СПОСОБ СТЕРИЛИЗАЦИИ СЕМЯН И ПОЧЕК КЕДРА ЛИВАНСКОГО (CEDRUS LIBANI) Российский патент 2022 года по МПК A01H4/00 

Описание

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к микроклональному размножению хвойных культур. Способ включает выдерживание семян и почек кедра ливанского перед их вводом в культуру in vitro в размягчителе тканей, который представлен водным раствором (3%) трихлоруксусной кислоты (CCl₃COOH), с экспозицией в растворе ТХУ 5 минут и последующим отмыванием в дистиллированной воде 10 минут, далее высаживают экспланты на питательную среду WPM, модифицированную регуляторами роста 2,4-Д (2 мг/л) и 6-БАП (1 мг/л) и обогащенную мезоинозитом - 100 мг/л и глутаминовой кислотой - 500 мг/л.

Способ обеспечивает увеличение доли регенерированных микропобегов in vitro у эксплантов (семян и почек) кедра ливанского (табл. 1).

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микроклональному размножению редких декоративных хвойных культур и может быть использовано для размножения кедра ливанского (Cedrus Libani).

Известен способ подготовки семян хвойных растений к проращиванию, при котором семена замачивают в растворах сернокислых солей меди и кобальта. Водные растворы данных элементов должны иметь концентрацию 0,01-0,03%. Замачивание семян проводится в течение 18-24 ч. Семена обрабатывают в день посева и подсушивают в затененном месте до сыпучего состояния [Выполнение работ по профессии «Лесовод»: учебное пособие для спо. - 2-е изд., стер. - Санкт-Петербург: Лань, 2021. - 152 с.].

К недостаткам способа относятся длительность и трудоемкость проведения работ, что, в итоге, повышает цену на посадочный материал. К недостаткам способа можно отнести и то, что он не испытан на другом типе эксплантов на почках хвойных пород.

Также известен способ подготовки семян сосны обыкновенной к введению в культуру in vitro, с применением биопрепаратов: Нанокремний, Эко-Стим, Зеребро Агро, Фитолин. Контрольным вариантом подготовки семян используется метод снегования, принятый в лесном хозяйстве. [Карасева Т.А. Применение биотехнологических методов подготовки семян сосны обыкновенной к посеву в лесовосстановлении // в сборнике: «От биопродуктов к биоэкономике». Материалы III межрегиональной научно-практической конференции (с международным участием). Под редакцией А.Н. Лукьянова. 2019. С. 296-302.].

Недостаток данного метода в отсутствии подробных рекомендаций по применению данных биопрепаратов для кедра ливанского.

В связи с этим оптимизация технологии микроклонального размножения кедра ливанского представляет интерес. Кроме того, в качестве препаратов, размягчающих семена и почки хвойных растений, испытано только небольшое количество веществ, тогда как другие так же могут обладать подобными свойствами.

Наиболее близким является способ обработки семян сосны «Крымской» в растворе электрохимически активированной воды с рН 10-11 и показателем окислительно-восстановительного потенциала -400 мВ. [RU 2737352 С1 27.11.2020]

Недостатком прототипа является сложность технологии и невозможность ее широкого применении, особенно при технологии in vitro.

Техническим результатом является ускорение прорастания семян в условиях in vitro, позволяющий увеличить выход и улучшить качество растений-регенерантов кедра ливанского.

Технический результат достигается тем, что семена, перед вводом в культуру in vitro, размягчают водным раствором (3%) трихлоруксусной кислоты (CCl₃COOH) с экспозицией в растворе ТХУ 5 минут и последующим отмыванием в дистиллированной воде.

Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что в качестве размягчителя тканей используют 3%-ный водный раствор трихлоруксусной кислоты (CCl₃COOH).

Признаки, отличающее заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ рекомендовано использовать в сельскохозяйственной биотехнологии, в частности, в микроклональном размножении хвойных культур для быстрого получения растений-регенерантов, что соответствует критерию «промышленная применимость».

Способ размягчения тканей эксплантов кедра ливанского осуществляют следующим образом.

Водный раствор 3%-ной трихлоруксусной кислоты (CCl₃COOH) испытывали на семенах и почках кедра ливанского.

Схема опыта: обработка дистиллированной водой (контроль); трихлоруксусной кислотой - 1%, 3%, 5%.

Предварительно семена и почки заготавливали с материнских растений кедра ливанского. Осуществляли транспортировку в холодильной камере. После этого промывали в проточной воде.

В соответствие со схемой опыта семена и почки замачивали в водном растворе 1, 3, 5%-ной трихлоруксусной кислоты (CCl₃COOH) соответственно, с экспозицией в растворе ТХУ 5 минут и последующим отмыванием в дистиллированной воде 10 минут. Контрольные семена и почки кедра ливанского обрабатывали дистиллированной водой. Слой жидкости во всех случаях составлял около 5 см, продолжительность обработки 5 минут.

После обработки трихлоруксусной кислотой (CCl₃COOH) экспланты стерилизовали.

Стерилизованные экспланты сажали в пенициллинки на питательную среду WPM по 20 пенициллинок с семенами и 15 с почками. Пенициллинки находились в климатической комнате, микроклимат помещения характеризовался следующими показателями: освещенность 3000 люкс, температура 24±20С. Фотопериод поддерживался как 16-часовой, 8 часов - затемнение. Влажность воздуха - 70%.

При инициации микропобегообразования уровень регуляторов роста составлял: 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) - 2 мг/л (Sigma-Aldrich, США) и 6-бензоаминопурина (6-БАП) - 1 мг/л (Sigma-Aldrich, США). Питательную среду обогащали мезоинозитом - 100 мг/л и глутаминовой кислотой - 500 мг/л. Содержание сахарозы задавали 30 г/л (ПАО «Шосткинский завод хим. реактивов», Украина). Питательные среды доводили до рН=5,8, затем автоклавировали (121°С, 110 кРа, 20 мин).

Культивирование проводили в пенициллинках, затем пассировали в стеклянные банки объемом 0, 25 л. Длительность пассажа на этапе инициации составляла 4 недели.

Таким образом, установили, что обработка плотных покровных тканей семян и вегетативных почек 3%-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ) размягчает обработанный материал с сохранением его жизнеспособности и повышает уровень регенерации in vitro эксплантов кедра ливанского (Cedrus libani) до 60-66%, при контрольных показателях (обработка дистиллированной водой) 5-6% регенерированных микропобегов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ микроклонального размножения кедра ливанского (Cedrus libani), заключающийся в выдерживании семян и почек кедра ливанского перед их вводом в культуру in vitro в размягчителе тканей, который представлен водным раствором (3%) трихлоруксусной кислоты (CCl₃COOH), с экспозицией в растворе ТХУ 5 минут и последующим отмыванием в дистиллированной воде 10 минут. Изобретение позволяет ускорить прорастания семян в условиях in vitro и позволяет увеличить выход и улучшить качество растений-регенерантов кедра ливанского. 1 табл.

Способ микроклонального размножения хвойных пород, отличающийся тем, что в качестве хвойных пород используют кедр ливанский (Cedrus libani), осуществляют подготовку, затем вводят экспланты кедра ливанского в виде семян и почек в культуру in vitro путём их посадки на питательную среду WPM, семена и почки перед вводом в культуру in vitro размягчают водным раствором 3%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ) с экспозицией в растворе 5 минут и последующим отмыванием в дистиллированной воде в течение 10 минут.