КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ ФОРМА СОЕДИНЕНИЯ 1H-ИМИДАЗО[4,5-B]ПИРИДИН-2(3H)-ОНА И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2022 года по МПК C07D471/04 A61K31/519 A61P29/00 A61P37/00 

Перекрестная ссылка на родственную заявку

По настоящей заявке испрашивается приоритет следующей заявки:

китайская заявка № 201810085704.1, поданная 29 января 2018 года.

Область техники, к которой относится изобретение

Представлены кристаллическая Форма соединения 1H-имидазо[4,5-b]пиридин-2(3H)-она и способ ее получения, а также применение кристаллической формы для получения лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с PDE4.

Предпосылки создания изобретения

Фактор некроза опухоли (TNFα) представляет собой цитокин, высвобождаемый преимущественно моноцитами и макрофагами в ответ на иммунную стимуляцию. TNFα может промотировать большинство процессов клеточной дифференциации, рекрутинга, пролиферации и разрушения белка. TNFα имеет защитный эффект против инфекционных агентов, опухолей и повреждения ткани при низком уровне. Однако чрезмерное высвобождение TNFα может также вызывать заболевание. Например, при введении млекопитающим или человеку TNFα может вызывать или обострять воспаление, лихорадку, сердечно-сосудистые проблемы, кровотечение, свертывание крови и острые реакции, подобные острой инфекции и шоку. Продукция избыточного или неконтролируемого TNFα у животных или людей часто указывает на следующие заболевания: эндотоксемия и/или синдром токсического шока, кахексия, респираторный стресс-синдром у взрослых, рак (такой как солидные опухоли и гематологические опухоли), болезнь сердца (такая как застойная сердечная недостаточность), вирусная инфекция, генетическое заболевание, воспалительное заболевание, аллергическое заболевание или аутоиммунное заболевание.

Рак представляет собой заболевание с особой деструктивностью, и повышение уровня TNFα в крови указывает на риск рака или метастазирования. Как правило, раковые клетки не могут выжить в системе кровообращения здорового субъекта, и одна из причин заключается в том, что внутренняя стенка кровеносных сосудов служит барьером для экстравазации раковых клеток. Исследования показали, что ELAM-1 на эндотелиальных клетках может опосредовать адгезию клеток рака толстой кишки к эндотелию, подвергаемому действию цитокинов.

Циклический аденозинмонофосфат (cAMP) играет роль во многих заболеваниях и расстройствах. Увеличение концентрации cAMP в лейкоцитах в процессе воспаления подавляет активацию лейкоцитов и впоследствии высвобождает воспалительные регуляторные факторы, включая TNFα и NF-κB. Повышенный уровень cAMP также приводит к релаксации гладких мышц дыхательных путей.

Основной клеточный механизм инактивации cAMP обусловлен разрушением cAMP семейством изозимов, называемых циклическими нуклеотидфосфодиэстеразами (PDE). Известно, что семейство PDE включает 11 членов. К настоящему времени доказано, что ингибирование фермента PDE4 является особенно эффективным для ингибирования высвобождения медиаторов воспаления и релаксации гладких мышц дыхательных путей, и поэтому фермент PDE4 стал одной из популярных мишеней для лекарственных средств. Согласно другому генетическому кодированию, семейство PDE-4 можно разделить на 4 подтипа (PDE-4A, B, C, D). Среди них экспрессия PDE-4A, PDE-4B и PDE-4D в воспалительных клетках (таких как B-клетки, T-клетки и нейтрофилы) сильнее, чем в PDE-4C. Ингибирование фермента PDE4 приводит к повышению уровней cAMP, регулируя тем самым уровень TNFα так, чтобы лечить заболевания.

Сущность изобретения

В одном аспекте представлена кристаллическая Форма A соединения 1, где кристаллическая Форма A имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, имеющую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 14,10±0,2°, 19,07±0,2°, 21,79±0,2°.

Соединение 1

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим раскрытием кристаллическая Форма A соединения 1 имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, имеющую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 10,69±0,2°, 12,31±0,2°, 13,45±0,2°, 14,10±0,2°, 14,62±0,2°, 19,07±0,2°, 20,33±0,2°, 21,79±0,2°.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим раскрытием кристаллическая Форма A соединения 1 имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, имеющую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 6,25±0,2°, 8,93±0,2°, 10,69±0,2°, 12,31±0,2°, 13,45±0,2°, 14,10±0,2°, 14,62±0,2°, 18,16±0,2°, 19,07±0,2°, 20,33±0,2°, 21,79±0,2°.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим раскрытием кристаллическая Форма A соединения 1 имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, показанную на Фиг. 1.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим раскрытием кристаллическая Форма A соединения 1 имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму с данными анализа, показанными в Таблице 1

Таблица 1
Данные анализа рентгеновской порошковой дифрактограммы кристаллической Формы A соединения 1 № Угол 2θ (°) Межплоскостное
расстояние (Å) Относительная интенсивность (%) № Угол 2θ (°) Межплоскостное
расстояние (Å) Относительная интенсивность (%) 1 6,250 14,1293 21,2 21 24,713 3,5995 17,3 2 8,932 9,8927 19,2 22 24,930 3,5686 14,4 3 9,425 9,3754 9,8 23 25,622 3,4739 14,8 4 10,690 8,2687 45,3 24 26,922 3,3090 14,6 5 12,306 7,1868 45,9 25 27,220 3,2734 10,6 6 12,660 6,9865 29,3 26 28,010 3,1829 22,1 7 13,449 6,5783 38,0 27 28,324 3,1483 26,0 8 14,098 6,2769 100,0 28 29,410 3,0344 7,5 9 14,615 6,0558 28,8 29 29,942 2,9817 11,6 10 15,162 5,8386 11,5 30 30,854 2,8957 5,3 11 17,417 5,0874 5,7 31 31,459 2,8414 2,1 12 18,162 4,8805 24,3 32 32,250 2,7735 3,0 13 18,796 4,7173 28,0 33 32,725 2,7342 2,5 14 19,072 4,6496 72,4 34 33,082 2,7056 2,2 15 20,333 4,3639 32,1 35 33,379 2,6822 3,6 16 20,728 4,2817 27,7 36 34,167 2,6221 3,6 17 21,794 4,0746 68,2 37 35,525 2,5249 2,7 18 22,739 3,9074 9,9 38 35,902 2,4993 3,0 19 22,998 3,8639 13,1 39 36,988 2,4283 2,6 20 24,261 3,6656 20,0 40 37,462 2,3987 3,3

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим раскрытием кристаллическая Форма A соединения 1 имеет кривую дифференциальной сканирующей калориметрии, имеющую точку начала эндотермического пика при 201,70°C±2°C.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим раскрытием кристаллическая Форма A соединения 1 имеет кривую DSC, показанную на Фиг. 2.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим раскрытием кристаллическая Форма A соединения 1 имеет кривую термогравиметрического анализа, где потеря массы при 100,00±2°C составляет 0,02039%.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим раскрытием кристаллическая Форма A соединения 1 имеет кривую TGA, показанную на Фиг. 3.

В другом аспекте представлен способ получения кристаллической Формы A, включающий добавление соединения 1 в спиртовой растворитель, кетоновый растворитель, эфирный растворитель, смешанный растворитель, состоящий из спиртового растворителя и воды, смешанный растворитель, состоящий из кетонового растворителя и воды, или смешанный растворитель, состоящий из эфирного растворителя и воды; нагревание для растворения и затем охлаждение для кристаллизации с получением кристаллической Формы A.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим раскрытием спиртовой растворитель выбран из группы, состоящей из метанола, этанола и изопропанола.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим раскрытием кетоновый растворитель выбран из группы, состоящей из ацетона и бутанона.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим раскрытием эфирный растворитель выбран из группы, состоящей из диметилового эфира гликоля.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим раскрытием смешанный растворитель, состоящий из спиртового растворителя и воды, выбран из группы, состоящей из смешанного растворителя, состоящего из этанола и воды.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим раскрытием в смешанном растворителе, состоящем из спиртового растворителя и воды, объемное соотношение спиртового растворителя и воды выбрано из группы, состоящей из 1:0,2-1,5.

Еще в одном аспекте представлено применение кристаллической формы A соединения 1 для получения лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с PDE4 рецептором.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим раскрытием заболевание, связанное с PDE4, включает псориаз, псориатический артрит, хроническую обструктивную пневмонию, анкилозирующий спондилит, воспалительное заболевание кишечника.

Технический эффект

Кристаллическая Форма A соединения 1 обладает хорошей стабильностью, низкой гигроскопичностью и потенциальной возможностью создания лекарства. Кристаллическая Форма A соединения 1 демонстрирует хорошую стабильность в спиртовом растворителе, ацетонитриле, ацетоне, этилацетате, тетрагидрофуране, смешанном растворителе, состоящем из спиртового растворителя и воды, смешанном растворителе, состоящем из ацетонитрила и воды, или смешанном растворителе, состоящем из ацетона и воды. Кристаллическая Форма A соединения 1 демонстрирует хорошую стабильность в условиях ускоренного испытания 40ºC/относительной влажности 75%. кристаллическая Форма A соединения 1 демонстрирует хорошую стабильность в условиях долгосрочного хранения при 25ºC/относительной влажности 60%.

Соединение 1 демонстрирует отличную активность in vitro, направленную на ингибирование фосфодиэстеразы подтипа 4B (PDE4B). Кроме того, соединение 1 демонстрирует отличную активность in vitro, направленную на ингибирование продукции TNFα в hPBMC, которая выше, чем у Апремиласта. Соединение 1 в трех дозовых группах 0,3, 1 и 3 мг/кг существенно улучшает симптомы коллаген-индуцированного артрита. Кроме того, соединение 1 в дозовых группах 1 мг/кг и 3 мг/кг демонстрирует существенное улучшение патологии артрита. Эти три дозовые группы демонстрируют очевидную взаимосвязь доза-эффект при оценке патологии артрита. Терапевтический эффект соединения 1 при 3 мг/кг (клиническая оценка и оценка патологии артрита) лучше, чем у Апремиласта при 5 мг/кг.

Общие определения

Если не указано иное, следующие термины и фразы имеют следующие определения. Конкретный термин или фраза не должны рассматриваться как неопределенные или неясные без конкретного определения и должны пониматься в соответствии с обычными значениями. Используемое торговое наименование должно относиться к соответствующему изделию или активному ингредиенту.

Промежуточные соединения могут быть получены различными способами синтеза, хорошо известными специалистам в данной области, включая конкретные варианты осуществления, перечисленные ниже, варианты осуществления в комбинации с другими способами химического синтеза и эквивалентные альтернативы, хорошо известные специалистам в данной области техники. Предпочтительные варианты осуществления включают, но не ограничиваются этим, Примеры, представленные ниже.

В конкретных вариантах осуществления химическую реакцию осуществляют в подходящем растворителе, и растворитель должен быть подходящим для химических изменений настоящего раскрытия и требуемых реагентов и материалов. Для получения соединения по настоящему изобретению специалист в данной области может модифицировать или выбрать стадию синтеза или схему реакции на основе представленных вариантов осуществления.

Настоящее раскрытие будет описано подробно, и Примеры не должны рассматриваться как его ограничение.

Растворители, используемые в настоящем изобретении, являются коммерчески доступными и могут использоваться без дальнейшей очистки.

Используются следующие аббревиатуры: DMF: диметилформамид; MsOH: метансульфоновая кислота; EtOH: этанол; NaOH: гидроксид натрия.

Соединения названы вручную или с использованием программного обеспечения ChemDraw®. Провайдеры используют названия соединений по каталогу.

Рентгеновский порошковый дифрактометр, XRPD

Устройство: Рентгеновский дифрактометр BRUKER D8 advance

Метод испытания: Для XRPD детекции используют около 10-20 мг образца.

Конкретные XRPD параметры являются следующими:

Излучающая трубка: Cu, kα, (λ=1,54056Ǻ).

Напряжение излучающей трубки: 40 кВ, ток излучающей трубки: 40 мА

Щель расходимости: 0,60 мм

Щель детектора: 10,50 мм

Антирассеивающая щель: 7,10 мм

Диапазон сканирования: 4-40 град.

Размер шага: 0,02 град.

Время/шаг: 0,12 сек

Скорость вращения предметного столика: 15 об/мин

Дифференциальный сканирующий калориметр, DSC

Устройство: Дифференциальный сканирующий калориметр TA Q2000

Метод испытания: Образец (около 1 мг) помещают в DSC алюминиевую чашу для испытания, под 50 мл/мин потоком N₂, нагревают от 25°C до 350°C при скорости нагрева 10°C/мин.

Термогравиметрический анализатор, TGA

Устройство: Термогравиметрический анализатор TA Q5000IR

Метод испытания: Образец (2-5 мг) помещают в TGA платиновую чашу для испытания, под 25 мл/мин потоком N₂, нагревают от комнатной температуры до 350°C при скорости нагрева 10°C/мин.

Динамическая сорбция паров, DVS

Устройство: Анализатор динамической сорбции паров SEM Advantage-1

Условия испытания: Образец (10-20 мг) помещают в DVS диск образцов для испытания.

Конкретные DVS параметры являются следующими:

Температура: 25°C

Весы: dm/dt=0,01%/мин (мин.: 10 мин, макс.: 180 мин)

Сушка: сушка при 0% RH в течение 120 мин

RH (%) тестируемый градиент: 10%

RH (%) тестируемый диапазон градиента: 0% - 90% - 0%

Гигроскопичность подразделяют на следующие категории:

Категория гигроскопичности ΔW% Переход в жидкое состояние Абсорбирование достаточного количества воды для образования жидкости Очень гигроскопичный ΔW% ≥ 15% Гигроскопичный 15% > ΔW% ≥ 2% Слегка гигроскопичный 2% > ΔW% ≥ 0,2% Негигроскопичный или немного гигроскопичный ΔW% < 0,2% Примечание: ΔW% относится к гигроскопичному увеличению массы испытываемого образца при 25±1°C и 80±2% RH

Метод определения содержания

Устройство: Высокоэффективный жидкостный хроматограф Agilent 1260 с DAD детектором или высокоэффективный жидкостный хроматограф Shimadzu LC-20A с PDA детектором

Конкретные хроматографические параметры являются следующими:

Хроматографическая колонка: Agilent Eclipse plus C18 (4,6мм × 150мм, 3,5мкм)

Температура колонки: 40°C

Скорость потока: 1,0 мл/мин

Длина волны детектора: 230 нм

Объем вводимой пробы: 10 мкл

Время регистрации хроматограммы: 60 мин

Подвижная фаза A: 0,04% водный раствор трифторуксусной кислоты (об/об)

Подвижная фаза B: ацетонитрил

Разбавитель: ацетонитрил:очищенная вода=3:1(об/об)

Раствор для промывки: ацетонитрил:очищенная вода =3:1(об/об)

Процедура градиентного элюирования:

Время (мин) Подвижная фаза A (%) Подвижная фаза B (%) 0,00 85 15 30,00 70 30 50,00 30 70 55,00 15 85 55,01 85 15 60,00 85 15

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 демонстрирует рентгеновскую порошковую дифрактограмму, полученную с использованием Cu-Kα излучения, кристаллической формы A соединения 1.

Фиг. 2 демонстрирует кривую DSC кристаллической формы A соединения 1.

Фиг. 3 демонстрирует кривую TGA кристаллической формы A соединения 1.

Фиг. 4 демонстрирует кривую DVS кристаллической формы A соединения 1.

Примеры

Следующие Примеры представлены для лучшей иллюстрации для лучшего понимания настоящего изобретения. Конкретные варианты осуществления не следует рассматривать как ограничение настоящего изобретения.

Пример 1: Получение кристаллической Формы A соединения 1

Стадия 1: Синтез соединения 3

При комнатной температуре соединение b (10,00 г, 39,77 ммоль), соединение 2 (9,78 г, 35,79 ммоль) и диизопропиламин (10,28 г, 79,53 ммоль, 13,89 мл) растворяли в N,N-диметилформамиде (200,00 мл), смесь продували азотом три раза и реакционную смесь нагревали до 120°C в защитной атмосфере азота при перемешивании в течение 16 ч. После завершения реакции реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли воду (400 мл) и экстрагировали этилацетатом (200 мл ×3). Органические фазы объединяли и промывали насыщенным солевым раствором (100 мл ×3), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали для удаления осушителя. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток подвергали колоночной хроматографии (элюент: этилацетат/петролейный эфир=1/4-1/2, объемное отношение) с получением целевого соединения 3.

MS-ESI m/z: 509,8 [M+Na]⁺, 511,8 [M+Na+2]⁺. ¹H ЯМР (400МГц, CDCl₃) δ: 8,27 (с, 1H), 7,27 (д, J=6,8 Гц, 1H), 6,90-6,86 (м, 2H), 6,81 (д, J=8,0 Гц, 1H), 5,72 (кв., J=6,4 Гц, 1H), 4,04 (кв., J=6,8 Гц, 2H), 3,80 (с, 3H), 3,68 (дд, J=6,6, 14,6 Гц, 1H), 3,40 (дд, J=6,4, 14,8 Гц, 1H), 2,52 (с, 3H), 2,45 (с, 3H), 1,40 (т, J=7,0 Гц, 3H).

Стадия 2: Синтез соединения 4

При комнатной температуре соединение 3 (12,10 г, 24,78 ммоль) и o-фторфенилбороновую кислоту (5,20 г, 37,17 ммоль) растворяли в диоксане (150,00 мл) и воде (50,00 мл), затем добавляли карбонат калия (10,27 г, 74,34 ммоль) и комплекс дихлорида [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]палладия с дихлорметаном (2,02 г, 2,48 ммоль) в защитной атмосфере азота. Реакционную смесь нагревали в защитной атмосфере азота до 80°C при перемешивании в течение 14 ч. После завершения реакции реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли воду (500 мл) и экстрагировали этилацетатом (300 мл ×3). Органические фазы объединяли, сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали для удаления осушителя. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток подвергали колоночной хроматографии (элюент: этилацетат/петролейный эфир=1/10-1/4, объемное отношение) с получением целевого соединения 4.

MS-ESI m/z: 504,1 [M+H]⁺. ¹H ЯМР (400МГц, CDCl₃) δ: 8,07 (с, 1H), 7,42 (д, J=6,8 Гц, 1H), 7,38-7,30 (м, 1H), 7,18-7,06 (м, 3H), 6,98-6,89 (м, 2H), 6,83 (д, J=8,4 Гц, 1H), 5,82 (кв., J=6,6 Гц, 1H), 4,13-4,00 (м, 3H), 3,81 (с, 3H), 3,43 (дд, J=6,4, 14,7 Гц, 1H), 2,55 (с, 3H), 2,23 (с, 3H), 1,41 (т, J=7,0 Гц, 3H).

Стадия 3: Синтез соединения 5

При комнатной температуре к соединению 4 (9,20 г, 18,27 ммоль) и хлориду аммония (9,77 г, 182,70 ммоль) добавляли метанол (200,00 мл) и добавляли цинковый порошок (11,95 г, 182,70 ммоль) 20 партиями при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 16 ч. После завершения реакции реакционную смесь фильтровали для удаления цинкового порошка и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток растворяли в дихлорметане (200 мл). Суспензию фильтровали для удаления нерастворимых веществ и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением соединения 5.

MS-ESI m/z: 474,0 [M+H]⁺. ¹H ЯМР (400МГц, CDCl₃) δ: 7,55 (с, 1H), 7,42-7,32 (м, 1H), 7,20 (д, J=4,8 Гц, 2H), 7,13 (т, J=9,0 Гц, 1H), 7,08-7,03 (м, 2H), 6,88 (д, J=8,8 Гц, 1H), 5,70 (с, 1H), 4,19-4,07 (м, 2H), 4,00-3,90 (м, 1H), 3,87 (с, 3H), 3,58 (дд, J=6,0, 14,4 Гц, 1H), 2,78 (с, 3H), 2,05 (с, 3H), 1,47 (т, J=7,2 Гц, 3H).

Стадия 4: Синтез соединения 1

При комнатной температуре соединение 5 (9,30 г, 19,64 ммоль) и триэтиламин (19,87 г, 196,40 ммоль) растворяли в тетрагидрофуране (200,00 мл). Реакционную смесь охлаждали до 0°C и добавляли по каплям раствор трифосгена (2,33 г, 7,86 ммоль) в тетрагидрофуране (50,00 мл). Тетрагидрофурановый (50,00 мл) раствор добавляли по каплям к описанному выше реакционному раствору. После добавления реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 3 ч в защитной атмосфере азота. После завершения реакции к реакционной смеси добавляли воду (200 мл) и экстрагировали этилацетатом (100 мл ×3). Органические фазы объединяли, сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали для удаления осушителя. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток подвергали колоночной хроматографии (элюент: этилацетат/петролейный эфир=1/3-2/1, объемное отношение) с получением соединения 1.

¹H ЯМР (400МГц, CDCl₃) δ: 10,13-10,01 (м, 1H), 7,87 (с, 1H), 7,39-7,32 (м, 1H), 7,31 (д, J=1,6 Гц, 1H), 7,18-7,15 (м, 3H), 7,11 (т, J=9,2 Гц, 1H), 6,74 (д, J=8,4 Гц, 1H), 6,14 (дд, J=4,8, 9,6 Гц, 1H), 4,86 (дд, J=9,4, 14,6 Гц, 1H), 4,09-3,97 (м, 2H), 3,88 (дд, J=4,4, 14,8 Гц, 1H), 3,76 (с, 3H), 2,70 (с, 3H), 2,16 (с, 3H), 1,35 (т, J=7,0 Гц, 3H).

Стадия 5: Получение кристаллической Формы A соединения 1

При комнатной температуре к соединению 1 (6,45 г, 12,91 ммоль) добавляли воду (160,00 мл) и этанол (170,00 мл) и реакционную смесь перемешивали при 90°C в течение 0,5 ч. Реакционный раствор постепенно становился прозрачным в процессе перемешивания. Реакционную смесь медленно охлаждали до 20°C при перемешивании и перемешивание продолжали при 20°C в течение 16 ч, в течение этого времени осаждалось много белых твердых частиц. Белые твердые частицы собирали фильтрованием и сушили в вакуумной печи при 45°C в течение 18 ч с получением кристаллической Формы A соединения 1.

MS-ESI m/z: 500,2 [M+H]⁺. ¹H ЯМР (400МГц, CDCl₃) δ: 9,97 (с, 1H), 7,94 (с, 1H), 7,46-7,39 (м, 1H), 7,38 (д, J=1,6 Гц, 1H), 7,26-7,22 (м, 3H), 7,17 (т, J=9,0 Гц, 1H), 6,81 (д, J=8,0 Гц, 1H), 6,22 (дд, J=4,8, 9,6 Гц, 1H), 4,93 (дд, J=9,6, 14,8 Гц, 1H), 4,13-4,03 (м, 2H), 3,95 (дд, J=4,8, 14,8 Гц, 1H), 3,83 (с, 3H), 2,77 (с, 3H), 2,23 (с, 3H), 1,42 (т, J=7,0 Гц, 3H).

Экспериментальный пример 1: Испытания стабильности кристаллической Формы A в различных растворителях

50 мг кристаллической Формы A несколькими порциями добавляли в один растворитель или смешанные растворители, указанные в следующей таблице, перемешивали при 40°C в течение 2 дней и центрифугировали. Твердые вещества во всех образцах собирали и сушили в вакуумной сушильной печи (40°C) в течение ночи. Кристаллические формы тестировали для XRPD. Результаты показаны в Таблице 2.

Таблица 2
Испытания стабильности кристаллической Формы A в различных растворителях № Растворитель Добавленный растворитель (мл) Состояние (через 2 дня) Кристаллическая форма 1 Метанол 0,4 Суспензия Кристаллическая Форма A 2 Этанол 0,4 Суспензия Кристаллическая Форма A 3 Ацетонитрил 0,4 Суспензия Кристаллическая Форма A 4 Ацетон 0,4 Суспензия Кристаллическая Форма A 5 Этилацетат 0,4 Суспензия Кристаллическая Форма A 6 Тетрагидрофуран 0,3 Суспензия Кристаллическая Форма A 7 Метанол:Вода (3:1) 0,4 Суспензия Кристаллическая Форма A 8 Этанол:Вода (3:1) 0,4 Суспензия Кристаллическая Форма A 9 Ацетонитрил:Вода (1:1) 0,4 Суспензия Кристаллическая Форма A 10 Ацетон:Вода (1:2) 0,4 Суспензия Кристаллическая Форма A

Заключение: Кристаллическая Форма A соединения 1 демонстрирует хорошую стабильность в спиртовом растворителе, ацетонитриле, ацетоне, этилацетате, тетрагидрофуране, смешанном растворителе, состоящем из спиртового растворителя и воды, смешанном растворителе, состоящем из кетонового растворителя и воды, смешанном растворителе, состоящем из ацетонитрила и воды, или смешанном растворителе, состоящем из ацетона и воды.

Экспериментальный пример 2: Испытание на гигроскопичность кристаллической Формы A соединения 1

Материалы:

Анализатор динамической сорбции паров SEM DVS Advantage-1

Процедуры:

10-20 мг кристаллической Формы A соединения 1 помещали в диск для образцов DVS для испытания.

Результаты:

DVS кривая кристаллической Формы A соединения 1 показана на Фиг. 4, △W= 0,08%.

Заключение:

Кристаллическая Форма A соединения 1 имела гигроскопичное увеличение массы 0,08% при 25°C и 80% RH, что было меньше 0,2%, показывая отсутствие гигроскопичности или небольшую гигроскопичность.

Экспериментальный пример 3: Испытания стабильности в твердом состоянии кристаллической Формы A соединения 1 при высокой температуре, высокой влажности и в условиях сильного освещения.

В соответствии с "Guidelines for Stability Test of APIs and Preparations" (Chinese Pharmacopoeia 2015 Edition Four General Principles 9001), кристаллическую Форму A соединения 1 испытывали на стабильность при высокой температуре (60°C, открытый образец), высокой влажности (комнатная температура/относительная влажность 92,5%, открытый образец) и сильного освещения (4500±500люкс, 90мквт/см², плотно закрыт).

Отвешивали 1,5 г кристаллической Формы A соединения 1 и помещали на открытое предметное стекло и распределяли тонким слоем. Образцы помещали в условия высокой температуры и высокой влажности в эксикатор для контроля и образцы брали на 5, 10 и 30 день для испытания и результаты испытаний сравнивали с исходными результатами испытаний дня 0. Образцы, которые помещали в условия сильного освещения, закрывали прозрачной крышкой с герметизирующей пленкой и образцы брали на 5 и 10 день для испытания и результаты испытаний сравнивали с исходными результатами испытаний в день 0. Результаты испытаний показаны в следующей Таблице 3.

Таблица 3
Результаты испытаний стабильности в твердом состоянии кристаллической Формы A соединения 1 в условиях высокой температуры, высокой влажности и сильного освещения Условия испытания Время взятия образцов Внешний вид Содержание Общее количество примесей - День 0 Белый порошок 99,5% 0,11% Высокая температура (60°C, открытый образец) День 5 Белый порошок 99,2% 0,16% День 10 Белый порошок 98,8% 0,16% День 30 Белый порошок 99,0% 0,16% Высокая влажность (комнатная температура/относительная влажность 92,5%, открытый образец) День 5 Белый порошок 99,0% 0,16% День 10 Белый порошок 98,9% 0,16% День 30 Белый порошок 99,0% 0,16% Сильное освещение (4500±500люкс,90мквт/см², плотно закрыт) День 5 Белый порошок 98,8% 0,11% День 10 Белый порошок 98,6% 0,11%

Заключение: Кристаллическая Форма A соединения 1 показала хорошую стабильность в условиях высокой температуры, высокой влажности или сильного освещения

Экспериментальный пример 4: Испытание стабильности в твердом состоянии кристаллической Формы A соединения 1 в условиях ускоренного испытания

В соответствии с "Guidelines for Stability Test of APIs and Preparations" (Chinese Pharmacopoeia 2015, Volume IV, General Principles 9001), кристаллическую Форму A соединения 1 испытывали на стабильность в условиях ускоренных испытаний при высокой температуре и высокой влажности (40°C/относительная влажность 75%, образец плотно закрыт).

Отвешивали 1,4 г кристаллической Формы A соединения 1 и помещали в двухслойный низкой плотности полиэтиленовый пакет. Каждый слой полиэтиленового пакета с низкой плотностью загибали и запечатывали соответственно и затем пакет помещали в пакет из алюминиевой фольги и запечатывали термосваркой. Образцы брали на 1, 2, 3 и 6 месяц для испытания и результаты испытаний сравнивали с исходными результатами испытаний дня 0. Испытание повторяли три раза, каждый раз с другой партией кристаллической Формы A соединения 1. Результаты испытаний показаны в следующей Таблице 4.

Таблица 4
Результаты испытаний стабильности в твердом состоянии кристаллической Формы A соединения 1 в условиях ускоренного испытания (40°C/относительная влажность 75%, плотно закрытый образец) Условия испытания Партия Время взятия образцов Внешний вид Содержание Общее количество примесей Кристаллическая форма (XRPD) - 1 День 0 Белый порошок 99,4% 0,09% Кристаллическая Форма A 40°C/относительная влажность 75%, плотно закрытый образец 1^-й месяц Белый порошок 99,3% 0,09% Не определяли 2^-й месяц Белый порошок 99,1% 0,09% Не определяли 3^-й месяц Белый порошок 99,5% 0,09% Не определяли 6^-й месяц Белый порошок 100,1% 0,10% Кристаллическая Форма A - 2 День 0 Белый порошок 99,4% 0,10% Кристаллическая Форма A 40°C /относительная влажность 75%, плотно закрытый образец 1^-й месяц Белый порошок 99,1% 0,11% Не определяли 2^-й месяц Белый порошок 99,0% 0,11% Не определяли 3^-й месяц Белый порошок 99,2% 0,10% Не определяли 6^-й месяц Белый порошок 100,5% 0,12% Кристаллическая Форма A - 3 День 0 Белый порошок 99,5% 0,11% Кристаллическая Форма A 40°C /относительная влажность 75%, плотно закрытый образец 1^-й месяц Белый порошок 98,8% 0,16% Не определяли 2^-й месяц Белый порошок 98,9% 0,16% Не определяли 3^-й месяц Белый порошок 99,2% 0,16% Не определяли 6^-й месяц Белый порошок 100,0% 0,11% Кристаллическая Форма A

Заключение: Кристаллическая Форма A соединения 1 показала хорошую стабильность в условиях ускоренного испытания 40°C/относительная влажность 75%.

Экспериментальный пример 5: Испытание стабильности в твердом состоянии кристаллической Формы A соединения 1 в условиях долгосрочного хранения

В соответствии с "Guidelines for Stability Test of APIs and Preparations" (Chinese Pharmacopoeia 2015, Volume IV, General Principles 9001), кристаллическую Форму A соединения 1 испытывали на стабильность в условиях долгосрочного хранения (25°C/относительная влажность 60%, плотно закрытый образец).

Отвешивали 1,4 г кристаллической Формы A соединения 1 и помещали в двухслойный низкой плотности полиэтиленовый пакет. Каждый слой полиэтиленового пакета с низкой плотностью загибали и запечатывали соответственно и затем пакет помещали в пакет из алюминиевой фольги и запечатывали термосваркой. Образцы брали на 3, 6, 9, 12 и 18 месяц для испытания и результаты испытаний сравнивали с исходными результатами испытаний дня 0. Испытание повторяли три раза, каждый раз с другой партией кристаллической Формы A соединения 1. Результаты испытаний показаны в следующей Таблице 5.

Таблица 5
Результаты испытаний стабильности в твердом состоянии кристаллической Формы A соединения 1 в условиях долгосрочного хранения (25°C/относительная влажность 60%, плотно закрытый образец) Условия испытания Партия Время взятия образцов Внешний вид Содержание Общее количество примесей Кристаллическая форма (XRPD) - 1 День 0 Белый порошок 99,4% 0,09% Кристаллическая Форма A 25°C/относительная влажность 60%, плотно закрытый образец 3^-й месяц Белый порошок 99,0% 0,09% Не определяли 6^-й месяц Белый порошок 101,4% 0,09% Кристаллическая Форма A 9^-й месяц Белый порошок 99,6% 0,09% Не определяли 12^-й месяц Белый порошок 98,8% 0,08% Кристаллическая Форма A 18^-й месяц Белый порошок 97,3% 0,10% Не определяли - 2 День 0 Белый порошок 99,4% 0,10% Кристаллическая Форма A 25°C/относительная влажность 60%, плотно закрытый образец 3^-й месяц Белый порошок 100,5% 0,11% Не определяли 6^-й месяц Белый порошок 100,1% 0,12% Кристаллическая Форма A 9^-й месяц Белый порошок 99,6% 0,11% Не определяли 12^-й месяц Белый порошок 98,2% 0,09% Кристаллическая Форма A 18^-й месяц Белый порошок 99,1% 0,11% Не определяли - 3 День 0 Белый порошок 99,5% 0,11% Кристаллическая Форма A 25°C/относительная влажность 60%, плотно закрытый образец 3^-й месяц Белый порошок 98,9% 0,16% Не определяли 6^-й месяц Белый порошок 98,5% 0,12% Кристаллическая Форма A 9^-й месяц Белый порошок 99,2% 0,11% Не определяли 12^-й месяц Белый порошок 98,4% 0,10% Кристаллическая Форма A 18^-й месяц Белый порошок 99,7% 0,17% Не определяли

Заключение: Кристаллическая Форма A соединения 1 показала хорошую стабильность в условиях долгосрочного хранения 25°C/относительная влажность 60%.

Пример испытаний 1: Ингибиторная активность соединения 1 в отношении фосфодиэстеразы подтипа 4B (PDE4B фермент)

Этот биологический эксперимент, основанный на поляризации флуоресценции, использовали для определения экспрессии AMP/GMP, т.е. для демонстрации активности фермента путем отслеживания связывания антител AMP/GMP.

Агенты:

Экспериментальный буферный раствор: 10 мМ буферного раствора тригидроксиметиламинометан-хлористоводородная кислота (Tris-HCl) (pH 7,5), 5 мМ MgCl₂, 0,01% полиоксиэтиленлаурилового эфира (Brij 35), 1 мМ дитиотреитола (DTT) и 1% DMSO.

Ферменты: Рекомбинантный гуманизированный PDE4B (Genebank Accession Number NM_002600; amino acid 305 terminal) экспрессировали с использованием бакуловируса в клетках насекомого Sf9 с использованием N-концевой GST метки. Мол.масса=78 кДа.

Субстрат фермента: 1 мкМ cAMP

Детекция: Transcreener®AMP2/GMP2 антитело и AMP2/GMP2 AlexaFluor633 мечение.

Процедуры:

1. Растворение рекомбинантного человеческого PDE4B фермента и субстрата фермента (1 мкМ cAMP) в свежеприготовленном экспериментальном буфере;

2. Перенос полученного буферного раствора PDE4B фермента в реакционные лунки;

3. Добавление соединения 1, растворенного при помощи 100% DMSO, в реакционную лунку с буферным раствором PDE4B фермента акустическим методом (эхо 550 нанолитровый диапазон) и осуществление инкубации в течение 10 минут при комнатной температуре;

4. Затем добавление буферного раствора субстрата фермента в указанные реакционные лунки для инициирования реакции;

5. Осуществление инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре;

6. Добавление смеси для детекции (Transcreener®AMP2/GMP2 антитело и AMP2/GMP2 AlexaFluor633 метка) для остановки реакции и осуществление инкубации в течение 90 мин при медленном перемешивании. Диапазон определения поляризации флуоресценции возбуждение/эмиссия=620/688.

Анализ данных: Сигнал поляризации флуоресценции преобразовывали в нМ в соответствии с AMP/GMP стандартной кривой и контрольной % активностью фермента относительно DMSO, рассчитанной с использованием программы Excel. Подгонку кривой осуществляли с использованием программы GraphPad Prism (графически представляющей медицинские данные).

Таблица 6
Результаты in vitro скринингового теста соединения в соответствии с настоящим раскрытием Соединение IC50 (нМ) Соединение 1 0,685

Заключение: Соединение 1 показало отличную in vitro активность ингибирования фосфодиэстеразы подтипа 4B (PDE4B).

Пример испытаний 2: Оценка ингибирования продукции TNFα в мононуклеарных клетках периферической крови человека (hPBMC) in vitro

Активность соединения 1, направленная на ингибирование липополисахарид (LPS)-индуцированной продукции TNFα в человеческих мононуклеарных клетках периферической крови.

Процедуры:

1. Сбор нормальной цельной крови человека, которую подвергали антикоагуляционной обработке с использованием пробирки с антикоагулянтом EDTA-K2;

2. Отделение PBMC центрифугированием в градиенте плотности фиколла, подсчет и доведение клеточной концентрации до 2×10⁶/мл;

3. В U-донный 96-луночный планшет добавляли 2×10⁵ клеток/лунка, добавляли LPS 1 нг/мл, различные концентрации соединения при 100 мкМ, 10 мкМ, 1 мкМ, 100 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 100 пМ, 10 пМ, 200 мкл системы/лунка, в дублируемые лунки;

4. Осуществление инкубации в течение 24 ч, сбор супернатанта;

5. Детекция уровня TNFα в супернатанте методом ELISA, подгонка кривой ингибирования и расчет IC50 с использованием программы Graphpad Prism.

Таблица 7
Ингибиторная активность соединения в соответствии с настоящим раскрытием в отношении продукции TNFα в hPBMC Соединение IC50(нМ) Соединение IC50(нМ) Апремиласт 16,5 (n=3) Соединение 1 0,56 (n=2) n представляет количество испытаний

Заключение: Соединение 1 показало отличную in vitro активность ингибирования продукции TNFα в hPBMC, которая была выше, чем у Апремиласта.

Пример испытаний 3: Модель CIA in vivo

Цель:

Модель коллаген-индуцированного артрита у мышей представляет собой животную модель, используемую для оценки эффективности лекарственного лечения псориатического артрита, и патогенез и симптомы в значительной степени коррелируют с псориатическим артритом. Ряд симптомов, подобных псориатическому артриту человека, таких как покраснение и отек сустава, повреждение суставного хряща и повреждение суставной капсулы, вызывается в модели путем инъекции коллагена типа II для активации реактивности В-клеток, Т-клеток на костный коллаген, и активированные В-клетки и Т-клетки проникают в суставы, вызывая воспаление суставов. При доклинической оценке соединений-кандидатов для лечения псориатического артрита часто используют коллаген-индуцированный артрит у мышей для оценки эффективности.

Целью этого эксперимента было исследование терапевтического эффекта соединения 1 на коллаген-индуцированный артрит у мышей для предоставления соответствующей доклинической фармакодинамической информации для последующих клинических исследований.

Процедуры:

1. Иммунизация с использованием коллагена II типа/полного адъюванта Фрейнда

Получение уксусной кислоты: Разбавление уксусной кислоты до 100 мМ, фильтрование через 0,22 мкм мембранный фильтр и хранение при 4°C.

Раствор бычьего коллагена II типа: Растворение бычьего коллагена II типа (CII) в растворе уксусной кислоты, который хранили при 4°C в течение ночи.

Получение эмульсии: Смешивание CII раствора, который хранили в течение ночи, с равным объемом полного адъюванта Фрейнда и гомогенизация смеси с использованием высокоскоростного гомогенизатора до образования стабильной эмульсии из раствора.

Получение липополисахарида (LPS): Отвешивание LPS, добавление нормального солевого раствора и смешивание до получения стабильного раствора с концентрацией 0,3 мг/кг.

2. Индукция артрита:

Мышей рандомизированно разделяли на разные группы обработки. День первой иммунизации определяли как день 0, а последующие дни обозначали последовательно.

После того, как DBA/1 мышей анестезировали изофлураном, полученную эмульсию коллагена вводили подкожно в хвост.

В день 23 интраперитонеально вводили 100 мкл раствора LPS.

Мышам в нормальной группе иммунизацию не осуществляли.

3. Введение и схема введения доз

В день 27, когда средняя клиническая оценка достигала примерно 1, отбирали 60 мышей с умеренным началом заболевания и их снова рандомизированно разделяли в соответствии с массой тела и оценкой, по 10 мышей в каждой группе.

В CIA модели обычно используют дексаметазон в качестве положительного контрольного лекарственного средства в 0,3 мг/кг дозовой группе. Кроме того, соответствующую схему введения доз соединения 1 и контрольного соединения Апремиласта определяли в соответствии с результатами предварительных экспериментов. Группа 1 включала нормальных мышей без какой-либо обработки; Группа 2 представляла собой контрольную группу введения носителя; Группа 3 представляла собой группу введения дексаметазона при дозе 0,3 мг/кг; Группа 4 представляла собой группу введения Апремиласта при дозе 5 мг/кг; Группа 5, Группа 6 и Группа 7 представляли собой группы введения Соединения 1 при дозах 0,3, 1 и 3 мг/кг, соответственно. Введение осуществляли один раз в день всего в течение 11 дней. Объем внутрижелудочного введения составлял 10 мл/кг.

Таблица 8
Группы и схема введения доз Группа Испытываемое лекарственное средство Количество Путь введения Концентрация Доза Частота введения мг/мл мг/кг 1 Нормальная группа 5 N/A. N/A N/A N/A 2 Носитель 10 Через желудочный зонд N/A N/A 1/день, 11 дней 3 Дексаметазон 10 Через желудочный зонд 0,03 0,3 1/день, 11 дней 4 Апремиласт 10 Через желудочный зонд 0,5 5 1/день, 11 дней 5 Соединение 1 10 Через желудочный зонд 0,03 0,3 1/день, 11 дней 6 Соединение 1 10 Через желудочный зонд 0,1 1 1/день, 11 дней 7 Соединение 1 10 Через желудочный зонд 0,3 3 1/день, 11 дней

4. Определение показателя инцидентности артрита

Клиническое наблюдение: от 7 дней до иммунизации до 23 дней после иммунизации основное состояние здоровья и изменения массы тела мышей DBA/1 наблюдали ежедневно (регистрировали один раз в неделю). После 23-го дня состояние здоровья, заболеваемость и изменение массы тела мышей наблюдали ежедневно (регистрировали не менее трех раз в неделю) до конца эксперимента.

Клиническая оценка: после инъекции LPS заболеваемость мышей наблюдали каждый день. После начала заболевания у мышей (клинические симптомы артрита) их оценивали в соответствии с тяжестью состояния (покраснение и отек, деформация суставов) в соответствии с 0-4-балльным стандартом, с максимальной оценкой 4 для каждой конечности и максимальной оценкой 16 для каждого животного. Стандарт оценки показан в Таблице 9. Оценку осуществляли по меньшей мере три раза в неделю.

Таблица 9
Стандарт клинической оценки артрита Оценка Клинические симптомы 0 Отсутствие эритемы, покраснения и отека 1 Эритема или небольшое покраснение и отек около предплюсневой кости или голеностопного сустава или плюсневой кости, 1 палец с покраснением и отеком 2 Небольшая эритема и отек голеностопного сустава и плюсневой кости, или более чем два пальца с покраснением и отеком 3 Умеренная эритема и отек голеностопного сустава, запястного сустава и плюсневой кости 4 Сильное покраснение и отек всех голеностопных суставов, запястных суставов, плюсневой кости и пальцев

Патология: На 38 день мышь умерщвляли. Брали две задние конечности мыши, пропитывали 10% раствором формалина, декальцинировали раствором муравьиной кислоты, заливали парафином, делали срезы, окрашивали гематоксилин-эозином (HE) и наблюдали микрофотографическим методом. Степень повреждения сустава оценивали по четырем параметрам: инфильтрация воспалительными клетками, образование паннуса, повреждение хряща и резорбция кости, и оценивали по 0-4 балльному стандарту. Стандарт оценки представлен в таблице 10:

Таблица 10
Стандарт оценки патологии артрита Поражение Характеристики поражения Оценка Инфильтрация воспалительными клетками Отсутствие видимых воспалительных клеток 0 Фиброз клеток под синовиальной оболочкой, с минимальной клеточной инфильтрацией 1 Гиперплазия синовиальных клеток, с небольшим количеством инфильтрации моноцитами 2 Гиперплазия синовиальных клеток, с массивной инфильтрации моноцитами, клетками плазмы, лимфоцитами 3 Инфильтрация большим количеством воспалительных клеток вокруг сустава, фиброз ткани, утолщение синовиальной оболочки 4 Образование паннуса Отсутствие видимого образования паннуса 0 Минимальное образование паннуса у края хряща 1 Гиперплазия фиброзной ткани между хрящами, с небольшим образованием паннуса у края сустава 2 Образование паннуса на 50% поверхности суставного хряща 3 Образование паннуса на всей поверхности суставного хряща 4 Повреждение хряща Отсутствие видимого повреждения хряща 0 Гиперплазия суставных хондроцитов 1 Потеря матрицы хондроцитов, с небольшим количеством разрушенных хондроцитов 2 Гиперплазия фиброзной ткани вокруг суставов, с большим количеством разрушенных хондроцитов 3 Большая гиперплазия фиброзной ткани между суставными хрящами, с эрозией хрящей 4 Резорбция кости Отсутствие видимой резорбции кости 0 Минимальная резорбция кости у края синовиальной оболочки 1 Образование небольшого количества остеокластов для небольшого количества костной ткани 2 Костная ткань под очаговым суставным хрящом, с резорбцией кости 3 Резорбция кости для широкого ряда костных тканей, с эрозией хрящей 4

5. Статистическая обработка

Экспериментальные данные выражали как среднее значение ± стандартная ошибка (Среднее значение ± SEM), массу тела и клиническую оценку анализировали с использованием двухфакторного дисперсионного анализа, патологическую оценку и AUC анализировали с использованием t-критерия, и значение p <0,05 считалось значимым.

Экспериментальные результаты:

1. Клиническая оценка:

В день 25 после первой иммунизации (День 2 после второй иммунизации) у мышей начиналось развитие клинических симптомов артрита. Введение начинали на 27 день. Средняя клиническая оценка контрольной группы введения носителя постепенно повышалась и достигала 8,3 пунктов в день 36, указывая на успешное установление модели коллаген-индуцированного артрита.

По сравнению с контрольной группой введения носителя, соединение 1 при 0,3, 1 и 3 мг/кг может существенно снижать клиническую оценку артрита у мышей в конечной точке эксперимента (день 37), и клинические средние оценки при трех дозах падали до 3,6 (p<0,0001), 4,3 (p<0,001) и 3,5 (p<0,0001). Следовательно, соединение 1 может эффективно уменьшать коллаген-индуцированный артрит при такой низкой дозе как 0,3 мг/кг. В группе введения 0,3 мг/кг дексаметазона могла существенно подавляться клиническая оценка коллаген-индуцированного артрита. С дня 30 клиническая оценка поддерживалась при 0, что существенно отличалось от контрольной группы введения носителя (p<0,0001), и оставалась на этом уровне до конца эксперимента. В группе введения 5 мг/кг Апремиласта также подавлялось повышение клинической оценки, и было показано существенное отличие от контрольной группы введения носителя с дня 33, и оно продолжалось до конца эксперимента. До дня 37 средняя оценка клинических симптомов составляла 4,2, что было ниже на 3,7 (p<0,001) по сравнению с контрольной группой введения носителя.

Путем анализа кривой клинической оценки каждого животного в каждой группе рассчитывали площадь под кривой (AUC). С использованием среднего значения площади под кривой между группами рассчитывали процент ингибирования в каждой дозовой группе относительно контрольной группы введения носителя. По сравнению с контрольной группой введения носителя, в группе введения дексаметазона и группе введения Апремиласта существенно снижались клинические оценки артрита у животных, и проценты ингибирования составили 96,4% (p<0,0001) и 41,3% (p<0,05), соответственно. Соединение 1 при трех дозах 0,3, 1 и 3 мг/кг может существенно уменьшать площадь под кривой клинической оценки артрита у животных, и проценты ингибирования составили 43,9% (p<0,05), 39,4% (p<0,05) и 51,7% (p<0,01), соответственно. Группа введения соединения 1 при 1 мг/кг имела процент ингибирования, сопоставимый с группой введения Апремиласта при 5 мг/кг (p<0,05 для обеих групп), тогда как группа введения соединения 1 при 3 мг/кг имела лучшие проценты ингибирования, чем группа введения Апремиласта при 5 мг/кг (p значения были < 0,01 и <0,05, соответственно)

2. Гистопатологическая оценка

Две задние конечности из каждой группы мышей брали в виде срезов для H.E. окрашивания, и получали общую оценку обеих задних конечностей. Артрит у мышей в контрольной группе введения носителя имел общую патологическую оценку 20,20±1,15. По сравнению с контрольной группой введения носителя, контрольное соединение Апремиласт при дозе 5 мг/кг также существенно снижало патологическую оценку артрита у мышей, которая могла снижаться до 13,90±1,89 (p<0,05). Соединение 1 при дозе 1 и 3 мг/кг могло существенно снижать патологические оценки артрита у мышей, которые могли снижаться до 14,00±2,43 (p<0,05) и 9,20±1,83 (p<0,0001), соответственно. Группа введения соединения 1 при 1 мг/кг имела патологическую оценку артрита, сопоставимую с группой введения Апремиласта при 5 мг/кг (p<0,05 для обеих групп), тогда как группа введения соединения 1 при 3 мг/кг имела лучшую патологическую оценку артрита, чем в группе введения Апремиласта при 5 мг/кг (p значения <0,0001 и <0,05, соответственно).

3. Заключение

Соединение 1 в трех дозовых группах 0,3, 1 и 3 мг/кг существенно улучшало симптомы коллаген-индуцированного артрита.

Было существенное улучшение патологии артрита в 1 мг/кг и 3 мг/кг дозовых группах, и эти три дозовые группы показали очевидную взаимосвязь доза-эффект в патологической оценке артрита. Терапевтический эффект соединения 1 при 3 мг/кг (клиническая оценка и патологическая оценка артрита) был лучше, чем у Апремиласта при 5 мг/кг.

Изобретение относится к кристаллической Форме A соединения 1, где кристаллическая Форма A характеризуется рентгеновской порошковой дифрактограммой, имеющей характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 10,69±0,2°, 12,31±0,2°, 13,45±0,2°, 14,10±0,2°, 14,62±0,2°, 19,07±0,2°, 20,33±0,2°, 21,79±0,2°. Кристаллическую форму A соединения 1 получают путем добавления соединения 1 в спиртовой растворитель, кетоновый растворитель, смешанный растворитель, состоящий из спиртового растворителя и воды, смешанный растворитель, состоящий из кетонового растворителя и воды; спиртовой растворитель выбран из группы, состоящей из метанола, этанола; кетоновый растворитель выбран из группы, состоящей из ацетона и нагревания для растворения и затем охлаждение для кристаллизации с получением кристаллической Формы A. При этом смешанный растворитель, состоящий из спиртового растворителя и воды, состоит из смешанного растворителя, состоящего из этанола и воды. Технический результат – кристаллическая форма А соединения 1H-имидазо[4,5-b]пиридин-2(3H)-она (1), обладающая хорошей стабильностью, предназначенная для применения при получении лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с PDE4 рецептором. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 4 ил., 10 табл., 9 пр.

(1)

1. Кристаллическая Форма A соединения 1, где

кристаллическая Форма A характеризуется рентгеновской порошковой дифрактограммой, имеющей характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 10,69±0,2°, 12,31±0,2°, 13,45±0,2°, 14,10±0,2°, 14,62±0,2°, 19,07±0,2°, 20,33±0,2° 21,79±0,2°

Соединение 1.

2. Кристаллическая Форма A соединения 1 по п. 1, где

кристаллическая Форма A характеризуется рентгеновской порошковой дифрактограммой, имеющей характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 6,25±0,2°, 8,93±0,2°, 10,69±0,2°, 12,31±0,2°, 13,45±0,2°, 14,10±0,2°, 14,62±0,2°, 18,16±0,2°, 19,07±0,2°, 20,33±0,2°, 21,79±0,2°.

3. Кристаллическая Форма A соединения 1 по п. 2, где

кристаллическая Форма A характеризуется рентгеновской порошковой дифрактограммой, показанной на Фиг. 1.

4. Кристаллическая Форма A соединения 1 по любому из пп. 1-3, где

кристаллическая Форма A характеризуется кривой дифференциальной сканирующей калориметрии, имеющую точку начала эндотермического пика при 201,70°C±2°C.

5. Кристаллическая Форма A соединения 1 по п. 4, где кристаллическая Форма A характеризуется кривой DSC, показанной на Фиг. 2.

6. Кристаллическая Форма A соединения 1 по любому из пп. 1-3, где кристаллическая Форма A характеризуется кривой термогравиметрического анализа, где потеря массы при 100,00±2°C составляет 0,02039%.

7. Кристаллическая Форма A соединения 1 по п. 6, где кристаллическая Форма A характеризуется кривой TGA, показанную на Фиг. 3.

8. Способ получения кристаллической Формы A соединения 1 по п. 1, включающий

добавление соединения 1 в спиртовой растворитель, кетоновый растворитель, смешанный растворитель, состоящий из спиртового растворителя и воды, смешанный растворитель, состоящий из кетонового растворителя и воды; спиртовой растворитель выбран из группы, состоящей из метанола, этанола; кетоновый растворитель выбран из группы, состоящей из ацетона и

нагревание для растворения и затем охлаждение для кристаллизации с получением кристаллической Формы A.

9. Способ получения кристаллической Формы A соединения 1 по п. 8, где

смешанный растворитель, состоящий из спиртового растворителя и воды, выбран из группы, состоящей из смешанного растворителя, состоящего из этанола и воды.

10. Способ получения кристаллической Формы A соединения 1 по п. 9, где

в смешанном растворителе, состоящем из спиртового растворителя и воды, объемное отношение спиртового растворителя к воде выбрано из группы, состоящей из 1:0,2-1,5.