СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИТРИЛО-СТИЛЬБЕНА (СОЕДИНЕНИЯ А-104815) Российский патент 2022 года по МПК C07D317/64 

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, в частности к химиотерапии злокачественных новообразований.

В настоящий момент в химиотерапии различных злокачественных новообразований эффективно используют доцетаксел и паклитаксел. Эти лекарственные средства являются полусинтетическими цитостатическими препаратами растительного происхождения из группы таксанов, которые получаются путем химического синтеза из природного сырья -из игл тиса европейского (Taxus baccata). Субстанция паклитаксел является действующим компонентом, входящим в состав ряда онкопрепаратов, самый известный из них Таксол. Препарат Таксол прочно занял ведущие позиции в лечении наиболее часто встречающихся злокачественных опухолей - рака молочной железы, легкого, рака головы и шеи, мочевого пузыря, пищевода, лейкемии. В зависимости от формы и локализации заболевания общая доля полной и частичной регрессии составляет не менее 50%, то есть терапия с использованием паклитаксела является весьма эффективной.

Препараты на основе паклитаксела могли бы применяться гораздо шире, но ограничивающим фактором является недостаточность химической базы для их производства, прежде всего, для производства субстанции паклитаксел, которая содержится в коре отдельных видов тиса. Поскольку содержание активных веществ в коре незначительно, для получения 1 кг паклитаксела необходимо 9-12 тонн коры, для получения которой, в свою очередь, необходимо срубить 2000-4000 деревьев. Из этого количества исходного сырья может быть произведено готового лекарства на 15 тыс. курсов лечения. Очевидно, что низкое содержание активных веществ в исходном сырье определяет высокую стоимость субстанции паклитаксела. Другим следствием является то, что удовлетворение ежегодной потребности в производстве лекарственных форм из субстанции паклитаксела в перспективе может привести к уничтожению всей популяции тиса. Следовательно, производство паклитаксела из природных источников в нужном объеме нанесет существенный урон лесным экосистемам. Попытки получить паклитаксел с помощью химического синтеза для крупномасштабного коммерческого получения данного вещества успехом не увенчались из-за своей высокой стоимости.

Существующие мощности производства, в основном из природного сырья, обеспечивают выпуск субстанции паклитаксела в объеме около 400 кг в год при существующей в настоящее время общемировой потребности не менее 600 кг в год, что соответствует 8-9 млн курсов лечения.

Несмотря на значительные производственные мощности, субстанция остается чрезвычайно дорогой, поскольку большинство производителей пользуются технологией экстракции из природного растительного сырья. Цена субстанции паклитаксела составляет 200-600 долларов США за 1 г в зависимости от качества и производителя.

Комбретастатин СА4 (Фиг. 1), который был выделен в 1988 году из семян Южного Африканского растения Combretum caffrum, является одним из самых известных природных цитостатиков, механизм действия которых основан на ингибировании полимеризации белка тубулина.

Однако, несмотря на высокую цитостатическую/цитотоксическую активность in vitro (ИК₅₀: 1-10×10^-9 М), вышеназванное вещество не нашло применения в медицинской практике из-за своего физического строения в физиологических растворах. Наиболее активная форма Комбретастатина СА4 существует в цис-положении, которое в живом организме млекопитающих, предположительно, под действием ферментов легко переходит в мало токсичный для опухолевых клеток транс-изомер.

Многочисленные попытки стабилизировать цис-форму Комбретастатина СА4 путем введения различных заместителей в ядра А и Б были безуспешными. Любое отклонение от канонической формы молекулы Комбретастатина СА4 приводило к резкому падению цитотоксичности в отношении опухолевых клеток.

Обычно все методы синтеза производных Комбретастатина СА4 не затрагивают кольцо А (3,4,5-триметоксифенильный остаток), поскольку ранее считалось, что триметоксифенильный радикал является обязательным условием высокой цитотоксичности соединения. Все изменения приходились на кольцо В (3-гидрокси-4-метоксифенильный радикал). Еще одним направлением модификации формулы Комбретастатина СА4 являлся этиленовый мостик между фенильными радикалами. В большинстве случаев синтез заключается в замене этиленового мостика на гетероциклический фрагмент или на мостик из трех атомов углерода. Следует отметить также введение новых функциональных групп в ядро В для повышения гидрофильности преобразованной молекулы Комбретастатина СА4, поскольку одним из недостатков Комбрестатина СА4 и его аналогов является низкая растворимость в воде.

Еще одним направлением получения производных Комбретастатина СА4 являлся синтез его производных с заместителями при двойной связи двух ароматических ядер, которые тормозили бы переход наиболее активной цис-формы в транс-форму молекулы Комбретастатина СА4.

Одним из таких способов стабилизации цис-формы является введение электроотрицательного заместителя, например, С-О или -CN (нитрила) непосредственно к двойной связи между ароматическими циклами.

Однако и эти изменения молекулы не привели к повышению цитотоксичности производных, имеющих заместитель при двойной связи по отношению к Комбретастатину СА4.

Существуют разнообразные производные Комбретастатина СА4 (US 5525632, US 5674906, US 5731353), в которых при двойной связи находится нитрильная группа. Эти соединения проявляют в условиях in vivo значительную цитотоксическую активность, превосходя по своим действиям Комбретастатин СА4 (Фиг. 2).

Однако во всех известных производных Комбретастатина СА4 речь идет о триметоксифенильных производных кольца А производных СА4.

Описанные производные Комбретастатина СА4 (нитрило-стильбены) (US 5525632, US 5674906, US 5731353) отличаются от аналогичных незамещенных производных СА4 тем, что сохраняют цис-структуру в биологических жидкостях в опытах in vivo, а также сохраняют высокую физиологическую активностью в живых организмах. Подчеркивается, что высокая физиологическая активность производных нитрило-стильбенов обеспечивается триметоксигруппами при фенильном ядре в кольце А.

Прототипом служит Патент US 5731353.

Главный недостаток способов синтеза производных Комбретастатина СА4, содержащих нитрильную группу при двойной связи, заключается в малой доступности исходных соединений, что не позволяет решить задачу, поставленную перед нами.

Следовательно, поиск более дешевого цитостатика и метода его получения является актуальной задачей.

Целью настоящего изобретения явилась разработка технологии получения из доступного отечественного сырья оригинального цитостатического вещества на основе Комбретастатина СА4 для химиотерапии опухолей, который обладает высокой цитостатической/цитотоксической активностью (ИК₅₀ - 6,0 - 8,0×10^-8 М) в отношении опухолевых клеток человека и животных различного гистогенетического происхождения, и приближающегося по цитостатической/цитотоксической активности к природному Комбретастатину СА4 и доцетакселу.

Задачей изобретения является способ получения аналогов производных Комбретастатина СА4 с нитрильной группой при двойной связи.

Задача решается тем, что в качестве исходного соединения используют 4-метоксибензальдегид и 3-метокси-(4,5-метилендиокси) бензиловый спирт, который последовательно хлорируют, замещают галоид на нитрильную группу и сплавляют с 4-метоксибензальдегидом с образованием соединения А-104815:

Изобретение поясняется подробным описанием, примерами и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг. 1 - Комбретастатин СА4.

Фиг. 2 - Нитрило-стильбены.

Фиг. 3 - Комбретастатин А2 (СА2).

Фиг. 4 - (Е)-2-(7-метокси-1,3-бензодиоксол-5-ил)-3-(4-метоксифенил)-проп-2-ене-нитрил (А-104815).

Фиг. 5 - Общая схема получения (Е)-2-(7-метокси-1,3-бензодиоксол-5-ил)-3-(4-метоксифенил)-проп-2-ене-нитрила (А-104815):

а) - первая стадия хлорирования осуществляется с помощью тионилхлорида с образованием хлорида 2;

б) - вторая стадия заключается в замене хлорина на нитрильную группу с помощью KCN с образованием соответствующего нитрила 3;

в) - третья стадия заключается в конденсации нитрила 3 и анисового альдегида с образованием соответствующего нитрило-стильбена 4 (А-104815).

г) получение нитрило-стильбена (соединения А-104815) - (Е)-2-(7-метокси-1,3-бензодиоксол-5-ил)-3-(4-метоксифенил)-проп-2-ене-нитрил.

Фиг. 6 - Цитостатическая активность соединения А-104815 (1) и Таксакад® (2) относительно опухолевых клеток карциномы предстательной железы человека (РС-3).

Фиг. 7 - Цитостатическая активность соединения А-104815 (1) и Таксакад® (2) относительно опухолевых клеток аденокарциномы легкого человека (А549).

Фиг.8 - Цитостатическая активность соединения А-104815 (1) и Таксакад® (2) относительно опухолевых клеток гортаноглотки человека (НЕр2).

Фиг. 9 - Цитостатическая активность соединения А-104815(1) и Таксакад®(2) относительно опухолевых клеток саркомы мыши (S-37).

Фиг. 10 - Цитостатическая активность соединения А-104815(1) и препарата Таксакад®(2) относительно опухолевых клеток аденокарциномы толстой кишки мыши (С26).

Из работы «Полиоксифоаваноиды - ингибиторы тубулина», опубликованной в RusChemRev 2015-134, стало известно еще об одном природном Комбретастатине А2, в котором в фенильном ядре А вместо трех метоксильных групп присутствует одна 3-мето-ксильная группа и 4,5-метилендиокси -группа.

Мы полагали, что при введении нитрильной группы (-CN) при двойной связи молекулы СА2 (Фиг. 3) возможно получить биологически активное соединение, обладающее цитотоксической и антитубулиновой активностью, а сам синтез будет доступен для промышленного масштабирования.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве исходного соединения использовали 3-метокси-4,5-метилендиокси-бензиловый спирт, который в настоящее время является доступным соединением благодаря современным методам экстракции полиметокси-фенолов из семян петрушки и оригинальной технологии, разработанной авторами патента.

Вторым компонентом является 4-метоксибензальдегид (анисовый альдегид), доступный и дешевый химический реактив.

Для получения соответствующего аналога нитрило-стильбена (Фиг. 4) 3-метокси-4,5-метилендиокси-бензиловый спирт переводят в соответствующий хлорид, а затем по реакции замещения галоида на нитрильную группу, получают нитрил. Далее, образовавшийся нитрил по реакции Кневенагеля обрабатывают 3-гидрокси-4-метоксибензальдегидом с образованием нитрило-стильбена (А 104815) с практически количественным выходом. Общая схема получения (Е)-2-(7-метокси-1,3-бензодиоксол-5-ил)-3-(4-мето-ксифенил)проп-2-ене-нитрил (А-104815) представлена на Фиг. 5.

Полученное соединение А104815 по своим цитостатическим свойствам превосходит препарат Таксакад® на 50%, а финансовые затраты на его получение на порядок ниже, чем для получения препарата Таксакад®.

Следовательно, поставленная задача разработки синтеза относительно дешевого цитостатика из доступного в РФ сырья была успешно решена.

Экспериментальная часть - Технология синтеза 2-(7-метокси-1,3-бензодиоксол-5-ил)-3-(4-метоксифенил)проп-2-ене-нитрила(А-104815).

1. Общая процедура синтеза Нитрило-стильбена А-104815.

Общие экспериментальные процедуры проводились в ФГБУН ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН. Спектры ЯМР были получены на приборе Bruker DR-500: рабочие частоты 500,13 МГц (1Н) и 75,47 (13С). Масс-спектры были получены на приборе Finnigan МАТ / INCOS 50 (70 эВ) с использованием прямого введения зонда. Элементный анализ осуществляли с помощью автоматического микроанализатора Perkin-Elmer 2400 CHN.

Озонолиз проводился с использованием специально разработанного аппарата в ФГБУН ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН, оборудованного ИК-детектором концентрации О₃ (Япония) и автоматической цепью отключения. Устройство допускает контролируемую генерацию озона с максимальной производительностью 10 г/ч в час из О₂.

Исходный 4-метоксибензальдегид (анисовый альдегид) был приобретен в фирме Acros Organics; 3-метокси-(4,5-метилендиокси) бензиловый спирт с Т плавления (т.пл.) 66-67°С получали по отработанной технологии из 1-аллил-3-метокси-4,5-метилендиоксибензола (98-99%) чистоты, полученного из масла семян петрушки, путем высокоэффективной экстракции жидким СО₂ с последующей высокоэффективной ректификацией, озонолиза и каталитического восстановления, используя устройства опытного завода в ФГБУН ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН (Москва, Россия).

Получение 3-метокси-4,5-метилендиоксибензилхлорида (2).

К раствору соединения 4 (3,00 г, 16,5 ммоль) и Et3N (2,43 мл, 17,5 ммоль) в 1,2-дихлорэтане (80 мл) по каплям добавляют SOCl2 (1,80 мл, 24,7 ммоль) и смесь перемешивают в течение 6 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь промывают 5% Na₂CO₃, сушат над безводным Na₂SO₄ и упаривают. Сырой продукт очищают колоночной хроматографией (н-гексан : EtOAc=3:1), получая 5 (3,21 г, 96,7%) в виде белого порошка: т.пл. 94-96°С; 1 Н-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) d: 3,90 (ЗН, с), 4,43 (2Н, с), 5,97 (2Н, с), 6,56 (1Н, с), 6,58 (1H, с)

Получение 3-метокси-4,5-метилендиоксифенилацетонитрила (3).

К раствору 20,3 г (0,1 моль) 3-метокси-4,5-метилендиоксибензилхлорида(5) в 120 мл ацетонитрила добавляют дибензо-18-краун-6 (0,5 г, 1,4 ммоль) с последующим добавлением высушенного KCN (15 г, 0,23 моль). Смесь выдерживают при 50°С в течение 10 часов. Отфильтровывают твердый остаток. Растворитель концентрируют в вакууме и обрабатывают водой (200 мл). Остаток отфильтровывают и перекристаллизовывают из EtOH, получая соответствующий нитрил 3. Получается 17,25 г (90%) 3-метокси-4,5-метилендиоксибензилнитрила (3). Т пл. 88-90°С (лит. т.пл. 89-90°С); 1H ЯМР (ДМСО-d6, 500 МГц) 5 6,65 (1Н, д, J=1,5 Гц, Н-4), 6,60 (1H, д, J=1,5 Гц, ArH-6), 6,00 (2Н, с, OCH2O), 3,90 (2Н, с, СН2), 3,83 (3Н, с, ОСН3); EIMS m / z 191 [М]+(100), 190 (43), 176 (11), 160 (5), 146 (23), 133 (16), 90 (51), 78 (19), 77 (17), 64 (20).

Получение (Е)-2-(7-метокси-1,3-бензодиоксол-5-ил)-3-(4-метоксифенил)проп-2-ене-нитрила(А-104815).

1,95 г (0,01 моль) 3-метокси-4,5-метилендиоксибензилнитрила (3) смешивают с 1,36 г (0,01 моль) 4-метоксибензальдегида. Нагревают при перемешивании до 60°С и выдерживают 2 часа при этой температуре. Конечный продукт, 2-(7-метокси-1,3-бензо-диоксол-5-ил)-3-(4-метоксифенил)проп-2-ене-нитрил (А-104815), перекристаллизовывают из метанола. Получают 6,95 г (98%) твердого кристаллического вещества с Т пл. 115-117°С.

ЯМР 1H (ДМСО-d6, 500 МГц).

6.95 и 7.01 это дублет дублетов с JJ=30 Hz и с J=1.5 Hz, а сигналы 7.09 и 7.11 тоже дублет дублетов с JJ=12 Hz, a J=8Hz. 6.11 это синглет.

Анализ. Вычислено для C18H15NO4, С 69,9%, Н 4,85%, N 4,53; Найдено С 69,57%; Н 4,68%; N 4,53%$

EIMS m/z 309 [М]+(100)

2. Цитотоксическая активность (Е)-2-(7-метокси-1,3-бензо-диоксол-5-ил)-3-(4-метоксифенил)-проп-2-ене-нитрил(А-104815) в тест-системе in vitro.

Методика исследования цитотоксической активности А-104815 в тест-системе in vitro на опухолевых клетках человека и животных различного происхождения.

Исследование цитотоксической/цитостатической активности в системе in vitro проводили на 3-х клеточных линиях опухолей человека - аденокарциноме легкого (А 549), карциноме предстательной железы (РС-3), эпидермоидной карциноме гортаноглотки (НЕр2) и 2-х клеточных линиях опухолей мыши - саркоме (S-37) и карциноме толстой кишки (С26). Для культивирования опухолевых клеток использовали питательные среды Игла-MEM (А549, НЕр2), F-12K (РС-3), ДМЕМ (S-37, С26) с добавлением 2 mM L-глугамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Культивирование проводили при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% содержанием СО₂. Клетки рассевали в лунки плоскодонного 96-луночного микропланшета в концентрации 1×10⁵ клеток в мл. Через 24 часа вносили тестируемые соединения - нитрило-стильбен А-104815 и препарат сравнения - Таксакад® (действующее вещество - паклитаксел) в серийных разведениях, варьируя концентрацию от 10^-12 М до 10^-5 М, и инкубировали в течение 72 часов при 37°С в атмосфере с 5% содержанием CO₂. Выживаемость клеток определяли визуально, оценивая с помощью световой микроскопии морфологические изменения клеток, и калориметрическим методом с использованием МТТ-теста. Биологически значимым эффектом считали ингибирование роста клеток в культуре более чем на 50%.

Выявлено, что соединение А-104815 проявляло высокую специфическую активность относительно опухолевых клеток в системе in vitro, величина ИК₅₀ варьировала от 60 нМ до 80 нМ в зависимости от культуры клеток, отмечено, что цитотоксическая активность препарата Таксакад® оказалась сопоставимой с изученным соединением (величина ИК₅₀ составляла 100-120 нМ).

Настоящее изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Цитотоксическая активность А-104815 относительно опухолевых клеток рака предстательной железы человека (культура РС-3).

Изучение цитотоксической активности А-104815 относительно опухолевых клеток рака предстательной железы (РС-3) показало, что соединение проявляло высокую цитотоксическую активность относительно опухолевых клеток культуры РС-3, сопоставимую со специфической активностью препарата Таксакад®, так величина ИК₅₀ А-104815 составила 65 нМ (6,5×10^-8 М), препарата Таксакад® - 100 нМ (1,0×10^-7 М) (Фиг. 6).

Пример 2. Изучение цитотоксической активности А-104815 относительно опухолевых клеток аденокарциномы легкого человека (культура А549).

Изучение цитотоксической активности А-104815 относительно клеток аденокарциномы легкого человека (А549) показало, что изученное соединение проявляло высокую цитотоксическую активность относительно опухолевых клеток культуры А549, сопоставимую со специфической активностью препарата Таксакад®, так величина ИК₅₀ А-104815 составила 60 нМ (6,0×10^-8 М), препарата Таксакад® - 100 нМ (1,0x10^-7 М) (Фиг. 7).

Пример 3. Изучение цитотоксической активности А-104815 относительно опухолевых клеток эпидермоидной карциномы гортаноглотки человека (культура НЕр2)

Изучение цитотоксической активности А-104815 относительно карциномы гортаноглотки человека (НЕр2) показало, что изученное соединение проявляло высокую цитотоксическую активность относительно опухолевых клеток культуры НЕр2, сопоставимую со специфической активностью препарата Таксакад®, так величина ИК_{50 А-104815 составила 70 нМ (7,0×10^-8 М), препарата Таксакад® - 100 нМ (1,0×10^-7 М) (Фиг. 8).}

Пример 4. Изучение цитотоксической активности А-104815 относительно опухолевых клеток саркомы мыши (культура S-37).

Изучение цитотоксической активности А-104815 относительно опухолевых клеток саркомы мыши (S-37) показало, что соединение проявляло высокую цитотоксическую активность относительно опухолевых клеток культуры S-37, сопоставимую со специфической активностью препарата Таксакад®, так величина ИК₅₀ А-104815 составила 70 нМ (7,0×10^-8 М), препарата Таксакад® - 100 нМ (1,0×10^-7 М) (Фиг. 9).

Пример 5. Изучение цитотоксической активности А-104815 относительно опухолевых клеток аденокарциномы толстой кишки мыши (культура С26).

Изучение цитотоксической активности А-104815 относительно аденокарциномы толстой кишки мыши (С26) показало, что соединение проявляло высокую цитотоксическую активность относительно опухолевых клеток культуры С26, сопоставимую со специфической активностью препарата Таксакад®, так величина ИК₅₀ А-104815 составила 80 нМ (8,0×10^-8 М), препарата Таксакад® - 100 нМ (1,0×10^-7 М) (Фиг. 10).

Предлагаемое нами соединение (Е)-2-(7-метокси-1,3-бензодиоксол-5-ил)-3-(4-метоксифенил)-проп-2-ене-нитрил (А-104815) является оригинальным и доступным веществом, при получении которого используется только отечественное сырье. Данный способ получения не имеет аналогов на территории Российской Федерации,

Предлагаемое соединение - (Е)-2-(7-метокси-1,3-бензодиоксол-5-ил)-3-(4-метоксифенил)-проп-2-ене-нитрил (А-104815) в опухолевых клетках ингибирует полимеризацию тубулинов, что приводит к нарушению фазы митоза и межфазных взаимодействий в клетках. Нитрило-стильбен А-104815 является высокоактивным цитостатиком с ИК₅₀=6,5-8,0×10^-8 М, что на 20-50% превышает цитотоксическую активность используемого в настоящее время препарата Таксакад®.

Изобретение относится к способу получения (Е)-2-(7-метокси-1,3-бензодиоксол-5-ил)-3-(4-метоксифенил)-проп-2-ене-нитрила (нитрило-стильбена - соединения А-104815), который заключается в том, что в качестве исходного соединения используют 4-метоксибензальдегид и 3-метокси-(4,5-метилендиокси)бензиловый спирт, который хлорируют, затем замещают галоид на нитрильную группу и полученное производное сплавляют с 4-метоксибензальдегидом с образованием соединения А-104815. Технический результат – разработан способ получения соединения А-104815 с высоким выходом, которое может найти применение в медицине для химиотерапии опухолей. 10 ил., 5 пр.

А-104815

Способ получения (Е)-2-(7-метокси-1,3-бензодиоксол-5-ил)-3-(4-метоксифенил)-проп-2-ене-нитрила (нитрило-стильбена - соединения А-104815), характеризующийся тем, что в качестве исходного соединения используют 4-метоксибензальдегид и 3-метокси-(4,5-метилендиокси)бензиловый спирт, который хлорируют, затем замещают галоид на нитрильную группу и полученное производное сплавляют с 4-метоксибензальдегидом с образованием соединения А-104815: