СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДНК ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ ЧИСТОТЫ Российский патент 2018 года по МПК C07H1/08 C07H21/04 

Изобретение относится к биохимии, биотехнологии и может найти применение в медицине, фармацевтической, пищевой и косметической промышленности, микробиологии, сельскохозяйственном производстве.

В настоящее время ДНК и ее низкомолекулярные производные широко используются как в составе биологически активных добавок к пище (БАД) в качестве источника нуклеотидов для синтеза дезоксирибонуклеиновых кислот в организме, так и в составе лекарственных средств (патент RU 2106149, A61K 31/70, опубл. 10.03.1998; авторское свидетельство СССР 1804852, A61K 35/60, 1987; патент RU 2034028, МПК C12N 9/64, опубл. 30.04.1995).

Молоки рыб, получаемые при переработке рыбы, являются продуктом питания. В то же время благодаря высокому содержанию ДНК молоки уже давно и успешно используются в качестве дешевого и доступного исходного сырья для лекарственных препаратов и продуктов здорового питания (патент GB 808296, МПК С07С, опубл. 04.02.1959; патент DE 1142362, МПК C12N 15/10, опубл. 17.01.1963; патент GB 1233540, МПК C07H 14/47, опубл. 26.05.1971; патент US 3899481, МПК A61K 31/70, опубл. 12.08.1975; патент SU 652187, МПК С07Н 21/04, опубл. 15.03.1979; патент RU 2036652, МПК А61К 35/60, опубл. 09.06.1995; патент RU 2091073, МПК A61K 35/60, опубл. 20.10.1996). При этом несомненными преимуществами молок рыб являются более высокое содержание ДНК по сравнению с другими источниками и относительно низкое содержание примесей, а также дешевизна и доступность молок.

Известные способы крупномасштабной промышленной переработки молок рыб позволяют быстро перерабатывать большие объемы сырья (патент JP S552634, МПК С07Н 21/04, опубл. 10.01.1980; патент JPS 554308, МПК С07Н 01/08, опубл. 12.01.1980; патент CN 103865919, МПК C12N 15/10, опубл. 18.06.2014), иногда даже без предварительного измельчения исходного материала (патент JPS 552635, МПК С07Н 21/04, опубл. 10.01.1980), и получать при этом препараты высокомолекулярной ДНК, не отличающиеся высокой чистотой, которые, тем не менее, могут быть использованы в виде биологически активных пищевых добавок и в косметических препаратах.

Однако для получения медицинских препаратов необходима тщательная очистка ДНК от белков, жиров и полисахаридов, содержащихся в молоках. Этого можно добиться обработкой молок детергентами (патент RU 2108797, МПК A61K 35/60, С07Н 21/04, опубл. 20.04.1998) либо ферментами, способными разрушать примесные макромолекулы до легко выводимых из процесса получения ДНК мономеров, при этом могут использоваться как экзоферменты (патент SU 780444, МПК С07Н 21/04, опубл. 23.04.1985; патент RU 2072855, МПК A61K 35/60, С07Н 21/04, опубл. 10.02.1997; патент RU 2488634, МПК С12Р 19/34, С07Н 21/04, опубл. 27.07.2013), так и собственные лизосомальные ферменты, содержащиеся в клетках молок (патент RU 2055482, МПК A23J 3/04, A23J 3/00, A23J 3/34, A61K 35/60, опубл. 10.03.1996). Такой подход позволяет добиться большой чистоты выделяемой ДНК, но не обеспечивает ее расщепление на низкомолекулярные фрагменты, потенциально обладающие биологической активностью. Для получения низкомолекулярной ДНК необходимо проводить ее контролируемое фрагментирование, например, при помощи ультразвука (патент RU 2039564, МПК A61K 35/56, С07Н 21/04, опубл. 20.07.1995, патент ЕР 2289903, МПК С07Н 1/08, опубл. 02.03.2011).

Важным моментом при получении низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты является не только очистка полупродуктов от белковых примесей (патент RU 2268730, МПК A61K 31/70, A61K 35/60, С07Н 21/04, опубл. 27.01.2006), но и способы выделения конечного продукта. Обычно для этого используют сорбенты и иные белок-связывающие компоненты, фильтрацию и диафильтрацию на полых волокнах с последующим осаждением и переосаждением полученного продукта органическими растворителями (патент RU 2005724, МПК С07Н 21/04, опубл. 15.01.1994; патент RU 2034554, МПК A61K 35/60, опубл. 10.05.1995; патент RU 2055837, МПК С07Н 21/04, опубл. 10.03.1996; патент RU 2172632, МПК A61K 5/60, опубл. 27.08.2001; заявка JP 2005245394, МПК C12N 15/09, опубл. 15.09.2005).

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения порошка натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок рыб (патент RU 2041885, МПК С07Н 21/04, C12N 15/10, опубл. 20.08.1995), который включает гомогенизацию сырья, обработку реакционной массы детергентом и концентрированным раствором соли при повышенной температуре, охлаждение, отделение белка и детергента фильтрованием и осаждение ДНК спиртом, при этом после обработки реакционной массы детергентом и солевым раствором проводят первую обработку ультразвуком с использованием типового комплекта озвучивающего оборудования в условиях, обеспечивающих получение ДНК с молекулярной массой 600-1500 кДа, фильтрат после отделения белка и детергента концентрируют с помощью ультрафильтрационного модуля при давлении 0,1-0,8 атм, подвергают диафильтрации и второй обработке ультразвуком в условиях, обеспечивающих получение ДНК с молекулярной массой 250-600 кДа, а полученный осадок ДНК сушат до постоянной массы. Таким образом, получают порошок с содержанием ДНК 78-95%, гиперхромным эффектом 40-50% и молекулярной массой ДНК 250-600 кДа, с выходом 56-60% от количества ДНК, содержащегося в молоках, и концентрацией примесного белка 0,30-0,60%.

Недостатки данного способа заключаются в следующем:

- в низком выходе ДНК (не более 60% от содержания ДНК в молоках), обусловленном большими потерями ДНК в процессе выделения, главным образом при очистке от белковых примесей на сорбенте;

- в использовании больших объемов легковоспламеняющихся и токсичных растворителей и больших количеств солей, что затрудняет процесс масштабирования при производстве продукта и делает сам процесс небезопасным;

- в достижении нужной длины молекул ДНК только при условии двустадийной ультразвуковой обработки с большой длительностью воздействия ультразвуком;

- в заниженной биологической активности получаемой ДНК, поскольку молекулы ДНК с молекулярной массой выше 450 кДа обладают более низкой проникающей способностью через мембраны клетки и более высокой способностью подвергаться гидролизу крупнощепящими дезоксирибонуклеазами, чем молекулы ДНК меньших молекулярных масс (Шабаева Ю.Д., Филимонова М.Н. Сравнительный анализ субстратов в отношении активности эндонуклеазы бактерий Seratia marcescens.Учебные записки Казанского Государственного университета. Сер. Естественные науки. - 2005. - Т. 147. Кн. 2. - С. 206-212; Черепанова А.В., Тамкович С.Н., Власов В.В. и др. Активность дезоксирибонуклеаз крови в норме и при патологии. Биомед. химия. - 2007. - Т. 93, №5. - С. 488-496).

Раскрытие сущности изобретения

Сущность заявляемого способа получения низкомолекулярной ДНК из сырья животного происхождения заключается в том, что разрушение клеточных мембран осуществляют чередованием процессов заморозки и разморозки гомогената сырья в режиме, обеспечивающем максимально полное разрушение клеточных мембран с сохранением активности внутриклеточных ферментов; гомогенат подвергают автолизу до образования однородной вязкой массы серого цвета - в условиях активности комплекса эндогенных ферментов и длительности автолиза, достаточной для максимально полного разрушения макромолекул углеводов, жиров, липидов и белков до их моно- и олигомеров; протеолиз остаточных белков и их фрагментов осуществляют обработкой автолизата ферментным препаратом с высокоактивным комплексом нейтральных и щелочных экзопротеаз до растворения автолизата; после депротеинизации отделяют агрегаты ДНК, получаемые с помощью нейтрального инертного органического высокомолекулярного осадителя, после чего однократно фрагментируют ДНК путем ее обработки ультразвуком в режиме, позволяющем получать фрагменты ДНК длиной не более 700 пар нуклеотидных остатков (п.н.о.).

В качестве сырья для получения низкомолекулярной ДНК используют молоки рыб, а также могут быть использованы гонады кальмаров, тимус теленка, селезенка свиньи, сперма петуха, семенники рогатого скота.

Осуществляют несколько циклов заморозки и последующей разморозки гомогената сырья до максимально полного разрушения мембран клеток. В ходе многократного повторения заморозки и разморозки происходит разрушение стенок клеток гомогената сырья, а также иных мембран клеток, что подтверждается световой микроскопией, показывающей ничтожно малое содержание целых клеток в гомогенате (не более 10 целых на 1000 фрагментированных) (Данилин Н.Ф. Методические рекомендации по молекулярно-генетическим основам микробиологии. - Ленинград, 1982. - 416 с.).

Экспериментально установлено, что для разрушения мембран клеток используемого для выделения ДНК из сырья, достаточно 3-5 циклов заморозки до температуры от (-40) до (-50)°С и разморозки при температуре от 20 до 40°С. Критерием максимально полного разрушения клеточных мембран с сохранением активности внутриклеточных ферментов является полнота протекания последующей стадии автолиза. Полнота протекания процесса автолиза контролируется по уменьшению длины молекулы ДНК до 20000 п.н.о., определяемой методом электрофореза в агарозном геле после выделения ДНК фенольным методом (ссылки в примерах).

Индуцированный последовательными процессами заморозки и разморозки автолиз клеток продолжают путем инкубирования гомогената при температуре от 20 до 40°С в течение 8-24 часов. Автолиз может осуществляться без контроля рН.

Длительность автолиза определяется экспериментально. Гомогенат после автолиза должен стать полностью однородным, без видимого наличия посторонних включений, вязким за счет равномерного распределения внутриклеточной жидкости (цитозоля) по всему объему автолизата и частичного испарения воды. Он теряет красную, кремовую или белую окраску с красными включениями и приобретает серый цвет. Выделенная после автолиза ДНК имеет длину, не превышающую 20000 п.н.о.

Далее процессы ферментативного гидролиза остаточного белка в автолизате продолжают с помощью внеклеточных ферментов (экзоферментов) протеолитического действия. В качестве источника экзоферментов используют ферментный препарат с высокоактивным комплексом нейтральных и щелочных экзопротеаз и рабочим температурным режимом от 40 до 60°С, например, разрешенный для использования в пищевой промышленности ферментный препарат «Алкалаза 2,4 LFG».

Автолизат полностью растворяется при добавлении протеаз не более чем за 6 часов с образованием прозрачной темноокрашенной жидкости красноватых тонов.

Инактивируют экзоферменты термической денатурацией и удаляют образовавшиеся агрегаты денатурированных белков-экзоферментов. Перед фрагментацией ДНК ее осаждают с помощью нейтрального инертного органического высокомолекулярного осадителя, в качестве которого могут быть использованы полиэтиленгликоль с молекулярной массой от 1 до 15 кДа или полоксамеры с молекулярной массой от 0,9 до 12,5 кДа с различным соотношением полиэтиленоксидных и полипропиленоксидных звеньев.

При использовании полиэтиленгликоля для осаждения ДНК в очищенный от белковых примесей раствор ДНК добавляют хлорид натрия до концентрации, не превышающей 10 мас. %, после чего добавляют полиэтиленгликоль до концентрации не выше 30 мас. %; смесь выдерживают при температуре от 5 до 15°С в течение 8-24 часов и образовавшуюся взвесь, содержащую ДНК, отделяют центрифугированием.

Полученный осадок ДНК растворяют в воде до кинематической вязкости не выше 65 мм²/с. Полученный раствор подвергают воздействию ультразвука, при этом частота ультразвука для фрагментирования ДНК подобрана таким образом, чтобы за 9 минут воздействия вся ДНК, находящаяся в растворе в объеме ультразвуковой камеры, фрагментировалась до фрагментов, не превышающих 700 п.н.о.

Далее проводят концентрирование и очистку низкомолекулярной ДНК методом диафильтрации, выделяют целевой продукт с длиной цепи ДНК от 200 до 700 п.н.о.

Описание чертежей

На фиг. 1 показана схема получения низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты по заявляемому способу.

Осуществление изобретения

Сырье животного происхождения для получения ДНК, например молоки рыб, тщательно моют и очищают от пленок, жира и иных посторонних включений, после чего подготовленное сырье подвергают тщательному измельчению с гомогенизацией. Для разрушения клеточных мембран гомогенат фасуют в полиэтиленовые пакеты и несколько раз последовательно замораживают при температуре от (-40) до (-50)°С и размораживают при температуре от 20 до 40°С.

Автолиз гомогената молок рыб посредством действия комплекса собственных лизосомальных ферментов проводят инкубированием гомогената в воздушном термостате при температуре от 20 до 40°С в течение 8-24 часов.

В процессе автолиза часть белков гидролизуется до свободных аминокислот и пептидов под действием лизосомальных протеаз и пептидаз, а дезоксирибонуклеиновая кислота за счет вхождения в дезоксирибонуклеопротеидный комплекс с гистоновыми белками подвергается гидролизу в незначительной степени.

Стадия автолиза может проводиться без контроля рН, поскольку оптимальная рН поддерживается за счет буферных жидкостей цитозоля самих разрушенных клеток гомогената.

Затем осуществляют гидролиз полученной смеси протеолитическими экзоферментами. В качестве источника экзоферментов используют комплексный препарат протеолитического действия, например «Алкалаза 2,4 L FG» (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Дания), разрешенный для использования в пищевой промышленности.

К автолизату добавляют водный раствор гидрокарбоната натрия с концентрацией 0,5-2,0 мас. % в массовом соотношении автолизат:раствор гидрокарбоната натрия 1:(1,8-2,2), доводя рН до значений 6,0-9,0, после чего нагревают полученную смесь до температуры от 40 до 60°С, добавляют препарат «Алкалаза 2,4 L FG» в количестве от 0,5 до 4,0 мас. % от массы автолизата до добавления раствора гидрокарбоната натрия и выдерживают полученную смесь при температуре от 40 до 60°С в течение 1-6 часов при постоянном перемешивании до полного растворения гомогената с образованием прозрачной темноокрашенной жидкости красноватых тонов.

Затем реакционную смесь нагревают до температуры от 70 до 90°С и выдерживают в течение 1-2 часов для инактивации экзоферментов и их агрегации. Далее смесь охлаждают до температуры от 5 до 15°С и отделяют образовавшиеся агрегированные молекулы ферментов любым доступным способом, например фильтрацией или центрифугированием.

После удаления внесенных на стадии протеолиза белков-ферментов из полученного раствора осаждают ДНК, для чего в раствор добавляют хлорид натрия до концентрации, не превышающей 10 мас. %, что приводит к снижению подвижности молекул ДНК за счет увеличения ионной силы раствора. Далее в полученный раствор ДНК добавляют нейтральный инертный органический высокомолекулярный осадитель, например полиэтиленгликоль с молекулярной массой от 1 до 15 кДа в концентрации не выше 30 мас. %, и выдерживают при температуре от 5 до 15°С в течение 8-24 часов для формирования агрегатов, после чего образовавшуюся взвесь отделяют центрифугированием или фильтрацией. В результате получают осадок с содержанием ДНК не ниже 80 мас. % (в пересчете на сухой остаток). Содержание ДНК определяют спектрофотометрическим методом.

Далее проводят ультразвуковое фрагментирование полученной ДНК. Для этого готовят водный раствор ДНК с вязкостью от 40 до 65 мм²/с, который в проточном или в стационарном режиме однократно обрабатывают ультразвуком в условиях, обеспечивающих получение молекул ДНК размером от 200 до 700 п.н.о., например обрабатывают ультразвуком с частотой от 70 до 100 кГц в течение не более 9 минут. Длину молекул определяют методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле.

После этого полученный раствор низмолекулярной ДНК подвергают концентрированию и очистке методом диафильтрации через фильтры с размером пор 100 кДа, при этом получают продукт с содержанием низкомолекулярной ДНК не ниже 95%. Содержание ДНК в продукте определяют спектрофотометрическим методом. В целях дальнейшего хранения полученную низкомолекулярную ДНК подвергают лиофильному высушиванию и хранят при температуре не выше 30°С в плотно закрытой упаковке (предпочтительно при 10°С).

Полученный продукт пригоден для использования без дополнительной обработки как в качестве источника нуклеотидов с высокой биодоступностью для организма в лекарственных средствах и биологически активных добавках к пище, так и в качестве реагента, содержащего фрагменты ДНК определенной длины высокой степени чистоты для различных областей биохимии и биотехнологии. Низкое содержание белка в получаемом продукте (0,069-0,100%) делает также возможным его использование при разработке инъекционных препаратов.

Отличия заявляемого способа от прототипа, технические результаты предлагаемого способа заключаются в следующем:

- на начальном этапе очистки проводится разрушение клеток сырья животного происхождения, в частности молок, посредством чередования процессов заморозки и разморозки гомогената, что приводит к разрушению клеточных мембран и активации процессов лизиса макромолекул клетки лизосомальными ферментами и делает возможным проведение двустадийной ферментной очистки продукта,

- автолиз молок эндогенными, содержащимися в клетках молок лизосомальными ферментами приводит к тому, что возрастает чистота получаемого продукта за счет гидролиза внутриклеточных макромолекул (белков, липидов, жиров и углеводов) до моно- и олигомеров. Кроме того, происходит дополнительное уменьшение длины цепи молекулы ДНК, что облегчает дальнейший процесс ее фрагментирования;

- стадия автолиза может проводиться без контроля рН, поскольку оптимальная рН поддерживается за счет буферных жидкостей цитозоля самих разрушенных клеток гомогената;

- на стадии протеолиза может использоваться высокоактивный протеолитический комплекс "Алкалаза 2,4 LFG", разрешенный для использования в пищевой промышленности, что облегчает использование конечного продукта в медицинских целях. При этом достигается практически полный гидролиз белка до коротких пептидов и аминокислот, а белки самого ферментного комплекса денатурируют с образованием легко удаляемого осадка;

- использование в качестве осадителя полиэтиленгликоля позволяет не только достичь практически полной агрегации молекул ДНК (не ниже 90% от содержания ДНК в растворе), но и исключить использование в процессе выделения легковоспламеняющихся и токсичных жидкостей, что делает процесс производства более безопасным, увеличивает выход целевого продукта и уменьшает его себестоимость;

- содержание белковых примесей в конечном продукте снижается до 0,1 мас. % и менее (как показано в нижеприведенных примерах - до 0,069-0,100%) против 0,3-0,6% в прототипе, что делает возможным дальнейшую разработку инъекционных препаратов на его основе;

- получаемая по заявляемому способу ДНК имеет диапазон длин фрагментов от 200 до 700 п.н.о., что соответствует молекулярной массе от 130 до 455 кДа (в прототипе 250-600 кДа), и обладает более высокой способностью проникать через клеточные барьеры и в то же время в меньшей степени подвергаться гидролизу ферментами нуклеазного действия, что важно при применении в качестве медицинского средства (Николин В.П., Попова Н.А., Себелева Т.Е. и др. Влияние экзогенной ДНК на восстановление лейкопоэза и противоопухолевый эффект циклофосфана. Вопр. онкол. - 2006. - Т. 52., №3. - С. 336-340; Patil S.D., Rhodes D.G. and Burgess D.J. DNA-based therapeutics and DNA delivery systems: a comprehensive review. AAPS. J. - 2005. - V. 7, №1. - P. E61-E77);

- гиперхромный эффект получаемой низкомолекулярной ДНК - не ниже 42% (как показано в нижеприведенных примерах - от 42 до 48%);

- предлагаемый способ является более эффективным: выход готового продукта составляет в предлагаемом способе не менее 80% (как показано в нижеприведенных примерах - от 81,05 до 85,00%) от исходного содержания ДНК в сырье (в прототипе - 56-60%).

Ниже приведены примеры осуществления способа.

Пример 1. 10 кг молок рыб с содержанием ДНК 7% (определялось фенольным методом по руководству В.А. Беликова «Молекулярная биология. Практическое руководство». Саратов: Издательство «Саратовский источник» - 2013. - 84 с.) очищали от пленок, посторонних включений, жира, промывали и измельчали с гомогенизацией на гомогенизаторе шнеково-ножевого типа, фасовали в полиэтиленовые пакеты по 0,5 кг и замораживали в морозильной камере при температуре (-40)°С, затем размораживали в водяном термостате при 37°С в течение 1-2 часов. Операцию заморозки-разморозки повторяли трижды. После третьей разморозки гомогенат молок распределяли в поддоне на марлевой ткани плотным слоем высотой в 25 см и инкубировали в воздушном термостате при 20°С в течение 24 ч.

Протеолиз полученного автолизата проводили следующим образом: автолизат помещали в ферментер, добавляли водный раствор гидрокарбоната натрия с концентрацией соли 2,0 мас. % в массовом соотношении автолизат: раствор гидрокарбоната натрия 1:(1,8-2,2), смесь нагревали до 55°С при постоянном перемешивании и добавляли 200 г ферментного препарата "Алкалаза 2,4 LFG". Реакционную смесь выдерживали при температуре 60°С и постоянном перемешивании в течение 1 ч, далее ее нагревали до 90°С и снова выдерживали в течение часа при постоянном перемешивании. Полученный гидролизат представлял собой темноокрашенную прозрачную жидкость красноватых тонов. Его охлаждали до 15°С, после чего подвергали центрифугированию при 6000 об/мин в течение 15 мин для отделения образовавшихся белковых агрегатов.

Масса полученного супернатанта составила 28 кг. К полученному супернатанту добавляли 2,8 кг хлорида натрия (10 мас. % к массе супернатанта) и 6,75 кг полиэтиленгликоля ПЭГ-6000 ("Завод Синтанолов", Нижний Новгород, Россия) (24 мас. % к массе супернатанта) и перемешивали в течение 30 мин, после чего смесь разливали в полиэтиленовые емкости объемом 6 л и выдерживали при температуре от 5 до 15°С в течение 8 ч.

Образовавшийся осадок ДНК отделяли центрифугированием при 6000 об/мин в течение 15 мин, ДНК растворяли в очищенной воде с контролем вязкости до кинематической вязкости 65 мм²/с и с помощью перистальтического насоса подавали в ультразвуковую камеру проточной ультразвуковой установки «Волна-М». Фрагментирование ДНК проводилось в течение 7 мин при частоте ультразвука 100 кГц. Для итоговой очистки и концентрации полученный раствор ДНК подвергали процессу диафильтрации: раствор с помощью центробежного насоса пропускали через ультрафильтрационную установку УПВ-6 с размером пор картриджа 100 кДа, при этом концентрировали раствор в 10 раз, далее концентрат разбавляли очищенной водой в 10 раз и вновь концентрировали в 10 раз. Процедуру разбавления и концентрирования раствора повторяли дважды. Полученный концентрированный раствор, содержащий конечный продукт, подвергали лиофильной сушке.

Выход ДНК рассчитывали по поглощению при 260 нм, используя коэффициент пересчета 1 о.е.=40 мкг. Содержание ДНК в конечном продукте определяли спектрофотометрически, анализируя соотношение поглощения растворов на длинах волн 260 и 280 нм (Маниатис Т. Молекулярное клонирование. - М.: "Мир", 1984. - 480 с.). Содержание белка определяли по стандартному методу Бредфорда, используя в качестве стандарта раствор человеческого сывороточного альбумина (Bradford М.М. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem., 1976, V. 72, p. 248-254). Молекулярную массу ДНК определяли электрофорезом в 12% полиакриламидном геле (Maniatis Т., Jeffrey A. and deSande H.V. Chain length determination of small double-andsingle-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry. 1975, V. 14, P. 3787-3794). Гиперхромный эффект ДНК определяли, сравнивая оптическую плотность при 260 нм раствора ДНК до и после гидролиза 5% хлорной кислотой при 100°С в течение 20 мин (Лазуркин Ю.С. Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - М.: Наука, 1967. - 342 с.). Обработку результатов анализа продукта проводили путем получения среднего арифметического результата из пяти параллельных определений.

Выход ДНК составил 82,0% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 95,12%, содержание белка - 0,100%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 47%, что соответствует заявленному результату.

Пример 2. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, при этом автолиз подвергнутого замораживаниям и размораживаниям гомогената молок проводили при 40°С в течение 8 ч. Выход ДНК составил 81,05% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 95,17%, содержание белка - 0,050%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 42%, что соответствует заявленному результату.

Пример 3. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, при этом протеолиз автолизата проводили при 40°С в течение 6 ч.

Выход ДНК составил 83,0% от количества исходной. ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 97,30%, содержание белка - 0,076%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 47%, что соответствует заявленному результату.

Пример 4. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, при этом осаждение ДНК осуществляли путем добавления к супернатанту 9 кг (30 мас. %) ПЭГ-1000 ("Завод Синтанолов", Нижний Новгород, Россия).

Выход ДНК составил 82,5% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 95,10%, содержание белка - 0,091%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 44%, что соответствует заявленному результату.

Пример 5. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, при этом осаждение высокомолекулярной ДНК из супернатанта проводили путем добавления к супернатанту 8,85 кг (29,5% к массе супернатанта) ПЭГ-1500 ("Завод Синтанолов", Нижний Новгород, Россия).

Выход ДНК составил 84,0% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 95,13%, содержание белка - 0,094%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 48%, что соответствует заявленному результату.

Пример 6. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, за исключением того, что осаждение ДНК осуществляли путем добавления в супернатанту 4,5 кг (15 мас %) ПЭГ-15000 ("Завод Синтанолов", Нижний Новгород, Россия).

Выход ДНК составил 83,0% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 95,07%, содержание белка - 0,085%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 47%, что соответствует заявленному результату.

Пример 7. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, за исключением того, что для получения осадка высокомолекулярной ДНК смесь, содержащую высокомолекулярную ДНК, гидрокарбонат натрия, хлористый натрий и ПЭГ-6000, выдерживали при температуре 5°С в течение 24 часов.

Выход ДНК составил 84,5% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 96,30%, содержание белка - 0,090%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 44%, что соответствует заявленному результату.

Пример 8. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, за исключением того, что осадок высокомолекулярной ДНК растворяли в очищенной воде до кинематической вязкости 40 мм²/с, а фрагментирование молекул ДНК проводили в течение 7 мин при частоте ультразвука 70 кГц.

Выход ДНК составил 82,0% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 97,00%, содержание белка - 0,069%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 46%, что соответствует заявленному результату.

Пример 9. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, за исключением того, что осадок высокомолекулярной ДНК растворяли в очищенной воде до кинематической вязкости 65 мм²/с, а фрагментирование молекул ДНК проводили в течение 9 мин при частоте ультразвука 100 кГц.

Выход ДНК составил 85,0% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 95,11%, содержание белка - 0,082%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 44%, что соответствует заявленному результату.

Пример 10. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, при этом осаждение ДНК осуществляли путем добавления к супернатанту 8,4 кг (28 мас. %) блок-сополимера Pluronic РЕ 3100 с молекулярной массой полипропиленового блока 950 г/моль и с содержанием полиэтиленгликолевого блока 50 мас. % (производства ООО "БАСФ" (Россия, Москва)).

Выход ДНК составил 83,5% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 95,70%, содержание белка - 0,084%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 47%, что соответствует заявленному результату.

Пример 11. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, при этом осаждение ДНК осуществляли путем добавления к супернатанту 5,85 кг (19,5 мас. %) блок-сополимера Pluronic РЕ 10500 с молекулярной массой полипропиленового блока 3 250 г/моль и с содержанием полиэтиленгликолевого блока 50 мас. % (производства ООО "БАСФ" (Россия, Москва)).

Выход ДНК составил 81,2% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 96,40%, содержание белка - 0,061%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 45%, что соответствует заявленному результату.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения низкомолекулярной ДНК из сырья животного происхождения. Осуществляют разрушение клеточных мембран и белков чередованием процессов заморозки и разморозки гомогената в режиме, обеспечивающем максимально полное разрушение клеточных мембран с сохранением активности внутриклеточных ферментов. Заморозку осуществляют при температуре от -40 до -50°С, а последующую разморозку при температуре от 20 до 40°С. Циклы заморозки и разморозки повторяют 3-5 раз. Гомогенат подвергают автолизу при температуре от 20 до 40°С в течение 8-24 часов до образования однородной вязкой массы серого цвета. Осуществляют протеолиз остаточных белков и их фрагментов обработкой автолизата до его растворения комплексом нейтральных и щелочных экзопротеаз с рабочим температурным режимом от 40 до 60°С. После депротеинизации отделяют агрегаты ДНК с помощью нейтрального инертного органического высокомолекулярного осадителя, такого как полиэтиленгликоль с молекулярной массой от 1 до 15 кДа или полоксамер с молекулярной массой от 0,9 до 12,5 кДа в концентрации не выше 30 мас.%, в присутствии хлорида натрия до концентрации, не превышающей 10 мас.%. Однократно фрагментируют ДНК путем ее обработки ультразвуком с частотой от 70 до 100 кГц в течение не более 9 мин, позволяющем получить фрагменты ДНК длиной не более 700 п.н.о. Способ обеспечивает выход ДНК из сырья более 80% от исходного, получение фрагментов ДНК длиной 200-700 п.н.о., уменьшение количества примесей в целевом продукте до 0,1% и менее. 8 з.п. ф-лы, 1 ил., 11 пр.

1. Способ получения низкомолекулярной ДНК из сырья животного происхождения, включающий разрушение клеточных мембран и белков, осаждение ДНК, фрагментацию ДНК ультразвуком, отличающийся тем, что разрушение клеточных мембран осуществляют чередованием процессов заморозки и разморозки гомогената в режиме, обеспечивающем максимально полное разрушение клеточных мембран с сохранением активности внутриклеточных ферментов; гомогенат подвергают автолизу до образования однородной вязкой массы серого цвета; протеолиз остаточных белков и их фрагментов осуществляют обработкой автолизата до его растворения ферментным препаратом, представляющим собой комплекс нейтральных и щелочных экзопротеаз с рабочим температурным режимом от 40 до 60°С; после депротеинизации отделяют агрегаты ДНК, получаемые с помощью нейтрального инертного органического высокомолекулярного осадителя, такого как полиэтиленгликоль с молекулярной массой от 1 до 15 кДа или полоксамер с молекулярной массой от 0,9 до 12,5 кДа; после чего однократно фрагментируют ДНК путем ее обработки ультразвуком в режиме, позволяющем получить фрагменты ДНК длиной не более 700 п.н.о.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве сырья для получения низкомолекулярной ДНК используют молоки рыб, гонады кальмаров, тимус теленка, селезенку свиньи, сперму петуха, семенники рогатого скота.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что заморозку гомогената осуществляют при температуре от –40 до –50°С, а последующую разморозку - при температуре от 20 до 40°С.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что циклы заморозки и разморозки гомогената повторяют 3-5 раз.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для проведения процесса автолиза гомогенат инкубируют при температуре от 20 до 40°С в течение 8-24 часов.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для ферментативного гидролиза автолизата его обрабатывают разрешенной для использования в пищевой промышленности «Алкалазой 2,4 L FG».

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что гидролиз автолизата «Алкалазой 2,4 L FG» осуществляют в солевом буферном растворе при рН 6,0-9,0 и температуре от 40 до 60°С в течение 1-6 часов.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, для осаждения ДНК в очищенный от белковых примесей раствор ДНК добавляют хлорид натрия до концентрации, не превышающей 10 мас.%, после чего добавляют полиэтиленгликоль до концентрации не выше 30 мас.%, смесь выдерживают при температуре от 5 до 15°С в течение 8-24 часов и образовавшуюся взвесь, содержащую высокомолекулярную ДНК, отделяют центрифугированием.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фрагментируют ДНК ультразвуком с частотой от 70 до 100 кГц в течение не более 9 минут.