СПОСОБ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 1998 года по МПК A61K39/02 A61K39/04 A61K39/10 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к диагностике инфекционных болезней животных, и является усовершенствованием известных способов серологической диагностики бруцеллеза и туберкулеза крупного рогатого скота в реакции связывания комплемента (РСК).

Способы серологической диагностики бруцеллеза [1] и туберкулеза [2] в РСК предусматривают постановку реакций с каждым из антигенов в отдельности по существующим методикам. Кроме того, известен способ серологической диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота [3] при котором достигается повышение чувствительности единого бруцеллеза бовис в соотношении 1:0,5, после чего готовят рабочее разведение и вносится в реакцию в количестве 0,2 мл. Благодаря этому, в РСК со смешанным антигеном обнаруживаются до 15% больше больных бруцеллезом животных нежели чем при постановке реакции с чистым бруцеллезным антигеном. Однако, низкая чувствительность смешанного антигена [3] в РСК для выявления больных туберкулезом животных не позволяет использовать его в качестве единого антигена для одномоментной постановки РСК на обе инфекции.

Цель изобретения - разработка способа диагностики бруцеллеза и туберкулеза крупного рогатого скота однократной постановкой РСК с комбинированным антигеном.

Поставленная цель достигается тем, что РСК ставится с комбинированным антигеном (единый бруцеллезный антиген для РА и РСК + микробактериальный антиген) при соотношении компонентов 1:1.

Предлагаемый способ отличается тем, что РСК ставится с комбинированным антигеном, в котором вытяжка из микобактерий бовис используемая в смешанном антигене, заменяется антигеном повышенной чувствительности и специфичности в отношении туберкулезных антител. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию "новизна". Сравнение данного технического решения с другими способами [1-3] в данной области, позволило выявить признак, сходный с признаком отличающим заявляемое техническое решение - в РСК используется смесь двух полноценных антигенов.

В предлагаемом решении антигенная смесь также проявляет свойство повышенной чувствительности в РСК при диагностике бруцеллеза. Однако, указанная смесь в данном случае проявляет новое свойство, а именно - одновременно выявляет комплементсвязывающие противотуберкулезные антитела в сыворотках крови при вероятном наличии больных туберкулезом животных среди исследуемого поголовья.

Наличие нового свойства, проявляемое в предлагаемом решении, обеспечивает ему соответствие критерию "существенные отличия".

Сущность изобретения заключается в том, что при постановке РСК с комбинированным антигеном, наряду с повышением чувствительности бруцеллезного антигена, достигнута высокая чувствительность и к противотуберкулезным антителам.

Туберкулезный антиген используемый для получения комбинированного готовится предварительно и состоит из смеси: полисахаридной фракции из микобактерий бовис и туберкулезис (по методике МОНИТИ), метанолового экстракта по Боке и Негри, сырого экстракта (по А.И. Тогуновой с соавт., 1962) и водного экстракта из легочной ткани здорового крупного рогатого скота (стабилизатор). Указанные компоненты смешиваются соответственно в объемах: 2,5; 3,0; 5,0; 43. Титр микобактериального антигена доводят до 1:75, что соответствует титру единого бруцеллезного антигена для РА и РСК. Комбинированный антиген используемый в РСК для одновременной диагностики бруцеллеза и туберкулеза готовится путем смешивания единого бруцеллезного антигена для РА и РСК с микобактериальным антигеном в соотношении 1:1.

Таким образом, замененная вытяжка из микобактерий бовис полноценным микобактериальным антигеном в составе комбинированного антигена приобретает свойства, полного антигена в отношении противотуберкулезных и противобруцеллезных антител, который проходит соответствующий контроль.

При осуществлении способа одновременной серологической диагностики бруцеллеза и туберкулеза по РСК предусматривается титрование комплемента и гемолизина, инактивация испытуемой и контрольных (позитивной и негативной сывороток путем прогревания при 60-61^oC. 30 мин, подготовка комбинированного антигена (единый бруцеллезный антиген смешивается с антигеном из микобактерий в соотношении 1:1) после чего готовят рабочее разведение и добавляют в реакцию в количестве 0,2 мл. Затем добавляют комплемент (в установленном титре) в объеме 0,2 мл и смесь выдерживают при комнатной температуре 40 мин, далее на водяной бане при 37^oC в течение 20 мин. После инкубации к смеси сыворотки и комплемента добавляют гемолитическую сыворотку и повторно выдерживают в водяной бане при 37^oC в течение 20 мин. Учет и оценку реакции проводят после 16-18 часовой выдержки при комнатной температуре. В последующем, сыворотки крови с позитивными показаниями в РСК с комбинированным антигеном отделяются и только с ними ставится РСК с туберкулезным антигеном. Разница между показателями первичной постановки реакции и повторной показывает на наличие бруцеллеза, так как позитивные показания комбинированного антигена и чистого туберкулезного антигена абсолютно совпадают.

Опыты по отработке эффективного соотношения обоих антигенов показали, что чувствительность реакции была наиболее высокой при их соотношении 1:1 и введения в реакцию этой смеси (в едином титре 1:75) в объеме 0,2 мл. Использование в предлагаемой смеси туберкулезного антигена в иных соотношениях приводило к снижению чувствительности реакции в отношении выявления позитивных туберкулезных сывороток или же к ее перерасходу.

Пример 1. Сыворотки крови крупного рогатого скота больного туберкулезом в количестве 17 проб исследовали в РСК. Для этого титровали комплемент и гемолизин, инактивировали испытуемые сыворотки путем прогревания при 60-61^oC 30 мин. Смесь единого бруцеллезного и туберкулезного антигенов готовили в соотношении 1:0,55. Рабочее разведение комбинированного антигена в количестве 0,2 мл добавляли к разведенным испытуемым сывороткам и смесь выдерживали при комнатной температуре 40 мин, инкубировали 30 мин при 37^oC, добавляли гемолитическую систему и повторно инкубировали 20 мин. Учет и оценку реакции проводили через 16-18 ч выдержки при комнатной температуре. При этом из исследованных 17 проб в 14 выделены комплементсвязывающие антитела в диагностическом титре.

Пример 2. Смесь единого бруцеллезного и туберкулезного антигенов готовили в соотношении 1:1, после чего рабочее разведение добавляли в реакцию в количестве 0,2 мл. Затем добавляли разведенный в установленном титре комплемент, выдерживали при комнатной температуре 40 мин, инкубировали при 37^oC 30 мин. После этого добавляли гемолитическую систему и повторно инкубировали 20 мин при том же режиме. Учет и оценку реакции проводили после 16-18 часовой выдержки при комнатной температуре. При этом, из исследованных 17 проб сывороток крови крупного рогатого скота больного туберкулезом в 17 выявили комплементсвязывающие антитела в диагностическом титре. В РСК с единым бруцеллезным антигеном позитивные сыворотки не установлены; с туберкулезным антигеном выявлено - 17; со смешанным антигеном - 9 сывороток с диагностическим титром антител (контроль).

Пример 3. Сыворотки крови крупного рогатого скота, больного туберкулезом в количестве 17 проб исследовали в РСК. К смеси инактивированных сывороток добавляли 0,2 мл разведенного в рабочем титре комплемента и по 0,2 мл смеси единого бруцеллезного и туберкулезного антигенов в соотношении 1:1,25. После выдержки при комнатной температуре в течение 40 мин, смесь инкубировали при 27-38^oC 30 мин, добавляли гемолитическую систему и повторно инкубировали 20 мин при том же режиме. Учет и оценку реакции проводили после 16-18 часовой выдержки при комнатной температуре. При этом из исследованных 17 проб в 17 выявлены комплементсвязывающие антитела в диагностическом титре, тогда как в РСК со смешанным антигеном состоящим из единого бруцеллезного антигена и вытяжки из микробактерий бовис из 17 в 14 случаях (контроль).

Результаты опытов по отработке оптимального соотношения компонентов комбинированного антигена, используемого в РСК по предлагаемому способу приводятся в табл. 1.

Постановка РСК по предлагаемому способу позволяет не только получить эффект повышения чувствительности единого бруцеллезного антигена, но одновременно обнаруживать пробы сывороток крови с диагностическими титрами комплементсвязывающих противотуберкулезных антител (табл. 2). При этом отпадает необходимость двукратного исследования с двумя антигенами, поступающих в лабораторию проб сывороток крови. Экономятся материальные и трудовые расходы, рабочее время.

Источники информации
1. Лабораторные исследования в ветеринарии. Бактериальные инфекции. /Справочник под ред. Б.А.Антонова, М.: Агропромиздат, 1986, с. 60-89.

2. Наставление по диагностике туберкулеза животных. М.: 1986, с. 44.

3. Авторское свидетельство СССР N 1750687. A1, кл A 61 K 39/10. 1992.

Способ предназначен для использования в ветеринарии при диагностике бруцеллеза и туберкулеза животных. Для осуществления способа титруют компонент и гемолизин, инактивируют испытываемую сыворотку, рассчетное количество единого бруцеллезного антигена перед приготовлением рабочего разведения смешивают с агентом из Mycobacterium bovis и Mycobacterium tuborecylosis в соотношении 1:1, после чего смесь разбавляют физиологическим раствором в едином титре 1:75 и добавляют в реакцию в количестве 0,2 мл. Затем добавляют комплемент и выдерживают при комнатной температуре 40 мин, инкубируют на водяной бане при 37 - 38^oC в течение 30 мин, после чего добавляют гемосистему и повторно инкубируют на водяной бане 20 мин, при том же режиме. Учет и оценку реакции проводят после 16 - 18 часовой выдержки при комнатной температуре. Способ позволяет одновременно осуществлять диагностику бруцеллеза и туберкулеза, обладает более высокой чувствительностью по сравнению с известными способами. 2 табл.

Способ серологической диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, включающий использование смеси единого бруцеллезного антигена с туберкулезным антигеном, отличающийся тем, что в качестве туберкулезного антигена используют антиген, полученный из микобактерий бовис Mycobacterium bovis, и туберкулезис Mycobacterium tuberculosis, а смешивают его с бруцеллезным антигеном в соотношении 1 : 1.