Набор праймеров для выявления возбудителей бактериальной пневмонии человека методом мультиплексной рекомбиназной полимеразной амплификации Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к молекулярной биологии, микробиологии и медицине и обеспечивает обнаружение бактерий - возбудителей инфекционной пневмонии человека с помощью видоспецифичных праймеров. Изобретение направлено на применение в клинических лабораториях для ускоренной диагностики бактериальной пневмонии и уточнения диагноза при выявленной пневмонии неясной этиологии.

Уровень техники

Инфекционная пневмония относится к социально-значимым заболеваниям и представляет собой воспаление респираторных отделов легких. Внебольничная пневмония бактериальной природы встречается гораздо чаще грибковой, паразитарной, аллергической, ожоговой и лучевой, однако часто сочетается с вирусной инфекцией (Campigotto А., Mubareka S. (2015) Influenza-associated bacterial pneumonia; managing and controlling infection on two fronts. Expert. Rev. Anti. Infect. Ther. 13, 55-68; Noskin G.A., Glassroth J. (1996) Bacterial pneumonia associated with HIV-1 infection. Clin. Chest. Med. 17, 713-723). Ежегодно бактериальной пневмонией заболевает около 1000 человек на 100 тыс.населения. Следует отметить, что статистические данные сильно варьируют для различных возрастных категорий (Henig О., Кауе K.S. (2017) Bacterial pneumonia in older adults. Infect. Dis. Clin. North. Am. 31, 689-713; Eshwara V.K., Mukhopadhyay C., Rello J. (2020) Community-acquired bacterial pneumonia in adults: An update. Indian. J. Med. Res. 151, 287-302). Бактериальная пневмония характеризуется этиологической неоднородностью и вызывается широким спектром грамположительных и грамотрицательных бактерий. В этой связи крайне важным является своевременное выявление возбудителя, поскольку стратегия лечения для различных патогенных бактерий может отличаться (Harris М, Clark J., Coote N., Fletcher P., Harnden A., McKean M., Thomson A. (2011) British thoracic society standards of care committee. British thoracic society guidelines for the management of community acquired pneumonia in children: update 2011. Thorax. 66 (Suppl. 2), iil-ii23).

Современная клиническая диагностика базируется на классических методах: зачастую просто на определении клинической картины заболевания (Cunha В.А. (2006) The atypical pneumonias: clinical diagnosis and importance. Clin. Microbiol. Infect. 12, Suppl. 3, 12-24), на данных радиологического исследования (Azoulay Е., Russell L., Van de Louw A., Metaxa V., Bauer P., Povoa P., Montero J.G., Loeches I.M., Mehta S., Puxty K., Schellongowski P., Rello J., Mokart D., Lemiale V., Mirouse A. (2020) Diagnosis of severe respiratory infections in immunocompromised patients. Intensive. Care. Med. 46, 298-314; Mabie M., Wunderink R.G. (2003) Use and limitations of clinical and radiologic diagnosis of pneumonia. Semin. Respir. Infect. 18, 72-79) или культуральных методов (Budayanti N.S., Suryawan К., Iswari I.S., Sukrama D.M. (2019) The quality of sputum specimens as a predictor of isolated bacteria from patients with lower respiratory tract infections at a tertiary referral hospital, Denpasar, Bali-Indonesia. Front. Med. (Lausanne). 6, 64), что, с учетом быстрой динамики развития патологии, не является оптимальным. В лучшем случае, используют серологические тесты или ПЦР, которые в своем большинстве ориентированы на определение лишь одного вида возбудителя (Lee N., Rainer Т.Н., Ip М., Zee В., Ng М.Н., Antonio G.E., Chan Е., Lui G., Cockram C.S., Sung J.J., Hui D.S. (2006) Role of laboratory variables in differentiating SARS-coronavirus from other causes of community-acquired pneumonia within the first 72 h of hospitalization. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 25, 765-772; Dorigo-Zetsma J.W., Zaat S.A., Wertheim-van Dillen P.M., Spanjaard L., Rijntjes J., van Waveren G., Jensen J.S., Angulo A.F., Dankert J. (1999) Comparison of PCR, culture, and serological tests for diagnosis of Mycoplasma pneumoniae respiratory tract infection in children. J. Clin. Microbiol. 37, 14-17).

Изобретение RU 2737829 C1, дата приоритета 12.11.2019, дата публикации 03.12.2020, «Последовательность ДНК-аптамера, связывающаяся с пептидогликан-ассоциированным липопротеином Legionella pneumophila» описывает специфичный аптамер, способный выявлять присутствие в образце возбудителя пневмонии - легионеллы. Описанный алтамер применим для выявления в образце лишь одного бактериального возбудителя.

В изобретении RU 2781014 С1, дата приоритета 06.12.2021, дата публикации 04.10.2022, «Способ и набор праймеров для видоспецифической идентификации возбудителей бактериальной пневмонии человека» применяется мультиплексная ПЦР для выявления возбудителей бактериальной пневмонии. Для осуществления способа требуется наличие термоциклера, что ограничивает применение метода вне специализированных лабораторий (невозможность осуществления анализа в «полевых условиях»).

Изобретение RU 2784653 С1, дата приоритета 06.12.2021, дата публикации 29.11.2022, «Способ обратной транскрипции, совмещенный с мультиплексной ПЦР для видеоспецифической идентификации возбудителей бактериальной и вирусной пневмонии человека с иммобилизованными праймерами и биологический микрочип для его осуществления» требует проведения обратной транскрипции и последующей ПЦР, использует специализированный биологический микрочип и термоциклер для осуществления способа.

Настоящее изобретение описывает набор праймеров для быстрого определения возбудителя бактериальной пневмонии с помощью рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA, от Recombinase Polymerase Amplification) в мультиплексном формате - реакции, которая проходит в изотермическом режиме, характеризуется большей, по сравнению с ПЦР, скоростью накопления продукта и чувствительностью, а также не нуждается в применении термоциклера (Piepenburg О., Williams С.Н., Stemple D.L., Armes N.A. (2006) DNA detection using recombination proteins. PLoS Biol., 4, e204; Lobato I.M., O'Sullivan C.K. (2018) Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends. Analyt. Chem. 98, 19-35).

Настоящее изобретение выгодно отличается от аналогов низкой восприимчивостью к загрязнениям образца (свойство рекомбиназной полимеразной системы амплификации).

Преимущества RPA, в условиях все большего распространения и доступности реагентов для ее выполнения в профильных клинических лабораториях, могут сделать этот подход привлекательной и эффективной альтернативой другим распространенным методам выявления возбудителей пневмонии. Отсутствие необходимости наличия термоциклера теоретически позволяет осуществлять метод в «полевых условиях» вне специализированных лабораторий.

Раскрытие сущности изобретения

Целью изобретения является создание набора праймеров для видовой идентификации шести социально-значимых возбудителей бактериальной пневмонии человека методом мультиплексной рекомбиназной полимеразной амплификации.

Изобретением предлагается набор из шести пар праймеров (прямые и обратные) для видоспецифичной идентификации социально-значимых бактериальных возбудителей пневмонии человека, обладающих видоспецифичностью и устойчивых к генетической пластичности благодаря выбору консервативных локусов для анализа, а также (при необходимости) введению вырожденных нуклеотидных позиций в последовательность олигонуклеотидных праймеров. Набор предназначен для применения в составе оригинальной системы мультиплексной RPA.

Набор из шести пар видоспецифичных праймеров включает в себя праймеры для видовой идентификации следующих социально-значимых бактериальных возбудителей пневмонии: Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae и Pseudomonas aeruginosa. Для каждого бактериального возбудителя выбирали фунционально-значимые видоспецифичные участки генов. Ген cpsB S. pneumoniae кодирует тирозин-специфичную протеинфосфатазу В, ген ebpS S. aureus кодирует эластинсвязывающий белок S, ген fucK, применяемый для видовой идентификации H. influenzae, относится к генам углеводного обмена, ген oprL кодирует пептидогликан-ассоциированный белок P. aeruginosa, для видовой идентификации L. pneumophila и K. pneumoniae использовали детерминанты вирулентности этих бактерий - sidA и fimH, соответственно. Выбор генов и функциональные роли кодируемых ими белков со ссылками на первоисточники более подробно описаны в (Лапа С.А., Мифтахов Р.А., Клочихина Е.С., Аммур Ю.И., Благодатских С.А., Шершов В.Е., Заседателев А.С., Чудинов А.В. (2021) Разработка мультиплексной ОТ-ПЦР с иммобилизованными праймерами для идентификации возбудителей инфекционной пневмонии человека Молек. Биол. 55, 944-955).

Основные подходы, примененные в данном изобретении к конструированию праймеров, специфичных к участкам геномов бактериальных возбудителей пневмонии, описаны в (Клочихина Е.С., Шершов В.Е., Кузнецова В.Е., Лапа С.А., Чудинов А.В. (2021) Особенности оптимизации мультипраймерной ПЦР для выявления возбудителей инфекционной пневмонии человека. Тонкие Химические Технологии 16, 225-231), но с той разницей, что для RPA в большинстве случаев требуются праймеры большей длины, по сравнению с ПЦР, а именно 30-35 нт (Инструкция TwistAmp, официальные рекомендации по дизайну праймеров: https://www.twistdx.co.uk/wp-content/uploads/2021/04/twistamp-assay-design-manual-v2-5.pdf). Однако длина праймеров дополнительно увеличена по сравнению с рекомендованной, а именно до 35-40 нт, что повышает воспроизводимость результатов в мультиплексном режиме работы системы.

Последовательности праймеров указаны в Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 1 - 12). Кроме того, основные характеристики праймеров, в том числе их последовательности, указаны в Таблице 1, в порядке увеличения длин образующихся продуктов.

Для проверки специфичности праймеров в системе амплификации RPA использовали образцы деконтаминированной геномной ДНК, указанные в Таблице 2. Проверку осуществляли как с использованием ДНК из коллекционных штаммов, так и с использованием выделенной и охарактеризованной ДНК из клинических образцов и природных источников, что повышает доказательную базу и достоверность результатов проверки.

Краткое описание фигур и таблиц

Фигура 1. Визуальная идентификация возбудителя пневмонии по электрофореграмме: а) неизбирательная детекция ДНК с помощью красителя SYBR Green I, b) избирательная идентификация продуктов удлинения праймеров, окрашенных цианиновым красителем Су5. Окрашивание праймеров, специфичных к Н. influenzae, L. pneumophila и S. aureus позволяет надежно дискриминировать соответствующие продукты амплификации от продуктов амплификации, не несущих метку: P. aeruginosa, S. pneumoniae, К. pneumoniae. Обозначения: L - маркер длин ДНК Ladder GeneRuler 50bp ("Thermo", США), Pse -Pseudomonas aeruginosa, Hae - Haemophilus influenzae, Str - Streptococcus pneumoniae, Leg -Legionella pneumophila, Kle - Klebsiella pneumoniae, Sta - Staphylococcus aureus, ТВ -Mycobacterium tuberculosis (контроль специфичности праймеров), NC - отрицательный контроль. Цифрами слева обозначены длины дцДНК (нп), соответствующие полосам маркера длин ДНК (от 50 до 500 нп).

Таблица 1. RPA-праймеры (SEQ ID NO: 1 - 12); нт - нуклеотиды, нп - нуклеотидные пары.

Таблица 2. Штаммы возбудителей бактериальной пневмонии человека, использованные для проверки видоспецифичности сконструированных праймеров.

Осуществление изобретения

Подбор олигонуклеотидных праймеров выполняется на основе систематизации последовательностей ДНК выявляемых бактериальных возбудителей пневмонии. Систематизация и выбор консервативных локусов осуществляется на основе анализа литературных источников и последовательностей генов в базах данных (GenBank, European Nucleotide Archive). Далее проводится множественное выравнивание (Multiplex Alignment) последовательностей отдельных локусов либо полноразмерных генов-мишеней для каждого из возбудителей. Выравнивания проводятся с помощью специализированного программного обеспечения, например BioEdit Sequence Alignment Editor (версия 7.1.9) по алгоритму ClustalW. Далее, используя соответствующее программное обеспечение, например Oligo v. 6. 3 (Molecular Biology Insights Inc., США) или Fast PCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/ Programs/fastpcr.htm), проводится расчет температуры отжига праймеров и, варьируя их длину, добиваются того, чтобы разброс температур отжига праймеров внутри набора не превышал 3-4°С. При подборе праймеров избегают таких последовательностей, которые способны формировать вторичные структуры типа шпильки с высокими температурами плавления. Специфичность подобранных праймеров проверятся путем поиска по базам данных нуклеотидных последовательностей (GenBank, European Nucleotide Archive) с использованием программного обеспечения, поддерживающего алгоритм BLAST (например, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Консервативность участка выбранного гена для сконструированных праймеров доказывается путем множественного анализа последовательностей с помощью алгоритма BLAST (например, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

В качестве образцов для анализа при осуществлении способа используются непосредственно лизаты культур, клинические или природные образцы, предположительно содержащие один или несколько из шести указанных возбудителей пневмонии человека (Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae и Pseudomonas aeruginosa), деконтаминированные при помощи СТАВ-метода. Обработка образца перед проведением анализа осуществляется любым из имеющихся методов выделения ДНК из биологических образцов, например с помощью методов, указанных в (Niemz, A., Ferguson, Т.М., & Boyle, D.S. (2011). Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends in biotechnology, 29(5), 240-250. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2011.01.007). При разработке набора праймеров и способа идентификации бактериальных возбудителей пневмонии перед выделением ДНК из образцов бактериальных возбудителей пневмонии человека, изоляты из природных источников, а также клинические образцы культивируют на селективных средах. ДНК из культур выделяют и деконтаминируют с использованием СТАВ-метода. Видовую принадлежность штамма доказывают с помощью стандартного секвенирования по Сенгеру.

Продукты амплификации, полученные с помощью рекомбиназной полимеразной реакции с использованием данного набора праймеров, подвергаются разделению путем проведения электрофореза в агарозном геле. Далее, проводится анализ полученных изображений электрофореграмм. По расположению специфических полос для продуктов амплификации проводится интерпретация электрофореграммы и делается вывод о наличии в анализируемых образцах того или иного возбудителя по продукту амплификации участка ДНК. Для облегчения визуального контроля по электрофореграмме продуктов амплификации три из шести прямых праймеров несут флуоресцентную метку Су5. Шесть обратных праймеров не несут флуоресцентную метку.

На Фигуре 1 представлен результат выполнения мультиплексной RPA в одном общем объеме с настоящим набором праймеров и при оптимизированных условиях амплификации.

Из Фигуры 1 видно, что визуальная дискриминация в ряде случаев может быть осложнена, поскольку выбранный интервал теоретических длин продуктов амплификации при конструировании дизайна данной системы RPA был ограничен официальными рекомендациями производителя набора TwistAmp по максимальной длине продуктов амплификации. Кроме того, теоретически при наличии в образце двух и более генетических мишеней возможна конкурентная амплификация в пользу продуктов меньшей длины.

Поэтому для надежной дискриминации предложена двухволновая детекция флуоресценции. Двухцепочечный комплекс ДНК/SYBR Green I характеризуется максимумом поглощения λ_max=497 нм и максимумом излучения λ_max=520 нм. Окрашивание SYBR Green I применяли после окончания электрофореза для визуализации всех продуктов амплификации. Цианиновый краситель Су5 ковалентно пришивали по 5'-концу к трем прямым праймерам (с возрастанием длин продуктов по схеме «через один») для повышения надежности интерпретации результатов. Этот краситель характеризуется максимумом поглощения λ_max=650 нм и максимумом излучения λ_max=670 нм, что не приводит к перекрестному возбуждению и удобно для раздельной визуализации SYBR и Су5. Продукты амплификации, полученные с Су5-меченными праймерами, отличаются по цветовому окрасу даже при использовании UV-трансиллюминатора с применением оптического фильтра SYBR photographic filter S7569 ("Molecular Probes", США), но для надежности интерпретации результата в настоящей работе использовали систему гельдокументирования со специализированными источниками возбуждения и светофильтрами для каждого из красителей.

Определение основных параметров системы (аналитическая чувствительность, специфичность, воспроизводимость) в мультиплексном варианте с применением разработанных праймеров проводили с помощью амплификации в реальном времени (в изотермическом режиме) для разных концентраций образцов, с последующим электрофоретическим контролем. Для представленной в Таблице 2 выборки специфичность была 100%, при этом не наблюдали перекрестной амплификации. Кроме того, использовали геномную ДНК штамма М. tuberculosis H37rv в качестве теста на специфичность, поскольку клинические проявления туберкулеза легких могут быть сходны с пневмонией. Чувствительность метода составила от 10² до 10³ копий ДНК на реакционный объем.

Таким образом, заявляемый набор праймеров позволяет проводить надежную видовую идентификацию шести социально-значимых возбудителей пневмонии человека.

Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.

Пример 1. Набор олигонуклеотидных праймеров, специфичных к участкам генов бактерий - возбудителей пневмонии человека Для обеспечения видоспецифичности праймеров выбирают консервативные видоспецифичные участки геномов бактерий-возбудителей пневмонии человека. Список генов-мишеней для разработанных праймеров приведен в Таблице 1.

Нуклеотидные последовательности геномных мишеней выравнивают с помощью алгоритма ClustalW (www.clustal.org). Праймеры для RPA (длиной от 35 до 40 нт) конструируют с использованием сетевого ресурса www.idtdna.com. Проводят тестирование на внутри- и межмолекулярные вторичные структуры. Специфичность анализируют с помощью алгоритма BLAST (NIH, США, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Праймеры конструируют с учетом удобства визуального контроля продуктов амплификации по электрофореграмме (для образования продуктов различной, визуально различимой длины). Кроме того, с целью повышения надежности дискриминации, в праймеры, специфичные к Н. influenzae, L. pneumophila и SI aureus вводят Су5-метку по 5'-концу через аминолинкер.

Твердофазный синтез олигонуклеотидов осуществляют с помощью автоматического синтезатора ABI 394 DNA/RNA ("Applied Biosystems", США) по стандартному регламенту, очистку производят на колонке BDS Hypersil С18 ("Thermo", США).

Список праймеров и их последовательности приведены в Перечне Последовательностей.

Пример 2. Использованные штаммы бактерий - возбудителей пневмонии человека

В работе используют ДНК штаммов из коллекции ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (п.Оболенск), в том числе клинические и природные изоляты. Перед выделением ДНК изоляты из природных источников, а также клинические образцы культивируют на селективных средах. ДНК из культур выделяют и деконтаминируют с использованием СТАВ-метода. Видовую принадлежность штамма доказывают с помощью стандартного секвенирования по Сенгеру.

При создании и оптимизации состава заявляемого набора праймеров, а также для проверки специфичности набора праймеров используют образцы бактерий, указанные в Таблице 2.

Пример 3. Проведение мультиплексной RPA

Рекомбиназную полимеразную реакцию проводят в микропробирке в объеме 50 мкл. Смесь содержит компоненты набора TwistAmp ("TwistDX", Великобритания) в рекомендуемых производителем концентрациях, а также раствор шести пар праймеров (из расчета 10 пмоль на реакцию каждого), заявляемых в настоящем изобретении как набор праймеров. Праймеры специфичны к бактериальным возбудителям пневмонии. Также смесь содержит 1 мкл очищенных полногеномных бактериальных ДНК в концентрации от 10¹ до 10³ копий/мкл (раститровка для определения чувствительности метода). Раствор, содержащий шесть пар праймеров, перед внесением в общий реакционный объем прогревают в течение 5 мин при 95°С и сразу же помещают на лед (-2-0°С). Реагенты набора, за исключением матрицы (образец ДНК) и ацетата магния, входят в общую смесь, которую после аккуратного перемешивания разливают по реакционным пробиркам объемом 200 мкл. Ацетат магния вносят на внутреннюю сторону крышки каждой реакционной пробирки и закрывают крышки пробирок лишь перед окончательным перемешиванием и началом проведения реакции, образец ДНК вводят на верхнюю часть внутренней поверхности пробирки для предотвращения преждевременного контакта с компонентами смеси. Растворы «сбрасывают» коротким центрифугированием, аккуратно перемешивают шестикратным переворачиванием и еще раз «сбрасывают», после чего немедленно помещают в термостат. Реакцию проводят в течение 20 мин при 40°С на лабораторном термостате для микропробирок TDB-120 ("Biosan", Латвия), останавливают реакцию путем смешивания реакционной смеси с компонентами загрузочного буфера для проведения электрофореза либо нагреванием в течение 5 мин при 95°С.

Чувствительность RPA определяют раститровкой ДНК анализируемых образцов в интервале 10¹-10³ копий на реакционный объем (50 мкл). Скорость накопления продукта оценивают при температурном режиме, описанном выше, с добавлением красителя EvaGreen ("Lumiprobe", Россия) на амплификаторе iCycler iQ5 ("Bio-Rad", США). Эксперименты выполняют в трех повторностях для каждого исследуемого образца и рассчитывают среднее значение. Качественный анализ наличия/отсутствия продукта амплификации проводят визуально по электрофореграмме.

Пример 4. Электрофоретическое разделение продуктов RPA

Продукты RPA разделяют в 4%-ном агарозном геле (Agarose LE, "Helicon", Россия) в течение 20 мин при напряженности электрического поля 10 В/см, для окрашивания используют SYBR Green I ("Molecular Probes", США). Визуализацию проводят на трансиллюминаторе ТСР-20.МС 254/312 нм ("Vilber Lourmat", Франция) при длине волны 260 нм, снабженного цифровым фотоаппаратом EOS 60D ("Canon", Япония) - для получения цветного изображения, а также на системе гельдокументирования ChemiScope 6200 Touch ("Clinx Science Instruments", КНР) с помощью входящего в комплект УФ-трансиллюминатора - для общей детекции ДНК по окрашиванию SYBR Green I, и с помощью встроенных LED-светодиодов и светофильтров "Red light excitation/emission", соответствующих характеристикам флуоресцентного красителя Су5 - для избирательной детекции продуктов удлинения меченых праймеров.

Результат видового определения бактерий - возбудителей пневмонии с помощью набора праймеров показан на Фигуре 1.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Набор праймеров

для выявления возбудителей бактериальной пневмонии человека методом

мультиплексной рекомбиназной полимеразной амплификации.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2023-08-12">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>27.07.2023</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А.

Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Engelhardt Institute of Molecular Biology,

Russian Academy of Sciences</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Набор праймеров для выявления

возбудителей бактериальной пневмонии человека методом мультиплексной

рекомбиназной полимеразной амплификации</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>12</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q21">

<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>direct primer</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q22">

<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>oprL-f1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtacaacatggctctgggcgagcgtcgtgccaagg</INSDSeq_sequ

ence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q23">

<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>reverse primer</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q24">

<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>oprL-r1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttctgagcccaggactgctcgtcgtggccggtagc</INSDSeq_sequ

ence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q25">

<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>direct primer</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q26">

<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>fucK-f1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>&lt;1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q58">

<INSDQualifier_name>function</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>carries Cy5 through an

aminospacer</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgctaacggtaattgggatccatcgattttagcct</INSDSeq_sequ

ence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q27">

<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>reverse primer</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q28">

<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>fucK-r1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccwgcaccagacccaaacacagcaaattgggtatc</INSDSeq_sequ

ence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q19">

<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>direct primer</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q20">

<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>cpsB-f1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgtagatgacggtcccaagtcaagagaggaaagc</INSDSeq_sequ

ence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q30">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q31">

<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>reverse primer</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q32">

<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>cpsB-r1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atctctgcgccataagcaatgactaaatcatctgc</INSDSeq_sequ

ence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q34">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q35">

<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>direct primer</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q36">

<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>sidA-f1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>&lt;1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q59">

<INSDQualifier_name>function</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>carries Cy5 through an

aminospacer</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcagcgatcaycctcggtggattggctgccgcaat</INSDSeq_sequ

ence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q38">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q39">

<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>reverse primer</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q40">

<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>sidA-r1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>catgttggagttctatggcacgaatttckaataag</INSDSeq_sequ

ence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q42">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q43">

<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>direct primer</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q44">

<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>fimH-f1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggtgtgctgtcgagtttttcaggcaccgtgaaatataacg</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="10">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q46">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q47">

<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>reverse primer</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q48">

<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>fimH-r1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gttgttggcgtagatgttccagatgaactggaaggagtcg</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="11">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q50">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q51">

<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>direct primer</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q52">

<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>ebpS-f1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>&lt;1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q57">

<INSDQualifier_name>function</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>carries Cy5 through an

aminospacer</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>&lt;1</INSDFeature_location>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccaaatatcgctaatgcaccgataattagtacagc</INSDSeq_sequ

ence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="12">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q54">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q55">

<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>reverse primer</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q56">

<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>ebpS-r1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>actcgactgaggataaagcgtctcaagataagtct</INSDSeq_sequ

ence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен набор видоспецифичных праймеров для видовой идентификации шести социально-значимых возбудителей пневмонии человека методом мультиплексной рекомбиназной полимеразной реакции (RPA), состоящий из последовательностей SEQ ID NO: 1-12. Набор праймеров в составе разработанной системы может найти применение в профильных клинических лабораториях для экспресс-анализа образцов от пациентов с подозрением на пневмонию. Аналитическая чувствительность разработанной мультиплексной RPA с применением заявляемого набора праймеров составила 10²-10³ копий ДНК. Специфичность метода мультиплексной RPA на основе заявляемых праймеров составила 100%. Время выполнения анализа составило менее часа, включая электрофоретический контроль реакции. 1 ил., 2 табл., 4 пр.

Набор праймеров для выявления возбудителей бактериальной пневмонии человека методом мультиплексной рекомбиназной полимеразной амплификации, представленных последовательностями SEQ ID NO: 1-12.