразы, аллюлозо-6-фосфатэпимеразы и аллюлозо-6-фосфатфосфатазы, с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют ферменты, причем по меньшей мере один из вышеупомянутых ферментов является термостабильным, (b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата, (с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природную молекулу с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько термостабильных ферментов со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата и (d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии целлодекстрина и источника фосфата (например, неорганического фосфата) с получением аллюлозы.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, бесклеточные способы предусматривают (а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, аллюлозо-6-фосфатэпимераз и аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты, причем по меньшей мере один из вышеупомянутых ферментов является термостабильным, (b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов, (с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и аллюлозо-6-фосфатфосфатазу, (d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природную молекулу с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько термостабильных ферментов со стадии (с), с получением инактивированного нагреванием лизата и (е) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и источника фосфата (например, неорганического фосфата) с получением аллюлозы.

В соответствии с другими вариантами осуществления, бесклеточные способы предусматривают (а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, аллюлозо-6-фосфатэпимераз и аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты, причем по меньшей мере один из вышеупомянутых ферментов является термостабильным, (b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов, (с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, (d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природную молекулу с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько термостабильных ферментов со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата, (е) добавление к инактивированному нагреванием лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, аллюлозо-6-фосфатэпимераз и аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей целлодекстринфосфорилазы, фосфоглюкомутазы, фосфоглюкоизомеразы, аллюлозо-6-фосфатэпимеразы и аллюлозо-6-фосфатфосфатазы, и (f) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и источника фосфата (например, неорганического фосфата) с получением аллюлозы.

Настоящим раскрытием также охватывается бесклеточное получение других сахаров, таких как глюкоза, фруктоза, манноза, сорбит, рибулоза, рибоза и арабиноза.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, представленные пути получения сахара нуждаются в уравновешивании энергетических кофакторов, таких как NADH, NADPH, NAD⁺ или NADP⁺. Это можно осуществить с помощью систем регенерации кофактора. В этих случаях NADH и NADPH называют «восстановленными кофакторами» или «восстановителями», а NAD⁺ и NADP⁺ называют «окисленными кофакторами» или «окислителями». В случаях с избытком восстановителей можно применять NAD(P)H-оксидазу (EC № 1.6.3.1, 1.6.3.2, 1.6.2.3 или 1.6.3.4) для сжигания избыточных восстановленных кофакторов с образованием либо H₂O₂, либо O^-₂, либо H₂O, в зависимости от типа оксидазы. При образовании H₂O₂ и O₂^-, которые могут причинить вред лизату, можно применять в тандеме супероксиддисмутазу (EC № 1.15.1.1) и/или каталазу (EC № 1.11.1.6) для превращения вредных соединений в H₂O и O₂. В случаях с избытком окислителей можно применять систему регенерации кофакторов для восстановления окисленных кофакторов обратно в их восстановленные формы. Некоторые примеры включают применение формиатдегидрогеназы (EC № 1.2.1.2) для окисления формиата до CO₂ при одновременном восстановлении NAD(P)⁺ до NAD(P)H или применение фосфонатдегидрогеназы (EC № 1.20.1.1) или сульфитоксидоредуктазы (EC № 1.8.1.2) для окисления соответствующих неорганических солей до фосфата и сульфата, что в результате дает восстановленный NAD(P)H.

В настоящем документе также представлены сконструированные клетки, клеточные лизаты и реакционные смеси, содержащие ферменты, такие как термостабильные ферменты, применяемые для получения конкретного представляющего интерес сахара (например, аллюлозы, глюкозы, фруктозы, сорбита, рибулозы, рибозы и/или арабинозы).

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение ферментативного пути превращения крахмала в аллюлозу. Сокращения имеют следующие значения: G1P = глюкозо-1-фосфат, G6P = глюкозо-6-фосфат, F6P = фруктозо-6-фосфат, A6P = аллюлозо-6-фосфат и PO₄ = неорганический фосфат.

Фиг. 2 представляет собой схематическое изображение двух ферментативных путей превращения крахмала в глюкозу. Сокращения имеют следующие значения: G1P = глюкозо-1-фосфат, G6P = глюкозо-6-фосфат и PO₄ = неорганический фосфат.

Фиг. 3 представляет собой схематическое изображение двух ферментативных путей превращения крахмала во фруктозу. Сокращения имеют следующие значения: G1P = глюкозо-1-фосфат, G6P = глюкозо-6-фосфат, F6P = фруктозо-6-фосфат и PO₄ = неорганический фосфат.

Фиг. 4 представляет собой схематическое изображение ферментативного пути превращения крахмала в сорбит. Сокращения имеют следующие значения: G1P = глюкозо-1-фосфат, G6P = глюкозо-6-фосфат, S6P = сорбит-6-фосфат, F6P = фруктозо-6-фосфат, NADPH = никотинамидадениндинуклеотидфосфат (восстановленная форма), NADP⁺ = никотинамидадениндинуклеотидфосфат и PO₄ = неорганический фосфат.

Фиг. 5 представляет собой схематическое изображение ферментативного пути превращения крахмала в рибулозу. Сокращения имеют следующие значения: G1P = глюкозо-1-фосфат, G6P = глюкозо-6-фосфат, 6PGL = 6-фосфоглюконолактон, 6PG = 6-фосфоглюконат, Ru5P = рибулозо-5-фосфат, NADPH = никотинамидадениндинуклеотидфосфат (восстановленная форма), NADP⁺ = никотинамидадениндинуклеотидфосфат, CO₂ = диоксид углерода и PO₄ = неорганический фосфат.

Фиг. 6 представляет собой схематическое изображение ферментативного пути превращения крахмала в рибозу. Сокращения имеют следующие значения: G1P = глюкозо-1-фосфат, G6P = глюкозо-6-фосфат, 6PGL = 6-фосфоглюконолактон, 6PG = 6-фосфоглюконат, Ru5P = рибулозо-5-фосфат, R5P = рибозо-5-фосфат, NADPH = никотинамидадениндинуклеотидфосфат (восстановленный динуклеотид), NADP⁺ = никотинамидадениндинуклеотидфосфат, CO₂ = диоксид углерода и PO₄ = неорганический фосфат.

Фиг. 7 представляет собой схематическое изображение ферментативного пути превращения крахмала в арабинозу. Сокращения имеют следующие значения: G1P = глюкозо-1-фосфат, G6P = глюкозо-6-фосфат, 6PGL = 6-фосфоглюконолактон, 6PG = 6-фосфоглюконат, Ru5P = арабинозо-5-фосфат, Ar5P = рибозо-5-фосфат, NADPH = никотинамидадениндинуклеотидфосфат (восстановленный динуклеотид), NADP⁺ = никотинамидадениндинуклеотидфосфат, CO₂ = диоксид углерода и PO₄ = неорганический фосфат.

Фиг. 8 представляет собой схематическое изображение ферментативного пути превращения крахмала в маннозу. Сокращения имеют следующие значения: G1P = глюкозо-1-фосфат, G6P = глюкозо-6-фосфат, F6P = фруктозо-6-фосфат, M6P = маннозо-6-фосфат и PO4 = неорганический фосфат.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

В настоящем документе описаны ферментативные пути, применяемые для превращения крахмала (например, амилозы или амилопектина) или целлюлозы/целлодекстрина в пентозные (например, рибозу, арабинозу или ксилулозу) и/или гексозные (например, аллюлозу, глюкозу или фруктозу) сахара. В ферментативных путях используют по меньшей мере одну α-глюканфосфорилазу (также называемую крахмалфосфорилазой) (ЕС 2.4.1.1) или по меньшей мере одну целлодекстринфосфорилазу (также называемую целлюлозофосфорилазой) (ЕС 2.4.1.49), по меньшей мере одну фосфоглюкомутазу (ЕС 5.4.2.2, 5.4.2.5 или 5.4.2.6) и любое количество изомераз, эпимераз и/или сахарофосфатаз, в зависимости от конечного продукта. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, ферменты или часть ферментов являются термостабильными. Такие термостабильные ферменты могут противостоять стадии нагревания в процессе получения сахара, которая инактивирует молекулы с нежелательной активностью, содержащиеся в клеточных лизатах, в которых осуществляют процессы превращения. Такая стадия инактивации нагревом снижает вероятность микробного загрязнения, отрицательно влияющего на циклы производства.

Таким образом, настоящее раскрытие относится, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, к высокоэффективным и экономически эффективным способам, композициям и системам для получения сахаров, таких как гексозные и пентозные сахара. Неограничивающие примеры путей получения сахара и ферментов данных путей представлены в приведенной ниже таблице 1.

Таблица 1. Краткое описание ферментов иллюстративных путей

Путь Субстрат Ферменты получение глюкозы α(1-4)- или β(1-4)-глюканы α- или β-(1-4)-глюканфосфорилаза (EC 2.4.1.1, 2.4.1.49),
фосфоглюкомутаза (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 5.4.2.6),
глюкозо-6-фосфатфосфатаза (EC 3.1.3.9, 3.1.3.58) получение глюкозы α(1-4)- или β(1-4)-глюканы α- или β-(1-4)-глюканфосфорилаза (EC 2.4.1.1, 2.4.1.49),
глюкозо-1-фосфатфосфатаза (EC 3.1.3.10) получение фруктозы α(1-4)- или β(1-4)-глюканы α- или β-(1-4)-глюканфосфорилаза (EC 2.4.1.1, 2.4.1.49),
фосфоглюкомутаза (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 5.4.2.6),
фосфоглюкоизомераза (EC 5.3.1.9) и
фруктозо-6-фосфатфосфатаза (EC 3.1.3.-, 3.1.3.58) получение аллюлозы α(1-4)- или β(1-4)-глюканы α- или β-(1-4)-глюканфосфорилаза (EC 2.4.1.1, 2.4.1.49),
фосфоглюкомутаза (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 5.4.2.6),
фосфоглюкоизомераза (EC 5.3.1.9),
аллюлозо-6-фосфатэпимераза (EC 5.1.3.-) и
аллюлозо-6-фосфатфосфатаза (EC 3.1.3.-, 3.1.3.58) получение сорбита α(1-4)- или β(1-4)-глюканы α- или β-(1-4)-глюканфосфорилаза (EC 2.4.1.1, 2.4.1.49),
фосфоглюкомутаза (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 5.4.2.6),
альдозодегидрогеназа (EC 1.1.1.200) и
сорбит-6-фосфатфосфатаза (EC 3.1.3.50, 3.1.3.58) получение сорбита α(1-4)- или β(1-4)-глюканы α- или β-(1-4)-глюканфосфорилаза (EC 2.4.1.1, 2.4.1.49),
фосфоглюкомутаза (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 5.4.2.6),
фосфоглюкоизомераза (EC 5.3.1.9)
сорбит-6-фосфат-2-дегидрогеназа (EC 1.1.1.140)
сорбит-6-фосфатфосфатаза (EC 3.1.3.50, 3.1.3.58) получение рибулозы α(1-4)- или β(1-4)-глюканы α- или β-(1-4)-глюканфосфорилаза (EC 2.4.1.1, 2.4.1.49),
фосфоглюкомутаза (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 5.4.2.6),
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (EC 1.1.1.49, 1.1.1.388, 1.1.1.363),
6-фосфоглюконолактоназа (EC 3.1.1.31),
6-фосфоглюконатдегидрогеназа (EC 1.1.1.44, 1.1.1.343, 1.1.1.351) и
рибулозо-5-фосфатфосфатаза (EC 3.1.3.-, 3.1.3.58) получение рибозы α(1-4)- или β(1-4)-глюканы α- или β-(1-4)-глюканфосфорилаза (EC 2.4.1.1, 2.4.1.49),
фосфоглюкомутаза (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 5.4.2.6),
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (EC 1.1.1.49, 1.1.1.388, 1.1.1.363),
6-фосфоглюконолактоназа (EC 3.1.1.31),
6-фосфоглюконатдегидрогеназа (EC 1.1.1.44, 1.1.1.343, 1.1.1.351) и
рибозо-5-фосфатизомераза (EC 5.3.1.6) и
рибозо-5-фосфатфосфатаза (EC 3.1.3.-, 3.1.3.58) получение арабинозы α(1-4)- или β(1-4)-глюканы α- или β-(1-4)-глюканфосфорилаза (EC 2.4.1.1, 2.4.1.49),
фосфоглюкомутаза (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 5.4.2.6),
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (EC 1.1.1.49, 1.1.1.388, 1.1.1.363),
6-фосфоглюконолактоназа (EC 3.1.1.31),
6-фосфоглюконатдегидрогеназа (EC 1.1.1.44, 1.1.1.343, 1.1.1.351) и
арабинозо-5-фосфатизомераза (EC 5.3.1.13) и
арабинозо-5-фосфатфосфатаза (EC 3.1.3.-, 3.1.3.58) получение маннозы α(1-4)- или β(1-4)-глюканы α- или β-(1-4)-глюканфосфорилаза (EC 2.4.1.1, 2.4.1.49),
фосфоглюкомутаза (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 5.4.2.6),
фосфоглюкоизомераза (EC 5.3.1.9),
маннозо-6-фосфатизомераза (EC 5.3.1.8) и
маннозо-6-фосфатфосфатаза (EC 3.1.3.-, 3.1.3.58)

Получение аллюлозы

Некоторые аспекты настоящего раскрытия относятся к способам, композициям и системам для получения аллюлозы. Такие способы, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной α-глюканфосфорилазы и/или по меньшей мере одной целлодекстринфосфорилазы, по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной фосфоглюкоизомеразы, по меньшей мере одной аллюлозо-6-фосфатэпимеразы, по меньшей мере одной аллюлозо-6-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух (например, по меньшей мере трех или по меньшей мере четырех) из вышеперечисленных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, α-глюканфосфорилаза (и/или целлодекстринфосфорилаза) и фосфоглюкомутаза экспрессируются в виде единого гибридного (химерного) белка или бифункционального белка.

Гибридный белок можно создать путем соединения двух или более генов или генных сегментов, которые кодируют отдельные белки. Трансляция такого гибридного гена приводит к получению одного или нескольких полипептидов с функциональными свойствами, полученными от каждого из исходных белков. Полифункциональный белок представляет собой единый белок, который обладает по меньшей мере двумя различными активностями, причем такое функциональное свойство представляет собой природную биологическую функцию или является результатом гибридизации сконструированных ферментов. Другие ферменты также могут экспрессироваться в виде единого гибридного белка или полифункционального белка. Таким образом, гибридный белок может обладать множеством функциональных свойств любого из описанных в настоящем документе ферментов путей.

Ферменты путей получения аллюлозы, представленные в настоящем документе, обычно гетерологичны по отношению к клетке-хозяину (первоначально клонированы или получены из клеток другого типа), хотя некоторые из ферментов могут быть эндогенными (природными) по отношению к клетке-хозяину. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один фермент (например, термостабильный фермент), применяемый для превращения крахмала и/или целлодекстрина в аллюлозу, является гетерологичным по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре фермента являются гетерологичными по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один фермент является эндогенным (природным) по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре фермента являются эндогенным по отношению к клетке-хозяину.

Клетками-хозяевами могут быть прокариотические клетки, такие как бактериальные клетки (например, клетки, Escherichia coli), или эукариотические клетки, такие как дрожжевые клетки или клетки растений. Ниже описаны и другие типы клеток.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один из ферментов, применяемых для превращения крахмала и/или целлюлозы/целлодекстрина в аллюлозу, является термостабильным ферментом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два (например, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре) фермента являются термостабильными ферментами. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, все ферменты являются термостабильными ферментами. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной α-глюканфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкоизомеразы, по меньшей мере одной термостабильной аллюлозо-6-фосфатэпимеразы, по меньшей мере одной термостабильной аллюлозо-6-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной целлодекстринфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкоизомеразы, по меньшей мере одной термостабильной аллюлозо-6-фосфатэпимеразы, по меньшей мере одной термостабильной аллюлозо-6-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы получения аллюлозы предусматривает лизирование (например, термический, механический, химический или ферментативный лизис) культивированных клеток с получением по меньшей мере одного (например, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех или по меньшей мере четырех) клеточного лизата. Следует понимать, что в ферментативных реакциях, которые представлены в настоящем документе, можно применять множество клеточных лизатов (и, следовательно, множество клеточных популяций, например, из одного и того же организма (например, бактерии) или из разных организмов (например, бактерий, дрожжей и/или растительных клеток)). Например, одна клеточная популяция может быть сконструирована для экспрессии одного или нескольких ферментов пути получения аллюлозы, тогда как другая клеточная популяция (или несколько других клеточных популяций) может быть сконструирована для экспрессии другого (по меньшей мере, одного другого) фермента пути получения аллюлозы. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной α-глюканфосфорилазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкоизомеразы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной аллюлозо-6-фосфатэпимеразы, и/или культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной аллюлозо-6-фосфатфосфатазы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной целлодекстринфосфорилазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкоизомеразы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной аллюлозо-6-фосфатэпимеразы, и/или культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной аллюлозо-6-фосфатфосфатазы. После лизиса клеток клеточные лизаты объединяют с тем, чтобы ферменты присутствовали в едином клеточном лизате/единой реакционной смеси.

Следует понимать, что в любом из описываемых в настоящем документе способов клетки можно лизировать любым способом, включая механический, химический, ферментативный, осмотический и/или термический лизис. Таким образом, стадию лизирования и стадию нагревания (инактивации нагреванием) можно объединить в одну стадию нагревания клеток до температуры, которая лизирует клетки и инактивирует природные молекулы с нежелательной ферментативной активностью.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы дополнительно предусматривают нагревание одного или нескольких клеточных лизатов (или смеси клеточных лизатов) до температуры, которая инактивирует природные молекулы с нежелательной ферментативной активностью, но не инактивирует какие-либо термостабильные ферменты пути получения, с получением инактивированного нагреванием лизата. Один или несколько клеточных лизатов, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, нагревают до температуры по меньшей мере 50°C. Например, один или несколько клеточных лизатов можно нагреть до температуры по меньшей мере 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C или 90°C. Природный фермент (или другой, отличный от термостабильного фермент) считается инактивированным, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, когда уровень его активности уменьшен по меньшей мере на 50%. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, природный фермент (или другой, отличный от термостабильного фермент) считается инактивированным, когда уровень его активности уменьшен по меньшей мере на 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100%.

Один или несколько клеточных лизатов можно нагревать на протяжении периода времени, достаточного для инактивации природных ферментов (или других, отличных от термостабильных ферментов) клетки. Например, один или несколько клеточных лизатов можно нагревать в течение по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 минут. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, один или несколько клеточных лизатов нагревают в течение более чем 5 минут. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, один или несколько клеточных лизатов нагревают на протяжении периода времени, достаточного для уменьшения активности по меньшей мере некоторых природных ферментов (или других, отличных от термостабильных ферментов) по меньшей мере на 50% (например, по меньшей мере на 60%, 70%, 80% или 90%).

После инактивации нагреванием, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) очищенный фермент (или частично очищенный фермент) добавляют к клеточному лизату/реакционной смеси. Таким образом, реакционная смесь, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, включает комбинацию ферментов, присутствующих в клеточном лизате (экспрессируемых одной или несколькими сконструированными клетками-хозяевами), и по меньшей мере одного очищенного фермента. По меньшей мере один очищенный фермент можно выбрать из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз или целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, аллюлозо-6-фосфатэпимераз и аллюлозо-6-фосфатфосфатаз.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы также предусматривают инкубирование одного или нескольких инактивированных нагреванием лизатов в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением аллюлозы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы также предусматривают инкубирование одного или нескольких инактивированных нагреванием лизатов в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением аллюлозы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, инактивированные нагреванием лизаты инкубируют при температуре по меньшей мере 50°C. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, инактивированные нагреванием лизаты инкубируют в течение по меньшей мере 2 минут (например, по меньшей мере 3, 4 или 5 минут). Например, инактивированные нагреванием лизаты можно инкубировать в течение 2-5 минут или 2-10 минут. Крахмал может представлять собой, например, амилозу, амилопектин или смесь из амилозы и амилопектина. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, вместо крахмала применяют биомассу. Например, реакция может предусматривать участие одной или нескольких целлодекстринфосфорилаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, крахмал или целлодекстрин присутствует в качестве компонента смеси (например, части биомассы). Например, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, один или несколько инактивированных нагреванием лизатов (например, лизатов клеток микроорганизмов) инкубируют в присутствии кукурузного жома и неорганического фосфата с получением аллюлозы (или любого другого описываемого в настоящем документе сахара).

Настоящее изобретение также относится к клеткам и клеточным лизатам, применяемым для получения аллюлозы. Таким образом, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка, дрожжевая клетка и/или растительная клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию может включать по меньшей мере один (например, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре) фермент, выбранный из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, аллюлозо-6-фосфатэпимераз и аллюлозо-6-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию может включать по меньшей мере один (например, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре) фермент, выбранный из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, аллюлозо-6-фосфатэпимераз и аллюлозо-6-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка, дрожжевая клетка и/или растительная клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два, по меньшей мере три, или по меньшей мере четыре) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильных аллюлозо-6-фосфатэпимераз и термостабильных аллюлозо-6-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильных аллюлозо-6-фосфатэпимераз и термостабильных аллюлозо-6-фосфатфосфатаз.

Таблица 2. Иллюстративные ферменты пути аллюлозы

Стадия пути Название фермента EC № Природный организм NCBI № 1 α-глюканфосфорилаза 2.4.1.1 Aquifex aeolicus WP_010880430 Thermocrinis minervae WP_079654205 Thermosulfidibacter takaii WP_068550435 Thermosulfurimonas dismutans WP_068671361 Thermococcus litoralis WP_004066514 Palaeococcus pacificus WP_048164525 Thermotoga neapolitana WP_015919877 Ruminiclostridium thermocellum WP_003512623 Pyrococcus abyssi WP_048146597 Thermococcus thioreducens WP_055429034 Deinococcus radiodurans NP_295917 Sulfolobus acidocaldarius WP_011277212 Thermus caldophilus AAV68178 Meiothermus silvanus ADH63988 Oceanithermus profundus WP_013457575 Ardenticatena maritima WP_054491617 Thermococcus barophilus WP_013466486 Pseudothermotoga thermarum WP_013931760 Hydrogenobacter thermophilus WP_012962737 Thermus oshimai AFV76231 Meiothermus ruber WP_013013285 Marinitoga piezophila WP_014295659 Целлодекстринфосфорилаза (также называемая целлодекстрин-фосфорилазой) 2.4.2.49 Clostridium thermocellum BAB71818 Clostridium straminisolvens GAE90338 Thermotoga RQ2 WP_011943512 Ignisphaera aggregans ADM28607 Thermotoga maritima WP_004082399 Spirochaeta thermophila WP_013314871 Caldicellulosiruptor bescii WP_015907054 Dictyoglomus thermophilum WP_012548338 Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum WP_013297089 Thermosipho africanus ACJ76363 Caldisalinibacter kiritimatiensis WP_006313788 Defluviitalea phaphyphila WP_058486419 Caldicellulosiruptor kronotskyensis WP_013429146 Thermococcus sibiricus WP_015848606 Thermosphaera aggregans WP_013129904 2 Фосфоглюкомутаза 5.4.2.6 Thermococcus kodakaraensis BAD42440 Pyrococcus kukulkanii WP_068320630 Ammonifex degensii WP_015738524 Methanothermobacter wolfeii WP_074359679 Methanothermus fervidus WP_013413625 Sulfolobus acidocaldarius WP_011277678 Archaeoglobus fulgidus WP_010877965 Ferroglobus placidus WP_012964640 Geoglobus ahangari WP_048096365 Archaeoglobus veneficus WP_013683858 Archaeoglobus sulfaticallidus WP_015589873 Aciduliprofundum boonie WP_012997480 Clostridium thermocellum WP_003517493 Defluviitalea phaphyphila WP_058485855 Caminicella sporogenes WP_072968430 Caloranaerobacter ferrireducens WP_069650396 Thermosipho malanesiensis WP_012056981 Fervidobacterium pennivorans WP_014451812 Symbiobacterium thermophilum WP_011196853 Spirochaeta thermophila ADN02136 Thermoanaerobacter wiegelii AEM79998 3 Фосфоглюкоизомераза 5.3.1.9 Thermus thermophilus WP_041443619 Meiothermus timidus WP_018467230 Thermus filiformis WP_038061840 Marinithermus hydrothermalis WP_013704730 Thermosipho africanus WP_004103575 Sulfurihydrogenibium azorense WP_012674892 Persephonella marina WP_012675923 Marinitoga piezophila WP_014295589 Kosmotoga olearia WP_012744692 Thermotoga maritima WP_004081585 Geobacillus stearothermophilus KZE97846 Anoxybacillus flavithermus WP_041638934 Thermosulfidibacter takaii BAT72177 Fervidobacterium nodosum WP_011994042 Clostridium thermocellum WP_003512317 Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum WP_013297353 Methanococcus jannaschii WP_010871130 Methanotorris igneus WP_013799854 Methanocaldococcus villosus WP_004589908 Methanothermococcus okinawensis WP_013867340 Pseudothermotoga thermarum WP_013931655 Deferribacter desulfuricans WP_013007743 Thermovibrio ammonificans WP_013537727 4 Аллюлозо-6-фосфатэпимераза 5.3.1.- Thermobacterium thermosaccharolyticum WP_013298194 Thermoanaerobacter brockii WP_003868217 Caldanaerobacter subterraneus WP_011025758 Deferribacter desulfuricans WP_013008817 Thermocrinis ruber WP_025305325 Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1 WP_008287078 Brevibacillus thermoruber WP_029098887 Thermosipho atlanticus WP_073071389 Thermosulfidibacter takaii WP_068550718 5 Аллюлозо-6-фосфатфосфатаза 3.1.3.- Thermoanaerobacter wiegelii WP_014063120 Thermoanaerobacter ethanolicus WP_003870772 Thermus islandicus WP_022799086 Deinococcus geothermalis DSM 11300 ABF44399 Thermosphaera aggregans WP_013129214 Crenarchaeota archaeon 13_1_40CM_3_53_5 WP_013335457 Pyrococcus horikoshii Ot3 WP_010884566 Aquifex aeolicus WP_010880861 Ruminiclostridium thermocellum WP_003512401 Desulfotomaculum kuznetsovii AEG14852 Caldanaerobacter subterraneus WP_009610632 Acidothermus cellulolyticus WP_011718939 Methanothermobacter thermautotrophicus WP_010877362 Thermobifida fusca AAZ54262 Thermotoga neapolitana ACM23496 Petrotoga mobilis WP_012207996 Thermodesulfatator indicus WP_013908370 Thermus thermophilus AAS81813 Bacteroides vulgatus ABR41712 Bacteroides fragilus CAH06673

Следует понимать, что путь получения аллюлозы может включать любую комбинацию ферментов, выбранных из каждой стадии 1-5 пути из таблицы 2. Например, α-глюканфосфорилазу стадии 1 пути можно выбрать из любой из α-глюканфосфорилаз из Aquifex aeolicus, Thermocrinis minervae, Thermosulfidibacter takaii, Thermosulfurimonas dismutans, Thermococcus litoralis, Palaeococcus pacificus, Thermotoga neapolitana, Ruminiclostridium thermocellum, Pyrococcus abyssi, Thermococcus thioreducens, Deinococcus radiodurans, Sulfolobus acidocaldarius, Thermus caldophilus, Meiothermus silvanus, Oceanithermus profundus, Ardenticatena maritima, Thermococcus barophilus, Pseudothermotoga thermarum, Hydrogenobacter thermophilus, Thermus oshimai, Meiothermus ruber и Marinitoga piezophila и объединить с фосфоглюкомутазой из стадии 2 пути, выбранной из любой из фосфоглюкомутазы из Thermococcus kodakaraensis, Pyrococcus kukulkanii, Ammonifex degensii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermus fervidus, Sulfolobus acidocaldarius, Archaeoglobus fulgidus, Ferroglobus placidus, Geoglobus ahangari, Archaeoglobus veneficus, Archaeoglobus sulfaticallidus, Aciduliprofundum boonie, Clostridium thermocellum, Defluviitalea phaphyphila, Caminicella sporogenes, Caloranaerobacter ferrireducens, Thermosipho malanesiensis, Fervidobacterium pennivorans, Symbiobacterium thermophilum, Spirochaeta thermophila и Thermoanaerobacter wiegelii.

Получение глюкозы

Другие аспекты настоящего раскрытия относятся к способам, композициям и системам для получения глюкозы. Такие способы, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной α-глюканфосфорилазы и/или по меньшей мере одной целлодекстринфосфорилазы, по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной глюкозо-6-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух из вышеперечисленных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, α-глюканфосфорилаза (и/или целлодекстринфосфорилаза) и фосфоглюкомутаза экспрессируются в виде единого гибридного (химерного) белка или бифункционального белка. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, такие способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной α-глюканфосфорилазы и/или по меньшей мере одной целлодекстринфосфорилазы, по меньшей мере одной глюкозо-1-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух из вышеперечисленных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, α-глюканфосфорилаза (и/или целлодекстринфосфорилаза) и фосфоглюкомутаза экспрессируются в виде единого гибридного (химерного) белка или бифункционального белка.

Ферменты путей получения глюкозы, представленные в настоящем документе, обычно гетерологичны по отношению к клетке-хозяину (первоначально клонированы или получены из клеток другого типа), хотя некоторые из этих ферментов могут быть эндогенными (природными) по отношению к клетке-хозяину. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один фермент (например, термостабильный фермент), применяемый для превращения крахмала и/или целлодекстрина в глюкозу, является гетерологичным по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два фермента являются гетерологичными по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один фермент (например, термостабильный фермент) является эндогенным (природным) по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два фермента являются эндогенными по отношению к клетке-хозяину.

Клетками-хозяевами могут быть прокариотические клетки, такие как бактериальные клетки (например, клетки, Escherichia coli), или эукариотические клетки, такие как дрожжевые клетки или клетки растений. Ниже описаны и другие типы клеток.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один из ферментов, применяемых для превращения крахмала и/или целлодекстрина в глюкозу, является термостабильным ферментом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два фермента являются термостабильными ферментами. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, все ферменты являются термостабильными ферментами. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной α-глюканфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной термостабильной глюкозо-6-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной целлодекстринфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной термостабильной глюкозо-6-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной α-глюканфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной глюкозо-1-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной целлодекстринфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной глюкозо-1-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы получения глюкозы предусматривают лизирование (например, термальный, механический, химический или ферментативный лизис) культивированных клеток с получением по меньшей мере одного (например, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех или по меньшей мере четырех) клеточного лизата. Следует понимать, что в ферментативных реакциях, которые представлены в настоящем документе, можно применять множество клеточных лизатов (и, следовательно, множество клеточных популяций, например, из одного и того же организма (например, бактерии) или из разных организмов (например, бактерий, дрожжей и/или растительных клеток)). Например, одна клеточная популяция может быть сконструирована для экспрессии одного или нескольких ферментов пути получения глюкозы, тогда как другая клеточная популяция (или несколько других клеточных популяций) может быть сконструирована для экспрессии другого (по меньшей мере, одного другого) фермента пути получения глюкозы. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной α-глюканфосфорилазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, и/или культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной глюкозо-6-фосфатфосфатазы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной целлодекстринфосфорилазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, и/или культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной глюкозо-6-фосфатфосфатазы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной α-глюканфосфорилазы, и/или культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной глюкозо-1-фосфатфосфатазы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной целлодекстринфосфорилазы, и/или культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной глюкозо-1-фосфатфосфатазы. После лизиса клеток клеточные лизаты объединяют с тем, чтобы ферменты присутствовали в едином клеточном лизате/единой реакционной смеси.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы дополнительно предусматривают нагревание одного или нескольких клеточных лизатов (или смеси клеточных лизатов) до температуры, которая инактивирует природные молекулы с нежелательной ферментативной активностью, но не инактивирует какие-либо термостабильные ферменты пути получения, с получением инактивированного нагреванием лизата. Один или несколько клеточных лизатов, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, нагревают до температуры по меньшей мере 50°C. Например, один или несколько клеточных лизатов можно нагреть до температуры по меньшей мере 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C или 90°C.

Один или несколько клеточных лизатов можно нагревать на протяжении периода времени, достаточного для инактивации природных ферментов (или других, отличных от термостабильных ферментов) клетки. Например, один или несколько клеточных лизатов можно нагревать в течение по меньшей мере 2, 3, 4 или по меньшей мере 5 минут. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, один или несколько клеточных лизатов нагревают в течение более чем 5 минут. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, один или несколько клеточных лизатов нагревают на протяжении периода времени, достаточного для уменьшения активности природных ферментов (или других, отличных от термостабильных ферментов) по меньшей мере на 50% (например, по меньшей мере на 60%, 70%, 80% или 90%).

После инактивации нагреванием, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) очищенный фермент добавляют к клеточному лизату/реакционной смеси. Таким образом, реакционная смесь, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, включает комбинацию ферментов, присутствующих в клеточном лизате (экспрессируемых одной или несколькими сконструированными клетками-хозяевами), и по меньшей мере одного очищенного фермента. По меньшей мере один очищенный фермент можно выбрать из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз или целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, глюкозо-6-фосфатфосфатаз. В качестве альтернативы, по меньшей мере один очищенный фермент можно выбрать из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз или целлодекстринфосфорилаз и глюкозо-1-фосфатфосфатаз.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы также предусматривают инкубирование одного или нескольких инактивированных нагреванием лизатов в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением глюкозы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы также предусматривают инкубирование одного или нескольких инактивированных нагреванием лизатов в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением глюкозы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, инактивированные нагреванием лизаты инкубируют при температуре по меньшей мере 50°C. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, инактивированные нагреванием лизаты инкубируют в течение по меньшей мере 2 минут (например, по меньшей мере 3, 4 или 5 минут). Например, инактивированные нагреванием лизаты можно инкубировать в течение 2-5 минут или 2-10 минут.

Крахмал может представлять собой, например, амилозу, амилопектин или смесь из амилозы и амилопектина. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, вместо крахмала применяют биомассу. В соответствии с такими вариантами осуществления, реакция предусматривает участие одной или нескольких целлодекстринфосфорилаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, крахмал или целлодекстрин присутствует в качестве компонента смеси.

Настоящее изобретение также относится к клеткам и клеточным лизатам, применяемым для получения глюкозы. Таким образом, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию может включать по меньшей мере один (например, по меньшей мере два) фермент, выбранный из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз, фосфоглюкомутаз и глюкозо-6-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию может включать по меньшей мере один (например, по меньшей мере два) фермент, выбранный из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз и глюкозо-6-фосфатфосфатаз. Сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию может включать по меньшей мере один (например, по меньшей мере два) фермент, выбранный из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз и глюкозо-1-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию может включать по меньшей мере один (например, по меньшей мере два) фермент, выбранный из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз и глюкозо-1-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз и термостабильных глюкозо-6-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз и термостабильных глюкозо-6-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз и термостабильных глюкозо-1-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз и термостабильных глюкозо-1-фосфатфосфатаз.

Получение фруктозы

Еще одни аспекты настоящего раскрытия относятся к способам, композициям и системам для получения фруктозы. Такие способы, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной α-глюканфосфорилазы и/или целлодекстринфосфорилазы, по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной фосфоглюкоизомеразы, по меньшей мере одной фруктозо-6-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух из вышеперечисленных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, α-глюканфосфорилаза (и/или целлодекстринфосфорилаза) и фосфоглюкомутаза экспрессируются в виде единого гибридного (химерного) белка или бифункционального белка.

Ферменты путей получения фруктозы, представленные в настоящем документе, обычно гетерологичны по отношению к клетке-хозяину (первоначально клонированы или получены из клеток другого типа), хотя некоторые из ферментов могут быть эндогенными (природными) по отношению к клетке-хозяину. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один фермент (например, термостабильный фермент), применяемый для превращения крахмала и/или целлодекстрина в фруктозу, является гетерологичным по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два или по меньшей мере три фермента являются гетерологичными по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один фермент (например, термостабильный фермент) является эндогенным (природным) по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два или по меньшей мере три фермента являются эндогенными по отношению к клетке-хозяину.

Клетками-хозяевами могут быть прокариотические клетки, такие как бактериальные клетки (например, клетки, Escherichia coli), или эукариотические клетки, такие как дрожжевые клетки или клетки растений. Ниже описаны и другие типы клеток.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один из ферментов, применяемых для превращения крахмала и/или целлодекстрина во фруктозу, является термостабильным ферментом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два или по меньшей мере три фермента являются термостабильными ферментами. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, все ферменты являются термостабильными ферментами. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной α-глюканфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкоизомеразы, по меньшей мере одной термостабильной фруктозо-6-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной целлодекстринфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкоизомеразы, по меньшей мере одной термостабильной фруктозо-6-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы получения фруктозы предусматривают лизирование (например, термальный, механический, химический или ферментативный лизис) культивированных клеток с получением по меньшей мере одного (например, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех или по меньшей мере четырех) клеточного лизата. Следует понимать, что в ферментативных реакциях, которые представлены в настоящем документе, можно применять множество клеточных лизатов (и, следовательно, множество клеточных популяций, например, из одного и того же организма (например, бактерии) или из разных организмов (например, бактерий, дрожжей и/или растительных клеток)). Например, одна клеточная популяция может быть сконструирована для экспрессии одного или нескольких ферментов пути получения фруктозы, тогда как другая клеточная популяция (или несколько других клеточных популяций) может быть сконструирована для экспрессии другого (по меньшей мере, одного другого) фермента пути получения фруктозы. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной α-глюканфосфорилазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкоизомеразы, и/или культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фруктозо-6-фосфатфосфатазы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной целлодекстринфосфорилазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкоизомеразы, и/или культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фруктозо-6-фосфатфосфатазы. После лизиса клеток клеточные лизаты объединяют с тем, чтобы ферменты присутствовали в едином клеточном лизате/единой реакционной смеси.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы дополнительно предусматривают нагревание одного или нескольких клеточных лизатов (или смеси клеточных лизатов) до температуры, которая инактивирует природные молекулы с нежелательной ферментативной активностью, но не инактивирует какие-либо термостабильные ферменты пути получения, с получением инактивированного нагреванием лизата. Один или несколько клеточных лизатов, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, нагревают до температуры по меньшей мере 50°C. Например, один или несколько клеточных лизатов можно нагреть до температуры по меньшей мере 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C или 90°C.

Один или несколько клеточных лизатов можно нагревать на протяжении периода времени, достаточного для инактивации природных ферментов (или других, отличных от термостабильных ферментов) клетки. Например, один или несколько клеточных лизатов можно нагревать в течение по меньшей мере 2, 3, 4 или по меньшей мере 5 минут. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, один или несколько клеточных лизатов нагревают в течение более чем 5 минут. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, один или несколько клеточных лизатов нагревают на протяжении периода времени, достаточного для уменьшения активности природных ферментов (или других, отличных от термостабильных ферментов) по меньшей мере на 50% (например, по меньшей мере на 60%, 70%, 80% или 90%).

После инактивации нагреванием, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) очищенный фермент добавляют к клеточному лизату/реакционной смеси. Таким образом, реакционная смесь, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, включает комбинацию ферментов, присутствующих в клеточном лизате (экспрессируемых одной или несколькими сконструированными клетками-хозяевами), и по меньшей мере одного очищенного фермента. По меньшей мере один очищенный фермент можно выбрать из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз или целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз и фруктозо-6-фосфатфосфатаз.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы также предусматривают инкубирование одного или нескольких инактивированных нагреванием лизатов в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением фруктозы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы также предусматривают инкубирование одного или нескольких инактивированных нагреванием лизатов в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением фруктозы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, инактивированные нагреванием лизаты инкубируют при температуре по меньшей мере 50°C. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, инактивированные нагреванием лизаты инкубируют в течение по меньшей мере 2 минут (например, по меньшей мере 3, 4 или 5 минут). Например, инактивированные нагреванием лизаты можно инкубировать в течение 2-5 минут или 2-10 минут. Крахмал может представлять собой, например, амилозу, амилопектин или смесь из амилозы и амилопектина. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, вместо крахмала применяют биомассу. В соответствии с такими вариантами осуществления, реакция предусматривает участие одной или нескольких целлодекстринфосфорилаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, крахмал или целлодекстрин присутствует в качестве компонента смеси.

Настоящее изобретение также относится к клеткам и клеточным лизатам, применяемым для получения фруктозы. Таким образом, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию может включать по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) фермент, выбранный из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз, фосфоглюкомутаз и фруктозо-6-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз и термостабильной фруктозо-6-фосфатфосфатазы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз и термостабильной фруктозо-6-фосфатфосфатазы.

Получение маннозы

Еще одни некоторые аспекты настоящего раскрытия относятся к способам, композициям и системам для получения маннозы. Такие способы, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной α-глюканфосфорилазы и/или по меньшей мере одной целлодекстринфосфорилазы, по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной фосфоглюкоизомеразы, по меньшей мере одной маннозо-6-фосфатизомеразы, по меньшей мере одной маннозо-6-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух из вышеперечисленных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, α-глюканфосфорилаза (и/или целлодекстринфосфорилаза) и фосфоглюкомутаза экспрессируются в виде единого гибридного (химерного) белка или бифункционального белка.

Ферменты путей получения маннозы, представленные в настоящем документе, обычно гетерологичны по отношению к клетке-хозяину (первоначально клонированы или получены из клеток другого типа), хотя некоторые из ферментов могут быть эндогенными (природными) по отношению к клетке-хозяину. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один фермент (например, термостабильный фермент), применяемый для превращения крахмала и/или целлодекстрина в маннозу, является гетерологичным по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть ферментов являются гетерологичными по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один фермент (например, термостабильный фермент) является эндогенным (природным) по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть ферментов являются эндогенными по отношению к клетке-хозяину.

Клетками-хозяевами могут быть прокариотические клетки, такие как бактериальные клетки (например, клетки, Escherichia coli), или эукариотические клетки, такие как дрожжевые клетки или клетки растений. Ниже описаны и другие типы клеток.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один из ферментов, применяемых для превращения крахмала и/или целлодекстрина в маннозу, является термостабильным ферментом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть ферментов являются термостабильными ферментами. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, все ферменты являются термостабильными ферментами. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной α-глюканфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкоизомеразы, по меньшей мере одной термостабильной маннозо-6-фосфатизомеразы, по меньшей мере одной термостабильной маннозо-6-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной целлодекстринфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкоизомеразы, по меньшей мере одной термостабильной маннозо-6-фосфатизомеразы, по меньшей мере одной термостабильной маннозо-6-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы получения маннозы предусматривают лизирование (например, термальный, механический, химический или ферментативный лизис) культивированных клеток с получением по меньшей мере одного (например, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех или по меньшей мере четырех) клеточного лизата. Следует понимать, что в ферментативных реакциях, которые представлены в настоящем документе, можно применять множество клеточных лизатов (и, следовательно, множество клеточных популяций, например, из одного и того же организма (например, бактерии) или из разных организмов (например, бактерий, дрожжей и/или растительных клеток)). Например, одна клеточная популяция может быть сконструирована для экспрессии одного или нескольких ферментов пути получения маннозы, тогда как другая клеточная популяция (или несколько других клеточных популяций) может быть сконструирована для экспрессии другого (по меньшей мере, одного другого) фермента пути получения маннозы. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной α-глюканфосфорилазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкоизомеразы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной маннозо-6-фосфатизомеразы, и/или культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной маннозо-6-фосфатфосфатазы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной целлодекстринфосфорилазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкоизомеразы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной маннозо-6-фосфатизомеразы, и/или культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной маннозо-6-фосфатфосфатазы. После лизиса клеток клеточные лизаты объединяют с тем, чтобы ферменты присутствовали в едином клеточном лизате/единой реакционной смеси.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы дополнительно предусматривают нагревание одного или нескольких клеточных лизатов (или смеси клеточных лизатов) до температуры, которая инактивирует природные молекулы с нежелательной ферментативной активностью, но не инактивирует какие-либо термостабильные ферменты пути получения, с получением инактивированного нагреванием лизата. Один или несколько клеточных лизатов, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, нагревают до температуры по меньшей мере 50°C. Например, один или несколько клеточных лизатов можно нагреть до температуры по меньшей мере 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C или 90°C.

Один или несколько клеточных лизатов можно нагревать на протяжении периода времени, достаточного для инактивации природных ферментов (или других, отличных от термостабильных ферментов) клетки. Например, один или несколько клеточных лизатов можно нагревать в течение по меньшей мере 2, 3, 4 или по меньшей мере 5 минут. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, один или несколько клеточных лизатов нагревают в течение более чем 5 минут. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, один или несколько клеточных лизатов нагревают на протяжении периода времени, достаточного для уменьшения активности природных ферментов (или других, отличных от термостабильных ферментов) по меньшей мере на 50% (например, по меньшей мере на 60%, 70%, 80% или 90%).

После инактивации нагреванием, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) очищенный фермент добавляют к клеточному лизату/реакционной смеси. Таким образом, реакционная смесь, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, включает комбинацию ферментов, присутствующих в клеточном лизате (экспрессируемых одной или несколькими сконструированными клетками-хозяевами), и по меньшей мере одного очищенного фермента. По меньшей мере один очищенный фермент можно выбрать из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз или целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, маннозо-6-фосфатизомераз и маннозо-6-фосфатфосфатаз.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы также предусматривают инкубирование одного или нескольких инактивированных нагреванием лизатов в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением маннозы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы также предусматривают инкубирование одного или нескольких инактивированных нагреванием лизатов в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением маннозы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, инактивированные нагреванием лизаты инкубируют при температуре по меньшей мере 50°C. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, инактивированные нагреванием лизаты инкубируют в течение по меньшей мере 2 минут (например, по меньшей мере 3, 4 или 5 минут). Например, инактивированные нагреванием лизаты можно инкубировать в течение 2-5 минут или 2-10 минут. Крахмал может представлять собой, например, амилозу, амилопектин или смесь из амилозы и амилопектина. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, вместо крахмала применяют биомассу. В соответствии с такими вариантами осуществления, реакция предусматривает участие одной или нескольких целлодекстринфосфорилаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, крахмал или целлодекстрин присутствует в качестве компонента смеси.

Настоящее изобретение также относится к клеткам и клеточным лизатам, применяемым для получения маннозы. Таким образом, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию может включать по меньшей мере один (например, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть) фермент, выбранный из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, маннозо-6-фосфатизомераз и маннозо-6-фосфатфосфатаз. Сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию может включать по меньшей мере один (например, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть) фермент, выбранный из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, маннозо-6-фосфатизомераз и маннозо-6-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильных маннозо-6-фосфатизомераз и термостабильных маннозо-6-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильных маннозо-6-фосфатизомераз и термостабильных маннозо-6-фосфатфосфатаз.

Получение сорбита

Еще одни аспекты настоящего раскрытия относятся к способам, композициям и системам для получения сорбита. Такие способы, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной α-глюканфосфорилазы и/или по меньшей мере одной целлодекстринфосфорилазы, по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной альдозодегидрогеназы, по меньшей мере одной сорбит-6-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух из вышеперечисленных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной α-глюканфосфорилазы и/или по меньшей мере одной целлодекстринфосфорилазы, по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной фосфоглюкоизомеразы, по меньшей мере одной сорбит-6-фосфат-2-дегидрогеназы, по меньшей мере одной сорбит-6-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух из упомянутых выше ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, α-глюканфосфорилаза (и/или целлодекстринфосфорилаза) и фосфоглюкомутаза экспрессируются в виде единого гибридного (химерного) белка или бифункционального белка.

Ферменты путей получения сорбита, представленные в настоящем документе, обычно гетерологичны по отношению к клетке-хозяину (первоначально клонированы или получены из клеток другого типа), хотя некоторые из ферментов могут быть эндогенными (природными) по отношению к клетке-хозяину. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один фермент (например, термостабильный фермент), применяемый для превращения крахмала и/или целлодекстрина в сорбит, является гетерологичным по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два или по меньшей мере три фермента являются гетерологичными по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один фермент (например, термостабильный фермент) является эндогенным (природным) по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два или по меньшей мере три фермента являются эндогенными по отношению к клетке-хозяину.

Клетками-хозяевами могут быть прокариотические клетки, такие как бактериальные клетки (например, клетки, Escherichia coli), или эукариотические клетки, такие как дрожжевые клетки или клетки растений. Ниже описаны и другие типы клеток.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один из ферментов, применяемых для превращения крахмала и/или целлодекстрина в сорбит, является термостабильным ферментом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре фермента являются термостабильными ферментами. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, все ферменты являются термостабильными ферментами. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной α-глюканфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной термостабильной альдозодегидрогеназы, по меньшей мере одной термостабильной сорбит-6-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной целлодекстринфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной термостабильной альдозодегидрогеназы, по меньшей мере одной термостабильной сорбит-6-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной α-глюканфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкоизомеразы, по меньшей мере одной термостабильной сорбит-6-фосфат-2-дегидрогеназы, по меньшей мере одной термостабильной сорбит-6-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной целлодекстранфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкоизомеразы, по меньшей мере одной термостабильной сорбит-6-фосфат-2-дегидрогеназы, по меньшей мере одной термостабильной сорбит-6-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы получения сорбита предусматривают лизирование (например, термальный, механический, химический или ферментативный лизис) культивированных клеток с получением по меньшей мере одного (например, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех или по меньшей мере четырех) клеточного лизата. Следует понимать, что в ферментативных реакциях, которые представлены в настоящем документе, можно применять множество клеточных лизатов (и, следовательно, множество клеточных популяций, например, из одного и того же организма (например, бактерии) или из разных организмов (например, бактерий, дрожжей и/или растительных клеток)). Например, одна клеточная популяция может быть сконструирована для экспрессии одного или нескольких ферментов пути получения сорбита, тогда как другая клеточная популяция (или несколько других клеточных популяций) может быть сконструирована для экспрессии другого (по меньшей мере, одного другого) фермента пути получения сорбита. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной α-глюканфосфорилазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной альдозодегидрогеназы, и/или культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной сорбит-6-фосфатфосфатазы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной целлодекстринфосфорилазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной альдозодегидрогеназы, и/или культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной сорбит-6-фосфатфосфатазы. После лизиса клеток клеточные лизаты объединяют с тем, чтобы ферменты присутствовали в едином клеточном лизате/единой реакционной смеси.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы дополнительно предусматривают нагревание одного или нескольких клеточных лизатов (или смеси клеточных лизатов) до температуры, которая инактивирует природные молекулы с нежелательной ферментативной активностью, но не инактивирует какие-либо термостабильные ферменты пути получения, с получением инактивированного нагреванием лизата. Один или несколько клеточных лизатов, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, нагревают до температуры по меньшей мере 50°C. Например, один или несколько клеточных лизатов можно нагреть до температуры по меньшей мере 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C или 90°C.

Один или несколько клеточных лизатов можно нагревать на протяжении периода времени, достаточного для инактивации природных ферментов (или других, отличных от термостабильных ферментов) клетки. Например, один или несколько клеточных лизатов можно нагревать в течение по меньшей мере 2, 3, 4 или по меньшей мере 5 минут. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, один или несколько клеточных лизатов нагревают в течение более чем 5 минут. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, один или несколько клеточных лизатов нагревают на протяжении периода времени, достаточного для уменьшения активности природных ферментов (или других, отличных от термостабильных ферментов) по меньшей мере на 50% (например, по меньшей мере на 60%, 70%, 80% или 90%).

После инактивации нагреванием, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) очищенный фермент добавляют к клеточному лизату/реакционной смеси. Таким образом, реакционная смесь, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, включает комбинацию ферментов, присутствующих в клеточном лизате (экспрессируемых одной или несколькими сконструированными клетками-хозяевами), и по меньшей мере одного очищенного фермента. По меньшей мере один очищенный фермент можно выбрать из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз или целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, сорбит-6-фосфат-2-дегидрогеназ, альдозодегидрогеназ и сорбит-6-фосфатфосфатаз.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы также предусматривают инкубирование одного или нескольких инактивированных нагреванием лизатов в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением сорбита. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы также предусматривают инкубирование одного или нескольких инактивированных нагреванием лизатов в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением сорбита. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, инактивированные нагреванием лизаты инкубируют при температуре по меньшей мере 50°C. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, инактивированные нагреванием лизаты инкубируют в течение по меньшей мере 2 минут (например, по меньшей мере 3, 4 или 5 минут). Например, инактивированные нагреванием лизаты можно инкубировать в течение 2-5 минут или 2-10 минут. Крахмал может представлять собой, например, амилозу, амилопектин или смесь из амилозы и амилопектина. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, вместо крахмала применяют биомассу. В соответствии с такими вариантами осуществления, реакция предусматривает участие одной или нескольких целлодекстринфосфорилаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, крахмал или целлодекстрин присутствует в качестве компонента смеси.

Настоящее изобретение также относится к клеткам и клеточным лизатам, применяемым для получения сорбита. Таким образом, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию может включать по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) фермент, выбранный из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, альдозодегидрогеназ и сорбит-6-фосфатфосфатаз. Сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию может включать по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) фермент, выбранный из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, альдозодегидрогеназ и сорбит-6-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных альдозодегидрогеназ и термостабильных сорбит-6-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных альдозодегидрогеназ и термостабильных сорбит-6-фосфатфосфатаз. Таким образом, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию может включать по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) фермент, выбранный из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, сорбит-6-фосфат-2-дегидрогеназ и сорбит-6-фосфатфосфатаз. Сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию может включать по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) фермент, выбранный из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, сорбит-6-фосфат-2-дегидрогеназ и сорбит-6-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильных сорбит-6-фосфатальдозодегидрогеназ и термостабильных сорбит-6-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильных сорбит-6-фосфат-2-дегидрогеназ и термостабильных сорбит-6-фосфатфосфатаз.

Получение рибулозы

Дополнительные аспекты настоящего раскрытия относятся к способам, композициям и системам для получения рибулозы. Такие способы, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной α-глюканфосфорилазы и/или целлодекстринфосфорилазы, по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, по меньшей мере одной 6-фосфоглюконолактоназы, по меньшей мере одной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, по меньшей мере одной рибулозо-5-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух из вышеперечисленных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, α-глюканфосфорилаза (и/или целлодекстринфосфорилаза) и фосфоглюкомутаза экспрессируются в виде единого гибридного (химерного) белка или бифункционального белка.

Ферменты путей получения рибулозы, представленные в настоящем документе, обычно гетерологичны по отношению к клетке-хозяину (первоначально клонированы или получены из клеток другого типа), хотя некоторые из ферментов могут быть эндогенными (природными) по отношению к клетке-хозяину. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один фермент (например, термостабильный фермент), применяемый для превращения крахмала и/или целлодекстрина в рибулозу, является гетерологичным по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре или по меньшей мере пять ферментов являются гетерологичными по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один фермент (например, термостабильный фермент) является эндогенным (природным) по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре или по меньшей мере пять ферментов являются эндогенными по отношению к клетке-хозяину.

Клетками-хозяевами могут быть прокариотические клетки, такие как бактериальные клетки (например, клетки, Escherichia coli), или эукариотические клетки, такие как дрожжевые клетки или клетки растений. Ниже описаны и другие типы клеток.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один из ферментов, применяемых для превращения крахмала и/или целлодекстрина в рибулозу, является термостабильным ферментом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре или по меньшей мере пять ферментов являются термостабильными ферментами. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, все ферменты являются термостабильными ферментами. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной α-глюканфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной термостабильной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, по меньшей мере одной термостабильной 6-фосфоглюконолактоназы, по меньшей мере одной термостабильной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, по меньшей мере одной термостабильной рибулозо-5-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной целлодекстринфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной термостабильной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, по меньшей мере одной термостабильной 6-фосфоглюконолактоназы, по меньшей мере одной термостабильной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, по меньшей мере одной термостабильной рибулозо-5-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы получения рибулозы предусматривают лизирование (например, термальный, механический, химический или ферментативный лизис) культивированных клеток с получением по меньшей мере одного (например, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех или по меньшей мере четырех) клеточного лизата. Следует понимать, что в ферментативных реакциях, которые представлены в настоящем документе, можно применять множество клеточных лизатов (и, следовательно, множество клеточных популяций, например, из одного и того же организма (например, бактерии) или из разных организмов (например, бактерий, дрожжей и/или растительных клеток)). Например, одна клеточная популяция может быть сконструирована для экспрессии одного или нескольких ферментов пути получения рибулозы, тогда как другая клеточная популяция (или несколько других клеточных популяций) может быть сконструирована для экспрессии другого (по меньшей мере, одного другого) фермента пути получения рибулозы. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной α-глюканфосфорилазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной 6-фосфоглюконолактоназы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, и/или культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной рибулозо-5-фосфатфосфатазы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной целлодекстринфосфорилазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной 6-фосфоглюконолактоназы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, и/или культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной рибулозо-5-фосфатфосфатазы. После лизиса клеток клеточные лизаты объединяют с тем, чтобы ферменты присутствовали в едином клеточном лизате/единой реакционной смеси.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы дополнительно предусматривают нагревание одного или нескольких клеточных лизатов (или смеси клеточных лизатов) до температуры, которая инактивирует природные молекулы с нежелательной ферментативной активностью, но не инактивирует какие-либо термостабильные ферменты пути получения, с получением инактивированного нагреванием лизата. Один или несколько клеточных лизатов, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, нагревают до температуры по меньшей мере 50°C. Например, один или несколько клеточных лизатов можно нагреть до температуры по меньшей мере 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C или 90°C.

Один или несколько клеточных лизатов можно нагревать на протяжении периода времени, достаточного для инактивации природных ферментов (или других, отличных от термостабильных ферментов) клетки. Например, один или несколько клеточных лизатов можно нагревать в течение по меньшей мере 2, 3, 4 или по меньшей мере 5 минут. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, один или несколько клеточных лизатов нагревают в течение более чем 5 минут. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, один или несколько клеточных лизатов нагревают на протяжении периода времени, достаточного для уменьшения активности природных ферментов (или других, отличных от термостабильных ферментов) по меньшей мере на 50% (например, по меньшей мере на 60%, 70%, 80% или 90%).

После инактивации нагреванием, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) очищенный фермент добавляют к клеточному лизату/реакционной смеси. Таким образом, реакционная смесь, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, включает комбинацию ферментов, присутствующих в клеточном лизате (экспрессируемых одной или несколькими сконструированными клетками-хозяевами), и по меньшей мере одного очищенного фермента. По меньшей мере один очищенный фермент можно выбрать из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз или целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, 6-фосфоглюконолактоназ, 6-фосфоглюконатдегидрогеназ и рибулозо-5-фосфатфосфатаз.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы также предусматривают инкубирование одного или нескольких инактивированных нагреванием лизатов в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением рибулозы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы также предусматривают инкубирование одного или нескольких инактивированных нагреванием лизатов в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением рибулозы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, инактивированные нагреванием лизаты инкубируют при температуре по меньшей мере 50°C. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, инактивированные нагреванием лизаты инкубируют в течение по меньшей мере 2 минут (например, по меньшей мере 3, 4 или 5 минут). Например, инактивированные нагреванием лизаты можно инкубировать в течение 2-5 минут или 2-10 минут. Крахмал может представлять собой, например, амилозу, амилопектин или смесь из амилозы и амилопектина. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, вместо крахмала применяют биомассу. В соответствии с такими вариантами осуществления, реакция предусматривает участие одной или нескольких целлодекстринфосфорилаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, крахмал или целлодекстрин присутствует в качестве компонента смеси.

Настоящее изобретение также относится к клеткам и клеточным лизатам, применяемым для получения рибулозы. Таким образом, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию может включать по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) фермент, выбранный из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, 6-фосфоглюконолактоназ, 6-фосфоглюконатдегидрогеназ и рибулозо-5-фосфатфосфатаз. Сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию может включать по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) фермент, выбранный из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, 6-фосфоглюконолактоназ, 6-фосфоглюконатдегидрогеназ и рибулозо-5-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ и термостабильных рибулозо-5-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ и термостабильных рибулозо-5-фосфатфосфатаз.

Получение рибозы

Еще одни некоторые аспекты настоящего раскрытия относятся к способам, композициям и системам для получения рибозы. Такие способы, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной α-глюканфосфорилазы и/или по меньшей мере одной целлодекстринфосфорилазы, по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, по меньшей мере одной 6-фосфоглюконолактоназы, по меньшей мере одной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, по меньшей мере одной рибозо-5-фосфатизомеразы, по меньшей мере одной рибозо-5-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух из вышеперечисленных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, α-глюканфосфорилаза (и/или целлодекстринфосфорилаза) и фосфоглюкомутаза экспрессируются в виде единого гибридного (химерного) белка или бифункционального белка.

Ферменты путей получения рибозы, представленные в настоящем документе, обычно гетерологичны по отношению к клетке-хозяину (первоначально клонированы или получены из клеток другого типа), хотя некоторые из ферментов могут быть эндогенными (природными) по отношению к клетке-хозяину. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один фермент (например, термостабильный фермент), применяемый для превращения крахмала и/или целлодекстрина в рибозу, является гетерологичным по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть ферментов являются гетерологичными по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один фермент (например, термостабильный фермент) является эндогенным (природным) по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть ферментов являются эндогенными по отношению к клетке-хозяину.

Клетками-хозяевами могут быть прокариотические клетки, такие как бактериальные клетки (например, клетки, Escherichia coli), или эукариотические клетки, такие как дрожжевые клетки или клетки растений. Ниже описаны и другие типы клеток.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один из ферментов, применяемых для превращения крахмала и/или целлодекстрина в рибозу, является термостабильным ферментом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть ферментов являются термостабильными ферментами. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, все ферменты являются термостабильными ферментами. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной α-глюканфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной термостабильной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, по меньшей мере одной термостабильной 6-фосфоглюконолактоназы, по меньшей мере одной термостабильной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, по меньшей мере одной термостабильной рибозо-5-фосфатизомеразы, по меньшей мере одной термостабильной рибозо-5-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной целлодекстринфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной термостабильной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, по меньшей мере одной термостабильной 6-фосфоглюконолактоназы, по меньшей мере одной термостабильной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, по меньшей мере одной термостабильной рибозо-5-фосфатизомеразы, по меньшей мере одной термостабильной рибозо-5-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы получения рибозы предусматривают лизирование (например, термальный, механический, химический или ферментативный лизис) культивированных клеток с получением по меньшей мере одного (например, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех или по меньшей мере четырех) клеточного лизата. Следует понимать, что в ферментативных реакциях, которые представлены в настоящем документе, можно применять множество клеточных лизатов (и, следовательно, множество клеточных популяций, например, из одного и того же организма (например, бактерии) или из разных организмов (например, бактерий, дрожжей и/или растительных клеток)). Например, одна клеточная популяция может быть сконструирована для экспрессии одного или нескольких ферментов пути получения рибозы, тогда как другая клеточная популяция (или несколько других клеточных популяций) может быть сконструирована для экспрессии другого (по меньшей мере, одного другого) фермента пути получения рибозы. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной α-глюканфосфорилазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной 6-фосфоглюконолактоназы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной рибозо-5-фосфатизомеразы, и/или культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной рибозо-5-фосфатфосфатазы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной целлодекстринфосфорилазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной 6-фосфоглюконолактоназы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной рибозо-5-фосфатизомеразы, и/или культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной рибозо-5-фосфатфосфатазы. После лизиса клеток клеточные лизаты объединяют с тем, чтобы ферменты присутствовали в едином клеточном лизате/единой реакционной смеси.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы дополнительно предусматривают нагревание одного или нескольких клеточных лизатов (или смеси клеточных лизатов) до температуры, которая инактивирует природные молекулы с нежелательной ферментативной активностью, но не инактивирует какие-либо термостабильные ферменты пути получения, с получением инактивированного нагреванием лизата. Один или несколько клеточных лизатов, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, нагревают до температуры по меньшей мере 50°C. Например, один или несколько клеточных лизатов можно нагреть до температуры по меньшей мере 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C или 90°C.

Один или несколько клеточных лизатов можно нагревать на протяжении периода времени, достаточного для инактивации природных ферментов (или других, отличных от термостабильных ферментов) клетки. Например, один или несколько клеточных лизатов можно нагревать в течение по меньшей мере 2, 3, 4 или по меньшей мере 5 минут. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, один или несколько клеточных лизатов нагревают в течение более чем 5 минут. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, один или несколько клеточных лизатов нагревают на протяжении периода времени, достаточного для уменьшения активности природных ферментов (или других, отличных от термостабильных ферментов) по меньшей мере на 50% (например, по меньшей мере на 60%, 70%, 80% или 90%).

После инактивации нагреванием, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) очищенный фермент добавляют к клеточному лизату/реакционной смеси. Таким образом, реакционная смесь, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, включает комбинацию ферментов, присутствующих в клеточном лизате (экспрессируемых одной или несколькими сконструированными клетками-хозяевами), и по меньшей мере одного очищенного фермента. По меньшей мере один очищенный фермент можно выбрать из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз или целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, 6-фосфоглюконолактоназ, 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, рибозо-5-фосфатизомераз и рибозо-5-фосфатфосфатаз.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы также предусматривают инкубирование одного или нескольких инактивированных нагреванием лизатов в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением рибозы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы также предусматривают инкубирование одного или нескольких инактивированных нагреванием лизатов в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением рибозы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, инактивированные нагреванием лизаты инкубируют при температуре по меньшей мере 50°C. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, инактивированные нагреванием лизаты инкубируют в течение по меньшей мере 2 минут (например, по меньшей мере 3, 4 или 5 минут). Например, инактивированные нагреванием лизаты можно инкубировать в течение 2-5 минут или 2-10 минут. Крахмал может представлять собой, например, амилозу, амилопектин или смесь из амилозы и амилопектина. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, вместо крахмала применяют биомассу. В соответствии с такими вариантами осуществления, реакция предусматривает участие одной или нескольких целлодекстринфосфорилаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, крахмал или целлодекстрин присутствует в качестве компонента смеси.

Настоящее изобретение также относится к клеткам и клеточным лизатам, применяемым для получения рибозы. Таким образом, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию может включать по меньшей мере один (например, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть) фермент, выбранный из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, 6-фосфоглюконолактоназ, 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, рибозо-5-фосфатизомераз и рибозо-5-фосфатфосфатаз. Сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию может включать по меньшей мере один (например, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть) фермент, выбранный из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, 6-фосфоглюконолактоназ, 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, рибозо-5-фосфатизомераз и рибозо-5-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, термостабильных рибозо-5-фосфатизомераз и термостабильных рибозо-5-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, термостабильных рибозо-5-фосфатизомераз и термостабильных рибозо-5-фосфатфосфатаз.

Получение арабинозы

Еще одни некоторые аспекты настоящего раскрытия относятся к способам, композициям и системам для получения арабинозы. Такие способы, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной α-глюканфосфорилазы и/или по меньшей мере одной целлодекстринфосфорилазы, по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, по меньшей мере одной 6-фосфоглюконолактоназы, по меньшей мере одной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, по меньшей мере одной арабинозо-5-фосфатизомеразы, по меньшей мере одной рибозо-5-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух из вышеперечисленных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, α-глюканфосфорилаза (и/или целлодекстринфосфорилаза) и фосфоглюкомутаза экспрессируются в виде единого гибридного (химерного) белка или бифункционального белка.

Ферменты путей получения арабинозы, представленные в настоящем документе, обычно гетерологичны по отношению к клетке-хозяину (первоначально клонированы или получены из клеток другого типа), хотя некоторые из ферментов могут быть эндогенными (природными) по отношению к клетке-хозяину. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один фермент (например, термостабильный фермент), применяемый для превращения крахмала и/или целлодекстрина в арабинозу, является гетерологичным по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть ферментов являются гетерологичными по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один фермент (например, термостабильный фермент) является эндогенным (природным) по отношению к клетке-хозяину. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть ферментов являются эндогенными по отношению к клетке-хозяину.

Клетками-хозяевами могут быть прокариотические клетки, такие как бактериальные клетки (например, клетки, Escherichia coli), или эукариотические клетки, такие как дрожжевые клетки или клетки растений. Ниже описаны и другие типы клеток.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один из ферментов, применяемых для превращения крахмала и/или целлодекстрина в арабинозу, является термостабильным ферментом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть ферментов являются термостабильными ферментами. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, все ферменты являются термостабильными ферментами. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной α-глюканфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной термостабильной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, по меньшей мере одной термостабильной 6-фосфоглюконолактоназы, по меньшей мере одной термостабильной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, по меньшей мере одной термостабильной арабинозо-5-фосфатизомеразы, по меньшей мере одной термостабильной арабинозо-5-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной термостабильной целлодекстринфосфорилазы, по меньшей мере одной термостабильной фосфоглюкомутазы, по меньшей мере одной термостабильной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, по меньшей мере одной термостабильной 6-фосфоглюконолактоназы, по меньшей мере одной термостабильной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, по меньшей мере одной термостабильной арабинозо-5-фосфатизомеразы, по меньшей мере одной термостабильной арабинозо-5-фосфатфосфатазы или комбинации по меньшей мере двух или более из указанных выше термостабильных ферментов.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы получения арабинозы предусматривают лизирование (например, термальный, механический, химический или ферментативный лизис) культивированных клеток с получением по меньшей мере одного (например, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех или по меньшей мере четырех) клеточного лизата. Следует понимать, что в ферментативных реакциях, которые представлены в настоящем документе, можно применять множество клеточных лизатов (и, следовательно, множество клеточных популяций, например, из одного и того же организма (например, бактерии) или из разных организмов (например, бактерий, дрожжей и/или растительных клеток)). Например, одна клеточная популяция может быть сконструирована для экспрессии одного или нескольких ферментов пути получения арабинозы, тогда как другая клеточная популяция (или несколько других клеточных популяций) может быть сконструирована для экспрессии другого (по меньшей мере, одного другого) фермента пути получения арабинозы. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной α-глюканфосфорилазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной 6-фосфоглюконолактоназы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной арабинозо-5-фосфатизомеразы, и/или культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной арабинозо-5-фосфатфосфатазы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы предусматривают культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной целлодекстринфосфорилазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной фосфоглюкомутазы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной 6-фосфоглюконолактоназы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной арабинозо-5-фосфатизомеразы, и/или культивирование по меньшей мере одной популяции клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одной арабинозо-5-фосфатфосфатазы. После лизиса клеток клеточные лизаты объединяют с тем, чтобы ферменты присутствовали в едином клеточном лизате/единой реакционной смеси.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы дополнительно предусматривают нагревание одного или нескольких клеточных лизатов (или смеси клеточных лизатов) до температуры, которая инактивирует природные молекулы с нежелательной ферментативной активностью, но не инактивирует какие-либо термостабильные ферменты пути получения, с получением инактивированного нагреванием лизата. Один или несколько клеточных лизатов, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, нагревают до температуры по меньшей мере 50°C. Например, один или несколько клеточных лизатов можно нагреть до температуры по меньшей мере 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C или 90°C.

Один или несколько клеточных лизатов можно нагревать на протяжении периода времени, достаточного для инактивации природных ферментов (или других, отличных от термостабильных ферментов) клетки. Например, один или несколько клеточных лизатов можно нагревать в течение по меньшей мере 2, 3, 4 или по меньшей мере 5 минут. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, один или несколько клеточных лизатов нагревают в течение более чем 5 минут. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, один или несколько клеточных лизатов нагревают на протяжении периода времени, достаточного для уменьшения активности природных ферментов (или других, отличных от термостабильных ферментов) по меньшей мере на 50% (например, по меньшей мере на 60%, 70%, 80% или 90%).

После инактивации нагреванием, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, по меньшей мере один (например, по меньшей мере два или по меньшей мере три) очищенный фермент добавляют к клеточному лизату/реакционной смеси. Таким образом, реакционная смесь, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, включает комбинацию ферментов, присутствующих в клеточном лизате (экспрессируемых одной или несколькими сконструированными клетками-хозяевами), и по меньшей мере одного очищенного фермента. По меньшей мере один очищенный фермент можно выбрать из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз или целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, 6-фосфоглюконолактоназ, 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, арабинозо-5-фосфатизомераз и арабинозо-5-фосфатфосфатаз.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы также предусматривают инкубирование одного или нескольких инактивированных нагреванием лизатов в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением арабинозы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, способы также предусматривают инкубирование одного или нескольких инактивированных нагреванием лизатов в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением арабинозы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, инактивированные нагреванием лизаты инкубируют при температуре по меньшей мере 50°C. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, инактивированные нагреванием лизаты инкубируют в течение по меньшей мере 2 минут (например, по меньшей мере 3, 4 или 5 минут). Например, инактивированные нагреванием лизаты можно инкубировать в течение 2-5 минут или 2-10 минут. Крахмал может представлять собой, например, амилозу, амилопектин или смесь из амилозы и амилопектина. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, вместо крахмала применяют биомассу. В соответствии с такими вариантами осуществления, реакция предусматривает участие одной или нескольких целлодекстринфосфорилаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, крахмал или целлодекстрин присутствует в качестве компонента смеси.

Настоящее изобретение также относится к клеткам и клеточным лизатам, применяемым для получения арабинозы. Таким образом, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию может включать по меньшей мере один (например, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть) фермент, выбранный из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, 6-фосфоглюконолактоназ, 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, арабинозо-5-фосфатизомераз и арабинозо-5-фосфатфосфатаз. Сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию может включать по меньшей мере один (например, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть) фермент, выбранный из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, 6-фосфоглюконолактоназ, 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, арабинозо-5-фосфатизомераз и арабинозо-5-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, термостабильных арабинозо-5-фосфатизомераз и термостабильных арабинозо-5-фосфатфосфатаз. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированная клетка (например, бактериальная клетка и/или дрожжевая клетка) или один или несколько клеточных лизатов по настоящему раскрытию включает по меньшей мере один (например, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть) фермент, выбранный из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, термостабильных арабинозо-5-фосфатизомераз и термостабильных арабинозо-5-фосфатфосфатаз.

Пластичность субстрата и деветвящие ферменты

В случае всех описанных в настоящем документе путей можно применять множество полимерных глюкозных субстратов. Неограничивающие примеры полимерных глюкозных субстратов включают крахмал, гликоген и целлодекстрин. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, субстрат представляет собой крахмал. В соответствии с другими вариантами осуществления, субстрат представляет собой гликоген. В соответствии с еще одними вариантами осуществления, субстрат представляет собой целлодекстрин. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, применяют частично гидролизированный вариант полимерного глюкозного субстрата (например, крахмала, гликогена или целлюлозы/целлодекстрина). Крахмал и гликоген включают множество глюкозных мономеров, связанных преимущественно α(1-4)-связями, в то время как целлодекстрин включает те же самые глюкозные мономеры, связанные β(1-4)-связями. Еще одним важным отличием целлодекстрина от остальных двух субстратов является наличие α(1-6)-ответвлений от α(1-4)-цепей. Как крахмал, так и гликоген содержат эти точки ветвления, хотя гликоген существенно более разветвлен, чем крахмал. В случае α(1-4)-полимеров α-глюканфосфорилазы, также называемые α-глюкановыми фосфорилазами или гликогенфосфорилазами, в зависимости от предпочтения субстрата, потребляют полимеры по одной глюкозе за один раз, высвобождая глюкозо-1-фосфат. В случае целлодекстрина целлодекстринфосфорилаза проводит ту же реакцию, также высвобождая глюкозо-1-фосфат.

Длинные полимеры крахмала и целлюлозы/целлодекстрина зачастую нерастворимы в водных растворах и, помимо осаждения из раствора, могут вызывать гелеобразование и ретроградацию раствора. При частичном гидролизе крахмала и целлюлозы/целлодекстрина до полимеров с меньшей длиной цепи, либо химическими (например, кислотным гидролизом), либо ферментативными (например, α-амилазой) способами, получаемыми продуктами являются мальтодекстрины и целлодекстрины в случае крахмала и целлюлозы соответственно. Эти гидролизированные производные зачастую растворяются и смешиваются лучше, чем их исходные молекулы, и поэтому, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, их используют в путях, представленных в настоящем документе.

В случае гликогена, крахмала или гидролизированных мальтодекстринов α(1-6)-ответвления будут существенно снижать выход любого пути сахара, поскольку глюканфосфорилаза перерабатывает полимеры до конца их ответвлений, оставляя большое центральное ядро доступной глюкозы без изменений. В случае таких субстратов/путей можно применять деветвящие ферменты для увеличения доступности субстрата для глюканфосфорилазы. Существует два типичных класса деветвящих ферментов, которые можно применять, - это изоамилазы и пуллуланазы (см., например, таблицу 3). Ферментативно оба класса выполняют одну и ту же функцию, но различаются по субстратной специфичности. Хотя применение деветвящего фермента увеличивает выход, время применения будет зависеть от процесса и применяемых субстратов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, α-глюкан предварительно обрабатывают α-амилазой и деветвящим ферментом, а затем полученный один или несколько неразветвленных мальтодекстринов подают в реактор с другими ферментами пути. В соответствии с другими вариантами осуществления, деветвление происходит одновременно с реализацией пути, и разветвленные α-глюканы подают в реакционную смесь, содержащую все ферменты пути, а также деветвящий фермент.

Таблица 3. Иллюстративные деветвящие ферменты

Название фермента EC № Природный организм NCBI № Пуллуланаза 3.2.1.41 Fervidobacterium pennavorans AAD30387 Thermotoga sp. RQ5 WP_012310857 Bacillus flavocaldarius BAB18516 Thermosipho africanus WP_004100450 Kosmotoga olearia WP_015868997 Изоамилаза 3.2.1.68 Sulfolobus tokodaii BAB65940 Metallosphaera hakonensis AAS00512 Sphaerobacter thermophilus WP_012873143 Bacillus lentus AGL34022

Бесклеточное получение

«Бесклеточное получение» заключается в применении биологических процессов для синтеза биомолекулы или химического соединения без использования живых клеток. Скорее, клетки лизируют, а неочищенные (необработанные) порции, содержащие ферменты, используют для получения требуемого продукта. В качестве неограничивающего примера, клетки культивируют, собирают и лизируют посредством гомогенизации под высоким давлением. Бесклеточную реакцию можно проводить в порционном режиме или режиме с порционной подпиткой. В некоторых случаях сети биологических реакций заполняют рабочий объем реактора и могут быть более разбавленными, чем внутриклеточная среда. Тем не менее представлены, по сути, все клеточные катализаторы, включая катализаторы, которые связаны с мембраной. Внутренняя мембрана фрагментируется во время лизиса клеток, и фрагменты этих мембран образуют функциональные мембранные везикулы. Таким образом, в результате катализа происходят сложные биотрансформации. См., например, Swartz, AIChE Journal, 2012, 58(1), 5-13, включенную в настоящий документ посредством ссылки.

В бесклеточных способах и системах по настоящему изобретению, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, используют клеточные лизаты (например, необработанные или частично очищенные клеточные лизаты), которые более подробно рассмотрены в настоящем документе. Клеточные лизаты можно получить, например, механическими способами (например, растиранием или дроблением). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, клеточные лизаты отличаются от химически пермеабилизированных клеток. Как рассмотрено в настоящем документе, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, во время лизиса клеток (например, механического лизиса клеток) внутренняя клеточная мембрана фрагментируется так, что в лизатах клеток образуются инвертированные мембранные везикулы. Клетки, которые подвергаются лизису (например, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90% или 95%), более не являются интактными.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, применяют пермеабилизированные клетки. Пермеабилизированные клетки представляют собой интактные клетки, содержащие перфорации (небольшие отверстия). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, клетки можно пермеабилизировать для высвобождения содержимого клетки для его использования в реакции, как представлено в настоящем документе.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, применяют частично очищенные клеточные фракции. Частично очищенная клеточная фракция представляет собой клеточный лизат, из которого были частично или полностью удалены один или несколько клеточных компонентов (например, клеточные мембраны).

Термостабильные ферменты

Фермент считают термостабильным, если фермент (а) сохраняет значительную часть своей активности после воздействия высоких температур, которые денатурируют другие природные ферменты, или (b) выполняет свои функции с относительно высокой скоростью после воздействия средней или высокой температуры, после которых природные ферменты выполняют свои функции с низкой скоростью.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, термостабильный фермент сохраняет более чем 50% активности после воздействия относительно высокой температуры, которая, в противном случае, денатурировала бы аналогичный (нетермостабильный) природный фермент. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, термостабильный фермент сохраняет 50-100% активности после воздействия относительно высокой температуры, которая, в противном случае, денатурировала бы аналогичный (нетермостабильный) природный фермент. Например, термостабильный фермент может сохранять 50-90%, 50-85%, 50-80%, 50-75%, 50-70%, 50-65%, 50-60% или 50-55% своей активности после воздействия относительно высокой температуры, которая, в противном случае, денатурировала бы аналогичный (нетермостабильный) природный фермент. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, термостабильный фермент сохраняет 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% своей активности после воздействия относительно высокой температуры, которая, в противном случае, денатурировала бы аналогичный (нетермостабильный) природный фермент.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, активность термостабильного фермента после воздействия на среду высокой температурой превышает (например, на 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% превышает) активность аналогичного (нетермостабильного) природного фермента.

Термостабильные ферменты (например, фосфатазы или фосфорилазы) могут оставаться активными (способными катализировать реакцию), например, при температуре от 45°C до 80°C или выше. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, термостабильные ферменты остаются активными при температуре 45-80°C, 45-70°C, 45-60°C, 45-50°C, 50-80°C, 50-70°C, 50- 60°C, 60-80°C, 60-70°C или 70-80°C. Например, термостабильные ферменты могут оставаться активными при температуре 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C. С, 55°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C или 80°C. Термостабильные ферменты могут оставаться активными при относительно высоких температурах в течение периода от 15 минут до 48 часов или дольше после воздействия относительно высоких температур. Например, термостабильные ферменты могут оставаться активными при относительно высоких температурах в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 36, 42 или 48 часов.

Сконструированные клетки

Сконструированные клетки по настоящему изобретению, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, характеризуются по меньшей мере одной или всеми ферментативными активностями, необходимыми для превращения крахмала и/или целлюлозы/целлодекстрина в сахар. «Сконструированные клетки» представляют собой клетки, которые содержат по меньшей мере одну сконструированную (например, рекомбинантную или синтетическую) нуклеиновую кислоту или иным образом модифицированы таким образом, чтобы они структурно и/или функционально отличались от своих встречающихся в природе аналогов. Таким образом, клетка, которая содержит сконструированную нуклеиновую кислоту, считают «сконструированной клеткой».

Сконструированные клетки по настоящему изобретению, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, содержат α-глюканфосфорилазу (например, термостабильную α-глюканфосфорилазу) и/или целлодекстринфосфорилазу (например, термостабильную целлодекстринфосфорилазу), фосфоглюкомутазу (например, термостабильную фосфоглюкомутазу) и по меньшей мере один фермент (например, термостабильный фермент), выбранный из группы, состоящей из изомераз, эпимераз, дегидрогеназ и сахарофосфатаз.

Сконструированные клетки, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, экспрессируют селектируемые маркеры. Селектируемые маркеры обычно применяют для отбора сконструированных клеток, которые поглощают и экспрессируют сконструированную нуклеиновую кислоту после трансфекции клетки (или после другой процедуры, применяемой для введения чужеродной нуклеиновой кислоты в клетку). Так, нуклеиновая кислота, которая кодирует продукт, также может кодировать селектируемый маркер. Примеры селектируемых маркеров включают без ограничения гены, кодирующие белки, которые увеличивают или уменьшают резистентность или чувствительность к антибиотикам (например, гены устойчивости к ампициллину, гены устойчивости к канамицину, гены устойчивости к неомицину, гены устойчивости к тетрациклину и гены устойчивости к хлорамфениколу) или другим соединениям. В соответствии с настоящим раскрытием, можно применять и другие селектируемые маркеры.

Сконструированная клетка «экспрессирует» продукт, если продукт, кодируемый нуклеиновой кислотой (например, сконструированной нуклеиновой кислотой), вырабатывается в клетке. Из уровня техники известно, что экспрессия генов относится к процессу, с помощью которого генетические инструкции в форме нуклеиновой кислоты применяют используются для синтеза такого продукта, как белок (например, фермент).

Сконструированные клетки могут быть прокариотическими клетками или эукариотическими клетками. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированные клетки представляют собой бактериальные клетки, дрожжевые клетки, клетки насекомых, клетки млекопитающих или клеток других типов.

К сконструированным бактериальным клеткам, пригодным в контексте настоящего раскрытия, относятся без ограничения сконструированные Escherichia spp., Streptomyces spp., Zymonas spp., Acetobacter spp., Citrobacter spp., Synechocystis spp., Rhizobium spp., Clostridium spp., Corynebacterium spp., Streptococcus spp., Xanthomonas spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Bacillus spp., Alcaligenes spp., Pseudomonas spp., Aeromonas spp., Azotobacter spp., Comamonas spp., Mycobacterium spp., Rhodococcus spp., Gluconobacter spp., Ralstonia spp., Acidithiobacillus spp., Microlunatus spp., Geobacter spp., Geobacillus spp., Arthrobacter spp., Flavobacterium spp., Serratia spp., Saccharopolyspora spp., Thermus spp., Stenotrophomonas spp., Chromobacterium spp., Sinorhizobium spp., Saccharopolyspora spp., Agrobacterium spp., Vibrio spp. и Pantoea spp.

К сконструированным дрожжевым клеткам, пригодным в контексте настоящего раскрытия, относятся без ограничения сконструированные Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia и Pichia.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированными клетками, пригодными в контексте настоящего раскрытия, являются сконструированные клетки Escherichia coli, Bacillus subtilis, клетки Pseudomonas putida, клетки Saccharomyces cerevisiae и/или клетки Lactobacillus brevis. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированными клетками, пригодными в контексте настоящего раскрытия, являются сконструированные клетки Escherichia coli.

Сконструированные нуклеиновые кислоты

«Нуклеиновая кислота» представляет собой по меньшей мере два нуклеотида, ковалентно связанных вместе, и в некоторых случаях может содержать фосфодиэфирные связи (например, фосфодиэфирный «каркас»). Нуклеиновые кислоты (например, компоненты или части нуклеиновых кислот) могут быть встречающими в природе или сконструированными. «Встречающиеся в природе» нуклеиновые кислоты присутствуют в клетке, которая существует в природе без вмешательства человека. К «сконструированным нуклеиновым кислотам» относятся рекомбинантные нуклеиновые кислоты и синтетические нуклеиновые кислоты. Термин «рекомбинантная нуклеиновая кислота» обозначает молекулу, которая собрана путем объединения молекул нуклеиновой кислоты (например, из одного и того же вида или из разных видов) и, как правило, может реплицироваться в живой клетке. Термин «синтетическая нуклеиновая кислота» обозначает молекулу, которая синтезирована биологическими методами, синтезирована химическими методами или синтезирована или амплифицирована иными методами. К синтетической нуклеиновой кислоте относятся нуклеиновые кислоты, которые модифицированы химическими методами или модифицированы иными методами, но могут образовывать пары оснований с природными молекулами нуклеиновых кислот. К рекомбинантным и синтетическим нуклеиновым кислотам также относятся те молекулы, которые возникают в результате репликации любого из вышеперечисленных. Сконструированные нуклеиновые кислоты могут содержать части нуклеиновых кислот, которые встречаются в природе, но, в целом виде, сконструированные нуклеиновые кислоты не встречаются в природе и нуждаются в человеческом вмешательстве. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, нуклеиновая кислота, кодирующая продукт по настоящему раскрытию, представляет собой рекомбинантную нуклеиновую кислоту или синтетическую нуклеиновую кислоту. В соответствии с другими вариантами осуществления, нуклеиновая кислота, кодирующая продукт, встречается в природе.

Сконструированная нуклеиновая кислота, кодирующая ферменты, которые представлены в настоящем документе, могут быть функционально связаны с «промотором», который является регуляторным участком нуклеиновой кислоты, в котором происходит регуляция инициацией и скоростью транскрипции остальной части нуклеиновой кислоты. Промотор управляет экспрессией или управляет транскрипцией нуклеиновой кислоты, которую он регулирует.

Промотор может представлять собой промотор, который естественным образом связан с геном или последовательностью, что можно получить путем выделения 5’-некодирующих последовательностей, расположенных выше кодирующего сегмента данного гена или данной последовательности. Такой промотор можно назвать «эндогенным».

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты может быть расположена под контролем рекомбинантного или гетерологичного промотора, который относится к промотору, который обычно не связан с кодируемой последовательностью в своей естественной среде. К таким промоторам могут относиться промоторы других генов; промоторы, выделенные из любой другой клетки; и синтетические промоторы или энхансеры, которые «не встречаются в природе», такие как, например, промоторы, которые содержат разные элементы разных транскрипционных регуляторных участков и/или мутации, которые изменяют экспрессию, внесенные с помощью способов генной инженерии, которые известны из уровня техники. Помимо получения последовательностей нуклеиновых кислот из промоторов и энхансеров синтетическими методами, последовательности можно получить с помощью методики рекомбинантного клонирования и/или амплификации нуклеиновых кислот, в том числе с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Промотор считают «функционально связанным», когда он находится в правильном функциональном местоположении и ориентации по отношению к нуклеиновой кислоте, которую он регулирует для контроля («управления») инициацией транскрипции и/или экспрессией такой нуклеиновой кислоты.

Сконструированные нуклеиновые кислоты по настоящему раскрытию могут содержать конститутивный промотор или индуцируемый промотор. Термин «конститутивный промотор» обозначает промотор, который постоянно активен в клетке. Термин «индуцируемый промотор» обозначает промотор, который инициирует или усиливает транскрипционную активность в присутствии, под воздействием или при контакте с индуктором или индуцирующим средством или активируется в отсутствие фактора, обуславливающего репрессию. К индуцируемым промоторам для применения в соответствии с настоящим раскрытием относится любой индуцируемый промотор, описанный в настоящем документе или известный специалисту в настоящей области. Примеры индуцируемых промоторов включают без ограничения химически/биохимически регулируемые и физически регулируемые промоторы, такие как регулируемые спиртом промоторы, регулируемые тетрациклином промоторы, регулируемые стероидами промоторы, регулируемые металлом промоторы, регулируемые патогенезом промоторы, регулируемые температурой/нагреванием, регулируемые фосфатом (например, PhoA) и светорегулируемые промоторы.

Индуктор или индуцирующее средство может быть эндогенным или представлять собой, в норме, экзогенное состояние (например, свет), быть соединением (например, химическим или нехимическим соединением) или белком, который связывается с индуцируемым промотором таким образом, чтобы быть активным при регуляции транскрипционной активности, исходящей от индуцируемого промотора. Таким образом, «сигнал, который регулирует транскрипцию» нуклеиновой кислоты обозначает сигнал-индуктор, который действует на индуцируемый промотор. Сигнал, который регулирует транскрипцию, может активировать или инактивировать транскрипцию, в зависимости от используемой регуляторной системы. Активация транскрипции может подразумевать прямое воздействие на промотор для управления транскрипцией или косвенное воздействие на промотор путем инактивации репрессора, который не позволяет промотору управлять транскрипцией. И наоборот, дезактивация транскрипции может подразумевать прямое воздействие на промотор для предотвращения транскрипции или косвенное воздействие на промотор путем активации репрессора, который затем воздействует на промотор.

Сконструированные нуклеиновые кислоты можно вводить в клетки-хозяева с помощью любых средств, известных в настоящей области техники, включая без ограничения трансформацию, трансфекцию (например, химическую (например, с фосфатом кальция, катионными полимерами или липосомами) или нехимическую (например, электропорацию, сонопорацию, импалефекцию, оптическую трансфекцию, гидродинамику) и трансдукцию (например, вирусную трансдукцию).

Ферменты или другие белки, кодируемые природной внутриклеточной нуклеиновой кислотой, можно называть «эндогенными ферментами» или «эндогенными белками».

Протеазное нацеливание

Сконструированные клетки по настоящему изобретению могут экспрессировать (например, эндогенно экспрессировать) ферменты, необходимые для здоровья клеток, которые могут оказывать отрицательное влияние на выработку представляющего интерес сахара (например, аллюлозы). Такие ферменты в настоящем документе называют «целевыми ферментами». Например, целевые ферменты, экспрессируемые сконструированными клетками, могут конкурировать за субстраты или кофакторы с ферментом, который увеличивает долю предшественника, поставляемого в путь получения сахара. В качестве еще одного примера, целевые ферменты, экспрессируемые сконструированными клетками, могут конкурировать за субстраты или кофакторы с ферментом, который является ключевым ферментом для входа в путь получения сахара. В качестве еще одного примера, целевые ферменты, экспрессируемые сконструированными клетками, могут конкурировать за субстраты или кофакторы с ферментом, который поставляет субстрат или кофактор пути получения сахара.

Для устранения или уменьшения такого отрицательного влияния целевые ферменты можно модифицировать с включением в их белковую последовательность последовательность распознавания сайт-специфической протеазой, с тем чтобы целевой фермент мог стать «мишенью» и мог быть расщеплен для инактивации во время получения сахара (см., например, патентную публикацию США № 2012/0052547 A1, опубликованную 1 марта 2012 года, и международную публикацию № WO 2015/021058 A2, опубликованную 12 февраля 2015 года, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки).

Расщепление целевого фермента, содержащего последовательность распознавания сайт-специфической протеазой, происходит в результате контакта с когнатной сайт-специфической протеазой, которая находится в изоляции в периплазматическом пространстве клетки (отдельно от целевого фермента) во время фазы роста клеток (например, по мере культивирования сконструированных клеток) и приводится в контакт с целевым ферментом во время фазы превращения (например, после лизиса клеток с получением лизата клеток). Таким образом, сконструированные клетки по настоящему раскрытию содержат, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, (i) сконструированную нуклеиновую кислоту, кодирующую целевой фермент, который отрицательно влияет на скорость превращения и включает последовательность распознавания сайт-специфической протеазой в последовательности белка целевого фермента, и (ii) сконструированную нуклеиновую кислоту, кодирующую сайт-специфическую протеазу, которая расщепляет последовательность распознавания сайт-специфической протеазой у целевого фермента и включает последовательность, направляющую ее в периплазматическое пространство. Эта направляющая в периплазматическое пространство последовательность отвечает за изоляцию сайт-специфической протеазы в периплазматическом пространстве клетки до тех пор, пока клетка не лизируется. Примеры направляющих в периплазматическое пространство последовательностей представлены ниже.

Примеры протеаз, которые можно применять в соответствии с настоящим раскрытием, включают без ограничения аланиновую карбоксипептидазу, астацин, бактериальную лейциламинопептидазу, раковый прокоагулянт, катепсин B, клострипаин, цитозольаниламинопептидазу, эластазу, эндопротеиназу Brg-C, энтерокиназу, гастриксин, желатиназу, карбоксипептидазу Gly-X, глицилэндопептидазу, протеазу человеческого риновируса 3C, гиподермин С, Iga-специфическую сериновую эндопептидазу, лейциламинопептидазу, лейцилэндопептидазу, lysC, лизосомальную карбоксипептидазу pro-X, лизиламинопептидазу, метионильную аминопептидазу, миксобактер, нардилизин, эндопептидазу Е поджелудочной железы, пикорнаин 2В, пикорнаин 3С, проэндопептидазу, пролиламинопептидазу, пропротеинконвертазу I, пропротеинконвертазу II, русселлизин, сахаропепсин, семеногелазу, активатор Т-плазминогена, тромбин, тканевый калликреин, протеазу вируса гравировки табака (TEV), тогавирин, триптофаниламинопептидазу, активатор плазминогена U, V8, веномбин B, веномбин BB и аминопептидазу Xaa-pro.

Направление в периплазматическое пространство

Ферменты пути получения сахара могут включать по меньшей мере один фермент, который оказывает отрицательное влияние на здоровье (например, жизнеспособность) клетки. Для устранения или уменьшения такого отрицательного влияния фермент можно модифицировать с включением отвечающей за передислокацию последовательности таким образом, чтобы фермент передислоцировался в клеточный или внеклеточный компартмент, где он в норме не находится, и где фермент не оказывает отрицательного влияния на здоровье клетки (см., например, публикацию № US-2011-0275116-A1, опубликованную 10 ноября 2011 года, включенную в настоящий документ посредством ссылки). Например, фермент пути получения сахара можно передислоцировать в периплазматическое пространство клетки.

Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированные клетки по настоящему изобретению содержат по меньшей мере один фермент пути получения сахара, который связан с направляющей в периплазматическое пространство последовательностью. «Направляющая в периплазматическое пространство последовательность» представляет собой аминокислотную последовательность, которая направляет в периплазматическое пространство клетки белок, с которым она связана. Белок, который связан с направляющей в периплазматическое пространство последовательностью, будет изолироваться в периплазматическом пространстве клетки, в которой экспрессируется белок.

Направляющие в периплазматическое пространство последовательности можно получить, например, из N-конца бактериального секреторного белка. Последовательности варьируют по длине от приблизительно 15 до приблизительно 70 аминокислот. Первичные аминокислотные последовательности направляющих в периплазматическое пространство последовательностей варьируют, но обычно имеют общую структуру, включающую следующие компоненты: (i) N-концевая часть имеет переменную длину и обычно несет суммарный положительный заряд; (ii) далее следует центральное гидрофобное ядро длиной от приблизительно 6 до приблизительно 15 аминокислот; и (iii) конечный компонент включает от четырех до шести аминокислот, которые определяют сайт расщепления для сигнальных пептидаз.

Направляющие в периплазматическое пространство последовательности по настоящему изобретению, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, можно получить из белка, который секретируется у грамотрицательной бактерии. Секретируемый белок может кодироваться бактерией или бактериофагом, который заражает бактерию. Примеры грамотрицательных бактериальных источников секретируемых белков включают без ограничения представителей родов Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Salmonella, Caulobacter, Methylomonas, Acetobacter, Achromobacter, Acinetobacter, Aeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Azotobacter, Burkholderia, Citrobacter, Comamonas, Enterobacter, Erwinia, Rhizobium, Vibrio и Xanthomonas.

Примеры направляющих в периплазматическое пространство последовательностей для применения в соответствии с настоящим раскрытием включают без ограничения последовательности, выбранные из группы, состоящей из:

MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA (SEQ ID NO: 1);

MKQSTIALALLPLLFTPVTKA (SEQ ID NO: 2);

MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMA (SEQ ID NO: 3);

MNKKVLTLSAVMASMLFGAAAHA (SEQ ID NO: 4);

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (SEQ ID NO: 5);

MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID NO: 6);

MMTKIKLLMLIIFYLIISASAHA (SEQ ID NO: 7);

MKQALRVAFGFLILWASVLHA (SEQ ID NO: 8);

MRVLLFLLLSLFMLPAFS (SEQ ID NO: 9); и

MANNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA (SEQ ID NO: 10).

Клеточные культуры и клеточные лизаты

Как правило, культивируют сконструированные клетки. «Культивирование» обозначает способ, с помощью которого клетки выращивают в контролируемых условиях, обычно вне их естественной среды. Например, сконструированные клетки, такие как сконструированные бактериальные клетки, можно выращивать в виде суспензии клеток в жидком питательном бульоне, также называемом жидкой «культуральной средой».

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, в качестве субстрата для выращивания клеток применяют неизмененный крахмал.

Примеры традиционно используемых сред для выращивания бактерий Escherichia coli включают без ограничения бульон LB (Луриа-Бертани) Миллера (1% NaCl): 1% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта и 1% NaCl; бульон LB (Луриа-Бертани) Леннокса (0,5% NaCl): 1% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта и 0,5% NaCl; среда SOB (бульон Super Optimal Broth): 2% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4; среда SOC (бульон Super Optimal Broth с катаболическим репрессором): SOB + 20 мМ глюкозы; 2× бульон YT (2× дрожжевой экстракт и триптон): 1,6% пептона, 1% дрожжевого экстракта и 0,5% NaCl; среда TB (бульон Terrific Broth): 1,2% пептона, 2,4% дрожжевого экстракта, 72 мМ K2HPO4, 17 мМ KH2PO4 и 0,4% глицерина; и среда SB (бульон Super Broth): 3,2% пептона, 2% дрожжевого экстракта и 0,5% NaCl и/или среды Корца (Korz, DJ et al. 1995).

Примеры среды для выращивания бактерий Escherichia coli высокой плотности включают без ограничения среду DNAGro™, среду ProGro™, среду AutoX™, среду DetoX™, среду InduX™ и среду SecPro™.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления сконструированные клетки культивируют в условиях, которые приводят к экспрессии ферментов или нуклеиновых кислот. Такие условия культивирования могут зависеть от конкретного экспрессируемого продукта и требуемого количества продукта.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированные клетки культивируют при температуре от 3°C до 40°C. Например, сконструированные клетки можно культивировать при температуре 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C или 40°C. Обычно сконструированные клетки, такие как сконструированные бактериальные клетки, культивируют при температуре 37°C.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления,сконструированные клетки культивируют в течение периода времени от 12 часов до 72 часов или более. Например, сконструированные клетки можно культивировать в течение периода времени 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66 или 72 часа. Как правило, сконструированные клетки, такие как сконструированные бактериальные клетки, культивируют в течение периода времени от 12 до 24 часов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированные клетки культивируют в течение 12-24 часов при температуре 37°C.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированные клетки культивируют (например, в жидкой среде для культивирования клеток) до оптической плотности, измеренной на длине волны 600 нм (OD600) и составляющей 5-25. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированные клетки культивируют до OD600 5, 10, 15, 20 или 25.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированные клетки культивируют до плотности, составляющей от 1×10⁴ до 1×10⁸ жизнеспособных клеток/мл среды для культивирования клеток. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированные клетки культивируют до плотности 1×10⁴, 2×10⁴, 3×10⁴, 4×10⁴, 5×10⁴, 6×10⁴, 7×10⁴, 8×10⁴, 9×10⁴, 1×10⁵, 2×10⁵, 3×10⁵, 4×10⁵, 5×10⁵, 6×10⁵, 7×10⁵, 8×10⁵, 9×10⁵, 1×10⁶, 2×10⁶, 3×10⁶, 4×10⁶, 5×10⁶, 6×10⁶, 7×10⁶, 8×10⁶, 9×10⁶, 1×10⁷, 2×10⁷, 3×10⁷, 4×10⁷, 5×10⁷, 6×10⁷, 7×10⁷, 8×10⁷, 9×10⁷, 1×10⁸, 1×10⁹ или 1×10¹⁰ жизнеспособных клеток/мл. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированные клетки культивируют до плотности, составляющей от 1×10⁸ до 1×10¹⁰ жизнеспособных клеток/мл. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированные клетки культивируют до плотности, составляющей от 2×10⁵ до 3×10⁷ жизнеспособных клеток/мл.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированные клетки культивируют в биореакторе. Под биореактором обычно понимают емкость, в которой культивируют клетки, такую как колба для культивирования, чашка или пакет, который может быть одноразовым (одноразового употребления), автоклавируемым или стерилизуемым. Биореактор может быть выполнен из стекла, или он может быть полимерным, или он может быть выполнен из других материалов.

Примеры биореакторов включают без ограничения биореакторы с механическим перемешиванием (например, с интенсивным перемешиванием) и трубчатые (например, с поршневым потоком) биореакторы, барботажные биореакторы, мембранные резервуары с перемешиванием, резервуары с перемешиванием и центробежным фильтром, вибромиксеры, реакторы с псевдоожиженным слоем и мембранные биореакторы. Режим работы биореактора может быть порционным или непрерывным процессом и будет зависеть от культивируемых сконструированных клеток. Биореактор является реактором непрерывного действия, когда потоки сырья и продуктов непрерывно подают и выводят из системы. Порционный биореактор может иметь непрерывный рециркулируемый поток, но не иметь непрерывной подачи питательных веществ или непрерывного сбора продукта. В случае культур с периодическим сбором и порционной подпиткой (или порционных культур) клетки инокулируют с более низкой плотностью жизнеспособных клеток в среде, которая по композиции аналогична периодической среде. Клеткам позволяют расти в геометрической прогрессии фактически без каких-либо внешних манипуляций до истощения питательных веществ и достижения клетками стационарной фазы роста. В этот момент, в случае процесса порционной подачи и периодического сбора, можно собрать часть клеток и продукта, а удаленную культуральную среду пополнить свежей средой. Этот процесс можно повторять несколько раз. Для получения рекомбинантных белков и антител можно применять способ с порционной подпиткой. По мере экспоненциального роста клеток и истощения питательных веществ концентрированную питательную среду (например, в 10-15 раз концентрированную базальную среду) добавляют либо непрерывно, либо периодически для снабжения дополнительными питательными веществами, что позволяет дополнительно увеличить концентрацию клеток и продолжительность фазы перехода. Свежую среду можно добавлять пропорционально концентрации клеток без удаления культуральной среды (бульона). Для того, чтобы приспособить добавление среды, засевают подпитываемую культуру в объеме, намного меньшем, чем полная емкость биореактора (например, примерно 40% - 50% от максимального объема).

Некоторые способы по настоящему раскрытию относятся к крупномасштабному получению сахара. В случае крупномасштабных способов получения сконструированные клетки можно выращивать в жидкой культуральной среде в объеме от 5 литров (л) до 50 л или более. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированные клетки можно выращивать в жидкой культуральной среде в объеме, превышающем (или равном) 10 л. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированные клетки выращивают в жидкой культуральной среде в объеме 5 л, 10 л, 15 л, 20 л, 25 л, 30 л, 35 л, 40 л, 45 л, 50 л или более. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, сконструированные клетки можно выращивать в жидкой культуральной среде в объеме от 5 л до 10 л, от 5 л до 15 л, от 5 л до 20 л, от 5 л до 25 л, от 5 л до 30 л, от 5 л до 35 л, от 5 л до 40 л, от 5 л до 45 л, от 10 л до 15 л, от 10 л до 20 л, от 10 л до 25 л, от 20 л до 30 л, от 10 л до 35 л, от 10 л до 40 л, от 10 л до 45 л, от 10 л до 50 л, от 15 л до 20 л, от 15 л до 25 л, от 15 л до 30 л, от 15 л до 35 л, от 15 л до 40 л, от 15 л до 45 л или от 15 до 50 л.

Как правило, культивирование сконструированных клеток сопровождается лизисом клеток. «Лизис» обозначает процесс, в результате которого клетки разрушаются, например, посредством вирусных, ферментативных, механических, химических, тепловых или осмотических механизмов. «Клеточный лизат» обозначает жидкость, содержащуюся в содержимом лизированных клеток (например, лизированных сконструированных клеток), включающую, например, органеллы, мембранные липиды, белки, нуклеиновые кислоты и инвертированные мембранные везикулы. Клеточные лизаты по настоящему раскрытию можно получить путем лизирования любой популяции сконструированных клеток, представленных в настоящем документе. «Клеточный лизат» может исключать пермеабилизированные/перфорированные клетки.

Способы лизиса клеток, называемые «лизированием», известны из уровня техники, любой из которых можно применять в соответствии с настоящим раскрытием. Такие способы лизиса клеток включают без ограничения физический/механический лизис, такой как гомогенизация, а также химический, термический и/или ферментативный лизис.

Лизис клеток может нарушать тщательно контролируемые клеточные среды, что приводит к разрушению и модификации белка под действием нерегулируемых эндогенных протеаз и фосфатаз. Поэтому, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, в клеточный лизат или в клетки до лизиса можно добавить ингибиторы протеаз и/или ингибиторы фосфатаз или эти активные молекулы можно устранить путем инактивации генов или протеазного нацеливания.

Клеточные лизаты, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, можно объединить по меньшей мере с одним питательным веществом. Например, клеточные лизаты можно объединить с Na₂HPO₄, KH₂PO₄, NH₄Cl, NaCl, MgSO₄, CaCl₂. Примеры других питательных веществ включают без ограничения сульфат магния, хлорид магния, оротат магния, цитрат магния, одноосновный фосфат калия, двухосновный фосфат калия, трехосновный фосфат калия, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, трехосновный фосфат натрия, одноосновный фосфат аммония, двухосновный фосфат аммония, сульфат аммония, хлорид аммония, гидроксид аммония.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, клеточные лизаты могут состоять из суспензий разрушенных клеток, которые дополнительно модифицируют химическим, термическим, ферментативным или механическим способами для увеличения концентрации, или очистки, или уменьшения концентрации, или устранения конкретных компонентов. Например, после разрушения посредством механического, термического, химического или ферментативного способа, как описано выше, полученный в результате материал можно подвергнуть механическому разделению, например, мембранной фильтрации, центрифугированию или другим, для частичного увеличения содержания выбранной молекулы с ферментативной активностью или для устранения нежелательной молекулы с ферментативной активностью или компонента лизата. Дополнительные примеры могут включать добавление солей или растворителей к суспензии разрушенных клеток или изменение рН или температуры суспензии разрушенных клеток, что приводит к осаждению требуемых активных молекул с последующим механическим разделением этих осажденных компонентов, как описано выше. И наоборот, добавление солей или растворителей или изменение рН или температуры можно использовать для устранения нежелательных активных молекул посредством либо инактивации этих ферментов, либо осаждения и последующего механического отделения молекул с нежелательной ферментативной активностью или нежелательными ферментативными активностями.

Клеточные лизаты, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, можно объединить по меньшей мере с одним кофактором. Например, клеточные лизаты можно объединить с аденозиндифосфатом (АДФ), аденозинтрифосфатом (АТФ), никотинамидадениндинуклеотидом (NAD+) или другими небелковыми химическими соединениями, необходимыми для активности фермента (например, неорганическими ионами и коферментами).

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, клеточные лизаты инкубируют в условиях, которые приводят к превращению крахмала или целлюлозы/целлодекстрина в сахар.

Объем клеточного лизата, используемый для одной реакции, может варьировать. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, объем клеточного лизата составляет 1-150 м³. Например, объем клеточного лизата может составлять 1 м³, 5 м³, 10 м³, 15 м³, 20 м³, 25 м³, 30 м³, 35 м³, 40 м³, 45 м³, 50 м³, 55 м³, 60 м³, 65 м³, 70 м³, 75 м³, 80 м³, 85 м³, 90 м³, 95 м³, 100 м³, 105 м³, 110 м³, 115 м³, 120 м³, 125 м³, 130 м³, 135 м³, 140 м³, 145 м³ или 150 м³. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, объем клеточного лизата составляет от 25 м³ до 150 м³, от 50 м³ до 150 м³ или от 100 м³ до 150 м³.

Очищенные ферменты

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, ферменты по настоящему изобретению можно очистить перед добавлением в промышленную реакцию. Под очисткой фермента следует понимать любое увеличение концентрации или любую экстракцию конкретного фермента или молекулы с ферментативной активностью или групп ферментов или молекул с ферментативной активностью из сложной смеси материалов, например, в том числе без ограничения суспензий разрушенных клеток или питательные среды, оставшиеся после культивирования. Таким образом, под очищенным ферментом или белком следует понимать фермент или белок, который был отделен или увеличен в концентрации из сложной матрицы, при этом увеличивается его относительная концентрация по сравнению с другими компонентами матрицы. К способам очистки фермента относятся без ограничения механический, хроматографический, химический, pH-зависимый или температурный способы. Например, добавление соли в суспензию разрушенных клеток приводит к осаждению целевого фермента или белка с последующим механическим разделением осажденного фермента или белка, например, мембранной фильтрацией или центрифугированием. Дополнительные примеры могут включать отделение фермента от сложной матрицы с помощью способов аффинной хроматографии (например, очистки по гексагистидиновой метке или стрептавидину).

Ферментативная специфичность

Ферментативную специфичность следует понимать как признак, присущий ферменту, при этом у него наблюдают улучшенную ферментативную кинетику, термодинамику или скорость реакции по отношению к одному субстрату в сравнении с другим субстратом. Ферменты с высокой специфичностью лучше всего проиллюстрировать как имеющие высокое соотношение каталитической константы (определяемом как число оборотов или Kcat) к константе Михаэлиса (Km) или Kcat/Km. Преимущественно иметь фермент с высокой специфичностью к субстрату, поскольку это увеличивает скорость реакции и улучшает выход за счет уменьшения производства нецелевых продуктов. Например, в описанном в настоящем документе пути получения аллюлозы присутствуют несколько промежуточных соединений, которые схожи по химической структуре, а именно глюкозо-1-фосфат, глюкозо-6-фосфат, фруктозо-6-фосфат и аллюлозо-6-фосфат. Конечной ферментативной стадией в этом способе является дефосфорилирование аллюлозо-6-фосфата до конечной аллюлозы с участием аллюлозо-6-фосфатфосфатазы. Преимущественно использовать фермент с очень высокой специфичностью к аллюлозо-6-фосфату и относительно низкой специфичностью к другим промежуточным соединениям в данном пути, а именно к глюкозо-1-фосфату, глюкозо-6-фосфату и фруктозо-6-фосфату. Каталитическое дефосфорилирование этих промежуточных соединений приведет к получению либо глюкозы, либо фруктозы, что приведет к снижению выхода и увеличению сложности продукта.

Дополнительные варианты осуществления

1. Бесклеточный способ получения аллюлозы, причем способ предусматривает:

(а) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии термостабильной α-глюканфосфорилазы (также называемой крахмальной фосфорилазой), термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной фосфоглюкоизомеразы, термостабильной аллюлозо-6-фосфатэпимеразы и термостабильной аллюлозо-6-фосфатфосфатазы, с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют термостабильные ферменты;

(b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата;

(с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением аллюлозы.

2. Бесклеточный способ получения аллюлозы, причем способ предусматривает:

(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильных аллюлозо-6-фосфатэпимераз и термостабильных аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(c) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит термостабильную α-глюканфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, термостабильную фосфоглюкоизомеразу, термостабильную аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и термостабильную аллюлозо-6-фосфатфосфатазу;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(e) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением аллюлозы.

3. Бесклеточный способ получения аллюлозы, причем способ предусматривает:

(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильных аллюлозо-6-фосфатэпимераз и термостабильных аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;

(e) добавление к инактивированному теплом лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильной аллюлозо-6-фосфатэпимераз и термостабильных аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и аллюлозо-6-фосфатфосфатазу; и

(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением аллюлозы.

4. Бесклеточный способ по любому из вариантов осуществления 1-3, при котором одна или несколько термостабильных α-глюканфосфорилаз выбраны из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз Aquifex aeolicus, Thermocrinis minervae, Thermosulfidibacter takaii, Thermosulfurimonas dismutans, Thermococcus litoralis, Palaeococcus pacificus, Thermotoga neapolitana, Ruminiclostridium thermocellum, Pyrococcus abyssi, Thermococcus thioreducens, Deinococcus radiodurans, Sulfolobus acidocaldarius, Thermus caldophilus, Meiothermus silvanus, Oceanithermus profundus, Ardenticatena maritima, Thermococcus barophilus, Pseudothermotoga thermarum, Hydrogenobacter thermophilus, Thermus oshimai, Meiothermus ruber и Marinitoga piezophila.

5. Бесклеточный способ по любому из вариантов осуществления 1-4, при котором одна или несколько термостабильных фосфоглюкомутаз выбраны из группы, состоящей из фосфоглюкомутаз Thermococcus kodakaraensis, Pyrococcus kukulkanii, Ammonifex degensii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermus fervidus, Sulfolobus acidocaldarius, Archaeoglobus fulgidus, Ferroglobus placidus, Geoglobus ahangari, Archaeoglobus veneficus, Archaeoglobus sulfaticallidus, Aciduliprofundum boonie, Clostridium thermocellum, Defluviitalea phaphyphila, Caminicella sporogenes, Caloranaerobacter ferrireducens, Thermosipho malanesiensis, Fervidobacterium pennivorans, Symbiobacterium thermophilum, Spirochaeta thermophila и Thermoanaerobacter wiegelii.

6. Бесклеточный способ по любому из вариантов осуществления 1-5, при котором одна или несколько термостабильных фосфоглюкомутаз выбраны из группы, состоящей из фосфоглюкомутаз Thermus thermophilus, Meiothermus timidus, Thermus filiformis, Marinithermus hydrothermalis, Thermosipho africanus, Sulfurihydrogenibium azorense, Persephonella marina, Marinitoga piezophila, Kosmotoga olearia, Thermotoga maritima, Geobacillus stearothermophilus, Anoxybacillus flavithermus, Thermosulfidibacter takaii, Fervidobacterium nodosum, Clostridium thermocellum, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Methanococcus jannaschii, Methanotorris igneus, Methanocaldococcus villosus, Methanothermococcus okinawensis, Pseudothermotoga thermarum, Deferribacter desulfuricans и Thermovibrio ammonificans.

7. Бесклеточный способ по любому из вариантов осуществления 1-6, при котором одна или несколько термостабильных аллюлозо-6-фосфатэпимераз выбраны из группы, состоящей из аллюлозо-6-фосфатэпимераз Thermobacterium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacter brockii, Caldanaerobacter subterraneus, Deferribacter desulfuricans, Thermocrinis ruber, Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1, Brevibacillus thermoruber, Thermosipho atlanticus и Thermosulfidibacter takaii.

8. Бесклеточный способ по любому из вариантов осуществления 1-7, при котором одна или несколько термостабильных аллюлозо-6-фосфатфосфатаз выбраны из группы, состоящей из аллюлозо-6-фосфатфосфатаз Thermoanaerobacter wiegelii, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermus islandicus, Deinococcus geothermalis DSM 11300, Thermosphaera aggregans, Crenarchaeota archaeon, Pyrococcus horikoshii Ot3, Aquifex aeolicus, Ruminiclostridium thermocellum, Desulfotomaculum kuznetsovii, Caldanaerobacter subterraneus, Acidothermus cellulolyticus, Methanothermobacter thermautotrophicus, Thermobifida fusca, Thermotoga neapolitana, Petrotoga mobilis и Thermodesulfatator indicus, а также Thermus thermophilus.

9. Бесклеточный способ получения глюкозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии термостабильной α-глюканфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы и термостабильной глюкозо-6-фосфатфосфатазы, с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют термостабильные ферменты;

(b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата;

(с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением глюкозы.

10. Бесклеточный способ получения глюкозы, причем способ предусматривает:

(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз и термостабильных глюкозо-6-фосфатфосфатазы, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(c) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит термостабильную α-глюканфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу и термостабильную глюкозо-6-фосфатфосфатазу;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(e) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением глюкозы.

11. Бесклеточный способ получения глюкозы, причем способ предусматривает:

(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз и термостабильных глюкозо-6-фосфатфосфатазы, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;

(e) добавление к инактивированному теплом лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз и термостабильных глюкозо-6-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу и глюкозо-6-фосфатфосфатазу; и

(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением глюкозы.

12. Бесклеточный способ получения фруктозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии термостабильной α-глюканфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной фосфоглюкоизомеразы и термостабильной фруктозо-6-фосфатфосфатаза, с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют термостабильные ферменты;

(b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата;

(с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением фруктозы.

13. Бесклеточный способ получения фруктозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомер и термостабильных фруктозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(c) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит термостабильную α-глюканфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, термостабильную фосфоглюкоизомеразу и термостабильную фруктозо-6-фосфатфосфатазу;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(e) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением фруктозы.

14. Бесклеточный способ получения фруктозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомер и термостабильных фруктозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;

(e) добавление к инактивированному теплом лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз и термостабильных фруктозо-6-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу и фруктозо-6-фосфатфосфатазу; и

(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением фруктозы.

15. Бесклеточный способ получения сорбита, причем способ предусматривает:

(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии термостабильной α-глюканфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной альдозодегидрогеназы и термостабильной сорбит-6-фосфатфосфатазы, с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют термостабильные ферменты;

(b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата;

(с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением сорбита.

16. Бесклеточный способ получения сорбита, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных альдозодегидрогеназ и термостабильных сорбит-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(c) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит термостабильную α-глюканфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, термостабильную альдозодегидрогеназу и термостабильную сорбит-6-фосфатфосфатазу;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(e) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением сорбита.

17. Бесклеточный способ получения сорбита, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных альдозодегидрогеназ и термостабильных сорбит-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;

(e) добавление к инактивированному теплом лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных альдозодегидрогеназ и термостабильных сорбит-6-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, альдозодегидрогеназу и сорбит-6-фосфатфосфатазу; и

(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением сорбита.

18. Бесклеточный способ получения рибулозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии термостабильной α-глюканфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, термостабильной 6-фосфоглюконолактоназы, термостабильной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы и термостабильной рибулозо-5-фосфатфосфатазы, с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют термостабильные ферменты;

(b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата;

(с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением рибулозы.

19. Бесклеточный способ получения рибулозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ и термостабильных рибулозо-5-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(c) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит термостабильную α-глюканфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, термостабильную глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, термостабильную 6-фосфоглюконолактоназу, термостабильную 6-фосфоглюконатдегидрогеназу и термостабильную рибулозо-5-фосфатфосфатазу;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(e) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением рибулозы.

20. Бесклеточный способ получения рибулозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ и термостабильных рибулозо-5-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;

(e) добавление к инактивированному теплом лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ и термостабильных рибулозо-5-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу и рибулозо-5-фосфатфосфатазу; и

(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением рибулозы.

21. Бесклеточный способ получения рибозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии термостабильной α-глюканфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, термостабильной 6-фосфоглюконолактоназы, термостабильной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, термостабильной рибозо-5-фосфатизомеразы и термостабильной рибозо-5-фосфатфосфатазы, с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют термостабильные ферменты;

(b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата;

(с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением рибозы.

22. Бесклеточный способ получения рибозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, термостабильных рибозо-5-фосфатизомераз и термостабильных рибозо-5-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(c) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит термостабильную α-глюканфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, термостабильную глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, термостабильную 6-фосфоглюконолактоназу, термостабильную 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, термостабильную рибозо-5-фосфатизомеразу и термостабильную рибозо-5-фосфатфосфатазу;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(e) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением рибозы.

23. Бесклеточный способ получения рибозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, термостабильных рибозо-5-фосфатизомераз и термостабильных рибозо-5-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;

(e) добавление к инактивированному теплом лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, термостабильных рибозо-5-фосфатизомераз и термостабильных рибозо-5-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, рибозо-5-фосфатизомеразу и рибозо-5-фосфатфосфатазу; и

(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением рибозы.

24. Бесклеточный способ получения арабинозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии термостабильной α-глюканфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, термостабильной 6-фосфоглюконолактоназы, термостабильной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, термостабильной арабинозо-5-фосфатизомеразы и термостабильной арабинозо-5-фосфатфосфатазы, с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют термостабильные ферменты;

(b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата;

(с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением арабинозы.

25. Бесклеточный способ получения арабинозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, термостабильных арабинозо-5-фосфатизомераз и термостабильных арабинозо-5-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(c) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит термостабильную α-глюканфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, термостабильную глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, термостабильную 6-фосфоглюконолактоназу, термостабильную 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, термостабильную арабинозо-5-фосфатизомеразу и термостабильную арабинозо-5-фосфатфосфатазу;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(e) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением арабинозы.

26. Бесклеточный способ получения арабинозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, термостабильных арабинозо-5-фосфатизомераз и термостабильных арабинозо-5-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;

(e) добавление к инактивированному теплом лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, термостабильных арабинозо-5-фосфатизомераз и термостабильных арабинозо-5-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, арабинозо-5-фосфатизомеразу и арабинозо-5-фосфатфосфатазу; и

(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением арабинозы.

27. Бесклеточный способ получения маннозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии термостабильной α-глюканфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной фосфоглюкоизомеразы, термостабильной маннозо-6-фосфатэпимеразы и термостабильной маннозо-6-фосфатфосфатазы, с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют термостабильные ферменты;

(b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата;

(с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением маннозы.

28. Бесклеточный способ получения маннозы, причем способ предусматривает:

(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильных маннозо-6-фосфатэпимераз и термостабильных маннозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(c) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит термостабильную α-глюканфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, термостабильную фосфоглюкоизомеразу, термостабильную маннозо-6-фосфатэпимеразу и термостабильную маннозо-6-фосфатфосфатазу;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(e) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением маннозы.

29. Бесклеточный способ получения маннозы, причем способ предусматривает:

(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильных маннозо-6-фосфатэпимераз и термостабильных маннозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;

(e) добавление к инактивированному теплом лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильной маннозо-6-фосфатэпимераз и термостабильных маннозо-6-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, маннозо-6-фосфатэпимеразу и маннозо-6-фосфатфосфатазу; и

(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением маннозы.

30. Способ по любому из вариантов осуществления 1-26, при котором клетки включают бактериальные клетки.

31. Способ по любому из вариантов осуществления 1-26, при котором клетки включают дрожжевые клетки.

32. Способ по любому из вариантов осуществления 1-31, при котором по меньшей мере один из ферментов является гетерологичным по отношению к клеткам.

33. Способ по любому из вариантов осуществления 1-32, при котором стадия (b) лизирования включает механическое, химическое или ферментативное лизирование культивированных клеток.

34. Способ по любому из вариантов осуществления 1-33, при котором стадия (c) нагревания включает нагревание клеточного лизата до температуры по меньшей мере 50°C.

35. Способ по любому из вариантов осуществления 1-34, при котором крахмал содержит амилозу, амилопектин или как амилозу, так и амилопектин.

36. Способ по любому из вариантов осуществления 1-35, при котором термостабильная α-глюканфосфорилаза и термостабильная фосфоглюкомутаза экспрессируются в форме единого гибридного белка или бифункционального белка.

37. Клеточный лизат, полученный способом по любому из вариантов осуществления 1-36.

38. Сконструированная клетка, содержащая α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу и глюкозо-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

39. Сконструированная клетка, содержащая α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу и фруктозо-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

40. Сконструированная клетка, содержащая α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и аллюлозо-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

41. Сконструированная клетка, содержащая α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, альдозодегидрогеназу и сорбит-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

42. Сконструированная клетка, содержащая α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу и рибулозо-5-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

43. Сконструированная клетка, содержащая α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, рибозо-5-фосфатизомеразу и рибозо-5-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

44. Сконструированная клетка, содержащая α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, арабинозо-5-фосфатизомеразу и арабинозо-5-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

45. Сконструированная клетка, содержащая α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, маннозо-6-фосфатэпимеразу и маннозо-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

46. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 38-45, причем клетка представляет собой бактериальную клетку или дрожжевую клетку.

47. Единый клеточный лизат, смесь клеточных лизатов, полученных по меньшей мере из двух клеточных популяций, или реакционная смесь, которые содержат α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу и глюкозо-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

48. Единый клеточный лизат, смесь клеточных лизатов, полученных по меньшей мере из двух клеточных популяций, или реакционная смесь, которые содержат α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу и фруктозо-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

49. Единый клеточный лизат, смесь клеточных лизатов, полученных по меньшей мере из двух клеточных популяций, или реакционная смесь, которые содержат α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и аллюлозо-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

50. Единый клеточный лизат, смесь клеточных лизатов, полученных по меньшей мере из двух клеточных популяций, или реакционная смесь, которые содержат α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, альдозодегидрогеназу и сорбит-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

51. Единый клеточный лизат, смесь клеточных лизатов, полученных по меньшей мере из двух клеточных популяций, или реакционная смесь, которые содержат α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу и рибулозо-5-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

52. Единый клеточный лизат, смесь клеточных лизатов, полученных по меньшей мере из двух клеточных популяций, или реакционная смесь, которые содержат α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, рибозо-5-фосфатизомеразу и рибозо-5-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

53. Единый клеточный лизат, смесь клеточных лизатов, полученных по меньшей мере из двух клеточных популяций, или реакционная смесь, которые содержат α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, арабинозо-5-фосфатизомеразу и арабинозо-5-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

54. Единый клеточный лизат, смесь клеточных лизатов, полученных по меньшей мере из двух клеточных популяций, или реакционная смесь, которые содержат α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, маннозо-6-фосфатэпимеразу и маннозо-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

55. Бесклеточный способ получения аллюлозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии термостабильной целлодекстринфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной фосфоглюкоизомеразы, термостабильной аллюлозо-6-фосфатэпимеразы и термостабильной аллюлозо-6-фосфатфосфатазы, с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют термостабильные ферменты;

(b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата;

(с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением аллюлозы.

56. Бесклеточный способ получения аллюлозы, причем способ предусматривает:

(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильных аллюлозо-6-фосфатэпимераз и термостабильных аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(c) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит термостабильную целлодекстринфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, термостабильную фосфоглюкоизомеразу, термостабильную аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и термостабильную аллюлозо-6-фосфатфосфатазу;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(e) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением аллюлозы.

57. Бесклеточный способ получения аллюлозы, причем способ предусматривает:

(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильных аллюлозо-6-фосфатэпимераз и термостабильных аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;

(e) добавление к инактивированному теплом лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильной аллюлозо-6-фосфатэпимераз и термостабильных аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и аллюлозо-6-фосфатфосфатазу; и

(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением аллюлозы.

58. Бесклеточный способ по любому из вариантов осуществления 55-57, при котором одна или несколько термостабильных целлодекстринфосфорилаз выбраны из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз Aquifex aeolicus, Thermocrinis minervae, Thermosulfidibacter takaii, Thermosulfurimonas dismutans, Thermococcus litoralis, Palaeococcus pacificus, Thermotoga neapolitana, Ruminiclostridium thermocellum, Pyrococcus abyssi, Thermococcus thioreducens, Deinococcus radiodurans, Sulfolobus acidocaldarius, Thermus caldophilus, Meiothermus silvanus, Oceanithermus profundus, Ardenticatena maritima, Thermococcus barophilus, Pseudothermotoga thermarum, Hydrogenobacter thermophilus, Thermus oshimai, Meiothermus ruber и Marinitoga piezophila.

59. Бесклеточный способ по любому из вариантов осуществления 55-58, при котором одна или несколько термостабильных фосфоглюкомутаз выбраны из группы, состоящей из фосфоглюкомутаз Thermococcus kodakaraensis, Pyrococcus kukulkanii, Ammonifex degensii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermus fervidus, Sulfolobus acidocaldarius, Archaeoglobus fulgidus, Ferroglobus placidus, Geoglobus ahangari, Archaeoglobus veneficus, Archaeoglobus sulfaticallidus, Aciduliprofundum boonie, Clostridium thermocellum, Defluviitalea phaphyphila, Caminicella sporogenes, Caloranaerobacter ferrireducens, Thermosipho malanesiensis, Fervidobacterium pennivorans, Symbiobacterium thermophilum, Spirochaeta thermophila и Thermoanaerobacter wiegelii.

60. Бесклеточный способ по любому из вариантов осуществления 55-59, при котором одна или несколько термостабильных фосфоглюкомутаз выбраны из группы, состоящей из фосфоглюкомутаз Thermus thermophilus, Meiothermus timidus, Thermus filiformis, Marinithermus hydrothermalis, Thermosipho africanus, Sulfurihydrogenibium azorense, Persephonella marina, Marinitoga piezophila, Kosmotoga olearia, Thermotoga maritima, Geobacillus stearothermophilus, Anoxybacillus flavithermus, Thermosulfidibacter takaii, Fervidobacterium nodosum, Clostridium thermocellum, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Methanococcus jannaschii, Methanotorris igneus, Methanocaldococcus villosus, Methanothermococcus okinawensis, Pseudothermotoga thermarum, Deferribacter desulfuricans и Thermovibrio ammonificans.

61. Бесклеточный способ по любому из вариантов осуществления 55-60, при котором одна или несколько термостабильных аллюлозо-6-фосфатэпимераз выбраны из группы, состоящей из аллюлозо-6-фосфатэпимераз Thermobacterium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacter brockii, Caldanaerobacter subterraneus, Deferribacter desulfuricans, Thermocrinis ruber, Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1, Brevibacillus thermoruber, Thermosipho atlanticus и Thermosulfidibacter takaii.

62. Бесклеточный способ по любому из вариантов осуществления 55-61, при котором одна или несколько термостабильных аллюлозо-6-фосфатфосфатаз выбраны из группы, состоящей из аллюлозо-6-фосфатфосфатаз Thermoanaerobacter wiegelii, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermus islandicus, Deinococcus geothermalis DSM 11300, Thermosphaera aggregans, Crenarchaeota archaeon, Pyrococcus horikoshii Ot3, Aquifex aeolicus, Ruminiclostridium thermocellum, Desulfotomaculum kuznetsovii, Caldanaerobacter subterraneus, Acidothermus cellulolyticus, Methanothermobacter thermautotrophicus, Thermobifida fusca, Thermotoga neapolitana, Petrotoga mobilis и Thermodesulfatator indicus, а также Thermus thermophilus.

63. Бесклеточный способ получения глюкозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии термостабильной целлодекстринфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы и термостабильной глюкозо-6-фосфатфосфатазы, с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют термостабильные ферменты;

(b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата;

(с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением глюкозы.

64. Бесклеточный способ получения глюкозы, причем способ предусматривает:

(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз и термостабильных глюкозо-6-фосфатфосфатазы, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(c) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит термостабильную целлодекстринфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу и термостабильную глюкозо-6-фосфатфосфатазу;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(e) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением глюкозы.

65. Бесклеточный способ получения глюкозы, причем способ предусматривает:

(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз и термостабильных глюкозо-6-фосфатфосфатазы, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;

(e) добавление к инактивированному теплом лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз и термостабильных глюкозо-6-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу и глюкозо-6-фосфатфосфатазу; и

(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением глюкозы.

66. Бесклеточный способ получения фруктозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии термостабильной целлодекстринфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной фосфоглюкоизомеразы и термостабильной фруктозо-6-фосфатфосфатаза, с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют термостабильные ферменты;

(b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата;

(с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением фруктозы.

67. Бесклеточный способ получения фруктозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомер и термостабильных фруктозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(c) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит термостабильную целлодекстринфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, термостабильную фосфоглюкоизомеразу и термостабильную фруктозо-6-фосфатфосфатазу;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(e) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением фруктозы.

68. Бесклеточный способ получения фруктозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомер и термостабильных фруктозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;

(e) добавление к инактивированному теплом лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз и термостабильных фруктозо-6-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу и фруктозо-6-фосфатфосфатазу; и

(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением фруктозы.

69. Бесклеточный способ получения сорбита, причем способ предусматривает:

(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии термостабильной целлодекстринфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной альдозодегидрогеназы и термостабильной сорбит-6-фосфатфосфатазы, с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют термостабильные ферменты;

(b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата;

(с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением сорбита.

70. Бесклеточный способ получения сорбита, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных альдозодегидрогеназ и термостабильных сорбит-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(c) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит термостабильную целлодекстринфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, термостабильную альдозодегидрогеназу и термостабильную сорбит-6-фосфатфосфатазу;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(e) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением сорбита.

71. Бесклеточный способ получения сорбита, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных альдозодегидрогеназ и термостабильных сорбит-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;

(e) добавление к инактивированному теплом лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных альдозодегидрогеназ и термостабильных сорбит-6-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, альдозодегидрогеназу и сорбит-6-фосфатфосфатазу; и

(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением сорбита.

72. Бесклеточный способ получения рибулозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии термостабильной целлодекстринфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, термостабильной 6-фосфоглюконолактоназы, термостабильной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы и термостабильной рибулозо-5-фосфатфосфатазы, с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют термостабильные ферменты;

(b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата;

(с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением рибулозы.

73. Бесклеточный способ получения рибулозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ и термостабильных рибулозо-5-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(c) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит термостабильную целлодекстринфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, термостабильную глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, термостабильную 6-фосфоглюконолактоназу, термостабильную 6-фосфоглюконатдегидрогеназу и термостабильную рибулозо-5-фосфатфосфатазу;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(e) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением рибулозы.

74. Бесклеточный способ получения рибулозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ и термостабильных рибулозо-5-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;

(e) добавление к инактивированному теплом лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ и термостабильных рибулозо-5-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу и рибулозо-5-фосфатфосфатазу; и

(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением рибулозы.

75. Бесклеточный способ получения рибозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии термостабильной целлодекстринфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, термостабильной 6-фосфоглюконолактоназы, термостабильной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, термостабильной рибозо-5-фосфатизомеразы и термостабильной рибозо-5-фосфатфосфатазы, с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют термостабильные ферменты;

(b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата;

(с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением рибозы.

76. Бесклеточный способ получения рибозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, термостабильных рибозо-5-фосфатизомераз и термостабильных рибозо-5-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(c) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит термостабильную целлодекстринфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, термостабильную глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, термостабильную 6-фосфоглюконолактоназу, термостабильную 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, термостабильную рибозо-5-фосфатизомеразу и термостабильную рибозо-5-фосфатфосфатазу;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(e) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением рибозы.

77. Бесклеточный способ получения рибозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, термостабильных рибозо-5-фосфатизомераз и термостабильных рибозо-5-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;

(e) добавление к инактивированному теплом лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, термостабильных рибозо-5-фосфатизомераз и термостабильных рибозо-5-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, рибозо-5-фосфатизомеразу и рибозо-5-фосфатфосфатазу; и

(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением рибозы.

78. Бесклеточный способ получения арабинозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии термостабильной целлодекстринфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, термостабильной 6-фосфоглюконолактоназы, термостабильной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, термостабильной арабинозо-5-фосфатизомеразы и термостабильной арабинозо-5-фосфатфосфатазы, с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют термостабильные ферменты;

(b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата;

(с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением арабинозы.

79. Бесклеточный способ получения арабинозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, термостабильных арабинозо-5-фосфатизомераз и термостабильных арабинозо-5-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(c) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит термостабильную целлодекстринфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, термостабильную глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, термостабильную 6-фосфоглюконолактоназу, термостабильную 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, термостабильную арабинозо-5-фосфатизомеразу и термостабильную арабинозо-5-фосфатфосфатазу;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(e) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением арабинозы.

80. Бесклеточный способ получения арабинозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, термостабильных арабинозо-5-фосфатизомераз и термостабильных арабинозо-5-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;

(e) добавление к инактивированному теплом лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, термостабильных 6-фосфоглюконолактоназ, термостабильных 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, термостабильных арабинозо-5-фосфатизомераз и термостабильных арабинозо-5-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, арабинозо-5-фосфатизомеразу и арабинозо-5-фосфатфосфатазу; и

(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением арабинозы.

81. Бесклеточный способ получения маннозы, причем способ предусматривает:

(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии термостабильной целлодекстринфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной фосфоглюкоизомеразы, термостабильной маннозо-6-фосфатэпимеразы и термостабильной маннозо-6-фосфатфосфатазы, с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют термостабильные ферменты;

(b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата;

(с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением маннозы.

82. Бесклеточный способ получения маннозы, причем способ предусматривает:

(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильных маннозо-6-фосфатэпимераз и термостабильных маннозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(c) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит термостабильную целлодекстринфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, термостабильную фосфоглюкоизомеразу, термостабильную маннозо-6-фосфатэпимеразу и термостабильную маннозо-6-фосфатфосфатазу;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(e) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением маннозы.

83. Бесклеточный способ получения маннозы, причем способ предусматривает:

(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильных маннозо-6-фосфатэпимераз и термостабильных маннозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;

(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;

(с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов;

(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;

(e) добавление к инактивированному теплом лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильной маннозо-6-фосфатэпимераз и термостабильных маннозо-6-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, маннозо-6-фосфатэпимеразу и маннозо-6-фосфатфосфатазу; и

(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением маннозы.

84. Способ по любому из вариантов осуществления 1-80, при котором клетки включают бактериальные клетки.

85. Способ по любому из вариантов осуществления 1-80, при котором клетки включают дрожжевые клетки.

86. Способ по любому из вариантов осуществления 1-85, при котором по меньшей мере один из ферментов является гетерологичным по отношению к клеткам.

87. Способ по любому из вариантов осуществления 1-86, при котором стадия (b) лизирования включает механическое, химическое или ферментативное лизирование культивированных клеток.

88. Способ по любому из вариантов осуществления 1-87, при котором стадия (c) нагревания включает нагревание клеточного лизата до температуры по меньшей мере 50°C.

89. Способ по любому из вариантов осуществления 1-88, при котором целлодекстрин содержит амилозу, амилопектин или как амилозу, так и амилопектин.

90. Способ по любому из вариантов осуществления 1-89, при котором термостабильная целлодекстринфосфорилаза и термостабильная фосфоглюкомутаза экспрессируются в форме единого гибридного белка или бифункционального белка.

91. Клеточный лизат, полученный способом по любому из вариантов осуществления 1-90.

92. Сконструированная клетка, содержащая целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу и глюкозо-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

93. Сконструированная клетка, содержащая целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу и фруктозо-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

94. Сконструированная клетка, содержащая целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и аллюлозо-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

95. Сконструированная клетка, содержащая целлодекстринфосфорилазуа, фосфоглюкомутазу, альдозодегидрогеназу и сорбит-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

96. Сконструированная клетка, содержащая целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу и рибулозо-5-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

97. Сконструированная клетка, содержащая целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, рибозо-5-фосфатизомеразу и рибозо-5-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

98. Сконструированная клетка, содержащая целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, арабинозо-5-фосфатизомеразу и арабинозо-5-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

99. Сконструированная клетка, содержащая целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, маннозо-6-фосфатэпимеразу и маннозо-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

100. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 35-41, причем клетка представляет собой бактериальную клетку или дрожжевую клетку.

101. Единый клеточный лизат, смесь клеточных лизатов, полученных по меньшей мере из двух клеточных популяций, или реакционная смесь, которые содержат целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу и глюкозо-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

102. Единый клеточный лизат, смесь клеточных лизатов, полученных по меньшей мере из двух клеточных популяций, или реакционная смесь, которые содержат целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу и фруктозо-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

103. Единый клеточный лизат, смесь клеточных лизатов, полученных по меньшей мере из двух клеточных популяций, или реакционная смесь, которые содержат целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и аллюлозо-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

104. Единый клеточный лизат, смесь клеточных лизатов, полученных по меньшей мере из двух клеточных популяций, или реакционная смесь, которые содержат целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, альдозодегидрогеназу и сорбит-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

105. Единый клеточный лизат, смесь клеточных лизатов, полученных по меньшей мере из двух клеточных популяций, или реакционная смесь, которые содержат целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу и рибулозо-5-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

106. Единый клеточный лизат, смесь клеточных лизатов, полученных по меньшей мере из двух клеточных популяций, или реакционная смесь, которые содержат целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, рибозо-5-фосфатизомеразу и рибозо-5-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

107. Единый клеточный лизат, смесь клеточных лизатов, полученных по меньшей мере из двух клеточных популяций, или реакционная смесь, которые содержат целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, арабинозо-5-фосфатизомеразу и арабинозо-5-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

108. Единый клеточный лизат, смесь клеточных лизатов, полученных по меньшей мере из двух клеточных популяций, или реакционная смесь, которые содержат целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, маннозо-6-фосфатэпимеразу и маннозо-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.

109. Бесклеточный способ получения сахара, причем способ предусматривает:

(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии термостабильной α-глюканфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы и по меньшей мере одного термостабильного фермента, выбранного из группы, состоящей из изомераз, эпимераз, дегидрогеназ и сахарофосфатаз, с получением культивированных клеток, которые экспрессируют такие ферменты;

(b) лизирование культивированных клеток со стадии (a) с получением клеточного лизата;

(с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и

(d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением сахара.

110. Способ по варианту осуществления 109, при котором по меньшей мере один термостабильный фермент представляет собой изомеразу, выбранную из группы, состоящей из фосфоглюкоизомеразы, рибозо-5-фосфатизомеразы и арабинозо-5-фосфатизомеразы.

111. Способ по варианту осуществления 109 или 110, при котором по меньшей мере один термостабильный фермент представляет собой аллюлозо-6-фосфатэпимеразу.

112. Способ по любому из вариантов осуществления 109-111, при котором по меньшей мере один термостабильный фермент представляет собой дегидрогеназу, выбранную из группы, состоящей из альдозодегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы.

113. Способ по любому из вариантов осуществления 109-112, при котором по меньшей мере один термостабильный фермент представляет собой сахарофосфатазу, выбранную из группы, состоящей из глюкозо-6-фосфатфосфатазы, фруктозо-6-фосфатфосфатазы, аллюлозо-6-фосфатфосфатазы, сорбит-6-фосфатфосфатазы, рибулозо-5-фосфатфосфатазы, рибозо-5-фосфатфосфатазы и арабинозо-5-фосфатфосфатазы.

114. Способ по варианту осуществления 109, при котором сахар выбран из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, аллюлозы, сорбита, рибулозы, рибозы и арабинозы.

115. Способ по варианту осуществления 114, при котором сахар представляет собой глюкозу, а по меньшей мере одной термостабильный фермент включает глюкозо-6-фосфатфосфатазу.

116. Способ по варианту осуществления 115, при котором клетки сконструированы для экспрессии термостабильной α-глюканфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы и термостабильной глюкозо-6-фосфатфосфатазы.

117. Способ по варианту осуществления 114, при котором сахар представляет собой фруктозу, а по меньшей мере один термостабильный фермент выбран из фосфоглюкоизомераз и фруктозо-6-фосфатфосфатаз.

118. Способ по варианту осуществления 117, при котором клетки сконструированы для экспрессии термостабильной α-глюканфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной фосфоглюкоизомеразы и термостабильной фруктозо-6-фосфатфосфатазы.

119. Способ по варианту осуществления 114, при котором сахар представляет собой аллюлозу, а по меньшей мере один термостабильный фермент выбран из фосфоглюкоизомераз, аллюлозо-6-фосфатэпимераз и аллюлозо-6-фосфатфосфатаз.

120. Способ по варианту осуществления 119, при котором клетки сконструированы для экспрессии термостабильной α-глюканфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной фосфоглюкоизомеразы, термостабильной аллюлозо-6-фосфатэпимеразы и термостабильной аллюлозо-6-фосфатфосфатазы.

121. Способ по варианту осуществления 114, при котором сахар представляет собой сорбит, а по меньшей мере один термостабильный фермент выбран из альдозодегидрогеназ и сорбит-6-фосфатфосфатаз.

122. Способ по варианту осуществления 121, при котором клетки сконструированы для экспрессии термостабильной α-глюканфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной альдозодегидрогеназы и термостабильной сорбит-6-фосфатфосфатазы.

123. Способ по варианту осуществления 114, при котором сахар представляет собой рибулозу, а по меньшей мере один термостабильный фермент выбран из глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, 6-фосфоглюконолактоназ, 6-фосфоглюконатдегидрогеназ и рибулозо-5-фосфатфосфатаз.

124. Способ по варианту осуществления 123, при котором клетки сконструированы для экспрессии термостабильной α-глюканфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, термостабильной 6-фосфоглюконолактоназы, термостабильной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы и термостабильной рибулозо-5-фосфатфосфатазы.

125. Способ по варианту осуществления 114, при котором сахар представляет собой рибозу, а по меньшей мере один термостабильный фермент выбран из глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, 6-фосфоглюконолактоназ, 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, рибозо-5-фосфатизомераз и рибозо-5-фосфатфосфатаз.

126. Способ по варианту осуществления 125, при котором клетки сконструированы для экспрессии термостабильной α-глюканфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, термостабильной 6-фосфоглюконолактоназы, термостабильной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, термостабильной рибозо-5-фосфатизомеразы и термостабильной рибозо-5-фосфатфосфатазы.

127. Способ по варианту осуществления 114, при котором сахар представляет собой арабинозу, а по меньшей мере один термостабильный фермент выбран из глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, 6-фосфоглюконолактоназ, 6-фосфоглюконатдегидрогеназ, арабинозо-5-фосфатизомераз и арабинозо-5-фосфатфосфатаз.

128. Способ по варианту осуществления 127, при котором клетки сконструированы для экспрессии термостабильной α-глюканфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, термостабильной 6-фосфоглюконолактоназы, термостабильной 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, термостабильной арабинозо-5-фосфатизомеразы и термостабильной арабинозо-5-фосфатфосфатазы.

129. Способ по любому из вариантов осуществления 109-128, при котором клетки представляют собой бактериальные клетки.

130. Способ по любому из вариантов осуществления 109-128, при котором клетки представляют собой дрожжевые клетки.

131. Способ по любому из вариантов осуществления 109-130, при котором термостабильная α-глюканфосфорилаза, термостабильная фосфоглюкомутаза и/или по меньшей мере один термостабильный фермент является/являются гетерологичными по отношению к клеткам.

132. Способ по любому из вариантов осуществления 109-131, при котором стадия (b) лизирования включает механическое, химическое или ферментативное лизирование культивированных клеток.

133. Способ по любому из вариантов осуществления 109-132, при котором стадия (c) нагревания включает нагревание клеточного лизата до температуры по меньшей мере 50°C.

134. Способ по любому из вариантов осуществления 109-133, при котором крахмал содержит амилозу, амилопектин или как амилозу, так и амилопектин.

135. Способ по любому из вариантов осуществления 109-134, при котором термостабильная α-глюканфосфорилаза и термостабильная фосфоглюкомутаза экспрессируются в форме единого гибридного белка.

136. Бесклеточный способ получения сахара, причем способ предусматривает:

(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии α-глюканфосфорилазы, фосфоглюкомутазы и по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из изомераз, эпимераз, дегидрогеназ и сахарофосфатаз, с получением культивированных клеток, которые экспрессируют такие ферменты;

(b) лизирование культивированных клеток со стадии (a) с получением клеточного лизата; и

(c) инкубирование лизата в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением сахара.

137. Бесклеточный способ получения сахара, причем способ предусматривает:

(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии (i) гибридного белка, который содержит α-глюканфосфорилазу, гибридизированную с фосфоглюкомутазой, и (ii) по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из изомераз, эпимераз, дегидрогеназ и сахарофосфатаз, с получением культивированных клеток, которые экспрессируют такие ферменты;

(b) лизирование культивированных клеток со стадии (a) с получением клеточного лизата; и

(c) инкубирование лизата в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением сахара.

138. Бесклеточный способ получения сахара, причем способ предусматривает:

(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии гибридного белка, который содержит α-глюканфосфорилазу, гибридизированную с фосфоглюкомутазой;

(b) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из изомераз, эпимераз, дегидрогеназ и сахарофосфатаз, с получением культивированных клеток, которые экспрессируют такие ферменты;

(c) лизирование культивированных клеток со стадии (a) с стадии (b) с получением клеточных лизатов; и

(d) инкубирование лизатов в присутствии крахмала и неорганического фосфата с получением сахара.

139. Способ по варианту осуществления 137 или 138, при котором ферменты со стадий (a) и/или (b) являются термостабильными ферментами.

140. Способ по варианту осуществления 139, причем способ дополнительно предусматривает нагревание одного или нескольких клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты, с получением одного или нескольких инактивированных нагреванием лизатов.

141. Клеточный лизат, полученный способом по любому из вариантов осуществления 109-138.

142. Сконструированная клетка, содержащая термостабильную α-глюканфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу и по меньшей мере один термостабильный фермент, выбранный из группы, состоящей из изомераз, эпимераз, дегидрогеназ и сахарофосфатаз.

143. Сконструированная клетка по варианту осуществления 142, содержащая:

(a) термостабильную α-глюканфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу и термостабильную глюкозо-6-фосфатфосфатазу;

(b) термостабильную α-глюканфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу и фруктозо-6-фосфатфосфатазу;

(c) термостабильную α-глюканфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и аллюлозо-6-фосфатфосфатазу;

(d) термостабильную α-глюканфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, альдозодегидрогеназу и сорбит-6-фосфатфосфатазу;

(e) термостабильную α-глюканфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу и рибулозо-5-фосфатфосфатазу;

(f) термостабильную α-глюканфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, рибозо-5-фосфатизомеразу и рибозо-5-фосфатфосфатазу; или

(g) термостабильную α-глюканфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюконолактоназу, 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, арабинозо-5-фосфатизомеразу и арабинозо-5-фосфатфосфатазу.

144. Сконструированная клетка по варианту осуществления 142 или 143, причем такая клетка представляет собой бактериальную клетку или дрожжевую клетку.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Бесклеточное превращение крахмала в аллюлозу

В настоящем примере описано превращение крахмала в аллюлозу. Клетки (например, бактериальные или дрожжевые клетки), сконструированные для экспрессии по меньшей мере одного гетерологичного гена, кодирующего по меньшей мере один фермент для превращения крахмала в аллюлозу, выращивали в жидких культурах до высокой плотности клеток. Примеры гетерологичных ферментов, которые можно было использовать в настоящем примере, включают термостабильные варианты α-глюканфосфорилазы (EC 2.4.1.1), фосфоглюкомутазы (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 или 5.4.2.6), фосфоглюкоизомеразы (EC 5.3.1.9), аллюлозо-6-фосфатэпимеразы (EC 5.3.1.-) и аллюлозо-6-фосфатфосфатазы (EC 5.3.1.-). В конце стадии роста индуцировали экспрессию одного или нескольких гетерологичных ферментов, а затем собирали клеточную биомассу. Собранную биомассу затем лизировали механическим, химическим или ферментативным способом. Клеточный лизат затем нагревали до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько гетерологичных ферментов. К инактивированному теплом лизату добавляли сырье на основе крахмала, неорганический фосфат и необязательно другие дополнительные питательные вещества, что обеспечивало превращение крахмала в аллюлозу (фиг. 1).

Пример 2

Бесклеточное превращение крахмала в глюкозу

В настоящем примере описано превращение крахмала в глюкозу. Клетки (например, бактериальные или дрожжевые клетки), сконструированные для экспрессии по меньшей мере одного гетерологичного гена, кодирующего по меньшей мере один фермент для превращения крахмала в глюкозу, выращивали в жидких культурах до высокой плотности клеток. Примеры гетерологичных ферментов, которые можно было использовать в настоящем примере, включают термостабильные варианты α-глюканфосфорилазы (EC 2.4.1.1), фосфоглюкомутазы (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 или 5.4.2.6) и глюкозо-6-фосфатфосфатазы (EC 5.3.1.-). В конце стадии роста индуцировали экспрессию одного или нескольких гетерологичных ферментов, а затем собирали клеточную биомассу. Собранную биомассу затем лизировали механическим, химическим или ферментативным способом. Клеточный лизат затем нагревали до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько гетерологичных ферментов. К инактивированному теплом лизату добавляли сырье на основе крахмала, неорганический фосфат и необязательно другие дополнительные питательные вещества, что обеспечивало превращение крахмала в глюкозу (фиг. 2А).

В настоящем примере также описан другой путь превращения крахмала в глюкозу. Клетки (например, бактериальные или дрожжевые клетки), сконструированные для экспрессии по меньшей мере одного гетерологичного гена, кодирующего по меньшей мере один фермент для превращения крахмала в глюкозу, выращивали в жидких культурах до высокой плотности клеток. Примеры гетерологичных ферментов, которые можно было использовать в настоящем примере, включают термостабильные варианты α-глюканфосфорилазы (EC 2.4.1.1) и глюкозо-1-фосфатфосфатазы (EC 3.1.3.10). В конце стадии роста индуцировали экспрессию одного или нескольких гетерологичных ферментов, а затем собирали клеточную биомассу. Собранную биомассу затем лизировали механическим, химическим или ферментативным способом. Клеточный лизат затем нагревали до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько гетерологичных ферментов. К инактивированному теплом лизату добавляли сырье на основе крахмала, неорганический фосфат и необязательно другие дополнительные питательные вещества, что обеспечивало превращение крахмала в глюкозу (фиг. 2В).

Пример 3

Бесклеточное превращение крахмала во фруктозу

В настоящем примере описано превращение крахмала во фруктозу. Клетки (например, бактериальные или дрожжевые клетки), сконструированные для экспрессии по меньшей мере одного гетерологичного гена, кодирующего по меньшей мере один фермент для превращения крахмала во фруктозу, выращивали в жидких культурах до высокой плотности клеток. Примеры гетерологичных ферментов, которые можно было использовать в настоящем примере, включают термостабильные варианты α-глюканфосфорилазы (EC 2.4.1.1), фосфоглюкомутазы (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 или 5.4.2.6), фосфоглюкоизомеразы (EC 5.3.1.9) и фруктозо-6-фосфатфосфатазы (EC 5.3.1.-). В конце стадии роста индуцировали экспрессию одного или нескольких гетерологичных ферментов, а затем собирали клеточную биомассу. Собранную биомассу затем лизировали механическим, химическим или ферментативным способом. Клеточный лизат затем нагревали до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько гетерологичных ферментов. К инактивированному теплом лизату добавляли сырье на основе крахмала, неорганический фосфат и необязательно другие дополнительные питательные вещества, что обеспечивало превращение крахмала во фруктозу (фиг. 3).

Пример 4

Бесклеточное превращение крахмала в сорбит

В настоящем примере описано превращение крахмала в сорбит. Клетки (например, бактериальные или дрожжевые клетки), сконструированные для экспрессии по меньшей мере одного гетерологичного гена, кодирующего по меньшей мере один фермент для превращения крахмала в сорбит, выращивали в жидких культурах до высокой плотности клеток. Примеры гетерологичных ферментов, которые можно было использовать в настоящем примере, включают термостабильные варианты α-глюканфосфорилазы (EC 2.4.1.1), фосфоглюкомутазы (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 или 5.4.2.6), альдозодегидрогеназы (EC 1.1.1.200) и сорбит-6-фосфатфосфатазы (EC 5.3.1.-). В конце стадии роста индуцировали экспрессию одного или нескольких гетерологичных ферментов, а затем собирали клеточную биомассу. Собранную биомассу затем лизировали механическим, химическим или ферментативным способом. Клеточный лизат затем нагревали до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько гетерологичных ферментов. К инактивированному теплом лизату добавляли сырье на основе крахмала, неорганический фосфат и необязательно другие дополнительные питательные вещества, что обеспечивало превращение крахмала в сорбит (фиг. 4).

Пример 5

Бесклеточное превращение крахмала в рибулозу

В настоящем примере описано превращение крахмала в рибулозу. Клетки (например, бактериальные или дрожжевые клетки), сконструированные для экспрессии по меньшей мере одного гетерологичного гена, кодирующего по меньшей мере один фермент для превращения крахмала в рибулозу, выращивали в жидких культурах до высокой плотности клеток. Примеры гетерологичных ферментов, которые можно было использовать в настоящем примере, включают термостабильные варианты α-глюканфосфорилазы (EC 2.4.1.1), фосфоглюкомутазы (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 или 5.4.2.6), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (EC 1.1.1.49), 6-фосфоглюконолактоназы (EC 3.1.1.31), 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (EC 1.1.1.44) и рибулозо-5-фосфатфосфатазы (EC 5.3.1.-), а также рибулозо-6-фосфатфосфатазы (EC 5.3.1.-). В конце стадии роста индуцировали экспрессию одного или нескольких гетерологичных ферментов, а затем собирали клеточную биомассу. Собранную биомассу затем лизировали механическим, химическим или ферментативным способом. Клеточный лизат затем нагревали до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько гетерологичных ферментов. К инактивированному теплом лизату добавляли сырье на основе крахмала, неорганический фосфат и необязательно другие дополнительные питательные вещества, что обеспечивало превращение крахмала в рибулозу (фиг. 5).

Пример 6

Бесклеточное превращение крахмала в рибозу

В настоящем примере описано превращение крахмала в рибозу. Клетки (например, бактериальные или дрожжевые клетки), сконструированные для экспрессии по меньшей мере одного гетерологичного гена, кодирующего по меньшей мере один фермент для превращения крахмала в рибозу, выращивали в жидких культурах до высокой плотности клеток. Примеры гетерологичных ферментов, которые можно было использовать в настоящем примере, включают термостабильные варианты α-глюканфосфорилазы (EC 2.4.1.1), фосфоглюкомутазы (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 или 5.4.2.6), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (EC 1.1.1.49), 6-фосфоглюконолактоназы (EC 3.1.1.31), 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (EC 1.1.1.44), рибозо-5-фосфатизомеразы (EC 5.3.1.6) и рибозо-5-фосфатфосфатазы (EC 5.3.1.-). В конце стадии роста индуцировали экспрессию одного или нескольких гетерологичных ферментов, а затем собирали клеточную биомассу. Собранную биомассу затем лизировали механическим, химическим или ферментативным способом. Клеточный лизат затем нагревали до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько гетерологичных ферментов. К инактивированному теплом лизату добавляли сырье на основе крахмала, неорганический фосфат и необязательно другие дополнительные питательные вещества, что обеспечивало превращение крахмала в рибозу (фиг. 6).

Пример 7

Бесклеточное превращение крахмала в арабинозу

В настоящем примере описано превращение крахмала в арабинозу. Клетки (например, бактериальные или дрожжевые клетки), сконструированные для экспрессии по меньшей мере одного гетерологичного гена, кодирующего по меньшей мере один фермент для превращения крахмала в арабинозу, выращивали в жидких культурах до высокой плотности клеток. Примеры гетерологичных ферментов, которые можно было использовать в настоящем примере, включают термостабильные варианты α-глюканфосфорилазы (EC 2.4.1.1), фосфоглюкомутазы (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 или 5.4.2.6), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (EC 1.1.1.49), 6-фосфоглюконолактоназы (EC 3.1.1.31), 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (EC 1.1.1.44), арабинозо-5-фосфатизомеразы (EC 5.3.1.6) и арабинозо-5-фосфатфосфатазы (EC 5.3.1.-). В конце стадии роста индуцировали экспрессию одного или нескольких гетерологичных ферментов, а затем собирали клеточную биомассу. Собранную биомассу затем лизировали механическим, химическим или ферментативным способом. Клеточный лизат затем нагревали до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько гетерологичных ферментов. К инактивированному теплом лизату добавляли сырье на основе крахмала, неорганический фосфат и необязательно другие дополнительные питательные вещества, что обеспечивало превращение крахмала в арабинозу (фиг. 7).

Пример 8

Бесклеточное превращение целлюлозы/целлодекстрина в аллюлозу

В настоящем примере описано превращение целлюлозы/целлодекстрина в аллюлозу. Клетки (например, бактериальные или дрожжевые клетки), сконструированные для экспрессии по меньшей мере одного гетерологичного гена, кодирующего по меньшей мере один фермент для превращения целлюлозы/целлодекстрина в аллюлозу, выращивали в жидких культурах до высокой плотности клеток. Примеры гетерологичных ферментов, которые можно было использовать в настоящем примере, включают термостабильные варианты целлодекстринфосфорилазы (EC 2.4.1.49), фосфоглюкомутазы (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 или 5.4.2.6), фосфоглюкоизомеразы (EC 5.3.1.9), аллюлозо-6-фосфатэпимеразы (EC 5.3.1.-) и аллюлозо-6-фосфатфосфатазы (EC 5.3.1.-). В конце стадии роста индуцировали экспрессию одного или нескольких гетерологичных ферментов, а затем собирали клеточную биомассу. Собранную биомассу затем лизировали механическим, химическим или ферментативным способом. Клеточный лизат затем нагревали до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько гетерологичных ферментов. К инактивированному теплом лизату добавляли сырье на основе целлюлозы/целлодекстрина, неорганический фосфат и необязательно другие дополнительные питательные вещества, что обеспечивало превращение целлюлозы/целлодекстрина в аллюлозу.

Пример 9

Бесклеточное превращение целлюлозы/целлодекстрина в глюкозу

В настоящем примере описано превращение целлюлозы/целлодекстрина в глюкозу. Клетки (например, бактериальные или дрожжевые клетки), сконструированные для экспрессии по меньшей мере одного гетерологичного гена, кодирующего по меньшей мере один фермент для превращения целлюлозы/целлодекстрина в глюкозу, выращивали в жидких культурах до высокой плотности клеток. Примеры гетерологичных ферментов, которые можно было использовать в настоящем примере, включают термостабильные варианты целлодекстринфосфорилазы (EC 2.4.1.49), фосфоглюкомутазы (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 или 5.4.2.6) и глюкозо-6-фосфатфосфатазы (EC 5.3.1.-). В конце стадии роста индуцировали экспрессию одного или нескольких гетерологичных ферментов, а затем собирали клеточную биомассу. Собранную биомассу затем лизировали механическим, химическим или ферментативным способом. Клеточный лизат затем нагревали до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько гетерологичных ферментов. К инактивированному теплом лизату добавляли сырье на основе целлюлозы/целлодекстрина, неорганический фосфат и необязательно другие дополнительные питательные вещества, что обеспечивало превращение целлюлозы/целлодекстрина в глюкозу.

В настоящем примере также описан другой путь превращения целлюлозы/целлодекстрина в глюкозу. Клетки (например, бактериальные или дрожжевые клетки), сконструированные для экспрессии по меньшей мере одного гетерологичного гена, кодирующего по меньшей мере один фермент для превращения целлюлозы/целлодекстрина в глюкозу, выращивали в жидких культурах до высокой плотности клеток. Примеры гетерологичных ферментов, которые можно было использовать в настоящем примере, включают термостабильные варианты целлодекстринфосфорилазы (EC 2.4.1.49) и глюкозо-1-фосфатфосфатазы (EC 3.1.3.10). В конце стадии роста индуцировали экспрессию одного или нескольких гетерологичных ферментов, а затем собирали клеточную биомассу. Собранную биомассу затем лизировали механическим, химическим или ферментативным способом. Клеточный лизат затем нагревали до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько гетерологичных ферментов. К инактивированному теплом лизату добавляли сырье на основе целлюлозы/целлодекстрина, неорганический фосфат и необязательно другие дополнительные питательные вещества, что обеспечивало превращение целлюлозы/целлодекстрина в глюкозу.

Пример 10

Бесклеточное превращение целлюлозы/целлодекстрина во фруктозу

В настоящем примере описано превращение целлюлозы/целлодекстрина во фруктозу. Клетки (например, бактериальные или дрожжевые клетки), сконструированные для экспрессии по меньшей мере одного гетерологичного гена, кодирующего по меньшей мере один фермент для превращения целлюлозы/целлодекстрина во фруктозу, выращивали в жидких культурах до высокой плотности клеток. Примеры гетерологичных ферментов, которые можно было использовать в настоящем примере, включают термостабильные варианты целлодекстринфосфорилазы (EC 2.4.1.49), фосфоглюкомутазы (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 или 5.4.2.6), фосфоглюкоизомеразы (EC 5.3.1.9) и фруктозо-6-фосфатфосфатазы (EC 5.3.1.-). В конце стадии роста индуцировали экспрессию одного или нескольких гетерологичных ферментов, а затем собирали клеточную биомассу. Собранную биомассу затем лизировали механическим, химическим или ферментативным способом. Клеточный лизат затем нагревали до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько гетерологичных ферментов. К инактивированному теплом лизату добавляли сырье на основе целлюлозы/целлодекстрина, неорганический фосфат и необязательно другие дополнительные питательные вещества, что обеспечивало превращение целлюлозы/целлодекстрина во фруктозу.

Пример 11

Бесклеточное превращение целлюлозы/целлодекстрина в сорбит

В настоящем примере описано превращение целлюлозы/целлодекстрина в сорбит. Клетки (например, бактериальные или дрожжевые клетки), сконструированные для экспрессии по меньшей мере одного гетерологичного гена, кодирующего по меньшей мере один фермент для превращения целлюлозы/целлодекстрина в сорбит, выращивали в жидких культурах до высокой плотности клеток. Примеры гетерологичных ферментов, которые можно было использовать в настоящем примере, включают термостабильные варианты целлодекстринфосфорилазы (EC 2.4.1.49), фосфоглюкомутазы (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 или 5.4.2.6), альдозодегидрогеназы (EC 1.1.1.200) и сорбит-6-фосфатфосфатазы (EC 5.3.1.-). В конце стадии роста индуцировали экспрессию одного или нескольких гетерологичных ферментов, а затем собирали клеточную биомассу. Собранную биомассу затем лизировали механическим, химическим или ферментативным способом. Клеточный лизат затем нагревали до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько гетерологичных ферментов. К инактивированному теплом лизату добавляли сырье на основе целлюлозы/целлодекстрина, неорганический фосфат и необязательно другие дополнительные питательные вещества, что обеспечивало превращение целлюлозы/целлодекстрина в сорбит.

Пример 12

Бесклеточное превращение целлюлозы/целлодекстрина в рибулозу

В настоящем примере описано превращение целлюлозы/целлодекстрина в рибулозу. Клетки (например, бактериальные или дрожжевые клетки), сконструированные для экспрессии по меньшей мере одного гетерологичного гена, кодирующего по меньшей мере один фермент для превращения целлюлозы/целлодекстрина в рибулозу, выращивали в жидких культурах до высокой плотности клеток. Примеры гетерологичных ферментов, которые можно было использовать в настоящем примере, включают термостабильные варианты целлодекстринфосфорилазы (EC 2.4.1.49), фосфоглюкомутазы (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 или 5.4.2.6), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (EC 1.1.1.49), 6-фосфоглюконолактоназы (EC 3.1.1.31), 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (EC 1.1.1.44) и рибулозо-5-фосфатфосфатазы (EC 5.3.1.-), а также рибулозо-6-фосфатфосфатазы (EC 5.3.1.-). В конце стадии роста индуцировали экспрессию одного или нескольких гетерологичных ферментов, а затем собирали клеточную биомассу. Собранную биомассу затем лизировали механическим, химическим или ферментативным способом. Клеточный лизат затем нагревали до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько гетерологичных ферментов. К инактивированному теплом лизату добавляли сырье на основе целлюлозы/целлодекстрина, неорганический фосфат и необязательно другие дополнительные питательные вещества, что обеспечивало превращение целлюлозы/целлодекстрина в рибулозу.

Пример 13

Бесклеточное превращение целлюлозы/целлодекстрина в рибозу

В настоящем примере описано превращение целлюлозы/целлодекстрина в рибозу. Клетки (например, бактериальные или дрожжевые клетки), сконструированные для экспрессии по меньшей мере одного гетерологичного гена, кодирующего по меньшей мере один фермент для превращения целлюлозы/целлодекстрина в рибозу, выращивали в жидких культурах до высокой плотности клеток. Примеры гетерологичных ферментов, которые можно было использовать в настоящем примере, включают термостабильные варианты целлодекстринфосфорилазы (EC 2.4.1.49), фосфоглюкомутазы (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 или 5.4.2.6), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (EC 1.1.1.49), 6-фосфоглюконолактоназы (EC 3.1.1.31), 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (EC 1.1.1.44), рибозо-5-фосфатизомеразы (EC 5.3.1.6) и рибозо-5-фосфатфосфатазы (EC 5.3.1.-). В конце стадии роста индуцировали экспрессию одного или нескольких гетерологичных ферментов, а затем собирали клеточную биомассу. Собранную биомассу затем лизировали механическим, химическим или ферментативным способом. Клеточный лизат затем нагревали до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько гетерологичных ферментов. К инактивированному теплом лизату добавляли сырье на основе целлюлозы/целлодекстрина, неорганический фосфат и необязательно другие дополнительные питательные вещества, что обеспечивало превращение целлюлозы/целлодекстрина в рибозу.

Пример 14

Бесклеточное превращение целлюлозы/целлодекстрина в арабинозу

В настоящем примере описано превращение целлюлозы/целлодекстрина в арабинозу. Клетки (например, бактериальные или дрожжевые клетки), сконструированные для экспрессии по меньшей мере одного гетерологичного гена, кодирующего по меньшей мере один фермент для превращения целлюлозы/целлодекстрина в арабинозу, выращивали в жидких культурах до высокой плотности клеток. Примеры гетерологичных ферментов, которые можно было использовать в настоящем примере, включают термостабильные варианты целлодекстринфосфорилазы (EC 2.4.1.49), фосфоглюкомутазы (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 или 5.4.2.6), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (EC 1.1.1.49), 6-фосфоглюконолактоназы (EC 3.1.1.31), 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (EC 1.1.1.44), арабинозо-5-фосфатизомеразы (EC 5.3.1.6) и арабинозо-5-фосфатфосфатазы (EC 5.3.1.-). В конце стадии роста индуцировали экспрессию одного или нескольких гетерологичных ферментов, а затем собирали клеточную биомассу. Собранную биомассу затем лизировали механическим, химическим или ферментативным способом. Клеточный лизат затем нагревали до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует один или несколько гетерологичных ферментов. К инактивированному теплом лизату добавляли сырье на основе целлюлозы/целлодекстрина, неорганический фосфат и необязательно другие дополнительные питательные вещества, что обеспечивало превращение целлюлозы/целлодекстрина в арабинозу.

Все ссылки, патенты и заявки на выдачу патентов, раскрытые в настоящем документе, включены посредством ссылки в отношении предмета изобретения, для которого каждая из них упомянута, что в некоторых случаях может охватывать весь документ.

Если явно не указано иное, формы единственного числа, используемые в контексте описания и формулы изобретения, следует понимать как означающие «по меньшей мере один».

Следует также понимать, что, если явно не указано обратное, в любых заявленных в настоящем документе способах, которые предусматривают более одной стадии или более одного действия, порядок стадий или действий такого способа не обязательно ограничен порядком, в котором указаны стадии или действия такого способа.

В пунктах формулы изобретения, а также в приведенном выше описании все переходные фразы, такие как «входящий в состав», «включающий», «несущий», «имеющий», «содержащий», «охватывающий», «предусматривающий», «имеющий в своем составе» и тому подобное следует понимать как открытые, то есть означающие включающий без ограничения. И только переходные фразы «состоящий из» и «фактически состоящий из» следует рассматривать соответственно как закрытые или полузакрытые переходные фразы, что указано в Руководстве по процедурам патентной экспертизы Патентного ведомства США, раздел 2111.03 (United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ГРИНЛАЙТ БАЙОСАЙЕНСИС, ИНК.

<120> БЕСКЛЕТОЧНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ САХАРОВ

<130> G0830.70022WO00

<140> PCT/US2018/012516

<141> 2018-01-05

<150> US 62/443,447

<151> 2017-01-06

<150> US 62/538,181

<151> 2017-07-28

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 1

Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr

1 5 10 15

Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala

20 25

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 2

Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr

1 5 10 15

Pro Val Thr Lys Ala

20

<210> 3

<211> 25

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 3

Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala

1 5 10 15

Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala

20 25

<210> 4

<211> 23

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 4

Met Asn Lys Lys Val Leu Thr Leu Ser Ala Val Met Ala Ser Met Leu

1 5 10 15

Phe Gly Ala Ala Ala His Ala

20

<210> 5

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 5

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala

20

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 6

Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ala

<210> 7

<211> 23

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 7

Met Met Thr Lys Ile Lys Leu Leu Met Leu Ile Ile Phe Tyr Leu Ile

1 5 10 15

Ile Ser Ala Ser Ala His Ala

20

<210> 8

<211> 21

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 8

Met Lys Gln Ala Leu Arg Val Ala Phe Gly Phe Leu Ile Leu Trp Ala

1 5 10 15

Ser Val Leu His Ala

20

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 9

Met Arg Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Phe Met Leu Pro Ala

1 5 10 15

Phe Ser

<210> 10

<211> 39

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 10

Met Ala Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala

1 5 10 15

Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu

20 25 30

Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala

35

<---

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения аллюлозы, предусматривающий следующие стадии: превращение полимерного глюкозного углевода в глюкозо-1-фосфат (G1P), с использованием α-глюкан или целлодекстринфосфорилазы; превращение G1P в глюкозо-6-фосфат (G6P), с использованием фосфоглюкомутазы; превращение G6P в фруктозо-6-фосфат (F6P), с использованием фосфоглюкоизомеразы; превращение F6P в аллюлозо-6-фосфат (A6P), с использованием аллюлозо-6-фосфатэпимеразы (A6PE); и превращение A6P в аллюлозу, с использованием аллюлозо-6-фосфатфосфатазы (A6PP); где A6PP является A6PP Ruminiclostridium thermocellum или где A6PЕ является и A6PE Brevibacillus thermoruber. Изобретение позволяет получать аллюлозу с высокой степенью эффективности. 2 н и 13 з.п. ф-лы, 8 ил., 3 табл., 14 пр.

1. Способ получения аллюлозы, предусматривающий следующие стадии:

превращение полимерного глюкозного углевода в глюкозо-1-фосфат (G1P), с использованием α-глюкан или целлодекстринфосфорилазы; превращение G1P в глюкозо-6-фосфат (G6P), с использованием фосфоглюкомутазы; превращение G6P в фруктозо-6-фосфат (F6P), с использованием фосфоглюкоизомеразы; превращение F6P в аллюлозо-6-фосфат (A6P), с использованием аллюлозо-6-фосфатэпимеразы (A6PE); и превращение A6P в аллюлозу, с использованием аллюлозо-6-фосфатфосфатазы (A6PP); где A6PP является A6PP Ruminiclostridium thermocellum.

2. Способ получения аллюлозы, предусматривающий следующие стадии:

превращение полимерного глюкозного углевода в глюкозо-1-фосфат (G1P), с использованием α-глюкан или целлодекстринфосфорилазы; превращение G1P для получения глюкозо-6-фосфата (G6P), с использованием фосфоглюкомутазы; превращение G6P в фруктозо-6-фосфат (F6P), с использованием фосфоглюкоизомеразы; превращение F6P с получением аллюлозо-6-фосфата (A6P), с использованием аллюлозо-6-фосфатэпимеразы (A6PE); и превращение A6P в аллюлозу, с использованием аллюлозо-6-фосфатфосфатазы (A6PP); где A6PЕ является и A6PE Brevibacillus thermoruber.

3. Способ по п. 1 или 2, при котором по меньшей мере один из ферментов является термостабильным, или по меньшей мере два из ферментов являются термостабильными.

4. Способ по любому из пп. 1-3, при котором A6PE является, A6PP является, или обе A6PE и A6PP являются термостабильными или сконструированы для обеспечения термостабильности.

5. Способ по любому из пп. 1-4, при котором полимерный глюкозный углевод выбран из крахмала, целлодекстрина, мальтодекстринов и гликогена.

6. Способ по любому из пп. 1-4, дополнительно предусматривающий обработку полимерного глюкозного углевода деветвящим ферментом; и причем полимерный глюкозный углевод выбран из гликогена, крахмала и гидролизированных мальтодекстринов.

7. Способ по п. 6, при котором деветвящий фермент выбран из (i) изоамилаз, необязательно выбранных из изоамилаз Sulfolobus tokodaii, Metallosphaera hakonensis, Sphaerobacter thermophiles и Bacillus lentus, и (ii) пуллуланаз, необязательно выбранных из пуллуланаз Fervidobacterium pennavorans. Thermotoga sp. RQ5, Bacillus flavocaldarius, Thermosipho africanus и Kosmotoga olearia.

8. Способ по любому из пп. 1 и 3-7, при котором А6РЕ выбрана из группы, состоящей из аллюлозо-6-фосфатэпимераз Thermobacterium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacter brockii, Caldanaerobacter subterraneus, Deferribacter desulfuricans, Thermocrinis ruber, Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1, Brevibacillus thermoruber, Thermosipho atlanticus и Thermosulfidibacter takaii.

9. Способ по п.8, при котором А6РЕ выбрана из группы, состоящей из аллюлозо-6-фосфатэпимераз Thermobacterium thermosaccharolyticum, Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1, и Brevibacillus thermoruber.

10. Способ по любому из пп. 1-9, при котором α-глюканфосфорилаза выбрана из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз Aquifex aeolicus, Thermocrinis minervae,

Thermosulfidibacter takaii, Thermosulfurimonas dismutans, Thermococcus litoralis, Palaeococcus pacificus, Thermotoga neapolitana, Ruminiclostridium thermocellum, Pyrococcus abyssi, Thermococcus thioreducens, Deinococcus radiodurans, Sulfolobus acidocaldarius, Thermus caldophilus, Meiothermus silvanus, Oceanithermus profundus, Ardenticatena maritima, Thermococcus barophilus, Pseudothermotoga thermarum, Hydrogenobacter thermophilus, Thermus oshimai, Meiothermus ruber и Marinitoga piezophila.

11. Способ по любому из пп. 1-10, при котором целлодекстринфосфорилаза выбрана из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз Clostridium thermocellum, Clostridium straminisolvens, Thermotoga RQ2; Ignisphaera aggregans, Thermotoga maritima, Spirochaeta thermophila, Caldicellulosiruptor bescii, Dictyoglomus thermophilum, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Thermosipho africanus, Caldisalinibacter kiritimatiensis, Defluviitalea phaphyphila, Caldicellulosiruptor kronotskyensis, Thermococcus sibiricus и Thermosphaera aggregans.

12. Способ по любому из пп. 1-11, при котором фосфоглюкомутаза выбрана из группы, состоящей из фосфоглюкомутаз Thermococcus kodakaraensis, Pyrococcus kukulkanii, Ammonifex degensii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermus fervidus, Sulfolobus acidocaldarius, Archaeoglobus fulgidus, Ferroglobus placidus, Geoglobus ahangari, Archaeoglobus veneficus, Archaeoglobus sulfaticallidus, Aciduliprofundum boonie, Clostridium thermocellum, Defluviitalea phaphyphila, Caminicella sporogenes, Caloranaerobacter ferrireducens, Thermosipho malanesiensis, Fervidobacterium pennivorans, Symbiobacterium thermophilum, Spirochaeta thermophila и Thermoanaerobacter wiegelii.

13. Способ по любому из пп. 1-12, при котором фосфоглюкоизомераза выбрана из группы, состоящей из фосфоглюкоизомераз Thermus thermophilus, Meiothermus timidus, Thermus filiformis, Marinithermus hydrothermalis, Thermosipho africanus, Sulfurihydrogenibium azorense, Persephonella marina, Marinitoga piezophila, Kosmotoga olearia, Thermotoga maritima, Geobacillus stearothermophilus, Anoxybacillus flavithermus, Thermosulfidibacter takaii, Fervidobacterium nodosum, Clostridium thermocellum, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Methanococcus jannaschii, Methanotorris igneus, Methanocaldococcus villosus, Methanothermococcus okinawensis, Pseudothermotoga thermarum, Deferribacter desulfuricans и Thermovibrio ammonificans.

14. Способ по любому из пп. 2-7 и 9-13, при котором А6РР выбрана из группы, состоящей из аллюлозо-6-фосфатфосфатаз Thermoanaerobacter wiegelii, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermus islandicus, Deinococcus geothermalis DSM 11300, Thermosphaera aggregans, Crenarchaeota archaeon, Pyrococcus horikoshii Ot3, Aquifex aeolicus, Ruminiclostridium thermocellum, Desulfotomaculum kuznetsovii, Caldanaerobacter subterraneus, Acidothermus cellulolyticus, Methanothermobacter thermautotrophicus, Thermobifida fusca, Thermotoga neapolitana, Petrotoga mobilis и Thermodesulfatator indicus, Thermus thermophilus, Bacteroides vulgatus и Bacteroides fragilus.

15. Способ по любому из пп. 1-14, при котором аллюлозо-6-фосфатфосфатаза специфична к аллюлозо-6-фосфату.

название	год	авторы	номер документа
Новая термостабильная фруктозо-6-фосфат-3-эпимераза и способ получения аллюлозы с ее использованием	2017	Ян Сончже Чо Хён Гук Ли Ми Ким Сон Бо Чо Сон Чжун	RU2733427C2
ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ D-АЛЛЮЛОЗЫ	2017	Вихелецкий, Дэниел, Джозеф Роджерс, Эдвин, О.	RU2819709C2
Рибулозофосфат-3-эпимеразный мотив с низкой побочной реакционной способностью и фермент, содержащий указанный мотив	2020	Юн Сан Сон Бён-Сам Чо Хён Гук Пак Хён Чжун Ким Сын Хван Ян Сончже Пак Иль Хян Ким Сон Бо	RU2792229C2
Новая термостабильная тагатоза-6-фосфатфосфатаза и способ получения тагатозы с ее использованием	2017	Ян Сончже Чо Хён Гук Ли Ми Ким Сон Бо Чо Сон Чжун	RU2722208C1
ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ТАГАТОЗЫ	2019	Вихелецкий, Дэниел, Джозеф	RU2820606C2
ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ D-ТАГАТОЗЫ	2016	Вихелецкий, Дэниел, Джозеф	RU2749811C1
ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ГЕКСОЗ	2018	Вихелецкий, Дэниел Джозеф Роджерс, Эдвин О.	RU2766710C2
Способы и композиции для лечения опухолей	2017	Грисселли Франк Тюран Али Беннасер-Грисселли Аннелиз	RU2741786C2
СПОСОБ АМПЛИФИЦИРОВАНИЯ ЛОКУСОВ В БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКЕ	2009	Феррари Эудженио Пере Каролин	RU2577985C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННОГО БАКУЛОВИРУСА, ШТАММ ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА, СПОСОБ БОРЬБЫ С НАСЕКОМЫМИ, ИНСЕКТИЦИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ	1991	Лоис К.Миллер[Us] Девид Р.О'Рейлли[Ie]	RU2099420C1

WO 2017002978 A1, 05.01.2017
NCBI Reference Sequence: WP_013298194.1, 18.03.2013 Найдено в интернет по адресу https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/WP_013298194.1?report=girevhist
NCBI Reference Sequence: WP_008287078.1, 10.05.2013 найдено в интернет по адресу https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/WP_008287078.1?report=girevhist
NCBI Reference

БЕСКЛЕТОЧНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ САХАРОВ Российский патент 2022 года по МПК C12N9/16 C12N15/52 C12P19/02

Описание патента на изобретение RU2776637C2

Похожие патенты RU2776637C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 776 637 C2

Реферат патента 2022 года БЕСКЛЕТОЧНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ САХАРОВ

Формула изобретения RU 2 776 637 C2

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2022 года RU2776637C2

RU 2 776 637 C2