Новые депсипептидные соединения, обладающие антибактериальной активностью Российский патент 2023 года по МПК C07K11/02 A61K38/15 A61P31/04 

Настоящее изобретение относится к новым антибактериальным депсипептидным соединениям и может быть использовано для создания средств для лечения микробных инфекций человека и животных.

Уровень техники

Человек и животные часто подвергаются заражению микробными агентами, в том числе такими, как Streptococcus spp.; Arthrobacter spp.; Mycobacterium spp., Micrococcus spp.

Основные группы антибиотиков, применяемых в лечении стрептококковых инфекций (бактериями Streptococcus spp.), - это пенициллины, цефалоспорины, макролиды и гликозамиды [https://medvestnik.ru/content/articles/Opublikovan-Kokreinovskii-obzor-sravneniya-antibiotikov-pri-streptokokkovoi-infekcii.html]. Пенициллин может быть препаратом выбора как при легкой, так и при тяжелой форме заболевания. Для пациентов с аллергией на пенициллин можно использовать эритромицин.

Наиболее широко используемыми химиотерапевтическими агентами, применяемыми против Mycobacterium spp., являются антибиотики кларитромицин, азитромицин, рифампицин, рифабутин, этамбутол, стрептомицин и амикацин.

Одной из групп соединений, активных против указанных микроорганизмов, являются депсипептиды (ДП) - пептиды, в которых одна или более амидных групп замещены сложноэфирными группами. ДП относятся к нерибосомальным пептидам, которые синтезируются с помощью ферментных комплексов пептид-синтетаз, состоящих из повторяющихся доменов с модульной организацией для активации и связывания аминокислот. Основными продуцентами природных ДП являются почвенные бактерии, морские организмы и грибы.

Эти соединения могут обладать антибактериальной, иммуномодулирующей, противоопухолевой активностью, а также эффективны против различных микроорганизмов и гельминтов.

Так, из уровня техники известны соединения, относящиеся к депсипептидам, обладающие противогельминтной активностью (патент RU 2715556 С2 опубл. 02.03.2020). Известно применение депсипептидов при лечении грибковых инфекций (патент RU 2745671 С2, опубл. 30.03.2021).

Циклический депсипептид - даптомицин - пройдя все стадии изучения, зарегистрирован как антибактериальный лекарственный препарат [Tedesco KL, Rybak MJ. Daptomycin. Pharmacotherapy. 2004 Jan;24(l):41-57. Review.]. Он был выделен из культуральной жидкости бактерии Streptomyces roseosporus как самый активный компонент смеси соединений с 13-членным аминокислотным циклом. Даптомицин проявлял высокую активность in vitro против грамположительных бактерий - энтерококков, включая устойчивые к ванкомицину (VRE), стафилококков, включая устойчивые к метициллину (MRSA), стрептококков и коринебактерий. Даптомицин в настоящее время активно применяется как препарат для лечения различных инфекций [Patel S, Saw S. Daptomycin. 2020 Apr 13. StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2020 Jan-. Available from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK470407]. Состав лекарственной формы препарата даптомицина для инъекций совершенствуется, с тем чтобы улучшить его стабильность и скорость растворения, сохраняя при этом ту же эффективность [Frankenfeld С, Mittal S, Melendez Y, Mendez-Vigo L, Lamp KC, Keller KN, Bertolami SR. Daptomycin: a comparison of two intravenous formulations. Drug Des Devel Ther. 2018 Jun 29;12:1953-1958].

Известно изобретение, относящееся к улучшению способа очистки даптомицина (патент RU 2348647 С2, опубл. 10.03.2009). Усовершенствованный способ применения липопептидных антибиотиков, в частности даптомицина, бактерий, включая штаммы, устойчивые к действию других антибиотиков, представлен в патенте RU2363489C9, опубл. 2010-03-20).

Известны и другие депсипептидные соединения, обладающие антибактериальным действием, однако, часть из них по своим свойствам не удовлетворяют требованиям для получения на их основе лекарственных препаратов. Это такие соединения, как энниатины [Sy-Cordero АА, Реагсе CJ, Oberlies NH. Revisiting the enniatins: a review of their isolation, biosynthesis, structure determination and biological activities. J Antibiot (Tokyo). 2012 Nov;65(11):541-9.], боверицин [Wang Q, Xu L. Beauvericin, a bioactive compound produced by fungi: a short review. Molecules. 2012 Feb 24;17(3):2367-77], рамопланин A2 [Farver DK, Hedge DD, Lee SC. Ramoplanin: a lipoglycodepsipeptide antibiotic. Ann Pharmacother. 2005 May;39(5):863-8.], фузарицидины [Reimann M, Sandjo LP, Antelo L, Thines E, Siepe I, Opatz Т. A new member of the fusaricidin family - structure elucidation and synthesis of fusaricidin E. Beilstein J Org Chem. 2017 Jul 20;13:1430-1438], ацилдепсипептиды [Li Y, Lavey NP, Coker JA, Knobbe JE, Truong DC, Yu H, Lin YS, Nimmo SL,Duerfeldt AS. Consequences of Depsipeptide Substitution on the ClpP Activation Activity of Antibacterial Acyldepsipeptides. ACS Med Chem Lett. 2017 Oct 19;8(11):1171-1176. doi:10.1021/acsmedchemlett.7b00320.].

Соединение тейксобактин, открытое в 2015 г как метаболит почвенной Р-протеобактериии Eleftheria terrae [Ling, L.L., Schneider, Т., Peoples, A.J., Spoering, A.L., Engels, I., Conlon, B.P., Mueller, A., Schaberle, T.F., Hughes, D.E., Epstein, S., Jones, M., 2015. A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance. Nature 517 (7535), 455-459], а впоследствии синтезированный [Karas JA, Chen F, Schneider-Futschik EK, Kang Z, Hussein M, Swarbrick J, Hoyer D, Giltrap AM, Payne RJ, Li J, Velkov T. Synthesis and structure-activity relationships of teixobactin. Ann N Y Acad Sci. 2020 Jan; 1459(1): 86-105. doi: 10.1111/nyas.14282], является перспективным кандидатом на разработку лекарственного средства [Teixobactin and preparation method thereof (патент CN107266531A)].

Наиболее близким аналогом изобретения является суротомицин -антибактериальное средство, полусинтетический аналог даптомицина (патент RU 2666605 С2, опубл 06.11.2014), являющийся родственным соединением.

Задачей, решаемой с помощью заявляемого изобретения, является представление новых депсипептидных соединений, обладающих антибактериальной активностью.

Раскрытие сущности изобретения

В настоящем изобретении предложено соединение общей структурной формулы:

где R представляет собой следующие радикалы:

или

В другом аспекте нашего изобретения предлагается применение заявляемого соединения для приготовления средства, обладающего антибактериальной активностью.

Технический результат заявляемого изобретения состоит в следующем.

Несмотря на успехи, связанные с применением существующих антибактериальных агентов, продолжает сохраняться потребность в новых антибиотиках. Для многих патогенов повторное взаимодействие с применяемыми антибиотиками, приводит к отбору вариантов штаммов, устойчивых к широкому спектру антибиотиков. Потеря силы и эффективности антибиотика, определяемые возникновением механизмов устойчивости, приводит к неэффективности антибиотика и, следовательно, может вести к некоторым угрожающим жизни инфекциям, которые практически не поддаются лечению. Как только на рынке появляются и начинают применяться новые антибиотики, микроорганизмы начинают эволюционировать в сторону развития устойчивости к данным новым лекарствам, эффективно создавая потребность в создании новых антибактериальных агентов для борьбы с данными возникающими штаммами. Заявляемое изобретение расширяет спектр средств для борьбы с бактериальной инфекцией, которые могут быть использованы при создании антибактериальных средств.

Краткое описание поясняющих материалов

Рис. 1. Структура (I), вместе с данными ЯМР. Протонные, углеродные и азотные химические сдвиги при 30С в CDCl₃ показаны красным голубым и зеленым цветом соответственно.

Рис. 2. Различающиеся фрагменты структуры компонентов (I) и (II) и ЯМР данные для этих фрагментов.

Рис. 3а - Спектры MS1 молекулярного иона соединения (I) [М+Н]+ и [M+Na]+.

Рис. 3б - спектр MS2 молекулярного иона [М+Н]+ при 1190.4234,

Рис. 3в - схема фрагментации родительского иона.

Рис. 4а - спектр MS2 молекулярного иона соединения (II) [М+Н]+ при 1154.4461,

Рис. 4б - схема фрагментации родительского иона.

Таблица 1 - Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) соединений I и II.

Осуществление изобретения

Пример 1. Характеристика штамма-продуцента, технология получения и определение подлинности полученных соединений.

Заявленные вещества структурной формулы (I) и (II) получают от штамма-продуцента Streptomyces sp. КММ 9044 из коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН, справка о депонировании №16146-203 от 19.05.2022, который относится к роду Streptomyces sp.

Штамм Streptomyces sp.КММ 9044 выделен из образца грунта, методом прямого посева суспензии грунта на агаризованную среду SWM с добавлением морской воды следующего состава (г/л): пептон - 5.0; дрожжевой экстракт - 2.5; глюкоза - 1.0; K₂НРО₄ - 0.2; MgSO₄ - 0.05; 500 мл дистиллированной воды, 500 мл морской воды.

Штамм Streptomyces sp. КММ 9044 выращивали на чашках Петри в течение 7-8 суток при температуре 28°С, поддерживали на агаризованной среде SY, хранили не более трех месяцев при температуре около 4°С в холодильной камере. Длительное хранение культуры осуществляли в жидком глицерине при -70°С.

На всех вышеуказанных средах цвет колоний изученного штамма КММ 9044 бесцветный или слегка желтоватый. Колонии на ранних стадиях роста непрозрачные, выпуклые, плотные, гладкие или слегка складчатые, обычно вросшие в агар. Белый воздушный мицелий образуется на среде Sucrose yeast в течение 5-7 суток. Вегетативные и воздушные гифы слабо или интенсивно фрагментируются с возрастом на палочковидные неподвижные элементы. Морфология изученных штаммов характерна для описанных видов стрептомицетов.

На основании анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК штамм относен к роду Streptomyces (семейство Streptomycetaceae, класс Actinobacteria) и наиболее близок к известным видам S. pseudovenezuelae DSM 40212^T (98.97% сходства), S. variegatus NRRL В-16380^T (98.96%), S. cahuitamycinicus 13K301^T (98.96%), S. qaidamensis S10^T (98.83%), S cacaoi subsp.asoensis NRRL В-16592^T (98.76%), S. phaeoluteigriseus DSM 41896^T (98.76%), S. adustus WH-9^T (98.69%) и S. humidus NBRC 12877^T (98.69%).

Результаты анализа геномной сборки Streptomyces sp.КММ 9044 показали, что штамм имеет размер генома 7.15 млн п.н. и ГЦ-состав ДНК-71.1 мол%.

Технология получения стрептоциннамидов основана на культивировании штамма-продуцента КММ 9044 и извлечении субстанции из культуральной жидкости (КЖ) указанного штамма методом твердофазной экстракции и жидкостной хроматографии. Она состоит из следующих этапов.

1. Подготовка посевного материала. Штамм Streptomyces sp. КММ 9044 выращивали на чашках Петри в течение 7 сут при температуре 28 С на среде Sucrose yeast (SY) следующего состава (г/л): сахароза - 40.0, дрожжевой экстракт - 5.0, K₂HPO₄ - 1.5, MgSO₄×7H₂O - 3.1, NaCl - 2.0, (NH₄)₂SO₄ - 2.0, FeSO₄×6H₂O - 0.001, MnCl₂×7H₂O - 0.001, ZnSO₄×7H₂O - 0.001, глюкоза - 2.0, агар - 15.0, дистиллированная вода - до 1 л, рН 6.8.

2. Выращивание посевного материала 1-й генерации (первого инокулята). Культуру переносили с поверхности агаризованной среды в колбу Эрленмейера объемом 750 мл с 50 мл питательной среды SY. Культивирование осуществляли при 28 С в течение 5 сут на термостатируемой качалке Innova 40 (New Brunswick Scientific) при 150 об/мин.

3. Выращивание посевного материала 2 генерации (второго инокулята). Посевную культуру второй генерации выращивали в среде SY в аналогичных условиях в течение 5 сут, используя для засева первый инокулят в количестве 5% об.

4. Культивирование в ферментере. Культивирование проводили в ферментере BIOSTAT A plus (Sartorius BBI Systems) объемом 2 л. В ферментер, содержащий 1350 мл стерильной среды SY, вносили посевной материал в объеме 10% (150 мл культуры на 1.5 л среды) и 150 мл стерильного раствора глюкозы с концентрацией 20 г/л (конечная концентрация 2 г/л). Культивирование проводили при температуре 28°С. Концентрацию растворенного кислорода (pO2) поддерживали на уровне 90%, скорость перемешивания составила 300 об/мин, количество стерильного воздуха, подаваемого в аппарат, - 1.5 л/мин, рН среды поддерживали в интервале 6.8 титрованием 25% раствором аммиака. Пеногаситель силикон (0.01%) вносили в конце первого дня культивирования. Продолжительность ферментации 43 ч.

5. Отделение КЖ от биомассы. Выращенную культуру центрифугировали на скорости 10000 rpm (центрифуга Beckman J2-21), после чего супернатант фильтровали. Были использованы стекловолоконные фильтры Whatman glass microfiber GF/A и MF-Millipore MCE membrane с диаметром пор 0.45 мкм. Полученный объем КЖ составил 1.2 л.

6. Подготовка сорбционного картриджа. Картридж заполняли полимерным сорбентом LPS-500-H, фракция 70 мкм (компании «Техносорбент») насыпным способом. Использовали картридж объемом 45 мл, вес сорбента около 7.5 г.

7. Нанесение КЖ на полимерный сорбент. Картридж промывали 150 мл ацетонитрила (АЦН) и активировали 150 мл дистиллированной воды с помощью перистальтического насоса Masterflex Easy-Load 11 при скорости потока 15 мл/мин. При той же скорости наносили КЖ; по окончании картридж промывали 150 мл воды. Картридж можно использовать повторно, но не более 5 раз.

8. Элюирование с картриджа с использованием флэш-хроматографа. Картридж присоединяли к линии подачи элюента хроматографа PuriFlash 5.250 и элюировали со скоростью 15 мл/мин смесью растворителей вода - АЦН (степень чистоты "для ВЭЖХ"). Содержание АЦН в элюенте было задано по следующей программе: начальный состав - 5%; 1 мин - 45%, 10 мин - 45%, 11 мин - 100%, 22 мин - 100%. Состав элюата контролировали с помощью УФ детектора при длине волны 290 нм. УФ профили имели два пика: мажорный пик в области 5-6 мин, отвечающий сумме нецелевых соединений, и минорный пик в области 13-15 мин, содержащий целевые соединения Scm А и Scm В, УФ спектр которых имеет максимум при 290 нм. Данную фракцию объемом около 30 мл собирали с помощью коллектора фракций.

9. Очистка субстанции. Очистку Scm А и Scm В проводили методом ВЭЖХ (хроматограф Шимадзу Нексера). Весь объем фракции после картриджа помещали в колбу роторного испарителя (Buchi Rotavapor), концентрировали примерно в 5 раз. К раствору добавляли раствор 0.1% уксусной кислоты - половину от полученного объема (в конкретном случае 30 мл концентрировали до 6 мл и добавляли 3 мл раствора уксусной кислоты). При наличии осадка раствор центрифугируют на скорости 10000 rpm, супернатант переносят в пробирки. Разделение проводят колонке полупрепаративного размера на сорбенте типа С18, фракция 5 или 10 мкм, при том же составе элюента, температуре термостата колонки и длине волны УФ детектора, как в п. 5. Расходы элюента и объем пробы, элюируемой за один цикл разделения, выбирают в зависимости от размера колонки. На колонке 9.2×150 мм проводили разделения порциями по 1.5 мл при скорости потока 3 мл/мин. Продолжительность каждого разделения составляет 20 мин. Для очистки всего объема фракции требуется повторить операцию несколько раз, в данном случае 6 раз.

10. Получение сухого продукта из растворов фракций. Растворы фракций объединяют, сливают в колбу и высушивают на роторном испарителе с минимальным подогревом или на лиофильной сушке с центрифугой типа MiVac. Общий выход вещества составляет 3-5 мг на 1 л КЖ. Количество извлекаемого продукта и соотношение компонентов Scm А и Scm В в образцах может варьировать из-за влияния разных факторов на продукцию штамма.

Все этапы технологии могут быть масштабированы при использовании соответствующего оборудования и на общих принципах, применяемых при динамических сорбционных процессах.

В результате были получены соединения Scm A(Z) (структурная формула I) и, Scm B(Z) (структурная формула II). Структурные формулы установлены по результатам ЯМР-спектроскопии (рис. 1, 2) и тандемной масс-спектрометрии высокого разрешения (рис. 3, 4).

Анализ спектров ЯМР позволил прямо выяснить структуру циклического депсипептида, состоящего из семи аминокислотных остатков: треонина, двух лейцинов, пролина, трех непротеиногенных аминокислот и глицериновой кислоты. О-ацилированный треонин находится на N-конце пептидной части, за ним следует лейцин, затем О-ацетилированный 4-ацетокси-5-метилпролин, затем лейцин, N-гидроксивалин и, наконец, пролин на С-конце. Треонин N-ацилируется 2-метокси-6,8-дихлор-7-гидроксикоричной кислотой в Z-конформации, и его боковая цепь образует сложноэфирную связь с 3-гидрокси-4-хлорвалином. Наконец, цикл замыкается через глицериновую кислоту, соединяющую карбонил пролина и амид хлоргидроксивалина. Важно отметить, что амид модифицирован гидроксильной группой, что непосредственно наблюдается в 1Н ЯМР при 8,19 м.д. Две аминокислоты в структуре, 3-гидрокси-4-хлорвалин и транс-4-ацетокси-5-метил-L-пролин, являются редкими фрагментами в депсипептидах. Новый антибиотик получил название стрептоциннамид A(Z).

Пример 2.

Подтверждение антибактериальной активности заявленных соединений.

Для тестирования были использованы штаммы Micrococcus sp.КММ 1467 из коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ им. Г.Б. Елякова, Arthrobacter sp.21022 (АТСС) и Mycobacterium smegmatis АТСС 700084 из коллекции Lytech Co. Ltd.

Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) бактерий определяли серийными двукратными разведениями (0,1-10000 нг/мл) в бульоне 2YT (BD, США). МИК определяли как наименьшую концентрацию, препятствующую росту тестируемого организма в 96-луночном планшете после 16 ч культивирования. Для Mycobacterium smegmatis МИК определяли через 60 ч культивирования. Минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) определяли как наименьшую концентрацию, препятствующую повторному культивированию тест-организма через 24 ч инкубации. Длительное культивирование приводит к разложению Scm и к завышенным значениям МИК. Временной ход роста бактерий отслеживали при 800 нм с использованием многорежимного считывающего устройства Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США).

Оба варианта структур имеют противомикробную активность, причем для репортерного штамма Micrococcus sp.КММ 1467 величины минимальных ингибирующих концентраций (МИК) были на уровне нг/мл: 6 нг/мл для Scm А и 2 нг/мл для Scm В, т.е. значения для эпокси-производного в несколько раз ниже, чем значения для хлор-производного.

В отношении других патогенов активность соединений была существенно ниже. Были измерены МИКи для Scm А и получены значения, отраженные в табл. 1.

Изобретение относится к новым антибактериальным депсипептидным соединениям и может быть использовано для создания средств для лечения микробных инфекций человека и животных. Также предлагается применение указанного соединения для приготовления средства, обладающего антибактериальной активностью. Заявляемое изобретение расширяет спектр средств для борьбы с бактериальной инфекцией, которые могут быть использованы при создании антибактериальных средств. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 2 пр.

R: или

1. Соединение общей структурной формулы:

где R представляет собой следующие радикалы:

или

2. Применение соединения по п. 1 для приготовления средства, обладающего антибактериальной активностью.