((2-(5,6-БИС(4-ФТОРФЕНИЛ)-1,2,4-ТРИАЗИН-3-ИЛ)ХИНОЛИН)БИС(2-ФЕНИЛПИРИДИН))ИРИДИЙ(III) ХЛОРИД - КЛЕТОЧНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ КРАСИТЕЛЬ Российский патент 2025 года по МПК C07F15/00 C09K11/06 C09B57/10 

1. Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к области люминесцентных комплексных соединений иридия с гетероциклическим 2-(1,2,4-триазин-3-ил)хинолиновым лигандом а также с двумя циклометаллирующими 2-фенилпиридиновыми лигандами (Фиг. 1). Изобретение может быть использовано для флуоресцентной визуализации клеточных структур in vitro и может найти применение в медицине, клеточной биологии, а также в научно-исследовательских лабораториях.

2. Уровень техники.

Производные 2-(1,2,4-триазин-3-ил)хинолина могут быть использованы в качестве лигандов для комплексообразования с различными катионами металлов. Также они являются прекурсорами лигандов 2-пиридил-2-хинолина [D. S. Kopchuk al, ʺFunctionalized 2-(5-arylpyridin-2-yl)quinolines: Synthesis and photophysical properties,ʺ Russ. Chem. Bull., vol. 64, no. 4, pp.872-877, 2015, doi: 10.1007/s11 172-015-0947-х.], который в свою очередь является бензоаннелированным производным 2,2'-бипиридина. 1,2,4-триазиновые лиган-ды достаточно распространены, например содержащий 3-пиридил-2-триазин-1,2,4 ферро-зин, применяющийся в обнаружении двухвалентного железа [С.Е. Carpenter and R. Е. Ward, ʺIron Determination by Ferrozine Method BT - Food Analysis Laboratory Manual,ʺ S. S. Nielsen, Ed. Cham: Springer International Publishing, 2017, pp.157-159.].

Иридиевые комплексы с органическими лигандами находят применение в качестве рабочих тел солнечных батарей [С.Dragonetti, A. Valore, A. Colombo, S. Righetto, and V. Trifiletti, ʺSimple novel cyclometallated iridium complexes for potential application in dye-sensitized solar cells,ʺ Inorganica Chim. Acta, vol. 388, pp.163-167, 2012, doi: 10.1016/j.ica.2012.03.028.; S. I. Bezzubov et al, ʺIridium(III) 2-Phenylbenzimidazole Complexes: Synthesis, Structure, Optical Properties, and Applications in Dye-Sensitized Solar Cells,ʺ Eur. J. Inorg. Chem., vol. 2016, no. 3, pp.347-354, 2016, doi: 10.1002/ejic.201501068.], красителей клеточных структур живых клеток [G. Zhang et al, ʺNear-infrared-emitting iridi-um(III) complexes as phosphorescent dyes for live cell imaging,ʺ Organometallics, vol. 33, no. 1, pp.61-68, 2014, doi: 10.1021/om400676h.] Авторам публикации [Q. Zhao et al, ʺCationic iridium(III) complexes with tunable emission color as phosphorescent dyes for live cell imaging," Organometallics, vol. 29, no. 5, pp.1085-1091, 2010, doi: 10.1021/om900691r.] удалось создать серию красителей, флюоресцирующих в широком диапазоне от синего до красного с сохранением высокого квантового выхода. В химии органических комплексов иридия часто используется лиганд - 2-фенилпиридин, который циклометаллирует атом иридия что приводит к образованию прочных комплексов благодаря образованию ковалентной связи С-Ir.

В литературе присутствуют представители ряда (бис(2-фенилпиридин)(3-пиридил-2-триазин-1,2,4))иридий(III) комплексов с наиболее близким подобием, однако они не люминесцентные [Cooke L, Gristwood К, Adamson К, Sims М, Deary М, Bruce D, et al. Annealing 1,2,4-Triazine to Iridium(III) Complexes Induces Luminogenic Behaviour in Bioorthogonal Reactions with Stain Alkynes.. ChemRxiv. 2024; doi:10.26434/chemrxiv-2024-r4plp.; V. N. Kozhevnikov, M. E. Deary, T. Mantso, M. I. Panayiotidis, and M. T. Sims, "Iridium(III) complexes of 1,2,4-triazines as potential bioorthogonal reagents: metal coordination facilitates luminogenic reaction with strained cyclooctynes,ʺ Chem. Commun., vol. 55, no. 95, pp.14283-14286, 2019, doi: 10.1039/c9cc06828g.]. Также был найден флуоресцентный аналог представляемого изобретения с триазиновым компонентом в виде феррозина, применяемый для детектирования сывороточного альбумина человека in vitro, однако структурно он сильно отличается [С.Huang, G. Ran, Y. Zhao, С.Wang, and Q. Song,ʺSynthesis and application of a water-soluble phosphorescent iridium complex as tum-on sensing material for human serum albumin," Dalt. Trans., vol. 47, no. 7, pp.2330-2336, 2018, doi: 10.1039/c7dt04676f.].

Так как в обозримой литературе не было найдено подобия с наиболее близко совпадающими признаками, нами предлагается ((2-(5,6-бис(4-фторфенил)-1,2,4-триазин-3-ил)хинолин)бис(2-фенилпиридин))иридий(III) хлорид - клеточный флуоресцентный краситель.

3. Сущность изобретения.

Сущность изобретения составляет ((2-(5,6-бис(4-фторфенил)-1,2,4-триазин-3-ил)хинолин)бис(2-фенилпиридин))иридий(III) хлорид - клеточный флуоресцентный краситель (Фиг. 1). Представляемое изобретение демонстрирует фотофизические свойства, достаточные для окрашивания живых клеточных культур in vitro. Изобретение представляет собой иридиевый комплекс, люминесцирующий в красной области видимого спектра, окрашивающий живые клетки после инкубирования и облучении лазером с длиной волны 405-561 нм.

4. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

4.1. Для подтверждения возможности осуществления изобретения приводится способ получения соединения 1

Графически схема синтеза представлена на Фиг. 1.

Синтез комплекса 1.

Растворили 64 мг (0.06 ммоль) дихлортетракис(2-(2-пиридинил)фенил)дииридий(III) 2 в 10 мл смеси дихлорметана и метанола в соотношении 1:1. Растворили 47 мг (0.12 ммоль) 2-(5,6-бис(4-фторфенил)-1,2,4-триазин-3-ил)хинолина 3 в 20 мл смеси дихлорметана и метанола в соотношении 1:1. Смешали растворы веществ 2 и 3 в круглодонной колбе на 100 мл при перемешивании, и снабженную обратным холодильником. Перемешивали реакционную смесь при 75°С в атмосфере аргона в течение 24 часов. Реакционную смесь отогнали при пониженном давлении. Твердый осадок перекристаллизовали из ацетонитрила.

((2 (5,6 Бис(4 фторфенил) 1,2,4 триазин 3 ил)хинолин)бис(2 фенилпиридин))иридий(III) хлорид 1. Красные кристаллы. Выход 52 мг (0.05 моль, 91%). ЯМР ¹Н (CD₃CN, δ, м.д.): 6.04 (д, J=7.6 Гц, 1H), 6.43 (д, J=7.6 Гц, 1Н), 6.83 (т, J=7.5 Гц, 1H), 6.93 (t, J=6.7 Гц, 1Н), 6.96 - 7.04 (м, 5Н), 7.08 (т, J=7.6 Гц, 1Н), 7.17 (д, J=6.8 Гц, 3Н), 7.19 - 7.25 (м, 3Н), 7.30 (т, J=7.9 Гц, 1H), 7.67 (т, J=7.5 Гц, 1H), 7.75 (т, J=7.6 Гц, 2Н), 7.83 (м, 5Н), 7.97 -8.08 (м, 3Н), 8.11 (д, J=8.2 Гц, 1H), 8.23 (д, J=8.9 Гц, 1Н), 8.85 (д, J=8.5 Гц, 1Н), 9.04 (д, J=8.5 Гц, 1Н). ES1-MS, m/z: найдено 933.1884, вычислено 933.18 (М+Н)⁺ , ЯМР ¹⁹F (CD₃CN, δ, м.д.): 108.55-108.45, 110.40-110.3.

Заявленное соединение представляет собой красное кристаллическое вещество, растворимое в ацетонитриле и спиртах, нерастворимое в хлороформе, 1,2-дихлорэтане, бензоле и толуоле.

4.2. Измерение абсолютного квантового выхода.

Электронные спектры поглощения регистрировали с использованием стандартной программы Shimadzu Scan на двулучевом спектрофотометре UV-2600 (ʺShimadzuʺ, Япония) в диапазоне 250 - 600 нм с точностью установки длины волны ±0,1 нм. (Фиг. 2)

Спектры люминесценции зарегистрированы на спектрофлюориметре Horiba Fluro-Max с взаимно перпендикулярными лучами, точность установки длины волны 0.5 нм. Измерения проводились в диапазонах от 400 до 850 нм в кварцевых кюветах SUPRASIL 111-QS 10 (ʺHellmaʺ, Германия), ширина зоны вокруг стационарной точки возбуждения/испускания составляет 10 нм. Длина волны стационарной точки возбуждения задавалась каждый раз максимуму в спектрах поглощения и испускания, длина волны стационарной точки испускания - максимуму в спектрах возбуждения. Напряжение на ФЭУ выбиралось исходя из люминесцентного отклика во время тестовой регистрации. В спектрах учитывалась люминесценция растворителей. (Фиг. 3)

Как следует из приведенных данных (Фиг. 2 и Табл. 1), максимумы поглощения иридиевого комплекса находится при 268, 327 и 404 (плечо) нм. Квантовый выход люминесценции составляет 2.6%.

4.3. Окраска живых клеток соединением 1 in vitro

Раствор соединения 1 готовили в ДМСО с концентрацией 1*10^-3 М, разводились полной питательной средой до концентрации 1*10-5М. Растворы готовились непосредственно перед добавлением веществ к клеткам. Все манипуляции с растворами веществ и, в дальнейшем, с клетками проводились в ламинарном боксе Bioinnelix (BioinnLabs, Russia) при красной подсветке (625 нм) для минимизации воздействия на вещества светом.

Исследование проводилось на клетках культуры Vero (клетки эпителия почки зеленой мартышки) полученных из российской коллекции клеточных культур института цитологии РАН. Клетки поддерживаются в питательной среде ДМЕМ (BioinnLabs, Russia) с добавлением 10% FBS (Biolot, Russia) в инкубаторе при температуре 37°С и атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Перед проведением экспериментов клетки были протестированы на отсутствие микоплазмы.

Для исследования клетки рассевались в чашки со стеклянным дном для конфокальной микроскопии (JetBiofil, China) в концентрации 1*10⁴ клеток/мл и инкубировались в течение суток, после чего к ним добавлялся раствор исследуемых веществ в полной питательной среде. Клетки выдерживали с веществом 30 минут в инкубаторе, после чего трижды промывались питательной средой для удаления не вошедшего в клетку красителя и исследовались при помощи конфокального микроскопа. При перемещении чашек Петри в комнату с конфокальным микроскопом чашки заворачивались в алюминиевую фольгу, чтобы максимально защитить клетки от воздействия света.

Для исследования использовался лазерный сканирующий конфокальный микроскоп LSM-710 (Carl Zeiss, Germany). Клетки исследовались при помощи иммерсионного 40х объектива. Предварительно настраивался фокус при помощи 633 нм лазера чтобы минимально воздействовать на клетки, далее снимались лямбда (полноспектральные) изображения от других лазеров.

Соединение 1 в клетках заметно флуоресцирует в желто-красном диапазоне, окрашивает ЭПР. Изображения получены в полноспектральном режиме при возбуждении 405, 488 и 561 нм лазером (Фиг. 4, слева направо). Выраженного фототоксического действия на клетки не обнаружено.

Таким образом, соединение 1 способно окрашивать эндоплазматический ретикулум живых клеток с образованием желто-красной эмиссии.

Изобретение относится к области люминесцентных комплексных соединений иридия, а именно к ((2-(5,6-бис(4-фторфенил)-1,2,4-триазин-3-ил)хинолин)бис(2-фенилпиридин))иридий(III) хлориду, представленному указанной ниже структурной формулой. Предложенное соединение обладает люминесценцией в красной области видимого спектра и может быть использовано в качестве клеточного флуоресцентного красителя для флуоресцентной визуализации клеточных структур in vitro и может найти применение в медицине, клеточной биологии, а также в научно-исследовательских лабораториях. 4 ил., 1 табл.

((2-(5,6-Бис(4-фторфенил)-1,2,4-триазин-3-ил)хинолин)бис(2-фенилпиридин))иридий(III) хлорид - клеточный флуоресцентный краситель