Способ подавление роста бактериальной микрофлоры у коров с субклиническим маститом Российский патент 2022 года по МПК A61K33/38 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарной медицине, а именно к способу лечения скрытого (субклинического) мастита у коров.

Мастит является наиболее распространенным заболеванием молочных животных, наносит огромный экономический ущерб молочной промышленности. Мастит является серьезной экономической и медицинской проблемой, связанной со стадами молочных коров, и является основной причиной чрезмерной выбраковки.

Наиболее часто применяют следующие способы лечения скрытого мастита у коров: Мастисан А - комплексный препарат, состоящий бензилпенициллина, стрептомицина, норсульфазола или сульфадимезина, растительного или вазелинового масла.

В состав препарата Мастисан Б входят неомицин, сульфадимезин, метилурацил, диастарат полиглицерин, вазелиновое масло.

Суспензия из эритромицина и сульфадимезина входят в состав препарата Мастисан Е.

В состав Мастицида входят пенициллин, стрептомицин, сульфадимизин и норсульфазол в растительном масле.

Дифурол А - препарат, содержащий фурагин, фуразолидон, полиэтиленоксид - 400 и димексид.

Антибиотики, такие как пенициллин, цефалоспорин, стрептомицин и тетрациклин, используются для лечения и профилактики заболеваний, поражающих молочных коров, вызванных различными грамположительными и грамотрицательными бактериями. Антибиотики часто регулярно вводят целым стадам, чтобы предотвратить мастит.Увеличение заболеваемости в стаде, как правило, приводит к увеличению использования противомикробных препаратов, что, в свою очередь, увеличивает потенциал остатков антибиотиков в молоке и потенциал повышения устойчивости бактерий к противомикробным препаратам.

Также известен способ профилактики и лечения мастита у коров (патент RU 2201756, опубл. 10.04.2003) по методике которого предлагается введение в сосковый канал антимикробного средства (озонированное рафинированное дезодорированное растительное масло) с кислородом.

Недостатком данного способа является то, что препарат применяется только для коров в период сухостоя.

Предложен способ введения тканевого препарата (патент RU 2201758, опубл. 10.04.2003), который обладает иммуномодулирующим действием, состоящий из фильтрата экстракта молочной железы здоровых животных, стабилизированных маннитом.

Недостатком способа является то, что препарат готовят самостоятельно (кустарно) в лабораториях и на мясокомбинатах, в результате чего препарат различается по биологической активности и, естественно, эффективности.

Согласно патенту RU 2320325, опубл. 27.03.2008 предусматривается введение комплексного препарата, состоящего из 2%-раствора новокаина, АСД фракции-2, димексида и 40% раствора глюкозы. К недостаткам данного способа относится низкая эффективность предложенного препарата, длительность лечения мастита.

Патент RU 2463995, опубл. 20.10.2012 является наиболее близким аналогом, который предусматривает лечение субклинического мастита у коров с помощью препарата растительного происхождения - календулы и адаптогена - Лигфола. Недостатком данного способа является трудоемкость приготовления и хранения растительного сырья.

Техническим результатом настоящего изобретения является подавление роста бактериальной микрофлоры у коров с субклиническим маститом.

Технический результат достигается тем, что коровам с субклиническим маститом внутрицистернально вводят фитораствор на основе порошкообразного экстракта лекарственного растения Тимьяна ползучего (Thymus serpyllum L.) (чабрец) в разведении 1:4 для подавления роста бактериальной микрофлоры у коров с субклиническим маститом.

Экстракт чабреца обладает антибактериальной активностью в отношении грамположительных (Streptoccocus faecalis) и грамотрицательных (Escherichia coli) микроорганизмов.

Способ осуществляется следующим образом.

Для инокуляции использовали микробные взвеси (Streptoccocus faecalis, Escherichia coli выделенные из молока коров, больных маститом).

Для определения чувствительности экстракта чабреца к штаммам микроорганизмов применяли метод серийных разведений в бульоне. Тестировали в объеме 2 см³ каждого разведения экстракта чабреца с конечной концентрацией исследуемых микроорганизмов 1×10⁶ КОЕ/мл.

Питательный бульон (МПБ) для определения чувствительности разливали по 2,0 см³ в каждую пробирку. Количество пробирок определяли из необходимого диапазоном разведений чабреца (шесть штук) и увеличили на две пробирки для постановки контролей (контроль на рост культуры - МПБ с культурой без чабреца; контроль на чистоту (стерильность) бульона - МПБ (без чабреца и без культуры).

Для определения необходимой максимальной концентрации фитораствора в ряду серийных разведений использовался исходный образец порошкообразного экстракта чабреца. Разводили 1:1 (10 г экстракта+10 мл стерильной дистиллированной воды).

Исходный раствор экстракта чабреца, разведенный 1:1 в количестве 2,0 см³ при помощи микропипетки со стерильным наконечником, вносили в первую пробирку ряда, содержащую 2,0 см³ МПБ. Тщательно перемешивали и новым стерильным наконечником переносили 2,0 см³ раствора экстракта чебреца в МПБ из первой пробирки во вторую пробирку, содержавшую первоначально также 2,0 см³ МПБ. Эту процедуру повторяли, пока не приготовили необходимый ряд разведений, состоящий из восьми пробирок. Из последней пробирки 2,0 см³ взвеси удаляли.

Таким образом, получили ряд пробирок с растворами чабреца, концентрации которых отличаются в соседних пробирках в 2 раза.

Для этой цели использовали свежие 16-18-часовые агаровые культуры, которые для приготовления взвеси, вносили в стерильный 0,9%-ный водный раствор натрия хлорида. Делали взвесь по стандарту мутности 10 ЕД (в 1 мл культуры концентрация микробных клеток 10⁹). В первую пробирку, содержащую 10 мл МПБ, вносили 0,1 мл культуры с концентрацией микробных клеток 10⁹ (получив концентрацию микробных клеток в 1 мл 10⁷). Содержимое перемешивали и 1 мл переносили во вторую пробирку с 9 мл питательной среды МПБ для приготовления конечного инокулюма (в 1 мл культуры концентрация микробных клеток составила 10⁶, то есть в 1 мл среды будет 100 тыс.микробных клеток). Таким образом, конечная концентрация микроорганизма в каждой пробирке достигнет 1·10⁶ КОЕ/мл (100 тыс.микробных клеток в 1 мл среды)

Пробирки закрывали стерильными ватно-марлевыми пробками. Все пробирки с тестируемыми штаммами, и пробирки с контролями, инкубировали в термостате при обычной атмосфере при температуре 37°С в течение 16-18 часов.

Для определения наличия роста микроорганизмов пробирки с посевами просматривали в проходящем свете, отмечая пробирку, в которой отсутствует рост.Рост культур в присутствии чабреца сравнивали с контрольной пробиркой МПБ без засеянного в нее микроорганизма и разведения чабреца. При отсутствии роста культур в контрольных пробирках с МПБ (без чабреца и культуры), и при росте культур (в пробирке с культурой, но без чабреца) определяли МПК по наименьшей концентрации чабреца, которая подавляет видимый рост микроорганизма в разведениях.
При постановке методов серийных разведений в бульоне проводили контроль роста культур в питательных бульонах без чабреца. Также контролировали чистоту суспензии микроорганизмов, использованных для инокуляции, путем высева на неселективные среды (МПБ, МПА).

Рост культур в МПБ во взвесях с чабрецом контролировался микроскопией - окраска мазков по Грамму и высевом на плотные питательные среды (среда Эндо для кишечной палочки; среда МИС для стрептококка).

Таблица 1- Результаты опыта Степень разведения Бактериальные
культуры контроль МПБ с культурой без чабреца контроль МПБ чабреца
и без культуры 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 - - + + + + Escherichia coli + - - - - - + + Enterococcus faecalis + -

(+) - реакция положительная (есть рост бактериальной микрофлоры)

(-) - реакция отрицательная (нет роста бактериальной микрофлоры)

Таким образом, оптимальным для подавления роста бактериальных культур Escherichia coli и Enterococcus faecalis является разведение 1:4.

Сущность способа поясняется примерами.

Для подтверждения эффективности предлагаемого способа были проведены опыты по изучению влияния фитораствора на основе порошкообразного экстракта чабреца с целью подавления роста бактериальной микрофлоры у коров с субклиническим маститом.

Научно-хозяйственный опыт проводили на коровах черно-пестрой породы. В опыт было отобрано 12 коров по принципу аналогов, больных скрытой формой мастита, у каждого животного было поражено по одной доле вымени.

Диагноз на скрытый мастит у коров устанавливали на основании отсутствия у них клинически выраженных признаков воспаления вымени и положительных реакций молока с 2%-ным раствором мастидина. С целью исключения раздражения вымени исследования молока повторяли через 3 суток.

С целью установления чувствительности к антибиотикам выделенных из проб молока культур использовался метод диффузии в агар с применением дисков содержащих антибиотики.

Таблица 2 - Чувствительность к Escherichia coli Экспертиза №1Н № Диск антибиотика Зона,
мм Срок годности № Диск антибиотика Зона, мм Срок годности 1 Ампициллин 21 сер. 16 до 05.2022 16 Тетрациклин 27 сер.030321 до 03.2022 2 Амоксициллин 20 сер. 6 до 05.2022 17 Норфлоксацин 30 сер.050520 до 11.2021 3 Оксациллин - сер.010121 до 12.2022 18 Левофлоксацин 31 сер. 15 до 04.2022 4 Имипенем 30 сер. 11 до 12.2021 19 Левомицетин - сер. 14 до 04.2022 5 Цефалексин 24 сер. 10 до 03.2022 20 Линкомицин - сер. 15 до 04.2022 6 Цефуроксим 20 сер. 14 до 04.2022 21 Фурагин 26 сер. 10 до 11.2021 7 Цефотаксим 26 сер. 14 до 05.2022 22 Кларитромицин - сер.060621 до 12.2022 8 Цефтазидим 22 сер. 17 до 03.2022 23 Олеандомицин - сер.030321 до 03.2022 9 Эритромицин - сер. 11 до 04.2022 24 Рокситромицин - сер.010121 до 07.2022 10 Стрептомицин 23 сер.010121 до 01.2022 25 Цефтриаксон 30 сер.030321 до 03.2022 11 Гентамицин 20 сер. 19 до 03.2022 26 Меропенем 27 сер. 17 до 03.2022 12 Амикацин 21 сер. 17 до 04.2022 27 Энрофлоксацин 28 сер.070721 до 07.2022 13 Тобрамицин 20 сер. 17 до 04.2022 28 Нитроксолин 21 LOT 0000456548 до 10.2022 14 Доксициклин 20 сер. 11 до 03.2022 29 Фосфомицин 36 сер.010121 до 01.2022 15 Ципрофлоксацин 23 сер. 14 до 05.2022 30 Ломефлоксацин 22 сер.050520 до 05.2022

Таблица 3 - Чувствительность к Enterococcus faecalis Экспертиза №1Н+2Н № Диск антибиотика Зона,
мм Срок годности № Диск антибиотика Зона, мм Срок годности 1 Ампициллин 26 сер. 16 до 05.2022 16 Тетрациклин - сер.030321 до 03.2022 2 Амоксициллин 26 сер. 6 до 05.2022 17 Норфлоксацин 21 сер.050520 до 11.2021 3 Оксациллин - сер.010121 до 12.2022 18 Левофлоксацин 25 сер. 15 до 04.2022 4 Имипенем 26 сер. 11 до 12.2021 19 Левомицетин - сер. 14 до 04.2022 5 Цефалексин - сер. 10 до 03.2022 20 Линкомицин - сер. 15 до 04.2022 6 Цефуроксим - сер. 14 до 04.2022 21 Фурагин 25 сер. 10 до 11.2021 7 Цефотаксим - сер. 14 до 05.2022 22 Кларитромицин 21 сер.060621 до 12.2022 8 Цефтазидим - сер. 17 до 03.2022 23 Олеандомицин 20 сер.030321 до 03.2022 9 Эритромицин 21 сер. 11 до 04.2022 24 Рокситромицин 20 сер.010121 до 07.2022 10 Стрептомицин - сер.010121 до 01.2022 25 Цефтриаксон 20 сер.030321 до 03.2022 11 Гентамицин - сер. 19 до 03.2022 26 Меропенем 20 сер. 17 до 03.2022 12 Амикацин - сер. 17 до 04.2022 27 Энрофлоксацин 28 сер.070721 до 07.2022 13 Тобрамицин - сер. 17 до 04.2022 28 Нитроксолин - LOT 0000456548 до 10.2022 14 Доксициклин - сер. 11 до 03.2022 29 Фосфомицин 20 сер.010121 до 01.2022 15 Ципрофлоксацин 26 сер. 14 до 05.2022 30 Ломефлоксацин 21 сер.050520 до 05.2022

Был проведен анализ полученных данных, в результате которого, был выбран антибиотик Энрофлоксацин, имеющий наибольшую зону задержки роста (28 мм) для обоих культур Escherichia coli и Enterococcus faecalis. Действующее вещество Энрофлоксацин входит в состав лекарственного препарата Энрофлон-гель.

Были сформированы 2 группы (контрольная и опытная).

В контрольной группе проводили лечение Энрофлон-гелем (шприц 7,5 г), согласно инструкции для интрацистернального применения, в состав лекарственного препарата входит: 300 мг энрофлоксацина и 50 мг кетопрофена.

Таблица 4 - Результаты опыта Группа Схема лечения День диагностики (от начала лечения) 3-ий день 4-ий день 5-ий день Контрольная Энрофлон-гель интрацистернально 7,5 г два раза в сутки с интервалом 12 часов + + - Опытная Фитораствор на основе порошкообразного экстракта Тимьяна ползучего (разведение 1:4), интрацистернально 10 мл два раза в сутки с интервалом 12 часов + - -

Примечание:+положительная реакция; - отрицательная реакция с 2%-ным раствором мастидина.

Таким образом, интрацистернальное применении фитораствора на основе порошкообразного экстракта чабреца в разведении 1:4 у коров с субклиническим маститом (опытная группа) подавляло рост микроорганизмов на 3-е сутки введения препарата по сравнению с контрольной группой, где положительный результат наблюдали на 5-й день применения препарата Энрофлон-геля.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарной медицине, а именно к способу лечения субклинического мастита у коров. Способ позволяет осуществить подавление роста бактериальной микрофлоры у коров с субклиническим маститом. При этом коровам с субклиническим маститом внутрицистернально вводят фитораствор на основе порошкообразного экстракта лекарственного растения Тимьяна ползучего (Thymus serpyllum L.) в разведении 1:4 два раза в сутки с интервалом 12 часов в течение 3 дней. Введение фитораствора на основе порошкообразного экстракта чабреца способствует более быстрому выздоровлению животных без применения препаратов, содержащих антибиотики. 4 табл.

Способ подавления роста бактериальной микрофлоры у коров с субклиническим маститом, характеризующийся тем, что коровам с субклиническим маститом внутрицистернально вводят фитораствор на основе порошкообразного экстракта лекарственного растения Тимьяна ползучего (Thymus serpyllum L.) в разведении 1:4 два раза в сутки с интервалом 12 часов в течение 3 дней.