ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка основана на предшествующей японской патентной заявке №2017-157384, поданной 17 августа 2017 года полное содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки, и утверждает ее приоритет.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область техники
Настоящее изобретение относится к способу детекции нетипичного растения (хромосомная анеуплоидия) Brassica oleracea. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу, который способен молекулярно-биологическим путем точно и быстро классифицировать и выявлять индивидуумов, демонстрирующих различную нарушенную морфологию, связанную с анеуплоидией, у Brassica oleracea (далее в настоящем документе, может быть сокращено как «B. oleracea»), на любой стадии роста.
Предшествующий уровень техники
Растения Brassicaceae представляют собой виды растений, которые возникли на Ближнем Востоке и на побережье Средиземного моря. Это семейство включает растения рода Brassica, исключительно важные сельскохозяйственные культуры. Вид растений Brassica oleracea очень важен и в качестве неограничивающих примеров включает B. oleracea var. capitata (капусту), B. oleracea var. italica (брокколи), B. oleracea var. botrytis (цветную капусту), B. oleracea var. gemmifera (брюссельскую капусту), B. oleracea var. gongyloides (кольраби), B. oleracea var. acephara (декоративную капусту, браунколь), и B. oleracea var. albograbra (китайскую капусту).
В культурах Brassica oleracea коммерческое разведение чаще всего направлено на гибридные растения (F1) первого поколения, использующие свойства самонесовместимости (SI) или цитоплазматической мужской стерильности (CMS). По сравнению с нативными сортами или OP (с открытым опылением), сорта F1 демонстрируют отличную способность адаптации к окружающей среде и высокую однородность. Таким образом, эти сорта имеют высокую коммерческую ценность и используются во многих странах.
Было опубликовано, что индивидуумы, демонстрирующие морфологию, отличную от обычной морфологии, появляются с определенной частотой, даже если они являются F1-сортами, наследующими родительские гены (см. статью V. Ruffio-Chable et al., ISHS Acta Horticulturae 539 (2000) p 89. Developmentally «Aberrant» plants in F1 hybrids of Brassica oleracea (Непатентный документ 1)). Как правило, такие нетипичные индивидуумы имеют чрезвычайно низкую стоимость, как сельскохозяйственные продукты, и обычно не могут быть отправлены в виде свежих продуктов. Если большое количество индивидуумов, проявляющих нетипичный фенотип, включает определенные семена или сорта, это может привести к большой коммерческой проблеме. Таким образом, семеноводческим компаниям, возможно, придется отказаться от таких семян.
Причина появления таких нетипичных видов долгое время не была известна, но ученые предположили, что были воздействия окружающей среды во время производства семян или при выращивании культуры или были влияния, такие как мутация или эпигенетические изменения.
Вышеуказанная проблема нетипичных растений также очень мешает функции контроля качества сельскохозяйственных предприятий по производству семян. Семеноводческие компании, которые производят и продают гибридные семена F1, проводят тестирование с использованием полиморфных ДНК-маркеров или изозимов для проверки сортовой чистоты семян перед коммерциализацией указанных продуктов. Однако эти нетипичные индивидуумы имеют тот же генотип F1, что и сорт, и не могут быть обнаружены такими лабораторными исследованиями. По этой причине в течение уже длительного времени крайне необходима разработка способа быстрого тестирования для нетипичных растений.
Кроме того, в селекционных исследованиях необходимо улучшить сортовые характеристики, чтобы такие нетипичные индивидуумы встречались не часто. Однако трудно идентифицировать нетипичные растения по их появлению на стадии рассады. По этой причине, чтобы точно подсчитать частоту появления нетипичных растений, необходимо было выращивать растения в больших масштабах в поле и иметь характеристики индивидуумов, тщательно оцененные опытным селекционером. Тем не менее, такой тест имеет тенденцию к субъективности, и существует опасение, что результат может варьироваться в зависимости от человека, который выполняет оценку. Кроме того, даже квалифицированному селекционеру сложно сделать точное суждение, и результаты могут отличаться в зависимости от стадии роста и среды выращивания. В свете этого, компании по производству семян давно хотели получить простой тестовый способ для саженцев.
Например, статья V. Chable et al., Euphytica 170 (2009) p275, «Aberrant» plants in cauliflower: 2. Aneuploidy и global DNA methylation (Непатентный документ 2) утверждает возможность того, что аномальная морфология, появляющаяся у сорта цветной капусты F1, происходит от анеуплоидии. В нескольких экспериментальных исследованиях сообщалось об использовании проточного цитометра в качестве общего способа выявления анеуплоидии.
Тем не менее, нелегко точно определить разницу в одной хромосоме в способе с использованием проточного цитометра, и даже если эндогенный контроль добавляют в образец, может быть трудно принять решение, как показано в данных, описанных в статье N. Roux et al., Plant cell Report 21 (2003) p483, Rapid detection of aneuploidy in Musa using fluid cytometry (Непатентный документ 3). Существует также разница в размере хромосом, и соотношение геномов самой большой хромосомы и самой маленькой хромосомы может достигать почти 2:1. В случае, когда добавляется сравнительно небольшая хромосома, трудно судить, потому что разница между пиками нормальных индивидуумов и анеуплоидов чрезвычайно мала, а чувствительность обнаружения оказывает большое влияние на точность результатов.
По этой причине способ, который использует проточный цитометр, создает проблемы, такие как невозможность выполнить крупномасштабный тест в обычной лаборатории.
Кроме того, в способе с использованием проточного цитометра, даже если собрана высоконадежная экспериментальная система, в случае растений, которые имеют анеуплоидию во множестве хромосом. Например, в случае анеуплоида, в котором сочетаются трисомия по хромосоме 1 и моносомия по хромосоме 2, и, таким образом, 18 хромосом содержатся в ядре, его определяют как нормального индивидуума.
Кроме того, трудно определить, какая хромосома вызвала анеуплоидию в простом тесте с использованием проточного цитометра. В зависимости от хромосомы с трисомией существуют также виды, в которых можно собирать свежие продукты без проблем с качеством; хотя зрелость растения несколько меняется. Например, в случае трисомии хромосом 2 и 7 у брокколи и трисомии хромосом 1, 2 и 7 у цветной капусты, таким образом, в некоторых случаях наличие анеуплоида не сразу связано с уменьшением товарной стоимости. По этой причине важно уметь различать тип трисомии индивидуально в поле. С точки зрения развития селекции, тот факт, что любая хромосома имеет тенденцию к трисомии, предоставляет важную информацию. В связи с этим возникла потребность в разработке простого способа тестирования, который может анализировать подробную анеуплоидию для каждой хромосомы.
До настоящего времени сообщали о способах различения генотипов у растений при помощи ПЦР с использованием ДНК-маркеров. Например, JP 3836451 B2 (Патентный документ 1) раскрывает способ определения генотипа, участвующего в производстве острых ингредиентов растений Capsicum. Однако, насколько известно авторам настоящего изобретения, до настоящего времени не сообщалось о способе тестирования нетипичных растений Brassicaceae.
[Список по известному уровню техники]
Патентный документ
Патентный документ 1: японская патентная публикация №. 3836451 (JP 3836451 B2)
Непатентный документ
Непатентный документ 1: V. Ruffio-Chable et al., ISHS Acta Horticulturae 539 (2000) p89, Developmentally «Aberrant» plants in F1 hybrids of Brassica oleracea.
Непатентный документ 2: V. Chable et al., Euphytica 170 (2009) p275, «Aberrant» plants in cauliflower: 2. Aneuploidy и global DNA methylation.
Непатентный документ 3: N. Roux et al., Plant cell Report 21 (2003) p483, Rapid detection of aneuploidy in Musa using fluid cytometry.
Непатентный документ 4: I. Parkin et al., Genetics 171 (2005) p765, Segmental structure of the Brassica napus genome based on comparative analysis with Arabidopsis thaliana.
Непатентный документ 5: X. Cheng et al., Theoretical Applied Genetics 118 (2009) p1121, Development and genetic mapping of microsatellite markers from genom survey sequences in Brassica napus.
[СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ]
Задачи, подлежащие решению посредством изобретения
Целью настоящего изобретения является создание способа для точного и быстрого обнаружения нетипичного растения (хромосомного анеуплоида), которое может появиться у вида Brassica oleracea, для решения описанной выше проблемы, влияющей на ход контроля качества семян и селекционных исследований. Кроме того, способ можно проводить в лаборатории, оборудованной для общих молекулярно-биологических способов.
Способы решения проблемы
В результате обширных исследований, проведенных с целью удовлетворения требований ученых по контролю качества семян и селекции, авторам настоящего изобретения удалось точно и быстро идентифицировать анеуплоиды всех хромосом у видов Brassica oleracea с использованием ПЦР в реальном времени. Этот способ легко выполнять в лаборатории, оборудованной для ПЦР в реальном времени, и с его помощью стало возможным просто обнаруживать нетипичные растения. Кроме того, этот способ способен точно и быстро классифицировать и обнаруживать индивидуумов, проявляющих различные аномальные морфологии, вызванные анеуплоидией, на любой стадии роста с использованием молекулярно-биологического способа.
Таким образом, по настоящему изобретению, предлагаются следующие изобретения:
<1> Способ детекции анеуплоида растения Brassica oleracea, включающий:
проведение ПЦР в реальном времени с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из образца, полученного из растения Brassica oleracea для тестирования, и маркеров ДНК, специфичных для каждой из двух или более хромосом растения Brassica oleracea; и выявление хромосомной анеуплоидии по относительной разнице между значениями амплификации, полученными с помощью ДНК-маркеров.
<2> Способ, в соответствии с <1>, включающий определение того, является ли тестируемое растение анеуплоидом по хромосоме из всех хромосом, с использованием ДНК-маркеров, специфичных для каждой из хромосом с 1 по 9 растения Brassica oleracea.
<3> Способ, в соответствии с <1> или <2>, где в способе в качестве ДНК-маркера используют праймер, который специфичен только для одной из хромосомных ДНК растения Brassica oleracea и может производить продукт амплификации в реакции ПЦР, когда присутствует хромосомная ДНК.
<4> Способ, в соответствии с любым из с <1> по <3>, где в способе в качестве ДНК-маркеров используют (i) праймер, который специфичен только для одной из хромосомных ДНК растения Brassica oleracea и может производить продукт амплификации в реакции ПЦР, когда присутствует хромосомная ДНК; и (ii) зонд, который специфичен для хромосомной ДНК, идентичной любой из хромосомных ДНК, описанных в (i), и может выявлять продукт амплификации, полученный путем реакции ПЦР на основе праймера, описанного в (i).
<5> Способ, в соответствии с <3> или <4>, где в способе используют интеркалятор, который связывается с двухцепочечной ДНК, синтезируемой путем реакции ПЦР, и испускает флуоресценцию, или используют зонд, модифицированный флуоресцентным красителем, чтобы излучать флуоресценцию при реакции элонгации ПЦР.
<6> Способ, в соответствии с любым одним с <1> по <5>, где в способе используют увеличение флуоресцентного сигнала, полученного путем ПЦР в реальном времени, в качестве показателя для выявления анеуплоидной хромосомы.
<7> Способ, в соответствии с любым одним с <1> по <6>, где в способе используют в качестве ДНК-маркера один или несколько праймеров с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: с 1 до 18.
<8> Способ, в соответствии с любым одним с <1> по <7>, где в способе используют в качестве ДНК-маркера один или несколько праймеров с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: с 1 до 18 и один или несколько зондов с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: с 19 до 27.
<9> Набор праймеров для выявления анеуплоидного растения Brassica oleracea, включающий, по меньшей мере, один или несколько праймеров с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: с 1 до 18.
<10> Набор праймеров и зондов для выявления анеуплоидного растения Brassica oleracea, включающий, по меньшей мере, один или несколько праймеров с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: с 1 до 18; и, по меньшей мере, один или несколько зондов, модифицированных флуоресцентным красителем, с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: с 19 до 27.
<11> Способ селекции культуры Brassica oleracea, включающий оценку частоты встречаемости анеуплоидов хромосом для каждой генетической линии растения Brassica oleracea с использованием способа по любому из <1>-<8>, чтобы выбрать линию с низким уровнем встречаемости анеуплоидов.
<12> Способ контроля качества семян Brassica oleracea, включающий тестирование для определения степени загрязнения анеуплоидами, содержащимися в семенах партии семян Brassica oleracea, с использованием способа по любому из <1>-<8>
<13> Способ контроля качества растений Brassica oleracea, включающий тестирование для определения степени загрязнения анеуплоидами, содержащимися в растениях Brassica oleracea, с использованием способа по любому из <1>-<8>.
Эффекты изобретения
В соответствии со способом тестирования по настоящему изобретению становится возможным просто и точно оценить частоту появления нетипичных растений и будущую морфологию каждого из обнаруженных анеуплоидов, что позволяет проверить чистоту сорта коммерческих партий семян и частоту встречаемости нетипичных растений у селекционных линий. В результате становится возможным эффективно, быстро и в кратчайшие сроки обеспечивать способы для стабильной поставки высококачественных коммерческих семян и селекционных линий с хорошими характеристиками.
[КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ]
ФИГ. 1 показывает фенотипы анеуплоидов из растений брокколи, где на фигуре (A) представлен нормальный индивидуум (Нормальный), (B) представлена трисомия по хромосоме 1 (+C1), (C) представлена трисомия по хромосоме 2 (+C2), (D) представлена трисомия по хромосоме 3 (+C3), (E) представлена трисомия по хромосоме 4 (+C4), (F) представлена трисомия по хромосоме 5 (+C5), (G) представлена трисомия по хромосоме 6 (+C6), (H) представлена трисомия по хромосоме 7 (+C7), (I) представлена трисомия по хромосоме 8 (+C8), и (J) представлена трисомия по хромосоме 9 (+C9).
ФИГ. 2 показывает изображение амплификационной кривой при проведении количественного анализа путем ПЦР в реальном времени, где фигура основана на примере трисомии по хромосоме 6, и где количество ДНК в качестве матрицы, добавляемое в раствор для реакции ПЦР, является неизменным. Например, в случае трисомии по хромосоме 6 (Трисомия), амплификационная кривая маркера, расположенного на хромосоме 6, поднимается быстрее, чем у нормального индивидуума (Нормальный).
ФИГ. 3 показывает пример выявления анеуплоида, а именно, пример результата, рассчитанного из относительной разницы между амплификационными значениями, полученными с помощью ДНК-маркеров при выполнении ПЦР в реальном времени. Девяносто шесть индивидуумов, полученных из поколения F1 сорта брокколи, используемого в качестве материалов, тестировали с помощью мультиплексной ПЦР с использованием маркера на хромосоме 4 и маркера на хромосоме 6. Маркер на хромосоме 6 показывает относительные различия между значениями амплификации с хромосомой 4 в качестве стандарта, и, как следствие, могут быть идентифицированы трисомия по хромосоме 6 и трисомия по хромосоме 4.
ФИГ. 4 показывает микрофотографии хромосом, наблюдаемых в материнских клетках пыльцы трисомных растений. С использованием микроскопического наблюдения за клетками в первичной метафазе мейоза материнских клеток пыльцы, в случае нормальной хромосомы наблюдали девять двухвалентных хромосом (2n=18). В то время как на хромосомном уровне у трисомного растения наблюдали девять двухвалентных хромосом и одну дополнительную хромосому (обозначены стрелкой) (2n+1).
ФИГ. 5 показывает фенотипы анеуплоидов из растений цветной капусты, где на фигуре (A) представлен нормальный индивидуум (Нормальный), (B) представлена трисомия по хромосоме 1 (+C1), (C) представлена трисомия по хромосоме 2 (+C2), (D) представлена трисомия по хромосоме 4 (+C4), (E) представлена трисомия по хромосоме 6 (+C6), (F) представлена трисомия по хромосоме 7 (+C7), и на (G) представлена трисомия по хромосоме 9 (+C9).
ФИГ. 6 показывает фенотипы анеуплоидов из растений капусты, где на фигуре (A) представлен нормальный индивидуум (Нормальный), (B) представлена трисомия по хромосоме 1 (+C1), (C) представлена трисомия по хромосоме 2 (+C2), (D) представлена трисомия по хромосоме 4 (+C4), (E) представлена трисомия по хромосоме 5 (+C5), (F) представлена трисомия по хромосоме 6 (+C6), (G) представлена трисомия по хромосоме 7 (+C7), (H) представлена трисомия по хромосоме 8 (+C8), (I) представлена трисомия по хромосоме 9 (+C9), и на (J) представлен индивидуум с анеуплоидией по хромосоме 1 и хромосома 2 (+C1, +C2), на (K) представлен индивидуум с анеуплоидией по хромосоме 1 и хромосома 8 (+C1, +C8), и на (L) представлен индивидуум с анеуплоидией по хромосоме 5 и хромосома 8 (+C5, +C8).
ФИГ. 7 показывает фенотипические характеристики анеуплоидов, полученных из растений брокколи, цветной капусты и капусты. Эти характеристики относятся только к некоторым из фенотипических характеристик, наблюдаемых в исследовании для этого примера, и не обязательно можно обобщать и характеризовать отличительные признаки для соответствующих видов растений и анеуплоидов.
[ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ]
Далее в настоящем документе, настоящее изобретение будет описано подробно.
Как описано выше, настоящее изобретение относится к способу обнаружения анеуплоида растения Brassica oleracea, включая проведение ПЦР в реальном времени с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из образца, полученного из тестируемого растения Brassica oleracea, и маркеров ДНК, специфичных для каждой из двух или более хромосом растения Brassica oleracea; и выявление хромосомной анеуплоидии по относительной разнице между значениями амплификации, полученными с помощью ДНК-маркеров. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения число хромосом, используемых для способа детекции, составляет 3 или более, 4 или более, 5 или более, 6 или более, 7 или более, и 8 или более являются более предпочтительными в этом порядке. Наиболее предпочтительно использовать маркеры для всех девяти хромосом.
Таким образом, способ по настоящему изобретению предпочтительно включает: определение того, является ли тестируемое растение анеуплоидом по хромосоме, с использованием ДНК-маркеров, специфичных для каждой из хромосом с 1 по 9 растения Brassica oleracea.
В настоящем изобретении растение Brassica oleracea означает растение видов Brassica oleracea рода Brassica, которые в качестве неограничивающих примеров включают B. oleracea var. capitata (капусту), B. oleracea var. italica (брокколи), B. oleracea var. botrytis (цветную капусту), B. oleracea var. gemmifera (брюссельскую капусту), B. oleracea var. gongyloides (кольраби), B. oleracea var. acephara (декоративную капусту, браунколь), B. oleracea var. albograbra (китайскую капусту). В настоящем изобретении растение Brassica oleracea представляет собой брокколи, цветную капусту или капусту.
Термин «анеуплоид» или «нетипичный», применяемый в настоящем документе, означает индивидуума с нарушением числа хромосом (анеуплоидия). В этом случае имеется аномалия в количестве хромосом, обнаруженных в растении Brassica oleracea. Количество хромосом в нормальном растении Brassica oleracea составляет восемнадцать (2n=18), таким образом, в результате получается девять пар хромосом в одной клетке. Например, в случае анеуплоида, в частности анеуплоидного растения с трисомией по хромосоме 1, число хромосом 1 увеличивается с двух до трех; это указывает на то, что уровень плоидности хромосомы 1 является нарушенным. Хотя некоторые анеуплоидные индивидуумы могут быть приемлемы в качестве сельскохозяйственной продукции или свежих продуктов в зависимости от вида растений и условий роста, чаще всего нетипичные индивидуумы низко ценятсяв качестве сельскохозяйственная продукция и во многих случаях может не продаваться как свежая продукция. По этой причине важно уметь быстро и просто выявлять анеуплоиды.
В способе детекции анеуплоида по настоящему изобретению отбирают образец тестируемого растения Brassica oleracea, выделяют ДНК из образца, полученного из тестируемого растения Brassica oleracea, и используют ДНК в качестве матрицы для ПЦР.
Что касается способа выделения ДНК, то любой способ, известный специалисту в данной области, можно использовать для выделения нуклеиновой кислоты. В настоящем изобретении выделенную неочищенную ДНК можно использовать в качестве шаблона для ПЦР. Например, для экстракции ДНК можно использовать фенол/хлороформный способ, способ лизиса клеток с детергентом, способ лизиса клеток с протеазным ферментом, способ физического разрушения стеклянными шариками, способ обработки, включающий повторное замораживание/оттаивание и их сочетание. Также можно использовать различные наборы для экстракции ДНК, продаваемые производителями реагентов, такие как набор QIAGEN Plant mini (производства QIAGEN GmbH). ДНК, выделенная этими способами, предпочтительно находится в состоянии, подходящем для использования в качестве матрицы для ПЦР. Например, ДНК предпочтительно хранят при низкой температуре после растворения в соответствующем буферном растворе. Чистота полученной ДНК может быть проверена путем измерения оптической плотности при 230, 260 и 280 нм с использованием спектрофотометра. При проведении ПЦР предпочтительно, чтобы отношение оптической плотности при 260/230 нм составляло 2,0 или более, а отношение оптической плотности при 260/280 нм составляло от 1,8 до 2,0. Что касается полученного раствора ДНК, то можно подтвердить, что амплификация происходит с помощью ПЦР с использованием пары праймеров для эндогенного гена, общего для растений.
В способе детекции по настоящему изобретению ПЦР в реальном времени проводят с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из образца, полученного из тестируемого растения Brassica oleracea, и маркера ДНК, способного амплифицировать часть каждой хромосомы растения Brassica oleracea. В частности, ПЦР в реальном времени проводят с использованием в качестве маркера ДНК двух или более маркеров ДНК, специфичных для каждой из двух или более хромосом растения Brassica oleracea. Более конкретно, ПЦР в реальном времени проводят с использованием в качестве маркера ДНК двух или более маркеров ДНК, специфичных для каждой из двух или более хромосом из хромосом с 1 по 9 растения Brassica oleracea.
Маркер ДНК, используемый в данном документе, конкретно не ограничен при условии, что это маркер ДНК, расположенный на любой из хромосом растения Brassica oleracea, который присутствует в виде единственной копии в геноме, и на него не влияют другие последовательности, присутствующие на разных хромосомах. В настоящем изобретении применяют такой маркер, тем самым позволяя обнаруживать относительную разницу между значениями амплификации, полученными при помощи маркеров ДНК путем ПЦР в реальном времени, и тестировать анеуплоиды различных культур Brassica oleracea.
Таким образом, предпочтительно, чтобы маркер представлял собой пару праймеров, которые специфичны только для одной из хромосомных ДНК растения Brassica oleracea и могут производить продукт амплификации путем реакции ПЦР, когда присутствует хромосомная ДНК. Здесь термин «специфичный только для одной хромосомной ДНК растения Brassica oleracea» означает, что праймер специфичен только для одной из девяти пар хромосом, но не специфичен для других хромосом. Когда присутствует хромосомная ДНК, специфичная только для одной из девяти пар хромосом, праймер может амплифицировать целевой продукт посредством реакции ПЦР. Например, используемый маркер ДНК может включать праймер, который специфичен только для ДНК хромосомы 1 и может производить продукт амплификации путем реакции ПЦР, когда присутствует ДНК хромосомы 1.
Что касается дизайна используемого праймера, специалист в данной области может соответствующим образом подготовить праймер, предназначенный для использования только с одной из хромосомных ДНК растения Brassica oleracea, чтобы он мог производить продукт амплификации путем реакции ПЦР, когда присутствует хромосомная ДНК. В частности, специалист в данной области может соответствующим образом подготовить желаемый праймер, обратившись к описанию примера 1, описанному ниже.
В настоящем изобретении, возможно тестировать анеуплоид, проводя ПЦР в реальном времени с использованием праймера, имеющего вышеуказанные свойства, и способ с интеркалятором можно использовать в качестве одного из предпочтительных вариантов осуществления. В способе с интеркалятором интеркалятор, который был добавлен к раствору реакции ПЦР, связывается с двухцепочечной ДНК, синтезируемой реакцией ПЦР, и интеркалятор испускает флуоресценцию. Таким образом, реакция элонгации при помощи праймера происходит для амплификации продукта, тем самым приводя к флуоресценции. Эту флуоресценцию детектируют, что позволяет измерить относительную разницу между значениями амплификации, полученными с помощью маркеров ДНК.
Например, в качестве интеркалятора можно использовать SYBR Green I.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления способа с интеркалятором, (i) пару праймеров, которая специфична только для одной из хромосомной ДНК растения Brassica oleracea, и может амплифицировать продукт посредством реакции ПЦР, когда присутствует хромосомная ДНК, и (ii) интеркалятор добавляют к раствору реакции ПЦР; сигнал флуоресценции, испускаемый на стадии реакции элонгации в ПЦР, измеряют для каждого цикла, и рассчитывают значения амплификации, полученные с помощью маркеров ДНК. Таким образом, можно измерить относительную разницу между значениями амплификации, полученными с помощью маркеров ДНК.
Другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ с зондом с использованием зонда, способного обнаруживать продукт амплификации, генерируемый реакцией ПЦР на основе праймера, имеющего вышеуказанные свойства. Используемый зонд конкретно не ограничен при условии, что зонд может обнаружить целевой продукт амплификации, и предпочтительно использовать меченый зонд, который модифицирован флуоресцентным красителем так, чтобы флуоресценция испускалась при реакции элонгации в ПЦР. Способ для вычисления относительной разницы между значениями амплификации, полученными с помощью ДНК-маркеров, проводят путем измерения флуоресценции, испускаемой во время реакции элонгации в ПЦР, посредством чего способ можно проводить по тому же принципу, что и способ с интеркалятором. Кроме того, способ с зондом по сравнению со способом с интеркалятором может снизить риск обнаружения неспецифических продуктов ПЦР.
Согласно конкретному варианту осуществления способа с зондом, используют (i) пару праймеров, которая специфична только для одной из хромосомных ДНК растения Brassica oleracea, и может амплифицировать продукт посредством реакции ПЦР, когда присутствует хромосомная ДНК; и (ii) зонд, который специфичен для хромосомной ДНК, идентичной любой из хромосомной ДНК, описанных в (i), и может обнаружить продукт амплификации при реакции ПЦР на основе праймеров, описанных в (i); сигнал флуоресценции, излучаемой на этапе реакции элонгации при ПЦР измеряют для каждого цикла, и рассчитывают значения амплификации, полученные при помощи маркеров ДНК. Таким образом, можно измерить относительную разницу между значениями амплификации, полученными с помощью маркеров ДНК.
Что касается флуоресцентно-меченного зонда, то предпочтительным является зонд TaqMan, дважды меченный флуоресцентным веществом и гасителем. В зонде TaqMan 5‘-конец нуклеиновой кислоты зонда, как правило, модифицирован флуоресцентным веществом (репортерный флуоресцентный краситель), а 3‘-конец, как правило, модифицирован гасящим веществом (гасящий флуоресцентный краситель). Примеры репортерного флуоресцентного красителя включают: флуоресцентные красители на основе флуоресцеина, такие как Cy3, Cy5, 6-карбоксифлуоресцеин (6-FAM), 6-карбокси-4,7,2',7'-тетрахлорфлуоресцеин (TET), и 6-карбокси-2',4',7',4,7-гексахлорфлуоресцеин (HEX). Что касается гасящего флуоресцентного красителя, то можно использовать флуоресцентный краситель на основе родамина, такой как 6-карбокситетраметилродамин (TAMRA) или 6-карбокси-X-родмин (ROX). В случае проведения мультиплексной ПЦР предпочтительно выбирать темный гаситель, такой как BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 или Eclipse. В настоящем изобретении можно использовать, например, гидролизный зонд, меченный тремя типами флуоресцентных красителей, такими как FAM, HEX и Cy5 на 5'-конце и двумя типами гасителей, такими как BHQ-1 и BHQ-3 на 3'-конце.
Таким образом, в способе детекции по настоящему изобретению предпочтительно использовать интеркалятор, который связывается с двухцепочечной ДНК, синтезируемой путем реакции ПЦР, и испускает флуоресценцию, или использовать зонд, модифицированный флуоресцентным красителем, чтобы испускать флуоресценцию во время реакции элонгации в ПЦР.
В случае использования зонда, модифицированного флуоресцентным красителем, мультиплексную ПЦР можно проводить с использованием зондов, меченных разными типами флуоресцентных красителей, смешивая их с несколькими типами маркеров. Аналогично описанному выше способу, касающемуся каждого из тестируемых индивидуальных образцов и каждого из маркеров, можно измерить относительную разницу между значениями амплификации, полученными при помощи маркеров ДНК, на основе флуоресцентных сигналов, излучаемых флуоресцентными зондами. В этом способе, в случае мультиплексной ПЦР, можно рассчитать относительную разницу между значениями амплификации, полученными при помощи маркеров ДНК в том же реакционном растворе, что и эндогенный контроль, и уменьшение экспериментальных ошибок приведет к повышению достоверности результата.
Таким образом, в соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, мультиплексную ПЦР проводят при помощи способа с зондом.
Таким образом, согласно одному из предпочтительных вариантов настоящего изобретения, увеличение флуоресцентного сигнала, получаемого при ПЦР в реальном времени, используют в качестве показателя для обнаружения анеуплоида хромосомы в способе детекции по настоящему изобретению.
Олигонуклеотид, предназначенный для использования в качестве праймера или зонда, может быть синтезирован способом, известным в данной области как способ синтеза олигонуклеотидов, таким как фосфотриэтиловый способ или фосфодиэфирный способ, с использованием обычного автоматического синтезатора ДНК.
Согласно более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, используемый маркер ДНК может представлять собой один или несколько праймеров с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: от 1 до 18, и более предпочтительно, можно использовать один или несколько праймеров, описанных в таблице 1 ниже. Согласно другому более предпочтительному варианту настоящего изобретения можно использовать один или несколько праймеров с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: от 1 до 18, и один или несколько зондов с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: от 19 до 27. Более предпочтительно, можно использовать один или несколько праймеров, описанных в таблице 1, и один или несколько зондов, описанных в таблице 2. Эти маркеры являются маркерами, соответствующими хромосомам с 1 до 9.
В настоящем документе маркер ДНК «имеющий» нуклеотидную последовательность означает, что маркер имеет нуклеотидную последовательность. В настоящем изобретении, маркер ДНК специфичен для ДНК предопределенной хромосомы, как описано выше. Таким образом, при условии, что маркер ДНК обладает свойствами маркера, одно или несколько (например, одно, два или три, одно или два, и более одного) из оснований в нуклеотидной последовательности, соответствующей ДНК, могут быть замещены, делетированы, добавлены или удалены, или маркер ДНК может быть последовательностью, которая содержит нуклеотидную последовательность, частично соответствующую ДНК, и сохраняющую предопределенные свойства. В таком случае термин «имеющий» можно перефразировать как «включающий». Кроме того, в случае, когда допускается замена, делеция, добавление или удаление одного основания, термин «имеющий» можно перефразировать как «по существу состоящий из».
Согласно другому более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, используемый маркер ДНК может представлять собой одну или несколько пар праймеров с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: от 1 до 18, и более предпочтительно, может быть одной или несколькими парами праймеров, описанных в таблице 1 ниже. Согласно другому более предпочтительному варианту настоящего изобретения можно использовать одну или несколько праймеров с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: от 1 до 18, и зонд с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: от 19 до 27, соответствующими парам праймеров. Более предпочтительно, можно использовать одну или несколько пар праймеров, описанных в таблице 1, и один или несколько зондов, описанных в таблице 2.
Согласно еще более предпочтительному варианту настоящего изобретения, более точный и воспроизводимый тест можно проводить с использованием маркеров ДНК, разделенных на следующие три набора:
маркер хромосомы 6, маркер хромосомы 4 и маркер хромосомы 2;
маркер хромосомы 9, маркер хромосомы 3, маркер хромосомы 8; и
маркер хромосомы 1, маркер хромосомы 5 и маркер хромосомы 7.
В настоящем изобретении, в дополнение к использованию вышеуказанных пар праймеров и зондов можно проводить ПЦР в реальном времени. Например, способ может быть основан на обычных способах, описанных в Real-Time PCR Experiment Guide in Experimental Medicine, Supplement Edition, (YODOSHA CO., LTD), Saiki RK, et al., Science, 230: 1350-1354 (1985), и Plant PCR Experimental Protocol in Plant Cell Engineering, Supplement Edition, supervised by Ko Shimamoto and Takuji Sasaki (1995), и его можно проводить с использованием коммерчески доступного набора для ПЦР в реальном времени или прибора для ПЦР в реальном времени в соответствии с прилагаемыми инструкциями.
В качестве прибора для ПЦР в реальном времени можно использовать, например, LightCycler 480 System II (производится Roche) или аналогичное оборудование. В настоящее время можно использовать в качестве реакционного реагента, например, «Premix Ex Taq (Perfect Real Time)» (производства Takara Bio Inc.) или аналогичные реагенты, но использование конкретно не ограничено материалами, упомянутыми выше.
Сначала проводят ПЦР, используя в качестве матрицы образец ДНК, полученный вышеуказанным способом, и используя предопределенный праймер или пара праймеров по настоящему изобретению. Амплификация путем ПЦР конкретно не ограничена, за исключением того, что используют вышеуказанные праймеры или пару праймеров, и амплификацию путем ПЦР можно проводить в соответствии с обычным способом. Что касается условий ПЦР (таких как температура и время для каждого из этапов денатурации, отжига и элонгации и количества циклов) и состава раствора для реакции ПЦР (например, количество матричной ДНК, тип буферного раствора, концентрация праймера, тип и концентрация ДНК-полимеразы, концентрация dNTP и концентрация хлорида магния), специалист в данной области может, соответствующим образом, на основании предварительных экспериментов или т.п. выбрать и установить условия, при которых продукты амплификации путем ПЦР можно получать с желаемой высокой чувствительностью с помощью ПЦР с использованием описанного выше праймера или пары праймеров. Кроме того, мастер-микс для ПЦР в реальном времени, в котором ДНК-полимераза, концентрация dNTP и концентрация хлорида магния приблизительно оптимизированы, является коммерчески доступным, поэтому его можно использовать при необходимости.
Как описано выше, количество хромосом Brassica oleacea составляет восемнадцать (2n=18), поэтому в случае нормального растения в каждой клетке имеется девять пар хромосом. Например, в случае анеуплоидного растения с трисомией по хромосоме 1 число хромосом 1 увеличивается с двух до трех копий. Когда проводят ПЦР в реальном времени с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из этих растений, и маркеров ДНК, описанных в таблице 1 или в таблицах 1 и 2, в случае точной стандартизации количества ДНК, добавляемого в реакционный раствор, при трисомии по хромосоме 1, кривая амплификации маркера, расположенного на хромосоме 1, растет в ранних циклах по сравнению с нормальным индивидуумом. То есть, задают нижнее пороговое значение цикла (также сокращенно «значение Ct», то есть точку пересечения кривой амплификации маркера, полученной по интенсивности флуоресценции и пороговой линии, установленной с помощью определенного стандарта).
В качестве конкретного примера, как показано на ФИГ. 2, когда количество ДНК, добавляемой к реакционному раствору ПЦР в качестве матрицы, является постоянным, например, в случае трисомии по хромосоме 6 (Трисомия), кривая амплификации маркера, расположенного на хромосоме 6, растет быстрее, чем у нормального индивидуума (Нормальный).
Однако трудно точно стандартизировать количество ДНК в большом количестве образцов в реальном месте испытаний. Таким образом, вместо стандартизации количества ДНК амплификация маркеров хромосом подвергается относительной количественной оценке, посредством чего количество каждой из хромосом можно оценить по относительной разнице между значениями амплификации, полученными для каждого из маркеров ДНК, и можно определить анеуплоидию, такую как трисомия.
Чтобы широко применять этот способ для видов Brassica oleracea, необходимо разработать праймеры для ПЦР в общей области для видов Brassica oleracea, в которых отсутствуют однонуклеотидные полиморфизмы (SNP). В результате интенсивных исследований, проведенных авторами настоящего изобретения, был достигнут успех в разработке маркеров ДНК, которые могут широко применяться для видов Brassica oleracea и с помощью которых можно проводить эффективный тест с использованием мультиплексной ПЦР. Это привело к изобретению способа детекции по настоящему изобретению.
Таким образом, в вышеописанном способе детекции по настоящему изобретению, проводят ПЦР в реальном времени с использованием хромосомо-специфического маркера ДНК, а хромосомную анеуплоидию определяют по относительной разнице между значениями амплификации, полученными с помощью маркеров ДНК.
Здесь, относительная разница между значениями амплификации, полученными с помощью маркеров ДНК, может быть подтверждена путем проведения ПЦР в реальном времени на маркерах ДНК, специфичных для каждой из двух или более хромосом тестируемого растения Brassica oleracea, и сравнения значений амплификации для каждого из хромосомных маркеров. Таким образом, когда оценивают относительное количество при амплификации множества хромосомных маркеров и присутствует аномалия в любой из хромосом, возникает очевидная разница между амплификацией маркера на анеуплоидной хромосоме и амплификацией маркеров на хромосомах с нормальным уровнем плоидности. В результате становится возможным обнаружить наличие анеуплоидов.
Значения амплификации, полученные с помощью маркеров ДНК, можно подтвердить с помощью кривой амплификации маркера. Кривая амплификации маркера может быть легко построена на основе интенсивности флуоресценции, измеренной по реакции ПЦР.
В случае выполнения измерения относительной разности между значениями амплификации, полученными с помощью маркеров ДНК, т.е. при проведении относительного количественного определения, предпочтительно использовать кривую амплификации, полученную по каждому маркеру. Например, точка пересечения между кривой амплификации и пороговой линией, установленной с определенным стандартом, определяется как пороговое значение цикла (значение Ct), и каждое значение Ct сравнивают с другим значением Ct другой хромосомы, тем самым оценивая число целевых хромосом. С точки зрения поиска более воспроизводимых оценок числа хромосом, значение Ct может быть заменено другим значением, рассчитанным способу второй производной, который дважды дифференцирует кривую амплификации, и принимает значение цикла в положении, показывающем максимальный балл.
В настоящем изобретении, что касается значения Ct, указанного для каждого из индивидуумов в тестируемом образце, и каждого из маркеров, выбирают значение, рассчитанное способом второй производной, как описано выше, а соотношение чисел копий между целевыми областями генома можно оценивать способом ΔΔCt на основе относительной разницы между значениями амплификации, полученными с помощью маркеров ДНК.
Другими словами, часть предпочтительного варианта осуществления способа детекции по настоящему изобретению может быть конкретно выражена в виде следующих способов (a) или (b):
(a) способ, включающий определение значения Ct для каждого из индивидуумов в тестируемом образце и каждого из маркеров по сигналу, излучаемому флуоресцентным красителем, таким как SYBR Green I; и оценка соотношения количества копий целевой геномной области на основе относительной разницы между значениями амплификации, полученными с помощью маркеров ДНК различными способами, например, способом ΔΔCt, где флуоресцентный краситель, такой образом, как SYBR Green I смешивают с раствором для реакции ПЦР, и хромосомные маркеры раздельно амплифицируют путем ПЦР; или
(b) способ, включающий определение значения Ct каждого из индивидуумов в тестируемом образце и каждого из маркеров по флуоресценции сигнала, испускаемого флуоресцентным зондом, и оценки соотношения количества копий целевой геномной области на основе относительной разницы между значениями амплификации, полученными с помощью маркеров ДНК различными способами, например, способом ΔΔCt, где мультиплексную ПЦР проводят с использованием зондов, помеченных различными типами флуоресцентных красителей, и смешивая несколько типов маркеров.
Хотя способ (а) можно проводить с относительно недорогим реагентом, отдельные тесты ПЦР проводят для каждой хромосомы. Таким образом, для каждого растения необходимы множественные тесты ПЦР. В способе (b) необходимо синтезировать флуоресцентный зонд, в то время как относительное различие между значениями амплификации, полученными маркерами ДНК, можно проводить с эндогенным контролем в качестве стандарта. Таким образом, количество тестов также может быть уменьшено.
Описанные выше праймеры, пары праймеров и зонды также можно получать в виде набора. Набор по настоящему изобретению может быть любым при условии, что набор включает описанный выше праймер или пару праймеров, или, по меньшей мере, праймер или пару праймеров и зонд. При необходимости набор может включать молекулу ДНК, содержащую целевую последовательность в качестве положительного контроля для ПЦР, реагент для выделения ДНК, буферный раствор для ПЦР, реагент для ПЦР, такой как ДНК-полимераза, маркирующее вещество для метки, и руководство.
Таким образом, еще по одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, предлагается набор праймеров для детекции анеуплоида растения Brassica oleracea, включающий, по меньшей мере, один или несколько типов праймеров с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: 1-18. Дополнительно, еще по одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения предлагается набор праймеров и зондов для детекции анеуплоида растения Brassica oleracea, в том числе, по меньшей мере, один или несколько праймеров, с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: с 1 до 18; и, по меньшей мере, один или несколько модифицированные зондов, модифицированных флуоресцентным красителем, с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: 19-27.
Способ детекции анеуплоида по настоящему изобретению используют для оценки частоты появления анеуплоидов хромосом для каждой линии растения Brassica oleracea. Используя этот способ, настоящее изобретение может обеспечить способ для скрещивания культуры Brassica oleracea, включая выбор линии с низкой частотой встречаемости анеуплоидов.
Способ детекции анеуплоида по настоящему изобретению используют так, чтобы можно было обеспечить способ контроля качества семян Brassica oleracea, включая тестирование степени загрязнения анеуплоидоами, содержащимися в семенах из партии семян Brassica oleracea.
Уровень анеуплоидов, содержащихся в семенах, оценивают тестом на прорастание. Такое тестирование требует масштабного поля и периода выращивания в несколько месяцев. Кроме того, было невозможно получить точные результаты, если только прорастание не оценивается квалифицированным экспертом. По способу контроля качества семян по настоящему изобретению, можно выполнить тест на содержание анеуплоидов компактным способом и получить быстрые и точные результаты.
Способ детекции анеуплоида по настоящему изобретению используют так, чтобы можно было обеспечить способ контроля качества растений Brassica oleracea, включая тестирование степени загрязнения анеуплоидами, содержащимися в партии семян Brassica oleracea.
Согласно способу контроля качества растения Brassica oleracea по настоящему изобретению также возможно тестировать в качестве материала недавно появившиеся семядоли из прорастающих семян. Дополнительно, если тест на анеуплоиды проводят до стадии посадки, можно отбирать и культивировать только нормальных индивидуумов. В результате обычную свежую продукцию можно собирать практически со всех растений.
[ПРИМЕРЫ]
Настоящее изобретение будет конкретно описано со ссылкой на следующие примеры, но настоящее изобретение не ограничено этими примерами. Например, тестируемый образец, из которого выделяют ДНК, может находиться на любой стадии роста. Можно использовать семена, семядоли, истинные листья, корни и любые ткани. Никаких специальных способов не требуется для выделения ДНК, при условии, что ДНК очищают до такой степени, что ПЦР можно проводить без проблем. В качестве флуоресцентного красителя, можно использовать любой флуоресцентный краситель при условии, что это краситель, в основном, используемый в способе ПЦР в реальном времени.
Как показано в следующих примерах, способ по настоящему изобретению является универсальным и позволяет обнаруживать анеуплоиды в разных культурах, таких как брокколи, цветная капуста и капуста, с использованием общего маркера. Кроме того, авторы настоящего изобретения подтвердили в дополнение к этим примерам, что этот способ можно проводить на большом количестве линий, и этот способ не ограничивается линией, используемой в следующих примерах.
Пример 1: Получение маркера
ПЦР проводили при помощи праймеров (10-меров) для случайно амплифицируемой полиморфной ДНК (RAPD), Operon Technologies, Inc., и праймеров для связанного с последовательностью амплифицируемого полиморфизма (SRAP), разработанных авторами настоящего изобретения, и ДНК от поколения F2 брокколи в качестве матрицы, и, таким образом, строили карту сцепления Brassica oleracea.
Затем, карту сцепления, построенную авторами настоящего изобретения, сравнивали со статьей: I. Parkin et al., Genetics 171 (2005) p. 765, Segmental structure of the Brassica napus genome based on comparative analysis with Arabidopsis thaliana, статьей: X. Cheng et al., Theoretical Applied Genetics 118 (2009) p. 1121, Development and genetic mapping of microsatellite markers from genome survey sequences in Brassica napus, и с публичной информацией, зарегистрированнйо в NCBI, и, таким образом, анализировали связи между маркерами, расположенными в группах сцепления и картах сцепления в публичном доступе.
Кроме того, было необходимо модифицировать маркеры на хромосомах, чтобы расширить использование и включить все виды Brassica oleracea, и, таким образом, были выбраны характерные линии из широких генетических ресурсов капусты, брокколи и цветной капусты. ДНК этих линий применяли в качестве матриц для идентификации областей без SNP, и праймеры затем были переработаны.
Эти маркеры применяли для проведения ПЦР с использованием девяти типов трисомных растений в качестве матриц (фиг. 1), в которых каждая из хромосом с 1 по 9, выявленная в процессе разработки маркера, стала трисомной. Было подтверждено, что не было никакой неспецифической амплификации от других хромосом, влияющих на определение, а затем каждый из маркеров рассматривали как маркер, специфичный для одной из хромосом.
Далее, для проведения более простого и стабильного мультиплексного метода флуоресценции были разработаны гидролизные зонды, меченные тремя типами флуоресцентных красителей, включая FAM, HEX и Cy5. Цель заключалась в разработке праймеров и зондов таким образом, чтобы, даже если три вида маркеров смешивали в реакционном растворе (т.е. даже если смешивали шесть видов праймеров и три вида зондов), маркеры не мешали зондам и могли быть получены воспроизводимые результаты. Как правило, когда проводят мультиплексную ПЦР, возникают сложные реакции, так как происходит образование димеров праймеров и отжиг другого праймера с амплифицированным фрагментом ДНК. Таким образом, трудно построить систему, которая бы стабильно обнаруживала разницу между двумя и тремя хромосомами (1,5-кратная разница) по отношению к неочищенной матричной ДНК. Однако авторы настоящего изобретения успешно разработали маркеры, показанные в таблицах 1 и 2, в результате многократного улучшения последовательности маркеров и интенсивных исследований.
Далее, для проведения более точного и стабильного теста маркеры, полученные из девяти хромосом, были разделены на три группы по три маркера в каждой (см. Пример 4, который будет описан ниже).
[Таблица 1] Список последовательностей праймеров для ПЦР
[Таблица 2] Список последовательностей флуоресцентных зондов
ФИГ. 2 показывает основной принцип, связанный с относительной количественной оценкой с использованием ПЦР в реальном времени.
Когда количество ДНК, добавляемой в качестве матрицы в раствор для реакции ПЦР, является постоянным, то, например, в случае трисомии по хромосоме 6, кривая амплификации маркера, расположенного на хромосоме 6, растет быстрее, чем у нормального индивидуума. В случае проведения относительной количественной оценки точка пересечения между кривой амплификации и пороговой линией, установленной по определенному стандарту, определяется как значение Ct и сравнивается со значением Ct каждого из маркеров других хромосом, тем самым достигается оценка числа целевых хромосом.
На фиг. 3 показан пример результата вычисления относительного количества, полученного при проведении ПЦР в реальном времени. В этом тесте, мультиплексную ПЦР проводили при помощи способа с флуоресцентным зондом с использованием 96 индивидуумов F1 сортов брокколи в качестве материалов, маркера хромосомы 4 и маркера хромосомы 6. «LightCycler 480 System II» компании Roche использовали в качестве машины для ПЦР в реальном времени, а «Premix Ex Taq (Perfect Real Time)» компании Takara Bio Inc. использовали в качестве реагента для реакции. На рисунке ось X показывает количество индивидуумов, а ось Y показывает относительное количество маркера хромосомы 6, рассчитанное способом ΔΔCt с использованием маркера хромосомы 4 в качестве стандарта.
Среди 96 протестированных индивидуумов 88 индивидуумов нормального типа показали значение около 1, в то время как 5 индивидуумов с трисомией по хромосоме 6 показали значение около 1,4, а 3 индивидуума с трисомией по хромосоме 4 показали значение около 0,7. Когда эффективность амплификации ПЦР приняли как двойную за цикл, теоретические значения трисомии по хромосоме 6 и трисомии по хромосоме 4 были 1,5 и 0,66, соответственно, и, таким образом, фактические значения были близки к этим значениям.
Пример 2 Наблюдение хромомсомы у трисомного растения брокколи
Среди растений, которые были определены как трисомные при помощи ПЦР в реальном времени, в качестве материалов использовали трисомию по хромосоме 6, трисомию по хромосоме 7 и трисомию по хромосоме 2, и наблюдали хромосомы.
Пыльники были извлечены из бутонов брокколи длиной от 1 до 2 мм и окрашены 1% орсеином в растворе уксусной кислоты. Наблюдали хромосомы при первичной метафазе (стадия MI) мейоза материнских клеток пыльцы.
Результаты были такими, как показано на ФИГ. 4.
Как показано на ФИГ. 4, в случае хромосомы нормального индивидуума, наблюдали девять двухвалентных хромосом (2n=18). Между тем, в случае хромосомы, наблюдаемой в трисомном растении, наблюдали девять двухвалентных хромосом и одну хромосома (обозначена стрелкой) (2n+1).
Пример 3 Детекция нетипичного растения у брокколи
Семена F1 сорта брокколи «SBR-48», разрабатываемого SAKATA SEED CORPORATION, высевали в лотки для питомников. ДНК от 445 индивидуумов экстрагировали из недавно появившихся семядолей из прорастающих семян и проводили ПЦР в реальном времени с помощью способа с SYBR с использованием маркеров, специфичных для каждой хромосомы.
Конкретно, праймеры с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: 1 до 18, использовали в качестве маркеров, специфичных для хромосом. SYBR Green I (приобретенный у Roche) добавляли к нормальному реакционному раствору ПЦР в качестве интеркалятора, что приводило к конечной концентрации 1/20000, затем проводили ПЦР. Для ПЦР в реальном времени использовали «LightCycler 480 System II» компании Roche. Способ, используемый для ПЦР, включал инкубацию при 95°C в течение 1 минуты, после чего следовали 40 циклов трехступенчатой ПЦР при 95°C в течение 15 секунд, 60°C в течение 30 секунд и 72°C в течение 30 секунд. При измерении сигнала с SYBR Green I использовали фильтр с длиной волны возбуждения 465 нм и длиной волны обнаружения 510 нм.
На основании значения Ct, полученного способом второй производной, рассчитывали относительное количество по способу ΔΔCt с использованием маркера на хромосоме 9 в качестве стандарта.
Результаты были такими, как показано в таблице 3.
Эти результаты суммированы в таблице 3 для каждой хромосомы, и, таким образом, ясно, что анеуплоиды включены в соотношение, как показано в таблице 4.
В этом примере трисомия по хромосоме 3 не появилась. Однако, как показано на ФИГ. 1, трисомия по хромосоме 3 появляется в редких случаях (фенотипические характеристики трисомии по каждой хромосоме такие же, как показано на ФИГ. 7). Обратите внимание, что авторы настоящего изобретения раздельно подтвердили, что нет проблем с разработанными маркерами, включая трисомию по хромосоме 3.
Таблица 3. Результат тестирования на анеуплоид в растениях F1 брокколи (необработанные данные, полученные путем ПЦР на основании способа с SYBR (значение рассчитано при помощи способа ΔΔCt))
[Таблица 3-1]
[Таблица 3-2]
[Таблица 3-3]
[Таблица 3-4]
[Таблица 3-5]
[Таблица 3-6]
[Таблица 3-7]
[Таблица 4]
Таблица 4. Результат тестирования на анеуплоид у F1 сорта брокколи при помощи способа с SYBR (суммарная)
Пример 4 Пример детекции нетипичного растения цветной капусты
Семена F1 сорта цветной капусты "SCF-30", разрабатываемого SAKATA SEED CORPORATION, высевали в лотки для питомников. ДНК от 654 индивидуумов экстрагировали из недавно появившихся семядолей из прорастающих семян, затем проводили ПЦР в реальном времени с помощью способа с флуоресцентным зондом с использованием маркеров, специфичных для каждой хромосомы.
Конкретно, вышеуказанный способ проводили следующим образом.
ДНК экстрагировали из семядолей цветной капусты таким же образом, как в примере 3, описанном выше.
ПЦР-тест проводили с использованием хромосомо-специфических маркеров, разделенных на следующие три комбинации:
Триплекс, включающий маркер хромосомы 6, маркер хромосомы 4 и маркер хромосомы 2;
Триплекс, включающий маркер хромосомы 9, маркер хромосомы 3 и маркер хромосомы 8; и
Триплекс, включающий маркер хромосомы 1, маркер хромосомы 5 и маркер хромосомы 7.
Что касается хромосомных маркеров, использованных в этом документе, то для каждой из хромосом использовали праймеры и зонды, показанные в таблицах 1 и 2. Например, пару праймеров, имеющих последовательности, показанные в SEQ ID NO: 1 и 2, и зонд, имеющий последовательность, показанную в SEQ ID NO: 19, использовали в качестве маркера хромосомы 1.
Что касается ПЦР в реальном времени, использовали то же устройство, что и в Примере 3, и проводили ПЦР в условиях инкубации при 95°C в течение 1 минуты, с последующим 40 циклами двухступенчатой ПЦР при 95°C в течение 15 секунд и 60°C в течение 45 секунд. Фильтры с длиной волны возбуждения 465 нм, 533 нм, 618 нм и длиной волны обнаружения 510 нм, 580 нм и 660 нм использовали для измерения сигналов FAM, HEX и Cy5 соответственно.
На основании значения Ct, полученного способом второй производной, рассчитывали относительное количество по способу ΔΔCt с использованием соответствующих маркеров хромосомы 2, хромосомы 8 и хромосомы 7 в качестве эндогенных контролей.
Результаты были такими, как показано в таблице 5.
Эти результаты обобщены в таблице 5, и, таким образом, ясно, что анеуплоиды включены в соотношение, как показано в таблице 6.
Кроме того, растения, предположительно являющиеся анеуплоидами в этом эксперименте, выращивались в полевых условиях для изучения последующего фенотипа. Согласуясь со случаем для брокколи, каждый из анеуплоидов демонстрировал характерный вид (рис. 5) (фенотипические характеристики хромосомных трисомий были такими, как показано на ФИГ. 7).
Приведенные выше результаты показывают, что, подобно брокколи, анеуплоиды появляются в цветной капусте, и этот способ является эффективной процедурой обнаружения эти анеуплоидов у цветной капусты.
Таблица 5. Результат тестирования на анеуплоид в F1 сортов цветной капусты (необработанные данные, полученные путем мультиплексной ПЦР на основании способа с флуоресцентным зондом (значение рассчитано при помощи способа ΔΔCt))
[Таблица 5-1]
[Таблица 5-2]
[Таблица 5-3]
[Таблица 5-4]
[Таблица 5-5]
[Таблица 5-6]
[Таблица 5-7]
[Таблица 5-8]
[Таблица 6]
Таблица 6. Результат тестирования на анеуплоид у F1 сорта цветной капусты способом TaqMan(суммарная)
Пример 5 Пример детекции нетипичного растения у капусты
Индивидуумы с морфологией, отличающейся от нормального внешнего вида на этапе сбора урожая, были выбраны на поле для выращивания F1 сорта капусты "SCB-81", разрабатываемого SAKATA SEED CORPORATION. ДНК экстрагируют из зрелых листьев каждого растения, и анализ анеуплоидов происходит таким же образом, как в примере 4 выше.
Результаты были такими, как показано в таблице 7.
В результате были обнаружены все трисомные растения, кроме хромосомы 3, и было обнаружено, что анеуплоидия хромосом также стала причиной большинства нетипичных индивидуумов у капусты.
Эти факты свидетельствуют о том, что способ по настоящему изобретению эффективен для анализа нетипичных индивидуумов не только у брокколи и цветной капусты, но и у капусты.
ФИГ. 6 показывает появление различных анеуплоидов (фенотипические характеристики хромосомных трисомий были такими, как показано на ФИГ. 7). Как показано на ФИГ. 6 и в таблица 7, в дополнение к типичным трисомиям, были также индивидуумы, у которых анеуплоидия встречалась во множестве хромосом.
[Таблица 7]
Таблица 7. Результат тестирования на анеуплоид в F1 сортов капусты (необработанные данные, полученные путем мультиплексной ПЦР на основании способа с флуоресцентным зондом (значение рассчитано при помощи способа ΔΔCt))
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Sakata Seed Corporation
<120> СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ НЕТИПИЧНОГО РАСТЕНИЯ BRASSICA OLERACEA
<130> 800521JP01
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 1
ctggcaaatg taagcccttt ct 22
<210> 2
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 2
cttgtcttat tacagcagat gcattc 26
<210> 3
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 3
cgccattgct ttctctctac tct 23
<210> 4
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 4
gaagaggaag gactcgagga ag 22
<210> 5
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 5
cttaggattc gggttcgttt g 21
<210> 6
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 6
gccgtaagat ttcaaagaga cttc 24
<210> 7
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 7
cgtctcttgt ggtggttgaa g 21
<210> 8
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 8
tcaacttcat ctgcttggta atg 23
<210> 9
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 9
agcacatcat cccccatact t 21
<210> 10
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 10
cagtctctct ctccttgatg acg 23
<210> 11
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 11
aggaagagga aattgtcatt cg 22
<210> 12
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 12
gtgaccgttg cagcagataa 20
<210> 13
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 13
aagaaattag ccacaagtcg taaata 26
<210> 14
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 14
acgtgaatga tggatatttg atctc 25
<210> 15
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 15
aaagctcgtg aagcaaatac tacc 24
<210> 16
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 16
gaagcatacc aggagggaaa taa 23
<210> 17
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 17
gccatcgcga atcaaagata 20
<210> 18
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 18
atttggtatt ttgcaggcta cag 23
<210> 19
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 19
cacttgtaaa acatgggttt gatcaaaaga 30
<210> 20
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 20
tcctctactt ccaccccatc tgcc 24
<210> 21
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 21
ccgatctgaa aagggagcta acgac 25
<210> 22
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 22
ttgcagcaag gagcttagac cacag 25
<210> 23
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 23
tctcgagaaa tctcatcgct gcttg 25
<210> 24
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 24
ttctcagagc tgttccctcc tccac 25
<210> 25
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 25
ttgcaccacc gttacctttt aacacaa 27
<210> 26
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 26
tgttttgttt ggtgggcaaa tctctt 26
<210> 27
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 27
tggagatctt ccacctcatc ttgga 25
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ тотального облучения тела пациента | 2021 |
|
RU2760613C1 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ И ТРИТЕРПЕНОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ | 1997 |
|
RU2168517C2 |
| ВЕТЕРИНАРНАЯ КОМБИНАЦИЯ И СПОСОБ БОРЬБЫ С БЛОХАМИ | 1999 |
|
RU2233590C2 |
| Универсальный набор плоскопараллельных концевых мер длины | 2023 |
|
RU2812144C1 |
| СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ ФЕДЕРАЦИИ ВЫЧИСЛИТЕЛЕЙ | 2020 |
|
RU2749336C1 |
| НОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ F-15078 | 2000 |
|
RU2223968C2 |
| C-3 и C-17 модифицированные тритерпеноиды в качестве ингибиторов ВИЧ-1 | 2017 |
|
RU2716502C2 |
| ХИРАЛЬНЫЕ МИРТАНИЛСУЛЬФОНАМИДЫ | 2019 |
|
RU2725878C1 |
| ТРИФЕНИЛФОСФОНИЕВЫЕ СОЛИ ЛУПАНОВЫХ ТРИТЕРПЕНОИДОВ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВЕЩЕСТВ | 2012 |
|
RU2551647C2 |
| ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА СО ВСТРОЕННЫМИ В УГЛЕВОДОРОДНУЮ ЦЕПЬ ОСТАТКАМИ ЦИКЛОПЕНТАНА | 2014 |
|
RU2589054C2 |
Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности предлагает способ детекции анеуплоидного растения Brassica oleracea, включающий: проведение ПЦР в реальном времени с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из образца, полученного из растения Brassica oleracea для тестирования, и маркеров ДНК, специфичных для каждой из двух или более хромосом растения Brassica oleracea; и выявление хромосомной анеуплоидии по относительной разнице в количестве амплификации между полученными маркерами ДНК. По одному из вариантов осуществления настоящего изобретения можно просто, точно и быстро обнаружить нетипичное растение (хромосомный анеуплоид), которое может встречаться у сортов Brassica oleracea, в лаборатории, оснащенной общим молекулярно-биологическим оборудованием в процессе контроля качества семян и селекционных исследований. 6 н. и 7 з.п. ф-лы, 7 ил., 7 табл., 5 пр.
1. Способ детекции анеуплоидного растения Brassica oleracea, включающий:
предоставление ДНК-маркеров, которые включают один ДНК-маркер, который специфичен к любой одной из хромосом 1-9 растения Brassica oleracea, и другой ДНК-маркер, который специфичен к другой хромосоме из хромосом 1-9 растения Brassica oleracea,
проведение ПЦР в реальном времени с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из образца, полученного из растения Brassica oleracea для тестирования, и маркеров ДНК;
и выявление хромосомной анеуплоидии по относительной разнице между значениями амплификации, полученными с помощью ДНК-маркеров.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий определение того, является ли тестируемое растение анеуплоидом по одной из его хромосом с использованием ДНК-маркеров, специфичных для каждой из хромосом с 1 по 9 растения Brassica oleracea.
3. Способ по п. 1 или 2, где в способе в качестве ДНК-маркера используют праймер, который специфичен только для одной из хромосомных ДНК растения Brassica oleracea и может производить продукт амплификации в реакции ПЦР, когда присутствует хромосомная ДНК.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где в способе в качестве ДНК-маркеров используют (i) праймер, который специфичен только для одной из хромосомных ДНК растения Brassica oleracea и может производить продукт амплификации в реакции ПЦР, когда присутствует хромосомная ДНК; и (ii) зонд, который специфичен для хромосомной ДНК, идентичной любой из хромосомных ДНК, описанных в (i), и может выявлять продукт амплификации, полученный путем реакции ПЦР на основе праймера, описанного в (i).
5. Способ по п. 3 или 4, где в способе используют интеркалятор, который связывается с двухцепочечной ДНК, синтезированной путем реакции ПЦР, и испускает флуоресценцию, или используют зонд, модифицированный флуоресцентным красителем, чтобы излучать флуоресценцию при реакции элонгации ПЦР.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где в способе используют увеличение флуоресцентного сигнала, полученного путем ПЦР в реальном времени, в качестве показателя для выявления анеуплоидной хромосомы.
7. Способ по любому из пп. 1-6, где в способе используют в качестве ДНК-маркера один или несколько праймеров с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: 1-18.
8. Способ по любому из пп. 1-7, где в способе используют в качестве ДНК-маркера один или несколько праймеров с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: 1-18, и один или несколько зондов с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: 19-27.
9. Набор праймеров для применения в способе по любому из пп. 1-8, включающий по меньшей мере один или несколько праймеров с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: 1-18.
10. Набор праймеров и зондов для применения в способе по любому из пп. 1-8, включающий по меньшей мере один или несколько праймеров с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: 1-18; и по меньшей мере один или несколько зондов, модифицированных флуоресцентным красителем, с нуклеотидными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: 19-27.
11. Способ селекции культуры Brassica oleracea, включающий оценку частоты встречаемости анеуплоидов хромосом для каждой генетической линии растения Brassica oleracea с использованием способа по любому из пп. 1-8 для отбора линии с низким уровнем встречаемости анеуплоидов.
12. Способ контроля качества семян Brassica oleracea, включающий тестирование для определения степени загрязнения анеуплоидами, содержащимися в семенах из партии семян Brassica oleracea, с использованием способа по любому из пп. 1-8.
13. Способ контроля качества растений Brassica oleracea, включающий тестирование для определения степени загрязнения анеуплоидами, содержащимися в растениях Brassica oleracea, с использованием способа по любому из пп. 1-8.
| Varrieur, John Michael | |||
| AFLP marker analysis of monoploid potato | |||
| Diss | |||
| Virginia Tech, 2002, pp | |||
| Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
| Kim H | |||
| A | |||
| et al | |||
| High-throughput sequencing and de novo assembly of Brassica oleracea var | |||
| Capitata L | |||
| for transcriptome analysis, PLoS One, 2014, Т | |||
| Разборный с внутренней печью кипятильник | 1922 |
|
SU9A1 |
| Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. | 1921 |
|
SU3A1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНОЙ ЛИНИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК | 2011 |
|
RU2573927C2 |
