Способ определения концентрации глюкозы Российский патент 2023 года по МПК G01N21/00 G01N21/75 

Изобретение относится к аналитической химии и касается способов определения концентрации глюкозы в водных растворах с использованием соединений меди(II). Глюкоза является самым распространенным органическим веществом, которое встречается в природе в виде простого сахара, а также она входит в состав сложных сахаров от дисахаридов до полисахаридов [1], [2].

Глюкоза находит применение в различных отраслях:

– в медицине используют как универсальное антитоксическое средство, как источник углеводов при парентеральном питании, при тестировании на диабет;

– в пищевой промышленности при выпечке хлеба, в кондитерском деле, при производстве сгущённого молока, мороженого, простокваши, кефира, для производства спирта, вин, пива;

– в сельском хозяйстве для подкормки пчёл;

– в химической промышленности для получения витамина C (аскорбиновая кислота), сорбита и биополимеров;

– в фармацевтической промышленности при производстве лекарств и в качестве консерванта;

– в микробиологической промышленности при выращивании различных микроорганизмов;

– в кожевенном производстве в качестве восстановителя;

– в текстильном производстве при изготовлении вискозы.

Большое значение глюкозы в различных сферах, значимость ее для решения задач, указанных выше, определяет интерес к разработке методов определения глюкозы, среди которых полярографические [3], хроматографические [4], электрохимические [5], спектральные [6], [7], [8], фотометрические [9], [10], биосенсорные [11] и др.

Известным и применяемым методом определения восстанавливающих сахаров, в том числе и глюкозы, является метод Шомоди-Нельсона, который базируется на работах Шомоди [12], [13].

Раствор Шомоди готовят следующим образом.

- раствор А готовят, растворяя 10 г сернокислой меди в 90 см³ дистиллированной воды;

- раствор Б готовят из 24 г натрия углекислого безводного и 12 г калия-натрия виннокислого, которые растворяют в 250 см³ дистиллированной воды, затем при перемешивании последовательно вносят 40 см³ раствора А и 16 г кислого углекислого натрия.

- раствор В готовят из навески (18 г) сернокислого безводного натрия, которую растворяют в 500 см³ горячей дистиллированной воды и кипятят в течение 40 мин на электроплитке. Раствор охлаждают до комнатной температуры.

Далее растворы Б и В объединяют и доводят объем дистиллированной водой до 1000 см³. Если образуется осадок, его отфильтровывают.

Нельсон разработал [14] адаптацию метода Шомоди для фотометрического определения глюкозы, для этого был предложен раствор Нельсона, который готовят из двух растворов:

- раствор Г готовят, растворяя 3 г мышьяковокислого натрия в 25 см³ дистиллированной воды.

- раствор Д готовят, растворяя 25 г молибденовокислого аммония в 450 см³ дистиллированной воды, затем добавляют 21 см³ концентрированной серной кислоты и раствор Г. Полученный раствор выдерживают в термостате при температуре 55 °С в течение (25±1) мин.

Процедура выполнения анализа заключается в следующем. К 1 см³ анализируемого раствора приливают 1 см³ раствора Шомоди и кипятят 15 мин на водяной бане. Затем смесь быстро охлаждают на ледяной бане, добавляют к ней 1 см³ раствора Нельсона и доводят объем дистиллированной водой до 10 см³. Раствор тщательно перемешивают и измеряют оптическую плотность при 508 нм. Если оптическая плотность раствора больше 0,5, то определение повторяют с большим разведением. В контрольном опыте вместо анализируемого раствора используют дистиллированную воду. Концентрацию глюкозы определяют по градуировочной зависимости, построенной по растворам глюкозы с известными концентрациями.

Известен модифицированный метод Шомоди-Нельсона [15] , который осуществляется следующим образом. Первоначально готовят растворы Шомоди и Нельсона. Затем к 0,5 мл анализируемого раствора глюкозы добавляют 0,5 мл раствора Шомоди. Реакционную смесь нагревают в течение 20 минут. После охлаждения добавляют 0,5 мл раствора Нельсона. Затем измеряют оптическую плотность и по градуировочной зависимости определяют концентрацию глюкозы в анализируемом растворе. Недостатком является двухстадийность проведения фотометрической реакции.

Известен минимизированный метод Шомоди-Нельсона [16], который осуществляется следующим образом. Первоначально готовят растворы Шомоди и Нельсона. Затем 0,45 мкл анализируемого раствора помещают на микроплату из полипропилена, затем добавляют 0,45 мкл раствора Шомоди. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 с, после чего нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 мин. После нагревания микроплату охлаждают холодной водой в течение 5 мин. Затем в лунку пипеткой вносят 0,45 мкл раствора Нельсона. Планшет выдерживают не менее чем 15 минут для завершения фотометрической реакции. После чего реакционную смесь разбавляют и измеряют оптическую плотность при 600 нм и по величине оптической плотности определяют концентрацию глюкозы в растворе. Недостатками указанного метода являются многостадийность и большая продолжительность (прототип).

Задачей изобретения является упрощение процедуры выполнения фотометрического метода Шомоди-Нельсона для определения концентрации глюкозы.

Поставленная задача достигается тем, что фотометрическую реакцию проводят в одну стадию в присутствии нитрованных гуминовых кислот в качестве полимерного стабилизатора, в качестве окислителя используют этилендиаминовый комплекс меди(II), который образуется в результате взаимодействия катиона меди(II) с этилендиамином (щелочной реагент). Фотометрическую реакцию проводят следующим образом.

При выполнении фотометрической реакции использовали растворы, характеристика которых представлена в таблице 1. Растворы сульфата меди(II) и нитрованных гуминовых кислот готовили с использованием раствора этилендиамина с концентрацией последнего 4,9 мг/мл.

В предварительных экспериментах были определены расходы реагентов и продолжительность фотометрической реакции. Длина волны была установлена на основе изучения электронных спектров. Для этого была проведена фотометрическая реакция и записан электронный спектр в области 250…400 нм (фигура 1). Как видно, максимум полосы поглощения находится при 323 нм. Поэтому в качестве аналитической полосы использовали данную длину волны УФ излучения.

Таблица 1 – Характеристика растворов

№ Раствор вещество размерность значение 1 Нитрогуминовые кислоты (НГК) мг/мл 8,5 2 Этилендиамин (ЭДА) мг/мл 4,9 3 Сульфат меди(II) мг Cu/мл 2,3

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Первоначально готовят раствор, смешивая заданные объемы растворов сульфата меди(II) в ЭДА и НГК. К этому раствору добавляют известный объем раствора глюкозы. Реакционную смесь нагревают на кипящей водяной бане (КВБ) в течение 20 минут. После завершения реакции, реакционную смесь охлаждают, объем раствора доводят до 25 мл дистиллированной водой и измеряют оптическую плотность при 323 нм. После чего по градуировочной зависимости вычисляют концентрацию глюкозы в анализируемом растворе.

Пример 1. В мерной пробирке на 25 мл смешивали 1 мл раствора сульфата меди(II) в ЭДА, 0,1 мл раствора НГК и 1 мл раствора глюкозы с концентрацией 1,5 мг/мл и нагревали на КВБ в течение 20 мин. После чего реакционную смесь охлаждали, объём раствора доводили до 25 мл дистиллированной водой и измеряли его оптическую плотность при 323 нм на спектрометре, в кювете с длиной рабочего слоя 1 мм. Измеренная величина оптической плотности при 323 нм составила 0,544.

Пример 2. Способ определения глюкозы в условиях примера 1, отличающийся тем, что концентрация глюкозы в анализируемом растворе составила 3,0 мг/мл. Измеренная величина оптической плотности при 323 нм составила 1,007.

Пример 3. Способ определения глюкозы в условиях примера 2, отличающийся тем, что концентрация глюкозы в анализируемом растворе составила 4,0 мг/мл. Измеренная величина оптической плотности при 323 нм составила 1,339.

Пример 4. Способ определения глюкозы в условиях примера 3, отличающийся тем, что концентрация глюкозы в анализируемом растворе составила 4,5 мг/мл. Измеренная величина оптической плотности при 323 нм составила 1,488.

Пример 5. Способ определения глюкозы в условиях примера 1, отличающийся тем, что реакцию проводили без раствора глюкозы (холостой опыт), добавив вместо нее 1 мл дистиллированной воды. Измеренная величина оптической плотности при 323 нм составила 0,068.

По результатам примеров 1…5 была построена градуировочная зависимость, которая представляет собой полином первого порядка A₃₂₃ = 0,3161∙C_гл + 0,0674. Коэффициент парной корреляции для этой зависимости составляет R² = 0,9999.

Пример 6. Способ определения глюкозы в условиях примера 1, отличающийся тем, что концентрация раствора глюкозы составляла 2,0 мг/мл. Измеренная величина оптической плотности при 323 нм составила 0,723. Рассчитанная по градуировочной зависимости концентрация глюкозы составляет 2,07 мг/мл (103,5 % от заданного значения).

Пример 7. Способ определения в условиях примера 6, отличающийся тем, что концентрация раствора глюкозы составляла 2,5 мг/мл. Измеренная величина оптической плотности при 323 нм составила 0,897. Рассчитанная по градуировочной зависимости концентрация глюкозы составляет 2,62 мг/мл (104,9 % от заданного значения).

Пример 8. Способ определения глюкозы в условиях примера 7, отличающийся тем, что концентрация раствора глюкозы составляла 3,5 мг/мл. Измеренная величина оптической плотности при 323 нм составила 1,142. Рассчитанная по градуировочной зависимости концентрация глюкозы составляет 3,4 мг/мл (97,1% от заданного значения).

Результаты определения концентрации глюкозы сведены в таблице 2.

Таблица 2.

Пример Оптическая плотность при 323 нм Концентрация глюкозы, мг/мл Процент от заданной концентрации, % заданная определенная 6 0,723 2,0 2,07 103,5 7 0,897 2,5 2,62 104,9 8 1,142 3,5 3,40 97,1

Таким образом, изобретение позволяет упростить определение глюкозы по методу Шомоди-Нельсона, определять концентрацию глюкозы с хорошей точностью и избегать использования значительно более токсичных по сравнению с ионами меди (ПДК = 1,0 мг/л) соединения мышьяка и молибдена (ПДК = 0,05 и 0,25 мг/л соответственно).

СПИСОК ИСТОЧНИКОВ

[1] Stick, R., Williams, S.J. Carbohydrates: The Essential Molecules of Life. – 2nd Edition. – Amsterdam [etc.]: Elsevier Science, 2009. – 496 p. [2] Кочетков Н.К., Бочков А.Ф., Дмитриев Б.А., Усов А.И., Чижов О.С., Шибаев В.Н. Химия углеводов. – М.: Химия, 1967. – 626 с. [3] Fischl J., Federman D., Talmor N. Preparation of a Modified Glucose Oxidase Reagent for the Polarographic Determination of Glucose with the Beckman" Glucose Analyzer" // Clinical Chemistry. – 1975. – Vol. 21, N 6. – P. 760-761. [4] Murillo M.M.S., Granados-Chinchilla F. Total starch in animal feeds and silages based on the chromatographic determination of glucose // MethodsX. – 2018. – Vol. 5. – P. 83-89. [5] Gvozdenović M.M., Jugović B.Z., Bezbradica D.I., Antov M.G., Knežević-Jugović Z.D., Grgur B.N. Electrochemical determination of glucose using polyaniline electrode modified by glucose oxidase // Food Chem. – 2011. – Vol. 124, N 1. – P. 396-400., "DOI: 10.1016/j.foodchem.2010.06.046". [6] Cao R., Komura F., Nonaka A., Kato T., Fukumashi J., Matsui, T. (2014) Quantitative analysis of D-(+)-glucose in fruit juices using diffusion ordered-1H nuclear magnetic resonance spectroscopy // Analytical Sciences. – 2014. – Vol. 30. – P. 383-388. [7] Petibois C., Rigalleau V., Melin A.M., Perromat A., Cazorla G., Gin H., Déléris G. Determination of glucose in dried serum samples by Fourier-transform infrared spectroscopy // Clinical chem. – 1999. – Vol. 45, N 9. – P. 1530-1535., "DOI: 10.1093/clinchem/45.9.1530". [8] Baca J.T., Taormina C.R., Feingold E., Finegold D.N., Grabowski J.J., Asher S.A. Mass spectral determination of fasting tear glucose concentrations in nondiabetic volunteers // Clinical chem. – 2007. – Vol. 53, N 7. – P. 1370-1372., "DOI: 10.1373/clinchem.2006.078543". [9] Stitt F., Friedlander S., Lewis H.J., Young F.E. Photometric determina-tion of glucose in presence of fructose // Analytical Chemistry. – 1954. – Vol. 26, N 9. – P. 1478-1484. [10] Метод фотометрического определения глюкозы и сахарозы / Хабаров Ю. Г., Камакина Н. Д., Гусаков Л. В. // Изв. вузов. Химия и хим. технол. - 2004. - 47, № 2. - С. 20-22. [11] Wu B., Zhang G., Shuang S., Choi M.M.F. Biosensors for determination of glucose with glucose oxidase immobilized on an eggshell membrane // Talanta. – 2004. – Vol. 64, N 2. – P. 546-553. [12] Somogyi M. Sugar determination // J. Biol. Chem. – 1926. – Vol. 70. – P. 599-612. [13] Somogyi M. A reagent for the copper-iodometric determination of very small amounts of sugar // J. Biol. Chem. – 1937. – Vol. 117, N 2. – P. 771-776. [14] Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose // J. Biol. Chem. – 1944. – Vol. 153, N 2. – P. 375-380. [15] Hatanaka C., Kobara Y. Determination of glucose by a modification of So-mogyi-Nelson method // Agricultural and Biological Chemistry. – 1980. – Vol. 44, N 12. – P. 2943-2949. DOI: 10.1271/bbb1961.44.2943. [16] Shao Y., Lin A.H.-M. Improvement in the quantification of reducing sugars by miniaturizing the Somogyi-Nelson assay using a microtiter plate // Food Chem. – 2018. – Vol. 240. – P. 898-903. DOI: 10.1016/j.foodchem.2017.07.083. [17] Xue Y., Qiu X., Liu Z., Li Y. Facile and Efficient Synthesis of Silver Nano-particles Based on Biorefinery Wood Lignin and Its Application as the Optical Sensor // ACS Sustainable Chemistry & Engineering. – 2018. – Vol. 6, N 6. – P. 7695–7703. DOI:10.1021, /acssuschemeng.8b00578.

Изобретение относится к аналитической химии и касается способов определения концентрации глюкозы в водных растворах с использованием соединений меди(II). При определении готовят реакционную смесь, содержащую раствор сульфата меди(II), этилендамин, нитрованные гуминовые кислоты и глюкозу. Затем осуществляется нагревание смеси в течение заданного времени, охлаждение реакционной смеси после завершения реакции, доведение дистиллированной водой до заданного объема и определение оптической плотности раствора. Концентрация глюкозы вычисляется по предварительно построенной градуировочной зависимости. Техническим результатом определения является упрощение процедуры выполнения фотометрического метода Шомоди-Нельсона для определения концентрации глюкозы. 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 8 пр.

1. Способ определения концентрации глюкозы в растворе путем приготовления реакционной смеси, представляющей собой смесь растворов сульфата меди(II), полимерного стабилизатора, глюкозы, щелочного реагента, последующего нагревания смеси в течение заданного времени, охлаждения реакционной смеси после завершения реакции, доведения дистиллированной водой до заданного объема, определения оптической плотности раствора и вычисления концентрации глюкозы по предварительно построенной градуировочной зависимости, отличающийся тем, что в качестве полимерного стабилизатора используют нитрованные гуминовые кислоты, а в качестве щелочного реагента используют раствор этилендиамина.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что продолжительность нагревания на кипящей водяной бане составляет 20 мин.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что оптическую плотность измеряют при 323 нм.