Мультиплексная ПЦР-смесь для определения серотипов 12FAB, 15BC, 22FA, 8 Streptococcus pneumoniae и способ ее применения Российский патент 2022 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к лабораторным методам определения серотипов Streptococcus pneumoniae с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РРВ), и может быть использовано для молекулярной диагностики циркулирующих штаммов пневмококковой инфекции (ПИ), проведения микробиологического мониторинга и решения научно-исследовательских задач по изучению пневмококковых инфекций.

S. pneumoniae является грамположительным анаэробным видом бактерий. В зависимости от химических свойств полисахаридной капсулы выделяют около 50 серогрупп, образующих не менее 100 серотипов, многие из которых ассоциированы с инвазивными ПИ. Важным элементом эпидемиологического надзора за пневмококковыми инфекциями является микробиологический мониторинг, включающий антигенную и генетическую характеристику возбудителей ПИ, а также данные о чувствительности к антибиотикам. Антигенная характеристика возбудителей заключается в определении серотипов, что позволяет оценить эффективность существующих поливалентных вакцин. В России широкое применение получили 13-валентная конъюгированная пневмококковая вакцина (PCV13, «Превенар 13») и 23-валентная полисахаридная вакцина (PPV23, «Пневмовакс 23»). Определение спектра серотипов возбудителей ПИ позволяет планировать иммунопрофилактические мероприятия и оценивать их эффективность в группах лиц, вовлеченных в эпидемический процесс.

Для определения серотипов S. pneumoniae используются серологические способы, основанные на реакции набухания полисахаридной капсулы или реакции латекс-агглютинации. Широко используются и основанные на ПЦР способы детекции серотип-специфических последовательностей срт-локуса, такие как гены полисахаридной полимеразы wzy и флиппазы wzx, а также другие гены, участвующие в биосинтезе капсульного полисахарида (wcwV, galU, wciP, wzg) [Bentley, S.D. Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes / S.D. Bentley, D.M. Aanensen, A. Mavroidi et al. // PLoS Gene. - 2006. - Vol. 2. - №3. - P.262-269. doi: 10.1371/journal.pgen.0020031; Selva, L. Rapid and Easy Identification of Capsular Serotypes of Streptococcus pneumoniae by Use of Fragment Analysis by Automated Fluorescence-Based Capillary Electrophoresis / L. Selva, E. del Amo, P. Brotons, C. Munoz-Almagro // J. Clin. Microbiol. - 2012. - Vol. 50.-№11. - P. 3451-3457. doi:10.1128/JCM.01368-12].

В 2006 году R. Pai и соавторы предложили алгоритм серотипирования S. pneumoniae, основанный на последовательных мультиплексных ПЦР [Pai, R. Sequential multiplex PCR approach for determining capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates / R. Pai, R. E. Gertz, B. Beall // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol. 44. - №1. - P.124-131. doi:10.1128/JCM.44.1.124-131.2006]. К недостаткам данного подхода относится необходимость использования электрофоретической детекции продуктов ПЦР в агарозном геле, что, наряду с другими недостатками включения данного этапа, может осложнять дифференциацию серотипов при проведении мультиплексной ПЦР.

Из уровня техники также известен способ определения 29 серотипов [Yun, K. W. Streptococcus pneumoniae type determination by multiplex polymerase chain reaction / K.W. Yun, E. Y. Cho, K.B. Hong et al. // Journal of Korean medical science. 2011. Vol. 26. №8. - P.971-978. doi:10.3346/jkms.2011.26.8.971]. Недостатком данного способа также является этап электрофореза.

Оптимальным способом одновременного определения нескольких серотип-специфических мишеней является ПЦР-РРВ с использованием флуоресцентно меченых зондов. Несмотря на преимущества ПЦР-РРВ для определения серотипов, эффективность ее применения не всегда очевидна, что обусловлено постоянной адаптацией возбудителей под давлением популяционного иммунитета, в том числе обусловленного иммунопрофилактикой с использованием поливалентных вакцин.

Для определения серотипов S. pneumoniae с помощью ПЦР-РРВ используется методика, разработанная в ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, Россия), которая предполагает исследование 16 серотип-специфических мишеней в четырех реакционных смесях [MP 4.2.0114-16. Методические рекомендации. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика внебольничной пневмонии пневмококковой этиологии. Утверждены и введены в действие 20 октября 2016 г.; Миронов, К.О. Методика ПЦР в режиме реального времени для определения серотипов Streptococcus pneumoniae / К.О. Миронов, А.Е. Платонов, Е.А. Дунаева и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2014. №1. - С. 41-48.]. Каждая из реакционных смесей содержит праймеры и зонды для проведения ПЦР на амплификаторах с пятью каналами флуоресцентной детекции. Методика предназначена для определения пневмококков, ассоциированных с инвазивными формами инфекции, капсульные антигены которых включены в состав 10- и 13-валентных конъюгированных вакцин. Серотип-специфические праймеры и зонды распределены по реакционным смесям следующим образом:

реакционная смесь №13, 6 ВА, 19F, 9VA (ПЦР-смесь М5); реакционная смесь №2 - 1, 14, 23F, 4 (ПЦР-смесь N5); реакционная смесь №3 - 18, 9NL, 15AF, HAD (ПЦР-смесь Sp3); реакционная смесь №4 - 2, 5, 7AF, 19А (ПЦР-смесь Sp4).

Каждая реакционная смесь содержит праймеры и зонды для определения четырех серотипов, а также праймеры и зонд для детекции положительного внутреннего контроля фрагмента срт-локуса, общего для всех серотипов.

Несмотря на то, что вышеупомянутая методика позволяет определить указанные серотипы у 79% образцов, возникает ряд сложностей, поскольку при использовании 4-плексной методики такие серотипы, как 8, 12FAB, 15ВС и 22FA, которые, в свою очередь, входят в состав 23-валентной полисахаридной вакцины (PPV23, «Пневмовакс 23»), не определяются.

В силу того, что серотиповой состав возбудителей ПИ изменчив во времени и различается на разных территориях и в разных популяциях, существует потребность в разработке эффективного и доступного инструмента, позволяющего оптимизировать существующие лабораторные подходы, например, за счет использования дополнительных серотип-специфических мишеней, реализуемых с использованием широко распространенного лабораторного оборудования, например, ПЦР-РРВ. Определение серотипов S. pneumoniae позволяет своевременно использовать информацию об эпидемиологических особенностях циркулирующих возбудителей ПИ для эффективного планирования и контроля программ вакцинации.

Технической задачей изобретения является создание мультиплексной ПЦР-смеси и способа ее применения, что позволяет определять серотипы 12FAB, 15ВС, 22FA, 8S. pneumoniae непосредственно в биологическом материале методом ПЦР-РРВ. Данный подход позволяет одновременно выявлять фрагменты генов S. pneumoniae, не прибегая к использованию дополнительных методов выявления ампликонов (электрофорез ДНК в агарозном геле, ДНК-микрочипы), тем самым снижая риск контаминации продуктами амплификации и процент технологических ошибок. Мультиплексный формат ПЦР-РРВ сокращает трудоемкость, стоимость и продолжительность анализа.

Техническим результатом является повышение эффективности обнаружения фрагментов ДНК четырех серотипов S. Pneumoniae - 12FAB, 15ВС, 22FA, 8 методом ПЦР-РРВ в мультиплексном формате за счет создания мультиплексной ПЦР-смеси, содержащей 4 пары специфичных олигонуклеотидных праймеров и четырех флоуресцентных зондов, а также разработки способа применения упомянутой мультиплексной ПЦР-смеси, который обеспечивает минимальный риск контаминации при проведении исследования и исключает субъективность при оценке результатов. Кроме того, заявляемая группа изобретений позволяет в короткие сроки и с наименьшими затратами идентифицировать максимальную долю циркулирующих серотипов ПИ.

Заявляемая мультиплексная ПЦР-смесь содержит оригинальные олигонуклеотиды, позволяющие идентифицировать 4 серотипа ПИ, а именно:

- олигонуклеотиды для определения 12FAB серотипа S. pneumoniae, имеющие следующий нуклеотидный состав: прямой праймер (12FABF) SEQ ID NO: 1, обратный праймер (12FABR) - SEQ ID NO: 2, флоуресцентный зонд (12FABZ) - SEQ ID NO: 3;

- олигонуклеотиды для определения 15 ВС серотипа Streptococcus pneumoniae, имеющие следующий нуклеотидный состав: прямой праймер (15BCF) - SEQ ID NO: 4, обратный праймер (15BCR) SEQ ID NO: 5, флоуресцентный зонд (15BCZ) SEQ ID NO: 6;

- олигонуклеотиды для определения 22FA серотипа S. pneumoniae, имеющие следующий нуклеотидный состав: прямой праймер (22FAF) - SEQ ID NO: 7, обратный праймер (22FAR) - SEQ ID NO: 8, флоуресцентный зонд (22FAZ) - SEQ ID NO: 9;

- олигонуклеотиды для определения 8 серотипа S. pneumoniae, имеющие следующий нуклеотидный состав: прямой праймер (8F) - SEQ ID NO: 10, обратный праймер (8R) - SEQ ID NO: 11, флоуресцентный зонд (8Z) - SEQ ID NO: 12.

Заявляемые олигонуклеотиды разработаны на основе генов S. pneumoniae, входящих в срт-локус [Bentley, S.D. Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes / S.D. Bentley, D.M. Aanensen, A. Mavroidi et al. // PLoS Gene. 2006. Vol.2. №3. P.262-269. doi: 10.1371/journal.pgen.0020031]. С этой целью были проанализированы фрагменты последовательностей генома S. pneumoniae (срт-локуса) серотипов 12FAB, 15 ВС, 22FA, 8 для определения консервативных участков ДНК, не имеющих гомологии с фрагментами срт-локуса представителей других серотипов S. pneumoniae.

В результате проведенного анализа были выбраны гомологичные для серотипов 12FAB, 15 ВС, 22FA, 8 S. pneumoniae фрагменты срт-локуса, к каждому из которых подобраны праймеры и флоуресцентный зонд для амплификации фрагментов пар оснований, длина которых представлена в Таблице 1.

Для подбора последовательностей-мишеней - мест посадки олигонуклеотидов, используют фрагменты референсных геномов серотипов 12FAB, 15 ВС, 22FA, 8 S. pneumoniae, взятые из базы данных GenBank. Для поиска консервативных последовательностей применяют современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Mega и Unipro UGENE, олигокалькуляторы (Oligo Calculators) Thermo Fisher Scientific. Составляют перечень консервативных участков, характерных только для определяемого серотипа S. pneumoniae, к которым подобирают олигонуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров, а также флоуресцентный зонд.

С использованием ресурса Primer BLAST проанализировали серотип-специфичность полученных праймеров. Результаты приведены в Таблице 2.

В качестве положительного внутреннего контроля используется фрагмент cps-локуса общего для всех серотипов SEQ ID NO: 49-51, с праймерами сртА-f и cpsA-m [Pai, R. Sequential multiplex PCR approach for determining capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates / R. Pai, R. E. Gertz, B. Beall // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol.44. -№1.

P.124-131. doi:10.1128/JCM.44.1.124-131.2006] и зондом cpsA-Z2 [Миронов, КО. Методика ПЦР в режиме реального времени для определения серотипов Streptococcus pneumoniae / К.О. Миронов, А.Е. Платонов, Е.А. Дунаева и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2014. №1. С. 41-48.]. Для детекции cps-положительных образцов используют канал для флуорофора Су5.5.

Согласно предлагаемому способу из биологического материала выделяют ДНК. В качестве биологического материла предпочтительно использовать спинномозговую жидкость или образцы культур S. pneumoniae.

Выделение ДНК из биологического материала или штаммов проводят в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение ДНК из биологического материала производят с помощью комплекта реагентов в соответствии с инструкцией производителя. Для выделения ДНК может быть использован комплект реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или любой аналогичный набор для выделения ДНК. Оптимальная концентрация ДНК - 10³-10⁵ копий в 10 мкл.

ПЦР-РРВ проводят в формате мультиплекс в объеме 25 мкл, с применением олигонуклеотидов - праймеров и зондов, представленных в Таблице 2.

Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:

(a) 10 мкл смеси, содержащей:

- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 49, 50 - по 0,5 мкМ;

- флоуресцентные зонды SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 51 - по 0,2 мкМ;

- dNTPs - 0,44 мМ.

(b) реактив, содержащий рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразы,

например 0,5 мкл реактива «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии

Роспотребнадзора, Россия) или любого аналогичного коммерческого набора в соответствии с инструкцией производителя.

(c) ПЦР-буфер, содержащий MgCl₂, например 4,5 мкл ПЦР-буфера «ОТ-ПЦР-смесь-2 FEP/FRT» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или любого аналогичного коммерческого набора в соответствии с инструкцией производителя.

(d) выделенная ДНК - 10 мкл.

ПЦР-РРВ проводят с флуоресцентной детекцией на приборе «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия) или на любом другом приборе с 5 каналами детекции.

Амплификацию проводят по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 5 циклов при температуре 95°С - 5 секунд / 60°С - 20 секунд / 72°С - 5 секунд, затем 40 циклов при температуре 95°С - 5 секунд / 60°С - 20 сек / 72°С - 5 секунд.

Регистрация флуоресцентного сигнала проводится на этапе 60°С по 5 каналам детекции для флуорофоров FAM, R6G, ROX, Су5.

Для анализа результатов задают пороговую линию, соответствующую величине 8-10% от максимального сигнала положительного образца. Образцы, для которых кривые флуоресценции пересекают пороговую линию, и при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала является экспоненциальной, являются положительными. При этом по каналу для флуорофора FAM определяют наличие в биологическом материале 12FAB серотипа S. pneumoniae, по каналу для флуорофора R6G - наличие 15 ВС серотипа S. pneumoniae, по каналу для флуорофора ROX - наличие 22FA серотипа S. pneumoniae, по каналу для флуорофора Су5 - наличие 8 серотипа S. pneumoniae.

Кроме того, применение в заявляемом способе дополнительно трех мультиплексных ПЦР-смесей, содержащих олигонуклеотиды SEQ ID NO: 13-48 позволяют одновременно идентифицировать до 16 серотипов S. pneumoniae, для чего упомянутые олигонуклеотиды распределяют следующим образом: смесь №1 включает SEQ ID NO: 13-24, смесь №2 - SEQ ID NO: 25-36, смесь №3 - SEQ ID NO: 37-48, а ПЦР-РРВ проводят в четыре этапа. Для каждой ПЦР-смеси в качестве положительного внутреннего контроля используется фрагмент срт-локуса общего для всех серотипов S. pneumoniae SEQ ID NO: 49-51.

Из проб биологического материала выделяют ДНК и проводят ПЦР-РРВ в формате мультиплекс.Процедура выделения ДНК описана выше.

Компоненты для каждой ПЦР смешиваются следующим образом:

(а) 10 мкл смеси, содержащей:

(а.а) для смеси №1:

- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 49, 50 - по 0,5 мкМ;

- флоуресцентные зонды SEQ ID NO: 15, 18, 21, 24, 51 - по 0,2 мкМ;

- dNTPs - 0,44 мМ. (а.Ь) для смеси №2:

- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 49, 50 - по 0,5 мкМ;

- флоуресцентные зонды SEQ ID NO: 27, 30, 33, 36, 51 - по 0,2 мкМ;

- dNTPs - 0,44 мМ. (а.с) для смеси №3:

- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 37, 38, 40, 41, 43, 44, 46, 47, 49, 50 - по 0,5 мкМ;

- флоуресцентные зонды SEQ ID NO: 39, 42, 45, 48, 51 по 0,2 мкМ;

- dNTPs - 0,44 мМ.

(a.d) заявляемую мультиплексную ПЦР-смесь, содержащую оригинальные олигонуклеотиды SEQ ID NO: 1-12, готовят, как описано выше.

Общий объем каждой реакционной смеси, включая заявляемую мультиплексную ПЦР-смесь, должен составлять 25 мкл.

(b) реактив, содержащий рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразы, например, 0,5 мкл реактива «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или любого аналогичного коммерческого набора в соответствии с инструкцией производителя.

(c) ПЦР-буфер, содержащий MgCh, например 4,5 мкл ПЦР-буфера «ОТ-ПЦР-смесь-2 FEP/FRT» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или любого аналогичного коммерческого набора в соответствии с инструкцией производителя.

(d) выделенная ДНК - 10 мкл.

ПЦР-РРВ проводят с флуоресцентной детекцией на приборе «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия) или на любом другом приборе с 5 каналами детекции.

Амплификацию проводят по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 5 циклов при температуре 95°С - 5 секунд / 60°С - 20 секунд / 72°С - 5 секунд, затем 40 циклов при температуре 95°С - 5 секунд / 60°С - 20 сек / 72°С - 5 секунд.

Детекция флуоресценции проводится на этапе 60°С по 5 каналам детекции для флуорофоров FAM, R6G, ROX, Су5. Для анализа результатов задают пороговую линию, соответствующую величине 8-10% от максимального сигнала положительного образца. Образцы, для которых кривые флуоресценции пересекают пороговую линию, и при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала является экспоненциальной, являются положительными. ПЦР-РРВ проводят в четыре этапа.

На первом этапе применяют смесь №1, включающую олигонуклеотиды SEQ ID NO: 13-24. При этом по каналу для флуорофора FAM определяют наличие в биологическом материале 3 серотипа S. pneumoniae, по каналу для флуорофора R6G -наличие 6 ВА серотипа S. pneumoniae, по каналу для флуорофора ROX - наличие 19F серотипа S. pneumoniae, по каналу для флуорофора Су5 - наличие 9VA серотипа S. pneumoniae. При отрицательном результате или наличии не типируемых образцов переходят к следующему этапу.

На втором этапе используют смесь №2, которая содержит олигонуклеотиды SEQ ID NO: 25-36. По каналу для флуорофора FAM определяют наличие в биологическом материале 1 серотипа S. pneumoniae, по каналу для флуорофора R6G - наличие 14 серотипа S. pneumoniae, по каналу для флуорофора ROX - наличие 23F серотипа S. pneumoniae, по каналу для флуорофора Су5 - наличие 4 серотипа S. pneumoniae. При отрицательном результате или наличии не типируемых образцов переходят к следующему этапу.

На третьем этапе используют заявляемую мультиплексную ПЦР-смесь, которую применяют согласно заявляемому способу. При положительном результате определяют наличие 12FAB, 15 ВС, 22FA, 8 S. pneumoniae, а при отрицательном результате или наличии не типируемых образцов переходят к четвертому этапу.

На четвертом этапе используют смесь №3, которая содержит олигонуклеотиды для определения 18, 9NL, 15AF, HAD серотипов S. pneumoniae - SEQ ID NO: 37-48. По каналу для флуорофора FAM определяют наличие в биологическом материале 18 серотипа S. pneumoniae, по каналу для флуорофора R6G - наличие 9NL серотипа S. pneumoniae, по каналу для флуорофора ROX - наличие 15AF серотипа S. pneumoniae, по каналу для флуорофора Су5 - наличие 11AD серотипа S. pneumoniae.

Использование заявляемой мультиплексной ПЦР-смеси согласно описанному способу позволяет в короткие сроки и с наименьшими затратами идентифицировать максимальную долю циркулирующих серотипов инвазивных и неинвазивных форм ПИ, цирулирующих в России в настоящее время.

При этом каждая из упомянутых выше смесей может быть использована для выявления в биологическом материале фрагментов генов соответствующих серотипов S. pneumoniae отдельно.

Заявляемое решение поясняется Фиг. 1-5, на которых продемонстрированы примеры определения серотипов 12FAB, 15 ВС, 22FA, 8 S. pneumoniae с использованием методики ПЦР-РРВ:

Фиг. 1 - Детекция серотипа 12FAB (канал для флуорофора FAM);

Фиг. 2 - Детекция серотипа 15 ВС (канал для флуорофора R6G);

Фиг. 3 - Детекция серотипа 22FA (канал для флуорофора ROX);

Фиг. 4 - Детекция серотипа 8 (канал для флуорофора Су5);

Фиг. 5 - Детекция cps-положительных образцов (канал для флуорофора Су5.5)

Заявляемое решение является результатом работы в рамках исследования российских штаммов S. pneumoniae, проделанной в ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, Россия).

Эффективность заявленного способа была оценена на трех выборках российских штаммов, изолированных от больных инвазивными формами ПИ (Таблица 3). В столбце I отражены результаты определения серотипов согласно MP 4.2.0114-16 «Методические рекомендации. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика внебольничной пневмонии пневмококковой этиологии», в столбце II результаты определения серотипов согласно заявляемому решению, в столбце III результаты определения серотипов в объединенной выборке изолятов, информация о которых была опубликована в базе данных PubMLST [Public databases for molecular typing and microbial genome diversity. Электронный ресурс - URL: https://pubmlst.org/ (дата обращения:12.05.2021)]. Критериями включения изолятов в объединенную выборку были источник (больной менингитом или сепсисом) и/или биологический материал (спинномозговая жидкость или кровь); включены изоляты с минимальным идентификационным номером id9931, максимальным - id73033. Количество и доля серотипов, соответствующих серотип-специфическим мишеням, распределенным по ПЦР-смесям, представлены в Таблице 3.

Таким образом, заявляемое решение позволяет идентифицировать серотипы более 80% возбудителей инвазивных и неинвазивных форм ПИ, цирулирующих в РФ в настоящее время.

Реализация заявляемой группы изобретения поясняется следующими примерами:

Пример 1. Получение олигонуклеотидов для определения серотипов 12FAB, 15 ВС, 22FA, 8 S. pneumoniae.

Для подбора последовательностей-мишеней - мест посадки олигонуклеотидов, используют фрагменты референсных геномов серотипов 12FAB, 15 ВС, 22FA, 8 S. pneumoniae, взятые из базы данных GenBank. Для поиска консервативных последовательностей применяют современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Mega и Unipro UGENE, олигокалькуляторы (Oligo Calculators) Thermo Fisher Scientific. Составляют перечень консервативных участков, характерных только для определяемого серотипа S. pneumoniae, к которым подобирают олигонуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров, а также флоуресцентный зонд.

В качестве положительного внутреннего контроля используется фрагмент cps-локуса общего для всех серотипов S. pneumoniae SEQ ID NO: 49-51.

Анализ подобранных последовательностей с использованием ресурса Primer BLAST показал, что представленные уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-3 олигонуклеотиды амплифицируют консервативный для 12FAB серотипа участок со специфичностью 96%, представленные уникальными последовательностями SEQ ID NO: 4-6 олигонуклеотиды амплифицируют консервативный для 15 ВС серотипа участок со 100% специфичностью, олигонуклеотиды, представленные уникальными последовательностями SEQ ID NO: 7-9, амплифицируют консервативный для 22FA серотипа участок со 100% специфичностью, олигонуклеотиды, представленные уникальными последовательностями SEQ ID NO: 10-12, амплифицируют консервативный для 8 серотипа участок со 100% специфичностью.

Пример 2. Способ использования мультиплексной ПЦР-смеси для определения 12FAB, 15 ВС, 22FA, 8 S. pneumoniae.

От больных в возрасте от 1 до 89 лет, имеющих диагноз «внебольничная пневмония» в 2019-2020 годах было получено 86 культур S. pneumoniae.

Из культур выделили ДНК. Выделение ДНК проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение ДНК производили с помощью комплекта реагентов в соответствии с инструкцией производителя. Для выделения ДНК использовали комплект реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), в оптимальной концентрации ДНК для постановки ПЦР-РРВ - 10³-10⁵ копий в 10 мкл.

ПЦР-РРВ проводили в формате мультиплекс в объеме 25 мкл, с применением олигонуклеотидов праймеров и зондов, представленных в Таблице 2. В качестве положительного внутреннего контроля использовали фрагмент срт-локуса общего для всех серотипов S. pneumoniae SEQ ID NO: 49-51.

Компоненты ПЦР смешали следующим образом:

(a) 10 мкл смеси, содержащей:

- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 49, 50 - по 0,5 мкМ;

- флоуресцентные зонды SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 51 - по 0,2 мкМ;

- dNTPs - 0,44 мМ.

(b) 0,5 мкл реактива «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).

(c) 4,5 мкл ПЦР-буфера «ОТ-ПЦР-смесь-2 FEP/FRT» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).

(d) выделенная ДНК - 10 мкл.

ПЦР-РРВ проводили с флуоресцентной детекцией на приборе «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия).

Амплификацию проводили по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 5 циклов при температуре 95°С - 5 секунд / 60°С - 20 секунд / 72°С - 5 секунд, затем 40 циклов при температуре 95°С - 5 секунд / 60°С - 20 сек / 72°С - 5 секунд.

Детекцию флуоресценции проводили на этапе 60°С по 5 каналам детекции для флуорофоров FAM, R6G, ROX, Су5. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 8-10% от максимального сигнала положительного образца. Образцы, для которых кривые флуоресценции пересекали пороговую линию, и при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала являлась экспоненциальной, являются положительными.

По каналу для флуорофора FAM определили наличие 12FAB серотипа S. pneumoniae в одном образце (Фиг. 1), по каналу для флуорофора R6G определили наличие 15 ВС серотипа S. pneumoniae в восьми образцах (Фиг. 2), наличие в двух образцах 22FA серотипа S. pneumoniae определили по каналу для флуорофора ROX (Фиг. 3), по каналу для флуорофора Су5 определили наличие 8 серотипа S. pneumoniae в одном образце (Фиг. 4).

Результаты определения серотипов были подтверждены анализом данных полногеномного секвенирования с использованием программ «SeroBA» и «РneumoСаТ». Дискордантных результатов между результатами ПЦР-РРВ и результатами полногеномного секвенирования не обнаружено.

Пример 3. Способ использования заявляемой мультиплексной ПЦР-смеси в четырехэтапной ПЦР-РРВ.

Получено 90 образцов биологического материала от больных в возрасте от 1 до 89 лет, имеющих диагноз «внебольничная пневмония» в 2019-2020 годах, которые имели положительный срт-локус S. pneumoniae.

Из проб биологического материала выделили ДНК. Выделение ДНК проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение ДНК из биологического материала производили с помощью комплекта реагентов в соответствии с инструкцией производителя. Для выделения ДНК использовали комплект реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), в оптимальной концентрации ДНК для постановки ПЦР-РРВ - 10³-10⁵ копий в 10 мкл. Для каждой ПЦР-смеси в качестве положительного внутреннего контроля использовали фрагмент срт-локуса общего для всех серотипов S. pneumoniae SEQ ID N 49-51.

ПЦР-РРВ проводили в формате мультиплекс.Компоненты для каждой ПЦР смешивали следующим образом:

(a) 10 мкл смеси, содержащей: (а.а.) для смеси №1:

- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 49, 50 - по 0,5 мкМ;

- флоуресцентные зонды SEQ ID NO: 15, 18, 21, 24, 51 - по 0,2 мкМ;

- dNTPs - 0,44 мМ. (а.Ь.) для смеси №2:

- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 49, 50 - по 0,5 мкМ;

- флоуресцентные зонды SEQ ID NO: 27, 30, 33, 36, 51 - по 0,2 мкМ;

- dNTPs - 0,44 мМ. (а.с.) для смеси №3:

- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 37, 38, 40, 41, 43, 44, 46, 47, 49, 50- по 0,5 мкМ;

- флоуресцентные зонды SEQ ID NO: 39, 42, 45, 48, 51 - по 0,2 мкМ;

- dNTPs - 0,44 мМ.

(a.d) заявляемую мультиплексную ПЦР-смесь готовили, как описано в Примере 2. Общий объем каждой реакционной смеси составил 25 мкл.

(b) 0,5 мкл реактива «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).

(c) 4,5 мкл ПЦР-буфера «ОТ-ПЦР-смесь-2 FEP/FRT» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).

(d) выделенная ДНК 10 мкл.

ПЦР-РРВ проводили с флуоресцентной детекцией на приборе «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия).

Амплификацию проводили по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 5 циклов при температуре 95°С - 5 секунд / 60°С - 20 секунд / 72°С - 5 секунд, затем 40 циклов при температуре 95°С - 5 секунд / 60°С - 20 сек / 72°С - 5 секунд.

Детекцию флуоресценции проводили на этапе 60°С по 5 каналам детекции для флуорофоров FAM, R6G, ROX, Су5. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 8-10% от максимального сигнала положительного образца.

Образцы, для которых кривые флуоресценции пересекали пороговую линию, и при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала была экспоненциальной, идентифицировались как положительные. ПЦР-РРВ проводили в четыре этапа.

На первом этапе применяли смесь №1, включающую олигонуклеотиды SEQ ID NO: 13-24. Посредством смеси №1 серотипы S. pneumoniae были определены у 27 (30%) образцов, при этом по каналу для флуорофора FAM определяют наличие 3 серотипа S. pneumoniae в 6 образцах, по каналу для флуорофора R6G - наличие 6 ВА серотипа S. pneumoniae в 4 образцах, по каналу для флуорофора ROX - наличие 19F серотипа S. pneumoniae в 8 образцах, по каналу для флуорофора Су5 - наличие 9VA серотипа S. pneumoniae в 9 образцах.

На втором этапе применяли смесь №2, которая содержит олигонуклеотиды SEQ ID NO: 25-36. Посредством указанной смеси серотипы S. pneumoniae были определены у 13 (14,4%) образцов. По каналу для флуорофора FAM определили наличие 1 серотипа S. pneumoniae в 3 образцах биологического материала, по каналу для флуорофора R6G -наличие 14 серотипа S. pneumoniae в 4 образцах, по каналу для флуорофора ROX определили в 4 образцах биологического материала наличие 23F серотипа S. pneumoniae, по каналу для флуорофора Су5 - наличие 4 серотипа S. pneumoniae в 2 образцах биологического материала.

На третьем этапе использовали заявляемую мультиплексную ПЦР-смесь, которую применяли согласно заявляемому способу. На данном этапе серотипы S. pneumoniae были определены у 19 (21,1%) образцов. По каналу для флуорофора FAM определили наличие в 6 образцах биологического материала 12FAB серотипа S. pneumoniae, по каналу для флуорофора R6G - наличие 15 ВС серотипа S. pneumoniae в 4 образцах, по каналу для флуорофора ROX - наличие 22FA серотипа S. pneumoniae в 6 образцах, по каналу для флуорофора Су5 - в 3 образцах биологического материала наличие 8 серотипа S. pneumoniae.

На четвертом этапе применяли смесь №3, которая содержит олигонуклеотиды SEQ ID NO: 37-48. На данном этапе серотипы S. pneumoniae были определены у 16 (17,8%) образцов. По каналу для флуорофора FAM определили наличие в 6 образцах биологического материале 18 серотипа S. pneumoniae, по каналу для флуорофора R6G -наличие 9NL серотипа S. pneumoniae в 4 образцах, по каналу для флуорофора ROX в 6 образцах наличие 15AF серотипа S. pneumoniae, по каналу для флуорофора Су5 - наличие HAD серотипа S. pneumoniae в 3 образцах биологического материала.

Всего серотипы были определены у 75 образцов, что составляет 83,3% от всех 90 cps-положительных образцов. Нетипируемые образцы содержали ДНК S. pneumoniae серотипов 35 В, 24F, 23А, 17F, 35F, 35F, 22F, 38 и 13, то есть эти образцы были истинно отрицательными, поскольку использованные ПЦР-смеси не содержали соответствующих серотип-специфических мишеней.

Из приведенного примера явным образом следует, что упомянутые смеси №1-3 могут быть использованы в моноспецифическом формате для выявления в биологических образцах фрагментов генов соответствующих серотипов S. pneumoniae.

Указанная выборка дополнительно была проанализирована с использованием методики, описанной в MP 4.2.0114-16, и объединенной выборки изолятов, информация о которых была опубликована в базе данных PubMLST. Как продемонстрировано в Таблице 4 при использовании методики, описанной MP 4.2.0114-16 «Методические рекомендации. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика внебольничной пневмонии пневмококковой этиологии» серотипы было определены у 56 (62,6%) образцов (столбец II), при использовании объединенной выборки изолятов из PubMLST серотипы S. pneumoniae было определены у 69 (76,7%) (столбец III). Результаты серотипирования с использованием заявляемой мультиплексной ПЦР-смеси отражены в столбце II.

Таким образом, заявляемое решение позволяет идентифицировать серотипы более 80% возбудителей пневмококковой инфекции, циркулирующих в РФ в 2019-2020 годах.

Заявляемая мультиплексная ПЦР-смесь для определения серотипов 12FAB, 15ВС, 22FA, 8 S. pneumoniae и способ ее применения позволяют в короткие сроки и с наименьшими затратами идентифицировать максимальную долю циркулирующих серотипов ПИ, кроме того обеспечивают минимальный риск контаминации при проведении исследования и исключают субъективность при оценке результатов.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к лабораторным методам определения серотипов Streptococcus pneumoniae и может быть использовано для молекулярной диагностики циркулирующих штаммов пневмококковой инфекции (ПИ), проведения микробиологического мониторинга и решения научно-исследовательских задач по изучению пневмококковых инфекций. Предложена мультиплексная ПЦР-смесь для определения серотипов 12FAB, 15ВС, 22FA, 8 Streptococcus pneumonia и способ применения мультиплексной ПЦР-смеси. Определение серотипов 12FAB, 15ВС, 22FA, 8 S. pneumoniae осуществляют посредством мультиплексной ПЦР-смеси, содержащей оригинальные последовательности олигонуклеотидов SEQ ID NO: 1-12. Изобретение позволяет повысить эффективность обнаружения фрагментов ДНК четырех серотипов S. Pneumoniae - 12FAB, 15ВС, 22FA, 8 методом ПЦР-РРВ в мультиплексном формате, обеспечивает минимальный риск контаминации при проведении исследования и исключает субъективность при оценке результатов. Кроме того, позволяет в короткие сроки идентифицировать максимальную долю циркулирующих серотипов ПИ2. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 табл., 2 пр.

1. Мультиплексная ПЦР-смесь для определения серотипов 12FAB, 15ВС, 22FA, 8 Streptococcus pneumoniae, включающая положительный внутренний контроль, содержащий фрагмент cps-локуса общего для всех серотипов S. pneumoniae SEQ ID NO: 49-51, а также:

- олигонуклеотиды для определения 12FAB серотипа S. pneumoniae, имеющие следующий нуклеотидный состав: прямой праймер (12FABF) - SEQ ID NO: 1, обратный праймер (12FABR) - SEQ ID NO: 2, флоуресцентный зонд (12FABZ) - SEQ ID NO: 3;

- олигонуклеотиды для определения 15ВС серотипа S. pneumoniae, имеющие следующий нуклеотидный состав: прямой праймер (15BCF) - SEQ ID NO: 4, обратный праймер (15BCR) - SEQ ID NO: 5, флоуресцентный зонд (15BCZ) - SEQ ID NO: 6:

- олигонуклеотиды для определения 22FA серотипа S. pneumoniae, имеющие следующий нуклеотидный состав: прямой праймер (22FAF) - SEQ ID NO: 1, обратный праймер (22FAR) - SEQ ID NO: 8, флоуресцентный зонд (22FAZ) - SEQ ID NO: 9;

- олигонуклеотиды для определения 8 серотипа S. pneumoniae, имеющие следующий нуклеотидный состав: прямой праймер (8F) - SEQ ID NO: 10, обратный праймер (8R) - SEQ ID NO: 11, флоуресцентный зонд (8Z) - SEQ ID NO: 12.

2. Способ применения мультиплексной ПЦР-смеси по п. 1, включающий выделение ДНК из биологического материала и проведение ПЦР-РРВ в мультиплексном формате с олигонуклеотидами по п. 1, амплификацию, анализ и интерпретацию результатов путем оценки по кривым накопления флуоресцентного сигнала по каждому из заданных для образцов каналов: FAM, R6G, ROX, Су5; где наличие в изучаемом биологическом образце фрагмента гена того или иного серотипа S. pneumoniae определяют по уровню сигнала флуоресценции определенного зонда: по каналу FAM - для 12FAB серотипа S. pneumoniae, по каналу R6G - для 15ВС серотипа S. pneumoniae, по каналу ROX - для 22FA серотипа S. pneumoniae, по каналу Су5 - для 8 серотипа V. pneumoniae.

3. Способ по п. 2, при котором для его осуществления дополнительно применяют олигонуклеотиды SEQ ID NO: 13-48 для приготовления мультиплексных ПЦР-смесей и распределяют следующим образом: смесь №1 - SEQ ID NO: 13-24, смесь №2 - SEQ ID NO: 25-36, смесь №3 - SEQ ID NO: 37-48, положительный внутренний контроль, содержащий фрагмент cps-локуса общего для всех серотипов S. pneumoniae SEQ ID NO: 49-51, используют для каждой мультиплексной ПЦР-смеси, а ПЦР-РРВ проводят в четыре этапа, где:

- на первом этапе применяют смесь №1, при этом положительный результат указывает наличие в изучаемом биологическом образце фрагментов генов 3, 6ВА, 19F, 9VA серотипов S. pneumoniae, а при отрицательном результате или при наличии не типируемых образцов переходят к следующему этапу;

- на втором этапе используют смесь №2, при этом положительный результат указывает на наличие в изучаемом биологическом образце фрагментов генов 1, 14, 2BF, 4 серотипов S. pneumoniae, а при отрицательном результате или при наличии не типируемых образцов переходят к следующему этапу

- на третьем этапе используют мультиплексную ПДР-смесь по п. 1, которую применяют способом по п. 2, а при отрицательном результате или при наличии не типируемых образцов переходят к следующему этапу;

- на четвертом этапе используют смесь №3, при этом положительный результат указывает на наличие в изучаемом биологическом образце фрагментов генов 18, 9NL, 15AF, HAD серотипов S. pneumoniae.

4. Способ по пп. 2, 3, где для анализа результатов задают пороговую линию, соответствующую величине 8-10% от максимального сигнала положительного образца.