Способ и набор праймеров для видоспецифической идентификации возбудителей бактериальной пневмонии человека Российский патент 2022 года по МПК C12N15/86 C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к молекулярной биологии, микробиологии и медицине и обеспечивает видоспецифическую идентификацию шести основных возбудителей бактериальной пневмонии человека.

Уровень техники

Инфекционная пневмония представляет собой спектр различающихся по этиологии и патогенезу заболеваний, поражающих органы дыхательной системы (Nair GB, Niederman MS. Community-acquired pneumonia: an unfinished battle. Med Clin North Am. 2011 Nov; 95(6):1143-61). Острый воспалительный процесс легочной ткани может быть вызван широким рядом возбудителей бактериальной, вирусной и грибковой природы. Вспышки инфекционных пневмоний, вызванных коронавирусами SARS-CoV (2002-2003 г), MERS-CoV (2012-2013 г), SARS-CoV-2 (2019-?), вирусами гриппа А и В, а также бактериальных пневмоний, становятся реальной социальной угрозой. Бактериальные пневмонии характеризуются летальностью около 15%, при этом летальность в случаях тяжелого течения внебольничной пневмонии (ТВП) может достигать 21-58% (Sligl W.I., Marrie T.J.//Crit. Care. Clin. 2013. V. 29. P. 563-601. doi: 10.1016/j.ccc.2013.03.009), что сравнимо с таковыми показателями SARS (т.н. атипичная пневмония, ТОРС), MERS (Song Z., Хи Y, Bao L., Zhang L., Yu P., Qu Y., Zhu H., Zhao W., Han Y., Qin C. // Viruses. 2019. V. 11. E59. doi: 10.3390/v11010059) и превышает этот показатель для CoViD-19 и гриппа.

Несмотря на весомые достижения в противомикробной терапии, а также в совершенствовании диагностических тестов и профилактических мер в борьбе с ее распространением, пневмония продолжает оставаться серьезной проблемой мирового здравоохранения, являясь одной из главных инфекционных болезней с высоким процентом летальных исходов (Рачина, С.А. Особенности микробиологической диагностики при внебольничной пневмонии у взрослых / С.А. Рачина, Н.В. Иванчик, Р.С. Козлов // Практическая пульмонология. - 2016. - №. 4,; GBD 2013 Mortality and Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex specific all-cause and cause-specific mortality for 240 causes of death. 1990-2013: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet 2015, 385, 117-171).

Специализированные лечебные учреждения, в которые поступают пациенты с клиническим диагнозом "пневмония", сталкиваются с проблемой установления этиологии заболевания и быстрой идентификации возбудителя, поскольку часто вирусные и бактериальные пневмонии характеризуются сходной клинической картиной. Ситуация резко обострилась с возникновением пандемии CoViD-19, для которого необходима своевременная дифференциальная диагностика вторичной бактериальной инфекции, часто возникающей как одно из осложнений при течении болезни.

Точное и своевременное определение возбудителя, вызвавшего поражения, имеет важное значение в разработке успешных схем лечения (Harris М, Clark J, Coote N, Fletcher P, Harnden A, McKean M, Thomson A; British Thoracic Society Standards of Care Committee. British Thoracic Society guidelines for the management of community acquired pneumonia in children: update 2011. Thorax. 2011; Suppl 2:ii1-23), а также контроля зараженных, что является актуальной проблемой в условиях пандемии COVID-19, когда помимо вирусного заболевания поступающие в медицинские учреждения пациенты сталкиваются со вторичными внутрибольничными инфекциями (Бруснигина, Н.Ф. и др. Этиологическая структура внебольничной пневмонии // Медицинский альманах. - 2009. - №. 2).

Возбудителями пневмонии могут выступать представители различных групп патогенных микроорганизмов, однако зачастую этиологический агент остается неизвестным, что может быть объяснено сложностью в определении природы патогенов или недостаточной точностью и чувствительностью существующих методов их идентификации. Отдельную важность представляет собой выявление возбудителя на ранних стадиях болезни, что позволяет избежать применения эмпирической антимикробной терапии, за счет чего возможно предотвращение чрезмерного использование антибиотиков и, как следствие, появления резистентности к действующим препаратам на их основе.

В связи с этим совершенствование, а также упрощение и снижение стоимости уже существующих методов определения возбудителей пневмонии на начальных стадиях заболевания представляет собой актуальную практическую задачу.

Из бактериальных возбудителей инфекционной пневмонии одними из наиболее важных являются следующие: Staphilococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza. Legionella pneumophila. Klebsiella pneumoniae. Pseudomonas aeruginosa (Ustianowski, A. (2012). Diagnostics for community-acquired and atypical pneumonia. Current Opinion in Pulmonary Medicine, 18(3), 259-263. doi:10.1097/mcp.0b013e328351f94).

Для видоспецифичной идентификации возбудителей бактериальной пневмонии предложены методы, описанные ниже.

В настоящее время до сих пор широко используется постановка диагноза по клиническим проявлениям заболевания, к которым относятся: лихорадка, кашель, одышка, хрипы, боль в груди или животе, вялость, рвота и головная боль (Rodrigues CMC, Groves Н. Community-Acquired Pneumonia in Children: the Challenges of Microbiological Diagnosis. J Clin Microbiol. 2018 Feb 22;56(3):e01318-17. doi: 10.1128/JCM.01318-17). Однако, очень серьезным недостатком такого подхода является схожесть признаков патологического процесса с другими заболеваниями: сепсис, глубокая анемия, малярия, острая астма и др.

Из лабораторных методов выявления бактериальной патологии наиболее распространенными в настоящее время являются следующие.

1. Прямая визуализация является распространенным методом определения бактериальной патологии. Однако, в случае обнаружения респираторных патогенных агентов не было достигнуто значительных успехов в прямой визуализации. Единственным возможным применением этого метода на сегодняшний день остается способность лаборатории предоставить предварительные данные по бактериальной нагрузке (Rodrigues CMC, Groves Н. Community-Acquired Pneumonia in Children: the Challenges of Microbiological Diagnosis. J Clin Microbiol. 2018 Feb 22;56(3):e01318-17. doi: 10.1128/JCM.01318-17).

2. Культуральный метод используется в основном для определения антибиотикорезистентности, в т.ч. минимальной ингибирующей концентрации антибиотиков в пневмококке (Grohs Р, Janoir С, Grondin S, et al. Accuracy of MIC determination for Streptococcus pneumoniae using the Sirscan2000automatic MIC determination system. Diagn Microbiol Infect Dis 2011; 70:399-403.). Обычное культивирование для атипичных патогенов остается проблематичным и, как правило, имеет ограниченную клиническую значимость (She RC, Thurber A, Hymas WC, et al. Limited utility of culture for Mycoplasma pneumoniae and Chlamydophila pneumoniae for diagnosis of respiratory tract infections. J Clin Microbiol 2010; 48:3380-3382). Метод остается медленным и трудоемким, часто обладает низкой чувствительностью, характеризуется низкой дискриминирующей способностью (при этиологической диагностике), особенно под влиянием предшествующей антибиотикотерапии.

3. Обнаружение антигенов возбудителя. Диагностика определения антигенов по-прежнему в значительной степени основана на обнаружении антигенов пневмококка и легионеллы в моче, хотя также были установлены тесты на предмет оказания медицинской помощи при гриппе (Ginocchio СС, Zhang F, Manji R, et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. J Clin Virol 2009; 45:191-195). Установленные в настоящее время анализы имеют проблемы с чувствительностью: около 82% для диагностики пневмококкового (Streptococcus pneumoniae) антигена мочи у пациентов с бактериемией (со специфичностью 97%), но более низкая чувствительность для пациентов, не страдающих бактериемией (Dominguez J, Blanco S, Rodrigo С, et al. Usefulness of urinary antigen detection by an immunochromatographic test for diagnosis of pneumococcal pneumonia in children. J Clin Microbiol 2003; 41:2161-2163; Smith MD, Derrington P, Evans R, et al. Rapid diagnosis of bacteremic pneumococcal infections in adults by using the Binax NOW Streptococcus pneumoniae urinary antigen test: a prospective, controlled clinical evaluation. J Clin Microbiol 2003; 41:2810-2813.), и наиболее часто доступные анализы на антиген легионеллы в моче имеют чувствительность около 80% (на которые приходится около 85% инфекций в Соединенных Штатах и Европе). Существуют проблемы с ложноположительными анализами антигена стрептококка в моче из-за колонизации носа, давно известной у детей, но все чаще признаваемой и у взрослых, и в течение 48 часов после пневмококковой (Streptococcus pneumoniae) вакцинации (Binax. Streptococcus pneumoniae urinary antigen test package insert. http://www.binax.com. [Accessed November 2011]). Существует также весьма существенный недостаток, заключающийся в невозможности определить чувствительность к противомикробным препаратам, и, как следствие, могут возникнуть проблемы с длительным «позитивным» периодом, что может привести к получению ложноположительных результатов через несколько недель после заражения.

На сегодняшний день нет значительного или полезного с клинической точки зрения развития такой диагностики для других респираторных патогенов (Ustianowski, А. (2012). Diagnostics for community-acquired and atypical pneumonia. Current Opinion in Pulmonary Medicine, 18(3), 259-263. doi:10.1097/mcp.0b013e328351f94).

4. Серология. Серологические анализы имеют ряд недостатков - особенно чувствительность, специфичность и задержки с определяемым серологическим ответом, - которые, как правило, препятствуют их полезности при непосредственном ведении пациентов (в отличие от эпидемиологических и других исследований). Предпринимаются усилия по улучшению серологии легионеллы, чтобы помочь в более быстрой диагностике, однако они по-прежнему позволяют диагностировать менее 50% пациентов в первые 2 недели болезни (Elverdal PL, Svarrer CW, Jorgensen CS, et al. Development and validation of ELISA for detection of antibodies to Legionella pneumophila serogroup 1, 3 and 6 in human sera. J Microbiol Methods 2011; 86:298-303).

5. Обнаружение нуклеиновых кислот. Наиболее значительные достижения в последние годы были связаны с точным и своевременным обнаружением нуклеиновых кислот патогенов (Johansson N, Kalin М, Tiveljung-Lindell A, et al. Etiology of community acquired pneumonia: increased microbiological yield with new diagnostic methods. Clin Infect Dis 2010, 50:202-209; Kerdsin A, Uchida R, Verathamjamrus C, et al. Development of triplex SYBR green real-time PCR for detecting Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, and Legionella spp. without extraction of DNA. Jpn J Infect Dis 2010; 63:173-180; Lieberman D, Shimoni A, Shemer-Avni Y, et al. Respiratory viruses in adults with community-acquired pneumonia. Chest 2010; 138:811-816; Nolte FS. Molecular diagnostics for detection of bacterial and viral pathogens in community-acquired pneumonia. Clin Infect Dis 2008; 47 (Suppl 3):S123-S126; Pabbaraju K, Tokaryk KL, Wong S, Fox JD. Comparison of the Luminex xTAG respiratory viral panel with in-house nucleic acid amplification tests for diagnosis of respiratory virus infections. J Clin Microbiol 2008; 46:3056-3062; Smith MD, Sheppard CL, Hogan A, et al. Diagnosis of Streptococcus pneumoniae infections in adults with bacteremia and community-acquired pneumonia: clinical comparison of pneumococcal PCR and urinary antigen detection. J Clin Microbiol 2009; 47:1046-1049.). Многие предыдущие анализы имели проблемы со стандартизацией и контролем качества (Dowell SF, Peeling RW, Boman J, et al. Standardizing Chlamydia pneumoniae assays: recommendations from the Centers for Disease Control and Prevention (USA) and the Laboratory Centre for Disease Control (Canada). Clin Infect Dis 2001; 33:492-503.), а новые анализы по-прежнему требуют строгой проспективной оценки. Результаты гораздо менее подвержены влиянию предшествующей антибактериальной терапии, чем более традиционные бактериологические методы. В последнее время наблюдается интерес к обнаружению 16s рДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) либо для выявления специфических патогенов, либо для широкой диагностики множества потенциальных патогенов. Примеры на выявление патогенов включают 16 анализов рДНК на микоплазму, которые, к сожалению, показали длительную положительную реакцию после заражения (средняя продолжительность 5 недель), что может ограничить клиническую полезность для отдельных пациентов (Han X, Li S, Lu S, et al. Amplification of 16S rDNA by nested PCR for measurement of Mycoplasma pneumoniae DNA over time: clinical application. J Med Microbiol 2011. doi:10.1099/jmm.0.030098-0. [Epub ahead of print]). Примеры анализов 16s рДНК, предназначенных для выявления множества патогенов, включают широкий спектр ПЦР для множественных бактерий в плевральной жидкости, однако это не позволило значительно улучшить специфическую диагностику у детей (Gollomp K, Rankin SC, White С, et al. Broad-range bacterial polymerase chain reaction in the microbiologic diagnosis of complicated pneumonia. J Hosp Med 2012; 7:8-13). Другие мультиплексные ПЦР-анализы, которые обладают потенциальными преимуществами (Abdeldaim GM, Stralin К, Korsgaard J, et al. Multiplex quantitative PCR for detection of lower respiratory tract infection and meningitis caused by Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae and Neisseria meningitidis. BMC Microbiol 2010; 10:310; Thurman KA, Warner AK, Cowart КС, et al. Detection of Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, and Legionella spp in clinical specimens using a single-tube multiplex real-time PCR assay. Diagn Microbiol Infect Dis 2011; 70:1-9), имеют проблемы с чувствительностью и перекрестной контаминацией (Prere MF, Fayet OA. A specific polymerase chain reaction test for the identification of Streptococcus pneumoniae. Diagn Microbiol Infect Dis 2011; 70:45-53; Josefson P, Stralin K, Ohlin A, et al. Evaluation of a commercial multiplex PCR test (SeptiFast) in the etiological diagnosis of community-onset bloodstream infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2011; 30:1127-1134). Перекрестная контаминация является серьезной проблемой всех тест-систем, основанных на ПЦР-анализе 16s рДНК, т.к. прослеживается высокий уровень гомологии между различными бактериальными таксонами, в т.ч. в норме населяющими слизистые и кожные покровы человека.

Заявляемое изобретение отличается от вышеописанных аналогов тем, что в нем не используется анализ 16s рибосомальной РНК, а затрагиваются только исключительно видоспецифичные гены, что резко увеличивает специфичность анализа. В отличие от аналогов, в заявляемом изобретении применен метод мультиплексной ПЦР, который позволяет выявлять в одном анализе ДНК шести наиболее значимых возбудителей бактериальной пневмонии. Отечественных и зарубежных аналогов не описано.

Наиболее перспективными областями применения изобретения является использование тест-системы в клинических лабораториях, специализирующихся на проведении рутинных анализах образцов пациентов с предварительным диагнозом пневмония. Разработанный метод требует стандартной квалификации лаборанта, работающего с постановкой ПНР.

Раскрытие сущности изобретения

Целью изобретения является создание способа мультиплексной ПЦР для быстрого выявления шести основных возбудителей бактериальной пневмонии. Способ использует оригинальные видоспецифичные праймеры для шести социально значимых возбудителей пневмонии человека.

Для каждого праймера проводили процедуру BLAST-анализа, определяли его физико-химические характеристики, включая тестирование на наличие как внутри - так и межмолекулярных вторичных структур. Проводили оптимизацию температурно-временного профиля ПЦР с применением градиентной ПЦР, а также состава компонентов буфера и концентрации каждого из праймеров в смеси. Экспериментально определяли специфичность праймеров к целевым и нецелевым мишеням (используя тотальную геномную ДНК каждого из тестируемых бактериальных штаммов), как в режиме применения индивидуальных ДНК-матриц, так и в режиме смесей ДНК нескольких возбудителей в одной пробирке. Установили, что праймеры обладают высокой специфичностью в смеси, содержащей ДНК различных микроорганизмов и способны выявлять исключительно свои специфичные мишени, не давая ложноположительный результат при наличии в смеси неспецифичной ДНК.

Чувствительность способа, определенная раститровкой ДНК каждого из анализируемых возбудителей, составляет от 102 до 103 копий геномной ДНК на реакционную пробирку, в том числе при одновременном введении в смесь нескольких матриц.

Данные, полученные с помощью способа, могут быть использованы при выборе лекарственного препарата, режима лечения и эпидемиологического контроля.

Способ выгодно отличается от известных из уровня техники методов возможностью идентификации непосредственно в клиническом материале после деконтаминации, а также низкой себестоимостью, малым временем, необходимым для получения результата. Способ не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала. Данные, полученные с помощью способа, могут быть использованы при выборе лекарственного препарата, режима лечения и эпидемиологического контроля.

Данное изобретение обеспечивает способ идентификации шести социально значимых возбудителей пневмонии человека: Staphilococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa.

Способ основан на проведении полимеразной цепной реакции с оригинальным набором специфических олигонуклеотидных праймеров и последующем разделении продуктов реакции путем электрофореза в агарозном геле, анализе электрофоретической картины разделения продуктов амплификации и интерпретации результатов.

Данное изобретение обеспечивает также оригинальный набор специфичных праймеров для осуществления экспресс-способа идентификации генов шести социально значимых бактериальных возбудителей пневмонии человека. Праймеры, сконструированные и применяемые в способе, отличаются от известных из уровня техники тем, что имеют оригинальные олигонуклеотидные последовательности и позволяют специфическим образом идентифицировать гены шести наиболее значимых бактериальных возбудителей пневмонии человека.

Краткое описание фигур и таблиц

Фигура. 1. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР для идентификации бактериальных возбудителей пневмонии человека. L-молекулярный маркер длин продуктов ДНК GeneRuler 50bp (Thermo, США), 1 - Streptococcus pneumoniae, 2 - Staphylococcus aureus, 3 - Legionella pneumophila, 4 - Staphylococcus aureus + Legionella pneumophila, 5 - Haemophilus influenzae, 6 - Pseudomonas aeruginosa, 7 - Haemophilus influenzae+Pseudomonas aeruginosa, 8 - Klebsiella pneumoniae. Видно, что все шесть определяемых патогенов характеризуются разной длиной ПЦР-продуктов для удобства их идентификации. Показана возможность определения нескольких патогенов в одном клиническом образце (не более двух из соображений реально возможных, встречающихся в клинической практике, ситуаций).

Таблица 1. Длины ПЦР-продуктов

Осуществление изобретения

Изобретение предлагает использование способа мультиплексной ПЦР для быстрого выявления шести основных возбудителей бактериальной пневмонии. При конструировании праймеров руководствовались требованием видовой специфичности и внутривидовой консервативности выбранных участков генетических мишеней, необходимым для надежной дифференциальной диагностики, учитывали необходимость получения различных длин ПЦР-продуктов для удобства идентификации возбудителя при электрофоретическом разделении.

В случае каждого из анализируемых патогенов были сконструированы видоспецифичные праймеры, мишенями для которых являлись гены, характерные именно для данного возбудителя, часто - несущие дополнительную функциональную клинически значимую нагрузку, связанную с факторами патогенности:

- Staphylococcus aureus - ген связывания эластина ebpS (elastin-binding protein S);

- Streptococcus pneumoniae - стрептококковый ген cpsB (tyrosine-protein phosphatase B);

- Haemophilus influenza - кодирующий энзим ген fucK (fuculokinase gene);

- Legionella pneumophila - ген sidA, отвечающий за синтез белка, участвующего в системе секреции типа IV;

- Pseudomonas aeruginosa - ген белка внешней мембраны oprL;

- Klebsiella pneumoniae - ген-регулятор синтеза экстракапсулярного полисахарида гтрА (regulator of the mucoid phenorype).

В заявленном способе предложено использование полимеразной цепной реакции для амплификации последовательностей фрагментов генов, указанных выше, различающихся по длине для удобства последующего определения электрофоретическим методом. При этом в качестве исходного образца может быть использован клинический материал, лизат клеточной культуры, различные физиологические жидкости (мокрота при откашливании, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), аспираты из трахеи), соскобы из гортани и носоглотки. Заявленный способ предусматривает использование оригинального набора специфических олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO: 1-12, представленных в Перечне последовательностей.

Обработка образца перед проведением анализа осуществляется любым из имеющихся методов выделения ДНК из биологических образцов, например - фенол-хлороформным методом (Molecular Cloning. Volume 3. 3rd edition, by Joseph Sambrook and David W. Russell. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2001) или методом с использованием силикатных сорбентов (Cady N.C., Stelick S., Batt С.A. Nucleic acid purification using microfabricated silicon structures. Biosens Bioelectron. 2003 Oct 30;19(l):59-66), но не ограничивается ими.

Подбор олигонуклеотидных праймеров выполняется на основе систематизации последовательностей, кодирующих видоспецифичные гены возбудителей. Конструирование высокоспецифичных праймеров осуществляется на основе анализа литературных источников и последовательностей генов в базах данных (GenBank, Silva). Далее проводится множественное выравнивание (Multiplex Alignment) последовательностей генов-мишеней. Каждому выравниванию присваивается консенсусная последовательность. Выравнивания проводятся с помощью специализированного программного обеспечения, например BioEdit Sequence Alignment Editor (версия 7.1.9) по алгоритму ClustalW, консенсусная последовательность присваивалась со значением параметра «threshold frequency» равным 100%. Далее, используя соответствующее программное обеспечение, например Oligo v.6.3 (Molecular Biology Insights Inc., США) или Fast PCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/ Programs/fastpcr.htm), проводится расчет температуры отжига праймеров и, варьируя их длину, добиваются того, чтобы разброс температур отжига праймеров внутри набора не превышал 3-4°С. При подборе праймеров избегают таких последовательностей, которые способны формировать вторичные структуры типа шпильки с высокими температурами плавления. Специфичность подобранных праймеров проверятся путем поиска по базам данных нуклеотидных последовательностей (GenBank, Silva) с использованием программного обеспечения, поддерживающего алгоритм BLAST (например, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)

Продукты амплификации, полученные с помощью полимеразной цепной реакции с использованием данного набора праймеров, подвергаются разделению путем проведения электрофореза в агарозном геле. Далее, проводится анализ полученных изображений электрофореграмм. По расположению специфических полос для продуктов амплификации проводится интерпретация электрофореграммы и делается вывод о наличии у анализируемых образцов идентифицируемых генов, соответствующих конкретным возбудителям.

Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.

Пример 1. Набор специфических олигонуклеотидных праймеров, используемых в способе обнаружения видоспецифичных генов шести бактериальных возбудителей пневмонии человека.

Праймеры SEQ ID NO: 1-12 (Перечень последовательностей) для проведения полимеразной цепной реакции синтезируют на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA synthesizer (Applied Biosystems, США.

Пример 2. Выделение ДНК из клинических образцов.

1. В пробирки добавляют 20 мкл универсального сорбента (набор "ДНК-сорб-АМ", ЦНИИ Эпидемиологии Федеральной службы Роспотребнадзора, Россия), после чего вносят по 300 мкл лизирующего раствора.

2. В пробирки с добавленным сорбентом и лизирующим раствором вносят по 100 мкл клинического образца.

3. Содержимое пробирок тщательно перемешивают на вортексе и инкубируют в течении 5 мин при температуре 65°С в термостате. После окончания инкубации пробирки повторно перемешивают на вортексе и оставляют при комнатной температуре на 2 мин.

4. Осаждают сорбент в пробирках с помощью центрифугирования при 10000 об/мин в течение 30 секунд. Не захватывая сорбент, удаляют надосадочную жидкость.

5. К осадку добавляют по 1 мл отмывочного раствора и перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования сорбента.

6. Повторяют пункт 5.

7. Помещаютс пробирки с открытой крышкой в термостат с температурой 65°С на 5-10 мин для подсущивания сорбента.

8. В пробирки добавляют по 100 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА), рН 8,0 для элюции ДНК. Перемешивают пробирки на вортексе до полного ресуспендирования сорбента.

9. Центрифугируют пробирки при 12000 об/мин в течении 1 мин. Надосадочную жидкость использовуют для проведения ПЦР.

Пример 3. Проведение полимеразной цепной реакции для амплификации фрагментов вилоспенифичных генов шести возбудителей бактериальной пневмонии человека.

К 29 мкл ПЦР-смеси вносят 1 мкл образца, полученного в Примере 2.

Состав ПЦР-смеси:

1. ПЦР-буфер: 10 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (рН 8,3) (Силекс, Россия);

2. 2.0 мМ MgCl₂

3. 200 мкМ dATP, dCTP, dGTP, dUTP каждого (Силекс, Россия)

4. Смесь праймеров (последовательности представлены в Таблице 1.) в концентрации 80 нМ каждого

5. 5 ед. термостабильной Taq ДНК-полимеразы (Силекс, Россия)

Амплификацию проводят на термоциклере «Dyad» (MJ Research, США) со следующим режимом: 95°С - 30 с, 65°С - 30 с, 72°С - 30 с; 35 циклов (в первом цикле время денатурации увеличивали до 5 мин, в последнем - время достройки до 5 мин).

10 мкл реакционной смеси, полученной после проведения ПЦР, используют для электрофоретического разделения.

Пример 4. Проведение электрофоретического разделения продуктов амплификации.

1. Готовят 1 х ТАЕ-буфер путем пятидесятикратного разведения 50 х ТАЕ буфера (2 М Трис, 1 М уксусная кислота, 50 мМ ЭДТА, рН 8,4) в объеме, достаточном для заполнения электрофорезной камеры и приготовления геля (1000 мл).

2. Добавляют к 1 х ТАЕ буферу агарозу в количестве, необходимом для получения 2% раствора, и нагревют в микроволновой печи до полного расплавления агарозы.

3. Охлаждают смесь до 50°С.

4. Добавляют к раствору агарозы бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл и осторожно перемешивают.

5. Полученный раствор выливают в кювету для геля и равномерно распределяют по объему кюветы.

6. В кювету вставляют гребенку в вертикальном положении так, чтобы ее зубцы не доставали до дна примерно 1,5 мм.

7. Оставляют кювету с агарозным гелем на 30 мин при комнатной температуре для застывания геля. Далее, аккуратно удаляют гребенку и помещают кювету с гелем в электрофорезную камеру, содержащую необходимое количество 1 х ТАЕ буфера.

8. По 10 мкл образов, полученных в Примере 3, смешивают с 2 мкл буфера для нанесения (10 мМ Трис-HCl, рН 7.8, 40% глицерин, 40 мМ ЭДТА, 0,01% бромфеноловый синий, 0,01% ксиленцианол) и аккуратно вносят в лунки геля.

9. Проводят электрофорез при градиенте напряженности 1,5 В на 1 см геля в течение 30 мин.

10. Извлекают гель из электрофорезной камеры и просматривают в УФ-свете на транс-иллюминаторе. Результаты документируют путем фотографирования геля и сохранения полученных изображений.

Пример 5. Интерпретация результатов электрофоретического разделения продуктов амплификации.

Изображения, полученные в Примере 4 интерпретируют следующим образом. По наличию полосы оптической плотности с длиной в диапазоне 200-400 п. н. в дорожке на агаразном геле делают вывод о наличии соответствующего гена в исследуемом образце, соответствующем конкретному возбудителю (Фигура 1.).

--->

Перечень последовательностей

<210> 1

<211> 23

<212> cpsB-f1

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер прямой

<400> 1

TTGATGTAGA TGACGGTCCC AAG (SEQ ID NO: 1)

<210> 2

<211> 23

<212> cpsB-r1

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер обратный

<400> 2

TATATCTCTG CGCCATAAGC AAT (SEQ ID NO: 2)

<210> 3

<211> 23

<212> ebpS-f1

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер прямой

<400> 3

ACTCGACTGA GGATAAAGCG TCT (SEQ ID NO: 3)

<210> 4

<211> 23

<212> ebpS-r1

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер обратный

<400> 4

CCTCCAAATA TCGCTAATGC ACC (SEQ ID NO: 4)

<210> 5

<211> 23

<212> fucK-f1

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер прямой

<400> 5

TGCTCACTCA ACGCTTAACT GGT (SEQ ID NO: 5)

<210> 6

<211> 23

<212> fucK-r1

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер обратный

<400> 6

TTCTGGGCTA ATGGTGTACG TAA (SEQ ID NO: 6)

<210> 7

<211> 23

<212> oprL-f1

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер прямой

<400> 7

GCGTGCGATC ACCACCTTCT ACT (SEQ ID NO: 7)

<210> 8

<211> 23

<212> oprL-r1

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер обратный

<400> 8

TTCTTCAGCT CGACGCGACG GTT (SEQ ID NO: 8)

<210> 9

<211> 22

<212> sidA-f1

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер прямой

<400> 9

TTCCACTGGT GGGTGGGTTT TG (SEQ ID NO: 9)

<210> 10

<211> 23

<212> sidA-r1

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер обратный

<400> 10

TCATGTTGGA GTTCTATGGC ACG (SEQ ID NO: 10)

<210> 11

<211> 23

<212> rmpA-f2

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер прямой

<400> 11

GGACTACCTC TGTTTCATAT TAC (SEQ ID NO: 11)

<210> 12

<211> 20

<212> rmpA-r2

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер обратный

<400> 12

CCCCATTTTT CAGTAGGCAT (SEQ ID NO: 12)

<---

Изобретение относится к молекулярной биологии, микробиологии и медицине. В настоящем изобретении разработан способ, основанный на мультиплексной ПЦР, для видового определения шести основных возбудителей бактериальной пневмонии человека. Заявляемое изобретение характеризуется тем, что в нем не используется анализ 16s рибосомальной РНК, а затрагиваются только исключительно видоспецифичные гены, что резко увеличивает специфичность анализа. В отличие от аналогов, в заявляемом изобретении применен метод мультиплексной ПЦР, который позволяет выявлять в одном анализе ДНК шесть наиболее значимых возбудителей бактериальной пневмонии. Отечественных и зарубежных аналогов не описано. Изобретение может быть использовано в клинических лабораториях, специализирующихся на проведении рутинных анализов образцов пациентов с предварительным диагнозом пневмония. Разработанный метод требует стандартной квалификации лаборанта, работающего с постановкой ПЦР. Система ориентирована на применение в клинической диагностике для определения этиологии заболевания благодаря возможности дифференцировать бактериальную от вирусной и грибковой пневмонии и обеспечивает видоспецифическую идентификацию шести основных возбудителей бактериальной пневмонии человека. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 5 пр.

1. Способ идентификации генов бактериальных возбудителей пневмонии человека, включающий: а) - амплификацию фрагментов видоспецифичных генов Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila и Klebsiella pneumoniae путем проведения полимеразной цепной реакции с набором специфических олигонуклеотидных праймеров, представленным последовательностями SEQ ID NO: 1-12; б) - разделение продуктов реакции путем электрофореза в агарозном геле; в) - анализ электрофоретической картины разделения продуктов амплификации; г) - интерпретацию результатов анализа.

2. Набор специфичных олигонуклеотидных праймеров, представленный последовательностями SEQ ID NO: 1-12, для осуществления идентификации бактериальных возбудителей пневмонии человека, таких как Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila и Klebsiella pneumoniae, способом по п. 1.