КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПРОБИОТИКИ И ПОЛИПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АФФИННОСТЬЮ СВЯЗЫВАНИЯ В ОТНОШЕНИИ IGE, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2022 года по МПК A61K35/744 A61K35/745 A61K35/747 A61K39/395 A61P37/08 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к композиции для лечения или предупреждения аллергического заболевания.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Пищевая аллергия представляет собой заболевание, вызываемое сниженной иммунологической резистентностью к непатогенным пищевым антигенам (аллергенам). Заболевание может приводить к снижению качества жизни вследствие ограничений питания и может быть угрожающим жизни в случае развития острой и хронической анафилаксии. Число аллергических заболеваний, таких как аллергический ринит и атопический дерматит, а также пищевая аллергия, растет с высокой скоростью в индустриализированных и европизированных современных обществах. Кроме того, также возрастает число случаев развития анафилаксии, тяжелой аллергической реакции. Эти иммунные заболевания значительно ухудшают качество жизни и социально-экономические затраты растут соответствующим образом. Таким образом, существует острая потребность в мерах по преодолению таких заболеваний.

Хотя пищевые аллергические заболевания могут развиваться посредством IgE-опосредуемого или не IgE-опосредуемого иммунного ответа, IgE-опосредуемая пищевая аллергия является наиболее распространенной. При IgE-опосредуемой пищевой аллергии аллергены связываются с IgE, и связанный с аллергеном IgE связывает FcεRI, высокоаффинный Fc-рецептор для IgE, на эффекторных клетках, таких как тучные клетки и базофилы, тем самым индуцируя активацию эффекторных клеток. В случае, когда эффекторные клетки активируются, модуляторы высвобождаются, тем самым вызывая гиперчувствительность немедленного типа. В дополнение к пищевым аллергическим заболеваниям, большинство аллергических заболеваний вызываются чрезмерным иммунным ответом вследствие иммуноглобулина E (IgE). IgE представляет собой антитело, которое обычно присутствует в сыворотке в очень низкой концентрации. IgE также продуцируется в результате воздействия безопасных антигенов. В случае, когда уровень IgE возрастает без какого-либо конкретного стимула, может возникать аллергическое заболевание. Аномально увеличенное количество IgE может связываться с высокоаффинными Fc-рецепторами IgE (FcεRI), которые экспрессируются на поверхности тучных клеток, базофилов и т.п.

Такое связывание между IgE и Fc-рецептором IgE вызывает высвобождение тучными клетками или базофилами химических медиаторов, таких как гистамин, лейкотриен, простагландин, брадикинин и активирующие тромбоциты факторы. Высвобождение этих химических медиаторов тучными клетками или базофилами приводит к аллергическим симптомам. В частности, более тяжелые аллергические симптомы могут присутствовать, когда IgE и FcεRI связываются друг с другом. Известно, что уровень FcεRI-эспрессирующих клеток возрастает у пациентов с аллергией.

Для лечения аллергических заболеваний были предложены различные способы, такие как избегание аллергена, введение противоаллергических средств, модулирование синтеза IgE в организме и разработка антител против IgE. Однако такие способы имеют множество недостатков, таких как неспособность вылечить основную причину аллергии, недостаточную эффективность лекарственных средств и возникновение серьезных побочных эффектов.

Между тем, исследован способ использования микроорганизмов, таких как молочнокислые бактерии, для лечения или смягчения аллергических заболеваний. Такие здоровые микроорганизмы называют пробиотиками. Однако способы выявления и оценки пробиотиков для иммунного контроля, такого как ингибирование аллергии, еще не разработаны. В частности, исследований основного механизма действия пробиотиков недостаточно и большинство из исследований проведено in vitro. Иными словами, хотя пробиотики принимают перорально, большинство испытаний до настоящего времени было сфокусировано на экспериментах in vitro с использованием клеточных линий, и эти экспериментальные способы имеют существенный недостаток, состоящий в том, что невозможно предоставить замену испытаниям функций, которые могут демонстрироваться, когда человека принимает пробиотики.

Кроме того, проводили исследования композиций иммуноглобулинов для лечения аллергических заболеваний. Описано, что такие композиции являются пригодными для лечения IgE-опосредуемых нарушений, включая аллергию и астму (KR10-1783272B1). В частности, омализумаб (торговое наименование: Xolair), который нацелен на Fc-часть IgE-антитела, разработан и используется в качестве терапевтического средства против не поддающейся лечению тяжелой астмы и не поддающейся лечению крапивницы. Однако для поддержания эффекта требуется введение высокой дозы омализумаба. Таким образом, было описано, что омализумаб имеет высокую стоимость и побочные эффекты, такие как ангионевротический отек и анафилактическая реакция (The Journal of Clinical Investigation, Volume 99, Number 5, March 1997, 915-925).

Хотя основной механизм, посредством которого омализумаб вызывает побочные эффекты, еще не идентифицирован, можно ожидать, что он вызван тем, что омализумаб представляет собой IgG1-антитело. Исследование в модели на мышах показало, что большое количество антигенспецифических IgG1-антител могут индуцировать пассивную системную анафилаксию (PSA) через FcγRIII, низкоаффинный рецептор IgG, и активирующие тромбоциты факторы в богатой антигенами среде. Кроме того, такая IgG-опосредуемая анафилаксия возникает в чрезмерной степени вследствие отсутствия передачи сигнала FcεRI. Таким образом, пассивная системная анафилаксия может возникать в случае, когда значительное количество омализумаба инъецируют пациенту с аллергическим заболеванием, который демонстрирует высокий уровень IgE. Недавно было описано, что FcγRIIA, низкоаффинный рецептор IgG, экспрессируемый у человека, также ассоциирован с IgG-опосредуемой анафилаксией. Кроме того, постмаркетинговые исследования показали аномальные реакции, такие как аллергический гранулематозный васкулит и идиопатическая тяжелая тромбоцитопения.

Техническая проблема

Хотя было проведено множество исследований аллергических заболеваний, способ значительного смягчения аллергических заболеваний еще не разработан. Задачей настоящего изобретения является предоставление композиции для лечения или предупреждения таких аллергических заболеваний.

Решение проблемы

Согласно одному аспекту настоящего изобретения, предусматривается композиция, содержащая в качестве активных ингредиентов пробиотики и полипептид, обладающий способностью связываться с IgE.

В другом аспекте предусматривается фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения аллергического заболевания, содержащая указанную композицию в качестве активного ингредиента. В другом аспекте предусматривается диетическая функциональная пищевая композиция для смягчения или облегчения симптома аллергии, содержащая указанную композицию в качестве активного ингредиента.

В другом аспекте предусматривается набор для лечения или предупреждения аллергического заболевания, содержащий первую композицию, которая содержит пробиотики, и вторую композицию, которая содержит полипептид, обладающий способностью связываться с IgE.

Преимущественные эффекты изобретения

Композиция, содержащая в качестве активных ингредиентов пробиотики и полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, в соответствии с настоящим изобретением, демонстрирует превосходный эффект смягчения аллергии in vivo. Таким образом, композицию можно использовать в качестве фармацевтической композиции для лечения или предупреждения тяжелого аллергического заболевания. Более того, с точки зрения того, что композицию по настоящему изобретению можно применять для пероральной иммунотерапии, композиция может быть не только более эффективной при пищевой аллергии при одновременном снижении побочных эффектов, но также может быть идеальной для лечения детей, страдающих от IgE-опосредуемой аллергии. Таким образом, композицию можно использовать в качестве диетического функционального продукта питания для смягчения или ослабления симптома аллергии.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 проиллюстрирована схематическая диаграмма строения мономера, являющегося вариантом осуществления (IgE_TRAP) полипептидного димера по настоящему изобретению. Вариант осуществления IgE_TRAP может состоять из 425 аминокислот FcεRIα человека (область от 26-й аминокислоты до 205-й аминокислоты во внеклеточном домене FcεRIα, 180 а.к.) и гибридного Fc IgD/IgG4 (245 аминокислот). Гибридный Fc IgD/IgG4 имеет FcRn-связывающий участок (правая штриховая линия), но лишен участков связывания для FcγR и C1q (левая штриховая линия). Здесь, IgD может представлять собой область (38 а.к.) от 133-й аминокислоты до 170-й аминокислоты, и IgG4 может представлять собой область (207 а.к.) от 121-й аминокислоты до 327-й аминокислоты.

На фиг. 2 проиллюстрирована трехмерная структурная модель гомодимера IgE_TRAP. Структура демонстрирует внеклеточный домен FcεRIα (синий), шарнирную область IgD (желтый) и Fc IgG4 (зеленый).

На фиг. 3 проиллюстрированы результаты SDS-PAGE для полипептидов, обладающих способностью связываться с IgE, продуцированным в каждой клеточной линии (фиг.3A). Здесь можно видеть, что укороченная форма не образуется ни в восстанавливающих условиях, ни в не восстанавливающих условиях (фиг. 3A и 3B).

На фиг. 4 проиллюстрированы результаты экспериментов по изоэлектрическому фокусированию (GEL-IEF), проведенные для идентификации повышения содержания сиаловых кислот в полипептидах, обладающих способностью связываться с IgE, который продуцировался в каждой клеточной линии. Содержание белков с пониженной основной изоэлектрической точкой (pI) возрастает вследствие увеличения содержания отрицательно заряженной сиаловой кислоты, вызванного введением гена трансферазы сиаловых кислот. На основании этого, можно видеть, что содержание кислых белков возрастает посредством добавления трансферазы сиаловых кислот.

На фиг. 5 проиллюстрированы результаты SDS-PAGE для не восстановленных и восстановленных форм полипептидного димерного белка (IgE_TRAP) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. В частности, можно видеть, что полипептидный димер обладает высокой чистотой даже в культуральном супернатанте, который соответствует материалу на входе.

На фиг. 6 проиллюстрированы результаты, полученные путем проведения анализа SDS-PAGE для IgE_TRAP в условиях с восстановлением и без восстановления.

На фиг. 7 проиллюстрирован график, демонстрирующий способность связывания омализумаба с IgE. На графике показаны результаты, полученные путем иммобилизации омализумаба и анализа его связывающей способности в зависимости от использованных концентраций IgE. Взаимодействие между IgE человека и омализумабом анализировали с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и вычисляли аффинность связывания каждой молекулы.

На фиг. 8 проиллюстрирован график, демонстрирующий способность связывания с IgE полипептидного димерного белка (IgE_TRAP) в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения. На графике показаны результаты, полученные путем иммобилизации IgE_TRAP и анализа его способности к связыванию в зависимости от используемых концентраций IgE. Взаимодействие между IgE и IgE_TRAP анализировали с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и вычисляли аффинность связывания каждой молекулы.

На фиг. 9-13 проиллюстрированы результаты, полученные путем идентификации взаимодействий димерного белка (IgE_TRAP), являющегося вариантом осуществления настоящего изобретения, и омализумаба с IgG-рецепторами FcγRI (фиг.9), FcγRIIA (фиг.10), FcγRIIB (фиг.11), FcγRIIIA (фиг.12) и FcγRIIIB (фиг.13) с использованием анализа на основе биослойной интерферометрии (BLI).

На фиг. 14 проиллюстрирован график, полученный путем количественного определения связывающей способности между IgE_TRAP и рецепторами IgG, и между омализумабом и рецепторами IgG.

На фиг. 15A проиллюстрирован график, демонстрирующий ингибиторную способность в отношении активности происходящих из мыши тучных клеток полипептидного димерного белка (IgE_TRAP) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения в зависимости от его концентраций.

На фиг. 15B проиллюстрирован график, демонстрирующий сравнение между ингибиторной способностью в отношении активности экспрессирующих FcεRI человека происходящих из мыши тучных клеток полипептидного димерного белка (IgE_TRAP) согласно варианту осуществления настоящего изобретения и Xolair (омализумаб) в зависимости от их концентрации.

На фиг.16 проиллюстрирована эффективность полипептидного димерного белка в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения в модели индуцированного пищевой аллергией заболевания.

На фиг. 17 проиллюстрирована схема эксперимента для индукции пищевой аллергии и терапии IgE_TRAP, B. longum и комбинированной терапии. в/б, внутрибрюшинный путь; в/ж, внутрижелудочный путь.

На фиг. 18 проиллюстрирована эффективность IgE_TRAP, B. longum и комбинированной терапии в отношении ингибирования симптомов индуцированной аллергией диареи. n=16-18 мышей на группу, OVA против OVA+IgE_TRAP: *P < 0,05, OVA против OVA+B. longum+IgE_TRAP и OVA против PBS: ***P < 0,0001.

На фиг. 19A проиллюстрирован план эксперимента для идентификации того, что B. longum улучшает терапевтические эффекты IgE_TRAP. В частности, показан план эксперимента по индукции пищевой аллергии и однократному и комбинированному введению IgE_TRAP и B. longum. в/б, внутрибрюшинный путь; в/ж, внутрижелудочный путь.

На фиг. 19B проиллюстрирован график, полученный путем идентификации эффектов комбинированного введения пробиотиков и полипептидного димерного белка (IgE_TRAP), обладающего способностью связывания с IgE, в зависимости от увеличения доз в модели индуцированного пищевой аллергией заболевания. Показаны эффекты IgE_TRAP, B. longum и их комбинации в отношении ингибирования диареи, обусловленной пищевой аллергией. n=14 мышей на группу, OVA против OVA+B. longum+IgE_TRAP (20 мкг), OVA против OVA+B. longum+IgE_TRAP (200 мкг), и OVA против PBS: **P < 0,001.

На фиг. 20 проиллюстрированы результаты, полученные путем анализа ELISA уровней протеазы-1 тучных клеток (MCPT-1) в сыворотках, полученных от соответствующих экспериментальных групп, при введении IgE_TRAP, B. longum и их комбинации в модели индуцированного пищевой аллергией заболевания.

На фиг. 21 проиллюстрированы результаты, полученные путем измерения с использованием ELISA общих уровней IgE (свободный IgE и комплекс IgE-IgE_TRAP) в сыворотке, полученной от соответствующих экспериментальных групп во время введения IgE_TRAP, B. longum и их комбинаций, в модели индуцированного пищевой аллергией заболевания. n=16-18 мышей на группу, OVA против OVA+IgE_TRAP, OVA против OVA+B. longum+IgE_TRAP, и OVA против PBS: ***P < 0,0001.

На фиг. 22 проиллюстрированы результаты, полученные путем измерения с использованием ELISA уровней свободного IgE в сыворотке, полученной от соответствующих экспериментальных групп, при введении IgE_TRAP, B. longum и их комбинации в модели индуцированного пищевой аллергией заболевания. n=16-18 мышей на группу, OVA против OVA+IgE_TRAP, OVA против OVA+B. longum+IgE_TRAP, и OVA против PBS: ***P < 0,0001.

На фиг. 23 проиллюстрированы результаты, полученные путем идентификации ингибиторных эффектов на пролиферацию тучных клеток и пролиферацию бокаловидных клеток в соответствующих экспериментальных группах при введении IgE_TRAP, B. longum и их комбинации в модели индуцированного пищевой аллергией заболевания. Представлены результаты, полученные путем окрашивания тучных клеток (красный) в соответствующих парафиновых срезах тощей кишки соответствующих экспериментальных групп (увеличение 400x). Увеличение тощей кишки явно демонстрирует тучные клетки (красный).

На фиг. 24 проиллюстрированы результаты, полученные путем увеличения тучных клеток в 400 раз на фиг.23 и идентификации тучных клеток. n=10-12 мышей на группу, OVA против B. longum, и OVA против IgE_TRAP: **P < 0,001, OVA против OVA+B. longum+IgE_TRAP, и OVA против PBS: ***P < 0,0001.

На фиг. 25 проиллюстрированы результаты, полученные путем идентификации ингибиторных эффектов на пролиферацию тучных клеток и пролиферацию бокаловидных клеток в соответствующих экспериментальных группах при введении IgE_TRAP, B. longum и их комбинаций в модели индуцированного пищевой аллергией заболевания. Представлены результаты, полученные путем окрашивания бокаловидных клеток для идентификации в соответствующих парафиновых срезах тощей кишки в соответствующих экспериментальных группах (фиолетовый, увеличение 400x).

На фиг. 26 проиллюстрированы результаты, полученные путем случайного отбора бокаловидных клеток из элементов ворсинка-крипта (VCU) на фиг.25 и подсчета для 10 VCU. n=5-6 мышей на группу, OVA против B. longum, и OVA против IgE_TRAP: *P < 0,05, OVA против OVA+B. longum+IgE_TRAP, и OVA против PBS: ***P < 0,0001.

На фиг. 27 проиллюстрирована схематическая диаграмма механизма ингибирования пищевой аллергии, вызванной посредством комбинированной терапии B. longum и IgE_TRAP. Проглоченные пищевые аллергены могут индуцировать активацию эффекторных клеток (тучные клетки и базофилы) путем связывания IgE с высокоаффинным рецептором Fc IgE (FcεRI) на эффекторных клетках. Активированные эффекторные клетки высвобождают модуляторы, тем самым вызывая реакцию немедленной гиперчувствительности. B. longum индуцирует апоптоз тучных клеток посредством секреции внеклеточных везикул (EV), который снижает количество тучных клеток. Между тем, IgE_TRAP может блокировать связывание IgE с FcεRI на эффекторных клетках и, таким образом, ингибировать активацию и пролиферацию эффекторных клеток. Комбинированное введение B. longum и IgE_TRAP сделало возможным эффективно смягчать симптомы пищевой аллергии и гиперплазии бокаловидных клеток.

На фиг. 28 проиллюстрирован график, полученный путем идентификации изменений экспрессии IL-33 в ткани кишечника после введения B. longum и IgE_TRAP. Введение B. longum и IgE_TRAP снижало экспрессию мРНК IL-33 в тощей кишке мышей в модели пищевой аллергии. n=16-18 мышей на группу, OVA против OVA+B. longum+IgE_TRAP: *P < 0,05.

На фиг. 29 проиллюстрирован график, полученный путем идентификации частоты диареи после внутрибрюшинной инъекции IgE_TRAP и L. casei. n=7-10 мышей на группу

На фиг. 30 проиллюстрирован график, полученный путем идентификации частоты диареи после внутрибрюшинной инъекции IgE_TRAP и Lc. lactis. n=5 мышей на группу.

На фиг. 31 проиллюстрирован график, полученный путем идентификации частоты диареи после внутрибрюшинной инъекции IgE_TRAP и S. thermophilus. n=6-10 мышей на группу.

На фиг. 32 проиллюстрирован график, полученный путем идентификации частоты диареи после внутрибрюшинной инъекции IgE_TRAP и L. rhamnosus. n=5-10 мышей на группу.

На фиг. 33 проиллюстрирован график, полученный путем идентификации частоты диареи после внутрибрюшинной инъекции IgE_TRAP и L. reuteri. n=5-10 мышей на группу.

На фиг. 34 проиллюстрирован график, полученный путем идентификации частоты диареи после внутрибрюшинной инъекции IgE_TRAP и L. fermentum. n=7-10 мышей на группу.

На фиг. 35 проиллюстрирован график, полученный путем перорального введения IgE_TRAP нормальным мышам, а затем идентификации IgE_TRAP, адсорбированного в сыворотке мышей.

Подробное описание изобретения

В одном аспекте настоящего изобретения предусматривается композиция, содержащая в качестве активных ингредиентов пробиотики и полипептид, обладающий способностью связываться с IgE.

Как используют в рамках изобретения, термин "пробиотики" в обобщенном смысле относится к микроорганизмам, которые являются благоприятными для организма человека в случае их проглатывания в надлежащем количестве, указывая на бактерии, полезные для организма человека. Пробиотики могут представлять собой молочнокислые бактерии или бифидобактерии. Молочнокислые бактерии в общем относятся к бактериям, которые сбраживают сахар, продуцируя молочную кислоту. Большинство полезных бактерий кишечника классифицируют как молочнокислые бактерии, и молочнокислые бактерии могут деградировать сахара, из 50% или более которых продуцируется молочная кислота.

Молочнокислые бактерии могут представлять собой любые бактерии, выбранные из группы, состоящей из Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus и Streptococcus. В частности, Lactobacillus могут представлять собой любые бактерии, выбранные из группы, состоящей из L. acidophilus, L. casei, L. gasseri, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. helveticus, L. fermentum, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus, L. pentosus и L. salivarius. Кроме того, Lactococcus могут представлять собой Lc. lactis, и Streptococcus могут представлять собой S. themophilus. Кроме того, бифидобактерии могут представлять собой любые бактерии, выбранные из группы, состоящей из B. bifidum, B. breve, B. longum и B. animalis ssp. lactis.

Предпочтительно, пробиотики могут представлять собой Lactobacillus casei или Bifidobacterium longum. В частности, Bifidobacterium longum могут иметь номер доступа № KACC 91563 (KR10-1778734B1). В частности, штамм KACC 91563 нацелен на тучные клетки, которые являются важными клетками в аллергических реакциях, и, таким образом, его можно использовать в качестве молочнокислых бактерий для лечения аллергии. Как правило, пробиотики можно использовать в форме живых бактерий, где живые бактерии могут использоваться в лиофилизированной форме. Кроме того, пробиотики можно использовать в форме убитых бактерий. Предпочтительно, пробиотики могут представлять собой Lactobacillus casei или Bifidobacterium longum. В частности, Bifidobacterium longum могут иметь номер доступа № KACC 91563 (KR10-1778734B1). В частности, штамм KACC 91563 нацелен на тучные клетки, которые являются важными клетками в аллергических реакциях, и, таким образом, его можно использовать в качестве молочнокислых бактерий для лечения аллергии. Как правило, пробиотики можно использовать в форме живых бактерий, где живые бактерии могут использоваться в лиофилизированной форме. Кроме того, пробиотики можно использовать в форме убитых бактерий.

Как используют в рамках изобретения, термин "полипептид, обладающий способностью связывать IgE," означает полипептид, способный связываться с IgE. Как используют в рамках изобретения, термин "IgE" означает антительный белок, известный как иммуноглобулин E. IgE обладает аффинностью к тучным клеткам, базофилам крови и т.п. Кроме того, реакция между IgE-антителом и антигеном (аллергеном), соответствующим ему, вызывает воспалительную реакцию. Кроме того, известно, что IgE является антителом, которое вызывает анафилаксию.

В частности, полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, может представлять собой любой из рекомбинантных белков, включающих антитело против IgE, Fc-рецептор IgE, внеклеточный домен альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE, фрагмент внеклеточного домена альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE, и внеклеточный домен альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE или его фрагмент.

В рамках настоящей заявки антитело против IgE означает антитело, способное распознавать IgE в качестве антигена и связывать IgE. В рамках настоящей заявки, фрагмент антитела против IgE может представлять собой любой фрагмент, выбранный из группы, состоящей из Fab, scFv, F(ab)₂ и Fv, при условии, что фрагмент может связываться с IgE. Фрагменты антител означают антигенсвязывающие домены, не включая кристаллизующуюся область (Fc-область), которая выполняет функцию (эффекторную функцию) переноса на клетку или комплемент стимула в результате связывания с антигеном. Вариантом осуществления антитела против IgE может быть омализумаб.

Как используют в рамках изобретения, термин "Fc-рецептор IgE" также называют Fcε-рецептором, и он связывается с Fc-частью IgE. Существует два типа этого рецептора. Рецептор, обладающий высокой аффинностью к Fc IgE, называют Fcε-рецептором I (FcεRI). Рецептор, обладающий низкой аффинностью к Fc IgE, называют Fcε-рецептором II (FcεRII). FcεRI экспрессируется в тучных клетках и базофилах. В случае, когда IgE-антитела, связанные с FcεRI, связываются поливалентными антигенами, происходит дегрануляция тучных клеток или базофилов, тем самым высвобождая различные химические вещества-переносчики, включая гистамин. Это высвобождение приводит к немедленной аллергической реакции.

FcεRI представляет собой мембранный белок, состоящий из одной α-цепи, одной β-цепи и двух γ-цепей, связанных дисульфидной связью. Среди этих цепей часть, с которой связывается IgE, представляет собой α-цепь (FcεRIα), и FcεRIα имеет размер приблизительно 60 кДа. FcεRIα состоит из гидрофобного домена, существующего внутри клеточной мембраны, и гидрофильного домена, существующего снаружи клеточной мембраны. В частности, IgE связывается с внеклеточным доменом α-цепи.

В частности, альфа-субъединица Fc-рецептора IgE может иметь аминокислотную последовательность, указанную в NP_001992.1. Кроме того, внеклеточный домен (FcεRIaECD) альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. В настоящей заявке внеклеточный домен альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE может представлять собой фрагмент или вариант внеклеточного домена альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE при условии, что фрагмент или вариант способен связываться с IgE.

Получение варианта можно осуществлять способом замены, делеции или вставки одного или нескольких белков в FcεRIaECD дикого типа (внеклеточный домен) при условии, что способ не изменяет функцию α-цепи FcεRI. Такие различные белки или пептиды могут быть на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичными аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Кроме того, FcεRIaECD SEQ ID NO: 1 может кодироваться полинуклеотидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 5.

Таким образом, сам по себе внеклеточный домен альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE или фрагмент внеклеточного домена альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE можно использовать в качестве полипептида, обладающего способностью связываться с IgE. Вариант осуществления фрагмента внеклеточного домена может иметь форму, в которой некоторые из аминокислот на N-конце внеклеточного домена альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE удалены. В некоторых вариантах осуществления фрагмент внеклеточного домена может представлять собой фрагмент, в котором удалено 1-30 аминокислот на N-конце. Кроме того, фрагмент внеклеточного домена может представлять собой фрагмент, в котором удалены 5-25 аминокислот на N-конце. Кроме того, фрагмент внеклеточного домена может иметь форму, в которой удалены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот на N-конце. Кроме того, вариант осуществления фрагмента внеклеточного домена может быть в форме, в которой некоторые из аминокислот на C-конце внеклеточного домена альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE удалены. В одном варианте осуществления фрагмент внеклеточного домена может представлять собой фрагмент, в котором удалены 1-30 аминокислот на C-конце. Кроме того, фрагмент внеклеточного домена может представлять собой фрагмент, в котором удалено 5-25 аминокислот на C-конце. Кроме того, фрагмент внеклеточного домена может иметь форму, в которой удалены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот на C-конце. Кроме того, вариант осуществления фрагмента внеклеточного домена может иметь форму, в которой некоторые из аминокислот на N-конце и C-конце внеклеточного домена альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE удалены. В одном варианте осуществления фрагмент внеклеточного домена может иметь форму, в которой удалены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, соответственно, на N-конце и C-конце.

Однако внеклеточный домен альфа-субъединицы рецептора IgE дикого типа или его фрагмент плохо удерживается в организме. Для улучшения этого удержания внеклеточный домен альфа-субъединицы рецептора IgE или его фрагмент можно модифицировать различными способами. В качестве одного варианта осуществления способа модификации с ним можно связывать полиэтиленгликоль (ПЭГ). В качестве другого варианта осуществления способа модификации с ним можно связывать Fc-область иммуноглобулина. В данном случае, в дополнение к нативной форме Fc иммуноглобулина можно использовать модифицированную Fc-область.

Кроме того, как используют в рамках изобретения, термин "модифицированная Fc-область" означает область, в которой часть Fc-области антитела модифицирована. В рамках настоящей заявки термин "Fc-область" относится к белку, который содержит константную область тяжелой цепи 2 (CH2) и константную область тяжелой цепи 3 (CH3) иммуноглобулина, и не содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей и константную область легкой цепи 1 (CH1) иммуноглобулина. В частности, модифицированная Fc-область означает область, полученную путем замены некоторых аминокислот в Fc-области или путем комбинирования различных типов Fc-областей. В частности, модифицированная Fc-область может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Кроме того, модифицированная Fc-область SEQ ID NO: 2 может кодироваться полинуклеотидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 6.

Кроме того, модифицированная Fc-область по настоящему изобретению может иметь форму, имеющую цепи сахаров в нативной форме, увеличенное количество цепей сахаров относительно нативной формы или уменьшенное количество цепей сахаров относительно нативной форме, или она может быть в форме, из которой удалена цепь сахаров. Цепи сахаров Fc иммуноглобулинов можно модифицировать общепринятыми способами, такими как химические способы, ферментативные способы и способы генной инженерии с использованием микроорганизмов.

В рамках настоящей заявки модифицированная Fc-область по настоящему изобретению может представлять собой область, которая лишена функций антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (CDC) вследствие отсутствия участков связывания для FcγR или C1q.

Кроме того, FcεRIα-ECD или его фрагмент может быть связан с областью Fc дикого типа или модифицированной Fc-областью через линкер. Линкер может состоять из 20-60 последовательно расположенных аминокислот, 25-50 последовательно расположенных аминокислот или 30-40 аминокислот. В одном варианте осуществления линкер может состоять из 30 или 49 аминокислот, как показано ниже. Также линкер может содержать по меньшей мере один остаток цистеина. В частности, линкер может содержать один, два или три остатка цистеина. Предпочтительно, линкер содержит один остаток цистеина. В одном варианте осуществления линкер может представлять собой шарнирную область, происходящую из IgD-антитела. Кроме того, линкер может представлять собой вариант шарнирной области, полученный путем модификации шарнирной области IgD-антитела. Вариант шарнирной области может быть получен путем модификации некоторых остатков в последовательности шарнирной области IgD-антитела для минимизации образования укороченных форм в ходе процесса продуцирования белка.

В одном варианте осуществления шарнирная область может содержать следующую последовательность:

Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa1 Xaa2 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (SEQ ID NO: 17), где Xaa1 может представлять собой Lys или Gly, и Xaa2 может представлять собой Glu, Gly или Ser. В частности, линкер может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 19, тем самым минимизируя образование укороченных форм в процессе продуцирования белка.

В другом варианте осуществления шарнирная область может содержать следующую последовательность:

Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa3 Xaa4 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (SEQ ID NO: 18), где Xaa3 может представлять собой Lys или Gly, и Xaa4 может представлять собой Glu, Gly или Ser. В частности, линкер может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, тем самым минимизируя образование укороченных форм в ходе продуцирования белка.

В частности, в линкере, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, по меньшей мере один из Thr может быть гликозилирован. В частности, среди аминокислот SEQ ID NO: 18, 13-й, 14-й, 18-й и 19-й Thr могут быть гликозилированными. Предпочтительно, все четыре аминокислоты могут быть гликозилированными. В рамках настоящей заявки гликозилирование может представлять собой O-гликозилирование.

IgE_TRAP, который является вариантом осуществления полипептида, обладающего способностью связываться с IgE по настоящему изобретению, означает Fc-слитый белок из внеклеточного домена FcεRIα и гибридного Fc-домена IgD/IgG4. Fc-рецептор IgE FcεR состоит из α-цепи, β-цепи и двух идентичных связанных дисульфидной связью γ-цепей. FcεRIβ и FcεRIγ не имеют внеклеточного домена. Однако FcεRIα имеет два внеклеточных родственных иммуноглобулину домена и вовлечен в связывание IgE. Таким образом, для получения более безопасного и эффективного ингибитора IgE внеклеточный домен FcεRIα человека связывали с гибридным Fc-доменом IgD/IgG4 человека (фиг. 1 и 2) с получением IgE_TRAP. В отличие от омализумаба, IgE_TRAP не связывается с рецепторами IgG и, вероятно, будет снижать риск IgG-опосредуемой анафилаксии (фиг. 9-13). Кроме того, IgE_TRAP обладает аффинностью к IgE, которая в 69 раз превышает аффинность омализумаба. Таким образом, IgE_TRAP может быть более безопасным и эффективным, чем омализумаб, в качестве терапевтического средства против пищевой аллергии.

Полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, служит для блокирования связывания между FcεRIα на эффекторных клетках и IgE. Гибридный Fc IgD/IgG4 человека содержит верхний CH2-домен IgD и последние CH2- и CH3-домены IgG4, которые не имеют участка связывания для FcγR или C1q (фиг.1). Однако этот гибридный Fc может иметь участок связывания для неонатального Fc-рецептора (фиг.1). Кроме того, теоретическая молекулярная масса IgE_TRAP в гомодимерной форме составляет приблизительно 97,6 кДа. Однако его истинная молекулярная масса составляет приблизительно 150 кДа вследствие гликозилирования (фиг.6).

Полипептидный димерный белок, обладающий способностью связываться с IgE, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, не только обладает превосходной безопасностью и удержанием в организме по сравнению с традиционно используемыми антителами против IgE, но также очень сильно связывается с IgE вследствие наличия способности связываться с IgE, которая приблизительно в 70 раз выше, чем у традиционно используемого антитела против IgE омализумаба, что позволяет более длительный курс введения. Кроме того, полипептидный димерный белок в соответствии с настоящим изобретением представляет собой вещество, полученное с использованием модифицированного Fc, который имеет только IgE в качестве единственной мишени и не связывается с рецептором Fc-гамма, и, таким образом, лишен функций антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (CDC). Таким образом, в отличие от общепринятых антител против IgE, содержащих Fc-область IgG1, полипептидный димерный белок не связывается с рецептором Fc-гамма и, таким образом, может ингибировать высвобождение медиаторов, вызываемое связыванием с рецептором Fc-гамма на поверхности тучных клеток. Таким образом, полипептид, обладающий способностью связываться с IgE по настоящему изобретению, может минимизировать тяжелые побочные эффекты, такие как возникновение анафилаксии, которое может быть вызвано связыванием между IgG1 и рецептором Fc-гамма III на тучных клетках. Таким образом, полипептидный димерный белок в соответствии с настоящим изобретением можно использовать в качестве новой фармацевтической композиции, которая может заменить терапевтические средства, содержащие общепринятое антитело против IgE.

Кроме того, вариант осуществления полипептида, обладающего способностью связываться с IgE, который предусматривается в рамках настоящего изобретения, может иметь форму мономера. В частности, в случае, когда не используют цистеин в линкере, полипептид может иметь мономерную форму.

Кроме того, вариант осуществления полипептида, обладающего способностью связываться с IgE, который предусматривается в рамках настоящего изобретения, может представлять собой полипептидный димер. Здесь, как описано выше, полипептидный димер может иметь форму, в которой два мономера связаны друг с другом и каждый мономер получен путем связывания между внеклеточным доменом альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE и модифицированной Fc-областью. Полипептидный димер может иметь форму, в которой два одинаковых мономера связаны друг с другом посредством цистеина, находящегося в линкерной области. Кроме того, полипептидный димер может иметь форму, в которой два различных мономера связаны друг с другом. Например, в случае, когда два мономера отличаются друг от друга, полипептидный димер может иметь форму, в которой один мономер содержит внеклеточный домен альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE, а другой мономер содержит фрагмент внеклеточного домена альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE. В рамках настоящей заявки вариант осуществления мономера может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 22.

В другом аспекте настоящего изобретения предусматривается фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения аллергического заболевания, содержащая композицию, которая содержит в качестве активных ингредиентов пробиотики и полипептид, обладающий способностью связываться с IgE.

Пробиотики и полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, являются такими, как описано выше. Смешиваемое количество пробиотиков и полипептида, обладающего способностью связываться с IgE, в композиции можно определять соответствующим образом. В одном варианте осуществления пробиотики в композиции могут содержаться в количестве от 1×10⁵ к.о.е. до 1×10¹² к.о.е. Альтернативно пробиотики в композиции могут содержаться в количестве от 1×10⁶ к.о.е. до 1×10¹¹ к.о.е., от 1×10⁷ к.о.е. до 1×10¹⁰ к.о.е., или от 1×10⁹ к.о.е. до 5×10⁹ к.о.е. Кроме того, полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, может содержаться в количестве, но не ограничиваясь этим, от 0,1 мкг до 5 мг, от 0,5 мкг до 1 мг, от 1 мкг до 500 мкг, от 10 мкг до 400 мкг, или от 200 мкг до 300 мкг. Кроме того, соотношение смешения пробиотиков и полипептида, обладающего способностью связываться с IgE в композиции, можно надлежащим образом изменять.

В настоящем описании "аллергическое заболевание" означает патологический симптом, вызванный аллергической реакцией, опосредуемой активацией тучных клеток, такой как дегрануляция тучных клеток. Такие аллергические заболевания включают пищевую аллергию, атопический дерматит, астму, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит, аллергический дерматит, аллергический контактный дерматит, анафилаксию, крапивницу, зуд, аллергию на укусы насекомых, хроническую идиопатическую крапивницу, аллергию на лекарственные средства и т.п. В частности, аллергические заболевания могут быть IgE-опосредуемыми.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, который содержит внеклеточный домен FcεRIα, блокирует связывание IgE с FcεRI на эффекторных клетках через его связывание с IgE, и, таким образом, он может быть обозначен как IgE_TRAP. Кроме того, было идентифицировано, что B. longum могут улучшать терапевтический эффект IgE_TRAP и значительно снижать дозу IgE_TRAP, требуемую для лечения.

В композиции для лечения или предупреждения аллергического заболевания по настоящему изобретению, активный ингредиент может содержаться в любом количестве (эффективное количество) в зависимости от применения, состава, цели смешивания и т.п., при условии, что активный ингредиент может демонстрировать противоаллергическую активность. Типичное эффективное количество активного ингредиента может находиться в диапазоне от 0,001% по массе до 20,0% по массе в расчете на общую массу композиции. В настоящем описании "эффективное количество" относится к количеству активного ингредиента, которое способно индуцировать антиаллергический эффект. Такое эффективное количество может определить экспериментально специалист в данной области.

В рамках настоящего изобретения фармацевтическая композиция, кроме того, может содержать фармацевтически приемлемый носитель. В качестве фармацевтически приемлемого носителя может использоваться любой носитель при условии, что носитель представляет собой нетоксичное вещество, пригодное для доставки пациенту. В качестве носителей могут содержаться дистиллированная вода, спирт, жир, воск и инертное твердое вещество. Также в фармацевтической композиции могут содержаться фармакологически приемлемые адъюванты (буферы и диспергирующие вещества). В частности, можно использовать любой фармацевтически приемлемый состав при условии, что пробиотики и полипептид, обладающие способностью связываться с IgE, могут сохранять их стабильность в составе.

В частности, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит, в дополнение к активным ингредиентам, фармацевтически приемлемый носитель, и она может быть изготовлена в форме перорального или парентерального состава в зависимости от пути введения общепринятым способом, известным в данной области. В рамках настоящей заявки, термин "фармацевтически приемлемый" означает имеющий не более высокую токсичность, чем может переноситься индивидуумом, который будет применять (которому будет назначено) средство, без ингибирования активности активного ингредиента.

В случае, когда фармацевтическую композицию по настоящему изобретению изготавливают в форме перорального состава, фармацевтическая композиция может быть изготовлена в форме составов, таких как порошки, гранулы, таблетки, пилюли, таблетки с сахарным покрытием, капсулы, жидкости, гели, сиропы, суспензии и вафли, вместе с подходящими носителями, в соответствии со способами, известными в данной области. В рамках настоящего изобретения, примеры подходящих фармацевтически приемлемых носителей могут включать сахара, такие как лактоза, глюкоза, сахароза, декстроза, сорбит, маннит и ксилит, крахмалы, такие как кукурузный крахмал, картофельный крахмал и пшеничный крахмал, целлюлозы, такие как целлюлоза, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза, и гидроксипропилметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, вода, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, стеарат магния, минеральное масло, солод, желатин, тальк, полиол, растительное масло и т.п. В случае изготовления в виде препаратов, получение можно проводить, при необходимости, путем включения разбавителей и/или эксципиентов, таких как наполнитель, сухой разбавитель, связующее вещество, смачивающее вещество, разрыхлитель и поверхностно-активное вещество.

В случае, когда фармацевтическая композиция по настоящему изобретению изготовлена в виде парентерального состава, фармацевтическая композиция может быть изготовлена в виде препаратов в форме инъекций, трансдермальных лекарственных средств, назальных ингаляторов и суппозиториев, вместе с подходящими носителями, в соответствии со способами, известными в данной области. В случае получения в виде инъекций, в качестве подходящего носителя можно использовать стерилизованную воду, этанол, полиол, такой как глицерин и пропиленгликоль, или их смесь. В качестве носителя предпочтительно можно использовать изотонические растворы, такие как раствор Рингера, фосфатно-солевой буфер (PBS), содержащий триэтаноламин, стерильную воду для инъекций и 5% декстрозу, и т.п.

Получение фармацевтической композиции известно в данной области, и, в частности, может быть упомянут Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995) и т.п. Этот документ считается частью настоящего описания.

Предпочтительная суточная дозировка фармацевтической композиции по настоящему изобретению находится в диапазоне от 0,01 мкг/кг до 10 г/кг, и предпочтительно от 0,01 мг/кг до 1 г/кг, в зависимости от состояния пациента, массы тела, пола, возраста, тяжести заболевания или пути введения. Введение можно проводить один раз или несколько раз в сутки. Такую дозировку никоим образом не следует интерпретировать как ограничивающую объем настоящего изобретения.

Индивидуумом, у которого может применяться (может быть назначена) композиция по настоящему изобретению, является млекопитающее и человек, причем особенно предпочтительным является человек. Композиция против аллергии по настоящему изобретению, кроме того, может содержать, в дополнение к активному ингредиенту, любое соединение или природный экстракт, для которого уже подтверждена безопасность и для которого известно, что оно обладает противоаллергической активностью, для повышения и усиления противоаллергической активности. В рамках настоящего изобретения фармацевтическая композиция, кроме того, может содержать внеклеточную эндоплазматическую сеть, выделенную из Bifidobacterium longum KACC 91563.

В другом аспекте настоящего изобретения предусматривается диетическая функциональная пищевая композиция для смягчения или облегчения симптома аллергии, содержащая композицию, которая содержит в качестве активных ингредиентов пробиотики и полипептид, обладающий аффинностью связывания в отношении IgE. В рамках настоящего изобретения пищевая композиция, кроме того, может содержать в качестве активного ингредиента внеклеточную эндоплазматическую сеть, выделенную из Bifidobacterium longum KACC 91563.

Между тем, пищевая композиция по настоящему изобретению, кроме того, может содержать ситологически приемлемый носитель. Кроме того, пищевую композицию можно использовать вместе с другим продуктом питания или пищевым ингредиентом, и ее можно пригодным образом использовать в соответствии с общепринятыми способами. Количество активного ингредиента для смешения может быть подходящим образом определено в соответствии с его предполагаемым применением (профилактическое, оздоровительное или терапевтическое лечение).

Отсутствует конкретное ограничение типа продукта питания. Примеры продукта питания включают мясо, сосиски, хлеб, шоколад, конфеты, закуски, кондитерские изделия, молочные продукты, включающие мороженое, различные супы, напитки, чай, питьевую продукцию, алкогольные напитки и витаминные комплексы. Включаются все функциональные диетические продукты питания в общепринятом значении. Продукты питания, в которые можно добавлять описанные выше вещества, содержат ингредиенты, которые обычно добавляют в ходе производства, и примеры ингредиентов включают белки, углеводы, жиры, пищевые добавки, вкусовые добавки и специи. Вышеупомянутые углеводы представляют собой типичные сахара, например, моносахарид, такой как глюкоза и фруктоза, дисахарид, такой как мальтоза и сахароза, и полисахарид, такой как декстрин и циклодекстрин, и сахарный спирт, такой как ксилит, сорбит и эритрит. В качестве вкусовой добавки можно использовать природную вкусовую добавку, такую как тауматин и экстракт стевии, синтетическую вкусовую добавку, такую как сахарин и аспартам, и т.п.

Например, в случае, когда пищевую композицию по настоящему изобретению изготавливают в качестве напитка, в дополнение к композиции по настоящему изобретению она может содержать лимонную кислоту, жидкую фруктозу, сахар, глюкозу, уксусную кислоту, яблочную кислоту, сок, экстракт и т.п.

В дополнение к вышеуказанному, композиция по настоящему изобретению может содержать различные пищевые добавки, витамины, электролиты, вкусовые добавки, красители, пектиновую кислоту и ее соли, альгиновую кислоту и ее соли, органические кислоты, защитные коллоидные загустители, вещества для коррекции pH, стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирт, карбонизирующее средство, используемое в газированных напитках, и т.п. Кроме того, композиция по настоящему изобретению может содержать мякоть для изготовления напитков на основе фруктового сока и овощных напитков. Эти ингредиенты могут использоваться независимо или в смеси.

Кроме того, пищевая композиция по настоящему изобретению может относиться к любой категории продуктов по официальной или функциональной классификации при условии, что пищевая композиция удовлетворяет предписаниям контролирующих органов на момент производства и распространения. Например, пищевая композиция может представлять собой диетический функциональный продукт питания в соответствии с Актом о функциональной диетической продукции, или может относиться к кондитерским изделиям, продуктам на основе бобовых, чаям, напиткам, продуктам питания специального назначения и т.п. в соответствии с каждым типом продуктов питания в Кодом продуктов питания Акта о пищевой санитарии (стандарты и спецификации для продуктов писания, зарегистрированные в Управление продовольствия и лекарственных препаратов). Что касается других пищевых добавок, которые могут содержаться в пищевой композиции по настоящему изобретению, может быть упомянут Код продуктов питания или Дополнительный код продуктов питания в соответствии с Актом о пищевой санитарии.

В другом аспекте настоящего изобретения предусматривается набор для лечения или предупреждения аллергического заболевания, содержащий первую композицию, которая содержит пробиотики; и вторую композицию, которая содержит полипептид, обладающий способностью связываться с IgE. В рамках настоящего изобретения вторая композиция может представлять собой композицию для подкожного или внутривенного введения.

В следующем аспекте изобретения предусматривается способ лечения или предупреждения аллергического заболевания, включающий стадию введения пробиотиков; и введения полипептида, обладающего способностью связываться с IgE.

Пробиотики являются такими, как описано выше, и их можно вводить пероральным путем. В рамках настоящей заявки полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, можно вводить перорально и можно вводить парентерально. В рамках настоящего изобретения парентеральное введение можно проводить таким способом, как подкожное введение, внутривенное введение, введение через слизистую оболочку и т.п. В модели пищевой аллергии на мышах было показано, что IgE_TRAP не только снижает уровень свободного IgE, но также снижает количество тучных клеток, тем самым облегчая симптомы пищевой аллергии (фиг.21-26). Считается, что снижение количества тучных клеток, вызываемое IgE_TRAP, является следствием того факта, что IgE увеличивает количество тучных клеток путем увеличения выживаемости тучных клеток. Кроме того, избыточная пролиферация бокаловидных клеток в тонком кишечнике значительно ингибировалась путем введения IgE_TRAP и B. longum отдельно, и еще более ингибировалась при комбинированном введении (фиг. 23-26). Поскольку известно, что Th2-цитокины, такие как IL-13, индуцируют сверхпролиферацию бокаловидных клеток, можно ожидать, что IgE_TRAP, B. longum и их комбинация будут ослаблять условия для индукции Th2-цитокинов в тонком кишечнике. В подтверждение этого IgE_TRAP и B. longum продемонстрировали тенденцию к снижению экспрессии мРНК IL-33, который вовлечен в стимуляцию секреции IL-13, в тонком кишечнике путем активации врожденных лимфоидных клеток 2 типа (ILC2); и их комбинация значительно снижала экспрессию IL-33 более эффективным образом (фиг. 28). Кроме того, IL-33 не только секретируется в активируемых посредством IgE тучных клетках, но также вовлечен в стимуляцию дегрануляции тучных клеток. Таким образом, IL-33 имеет тесную корреляцию с тяжестью пищевой аллергии. Это указывает на то, что IgE_TRAP и B. longum могут смягчать симптомы пищевой аллергии посредством различных механизмов.

Ранее было описано, что B. longum индуцирует апоптоз тучных клеток и улучшает симптомы пищевой аллергии, что согласуется с результатами, полученными авторами настоящего изобретения. Однако, ежедневное введение B. longum для лечения пищевой аллергии было менее эффективным, чем введение только IgE_TRAP. Однако B. longum значительно улучшали терапевтический эффект IgE_TRAP (фиг. 18), и IgE_TRAP, использованный в комбинации с B. longum, демонстрировал терапевтический эффект, который является сходным с эффектом, которого достигают путем введения IgE_TRAP отдельно в 10 раз более высокой дозе (фиг.19B). Кроме того, было описано, что некоторые кишечные бактерии могут смягчать аллергическое заболевание путем увеличения количества Treg-клеток или снижения уровней IgE и Th2-цитокинов. Таким образом, можно ожидать, что другие пробиотики в дополнение к B. longum будут способны улучшать терапевтический эффект IgE_TRAP. Действительно, было идентифицировано, что повышенный терапевтический эффект демонстрируется при комбинированном введении различных типов пробиотиков и IgE_TRAP (фиг. 29-34).

В другом аспекте настоящего изобретения предусматривается способ лечения или предупреждения аллергического заболевания, включающий стадию введения индивидууму полипептида, обладающего способностью связываться с IgE, и пробиотиков в комбинации. Индивидуумом может быть млекопитающее, предпочтительно человека. В рамках настоящего изобретения введение можно проводить перорально или парентерально. В рамках настоящей заявки полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, и пробиотики можно получать в виде составов, подходящих для перорального введения. Кроме того, парентеральное введение можно проводить такими способами, как подкожное введение, внутривенное введение, введение через слизистую оболочку и внутримышечное введение.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее настоящее изобретение описано более подробно с помощью следующих примеров. Однако следующие примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения и объем настоящего изобретения не ограничивается только ими.

Материалы и способы

Конструирование клеточной линии для IgETRAP и его очистка

Нуклеотидную последовательность IgE_TRAP конструировали путем связывания C-конца (26-205) внеклеточного домена FcεRIα с N-концом гибридного Fc-домена IgD/IgG4 (IgD, 133-170; IgG4, 121-327). Белок экспрессировали в клетках яичника китайского хомячка с дефицитом дигидрофолатредуктазы DG44. IgE_TRAP очищали с использованием колонки HiTrap rProtein A FF column (GE Healthcare), и его чистоту идентифицировали посредством SDS-PAGE в восстанавливающих и не восстанавливающих условиях.

Моделирование 3D-структуры

Структурную модуль IgE_TRAP моделировали с использованием WinCoot и конструировали с использованием программного обеспечения PyMOL на основе информации о FcεRIα (номер доступа PDB 1F6A) и Fc IgD/IgG4 (номер доступа PDB 1ADQ) в Protein Data Bank.

Анализ с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

SPR-анализ проводили с использованием устройства ProteOn XPR36 (Bio-Rad). Степень связывания омализумаба и IgE_TRAP с IgE человека (Calbiochem) идентифицировали с использованием кинетического анализа. 850 единиц ответа (RU) омализумаба в ацетатном буфере (pH 5,5) и 500 RU IgE_TRAP в ацетатном буфере (pH 4,0) иммобилизовывали на сенсорном чипе ProteOn™ GLC (Bio-Rad). В качестве подвижного буфера использовали PBS, содержавший Tween-20, и скорость потока устанавливали на 30 мкл/мин. График каждого набора данных анализировали с использованием программного обеспечения ProteOn Manager (Bio-Rad).

Анализ с использованием биослойной интерферометрии (BLI)

Степень связывания IgE_TRAP и омализумаба с рецепторами IgG определяли с использованием системы Octet RED384 (Pall ForteBio, CA, США). Рекомбинантные белки FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA и FcγRIIIB (R & D Systems Inc., 5 мкг/мл), разбавленные в 300 мМ ацетатном буфере (pH 5), иммобилизовывали на биосенсоре Амин Reactive 2 Generation (AR2G), активированном посредством комбинации 400 мМ EDC и 10 мМ сульфо-NHS. Затем определяли ассоциацию с и диссоциацию от IgE_TRAP и омализумаба при различных концентрациях, соответственно, в течение 300 секунд. В данном случае использованный кинетический буфер представлял собой PBS, содержавший 0,1% Tween-20 и 1% бычью сыворотку, и все эксперименты проводили при 30°C с устройством для встряхивания планшета со скоростью 1000 об/мин.

Анализ высвобождения β-гексозаминидазы

Тучные клетки костномозгового происхождения (BMMC) культивировали при 37°C в RPMI, содержавшей 10% инактивированную нагреванием FBS, 10 нг/мл IL-3 мыши (PeproTech, Inc.) и 50 нг/мл SCF мыши (PeproTech, Inc.). Перед анализом 1 мкг/мл IgE против динитрофенила (Sigma-Aldrich) и различные концентрации IgE_TRAP инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Тучные клетки костномозгового происхождения инкубировали в смеси IgE против динитрофенила (Sigma-Aldrich) и IgE_TRAP при 37°C в течение 30 минут, и к ним добавляли 0,1 мкг/мл IgE против динитрофенила. Полученный материал вновь инкубировали при 37°C в течение 30 минут. Культуральный супернатант собирали и инкубировали с 3 мМ п-нитрофенил-N-ацетил-β-D-глюкозаминидом при 37°C в течение 20 минут. Добавляли 0,1 M натрий-карбонатный буфер (pH 10) для остановки реакции и определяли поглощение при 405 нм. Долю высвободившейся β-гексозаминидазы вычисляли путем сравнения с общим внутриклеточным содержанием в BMMC после растворения посредством 0,1% Triton X-100.

Индукция пищевой аллергии и введение B. longum

На 0 и 14 сутки 50 мкг OVA (категория V; Sigma-Aldrich) и 1 мг адъюванта на основе сульфата калия-алюминия (Sigma-Aldrich) внутрибрюшинно вводили мышам. После 14 суток мышам перорально вводили 50 мг OVA (категория III; Sigma-Aldrich) 5 раз с интервалами 2 суток. Мышей подвергали голоданию в течение приблизительно 4-5 часов перед пероральным введением OVA. Возникновение диареи оценивали посредством мониторинга мышей в течение вплоть до 1 часа после инокуляции OVA. B. longum лиофилизировали и смешивали с порошковым кормом для мышей в количестве 3×10⁹ к.о.е./г. Мышам обеспечивали доступ к корму без ограничений. Для поддержания свежести мышиный кром, смешанный с B. longum, заменяли каждые 2-3 суток.

Гистология

Тощую кишку фиксировали 4% параформальдегидом и заливали парафином с получением блока. Затем получали парафиновый срез на предметном стекле. Срез депарафинизировали и тучные клетки окрашивали с использование набора с нафтол AS-D хлорацетатэстеразой (Sigma-Aldrich). Для бокаловидных клеток срез окрашивали набором с перйодной кислотой-красителем Шиффа (ScyTek Laboratories, Inc.). Изображение окрашенного среза получали с использованием Pannoramic MIDI (3D HISTECH Ltd.).

ELISA

Набор для ELISA на тотальный IgE мыши (BioLegend) и набор для ELISA на MCPT-1 (Invitrogen) использовали в соответствии с протоколом изготовителя для определения общих концентраций IgE и MCPT-1 в сыворотке мыши. Для определения свободного IgE планшет покрывали 1 мг/мл IgE_TRAP и реакцию проводили в течение ночи при 4°C. Остальную часть анализа проводили в соответствии с протоколом изготовителя для набора для ELISA на тотальный IgE мыши.

Статистический анализ

Статистический анализ всех данных проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc.). Для вычисления частоты встречаемости диареи использовали анализ с использованием кривой выживаемости Каплана-Мейера с логарифмическим ранговым тестом (Ментеля-Кокса). Для идентификации значимых отличий в тесте использовали односторонний ANOVA с критерием множественных сравнений Ньюмана-Кеулса.

I. Получение и охарактеризация IgETRAP

Пример 1. Получение полипептида, содержащего FcεRIα-ECD и модифицированную Fc-область

C-концевой модифицированный полипептид внеклеточного домена (FcεRIα-ECD) альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE получали способом, описанным в патенте IgE США № 7867491.

Сначала получали слитый белок, который содержит внеклеточный домен α-цепи FcεRI, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и модифицированный Fc иммуноглобулина SEQ ID NO: 2. В частности, для экспрессии белка (FcεRIαECD-Fc1), белка (FcεRIαECD-Fc2) и белка (FcεR1αECD-Fc3), которые были связаны, соответственно, через шарнирную область SEQ ID NO: 19, шарнирную область SEQ ID NO: 3 и шарнирную область SEQ ID NO: 4, кассеты, полученные путем связывания гена, кодирующего каждый белок, клонировали в векторы pAD15 (Genexin, Inc.), с конструкцией, экспрессирующей белок FcεRIαECD-Fc. Затем каждый из экспрессирующих векторов трансдуцировали в клетки CHO DG44 (от Dr. Chasin, Columbia University, США).

В данном случае, при трансдукции в клеточную линию экспрессирующий вектор, полученный посредством клонирования гена трансферазы α-2,6-сиаловой кислоты в вектор pCI Hygro (Invitrogen), одновременно трансдуцировали для получения отдельно клеточных линий, которые были способны экспрессировать белки FcεRIαECD-Fc2ST и FcεRIα ECD-Fc3ST, к которым была добавлена сиаловая кислота.

В качестве первичной скрининговой процедуры проводили селекцию с HT с использованием среды, свободной от 5-гидрокситриптамина (HT) с 10% dFBS (Gibco, США, 30067-334), среды MEMα (Gibco, 12561, США, каталожный номер № 12561-049) и среды HT+ (Gibco, США, 11067-030). Затем проводили амплификацию с метотрексатом (MTX) с использованием отобранных с помощью HT клонов для повышения продуктивности с использованием системы "дигидрофолатредуктаза (DHFR)-".

После завершения амплификации с MTX проводили субкультивирование приблизительно 1-5 раз для стабилизации клеток с целью оценки продуктивности. После этого проводили оценку продуктивности в единицах для амплифицированных с MTX клеток. Результаты представлены в таблице 1 ниже.

[Таблица 1]

Версия Среда Концентрация MTX Продуктивность Культивирование в течение 3 суток Культура с подпиткой (мг/мл) мкг/мл мкг/10⁶ клеток FcεRIαECD-Fc2 Ex-cell DHFR 500 нМ 37,23 20,9 225 FcεRIαECD-Fc2+a2,6-ST 100 нМ 45,4 25,1 338,2 FcεRIαECD-Fc3 2 мкМ 27,0 16,9 180,4 FcεRIαECD-Fc3+a2,6-ST 1 мкМ 17,5 10,2 101,7

Как показано в таблице 1, клеточная линия FcεRIαECD-Fc3 демонстрировала продуктивность 16,9 мкг/10⁶ клеток после амплификациии с метотрексатом в концентрации 2 мкМ. С другой стороны, клеточная линия FcεRIαECD-Fc3 (FcεRIαECD-Fc3ST), котрансдуцированная трансферазой 2,6-сиаловых кислот, демонстрировала продуктивность 17,5 мкг/10⁶ клеток после амплификации с метотрексатом в концентрации 1 мкМ. Кроме того, клеточная линия FcεRIαECD-Fc2 демонстрировала продуктивность 20,9 мкг/10⁶ клеток в условиях амплификации с метотрексатом в концентрации 0,5 мкМ. Кроме того, клеточная линия FcεRIαECD-Fc2 (FcεRIαECD-Fc2ST), котрансдуцированная трансферазой 2,6-сиаловых кислот, демонстрировала продуктивность 25,1 мкг/10⁶ клеток после амплификации с метотрексатом в концентрации 0,1 мкМ. Следовательно, было идентифицировано, что клеточная линия FcεRIαECD-Fc2, котрансфицированная трансферазой 2,6-сиаловых кислот, которая была подвергнута селекции в условиях амплификации с метотрексатом в концентрации 0,1 мкМ, демонстрировала наилучшую продуктивность.

Пример 2. Очистка слитого белка FcεRIα ECD и определение его чистоты

Среди клеточных линий, отобранных согласно примеру 1 выше, i) FcεRIαECD-Fc3, ii) FcεRIαECD-Fc3ST и iii) FcεRIαECD-Fc2ST культивировали в масштабе 60 мл способом периодической культуры. Полученные культуры очищали с использованием аффинной колонки с белком A, а затем очищенные белки подвергали SDS-PAGE и эксклюзионной ВЭЖХ (SE-ВЭЖХ) для определения чистоты белков.

Как показано на фиг.3A и 3B, было идентифицировано, что все соответствующие белки, очищенные способом SE-ВЭЖХ, имели чистоту 93% или выше. Кроме того, в результате анализа SDS-PAGE было идентифицировано, что белки размером приблизительно 150 кДа и приблизительно 75 кДа, выявлялись, соответственно, в не восстанавливающих и восстанавливающих условиях (фиг. 3A, дорожки 1-6). Исходя из этого было обнаружено, что связанный с Fc FcεRIαECD образует димер. Кроме того, в результатах SDS-PAGE не наблюдалось примесей, таких как укороченная форма. В частности, даже после процесса оттаивания/замораживания (фиг. 3A, дорожки 7-9), было идентифицировано, что все белки имеют чистоту 93% или выше и не имеют примесей. В данном случае, гель-IEF проводили в приведенных ниже условиях тестирования для идентификации степени содержания сиаловых кислот в белках после введения трансферазы сиаловых кислот. Из этого было идентифицировано, что содержание кислых белков возрастало вследствие увеличения содержания сиаловых кислот.

[Таблица 2]

Условия тестирования Гель Гель IEF pH3-10 1,0 мм Буфер для образца Буфер для образца IEF (2X) Условия загрузки 100 В 1 ч, 200 В 1 ч, 500 В 2 ч

Для определения воспроизводимости выхода очистки клеточную линию FcεRIαECD-Fc2ST подвергали периодическому культивированию в 1-л колбе в масштабе 250 мл и очищали с использованием аффинной колонки с белком A. Затем культуральный супернатант и очищенный продукт подвергали разделению на 4%-15% геле TGX™ (Bio-Rad Laboratories, Inc.) в течение 30 минут в условиях буфера Tris-глицин SDS (TGS) и 200 В, а затем подвергали анализу SDS PAGE. В результате было идентифицировано что белки с очень высокой чистотой (98% или выше) очищались даже посредством только первой стадии очистки, и белки экспрессировались с очень высокой чистотой даже в культуральном супернатанте. Это указывает на то, что стадии разработки процесса могут быть упрощены при разработке белка FcεRIαECD-Fc, который экспрессируется в рассматриваемой клеточной линии, в виде медицинского продукта, и в результате вероятно, что стоимость разработки медицинского продукта значительно снизится.

Экспериментальный пример 1. Определение способности связывания слитого белка FcεRIα ECD с IgE

Способность связывания с IgE подвергали сравнительному определению для четырех белков: i) FcεRIαECD-Fc2, ii) FcεRIαECD-Fc2ST, iii) FcεRIαECD-Fc3 и iv) FcεRIαECD-Fc3ST, которые были очищены способом согласно примеру 2 выше, и коммерчески доступного антитела против IgE омализумаба (торговое название: Xolair). В частности, способность связываться с IgE определяли путем нанесения IgE на канал сенсорного чипа Protein GLC (Bio-Rad Laboratories, Inc.) и позволения омализумабу или каждому белку FceR1αECD-Fc в различных концентрациях течь со скоростью 30 мкл в минуту.

Эксперименты проводили путем идентификации нулевого фона с использованием 25 мМ NaOH в качестве регенерирующего буфера, а затем повторения описанных выше стадий. После этого кривую связывания идентифицировали с использованием анализатора связывания белков (ProteOn XPR36, Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Результаты представлены в таблице 3, и на фиг.7 и 8. IgE_TRAP на фиг. 8 означает FcεRIαECD-Fc2ST, который является вариантом осуществления полипептида, обладающего способностью связываться с IgE, по настоящему изобретению.

[Таблица 3]

Образцы
Положения FcεRIa ECD-Fc Омализумаб Примечания Тип лекарственного средства слитый белок Fc Ab против IgE Аффинность связывания ka (скорость ассоциации) Fc2 2,14×10⁵ 4,05×10⁵ В 1,9 раза слабее, чем омализумаб Fc2ST 2,64×10⁵ В 1,5 раза слабее, чем омализумаб Fc3 1,98×10⁵ В 2,0 раза слабее, чем омализумаб Fc3ST 2,40×10⁵ В 1,7 раза слабее, чем омализумаб kd (скорость диссоциации) Fc2 8,2×10^-5 6,02×10^-3 В 73 раз лучше, чем омализумаб Fc2ST 5,69×10^-5 В 106 раз лучше, чем омализумаб Fc3 1,33×10^-4 В 45 раз лучше, чем омализумаб Fc3ST 1,49×10^-4 В 40 раз лучше, чем омализумаб KD (kd/ka) Fc2 3,88×10^-10 1,49×10^-8 В 38 раз лучше, чем омализумаб Fc2ST 2,16×10^-10 В 69 раз лучше, чем омализумаб Fc3 6,72× 10^-10 В 22 раза лучше, чем омализумаб Fc3ST 6,21×10^-10 В 24 раза лучше, чем омализумаб

Как показано в таблице 3, было определено, что величина скорости ассоциации (ka) полипептидного димера в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения в 1,5-2,0 раза ниже, чем у омализумаба. Таким образом, было обнаружено, что его аффинность связывания с веществами, отличными от IgE, была в 1,5-2,0 ниже, чем у омализумаба. Кроме того, было определено, что величина скорости диссоциации (kd) полипептидного димера в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения в 40-106 раз выше, чем у омализумаба. Кроме того, как показано на фиг.7 и 8, можно было идентифицировать, что омализумаб утрачивал свое связывание с IgE в случае, когда после связывания проходил определенный период времени, в то время как после связывания полипептидного димера слитого белка FcεRIαECD по настоящему изобретению с IgE полипептидный димер не отделялся от IgE. Таким образом, можно видеть, что полипептидный димер по настоящему изобретению не легко отделяется от IgE, и он обладает значительно лучшей способностью сохранять его связанное состояние, чем омализумаб. В результате, было обнаружено, что полипептидный димер в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения имеет равновесную величину константы диссоциации (KD <kd/ka>), которая в 22-69 раз выше, чем у омализумаба.

Исходя из этого, можно видеть, что слитый белок FcεRIαECD по настоящему изобретению обладает значительно увеличенной способностью связываться с IgE по сравнению с омализумабом. В частности, было идентифицировано, что FcεRIαECD -Fc2 (FcεRIαECD-Fc2ST), к которому добавлена сиаловая кислота, демонстрирует наивысшую способность связывания IgE, которая была в 69 раз выше, чем у омализумаба. В частности, для FcεR1αECD-Fc2ST, скорость ассоциации (Ka) и скорость диссоциации (Kd) IgE_TRAP была приблизительно в 1,5 раза и в 94,5 раза ниже, чем у омализумаба, соответственно (фиг. 7 и 8, и таблица 4). Ранее было описано, что IgE диссоциировал от FcεRIα очень медленно. Было идентифицировано, что IgE_TRAP также диссоциировал очень медленно (фиг. 8). В результате, способность IgE_TRAP связываться с IgE была в 69 раз выше, чем у омализумаба (фиг. 8 и таблица 4).

[Таблица 4]

Ka (M^-1 с^-1) Kd (с^-1) KD (M) IgE_TRAP 2,64×10⁵ 5,69×10^-5 2,15×10^-10 Омализумаб 4,05×10⁵ 6,02×10^-3 1,49×10^-8 Сравнение KD [Омализумаб/IgE_TRAP] Приблизительно в 69 раз

Экспериментальный пример 2. Определение способности IgETRAP связываться с IgG-опосредуемыми рецепторами IgG

IgE_TRAP не связывается с низкоаффинными рецепторами IgG, ассоциированными с IgG-опосредуемой анафилаксией. Поскольку считается, что анафилаксия, основной побочный эффект омализумаба, вызывается возможным связыванием низкоаффинного рецептора IgG, анализ BLI использовали для проверки способности IgE_TRAP связываться с рецепторами IgG при использовании омализумаба в качестве контроля. В частности, степень связывания IgE_TRAP и омализумаба с рецептором IgG идентифицировали с использованием системы Octet RED384 (Pall ForteBio, CA, США).

Рекомбинантные белки FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA и FcγRIIIB (R & D Systems Inc., 5 мкг/мл), которые были разбавлены в 300 мМ ацетатном буфере (pH 5), иммобилизовывали на биосенсоре Amine Reactive 2 Generation (AR2G), активированном посредством комбинации 400 мМ EDC и 10 мМ сульфо-NHS. Затем определяли ассоциацию с и диссоциацию от IgE_TRAP и омализумаба при различных концентрациях, соответственно, в течение 300 секунд. В данном случае, использованный кинетический буфер представлял собой PBS, содержавший 0,1% Tween-20 и 1% бычью сыворотку, и все эксперименты проводили при 30°C с использованием устройства для встряхивания планшетов со скоростью 1000 об/мин.

Как и ожидалось, омализумаб продемонстрировал значительную способность связывать FcγRI, высокоаффинным рецептором IgG, а также с низкоаффинными рецепторами IgG, такими как FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA и FcγRIIIB (фиг. 9-14). Это означает, что, в отличие от омализумаба, IgE_TRAP не может связывать рецепторы IgG, такие как FcγRIIA и FcγRIII, и, таким образом, имеет очень низкий риск индукции IgG-опосредуемой анафилаксии (фиг.9-14). Способность связывания омализумаба и IgE_TRAP с рецепторами IgG количественно определяли, и она показана на фиг.14.

Экспериментальный пример 3. Определение активности слитого белка FcεRIα ECD с использованием анализа с бета-гексозаминидазой в тучных клетках костномозгового происхождения мыши

Анализ с бета-гексозаминидазой проводили для исследования активности in vitro слитого бека FcεRIαECD по настоящему изобретению. В частности, белок FcεRIαECD-Fc2 в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения смешивали в каждой концентрации с IgE мыши (1 мкг/мл) и инкубировали при комнатной температуре (20°C) в течение 30 минут с получением образцов. Тучные клетки костномозгового происхождения в культуре для активации тучных клеток промывали буфером на основе сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) для удаления среды, и определяли количество клеток. Затем проводили доведение таким образом, чтобы 5×10⁵ клеток инжектировали в 40 мкл буфера HBSS.

Затем к активированным тучным клеткам добавляли 50 мкл раствора образца, полученного посредством предварительной инкубации. Затем полученный материал инкубировали в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C в течение 30 минут. Затем после добавления в каждом случае по 10 мкл DNP (2,4-динитрофенол, 100 нг/мл), который является посторонним антигеном, вновь проводили инкубацию при 37°C в течение 30 минут в 5% CO₂, а затем отделяли 30 мкл супернатанта. 30 мкл отделенного супернатанта и 30 мкл субстрата (4-нитрофенил N-ацетил-β-D-глюкозаминид, 5,84 мМ) хорошо перемешивали, а затем инкубировали при 37°C в течение 20 минут в 5% CO₂. Затем добавляли 140 мкл 0,1 M натрий-карбонатного буфера (pH 10) в качестве стоп-раствора для завершения реакции. После этого определяли поглощение при 405 нм для идентификации секретируемого количества β-гексозаминидазы, секретируемой посредством постороннего антигена, в активированных тучных клетках. Результаты показаны на фиг. 15A.

IgE_TRAP ингибировал дегрануляцию тучных клеток дозозависимым образом с 0,45 мкг/мл IC₅₀ (концентрация лекарственного средства, необходимая для демонстрации ингибиторного эффекта 50%) в присутствии 1 мкг/мл IgE мыши (фиг. 15A). IgE_TRAP полностью ингибировал дегрануляцию тучных клеток костномозгового происхождения в молекулярном соотношении IgE:IgE_TRAP 0,79 (таблица 5).

[Таблица 5]

IgE против DNP 1 мкг/мл (= 5,26 нМ) IgE_TRAP (мкг/мл) 0 0,016 0,063 0,25 0,5 1 2 4 IgE_TRAP (нМ) 0 0,11 0,42 1,67 3,33 6,67 13,3 26,7 Молярное соотношение [IgE/IgE_TRAP] 0 47,8 12,5 3,15 1,58 0,79 0,40 0,20 Средняя доля ингибирования (%) 0 2,12 12,4 13,8 49,4 99,3 99,4 99,8

В частности, как показано на фиг. 15A, полипептидный димер согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения демонстрировал долю ингибирования тучных клеток приблизительно 49,4% в случае половинной (0,5 мкг/мл) концентрации IgE мыши, и демонстрировал долю ингибирования тучных клеток приблизительно 99,4% в случае той же концентрации (1 мкг/мл) IgE мыши. Таким образом, можно видеть, что индуцируемая IgE активность происходящих из костного мозга тучных клеток значительно подавляется полипептидным димером FcεRIα-ECD по настоящему изобретению.

Экспериментальный пример 4. Сравнение активности слитого белка FcεRIα ECD и антитела против IgE человека с использованием анализа с β-гексозаминидазой в экспрессирующих FcεRI человека тучных клетках костномозгового происхождения

Анализ с β-гексозаминидазой проводили для идентификации превосходства слитого белка FcεRIα ECD над Xolair посредством анализа активности in vitro. Соответствующие лекарственные средства, FcεRIαECD -Fc2ST (IgE_TRAP) и Xolair, получали в каждой концентрации, а затем смешивали с IgE человека (1 мкг/мл). Затем проводили инкубацию при комнатной температуре в течение 30 минут. В ходе предварительной инкубации с лекарственным средством вводили ген FcεRI человека и получали тучные клетки, происходящие и дифференцированные из костного мозга мыши, в которых ген FcεRI мыши удален. Полученные тучные клетки промывали буфером HBSS, а затем 5×10⁵ клеток инжектировали в 60 мкл буфера HBSS. К полученным тучным клеткам добавляли 20 мкл предварительно инкубированного образца, а затем инкубировали в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C в течение 30 минут.

Затем добавляли 20 мкл антитела против IgE человека (BioLegend, каталожный номер № 325502, 0,5 мкг/мл) для индукции сходной реакции с чужеродным антигеном, а затем полученный материал вновь инкубировали в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C в течение 30 минут. Затем после центрифугирования при 1500 об/мин при 4°C отделяли 30 мкл супернатанта. 30 мкл отделенного супернатанта и 30 мкл субстрата (4-нитрофенил N-ацетил-β-глюкозаминида, 5,84 мМ) хорошо перемешивали, а затем инкубировали в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C в течение 25 минут. Затем добавляли 140 мкл 0,1 M натрий-карбонатного буфера (pH 10) для завершения реакции.

Затем определяли поглощение при 405 нм для сравнения относительных количеств секретируемой β-гексозаминидазы и идентифицировали эффект ингибирования тучных клеток в зависимости от каждой концентрации лекарственного средства. Результаты представлены на фиг.15B. Как показано на фиг.15B, было определено, что IC₅₀ слитого белка FcεRIα ECD составляет приблизительно 11,16 нг/мл, и IC₅₀ белка Xolair составляет приблизительно 649,8 нг/мл. Таким образом, было идентифицировано, что слитый белок FcεRIα ECD обладает в 58 раз более высокой ингибиторной активностью в отношении активности тучных клеток, чем Xolair.

Экспериментальный пример 5. Анализ in vivo слитого белка FcεRIα ECD: модель пищевой аллергии

50 мкг овальбумина (OVA) и 1 мг квасцов внутрибрюшинно вводили мышам Balb/c (Orientbio Inc.) два раза с интервалом 14 суток для индукции сенсибилизации. После этого 50 мг OVA перорально вводили пять раз всего на 28, 30, 32, 34 и 36 сутки для индукции пищевой аллергии в кишечнике.

После перорального введения OVA два раза, т.е. на 31 сутки, мышей разделяли на три группы, каждая из которых содержала 7 мышей. Три разделенных группы были следующими: в первой группе вводили слитый белок FcεRIαECD -Fc2ST в высокой концентрации (200 мкг), во второй группе вводили слитый белок FcεRIαECD -Fc2ST в низкой концентрации (20 мкг), и в третьей группе ничего не вводили. При пероральном введении OVA определяли, происходит ли диарея в результате индукции пищевой аллергии. Мышей умерщвляли на 37 сутки и анализировали количество тучных клеток в тонком кишечнике, концентрацию IgE в крови и концентрацию фермента (протеаза-1 тучных клеток (MCPT-1)) дегрануляции тучных клеток в крови для мышей, относящихся к каждой группе.

Как показано на фиг.16, было идентифицировано, что мыши, относящиеся к группе, в которой вводили FcεRIαECD -Fc2ST, который представляет собой полипептидный димер, в высокой концентрации демонстрирует эффект смягчения пищевой аллергии зависимым от концентрации образом по сравнению с мышами, относящимися к группе, в которой ничего не вводили.

II. Получение комбинации полипептида, обладающего способностью связываться с IgE, и пробиотиков, и определение ее эффекта

Пример 3: Культивирование и введение пробиотиков

L. casei (Lactobacillus casei; KACC 12413), Lc. lactis (Lactococcus lactis; KACC 13877), L. fermentum (Lactobacillus fermentum; KACC 11441) и L. rhamnosus (Lactobacillus rhamnosus; KACC 11953) инокулировали на бульон MRS или среду с сердечно-мозговым экстрактом (BHI) и культивировали в инкубаторе при 37°C (N-Biotek, каталожный номер № NB201L) в течение 24 часов. L. reuteri (Lactobacillus reuteri; KACC 11452) и S. thermophiles (Streptococcus thermophiles; KACC 11857) культивировали в инкубаторе со встряхиванием (N-biotek) при 37°C и 50 об/мин в течение 24 часов ввиду их аэробной природы.

Культивированные пробиотики растворяли в среде для лиофилизации, содержавшей 10% снятое молоко и 10% сахарозу, и лиофилизировали с использованием лиофилизатора (Labcono). Затем полученный материал преобразовывали в порошок. Для полученных пробиотиков определяли количество колониеобразующих единиц (к.о.е.) на грамм посредством серийного разведения.

Лиофилизированные пробиотики непрерывно вводили с пищей в количестве от 1×10⁹ до 2,5×10⁹ к.о.е. на мышь с использованием орального зонда с интервалами 2-3 суток в ходе эксперимента. Отрицательных контрольных мышей кормили равным количеством лиофилизированной среды.

Пример 4: Получение композиции, содержащей пробиотики и полипептид, обладающий способностью связываться с IgE

Полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, полученный согласно примеру 1, и пробиотики, полученные согласно примеру 3, смешивали с получением композиции для лечения аллергии.

Экспериментальный пример 6. Определение эффекта слитого белка FcεRIα-Fc на смягчение аллергии

50 мкг овальбумина (OVA) и 1 мг квасцов внутрибрюшинно вводили мышам Balb/c (Orientbio Inc.) два раза с интервалом 14 суток для индукции сенсибилизации. После этого 50 мг OVA перорально вводили пять раз всего на 28, 30, 32, 34 и 36 сутки для индукции пищевой аллергии в кишечнике. Мышей, у которых была индуцирована пищевая аллергия, распределяли на пять групп, каждая из которых содержала 7 мышей. Эти пять групп были следующими: в первой группе вводили рекомбинантный белок FcεRIαECD в высокой концентрации (200 мкг), во второй группе вводили рекомбинантный белок FcεRIαECD в низкой концентрации (20 мкг), в третьей группе вводили рекомбинантный белок FcεRIαECD в высокой концентрации (200 мкг) плюс B. longum, в четвертой группе вводили рекомбинантный белок FcεRIαECD в низкой концентрации (20 мкг) плюс B. longum, и в пятой группе ничего не вводили.

При пероральном введении OVA определяли происходит ли диарея в результате индукции пищевой аллергии. Мышей умерщвляли на 37 сутки и анализировали количество тучных клеток в тонком кишечнике, концентрацию IgE в крови и концентрацию фермента (протеаза-1 тучных клеток (MCPT-1)) дегрануляции тучных клеток в крови для мышей, относящихся к каждой группе. Как показано на фиг.19B, было обнаружено, что мыши, относившиеся к группе, в которой вводили комбинацию полипептидного димера FcεRIαECD и B. longum, демонстрируют эффект смягчения пищевой аллергии по сравнению с мышами, относящимися к группе, в которой ничего не вводили.

Экспериментальный пример 7. Определение эффекта комбинированного введения IgETRAP и пробиотиков на смягчение аллергии

Для оценки эффекта IgE_TRAP на пищевую аллергию дозозависимую острую диарею индуцировали у мышей BALB/c для получения модели на мышах индуцированной аллергеном пищевой аллергии. В частности, эксперименты проводили аналогично тому, как в экспериментальном примере 6, за исключением того, что IgE_TRAP, рекомбинантный белок FcεRIαECD, вводили в количестве 100 мкг/мышь. Кроме того, пробиотики B. longum лиофилизировали и смешивали с порошкованным кормом для мышей в количестве 3×10⁹ к.о.е./г. Мышам обеспечивали доступ к корму без ограничений. Для поддержания свежести мышиный корм, смешанный с B. longum, заменяли каждые 2-3 суток. В результате, как показано в приведенной ниже таблице 6 и на фиг. 18, было обнаружено, что в экспериментальной группе, в которой одновременно вводили пробиотики B. longum и IgE_TRAP, полипептидный димер FcεRIαECD, наблюдали превосходный эффект смягчения аллергии.

[Таблица 6]

Группа Конечное количество мышей Характерный признак 1-ая нагрузка OVA 2-я нагрузка OVA 3-я нагрузка OVA 4-я нагрузка OVA 5-я нагрузка OVA 1 17 Контроль заболевания 0/17
(0,00%) 0/17
(0,00%) 2/17
(11,76%) 14/17
(82,35%) 15/17
(88,24%) 2 17 Только B.longum 0/17
(0,00%) 0/17
(0,00%) 2/17
(11,11%) 11/17
(61,11%) 11/17
(64,71%) 3 18 IgE-ловушка+B.longum 0/18
(0,00%) 0/18
(0,00%) 1/18
(5,56%) 2/18
(11,11%) 4/18
(22,22%) 4 17 Только IgE-ловушка 0/17
(0,00%) 0/17
(0,00%) 3/17
(17,65%) 6/17
(35,29%) 9/17
(52,94%) 5 16 Нормальный контроль 0/16
(0,00%) 0/16
(0,00%) 0/16
(0,00%) 0/16
(0,00%) 0/16
(0,00%)

С использованием этой модели авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение IgE_TRAP отдельно эффективно снижало частоту возникновения диареи и идентифицировали, что введение IgE_TRAP в комбинации с B. longum значительно снижали частоту возникновения диареи по сравнению с введением IgE_TRAP отдельно (фиг. 18). Было описано, что B. longum снижали количество тучных клеток и смягчали симптомы пищевой аллергии посредством апоптоза. Однако группа, в которой проводили внутрибрюшинную инъекцию IgE_TRAP, демонстрировала лучший терапевтический эффект, чем группа, в которой ежедневно вводили B. longum (фиг. 18). Интересно, что даже в случае, когда использовали IgE_TRAP с 10-кратно сниженной концентрацией, комбинированная терапия IgE_TRAP и B. longum демонстрировала сходный эффект с терапией IgE_TRAP отдельно (фиг. 19B).

Экспериментальный пример 8. Определение эффектов при комбинированном введении IgETRAP и B. longum: уровни MCPT-1 и IgE

Кроме того, определяли уровень MCPT-1 в сыворотке для идентификации дегрануляции тучных клеток. Введение IgE_TRAP и B. longum отдельно не снижало уровень MCPT-1, однако комбинация IgE_TRAP и B. longum значительно снижала уровень MCPT-1 (фиг. 20). Таким образом, можно видеть, что B. longum и IgE_TRAP кооперируют, ингибируя дегрануляцию тучных клеток. В модели пищевой аллергии на мышах для исследования эффективности терапевтического средства, которое снижает уровень IgE, использовали ELISA для анализа уровней тотального IgE и свободного IgE в сыворотке. IgE_TRAP, и комбинация IgE_TRAP и B. longum, слабо повышали уровень тотального IgE (фиг. 21). Однако IgE_TRAP, и комбинация IgE_TRAP и B. longum, значительно снижали уровень свободного IgE (фиг. 22). Напротив, введение B. longum отдельно не влияло на уровни тотального IgE и свободного IgE (фиг. 21 и 22). Таким образом, IgE_TRAP и B. longum смягчают симптомы пищевой аллергии несколькими путями, указывая на то, что эта комбинация может демонстрировать эффективный терапевтический эффект на пищевую аллергию.

Экспериментальный пример 9. Определение ингибиторного эффекта комбинации IgETRAP и B. longum на количество тучных клеток и гиперплазию бокаловидных клеток

Для исследования того, снижают ли IgE_TRAP и B. longum, и их комбинация количество тучных клеток, использовали активность хлорацетатэстеразы для окрашивания тучных клеток. Результаты показали, что введение IgE_TRAP и B. longum отдельно значительно снижало количество тучных клеток, и комбинация этих двух средств была значительно более эффективной (фиг. 23 и 24). Можно видеть, что результаты для B. longum согласуются с результатами, описанными ранее. Проводили исследование того, может ли гиперплазия бокаловидных клеток, индуцированная средой с Th2-цитокинами, ингибироваться посредством IgE_TRAP, B. longum и их комбинированной терапии. Как и ожидалось, было идентифицировано, что размер бокаловидных клеток в тонком кишечнике мышей с пищевой аллергией увеличивался, и возникала гиперплазия, поскольку увеличивалось количество клеток (фиг.25 и 26).

Было идентифицировано, что введение IgE_TRAP и B. longum значительно уменьшало размер и количество бокаловидных клеток, и этот эффект становился более выраженным в случае, когда IgE_TRAP и B. longum вводили в комбинации (фиг. 25 и 26). Кроме того, наблюдалось, что экспрессия мРНК IL-33 имела тенденцию к снижению посредством IgE_TRAP и B. longum, и этот эффект становился значительно более выраженным в случае введения в комбинации (фиг. 28). Эти результаты указывают на то, что IgE_TRAP и B. longum значительно ингибируют количество кишечных тучных клеток и гиперплазию бокаловидных клеток, и демонстрируют дополнительно улучшенный эффект в случае введения в комбинации.

Экспериментальный пример 10. Определение присутствия IgETRAP в сыворотке после перорального введения IgETRAP мышам

IgE_TRAP (300 мкг) перорально вводили мышам и через 2 часа проводили взятие сыворотки посредством ретроорбитального взятия крови. После обеспечения возможности реагировать при комнатной температуре в течение 30 минут получали супернатант (сыворотку) посредством центрифугирования при 4°C и 1300 об/мин в течение 15 минут. 96-луночный планшет Immuno покрывали антителом против FcεRI (Abcam, ab54411) и позволяли ему реагировать в течение ночи при 4°C. Планшет промывали промывочным буфером (PBS, содержащий 0,05% Tween-20), а затем добавляли блокирующий буфер (PBS, содержащий 1% бычий сывороточный альбумин). Реакции в планшете позволяли протекать в течение 1 часа. Планшет вновь промывали промывочным буфером, и в планшет добавляли стандартный образец и образец разбавленной сыворотки мыши. Планшету позволяли реагировать в течение 2 часов и вновь промывали промывочным буфером. В него добавляли антитело против Fc IgG4 человека (Abcam, ab99823), и реакции в планшете позволяли протекать в течение 1 часа. Планшет вновь промывали промывочным буфером и в него добавляли субстрат TMB (Supmodics). После реакции в течение 20 минут при блокировании света добавляли стоп-реагент (1 M H₂SO₄) для остановки реакции. Величину концентрации определяли с использованием устройства для считывания микропланшетов (спектрометров для микропланшетов Epoch) путем выбора длины волны 450 нм. В результате, IgE_TRAP обнаруживался в сыворотке нормальных мышей (фиг. 35). Из этих результатов можно видеть, что в случае, когда перорально вводили белок IgE_TRAP, белок IgE_TRAP доставлялся в сыворотку посредством связывания с FcRn в слизистой оболочке и, таким образом, может быть достигнут терапевтический эффект.

Экспериментальный пример 11. Определение эффекта, полученного посредством комбинированного введения IgETRAP и различных пробиотиков в модели пищевой аллергии

Для оценки эффекта IgE_TRAP и пробиотиков на пищевую аллергию индуцировали дозозависимую острую диарею у мышей BALB/c с получением модели на мышах индуцированной аллергеном пищевой аллергии. В частности, эксперименты проводили аналогично тому, как описано в экспериментальном примере 7, за исключением того, что IgE_TRAP, рекомбинантный белок FcεRIαECD, внутрибрюшинно вводили мышам в дозе 100 мкг/мышь, как на схеме эксперимента на фиг.17. Кроме того, лиофилизированными пробиотиками непрерывно кормили мышей в количестве от 1×10⁹ до 2,5×10⁹ к.о.е. на мышь с использованием орального зонда с интервалами 2-3 суток в ходе эксперимента, и отрицательных контрольных мышей кормили равным количеством лиофилизированной среды.

Результаты, полученные путем определения частоты диареи после введения IgE_TRAP и L. casei, проиллюстрированы на фиг.29. Результаты, полученные посредством определения частоты диареи после введения IgE_TRAP и Lc. lactis, проиллюстрированы на фиг.30. Результаты, полученные посредством определения частоты диареи после введения IgE_TRAP и S. thermophilus, проиллюстрированы на фиг.31. Результаты, полученные посредством определения частоты диареи после введения IgE_TRAP и L. rhamnosus, проиллюстрированы на фиг.32. Результаты, полученные путем определения частоты диареи после введения IgE_TRAP и L. reuteri, проиллюстрированы на фиг.33. Результаты, полученные путем определения частоты диареи после введения IgE_TRAP и L. fermentum, проиллюстрированы на фиг.34.

Список сокращений:

B. longum: Bifidobacterium longum

OIT: пероральная иммунотерапия

PSA: пассивная системная анафилаксия

SPR: Поверхностный плазмонный резонанс

BLI: биослойная интерферометрия

BMMC: тучная клетка костномозгового происхождения

к.о.е.: колониеобразующие единицы

MCPT-1: протеаза-1 тучных клеток

OVA: овальбумин

Treg-клетки: регуляторные T-клетки

Th2-клетки: хелперные T-клетки 2 типа

ILC2: врожденная лимфоидная клетка 2 группы

[Список последовательностей]

SEQ ID NO: 1

VPQKPKVSLN PPWNRIFKGE NVTLTCNGNN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNIVNAKF EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDWLLL QASAEVVMEG QPLFLRCHGW RNWDVYKVIY YKDGEALKYW YENHNISITN ATVEDSGTYY CTGKVWQLDY ESEPLNITVI KAPREKYWLQ

SEQ ID NO: 2

SHTQPLGVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK

SEQ ID NO: 3

RNTGRGGEEK KGSKEKEEQE ERETKTPECP

SEQ ID NO: 4

AQPQAEGSLA KATTAPATTR NTGRGGEEKK GSKEKEEQEE RETKTPECP

SEQ ID NO: 5

gtgccccaga agcccaaggt gagcctgaac cctccctgga acagaatctt caagggcgag aacgtgaccc tgacctgcaa cggcaacaac ttcttcgagg tgagcagcac caagtggttc cacaatggca gcctgagcga ggagaccaac agctccctga acatcgtgaa cgccaagttc gaggacagcg gcgagtacaa gtgccagcac cagcaggtga acgagagcga gcccgtgtac ctggaggtgt tcagcgactg gctgctgctg caggccagcg ccgaggtggt gatggagggc cagcccctgt tcctgagatg ccacggctgg agaaactggg acgtgtacaa ggtgatctac tacaaggatg gcgaggccct gaagtactgg tacgagaacc acaacatctc catcaccaac gccaccgtgg aggacagcgg cacctactac tgcacaggca aggtgtggca gctggactac gagagcgagc ccctgaacat caccgtgatc aaggctccca gagagaagta ctggctgcag

SEQ ID NO: 6

tgcgtggtcg tggatgtgag ccaggaagat cccgaagtgc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagaag agcagttcaa ctccacctac agagtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaagg cctgcccagc tccatcgaga agaccatcag caaagccaaa ggccagccca gagaacccca ggtgtacacc ctgcctccca gccaggaaga gatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggaaagca acggccagcc cgagaacaat tacaagacaa cccctcccgt gctggatagc gatggcagct tctttctgta cagcagactg accgtggaca agagcagatg gcaggaaggc aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgaa gccctgcaca accactacac ccagaagagc ctgtccctga gcctgggcaa g

SEQ ID NO: 7

aggaacaccg gcagaggagg cgaggaaaag aaaggaagca aggagaagga ggagcaggag gaaagagaaa ccaagacccc cgagtgcccc agccacaccc agcccctggg cgtgttcctg ttccccccca agcccaagga caccctgatg atcagcagaa cccccgaggt gacc

SEQ ID NO: 8

gcccagcccc aggccgaggg cagcctggct aaggccacca cagctcccgc caccaccagg aacaccggca gaggaggcga ggaaaagaaa ggaagcaagg agaaggagga gcaggaggaa agagaaacca agacccccga gtgccccagc cacacccagc ccctgggcgt gttcctgttc ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc agcagaaccc ccgaggtgac c

SEQ ID NO: 9

MDAMLRGLCC VLLLCGAVFV SPSHA

SEQ ID NO: 10

atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg tcccctagcc acgcc

SEQ ID NO: 11

MDAMLRGLCC VLLLCGAVFV SPSHAVPQKP KVSLNPPWNR IFKGENVTLT CNGNNFFEVS STKWFHNGSL SEETNSSLNI VNAKFEDSGE YKCQHQQVNE SEPVYLEVFS DWLLLQASAE VVMEGQPLFL RCHGWRNWDV YKVIYYKDGE ALKYWYENHN ISITNATVED SGTYYCTGKV WQLDYESEPL NITVIKAPRE KYWLQRNTGR GGEEKKGSKE KEEQEERETK TPECPSHTQP LGVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSLGK

SEQ ID NO: 12

atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc ctggaacaga atcttcaagg gcgagaacgt gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc agcaccaagt ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cctgaacatc gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gactggctgc tgctgcaggc cagcgccgag gtggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg tacaaggtga tctactacaa ggatggcgag gccctgaagt actggtacga gaaccacaac atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcacct actactgcac aggcaaggtg tggcagctgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag aagtactggc tgcagaggaa caccggcaga ggaggcgagg aaaagaaagg aagcaaggag aaggaggagc aggaggaaag agaaaccaag acccccgagt gccccagcca cacccagccc ctgggcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag cagaaccccc gaggtgacct gcgtggtcgt ggatgtgagc caggaagatc ccgaagtgca gttcaactgg tacgtggatg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagaaga gcagttcaac tccacctaca gagtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaaggc ctgcccagct ccatcgagaa gaccatcagc aaagccaaag gccagcccag agaaccccag gtgtacaccc tgcctcccag ccaggaagag atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggaaagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagacaac ccctcccgtg ctggatagcg atggcagctt ctttctgtac agcagactga ccgtggacaa gagcagatgg caggaaggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgaag ccctgcacaa ccactacacc cagaagagcc tgtccctgag cctgggcaag

SEQ ID NO: 13

MDAMLRGLCC VLLLCGAVFV SPSHAVPQKP KVSLNPPWNR IFKGENVTLT CNGNNFFEVS STKWFHNGSL SEETNSSLNI VNAKFEDSGE YKCQHQQVNE SEPVYLEVFS DWLLLQASAE VVMEGQPLFL RCHGWRNWDV YKVIYYKDGE ALKYWYENHN ISITNATVED SGTYYCTGKV WQLDYESEPL NITVIKAPRE KYWLQAQPQA EGSLAKATTA PATTRNTGRG GEEKKGSKEK EEQEERETKT PECPSHTQPL GVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK

SEQ ID NO: 14

atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc ctggaacaga atcttcaagg gcgagaacgt gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc agcaccaagt ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cctgaacatc gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gactggctgc tgctgcaggc cagcgccgag gtggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg tacaaggtga tctactacaa ggatggcgag gccctgaagt actggtacga gaaccacaac atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcacct actactgcac aggcaaggtg tggcagctgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag aagtactggc tgcaggccca gccccaggcc gagggcagcc tggctaaggc caccacagct cccgccacca ccaggaacac cggcagagga ggcgaggaaa agaaaggaag caaggagaag gaggagcagg aggaaagaga aaccaagacc cccgagtgcc ccagccacac ccagcccctg ggcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag gtgacctgcg tggtcgtgga tgtgagccag gaagatcccg aagtgcagtt caactggtac gtggatggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaagagca gttcaactcc acctacagag tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtgtccaa caaaggcctg cccagctcca tcgagaagac catcagcaaa gccaaaggcc agcccagaga accccaggtg tacaccctgc ctcccagcca ggaagagatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaaaggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg aaagcaacgg ccagcccgag aacaattaca agacaacccc tcccgtgctg gatagcgatg gcagcttctt tctgtacagc agactgaccg tggacaagag cagatggcag gaaggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaagccc tgcacaacca ctacacccag aagagcctgt ccctgagcct gggcaag

SEQ ID NO: 15

MIHTNLKKKF SCCVLVFLLF AVICVWKEKK KGSYYDSFKL QTKEFQVLKS LGKLAMGSDS QSVSSSSTQD PHRGRQTLGS LRGLAKAKPE ASFQVWNKDS SSKNLIPRLQ KIWKNYLSMN KYKVSYKGPG PGIKFSAEAL RCHLRDHVNV SMVEVTDFPF NTSEWEGYLP KESIRTKAGP WGRCAVVSSA GSLKSSQLGR EIDDHDAVLR FNGAPTANFQ QDVGTKTTIR LMNSQLVTTE KRFLKDSLYN EGILIVWDPS VYHSDIPKWY QNPDYNFFNN YKTYRKLHPN QPFYILKPQM PWELWDILQE ISPEEIQPNP PSSGMLGIII MMTLCDQVDI YEFLPSKRKT DVCYYYQKFF DSACTMGAYH PLLYEKNLVK HLNQGTDEDI YLLGKATLPG FRTIHC

SEQ ID NO: 16

atgatccaca ccaacctgaa gaagaagttc agctgctgcg tgctggtgtt cctgctgttc gccgtgatct gcgtgtggaa ggagaagaag aaaggcagct actacgacag cttcaagctg cagaccaagg agttccaggt gctgaagagc ctgggcaagc tggccatggg cagcgacagc cagagcgtgt ccagctcctc cacccaggat ccccacagag gcagacagac cctgggcagc ctgagaggcc tggccaaggc caagcccgag gccagcttcc aggtgtggaa caaggacagc agcagcaaga acctgatccc cagactgcag aagatctgga agaactacct gagcatgaac aagtacaagg tgagctacaa aggacccgga cccggcatca agttcagcgc cgaggccctg aggtgccacc tgagagacca cgtgaacgtg agcatggtgg aagtgaccga cttccccttc aacaccagcg agtgggaagg ctacctgccc aaggagagca tcaggaccaa ggctggcccc tggggcagat gcgccgtggt gagcagcgct ggcagcctga agagctccca gctgggcaga gagatcgacg accacgatgc cgtgctgagg ttcaatggcg ctcccaccgc caacttccag caggacgtgg gcaccaagac cacaatccgg ctgatgaaca gccagctggt gacaaccgag aagcggttcc tgaaggacag cctgtacaac gagggcatcc tgatcgtgtg ggatcccagc gtgtaccaca gcgacatccc caagtggtac cagaatcccg actacaactt cttcaacaac tacaagacct atagaaagct gcaccccaac cagcccttct acatcctgaa gccccagatg ccctgggagc tgtgggacat cctgcaggag atcagccctg aagagatcca gcccaaccct ccctccagcg gcatgctggg cattatcatc atgatgaccc tgtgcgacca ggtggacatc tacgagttcc tgcccagcaa gagaaagacc gacgtgtgct actactatca gaagttcttc gacagcgcct gcaccatggg cgcctaccac cccctgctgt acgagaagaa cctggtgaag cacctgaacc agggcaccga cgaggacatc tacctgctgg gcaaagccac cctgcccggc ttcagaacca tccactgc

SEQ ID NO: 17

RNTGRGGEEK KXXKEKEEQE ERETKTPECP

SEQ ID NO: 18

AQPQAEGSLA KATTAPATTR NTGRGGEEKK XXKEKEEQEE RETKTPECP

SEQ ID NO: 19

RNTGRGGEEK KKEKEKEEQE ERETKTPECP

SEQ ID NO: 20

VPQKPKVSLN PPWNRIFKGE NVTLTCNGNN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNIVNAKF EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDWLLL QASAEVVMEG QPLFLRCHGW RNWDVYKVIY YKDGEALKYW YENHNISITN ATVEDSGTYY CTGKVWQLDY ESEPLNITVI KAPREKYWLQ RNTGRGGEEK KKEKEKEEQE ERETKTPECP SHTQPLGVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK

SEQ ID NO: 21

VPQKPKVSLN PPWNRIFKGE NVTLTCNGNN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNIVNAKF EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDWLLL QASAEVVMEG QPLFLRCHGW RNWDVYKVIY YKDGEALKYW YENHNISITN ATVEDSGTYY CTGKVWQLDY ESEPLNITVI KAPREKYWLQ RNTGRGGEEK KGSKEKEEQE ERETKTPECP SHTQPLGVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK

SEQ ID NO: 22

VPQKPKVSLN PPWNRIFKGE NVTLTCNGNN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNIVNAKF EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDWLLL QASAEVVMEG QPLFLRCHGW RNWDVYKVIY YKDGEALKYW YENHNISITN ATVEDSGTYY CTGKVWQLDY ESEPLNITVI KAPREKYWLQ AQPQAEGSLA KATTAPATTR NTGRGGEEKK GSKEKEEQEE RETKTPECPS HTQPLGVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> PROGEN CO., LTD.

GI INNOVATION, INC.

<120> КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПРОБИОТИКИ И ПОЛИПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ

АФФИННОСТЬЮ СВЯЗЫВАНИЯ В ОТНШОЕНИИ IGE, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> PCB812127GEE/PCT

<150> KR 10-2018-0004421

<151> 2018-01-12

<160> 22

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 180

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> FCeRI1 ECD

<400> 1

Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile

1 5 10 15

Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe

20 25 30

Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu

35 40 45

Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly

50 55 60

Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val

85 90 95

Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn

100 105 110

Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys

115 120 125

Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu

130 135 140

Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr

145 150 155 160

Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys

165 170 175

Tyr Trp Leu Gln

180

<210> 2

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> Модифицированный Fc

<400> 2

Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

1 5 10 15

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

20 25 30

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

35 40 45

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

50 55 60

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

65 70 75 80

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

85 90 95

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

100 105 110

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

115 120 125

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

130 135 140

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

145 150 155 160

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

165 170 175

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

180 185 190

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

195 200 205

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

<210> 3

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> вариант шарнирной области IgD

<400> 3

Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys

1 5 10 15

Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro

20 25 30

<210> 4

<211> 49

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> вариант шарнирной области IgD

<400> 4

Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro

1 5 10 15

Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro

<210> 5

<211> 540

<212> ДНК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> нуклеотидная последовательность FCeRI1 ECD

<400> 5

gtgccccaga agcccaaggt gagcctgaac cctccctgga acagaatctt caagggcgag 60

aacgtgaccc tgacctgcaa cggcaacaac ttcttcgagg tgagcagcac caagtggttc 120

cacaatggca gcctgagcga ggagaccaac agctccctga acatcgtgaa cgccaagttc 180

gaggacagcg gcgagtacaa gtgccagcac cagcaggtga acgagagcga gcccgtgtac 240

ctggaggtgt tcagcgactg gctgctgctg caggccagcg ccgaggtggt gatggagggc 300

cagcccctgt tcctgagatg ccacggctgg agaaactggg acgtgtacaa ggtgatctac 360

tacaaggatg gcgaggccct gaagtactgg tacgagaacc acaacatctc catcaccaac 420

gccaccgtgg aggacagcgg cacctactac tgcacaggca aggtgtggca gctggactac 480

gagagcgagc ccctgaacat caccgtgatc aaggctccca gagagaagta ctggctgcag 540

540

<210> 6

<211> 561

<212> ДНК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> нуклеотидная последовательность модифицированного Fc

<400> 6

tgcgtggtcg tggatgtgag ccaggaagat cccgaagtgc agttcaactg gtacgtggat 60

ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagaag agcagttcaa ctccacctac 120

agagtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 180

tgcaaggtgt ccaacaaagg cctgcccagc tccatcgaga agaccatcag caaagccaaa 240

ggccagccca gagaacccca ggtgtacacc ctgcctccca gccaggaaga gatgaccaag 300

aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 360

tgggaaagca acggccagcc cgagaacaat tacaagacaa cccctcccgt gctggatagc 420

gatggcagct tctttctgta cagcagactg accgtggaca agagcagatg gcaggaaggc 480

aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgaa gccctgcaca accactacac ccagaagagc 540

ctgtccctga gcctgggcaa g 561

<210> 7

<211> 174

<212> ДНК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> нуклеотидная последовательность варианта шарнирной области IgD

<400> 7

aggaacaccg gcagaggagg cgaggaaaag aaaggaagca aggagaagga ggagcaggag 60

gaaagagaaa ccaagacccc cgagtgcccc agccacaccc agcccctggg cgtgttcctg 120

ttccccccca agcccaagga caccctgatg atcagcagaa cccccgaggt gacc 174

<210> 8

<211> 231

<212> ДНК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> нуклеотидная последовательность варианта шарнирной области IgD

<400> 8

gcccagcccc aggccgaggg cagcctggct aaggccacca cagctcccgc caccaccagg 60

aacaccggca gaggaggcga ggaaaagaaa ggaagcaagg agaaggagga gcaggaggaa 120

agagaaacca agacccccga gtgccccagc cacacccagc ccctgggcgt gttcctgttc 180

ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc agcagaaccc ccgaggtgac c 231

<210> 9

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> сигнальный пептид

<400> 9

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala

20 25

<210> 10

<211> 75

<212> ДНК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> нуклеотидная последовательность сигнального пептида

<400> 10

atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg 60

tcccctagcc acgcc 75

<210> 11

<211> 450

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> FceRIa ECD-шарнирная область-Fc2

<400> 11

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Pro Gln Lys Pro Lys Val

20 25 30

Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr

35 40 45

Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp

50 55 60

Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile

65 70 75 80

Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln

85 90 95

Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp

100 105 110

Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gln Pro Leu

115 120 125

Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile

130 135 140

Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn

145 150 155 160

Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys

165 170 175

Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile

180 185 190

Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr Trp Leu Gln Arg Asn Thr

195 200 205

Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys Glu Glu Gln

210 215 220

Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro

225 230 235 240

Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 12

<211> 1350

<212> ДНК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> нуклеотидная последовательность FceRIa ECD-шарнирная область-Fc2

<400> 12

atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg 60

tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc ctggaacaga 120

atcttcaagg gcgagaacgt gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc 180

agcaccaagt ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cctgaacatc 240

gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag 300

agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gactggctgc tgctgcaggc cagcgccgag 360

gtggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg 420

tacaaggtga tctactacaa ggatggcgag gccctgaagt actggtacga gaaccacaac 480

atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcacct actactgcac aggcaaggtg 540

tggcagctgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag 600

aagtactggc tgcagaggaa caccggcaga ggaggcgagg aaaagaaagg aagcaaggag 660

aaggaggagc aggaggaaag agaaaccaag acccccgagt gccccagcca cacccagccc 720

ctgggcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag cagaaccccc 780

gaggtgacct gcgtggtcgt ggatgtgagc caggaagatc ccgaagtgca gttcaactgg 840

tacgtggatg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagaaga gcagttcaac 900

tccacctaca gagtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaaggc ctgcccagct ccatcgagaa gaccatcagc 1020

aaagccaaag gccagcccag agaaccccag gtgtacaccc tgcctcccag ccaggaagag 1080

atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggaaagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagacaac ccctcccgtg 1200

ctggatagcg atggcagctt ctttctgtac agcagactga ccgtggacaa gagcagatgg 1260

caggaaggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgaag ccctgcacaa ccactacacc 1320

cagaagagcc tgtccctgag cctgggcaag 1350

<210> 13

<211> 469

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> FceRIa ECD-шарнирная область-Fc3

<400> 13

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Pro Gln Lys Pro Lys Val

20 25 30

Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr

35 40 45

Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp

50 55 60

Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile

65 70 75 80

Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln

85 90 95

Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp

100 105 110

Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gln Pro Leu

115 120 125

Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile

130 135 140

Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn

145 150 155 160

Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys

165 170 175

Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile

180 185 190

Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr Trp Leu Gln Ala Gln Pro

195 200 205

Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr

210 215 220

Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys

225 230 235 240

Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His

245 250 255

Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

260 265 270

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

275 280 285

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

290 295 300

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

305 310 315 320

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

325 330 335

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

340 345 350

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

355 360 365

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

370 375 380

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

385 390 395 400

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

405 410 415

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

420 425 430

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

450 455 460

Leu Ser Leu Gly Lys

465

<210> 14

<211> 1407

<212> ДНК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> нуклеотидная последовательность FceRIa ECD-шарнирная область-Fc3

<400> 14

atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg 60

tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc ctggaacaga 120

atcttcaagg gcgagaacgt gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc 180

agcaccaagt ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cctgaacatc 240

gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag 300

agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gactggctgc tgctgcaggc cagcgccgag 360

gtggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg 420

tacaaggtga tctactacaa ggatggcgag gccctgaagt actggtacga gaaccacaac 480

atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcacct actactgcac aggcaaggtg 540

tggcagctgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag 600

aagtactggc tgcaggccca gccccaggcc gagggcagcc tggctaaggc caccacagct 660

cccgccacca ccaggaacac cggcagagga ggcgaggaaa agaaaggaag caaggagaag 720

gaggagcagg aggaaagaga aaccaagacc cccgagtgcc ccagccacac ccagcccctg 780

ggcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag 840

gtgacctgcg tggtcgtgga tgtgagccag gaagatcccg aagtgcagtt caactggtac 900

gtggatggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaagagca gttcaactcc 960

acctacagag tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1020

tacaagtgca aggtgtccaa caaaggcctg cccagctcca tcgagaagac catcagcaaa 1080

gccaaaggcc agcccagaga accccaggtg tacaccctgc ctcccagcca ggaagagatg 1140

accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1200

gtggagtggg aaagcaacgg ccagcccgag aacaattaca agacaacccc tcccgtgctg 1260

gatagcgatg gcagcttctt tctgtacagc agactgaccg tggacaagag cagatggcag 1320

gaaggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaagccc tgcacaacca ctacacccag 1380

aagagcctgt ccctgagcct gggcaag 1407

<210> 15

<211> 406

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> трансфераза a-2,6 сиаловой кислоты человека

<400> 15

Met Ile His Thr Asn Leu Lys Lys Lys Phe Ser Cys Cys Val Leu Val

1 5 10 15

Phe Leu Leu Phe Ala Val Ile Cys Val Trp Lys Glu Lys Lys Lys Gly

20 25 30

Ser Tyr Tyr Asp Ser Phe Lys Leu Gln Thr Lys Glu Phe Gln Val Leu

35 40 45

Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser Gln Ser Val Ser

50 55 60

Ser Ser Ser Thr Gln Asp Pro His Arg Gly Arg Gln Thr Leu Gly Ser

65 70 75 80

Leu Arg Gly Leu Ala Lys Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gln Val Trp

85 90 95

Asn Lys Asp Ser Ser Ser Lys Asn Leu Ile Pro Arg Leu Gln Lys Ile

100 105 110

Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser Tyr Lys Gly

115 120 125

Pro Gly Pro Gly Ile Lys Phe Ser Ala Glu Ala Leu Arg Cys His Leu

130 135 140

Arg Asp His Val Asn Val Ser Met Val Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe

145 150 155 160

Asn Thr Ser Glu Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr

165 170 175

Lys Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala Gly Ser

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Gln Leu Gly Arg Glu Ile Asp Asp His Asp Ala Val

195 200 205

Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr Ala Asn Phe Gln Gln Asp Val Gly

210 215 220

Thr Lys Thr Thr Ile Arg Leu Met Asn Ser Gln Leu Val Thr Thr Glu

225 230 235 240

Lys Arg Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile Val

245 250 255

Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp Ile Pro Lys Trp Tyr Gln Asn

260 265 270

Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His

275 280 285

Pro Asn Gln Pro Phe Tyr Ile Leu Lys Pro Gln Met Pro Trp Glu Leu

290 295 300

Trp Asp Ile Leu Gln Glu Ile Ser Pro Glu Glu Ile Gln Pro Asn Pro

305 310 315 320

Pro Ser Ser Gly Met Leu Gly Ile Ile Ile Met Met Thr Leu Cys Asp

325 330 335

Gln Val Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser Lys Arg Lys Thr Asp Val

340 345 350

Cys Tyr Tyr Tyr Gln Lys Phe Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala

355 360 365

Tyr His Pro Leu Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys His Leu Asn Gln

370 375 380

Gly Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Pro Gly

385 390 395 400

Phe Arg Thr Ile His Cys

405

<210> 16

<211> 1218

<212> ДНК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> нуклеотидная последовательность трансферазы a-2,6-сиаловой

кислоты человека

<400> 16

atgatccaca ccaacctgaa gaagaagttc agctgctgcg tgctggtgtt cctgctgttc 60

gccgtgatct gcgtgtggaa ggagaagaag aaaggcagct actacgacag cttcaagctg 120

cagaccaagg agttccaggt gctgaagagc ctgggcaagc tggccatggg cagcgacagc 180

cagagcgtgt ccagctcctc cacccaggat ccccacagag gcagacagac cctgggcagc 240

ctgagaggcc tggccaaggc caagcccgag gccagcttcc aggtgtggaa caaggacagc 300

agcagcaaga acctgatccc cagactgcag aagatctgga agaactacct gagcatgaac 360

aagtacaagg tgagctacaa aggacccgga cccggcatca agttcagcgc cgaggccctg 420

aggtgccacc tgagagacca cgtgaacgtg agcatggtgg aagtgaccga cttccccttc 480

aacaccagcg agtgggaagg ctacctgccc aaggagagca tcaggaccaa ggctggcccc 540

tggggcagat gcgccgtggt gagcagcgct ggcagcctga agagctccca gctgggcaga 600

gagatcgacg accacgatgc cgtgctgagg ttcaatggcg ctcccaccgc caacttccag 660

caggacgtgg gcaccaagac cacaatccgg ctgatgaaca gccagctggt gacaaccgag 720

aagcggttcc tgaaggacag cctgtacaac gagggcatcc tgatcgtgtg ggatcccagc 780

gtgtaccaca gcgacatccc caagtggtac cagaatcccg actacaactt cttcaacaac 840

tacaagacct atagaaagct gcaccccaac cagcccttct acatcctgaa gccccagatg 900

ccctgggagc tgtgggacat cctgcaggag atcagccctg aagagatcca gcccaaccct 960

ccctccagcg gcatgctggg cattatcatc atgatgaccc tgtgcgacca ggtggacatc 1020

tacgagttcc tgcccagcaa gagaaagacc gacgtgtgct actactatca gaagttcttc 1080

gacagcgcct gcaccatggg cgcctaccac cccctgctgt acgagaagaa cctggtgaag 1140

cacctgaacc agggcaccga cgaggacatc tacctgctgg gcaaagccac cctgcccggc 1200

ttcagaacca tccactgc 1218

<210> 17

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> вариант шарнирной области IgD

<400> 17

Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa Xaa Lys Glu Lys

1 5 10 15

Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro

20 25 30

<210> 18

<211> 49

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> вариант шарнирной области IgD

<400> 18

Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro

1 5 10 15

Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa Xaa

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro

<210> 19

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> шарнирная область IgD

<400> 19

Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys

1 5 10 15

Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro

20 25 30

<210> 20

<211> 425

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> FceRIa ECD-шарнирная область-Fc1

<400> 20

Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile

1 5 10 15

Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe

20 25 30

Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu

35 40 45

Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly

50 55 60

Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val

85 90 95

Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn

100 105 110

Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys

115 120 125

Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu

130 135 140

Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr

145 150 155 160

Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys

165 170 175

Tyr Trp Leu Gln Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys

180 185 190

Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu

195 200 205

Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

210 215 220

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

225 230 235 240

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

245 250 255

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

260 265 270

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

275 280 285

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

290 295 300

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

305 310 315 320

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

325 330 335

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

340 345 350

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

355 360 365

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

370 375 380

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

385 390 395 400

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

405 410 415

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

420 425

<210> 21

<211> 425

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> FceRIa ECD-шарнирная область-Fc2

<400> 21

Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile

1 5 10 15

Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe

20 25 30

Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu

35 40 45

Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly

50 55 60

Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val

85 90 95

Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn

100 105 110

Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys

115 120 125

Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu

130 135 140

Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr

145 150 155 160

Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys

165 170 175

Tyr Trp Leu Gln Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly

180 185 190

Ser Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu

195 200 205

Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

210 215 220

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

225 230 235 240

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

245 250 255

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

260 265 270

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

275 280 285

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

290 295 300

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

305 310 315 320

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

325 330 335

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

340 345 350

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

355 360 365

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

370 375 380

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

385 390 395 400

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

405 410 415

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

420 425

<210> 22

<211> 444

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный белок

<220>

<223> FceRIa ECD-шарнирная область-Fc3

<400> 22

Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile

1 5 10 15

Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe

20 25 30

Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu

35 40 45

Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly

50 55 60

Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val

85 90 95

Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn

100 105 110

Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys

115 120 125

Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu

130 135 140

Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr

145 150 155 160

Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys

165 170 175

Tyr Trp Leu Gln Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala

180 185 190

Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu

195 200 205

Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys

210 215 220

Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<---

Группа изобретений относится к области фармацевтики и может быть использована для лечения или предупреждения аллергического заболевания. Композиция для лечения или предупреждения аллергического заболевания содержит в качестве активных ингредиентов пробиотики и полипептид, обладающий способностью связываться с IgE. При этом полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, представляет собой полипептидный димер, содержащий два мономера, каждый из которых содержит внеклеточный домен (FcεRIαECD) альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE, мономер содержит нативную или модифицированную Fc-область и Fc-область и FcεRIαECD связаны через линкер. Предложены также диетическая функциональная пищевая композиция для смягчения или облегчения симптома аллергии, набор и способ лечения или предупреждения аллергического заболевания. Группа изобретений обеспечивает синергический эффект значительного снижения пищевой аллергии. 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 35 ил., 6 табл., 4 пр.

1. Композиция, содержащая в качестве активных ингредиентов

пробиотики и

полипептид, обладающий способностью связываться с IgE,

где полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, представляет собой полипептидный димер, содержащий два мономера, каждый из которых содержит внеклеточный домен (FcεRIαECD) альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE,

мономер содержит нативную или модифицированную Fc-область и

Fc-область и FcεRIαECD связаны через линкер.

2. Композиция по п.1,

где пробиотики представляют собой молочнокислые бактерии или бифидобактерии.

3. Композиция по п.2,

где молочнокислые бактерии представляют собой любые бактерии, выбранные из группы, состоящей из Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus и Streptococcus.

4. Композиция по п.3,

где Lactobacillus представляют собой любые, выбранные из группы, состоящей из L. acidophilus, L. casei, L. gasseri, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. helveticus, L. fermentum, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus, L. pentosus и L. salivarius,

Lactococcus представляет собой Lc. lactis и

Streptococcus представляет собой S. themophilus.

5. Композиция по п.2,

где бифидобактерии представляют собой любые, выбранные из группы, состоящей из B. bifidum, B. breve, B. longum и B. animalis ssp. lactis.

6. Композиция по п.2,

где пробиотики представляют собой L. casei или B. longum.

7. Композиция по п.1,

где внеклеточный домен альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

8. Композиция по п.1,

где пробиотики имеют форму высушенного порошка.

9. Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения аллергического заболевания, содержащая

композицию по п.1.

10. Фармацевтическая композиция по п.9,

где аллергическое заболевание представляет собой любое заболевание, выбранное из группы, состоящей из пищевой аллергии, атопического дерматита, астмы, аллергического ринита, аллергического конъюнктивита, аллергического дерматита, хронической идиопатической крапивницы и аллергического контактного дерматита.

11. Диетическая функциональная пищевая композиция для смягчения или облегчения симптома аллергии, содержащая

композицию по п.1.

12. Набор для лечения или предупреждения аллергического заболевания, содержащий

первую композицию, которая содержит пробиотики, и

вторую композицию, которая содержит полипептид, обладающий способностью связываться с IgE,

где полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, представляет собой полипептидный димер, содержащий два мономера, каждый из которых содержит внеклеточный домен (FcεRIαECD) альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE,

мономер содержит нативную или модифицированную Fc-область и

Fc-область и FcεRIαECD связаны через линкер.

13. Набор по п.12,

где вторая композиция представляет собой композицию для подкожного или внутривенного введения.

14. Способ лечения или предупреждения аллергического заболевания, включающий

стадию введения пробиотиков и

стадию введения полипептида, обладающего способностью связываться с IgE,

где полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, представляет собой полипептидный димер, содержащий два мономера, каждый из которых содержит внеклеточный домен (FcεRIαECD) альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE,

мономер содержит нативную или модифицированную Fc-область и

Fc-область и FcεRIαECD связаны через линкер.