Фармакологическая композиция для компенсации артериальной гипертензии и ассоциированных с ней патологий сердечно-сосудистой системы Российский патент 2023 года по МПК A61K45/06 A61K31/138 A61K31/21 A61K31/4164 A61K31/165 A61P9/12 

Данное изобретение относится к медицине, а именно к медикаментозным препаратам, направленным на лечение кардиоваскулярных патологий. Настоящая композиция может использоваться для лечения в комплексной терапии артериальной гипертензии (АГ), ишемической болезни сердца, начальной стадии сердечной недостаточности, нефункциональной гипертрофии миокарда, нарушениях ритма и сердечной проводимости (аритмии различного генеза), кардионеврозе. Согласно статистике ВОЗ, сердечно-сосудистые заболевания бессменно лидируют в числе причин смертности населения Земли независимо от социоэкономических факторов, что указывает на принципиальную актуальность поисков новых стратегий для лечения/компенсации кардиоваскулярных патологий. Одной из наиболее распространенных (и прогрессирующих с возрастом) патологий является АГ. Ее принято считать скорее следствием (симптомом), нежели причиной патофизиологических реакций возникающих в организме. АГ является одним из ключевых факторов риска развития ишемической болезни сердца, нефункциональной гипертрофии миокарда, хронической сердечной недостаточности, инфаркта миокарда и инсультов. Среди внутренних факторов, провоцирующих возникновение АГ, наиболее существенны генетически детерминированные (предрасположенность) нарушения нормальной нейрогуморальной регуляции, заключающиеся в повышении активности прессорных механизмов и/или снижении функциональности депрессорных механизмов. Основными и наиболее часто применяемыми средствами являются ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, блокаторы потенциал-чувствительных Са²⁺-каналов, β-адреноблокаторы, антагонисты рецепторов ангиотензина-II, тиазидные диуретики, имидазолиновые агонисты. На практике, «одномерная» терапия препаратом из конкретной группы часто не приносит желаемых результатов, и тогда их назначают в составе комплексной терапии. Для ее показания обязано быть соблюденным условие усиления (потенцирования) тотального эффекта комбинации препаратов, наряду со снижением возможных побочных эффектов друг друга. Основой предлагаемой композиции является совместное использование β-адреноблокаторов, агонистов α₂-адренорецепторов и донора оксида азота (NO) для лечения АГ.

АГ - комплексная патология сердечно-сосудистой системы, при которой в течение длительного времени наблюдается увеличение артериального давления (АД) как во время систолы, так и в период диастолы в покое. Согласно статистическим данным, этому заболеванию подвержены 20-30% взрослого населения в мире, причем с возрастом распространенность заболевания значительно увеличивается [1]. В силу полиэтиологической природы возникновения АГ, в настоящий момент существует ряд стратегий компенсации увеличенного АД, которые, зачастую, для улучшения эффектов, комбинируют между собой в составе комплексной терапии. Из патента на изобретение RU 2073485 (СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ НИТРАТОВ И СИДНОНИМИНОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СТЕНОКАРДИИ) известно, что применение нитратов хорошо сказывается на качестве уровня жизни и частично компенсирует нарушения сердечной проводимости, возникающие у пациентов со стенокардией. Кроме того, известно применение нитратов в качестве лекарственных средств против сердечной недостаточности, отягощенных ишемической болезнью сердца (а.с. СССР №1503819, опубл. 30.08.89 г.; а.с. СССР №1685453, опубл. 23.10.91 г.).

Совместное использование одновременно β-адреноблокатора (метопролола) и антагониста мускариновых рецепторов - атропина предлагается для эффективной вегетативной блокады сердца в диагностических целях в патенте RU 2572339 (СПОСОБ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ ВЕГЕТАТИВНОЙ БЛОКАДЫ СЕРДЦА). Основное преимущество комбинирования заключалось в уменьшении количества ложноположительных результатов при проведении исследований, что приводило к исключению гипердиагностики состояний, связанных с заболеванием проводящей системы сердца. Исследований по терапии / коррекции патологических состояний (АГ, ишемическая болезнь сердца, миокардиальная гипертрофия и т.д.) комбинацией β-адреноблокатор + атропин в данном случае не проводилось.

Наиболее используемым способом лечения ХСН является способ, рекомендованный в 2003 г. Российским Обществом Специалистов по Сердечной Недостаточности (Национальные рекомендации по диагностике и лечению ХСН, ж. "Сердечная недостаточность", 2003 г., т. 4, №6), в котором в качестве основных средств медикаментозной терапии ХСН рекомендованы следующие группы препаратов: ингибиторы АПФ, β-адреноблокаторы, диуретики, ингибиторы альдостерона.

Эффективность приема β-адреноблокаторов показана широким спектром когортных исследований, а механизм действия сводится к блокаде β-адренергических рецепторов (β-АР) в гладкомышечной ткани сосудов и рабочих клетках миокарда [2]. β-адреноблокаторы вызывают опосредованное гипотензивное действие посредством снижения частоты сердечных сокращений и сердечного выброса. Установлено, что некоторые из них эффективны в задачах по предупреждению и улучшению прогноза при ишемической болезни сердца [3]. Прием β-адреноблокаторов повышает среднюю продолжительность жизни при ХСН, асимптоматической дисфункции левого желудочка и у больных, перенесших инфаркт миокарда [4]. Из-за широкого распространения β-АР в периферических тканях, где они участвуют в регуляции ряда физиологических функций, «одномерная» терапия β-адреноблокаторами может вызывать нежелательные побочные эффекты. Например, наиболее известным из них является бронхоспазм, в связи с чем, большинство врачей не рекомендуют назначение β-адреноблокаторов для снижения АД при хронической обструктивной болезни легких и/или бронхиальной астме [5]. Основное показание к их назначению - комплексная терапия при сердечной недостаточности или асимптоматической дисфункции левого желудочка и различные формы тахиаритмий, связанных с гиперактивацией синтеза катехоламинов при развитии и течении АГ. В клинической практике β-адреноблокаторы часто используют совместно с тиазидными диуретиками, что дает обнадеживающие результаты в поддерживающей терапии при АГ [6]. Однако, тиазидные диуретики негативно влияют на ряд метаболических показателей углеводного и жирового обменов, из-за чего комбинация β-адреноблокаторов и тиазидных диуретиков нежелательна для лиц с метаболическим синдромом и/или нарушениями энергетического метаболизма [7, 8]. В большом рандомизированном исследовании ASCOT BPLA, было обнаружено повышение уровня триглицеридов и снижение липопротеинов высокой плотности в сыворотке крови при совместном применении β-адреноблокаторов и тиазидных диуретиков. Помимо этого, почти на треть чаще возникал сахарный диабет II типа [9]. Тем не менее, комбинация β-адреноблокатора бисопролола и гидрохлоротиазида для лечения АГ зарегистрирована под коммерческим названием "Лодоз".

Еще одним, часто применяемым в клинической практике является комбинирование β-адреноблокаторов с блокаторами потенциал-зависимых Са²⁺-каналов (группа "медленных" Са²⁺-антагонистов или блокаторов) [10]. Са²⁺-блокаторы метаболически нейтральны [7, 8], и способны в некоторых случаях уменьшать степень поражения органов-мишеней при АГ [11]. На данный момент, коммерчески реализуемый препарат Са²⁺-блокатора (амлодипина) и β-адреноблокатора бисопролола является зарегистрированным под названием "Конкор AM" и используется в клинической практике.

Из патента RU 2304964 (СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ) известно, что дополнение к рекомендуемой, исходя из класса/степени тяжести ХСН, терапии, осуществляемой β-адреноблокаторами / ингибиторами ангиотензин-превращающего фермента / диуретиками / ингибиторами альдостерона, цитопротектора «Мексикора» (действующее вещество - этилметилгидроксипиридина сукцинат) приводит к улучшение прогноза и качества жизни пациентов с ХСН. Действие «Мексикора» в дозировке 0.1 мг/сутки связано с его неспецифической антиоксидантной и антигипоксической активностью, приводящей к снижению повреждений миокардиальных и гладкомышечных тканей свободными радикалами.

В настоящем патенте переход к «многомерной» терапии ХСН, АГ и связанных с их течением кардиоваскулярных патологий включает одновременное применение β-адреноблокаторов, α₂-адренергических агонистов и донора NO. α₂-адренорецепторы первоначально были обнаружены в центре контроля кровяного давления в продолговатом мозге, чья активация клонидином вызывала устойчивый гипотензивный и умеренный брадикардический эффект [12]. Наряду с этим, центральная активация α₂-адренорецепторов обладала некоторыми нежелательными побочными эффектами, в частности, сонливость, сухость во рту, одышка, седативный эффект [13]. На данный момент, агонисты α₂-адренорецепторов ограниченно применяются в клинической практике для лечения некоторых невропатических болей и состояний, премедикативных средств для ряда наркозов в анестезиологии, реже - как гипотензивные препараты первого поколения. Ограничения использования α₂-адреноагонистов для терапии АГ связаны, как упоминалось выше, с их выраженными побочными эффектами.

Недавно, на сарколемме одиночных кардиомиоцитов нами были обнаружены белки всех трех известных на данный момент подтипов α₂-адренорецепторов (α_2A, α_2B, α_2C) [14]. Обнаруженные α₂-адренорецепторы являются функционально активными по отношению к регуляции потенциал-зависимых Са²⁺-каналов и внутриклеточной концентрации ионов кальция, как основного посредника, определяющего порог и силу сокращения клеток миокарда. Так, активация α₂-адренорецепторов гуанабенцем снижает как плотность потенциал-зависимых Са²⁺-токов, так и уровень внутриклеточного Са²⁺ в одиночных кардиомиоцитах [14]. В данной заявке предлагается одновременное использование комбинации β-адреноблокаторов, α₂-адреноагонистов и донора NO для более эффективного контроля сердечной сократимости в основе комплексного лечения ХСН, АГ, а также связанных с ними патологических состояний (желудочковая гипертрофия, ишемическая болезнь сердца, аритмии различного генеза, стенокардия).

Так же, как и «одномерная» терапия β-адреноблокаторами, применение α₂-адреноагонистов или донора NO не всегда эффективно решает задачи компенсации означенных сердечно-сосудистых патологий. Применение α₂-адреноагонистов в настоящий момент сильно ограничено из-за достаточно высоких доз, применение которых необходимо для пересечения гематоэнцефалического барьера и достижения эффективной концентрации действующих соединений в центре кровяного давления в мозге [15]. Предлагаемый здесь впервые подход к использованию α₂-адреноагонистов отличается тем, что основывается на полученных нами данных, что мишени их действия локализованы непосредственно в миокардиальных клетках. Соответственно, для локально-миокардиального действия требуются меньшие дозы α₂-адреноагонистов, что, в свою очередь, будет минимизировать их побочные эффекты.

В работах [16, 17] нами было обнаружено усиление совместного действия β-адреноблокады и аппликации α₂-адреноагониста гуанабенца в отношении уменьшения плотности потенциал-зависимых Са²⁺-токов в кардиомиоцитах. Данный факт позволит существенно снизить эффективные дозы α₂-адреноагонистов и β-адреноблокаторов, ослабляя их возможные нежелательные эффекты. Кроме того, эксперименты на миокардиальных тканях показывают, что совместная аппликация α₂-адреноагониста и донора NO потенцируют активность серин/треониновых фосфатаз, что также способствует дополнительному снижению Са²⁺-токов и уменьшении нагрузки на сердце.

Хорошо известно, что поток ионов кальция через потенциал-управляемые Са²⁺-каналы определяет высвобождение Са²⁺, запасенного во внутриклеточных депо (так называемое Са²⁺-индуцируемый Са²⁺-выброс). Скачкообразное и кратковременное повышение Са²⁺ в цитоплазме запускает акт механохимического сопряжения в сердечной мышце, приводящий к ее сокращению при действии физиологических стимулов [18]. Периодически возникающие и/или длительные сбои в регулировке работы миокардиальных потенциал-управляемых Са²⁺-каналов, в конечном счете, приводят к инициации патофизиологических состояний (нефункциональная гипертрофия миокарда, аритмии разного генеза, нарушения проводимости отделов сердца, ХСН) [19]. Важнейшим нейрогуморальным регулятором Са²⁺-токов в сердечных клетках являются вырабатываемые надпочечниками катехоламины (норадреналин и адреналин), чья продукция резко увеличивается в момент стресс-реакции "сражайся или спасайся бегством" ("fight-or-flight"). Пролонгированное повышение концентраций катехоламинов, в плазме крови, возникающее при психоэмоциональных перегрузках, может модифицировать кинетические свойства Са²⁺-токов, приводя к изменениям чувствительности Са²⁺-каналов в отношении физиологических стимулов. В конечном счете, нарушения нормально-физиологической Са²⁺-сигнализации в сердечных клетках ведет к возникновению кардиоваскулярных патологий. Например, установлено, что вольт-амперные характеристики потенциал-управляемых Са²⁺-каналов L-типа в кардиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс (линия SHR) почти на 10 мВ сдвинуты в сторону гиперполяризованных потенциалов в сравнении с нормотензивным контролем [19]. Смещение вольт-амперных кривых влево означает тот факт, что реальный порог физиологического стимула для удаления канального воротного блока (а соответственно -и открытия Са²⁺-канала) снижен, и старт потенциала действия наблюдается при меньшей амплитуде стимула. Измененная активность потенциал-управляемых Са²⁺-каналов также характерна для атриальных кардиомиоцитов и гладких мышц сосудов у SHR крыс, что сопряжено с увеличенным Са²⁺-входом, который может приводить к кальциевой перегрузке и усилению тяжести течения сердечно-сосудистых патологий [20, 21]. Помимо этого, в сердцах спонтанно-гипертензивных крыс повышена экспрессия функционального белка Са²⁺-каналов L-типа [19], а текущие исследования обнаружили изменения в регуляции статуса фосфорилирования потенциал-управляемых Са²⁺-каналов [22]. В частности, блокада РКА-зависимого фосфорилирования или аппликация β-адреноблокаторов улучшали некоторые показатели в ряде моделей АГ, например, уровень систолического и диастолического АД, отношение массы левого желудочка к общей массе сердца, общее и периферическое сопротивление сосудов [23].

Кроме того, известны кардиопротекторные свойства оксида азота. Посредством активации цитозольной гуанилатциклазы и далее циклогуанозинмонофосфат (цГМФ) - протеинкиназа G-сигнального пути и/или прямого нитрозилирования белков-мишеней, NO способствует релаксации мышечной ткани, расслаблению стенок кровеносных сосудов, снижению сосудистого сопротивления, что вызывает стойкий гипотензивный эффект. Кроме того, некоторые доноры NO (нитроглицерин, нитраты) давно применяют для снятия острых приступов стенокардии, а из клинических исследований известно его торможение миокардиальной гипертрофии за счет воздействия на кальцинейрин/NFAT сигнальный путь [24]. Ранее нами было установлено, что NO кроме всего прочего, способствует усилению закачивания кальция в ретикулум посредством Са²⁺-АТФазы саркоплазматического ретикулума (SERCA). Активация SERCA способствует эффективной утилизации кальция из цитозоля, что обеспечивает более полное расслабление миокардиальных клеток и предотвращает их от возникновения Са²⁺-перегрузок.

Результаты собственных исследований

Действие агадреноагонистов на фоне стимуляции β-адренергической сигнализации

Гуанабенц (10 мкМ) сам по себе вызывает снижение потенциал-зависимых Са²⁺-токов на 31.3±4.2% относительно контрольного уровня (n=8, рис. 1а, б). Анализ стационарной (steady-state) кинетики активации/инактивации Са²⁺-токов при аппликации гуанабенца показывает, что он значительно смещает активационную кривую вправо, более чем на 2 мВ (с -18.9±0.3 мВ в контроле до -16.2±0.3 мВ в присутствии гуанабенца, р≤0.05, n=8, рис. 1в, штриховые линии), практически не влияя на кинетические параметры инактивации (-20.6±0.5 мВ vs. 21.2±0.4 мВ, р≥0.05, рис. 1в, сплошные линии). Значения slope-коэффициентов для кривой активации также достоверно отличаются (6.07±0.06 vs. 4.77±0.07, р≤0.05). Полученные данные свидетельствуют о том, что механизм ингибирования Са²⁺-каналов при активации α₂-адренорецепторов гуанабенцом, вероятно, связан с его действием на открытое состояние канала и почти не затрагивает кинетику канальной инактивации и/или закрытое состояние Са²⁺-канального комплекса. Гуанабенц также был эффективен в экспериментах по моделированию адренергического стресса с использование синтетического β-агониста. Агонист β-АР - изопротеренол (1 мкМ) стимулировал амплитуду входящих потенциал-зависимых Са²⁺-токов на 186.0±15.0% относительно контрольного уровня, n=12, рис 1г, д).

Резкое увеличение амплитуды и плотности входящего в клетку Са²⁺-тока сопровождалось также достоверным снижением времени полуинактивации канальных комплексов с 14.5±1.9 мс в контроле до 8.7±1.6 мс в присутствии изопротеренола (р≤0.05, рис. 1е). Очевидно, что такой механизм позволяет несколько снизить входящий поток ионов кальция, хоть и недостаточен для того, чтобы справиться с состоянием кальциевой перегрузки, возникающей в цитозоле кардиомиоцитов из-за аппликации β-агониста. Активация α₂-адренорецепторов гуанабенцем частично обращает действие изопротеренола, амплитуда Са²⁺-токов снижается почти вдвое против изопротеренол-индуцируемого уровня (повышение на 75.3±6.9%), хоть и не возвращается к базальным значениям (n=5, р≤0.05, рис. 16, в). Гуанабенц достоверно не влиял на величину полуинактивации Са²⁺-канальных комплексов (12.9±1.9 мс, р≥0.05, рис. 1е), однако был способен увеличивать время достижения половины пиковой амплитуды при действии изопротеренола до значений, достоверно не отличимых от контроля (12.3±1.8 vs. 14.2±2.1 в контроле, р≥0.05, рис. 1е). Таким образом, активация α₂-адренорецепторов оказывается полезной при пролонгированной чрезмерной стимуляции β-адренергической системы. Несмотря на то, что при действии исследуемых агонистов, индуцированные изопротеренолом Са²⁺-токи сохранялись на большем уровне, чем базальные, их частичная компенсация в сторону снижения амплитуды за счет влияния на проводимость Са²⁺-каналов представляется важной, как с функциональной, так и фармакологической точек зрения.

Участие протеинкиназы A (РКА) в реализации эффектов α₂-адреноагонистов

Далее был исследован возможный механизм ингибирования β-АР-сигнализации в отношении потенциал-чувствительных Са²⁺-токов через α₂-адренорецепторы. Установлено, что принципиальные эффекты β-агонистов в значительной степени опосредуются РКА [2, 3]. Если сигнальные пути от α₂-адренорецепторов, в конечном счете, приводят к подавлению РКА-опосредованного увеличения Са²⁺-токов, логично предположить, что действие их агонистов на фоне блокирования данной протеинкиназы будет отсутствовать или выражаться существенно меньше. Для проверки этой гипотезы, нами был использован специфический РКА-блокатор - соединение Н 89. Добавление Н 89 (5 мкМ) в камеру само по себе приводило к некоторому ингибированию потенциал-управляемых Са²⁺-токов на 37.4±5.2% от контроля, показывая, таким образом, что базальный уровень активности РКА в цитозоле кардиомиоцитов весьма важен для их нормальной функциональности (рис. 2а, б).

Стоит также отметить, что Н 89 достоверно увеличивал время полуинактивации Са²⁺-каналов с 14.5±1.9 мс в контроле до 22.5±2.2 мс (n=10, р≤0.05, рис. 2в). Вероятно, замедление кинетики инактивации Са²⁺-каналов было связано со снижением их уровня фосфорилирования и явилось компенсаторным эффектом в ответ на сниженное поступление Са²⁺ из экстраклеточного раствора. Замедленная кинетика инактивации, индуцируемая соединением Н 89, сохранялась и при последующей аппликации α₂-адреноагониста гуанабенца: (20.8±2.1 мс, n=5, р≥0.05 vs. Н 89).

На фоне Н 89 гуанабенц оказался способен эффективно подавлять амплитуду и плотность входящих Са²⁺-токов в размере, сопоставимом с его действием в одиночку, значения амплитуды Са²⁺-токов снижались до 37.8±5.2% (n=5, р≤0.05, рис. 2б). Полученные результаты свидетельствуют о том, что активация α₂-адренорецепторов снижает входящие через потенциал-управляемые Са²⁺-каналы токи, вероятно, не через блокаду активности РКА, а посредством иного, альтернативного механизма. Этот механизм аддитивен действию блокады РКА-зависимого фосфорилирования, и, по-видимому, не связан с G-белок-опосредуемой регуляцией активности аденилатциклазы. Установлено, что изменения внутриклеточной концентрации Са²⁺ тесным образом коррелируют с флуктуациями синтеза сигнальной молекулы оксида азота (NO) [14]. NO может стимулировать активность цитоплазматической гуанилатциклазы, продуцирующей циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ), а также, может прямо нитрозилировать таргетные белки (включая ионные каналы) и модулировать, таким образом, их функциональный статус [24]. Нитрозилирование потенциал-управляемых Са²⁺-каналов по-разному влияет на их общеканальную проницаемость для Са²⁺. Это зависит от положения аминокислотного остатка цистеина, по которому происходит нитрозилирование, в структуре белка (в порообразующей или регуляторных субъединицах), конкретного подтипа каналов, клеточной специфичности и ее физиологического состояния, концентрации свободного Са²⁺ в цитозоле и т.д. [24].

Действие α₂-адреноагонистов на Са²⁺-токи является NO-зависимым

На рис. 3 представлены результаты по действию гуанабенца на фоне блокатора изоформ NO-синтаз - 7NI (2 мкМ). В используемой концентрации, 7NI практически не влиял ни на базальный уровень Са²⁺-токов (95.6±3.7%, р≥0.05, рис. 3а), ни на величину канальной полуинактивации (15.3±2.4 мс vs. 14.5±1.9 мс в контроле, р≥0.05). Подача в экспериментальную камеру 10 мкМ гуанабенца на фоне 7NI приводила к существенно менее выраженному снижению амплитуды Са²⁺-токов (13.1±3.1% vs. 31.3±4.2%, р≤0.05, n=5, рис. 3а). Эти результаты подтвердились и при прямом измерении продукции NO с использованием высокоспецифичного NO-чувствительного зонда - 4'5'-диаминофлуоресцеин диацетата (DAF-FM). Аппликация 10 мкМ гуанабенца увеличивала уровень NO на 54.5±9.0% (рис. 3б, в).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что в механизмы снижения индуцированных изопротеренолом потенциал-зависимых Са²⁺-токов α₂-адреноагонистами вовлекается NO-опосредуемая сигнальная система.

Роль серин/треониновых протеинфосфатаз в реализации эффектов α₂-адреноагон истов

При активации α₂-адренорецепторов происходит стимуляция гуанилатциклазы и синтез цГМФ [24]. цГМФ является еще одним внутриклеточным мессенджером, который может активировать некоторые изоформы серин/треониновых протеинфосфатаз [25]. Дефосфорилирование потенциал-управляемых Са²⁺-каналов фосфатазами (преимущественно изоформами 1 и 2А, РР1 и РР2А) по остаткам серина и/или треонина - не менее важный фактор регулировки Са²⁺-токов в сердечных клетках, чем протеинкиназные влияния [26]. Поэтому, мы предположили, что в действие α₂-адреноагонистов могут вовлекаться фосфатазы, меняя, таким образом, киназно-фосфатазный баланс. Для проверки вовлеченности РР1 и/или РР2А в сигнализации, запускаемой от α₂-адренорецепторов, был использован общий ингибитор указанных протеинфосфатаз - каликулин А (0.5 мкМ). Его подача в экспериментальную камеру приводила к двукратному увеличению амплитуды (плотности) потенциал-управляемых Са²⁺-токов (на 95.6±7.8%, n=10), что, вероятно, было связано со сдвигом киназно-фосфатазного равновесия в сторону фосфорилирования (рис. 4а, б).

Несмотря на повышенные значения амплитуды токов, входящих в клетку при действии каликулина А через потенциал-зависимые Са²⁺-каналы, константа канальной полуинактивации достоверно увеличивалась до 20.8±2.6 мс (vs. 14.5±1.9 мс в контроле, n=5, р≤0.05, рис. 4в), что говорит о замедлении перехода каналов в инактивированное состояние, индуцируемое блокадой статуса дефосфорилирования. Действие гуанабенца (10 мкМ) на фоне каликулина А существенно ослабляется (снижение Са²⁺-токов на 12.6±4.1%, n=5, рис. 4б), что достоверно не отличается от действия ингибитора протеинфосфатаз в одиночку, и свидетельствует о вовлечении активности фосфатаз в α₂-адренорецептор-опосредуемую сигнализацию. Гуанабенц предотвращал вызванное каликулином А замедление перехода Са²⁺-каналов в инактивированное состояние, возвращая его к значениям не отличающимся от контроля (17.6±2.5 мс, р≥0.05, n=5, рис. 4в).

Для подтверждения участия фосфатаз в действии α₂-адреноагонистов были проведены прямые измерения активности серин/треониновых фосфатаз в миокардиальной ткани. Гуанабенц дозо-зависимым образом увеличивает в миокарде величину фосфатазной реакции (рис. 5).

В концентрациях 10 и 20 мкМ он повышает общую активность серин/треониновых фосфатаз на 21.0±3.6% (n=4, р≤0.05) и 33.0±5.0% (n=5, р≤0.05), соответственно. Для дополнительного валидирования протокола определения фосфатазной активности, был использован прямой донор NO - SNAP (S-нитрозо-N-ацетил-пеницилламин), который, как известно, увеличивает активность РР2А, РР2В и некоторых других фосфатаз. SNAP (100 мкМ) повышал величину фосфатазной реакции на 15.5±7.8% (n=5, р≤0.05, рис. 5), и его совместная аппликация с 20 мкМ гуанабенца проявляла синергизм их действия: активность серин/треониновых фосфатаз увеличивалась на 66.0±23.0%. Таким образом, активация α₂-адренорецепторной системы в условиях гиперактивации β-адренорецепторов в кардиомиоцитах, РКА-независимо снижает потенциал-управляемые Са²⁺-токи, и ключевыми механизмами наблюдаемого подавления проницаемости Са²⁺-каналов является синтез NO и стимуляция серин/треониновых фосфатаз.

Внутриклеточный уровень Са²⁺ и α₂-адреноагонисты

α₂-Адреноагонисты сами по себе снижают внутриклеточный уровень свободного кальция в кардиомиоцитах. Гуанабенц дозо-зависимым образом снижал [Ca²⁺]_jn на 3.1±2.2% (n=6), 28.0±6.3% (n=8), 48.9±7.3% (n=6), 64.9±11.2% (n=8) в концентрациях 1, 10, 20 и 50 мкМ, соответственно (рис. 6а). Кривая дозо-зависимости действия гуанабенца хорошо аппроксимировалась стандартным уравнением Хилла с константой полуингибирования IC₅₀=13.2±1.3 мкМ, максимальным уровнем ингибирования 27.0±4.7% относительно контроля, и коэффициентом Хилла, равным 1.6±0.2.

Эффект гуанабенц ацетата предотвращался на фоне блокатора α₂-адренорецепторов - раувольсцина (с 64.9±11.2% - для концентрации 50 мкМ до 11.6±8.3%, n=7, р≤0.05, рис. 6б, г), и ингибиторов сопряженного с этими рецепторами сигнального пути, вортманнина для фосфатидилинозитол-3-киназы (до 13.6±7.8%, n=9, р≤0.05, рис. 6в, г) и Akt1/2 киназы ингибитора (до 5.4±6.6%, n=7, р≤0.05, рис. 6в, г). Полученные данные указывают на важность α₂-адренорецепторов для регуляции внутриклеточного уровня кальция в кардиомиоцитах, и, судя по отсутствию в кардиологической литературе статей, посвященных этому вопросу, являются первой прямой демонстрацией влияния агонистов α₂-адренорецепторов на [Са²⁺]_in в клетках сердечной мышцы.

Установлено, что NO, изначально открытый как эндотелий-релаксирующий фактор, расслабляет гладкомышечные клетки сосудов и мышечную ткань миокарда. Ряд NO-высвобождающих доноров хорошо известны в клинической практике для купирования острых приступов стенокардии, аритмиях разного генеза и повышению расслабляемости миокарда. Кроме того, нами обнаружено, что NO приводит к повышению активности Са²⁺-АТФазы саркоплазматического ретикулума (SERCA), что в конечном счете, снижает уровень свободного кальция и препятствует Са²⁺-перегрузке сердечных клеток (рис. 7). В модельных животных спонтанно-гипертензивных крыс (SHR) способность NO стимулировать SERCA существенно снижена (рис. 7), что могло бы быть решено за счет экзогенного введения доноров NO. Особенно актуально рассматривать эту возможность исходя из установленного антигипертрофического действия NO, когда регулярное введение приводит к регрессии увеличенной мышечной ткани миокарда, а соотношение массы левого желудочка к массе сердца ревертируется к контрольным значениям. Кроме того, в работе [27] было показано, что α₂-адреноагонист гуанабенц предотвращал возникновение аритмии, вызванное высокими доза изопротеренола или индукторами массового Са²⁺-выброса из депо - тапсигаргина и туникамицина.

Таким образом, доноры NO потенцируют эффекты α₂-адреноагонистов, повышая эффективность функционирования сердечных клеток. Синергизм их действия позволяет снизить эффективные дозы для приема, что минимизирует риски и/или возможные побочные действия.

Технический результат настоящего изобретения заключается в том, что использование композиции обеспечивает синергизм совместного действия β-адреноблокаторов и α2-адренергических агонистов, который позволит снизить эффективные терапевтические дозы каждого из соединений, что неизбежно приведет к минимизации возможных побочных эффектов, связанных с приемом данных соединений, а третий компонент в виде донора NO потенцирует действие α2-адренергических агонистов в отношении активации серин/треониновых фосфатаз, что приводит к более эффективному контролю над сократимостью миокарда и снижает риски возникновения кальциевой перегрузки рабочих кардиомиоцитов, предотвращая развитие патологических событий в сердце.

Преимущества по сравнению с имеющимися аналогами:

1) Синергизм (усиление) совместного действия α2-адреноагонистов и β-адреноблокаторов позволит снизить эффективные терапевтические дозы каждого из соединений, что неизбежно приведет к минимизации возможных побочных эффектов, связанных с приемом данных соединений.

2) Синергизм (усиление) совместного действия α2-адреноагонистов и донора NO позволит дополнительно снизить эффективные дозы α2-адреноагонистов, что в еще большей степени уменьшит нежелательные побочные реакции.

Преимущества фиксированных комбинаций препаратов в одной таблетке ранее были исследованы и показана их эффективность. Так, Egan и соавт. обнаружили, что использование фиксированной комбинации, в отличие от свободной комбинации тех же препаратов, приводит к значительному улучшению контроля уровня артериального давления [10], а по данным метаанализа Gupta и соавт. к повышению приверженности больных терапии [28].

Литература.

[1] World Health Statistics 2016: Monitoring health for the SDGs. Geneva: World Health Organization; 2016. http://www.who.int/gho/publications/world_health_statistics/2016/en/

[2] O.E. Brodde, Beta-adrenoceptor blocker treatment and the cardiac beta-adrenoceptor-G-protein(s)-adenylyl cyclase system in chronic heart failure, Naunyn Schmiederbergs Arch. Pharmacol. 374 (2016) 361-372.

[3] A. Cannavo, G. Rengo, D. Liccardo, A. Pun, E. Gao, A.J. George, G. Gambino, A. Rapacciuolo, D. Leosco, B. Ibanez, N. Ferrara, N. Paolocci, W.J. Koch, Pi-Blockade Prevents Post-Ischemic Myocardial Decompensation Via PsAR-Dependent Protective Sphingosine-1 Phosphate Signaling, J. Am. Coll. Cardiol. 70 (2017) 182-192.

[4] J. Hong, A.R. Barry, Long-term beta-blocker therapy after myocardial infarction in the reperfusion era: a systematic review, Pharmacotherapy 38 (2018) 546-554.

[5] J.G. Baker, R.G. Wilcox, β-blockers, heart disease and COPD: current controversies and uncertainties, Thorax 72 (2017) 271-276.

[6] L. Hansson, L.H. Lindholm, T. Ekbom, B. Dahlof, J. Lanke, B. Schersten, P.O. Wester, T. Hedner, U. de Faire, Randomised trial of old and new antihypertensive drugs in elderly patients: cardiovascular mortality and morbidity the Swedish Trial in Old Patients with Hypertension-2 study, Lancet 354 (1999) 1751-1756.

[7] Brook R.D., Mechanism of Differential Effects of Antihypertensive Agents on Serum Lipids, Curr Hypertens Rep. 2 (2000) 370-377.

[8] J.H. Karnes, R.M. Cooper-DeHoff, Antihypertensive medications: benefits of blood pressure lowering and hazards of metabolic effects, Expert Rev Cardiovasc Ther. 7 (2009) 689-702.

[9] B. Dahlof, P.S. Sever, N.R. Poulter et al., Prevention of cardiovascular events with an antihypertensive regimen of amlodipine adding perindopril as required versus atenolol adding bendroflumethiazide as required, in the Anglo-Scandinavian Cardiac Outcomes Trial-Blood Pressure Lowering Arm (ASCOT-BPLA): a multicentre randomised controlled trial, Lancet. 366 (2005) 895-906.

[10] B.M. Egan, D. Bandyopadhyay, S.R. Shaftman et al., Initial monotherapy and combination therapy and hypertension control the first year, Hypertension. 59 (2012) 1124-1131.

[11] A.U. Klingbeil, M. Schneider, P. Martus et al., A meta-analysis of the effects of treatment on left ventricular mass in essential hypertension, Am J Med. 115 (2003) 41-46.

[12] A. Ally, Cardiovascular effects of intravenous administration of clonidine in conscious cats, Brain Res. 810 (1998) 153-160.

[13] C.C. Lang, C.M. Stein, H.B. He, et al., Blunted blood pressure response to central sympathoinhibition in normotensive blacks: increased importance of nonsympathetic factors in blood pressure maintenance in blacks, Hypertension. 30 (1997) 157-162.

[14] A.V. Maltsev, Y.M. Kokoz, E.V. Evdokimovskii, et al., Alpha-2 adrenoceptors and imidazoline receptors in cardiomyocytes mediate counterbalancing effect of agmatine on NO synthesis and intracellular calcium handling, J. Mol. Cell. Cardiol. 68 (2014) 66-74.

[15] P.A. van Zwieten, Centrally acting antihypertensives: a renaissance of interest. Mechanisms and haemodynamics, J. Hypertens. Suppl. 15 (1997) S3-8.

[16] Y.M. Kokoz, E.V. Evdokimovskii, A.V. Maltsev, et al., Sarcolemmal α₂-adrenoceptors control protective cardiomyocyte-delimited sympathoadrenal response, J. Mol. Cell. Cardiol. 100 (2016) 9-20.

[17] A.B. Мальцев, Ю.М. Кокоз, Периферические эффекты взаимодействия α2-адренергических и имидазолиновых агонистов в изолированных кардиомиоцитах, Кардиология. 59 (2019) 52-63.

[18] D.M. Bers, Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes, Annu. Rev. Physiol. 70 (2008) 23-49.

[19] Z.Z. Tang, P. Liao, G. Li, et al., Differential splicing patterns of L-type calcium channel Ca_V 1.2. subunit in hearts of Spontaneously Hypertensive Rats and Wistar Kyoto Rats, Biochim. Biophys. Acta 1783 (2008) 118-130.

[20] L. Shi, H. Zhang, Y. Chen, et al., Chronic exercise normalizes changes in Ca_V 1.2 and K_Ca 1.1 channels in mesenteric arteries from spontaneously hypertensive rats, Br. J. Pharmacol. 172 (2015) 1846-1858.

[21] F. Pluteanu, J. Heβ, J. Plackic, et al., Early subcellular Ca²⁺ remodelling and increased propensity for Ca²⁺ alternans in left atrial myocytes from hypertensive rats, Cardiovasc. Res. 106 (2015) 87-97.

[22] M. Poomvanicha, J. Matthes, K. Domes, et al., Beta-adrenergic regulation of the heart expressing the Ser1700A/Thr1704A mutated Ca_V 1.2 channel, J. Mol. Cell. Cardiol. 111 (2017)10-16.

[23] S.M. MacDonnell, H. Kubo, D.L. Crabbe, et al., Improved myocardial beta-adrenergic responsiveness and signaling with exercise training in hypertension, Circulation 111 (2005)3420-3428.

[24] R. Fischmeister, L. Castro, A. Abi-Gerges, et al., Species- and tissue-dependent effects of NO and cyclic GMP on cardiac ion channels, Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 142 (2005) 136-143.

[25] D. Zhuang, A.C. Ceacareanu, B. Ceacareanu, et al., Essential role of protein kinase G and decreased cytoplasmic Ca²⁺ levels in NO-induced inhibition of rat aortic smooth muscle cell motility, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288 (2005) 1859-1866.

[26] W.H. duBell, T.B. Rogers, Protein phosphatase 1 and an opposing protein kinase regulate steady-state L-type Ca²⁺ current in mouse cardiac myocytes, J. Physiol. 556 (2004) 79-93.

[27] C. Neuber, J. Uebeler, T. Schulze, et al., Guanabenz interferes with ER stress and exerts protective effects in cardiac myocytes, PLoS One. 9 (2014) e98893. doi: 10.1371/journal.pone.0098893.

[28] A.K. Gupta, S. Arshad, N.R. Poulter, Compliance, safety, and effectiveness of fixed-dose combinations of antihypertensive agents: a meta-analysis, Hypertension. 55 (2010) 399-407.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и представляет собой лекарственную композицию, предназначенную для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Данная композиция может применяться для лечения в комплексной терапии ишемической болезни сердца, хронической сердечной недостаточности, артериальной гипертензии, гипертрофии миокарда, нарушений ритма различного генеза, кардионевроза. Основой предлагаемой композиции является совместное использование β-адреноблокаторов, α₂-адреноагонистов, а также донора оксида азота (NO), что при совместном использовании позволит существенно снизить эффективные терапевтические дозы каждого из соединений за счет двойного синергичного эффекта (β-адреноблокатор + α₂-адреноагонист и α₂-адреноблокатор + донор NO), что, в свою очередь, приведет к минимизации возможных побочных эффектов, связанных с приемом данных соединений. 7 ил.

Композиция для лечения артериальной гипертензии и ассоциированных с ней патологий сердечно-сосудистой системы, состоящая из взятых в терапевтически эффективных количествах β-адреноблокатора, агониста α_2-адренергических рецепторов, донора оксида азота, где β-адреноблокатор выбирают из бисопролола, карведилола, пиндолола, атенолола, лабеталола, где агонист α₂-адренергических рецепторов выбирают из гуанабенца, гуанфацина, дексмедетомидина, тизанидина, клонидина, где донор NO выбирают из 3-нитрозо-N-ацетилпеницилламина, натрия нитропруссида, нитроглицерина, молсидомина.