НОВЫЙ ВАРИАНТ ЦИТРАТСИНТАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ВАЛИНА C ЕГО ПРИМЕНЕНИЕМ Российский патент 2025 года по МПК C12N9/10 C12N15/77 C12P13/08 

Область техники

Настоящее изобретение относится к новому варианту цитратсинтазы, к микроорганизму, включающему этот вариант, и к способу получения L-валина с применением этого микроорганизма.

Предшествующий уровень техники

С целью получения L-аминокислот и других полезных веществ были выполнены различные исследования по созданию микроорганизмов с высокоэффективным продуцированием и технологий для процессов ферментации. Например, широко использовались мишень-специфичные подходы, такие как способ увеличения экспрессии гена, кодирующего фермент, вовлеченный в биосинтез L-валина, или способ удаления гена, ненужного для биосинтеза (US 8465962 В2 и KR 10-2153534 В1).

В то же время цитратсинтаза (CS) представляет собой фермент, который продуцирует цитрат посредством катализа конденсации ацетил-КоА и оксалоацетата, которые образуются в процессе гликолиза микроорганизма, и она является важным ферментом для направления потока углерода в метаболический путь ТСА (трикарбоновые кислоты).

Ранее в литературе (Ooyen et al., Biotechnol. Bioeng., 109(8):2070-2081, 2012) сообщалось о фенотипических изменениях в штаммах, продуцирующих L-лизин, вследствие делеции гена gltA, кодирующего цитратсинтазу. Однако недостатками этих штаммов с делецией гена gltA является не только то, что ингибируется их рост, но также значительно снижается их уровень потребления сахара, что приводит к низкому продуцированию лизина в единицу времени. Соответственно, все еще необходимы дальнейшие исследования, учитывающие как эффективное увеличение продуктивности в отношении L-аминокислот, так и рост штаммов.

Описание изобретения

Техническая задача

В результате интенсивных усилий по получению L-валина с высоким выходом авторы настоящего изобретения завершили эту заявку, подтвердив, что новый вариант цитратсинтазы повышает способность продуцировать L-валин.

Техническое решение

Целью настоящего изобретения является предложение варианта цитратсинтазы, в котором глицин, который представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 413 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменен аспарагиновой кислотой.

Другая цель настоящего изобретения заключается в предложении полинуклеотида, кодирующего вариант по настоящему изобретению.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в предложении микроорганизма рода Corynebacterium, включающего вариант по настоящему изобретению или полинуклеотид, кодирующий этот вариант.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в предложении способа получения L-валина с применением микроорганизма по настоящему изобретению.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в предложении композиции для получения L-валина, включающей микроорганизм по настоящему изобретению; среду, на которой выращивают микроорганизм по настоящему изобретению; или их комбинацию.

Полезные эффекты

При использовании варианта цитратсинтазы по настоящему изобретению L-валин может быть получен с высоким выходом.

Подробное описание предпочтительных воплощений

Далее настоящее изобретение будет описано подробно. В то же время, каждое описание и воплощение, раскрытые в данном документе, могут быть применены к другим описаниям и воплощениям в отношении общих признаков. То есть все комбинации различных элементов, раскрытых в данном документе, входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, объем настоящего изобретения не ограничен конкретным описанием, приведенным ниже. Более того, в настоящем описании изобретения были сделаны ссылки на и процитированы ряд статей и патентных документов. Содержание цитируемых статей и патентных документов во всей их полноте включено в данное описание изобретения посредством ссылки, и уровень области техники, к которой относится настоящее изобретение, и содержание настоящего изобретения будут описаны более определенно.

В одном аспекте настоящего изобретения предлагается вариант цитратсинтазы, в котором глицин, который представляет собой аминокислоту, соответствующей положению 413 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменен аспарагиновой кислотой.

Вариант по настоящему изобретению может представлять собой вариант, в котором аминокислота, соответствующая положению 413 на основе аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, представляет собой аспарагиновую кислоту, и который имеет гомологию или идентичность по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%), 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или 99,7% или более с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1. Например, вариант по настоящему изобретению может представлять собой вариант, в котором аминокислота, соответствующая положению 413 на основе аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, представляет собой аспарагиновую кислоту, и может иметь или включать аминокислотную последовательность, имеющую гомологию или идентичность по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% или 99.7% или более с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, или может состоять или по существу состоять из данной аминокислотной последовательности. Кроме того, очевидно, что любой вариант, имеющий аминокислотную последовательность, в которой часть последовательности удалена, модифицирована, замещена, консервативно замещена или добавлена, также может входить в объем настоящего изобретения, пока аминокислотная последовательность имеет такую гомологию или идентичность и проявляет эффективность, соответствующую таковой у варианта по настоящему изобретению.

Например, это может быть случай, где N-конец, С-конец и/или внутренняя часть аминокислотной последовательности добавлен(а) или удален(а), с последовательностью, которая не изменяет функцию варианта по настоящему изобретению, естественной мутацией, молчащей мутацией или консервативной заменой.

При использовании в данном документе термин "консервативная замена" относится к замене аминокислоты другой аминокислотой, имеющей аналогичные структурные и/или химические свойства. Такая аминокислотная замена, в общем случае, может иметь место на основе подобия полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатка. Обычно консервативные замены могут оказывать незначительное влияние или вообще не оказывать никакого влияния на активность белка или полипептида.

При использовании в данном документе термин "вариант" относится к полипептиду, имеющему одну или более аминокислот, отличных от аминокислотной последовательности этого варианта до мутации посредством консервативных замен и/или модификаций таким образом, что функции и свойства полипептида сохраняются. Такие варианты, в общем случае, могут быть идентифицированы путем модификации одной или более указанных выше аминокислотных последовательностей полипептида и оценки свойств модифицированного полипептида. То есть способность вариантов может быть усилена, не изменена или снижена по сравнению с полипептидом до мутации. Кроме того, некоторые варианты могут включать те, в которых одна или несколько областей, таких как N-концевая лидерная последовательность или трансмембранный домен, удалены. Кроме того, другие варианты могут включать те, в которых удалена область с N- и/или С-конца зрелого белка. Термин "вариант" можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как модификация, модифицированный полипептид, модифицированный белок, мутант, мутеин, дивергент и т.д., если эти термины используются для обозначения мутации. Для цели настоящего изобретения вариант может представлять собой вариант, в котором лизин (Lys, K), который представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 415 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменен гистидином (His, Н).

Кроме того, варианты могут также включать удаление или добавление аминокислот, которые оказывают минимальное влияние на свойства и вторичную структуру полипептида. Например, варианты могут быть конъюгированы с сигнальной (или лидерной) последовательностью на N-конце, вовлеченной в транслокацию белков, котрансляционно или посттрансляционно. Кроме того, варианты также могут быть конъюгированы с другой последовательностью или линкером для идентификации, очистки или синтеза полипептида.

При использовании в данном документе термин "гомология" или "идентичность" относится к степени соответствия двух взятых аминокислотных последовательностей или нуклеотидных последовательностей и может быть выражен в процентах. Термины "гомология" и "идентичность" часто могут быть использованы взаимозаменяемо друг с другом.

Гомология последовательностей или идентичность консервативных полинуклеотидов или полипептидов может быть определена с помощью стандартных алгоритмов выравнивания и может использоваться со штрафом за пробелы по умолчанию, установленным используемой программой. По существу, обычно ожидается, что гомологичные или идентичные последовательности будут гибридизоваться со всеми последовательностями или с частью их в умеренных или очень жестких условиях. Очевидно, что в гибридизацию полинуклеотидов также включена гибридизация с полинуклеотидами, содержащими обычный кодон или вырожденные кодоны.

Имеют ли какие-либо две полинуклеотидные или полипептидные последовательности гомологию, сходство или идентичность, можно, например, определить посредством известного компьютерного алгоритма, такого как программа "FASTA" (Pearson et al., (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444) с использованием параметров по умолчанию. Альтернативно, это может быть определено посредством алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который выполняют с использованием программы Needleman из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (предпочтительно версия 5.0.0 или последующие версии) (пакет программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [et al/, J. MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Мартин Дж. Бишоп, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, и [CARILLO et al.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Например, гомология, сходство или идентичность могут быть определены с помощью BLAST или Clustal W Национального центра биотехнологической информации (NCBI).

Гомология, сходство или идентичность полинуклеотидов или полипептидов могут быть определены, например, путем сравнения информации о последовательностях с использованием, например, компьютерной программы GAP, такой как Needleman et al. (1970), J. Mol Biol. 48: 443, как раскрыто в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. В кратком изложении, программа GAP определяет гомологию, сходство или идентичность в виде значения, полученного путем деления количества аналогично выровненных символов (т.е. нуклеотидов или аминокислот) на общее количество символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать (1) двоичную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичностей и 0 для неидентичностей) и взвешенную матрицу сравнения Gribskov et al. (1986), Nucl. Acids Res. 14:6745, как описано в Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, Национального фонда биомедицинских исследований, стр. 353-358 (1979) (или матрицу замещения EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4)); (2) штраф 3,0 за каждый пробел и дополнительный штраф 0,10 за каждый символ в каждом пробеле (или штраф за открытие пробела в размере 10 и штраф за продление пробела в размере 0,5); и (3) отсутствие штрафа за конечные пробелы.

При использовании в данном документе термин "соответствующий" относится к аминокислотному остатку в положении, указанном в пептиде, или аминокислотному остатку, который подобен, идентичен или гомологичен остатку, указанному в пептиде. Идентификация аминокислоты в соответствующем положении может представлять собой определение конкретной аминокислоты в последовательности, которая относится к конкретной последовательности. При использовании в данном документе термин "соответствующая область" обычно относится к аналогичному или соответствующему положению в родственном белке или в эталонном белке.

Например, любую аминокислотную последовательность выравнивают с SEQ ID NO: 1, и на основе этого выравнивания каждый аминокислотный остаток аминокислотной последовательности может быть пронумерован со ссылкой на пронумерованное положение аминокислотного остатка, соответствующего аминокислотному остатку в SEQ ID NO: 1. Например, алгоритм выравнивания последовательностей, такой как описано в данном документе, может идентифицировать положение аминокислоты или положение, где имеют место модификации, такие как замены, вставки или делеции, по сравнению с запрашиваемой последовательностью (также называемой "эталонной последовательностью").

Пример выравнивания может быть определен с помощью алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который выполняют с использованием программы Needleman из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) и т.д., но без ограничения этим, и могут быть соответствующим образом использованы программы выравнивания последовательностей, такие как алгоритмы попарного сравнения последовательностей и т.д., известные в данной области техники.

При использовании в данном документе термин "цитратсинтаза" относится к ферменту, который продуцирует цитрат посредством катализа конденсации ацетил-КоА и оксалоацетата, которые образуются в процессе гликолиза микроорганизма. Кроме того, цитратсинтаза катализирует реакцию конденсации двухуглеродного ацетатного остатка от ацетил-КоА и молекулы 4-углеродного оксалоацетата с образованием 6-углеродного цитрата. Термин "цитратсинтаза" можно использовать взаимозаменяемо с "ферментом для синтеза цитрата", "CS", "GltA-белок" или "GltA". В настоящем раскрытии последовательность GltA может быть получена из известной базы данных GenBank NCBI. Кроме того, GltA может представлять собой полипептид, имеющий цитратсинтазную активность, кодируемый геном gltA, но без ограничения этим.

Вариант по настоящему изобретению может иметь активность повышения способности продуцирования L-валина по сравнению с полипептидом дикого типа.

Вариант по настоящему изобретению может иметь идентичность последовательности на 80% или более с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.

Кроме того, вариант по настоящему изобретению может включать полипептид, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 3 может представлять собой аминокислотную последовательность, в которой глицин, соответствующий положению 413 в аминокислотной последовательности от положена 362 до положения 413 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменен аспарагиновой кислотой.

Вариант по настоящему изобретению может включать аминокислотную последовательность общей формулы 1, приведенной ниже:

Общая формула 1

X₁N HGGDATX₂FMN KVKNKEDGVR LMGFGHRVYK NYDPRAAIVK ETAHEILEHL GGDDLLDLAI KLEEIALADD X₃FISRKLYPN VDFYTGLIYR AMGFPTDFFT VLFAIGRLPG WIAHYREQLG AADNX₄ (SEQ ID NO: 24),

где в общей формуле 1:

X₁ представляет собой аспарагин или серии;

Х₂ представляет собой аланин или глутаминовую кислоту;

Х₃ представляет собой тирозин или цистеин; и

Х₄ представляет собой лизин или гистидин.

Вариант по настоящему изобретению может иметь идентичность последовательности 90% или более с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, 10, 12 или 14. Кроме того, вариант по настоящему изобретению может включать, состоять или по существу состоять из аминокислотной последовательности, имеющей идентичность последовательности 90% или более с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, 10, 12 или 14. Например, вариант по настоящему изобретению может иметь идентичность последовательности 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 91%, 9%%, 99%, 99,5%, или 99,7% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, 10, 12 или 14, может включать аминокислотную последовательность, имеющую указанную идентичность последовательности, или может состоять или по существу состоять из аминокислотной последовательности, имеющей указанную идентичность последовательности.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему изобретению.

При использовании в данном документе термин "полинуклеотид", который представляет собой полимер из нуклеотидов, состоящий из нуклеотидных мономеров, соединенных в длинную цепь посредством ковалентной связи, представляет собой нить ДНК или РНК, имеющую, по меньшей мере, определенную длину. Более конкретно, он может относиться к фрагменту полинуклеотида, кодирующему этот вариант.

В полинуклеотиде по настоящему изобретению нуклеотиды, соответствующие положениям с 1237 по 1239 на основе последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2, представляют собой GAC, и может быть включен любой полинуклеотид, представленный последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей гомологию или идентичность по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,7%, или 99,9% или более и менее 100%, с последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной SEQ ID NO: 2. Кроме того, очевидно, что любой полинуклеотид, представленный нуклеиновокислотной последовательностью, в которой часть последовательности удалена, модифицирована, замещена, консервативно замещена или добавлена, также может входить в объем настоящего изобретения, до тех пор, пока последовательность имеет такую гомологию или идентичность и кодирует полипептид или белок, проявляющий эффективность, соответствующую эффективности варианта по настоящему изобретению.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может подвергаться различным модификациям в кодирующей области в пределах объема, который не изменяет аминокислотную последовательность варианта по настоящему изобретению, вследствие вырождения кодонов или с учетом кодонов, предпочтительных в организме, в котором должен экспрессироваться вариант по настоящему изобретению. Здесь, в последовательности, имеющей гомологию или идентичность, кодон, кодирующий аминокислоту, соответствующую положению 413 в SEQ ID NO: 1, может представлять собой один из кодонов, кодирующих аспарагиновую кислоту.

Кроме того, полинуклеотид по настоящему изобретению может включать зонд, который может быть получен из известной последовательности гена, например любой последовательности, которая может гибридизоваться с последовательностью, комплементарной всей или части полинуклеотидной последовательности по настоящему изобретению в жестких условиях без ограничения. "Жесткие условия" относятся к условиям, в которых обеспечивается специфическая гибридизация между полинуклеотидами. Такие условия конкретно описаны в литературе (J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8). Например, жесткие условия могут включать условия, в которых полинуклеотиды, имеющие высокую гомологию или идентичность 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, или 99% или более, гибридизуются друг с другом, и полинуклеотиды, имеющие гомологию или идентичность ниже указанных выше гомологий или идентичностей, не гибридизуются друг с другом, или условия промывки саузерн-гибридизации, то есть промывка один раз, конкретно два или три раза при концентрации соли и температуре, соответствующих 60°С, 1 × SSC (раствор хлорида натрия и цитрат натрия), 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), в частности 60°С, 0,1 × SSC, 0,1% SDS и, более конкретно 68°С, 0,1 × SSC, 0,1% SDS.

Гибридизация требует, чтобы две нуклеиновые кислоты содержали комплементарные последовательности, хотя возможны ошибки спаривания между основаниями, в зависимости от жесткости гибридизации. Термин "комплементарный" используют для описания взаимоотношения между нуклеотидными основаниями, которые могут гибридизоваться друг с другом. Например, в контексте ДНК аденин комплементарен тимину и цитозин комплементарен гуанину. Таким образом, полинуклеотид по настоящему изобретению может включать выделенные фрагменты нуклеотидов, комплементарные всей последовательности, а также последовательности нуклеиновых кислот, по существу аналогичные им.

Конкретно, полинуклеотиды, имеющие гомологию или идентичность с полинуклеотидом по настоящему изобретению, могут быть обнаружены с использованием условий гибридизации, включающих стадию гибридизации при значении T_m 55°С в описанных выше условиях. Кроме того, значение T_m может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но не ограничено этим, и может быть соответствующим образом скорректировано специалистами в данной области техники в зависимости от их цели.

Подходящая жесткость для гибридизации полинуклеотидов зависит от длины полинуклеотидов и степени комплементации, и эти переменные хорошо известны в данной области техники (например Sambrook et al.).

В одном примере полинуклеотид по настоящему изобретению может включать полинуклеотид, представленный нуклеиновокислотной последовательностью в положениях с 1084 по 1245 на основе нуклеиновокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, 11 или 13; полинуклеотид, представленный нуклеиновокислотной последовательностью в положениях с 1084 по 1245 на основе нуклеиновокислотной последовательности SEQ ID NO: 15; или полинуклеотид, представленный нуклеиновокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, 11, 13 или 15. В полинуклеотиде по настоящему изобретению вариант является таким, как описано в других аспектах выше.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему изобретению. Вектор может представлять собой экспрессионный вектор для экспрессии полинуклеотида в клетке-хозяине, но не ограничивается этим.

Вектор по настоящему изобретению может включать конструкцию ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего целевой полипептид, функционально связанную с подходящей областью регуляции экспрессии (регуляторной последовательностью экспрессии) таким образом, чтобы обеспечивалась возможность экспрессировать целевой полипептид в подходящей клетке-хозяине. Область регуляции экспрессии может включать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую последовательность оператора для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания мРНК с рибосомой, и последовательность регуляции окончания транскрипции и трансляции. После трансформации в подходящую клетку-хозяина вектор может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина или может интегрироваться в его геном.

Вектор, используемый в настоящем изобретении, конкретно не ограничен и можно использовать любой вектор, известный в данной области техники. Примеры обычно используемого вектора могут включать природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора можно использовать pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A и Charon21A и т.д.; и в качестве плазмидного вектора можно использовать векторы на основе pDZ, pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL и pET и т.д. Конкретно, можно использовать векторы pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117 (Biotechnology letters vol 13, No. 10, p.721-726 (1991), корейский патент №10-1992-0007401), pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC и т.д.

В одном примере полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, может быть встроен в хромосому посредством вектора для внутриклеточной хромосомной вставки. Встраивание полинуклеотида в хромосому можно выполнять посредством любого способа, известного в данной области, например путем гомологичной рекомбинации, но без ограничения этим. Вектор может дополнительно включать селективный маркер для подтверждения встраивания в хромосому. Селективный маркер предназначен для отбора клеток, трансформированных вектором, то есть для подтверждения, была ли встроена целевая молекула нуклеиновой кислоты, и можно использовать маркеры, которые обеспечивают селектируемые фенотипы, такие как лекарственная устойчивость, ауксотрофия, устойчивость к клеточным токсичным агентам или экспрессия поверхностных полипептидов. Только клетки, экспрессирующие селективный маркер, способны выживать или демонстрировать разные фенотипы в среде, обработанной селективным агентом, и таким образом могут быть отобраны трансформированные клетки.

При использовании в данном документе термин "трансформация" относится к введению вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, в клетку-хозяина или микроорганизм таким образом, что полипептид, кодируемый полинуклеотидом, может экспрессироваться в клетке-хозяине. До тех пор, пока трансформированный полинуклеотид может экспрессироваться в клетке-хозяине, не имеет значения, интегрирован ли трансформированный полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина и локализован в ней или расположен вне хромосомы, и могут быть включены оба случая. Кроме того, полинуклеотид может включать ДНК и/или РНК, кодирующие целевой полипептид. Полинуклеотид может быть введен в любой форме, при условии, что он может быть введен в клетку-хозяина и экспрессироваться в ней. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генную конструкцию, включающую все элементы, необходимые для ее автономной экспрессии. Обычно экспрессионная кассета может включать промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, терминатор транскрипции, сайт связывания рибосомы или терминатор трансляции. Экспрессионная кассета может находиться в форме самореплицирующегося вектора экспрессии. Кроме того, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина как есть и функционально связан с последовательностями, необходимыми для экспрессии в клетке-хозяине, но без ограничения этим.

Кроме того, при использовании в данном документе термин "функционально связанный" означает, что полинуклеотидная последовательность функционально связана с промоторной последовательностью, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего целевой вариант по настоящему изобретению.

В векторе по настоящему изобретению вариант и полинуклеотид являются такими, как описано в других аспектах выше.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается микроорганизм рода Corynebacterium, включающий вариант по настоящему изобретению или полинуклеотид по настоящему изобретению.

Микроорганизм по настоящему изобретению может включать вариант по настоящему изобретению, полинуклеотид, кодирующий вариант, или вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему изобретению.

При использовании в данном документе термин "микроорганизм (или штамм)" включает все микроорганизмы дикого типа, или естественно или искусственно генетически модифицированные микроорганизмы, и он может представлять собой микроорганизм, в котором конкретный механизм ослаблен или усилен вследствие введения чужого гена, или усиления или инактивации активности эндогенного гена и т.д., и может представлять собой микроорганизм, включающий генетическую модификацию для получения целевого полипептида, белка или продукта.

Микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, включающий любой один или более вариантов по настоящему изобретению, полинуклеотид по настоящему изобретения и вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему изобретению; микроорганизм, модифицированный для экспрессии варианта по настоящему изобретению или полинуклеотида по настоящему изобретению; микроорганизм (например рекомбинантный штамм), экспрессирующий вариант по настоящему изобретению или полинуклеотид по настоящему изобретению; или микроорганизм (например рекомбинантный штамм), обладающий вариантной активностью по настоящему изобретению, но без ограничения этим.

Микроорганизм по настоящему изобретению может иметь способность продуцировать L-валин.

Микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, который естественным образом обладает способностью продуцировать GltA или L-валин, или микроорганизм, в который был введен вариант по настоящему изобретению или полинуклеотид, кодирующий то же самое (или вектор, содержащий полинуклеотид), в родительский штамм, который естественным образом не обладает способностью продуцировать GltA или L-валин, и/или микроорганизм, которому была придана способность продуцировать GltA, L-валин, но без ограничения этим.

В одном примере микроорганизм по настоящему изобретению представляет собой клетку или микроорганизм, трансформированные с помощью полинуклеотида по настоящему изобретению или вектора, содержащего полинуклеотид по настоящему изобретению, для экспрессии варианта по настоящему изобретению, и для целей настоящего изобретения микроорганизм по настоящему изобретению может включать все микроорганизмы, способные продуцировать L-валин, включая вариант по настоящему изобретению. Например, штамм по настоящему изобретению может представлять собой рекомбинантный штамм, способность которого продуцировать L-валин повышена путем введения полинуклеотида, кодирующего вариант по настоящему изобретению, в природный микроорганизм дикого типа или микроорганизм, продуцирующий L-валин. Рекомбинантный штамм с повышенной способностью продуцировать L-валин может представлять собой микроорганизм, обладающий повышенной способностью продуцировать L-валин по сравнению с природным микроорганизмом дикого типа или немодифицированным микроорганизмом цитратсинтазы (т.е. микроорганизмом, экспрессирующим белок дикого типа (SEQ ID NO: 1), или микроорганизмом, не экспрессирующий вариант по настоящему изобретению), но без ограничения этим. Например, немодифицированный микроорганизм цитратсинтазы, который представляет собой целевой штамм для сравнения увеличения способности продуцировать L-валин, может представлять собой штамм АТСС14067, штамм АТСС13032 и штамм АТСС13869, штамм Corynebacterium glutamicum CJ7V, Cory neb acterium glutamicum CJ8V или CA08-0072, но без ограничения этим.

В одном примере рекомбинантный штамм, имеющий повышенную продуктивную способность, может иметь способность продуцировать L-валин, повышенную примерно на 1% или более, 5% или более, 7% или более, примерно 10% или более, примерно 13% или более, примерно 15% или более, примерно 17% или более, примерно 20% или более, примерно 30% или более, или примерно 40% или более (верхний предел конкретно не ограничен, например примерно 200% или менее, примерно 150% или менее, примерно 100% или менее, примерно 50% или менее, примерно 45% или менее, примерно 40% или менее) по сравнению со способностью продуцировать L-валин родительского штамма до модификации или немодифицированного микроорганизма, но без ограничения этим, пока он имеет повышенное значение + по сравнению с продуктивной способностью родительского штамма до модификации или немодифицированного микроорганизма. В другом примере рекомбинантный штамм, имеющий повышенную продуктивную способность, может иметь способность продуцировать L-валин, повышенную примерно в 1,01 раза или более, примерно в 1,05 раза или более, примерно в 1,07 раза или более, примерно в 1,1 раза или более, примерно в 1,2 раза или более, или примерно в 1,3 раза или более (верхний предел конкретно не ограничен, например примерно в 10 раз или менее, примерно в 5 раз или менее, примерно в 3 раза или менее, или примерно в 2 раза или менее) по сравнению с исходным штаммом до модификации или немодифицированным микроорганизмом, но без ограничения этим.

При использовании в данном документе термин "примерно" относится к диапазону, который включает в себя все из ±0,5, ±0,4, ±0,3, ±0,2, ±0.1, и т.д., и включает в себя все значения, которые эквивалентны или подобны тем, которые следуют за этими значениями, но диапазон не ограничивается этим.

При использовании в данном документе термин "немодифицированный микроорганизм" не исключает штамм, содержащий мутацию, которая может возникать в микроорганизме естественным образом, и может относиться к штамму дикого типа или к самому штамму природного типа, или к штамму до изменения признака вследствие генетической модификации, вызванной природными или искусственными факторами. Например, немодифицированный микроорганизм может относиться к штамму, в который не введен вариант белка, описанный в данном документе, или к штамму до его введения. "Немодифицированный микроорганизм" можно использовать взаимозаменяемо со "штаммом до модификации", "микроорганизмом до модификации", "немутантным штаммом", "немодифицированным штаммом", "немутантным микроорганизмом" или "эталонным микроорганизмом".

В другом примере настоящего изобретения микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris или Corynebacterium flavescens.

Микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, у которого дополнительно усилена активность малой субъединицы изофермента ацетолактатсинтазы (I1vN).

При использовании в данном документе термин "ослабление" полипептида представляет собой расширенное понятие, включающее как сниженную активность, так и ее отсутствие по сравнению с его эндогенной активностью. Ослабление можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как инактивация, дефицит, понижающая регуляция, уменьшение, снижение, подавление и т.д.

Ослабление может также включать случай, когда саму полипептидную активность снижают или удаляют по сравнению с активностью полипептида, которой первоначально обладал микроорганизм, вследствие мутации полинуклеотида, кодирующего полипептид; случай, когда общий уровень внутриклеточной полипептидной активности и/или концентрации (уровень экспрессии) снижают по сравнению с природным штаммом вследствие ингибирования экспрессии гена полинуклеотида, кодирующего полипептид, или ингибирования трансляции в полипептид и т.д.; случай, когда полинуклеотид не экспрессируется вообще; и/или случай, когда полипептидная активность не наблюдается даже когда полинуклеотид экспрессируется. При использовании в данном документе термин "эндогенная активность" относится к активности конкретного полипептида, которой первоначально обладал родительский штамм до трансформации, микроорганизм дикого типа или немодифицированный микроорганизм, когда признак изменяется посредством генетической модификации, вызванной естественными или искусственными факторами, и может использоваться взаимозаменяемо с "активностью до модификации". Выражение, что активность полипептида "инактивирована, недостаточна, понижена, нерегулируема, снижена или аттенуирована" по сравнению с его эндогенной активностью, означает, что активность полипептида понижена по сравнению с активностью конкретного полипептида, которой первоначально обладал родительский штамм до трансформации или немодифицированный микроорганизм.

Ослабление активности полипептида может быть выполнено любым способом, известным в данной области техники, но способ не ограничивается ими, и может быть достигнуто посредством применения различных способов, хорошо известных в данной области техники (например, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, и др.).

Конкретно, ослабление активности полипептида по настоящему изобретению может представлять собой:

1) делетирование части или всего гена, кодирующего полипептид;

2) модификацию области регуляции экспрессии (регуляторной последовательности экспрессии) таким образом, что экспрессия гена, кодирующего полипептид, снижается;

3) модификацию аминокислотной последовательности, составляющей полипептид, таким образом, что активность полипептида ликвидируется или ослабляется (например делеция/замена/добавление одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности);

4) модификацию последовательности гена, кодирующего полипептид, таким образом, что активность полипептида ликвидируется или ослабляется (например делеция/замена/добавление одного или более нуклеотидов в нуклеотидной последовательности гена полипептида для кодирования полипептида, который был модифицирован для ликвидации или ослабления активности полипептида).;

5) модификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей инициирующий кодон, или 5-UTR, транскрипта гена, кодирующего полипептид;

6) введение антисмыслового олигонуклеотида (например антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего полипептид;

7) добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно (SD), на переднем конце последовательности SD гена, кодирующего полипептид, для образования вторичной структуры, тем самым ингибируя связывание рибосом;

8) инженерию обратной транскрипции (RTE), которая добавляет промотор, подлежащий обратной транскрипции, на 3'-конце открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующей полипептид; или

9) комбинацию из двух или более, выбранных из приведенных выше (1)-(8), но без конкретного ограничения ими.

Например:

1) Делеция части или всего гена, кодирующего полипептид, может представлять собой делецию всего полинуклеотида, кодирующего эндогенный целевой полипептид в хромосоме, или замену полинуклеотида на полинуклеотид, имеющий частично делетированный нуклеотид, или на маркерный ген.

2) Модификация области регуляции экспрессии (регуляторной последовательности экспрессии) может представлять собой индуцирование модификации регуляторной области экспрессии (регуляторной последовательности экспрессии) посредством делеции, вставки, неконсервативной замены или консервативной замены или их комбинации; или замену последовательности на последовательность, имеющую более слабую активность. Область регуляции экспрессии может включать промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания с рибосомой, и последовательность регулирования окончания транскрипции и трансляции, но не ограничивается этим.

3) и 4) Модификация аминокислотной последовательности или полинуклеотид ной последовательности может представлять собой индуцирование модификации последовательности посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены аминокислотной последовательности полипептида или полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, или их комбинацию для ослабления активности полипептида, или замену последовательности на аминокислотную последовательность или полинуклеотидную последовательность, модифицированную так, чтобы обладать более слабой активностью, или на аминокислотную последовательность или полинуклеотидную последовательность, модифицированную так, чтобы не обладать активностью, но без ограничения этим. Например, экспрессию гена можно ингибировать или ослаблять путем введения мутации в полинуклеотидную последовательность с образованием терминирующего кодона, но без ограничения этим.

5) Модификация нуклеотидной последовательности, кодирующей инициирующий кодон или 5'-UTR транскрипта гена, кодирующего полипептид, может представлять собой, например, замену нуклеотидной последовательности на нуклеотидную последовательность, кодирующую другой инициирующий кодон, имеющий более низкую скорость экспрессии полипептида, чем эндогенный инициирующий кодон, но без ограничения этим.

6) Введение антисмыслового олигонуклеотида (например антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего полипептид, можно найти в литературе [Weintraub, Н. et al., Antisense -RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol.1(1) 1986].

7) Добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно (SD) на переднем конце последовательности гена SD, кодирующего полипептид, для образования вторичной структуры, тем самым ингибируя прикрепление рибосомы, может ингибировать трансляцию мРНК или снижать ее скорость.

Кроме того, 8) инженерия обратной транскрипции (RTE), которая добавляет промотор, который подлежит обратной транскрипции, на 3'-конце открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующей полипептид, может образовывать антисмысловой нуклеотид, комплементарный транскрипту гена, кодирующему полипептид, для ослабления активности.

Используемый здесь термин "усиление" активности полипептида означает, что активность полипептида повышается по сравнению с его эндогенной активностью. Усиление можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как активация, ап-регуляция, сверхэкспрессия, увеличение и т.д. В частности, активация, усиление, ап-регуляция, сверхэкспрессия и увеличение могут включать оба случая, в которых проявляется изначально отсутствующая активность, или активность усиливается по сравнению с эндогенной активностью или активностью до модификации. "Эндогенная активность" относится к активности конкретного полипептида, которой первоначально обладал родительский штамм до трансформации или немодифицированный микроорганизм, где признак изменяют посредством генетической модификации, вызванной естественными или искусственными факторами, и может использоваться взаимозаменяемо с термином "активность до модификации". "Усиление", "ап-регуляция", "сверхэкспрессия" или "увеличение" активности полипептида по сравнению с его эндогенной активностью означает, что активность и/или концентрация (уровень экспрессии) полипептида усиливаются по сравнению с активностью конкретного полипептида, которой первоначально обладал родительский штамм до трансформации, или немодифицированный микроорганизм.

Усиление может быть достигнуто посредством введения чужеродного полипептида или усиления активности и/или концентрации (уровня экспрессии) эндогенного полипептида. Усиление активности полипептида можно подтвердить по повышению уровня активности полипептида, уровня экспрессии или количества продукта, выделяемого от полипептида.

Усиление активности полипептида может проводиться посредством различных способов, хорошо известных в данной области техники, и способ не ограничен до тех пор, пока он может усиливать активность целевого полипептида по сравнению с активностью микроорганизма до модификации. Конкретно, можно использовать генную инженерию и/или белковую инженерию, хорошо известную специалистам в данной области техники, которая представляет собой обычный способ молекулярной биологии, но способ не ограничивается этим (например, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol.2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 и др.).

Конкретно, усиление активности полипептида по настоящему изобретению может представлять собой:

1) увеличение числа внутриклеточных копий полинуклеотида, кодирующего полипептид;

2) замену области регуляции экспрессии гена, кодирующего полипептид, на хромосоме, последовательностью, имеющей более сильную активность;

3) модификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей инициирующий кодон, или 5'-UTR, транскрипта гена, кодирующего полипептид;

4) модификацию аминокислотной последовательности полипептида таким образом, что активность полипептида усиливается;

5) модификацию полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, таким образом, что активность полипептида усиливается (например модификацию полинуклеотидной последовательности гена полипептида для кодирования полипептида, который был модифицирован для усиления активности полипептида);

6) введение чужеродного полипептида, проявляющего полипептидную активность, или чужеродного полинуклеотида, кодирующего его;

7) кодон-оптимизацию полинуклеотида, кодирующего полипептид;

8) анализ третичной структуры полипептида и, тем самым, выбор и модификацию экспонированного участка или его химическая модификация; или

9) комбинацию из двух или более выбранных из приведенных (1)-(8), но конкретно этим не ограничивается.

Более конкретно:

1) Увеличение числа внутриклеточных копий полинуклеотида, кодирующего полипептид, может быть достигнуто путем введения в клетку-хозяина вектора, который функционально связан с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, и способен реплицироваться и функционировать независимо от клетки-хозяина. Альтернативно, оно может представлять собой введение одной копии или двух копий полинуклеотидов, кодирующих полипептид, в хромосому клетки-хозяина. Введение в хромосому можно выполнять путем введения вектора, который способен встраивать полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина, в клетку-хозяина, но не ограничивается этим. Вектор является таким, как описано выше.

2) Замена регулирующей экспрессию области (или последовательности, регулирующей экспрессию) гена, кодирующего полипептид на хромосоме, на последовательность, имеющую сильную активность, может представлять собой, например, индуцирование модификации последовательности посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации для дальнейшего усиления активности регулирующей экспрессию области, или замену последовательности на последовательность, имеющую более сильную активность. Регулирующая экспрессию область может включать, но без конкретного ограничения этим, промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, и последовательность, регулирующую окончание транскрипции и трансляции и т.д. В одном примере это может представлять собой замену исходного промотора на сильный промотор, но без ограничения этим.

Примеры известных сильных промоторов могут включать промоторы CJ1-CJ7 (US 7662943 В2), промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор PR лямбда-фага, промотор PL, промотор tet, промотор gapA, промотор SPL7, промотор SPL13 (sm3) (US 10584338 В2), промотор 02 (US 10273491 В2), промотор tkt, промотор уссА и т.д., но сильные промоторы не ограничиваются ими.

3) Модификация нуклеотидной последовательности, кодирующей инициирующий кодон или 5'-UTR транскрипт гена, кодирующего полипептид, может, например, представлять собой замену нуклеотидной последовательности на нуклеотидную последовательность, кодирующую другой инициирующий кодон, имеющий более высокую степень экспрессии полипептида по сравнению с эндогенным инициирующим кодоном, но без ограничения этим.

4) и 5) Модификация аминокислотной последовательности или полинуклеотидной последовательности может представлять собой индуцирование модификации последовательности посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены аминокислотной последовательности полипептида или полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, или их комбинацию для усиления активности полипептида, или замену последовательности на аминокислотную последовательность или полинуклеотидную последовательность, модифицированную для придания более сильной активности, или на аминокислотную последовательность или полинуклеотидную последовательность, модифицированную для усиления активности, но без ограничения этим. Замену конкретно можно выполнять путем встраивания полинуклеотида в хромосому посредством гомологичной рекомбинации, но без ограничения этим. Вектор, используемый здесь, может дополнительно включать селективный маркер для подтверждения встраивания в хромосому. Селективный маркер является таким, как описано выше.

6) Введение чужеродного полинуклеотида, проявляющего активность полипептида, может представлять собой введение в клетку-хозяина чужеродного полинуклеотида, кодирующего полипептид, который проявляет такую же/аналогичную активность, что и полипептид. Чужеродный полинуклеотид можно использовать без ограничения, независимо от его происхождения или последовательности, пока он проявляет такую же активность, что и полипептид. Введение может быть выполнено обычными специалистами в данной области техники посредством соответствующего выбора известного в данной области техники метода трансформации, и экспрессия введенного полинуклеотида в клетке-хозяине дает возможность продуцировать полипептид, тем самым повышая его активность.

7) Оптимизация кодонов полинуклеотида, кодирующего полипептид, может представлять собой оптимизацию кодонов эндогенного полинуклеотида для увеличения транскрипции или трансляции внутри клетки-хозяина или оптимизацию его кодонов так, чтобы можно было достичь оптимизированной транскрипции и трансляции чужеродного полинуклеотида внутри клетки-хозяина.

Кроме того, 8) анализ третичной структуры полипептида и, посредством этого, выбор и модификация экспонированного участка или его химическая модификация могут представлять собой, например, сравнение информации о последовательности подлежащего анализу полипептида с базой данных, в которой хранится информация о последовательности известных белков, для определения кандидатов матричных белков в соответствии со степенью сходства последовательностей и, таким образом, подтверждения структуры на основе информации, таким образом отбирая и трансформируя или модифицируя экспонированный участок, подлежащий модификации или химической модификации.

Такое усиление активности полипептида может означать, что активность или концентрация (уровень экспрессии) соответствующего полипептида повышается относительно активности или концентрации (уровня экспрессии) полипептида, экспрессируемого в штамме дикого типа или в микроорганизме до модификации, или что количество продукта, полученного из полипептида, увеличивается, но без ограничения этим.

Модификации части или всего полинуклеотида в микроорганизме по настоящему изобретению (например модификация для кодирования варианта белка, описанного выше) можно достичь посредством (а) гомологичной рекомбинации с использованием вектора для хромосомной вставки в микроорганизм или редактирования генома с использованием сконструированной нуклеазы (например CRISPR-Cas9), и/или (б) она может быть индуцирована светом, таким как ультрафиолетовые лучи и радиация и т.д., и/или химической обработкой, но без ограничения этим. Способ модификации части или всего гена может включать способ с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Например, часть или весь ген могут быть делетированы посредством инъекции нуклеотидной последовательности или вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, гомологичную целевому гену, в микроорганизм для индуцирования гомологичной рекомбинации. Введенная нуклеотидная последовательность или вектор могут включать доминантный селективный маркер, но без ограничения этим.

Более конкретно, микроорганизм, продуцирующий L-валин, по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, включающий полипептид, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 22 и/или нуклеотид, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 23.

В микроорганизмах по настоящему изобретению вариант, полинуклеотид и т.д. являются такими, как описано в других аспектах выше.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения L-валина, включающий: культивирование в среде микроорганизма рода Corynebacterium, который включает вариант по настоящему изобретению или полинуклеотид по настоящему изобретению.

Способ получения L-валина по настоящему изобретению может включать культивирование в среде штамма Corynebacterium glutamicum, который включает вариант по настоящему изобретению, полинуклеотид по настоящему изобретению или вектор по настоящему изобретению.

При использовании здесь термин "культивирование" означает, что микроорганизм рода Corynebacterium по настоящему изобретению выращивают в надлежащим образом контролируемых условиях окружающей среды. Процесс культивирования по настоящему изобретению можно выполнять в подходящей культуральной среде и в условиях культивирования, известных в данной области техники. Такой процесс культивирования можно легко адаптировать для использования специалистами в данной области техники в соответствии с выбранным штаммом. Конкретно, культивирование может представлять собой периодическое культивирование, непрерывное культивирование и/или периодическое культивирование с подпиткой, но без ограничения этим.

При использовании здесь термин "среда" относится к смеси веществ, которая содержит питательные вещества, необходимые для культивирования микроорганизма рода Corynebacterium по настоящему изобретению, в качестве основного ингредиента, и она доставляет питательные вещества и факторы роста вместе с водой, которая является необходимой для выживания и роста. Конкретно, среда и другие условия культивирования, используемые для культивирования микроорганизма рода Corynebacterium по настоящему изобретению, могут представлять собой любую среду, используемую для обычного культивирования микроорганизмов без каких-либо конкретных ограничений. Однако микроорганизм рода Corynebacterium по настоящему изобретению можно культивировать в аэробных условиях в обычной среде, содержащей соответствующий источник углерода, источник азота, источник фосфора, неорганическое соединение, аминокислоту и/или витамин, при регулировании температуры, рН и т.д.

Конкретно, питательную среду для микроорганизма рода Corynebacterium можно найти в литературе ["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)].

В настоящем изобретении источник углерода может включать углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, сахароза, мальтоза и т.д.; сахарные спирты, такие как маннит, сорбит и т.д.; органические кислоты, такие как пировиноградная кислота, молочная кислота, лимонная кислота и т.д.; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин, лизин и т.д. Кроме того, источник углерода может включать натуральные органические питательные вещества, такие как гидролизат крахмала, меласса, черная меласса, рисовые отруби, маниока, меласса из сахарного тростника, кукурузный сироп и т.д. Конкретно, можно использовать углеводы, такие как глюкоза и стерилизованная предварительно обработанная меласса (т.е. меласса, превращенная в редуцирующий сахар), и, кроме того, можно использовать различные другие источники углерода в соответствующем количестве без ограничения. Эти источники углерода можно использовать по отдельности или в комбинации двух или более видов, но без ограничения этим.

Источник азота может включать в себя неорганические источники азота, такие как аммиак, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония, нитрат аммония и т.д.; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин, глутамин и т.д.; и органические источники азота, такие как пептон, NZ-амин, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, кукурузный сироп, гидролизат казеина, рыба или продукт ее разложения, обезжиренный соевый жмых или продукт его разложения и т.д. Эти источники азота можно использовать по отдельности или в комбинации двух или более видов, но без ограничения ими.

Источник фосфора может включать монокалийфосфат, дикалийфосфат или соответствующие натрийсодержащие соли и т.д. Примеры неорганических соединений могут включать хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция и т.д. Кроме того, могут быть включены аминокислоты, витамины и/или подходящие предшественники. Эти составляющие ингредиенты или предшественники можно добавлять в среду периодическим или непрерывным способом, но этими источники фосфора не ограничены перечисленным.

Кроме того, рН среды можно регулировать подходящим образом путем добавления соединения, такого как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота, серная кислота и т.д., во время культивирования штамма Corynebacterium glutamicum по настоящему изобретению. Кроме того, образование пузырьков во время культивирования можно предотвращать с помощью пеногасителя, такого как полигликоле вый эфир жирных кислот. Кроме того, с целью поддержания аэробных условий среды можно вводить в среду газообразный кислород или газ, содержащий кислород; или для поддержания анаэробных или микроаэробных условий можно вводить газообразный азот, газообразный водород или диоксид углерода, без введения газа, но газ не ограничивается этим.

Температура во время культивирования по настоящему изобретению может находиться в диапазоне от 20°С до 45°С, конкретно от 25°С до 40°С, и культивирование можно выполнять в течение примерно от 10 до 160 часов, но культивирование не ограничивается этим.

L-валин, полученный путем культивирования по настоящему изобретению, может высвобождаться в среду или оставаться в клетках.

Способ получения L-валина по настоящему изобретению может дополнительно включать стадию получения микроорганизма рода Corynebacterium по настоящему изобретению, стадию приготовления среды для культивирования микроорганизма или их комбинацию (независимо от порядка, в любом порядке), например перед стадией культивирования.

Способ получения L-валина по настоящему изобретению может дополнительно включать стадию выделения L-валина из культуральной среды (среды, на которой выращивали культуру) или микроорганизма рода Corynebacterium по настоящему изобретению. Стадия выделения может быть дополнительно включена после стадии культивирования.

На стадии выделения нужный L-валин может быть собран с использованием способа культивирования микроорганизма по настоящему изобретению, например, с использованием подходящего способа, известного в данной области техники, в соответствии со способом периодического культивирования, непрерывного культивирования или способа периодического культивирования с подпиткой. Например, можно использовать такие методы, как центрифугирование, фильтрация, обработка осадителем для кристаллизации белка (метод высаливания), экстракция, ультразвуковое разрушение, ультрафильтрация, диализ, различные виды хроматографии, такие как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография, аффинная хроматография и т.д., ВЭЖХ, или их комбинацию, и нужный L-валин можно выделять из среды или микроорганизмов с использованием подходящих методов, известных в данной области техники.

Кроме того, способ получения L-валина по настоящему изобретению может дополнительно включать стадию очистки, которую можно выполнять с использованием подходящего метода, известного в данной области техники. В одном примере, когда способ получения L-валина по настоящему изобретению включает как стадию выделения, так и стадию очистки, стадию выделения и стадию очистки можно выполнять непрерывно или с перерывами независимо от порядка или одновременно, или их можно объединять в одну стадию, но способ этим не ограничивается.

В способе по настоящему изобретению вариант, полинуклеотид, вектор, микроорганизм и т.д. являются такими, как описано в других аспектах выше.

Кроме того, в другом аспекте настоящего изобретения предлагается композиция для получения L-валина, включающая микроорганизм рода Corynebacterium, который включает вариант по настоящему изобретению, полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему изобретению, или вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему изобретению; среду, на которой выращивают микроорганизм; или их комбинацию.

Композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать любой подходящий эксципиент, обычно используемый в композициях для получения L-валина, и такие эксципиенты включают, например, консерванты, смачивающие агенты, диспергирующие агенты, суспендирующие агенты, буферы, стабилизаторы или изотонические агенты и т.д., но без ограничения этим.

В композиции по настоящему изобретению вариант, полинуклеотид, вектор, штамм, среда и т.д. являются такими, как описано в других аспектах выше.

Вариант осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет подробно описано с помощью Примеров. Однако эти Примеры представляют собой всего лишь предпочтительные Примеры, представленные в иллюстративных целях, и, таким образом, объем настоящего изобретения не предназначен для ограничения этими примерами или посредством этих Примеров. Вместе с тем, технические признаки, которые не описаны здесь, могут быть достаточно понятны и легко реализованы специалистами в области техники настоящего изобретения или в аналогичной технической области.

Пример 1. Отбор вариантных штаммов для повышения способности продуцировать L-валин посредством случайного мутагенеза

Пример 1-1. Индукция случайной мутации при помощи ультрафиолетового облучения

Для отбора вариантных штаммов с повышенной способностью продуцировать L-валин, продуцирующий L-валин штамм Corynebacterium glutamicum СА08-0072 (KCCM11201P, US 8465962 В2) высевали на питательную среду, содержащую агар, и культивировали при 30°С в течение 36 часов. Сотни полученных таким образом колоний облучали ультрафиолетовым светом при комнатной температуре для индукции случайных мутаций в геноме штаммов.

Питательная среда (рН 7,2).

Глюкоза 10 г, мясной экстракт 5 г, полипептон 10 г, хлорид натрия 2,5 г, дрожжевой экстракт 5 г, агар 20 г, мочевина 2 г (из расчета на 1 л дистиллированной воды).

Пример 1-2. Эксперимент по определению титра ферментации штаммов с индуцированной мутацией и отбор штаммов

Эксперимент по определению титра ферментации штаммов, в которых была индуцирована случайная мутация, выполняли с целью отбора вариантных штаммов с повышенной способностью продуцировать L-валин по сравнению с Corynebacterium glutamicum СА08-0072, использованным в качестве родительского штамма. Каждую колонию (от M1 до М16) субкультивировали в питательной среде и затем каждый штамм высевали в колбу 250 мл с угловой перегородкой, содержащую 25 мл питательной среды, и культивировали при 30°С в течение 72 часов при 200 об/мин при встряхивании. После этого анализировали концентрацию L-валина с использованием ВЭЖХ и проанализированная концентрация L-валина представлена в Таблице 1 ниже.

Питательная среда (рН 7,2)

Глюкоза 10 г, мясной экстракт 5 г, полипептон 10 г, хлорид натрия 2,5 г, дрожжевой экстракт 5 г, агар 20 г, мочевина 2 г (из расчета на 1 л дистиллированной воды).

Среда для продуцирования (рН 7,0)

Глюкоза 100 г, (NH₄)₂SO₄ 40 г, соевый белок 2,5 г, кукурузный крахмал 5 г, мочевина 3 г, K₂HPO₄ 1 г, MgSO₄⋅7H₂O 0,5 г, биотин 100 мкг, тиамина-HCl 1 мг, кальций-пантотеновая кислота 2 мг, никотинамид 3 мг, СаСО₃ 30 г (из расчета на 1 л дистиллированной воды)

В результате были отобраны штаммы М5 и М12 с наибольшим повышением способности продуцировать L-валин, способность которых продуцировать L-валин была увеличена на 178% и 181% соответственно по сравнению с контрольным штаммом СА08-0072.

Пример 2. Подтверждение мутации с помощью секвенирования генов

Основные продуцирующие L-валин гены штаммов М5 и М12 с повышенной способностью продуцировать L-валин секвенировали и сравнивали с генами штамма СА08-0072 и штаммов Corynebacterium glutamicum АТСС14067, АТСС13032 и АТСС13869 дикого типа. В результате было подтверждено, что штаммы М5 и М12 содержали мутации в определенных положениях цитратсинтазы (GltA). Конкретно, в М5 и М12 было подтверждено, что глицин (G), который представляет собой 413-ую аминокислоту GltA, заменен аспарагиновой кислотой (D).

В следующих примерах была предпринята попытка подтвердить, влияют ли мутации на продуктивность по L-валину микроорганизма рода Corynebacterium.

Пример 3. Конструирование векторов для введения мутации и штаммов для введения мутации

Пример 3-1: Отбор вариантов цитратсинтазы и конструирование вектора

Конструировали вектор, в котором глицин, представляющий собой 413-ую аминокислоту GltA, заменен аспарагиновой кислотой.

ПЦР выполняли с использованием пар праймеров SEQ ID NO: 25 и 26 и SEQ ID NO: 27 и 28 на основе гДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 14067 дикого типа в качестве матрицы, с целью конструирования вектора для замены глицина, который представляет собой 413-ую аминокислоту GltA, аспарагиновой кислотой. Здесь ПЦР выполняли в условиях денатурации при 95°С в течение 5 минут с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 55°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 30 секунд и затем полимеризации при 72°С в течение 5 минут. Перекрывающуюся ПЦР выполняли на основе смеси двух полученных выше фрагментов в качестве матрицы, используя пару праймеров с идентификационными номерами SEQ ID NO: 25 и 26 для получения фрагмента. Здесь ПЦР выполняли в условиях денатурации при 94°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 94°С в течение 30 секунд, отжига при 55°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 1 минуты и 30 секунд, и затем полимеризации при 72°С в течение 5 минут. Вектор pDCM2 (публикация корейской заявки №. 10-2020-0136813) обрабатывали SmaI, и каждый полученный выше продукт ПЦР подвергали клонированию слиянием. Клонирование слиянием выполняли с использованием набора для клонирования In-Fusion® HD (Clontech). Полученная плазмида была названа pDCM2-gltA(G413D). Последовательности праймеров, использованных в этом Примере, представлены в Таблице 2 ниже.

Пример 3-2. Введение варианта GltA в штаммы, продуцирующие L-валин, и их оценка

Пример 3-2-1. Конструирование штаммов на основе продуцирования L-валина и их оценка

Один вид мутации [ilvN(A42V);); Biotechnology and Bioprocess Engineering, June 2014, Volume 19, Issue 3, pp. 456-467] (SEQ ID NO: 22) вводили в малую субъединицу изофермента ацетолактатсинтазы 1 (IlvN) Corynebacterium glutamicum АТСС 14067 и АТСС 13869 дикого типа для конструирования штаммов, обладающих усиленной способностью продуцировать L-валин (KR 10-1947945 В1).

Конкретно, ПЦР выполняли с использованием пар праймеров SEQ ID NO: 31 и 33 и SEQ ID NO: 32 и 34 на основе на гДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 14067 дикого типа в качестве матрицы. Перекрывающуюся ПЦР выполняли на основе смеси двух полученных выше фрагментов в качестве матрицы, используя пару праймеров SEQ: 31 и 34 для получения ПЦР-фрагмента. Здесь ПЦР выполняли в условиях денатурации при 94°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 94°С в течение 30 секунд, отжига при 55°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 1 минуты и 30 секунд, а затем полимеризации при 72°С в течение 5 минут. Вектор pDCM2 обрабатывали Smal и каждый полученный выше продукт ПЦР подвергали клонированию слиянием. Клонирование слиянием выполняли с использованием набора для клонирования In-Fusion® HD (Clontech). Полученная плазмида была названа pDCM2-ilvN(A42V). После этого pDCM2-ilvN(A42V) трансформировали в каждый из Corynebacterium glutamicum АТСС 14067 и АТСС 13869 дикого типа для индуцирования гомологичной рекомбинации на хромосоме (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Штаммы с вектором, введенным в хромосому посредством рекомбинации гомологичных последовательностей, отбирали в среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Фрагменты генов амплифицировали на основе выбранных трансформантов Corynebacterium glutamicum посредством ПЦР с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 35 и 36, и введение мутации подтверждали посредством анализа секвенирования генов. Рекомбинантные штаммы были названы Corynebacterium glutamicum CJ7V и CJ8V соответственно. Последовательности праймеров, использованных в этом Примере, представлены в Таблице 3 ниже.

После этого выполняли эксперимент по определению титра ферментации на основе Corynebacterium glutamicum АТСС 14067 и АТСС 13869 дикого типа и штаммов CJ7V и CJ8V, сконструированных выше. Каждый штамм субкультивировали в питательной среде и затем высевали в колбу 250 мл с угловой перегородкой, содержащую 25 мл питательной среды, и культивировали при 30°С в течение 72 часов при 200 об/мин при встряхивании. После этого анализировали концентрацию L-валина посредством ВЭЖХ и проанализированная концентрация L-валина представлена в Таблице 4 ниже. Питательная среда (рН 7,2)

Глюкоза 10 г, мясной экстракт 5 г, полипептон 10 г, хлорид натрия 2,5 г, дрожжевой экстракт 5 г, агар 20 г, мочевина 2 г (из расчета на 1 л дистиллированной воды) Среда для продуцирования (рН 7,0)

Глюкоза 100 г, (NH₄)₂SO₄ 40 г, соевый белок 2,5 г, твердые вещества кукурузного экстракта 5 г, мочевина 3 г, K₂HPO₄ 1 г, MgSO₄⋅7H₂O 0,5 г, биотин 100 мкг, тиамин-HCl 1 мг, кальций-пантотеновая кислота 2 мг, никотинамид 3 мг, СаСО₃ 30 г (из расчета на 1 л дистиллированной воды)

Как показано в результатах, было подтверждено, что способность продуцировать L-валин была повышена у штаммов CJ7V и CJ8V с введенной мутацией гена ilvN(A42V), по сравнению со штаммами Corynebacterium glutamicum АТСС 14067 и АТСС 13869 дикого типа.

Пример 3-2-2: Введение варианта GltA (G413D) в штаммы, продуцирующие L-валин, и их оценка

Способность продуцировать L-валин оценивали посредством введения варианта GltA в штаммы, продуцирующие L-валин. Сконструированный в Примере 3-1 pDCM2-gltA(G413D) трансформировали в каждый из продуцирующих L-валин штаммов CJ7V и CJ8V и СА08-0072 посредством гомологичной рекомбинации на хромосоме. Штаммы с вектором, введенным в хромосому путем рекомбинации гомологичных последовательностей, отбирали в среде, содержащей 25 мг/л канамицина.

После этого фрагменты генов амплифицировали на основе трансформантов Corynebacterium glutamicum, в которых была завершена вторичная рекомбинация, посредством ПЦР с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 29 и 30 (таблица 5) и затем штаммы с внесенной мутацией подтверждали путем анализа секвенирования генов. Рекомбинантные штаммы были названы, как показано ниже, и оценку титра проводили таким же образом, как в Примере 1. Результаты приведены в Таблице 6.

Как показано в Таблице 6, вариант G413D имел повышенную способностью продуцировать L-валин без снижения роста.

Пример 3-3: Оценка интеграции варианта GltA в штаммы, продуцирующие L-валин

Пример 3-3-1. Конструирование вектора, интегрирующего вариант GltA

Вектор, интегрирующий вариант, заменяющий гистидин (Н) на лизин (К), который представляет собой 415-ую аминокислоту GltA, конструировали на основе вектора, сконструированного в Примере 3-1. Конкретно, ПЦР с сайт-направленным мутагенезом (ВМС Biotechnology volume 9, Article number: 61 (2009)) выполняли с использованием пары праймеров SEQ: 37 и 38 на основе pDCM2-gltA(G413D), сконструированного в Примере 3-1, в качестве матрицы. Благодаря этому получали плазмиду, в которой глицин (G), который представляет собой 413-ую аминокислоту, заменен аспарагиновой кислотой (D), и лизин (K), который представляет собой 415-ую аминокислоту, заменен гистидином(Н), и которую назвали _PDCM2-gltA(G413D, К415Н).

Пример 3-3-2. Конструирование GltA-вариант-интегративного штамма у штамма, продуцирующий L-валин, и его оценка

Способность продуцировать L-валин оценивали путем введения варианта GltA в штаммы, продуцирующие L-валин. Вектор pDCM2-gltA(G413D, К415Н), сконструированный в Примере 3-3-1, трансформировали в каждый из продуцирующих L-валин штаммов CJ7V и CJ8V и СА08-0072 посредством гомологичной рекомбинации на хромосоме. Штаммы с вектором, введенным в хромосому путем рекомбинации гомологичных последовательностей, отбирали в среде, содержащей 25 мг/л канамицина.

После этого фрагменты генов амплифицировали на основе трансформантов Corynebacterium glutamicum, в которых вторичная рекомбинация была завершена, посредством ПЦР с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 29 и 30, и штаммы с введенной мутацией подтверждали посредством анализа секвенирования генов. Рекомбинантные штаммы названы, как показано ниже, и оценку титра проводили таким же образом, как в Примере 1. Результаты приведены в Таблице 8.

Как можно увидеть из приведенных выше результатов, было подтверждено, что все штаммы с введенным вариантом GltA, имели повышенную способность продуцировать L-валин по сравнению с родительским штаммом, в который мутацию не вводили, без уменьшения их роста.

CA08-0072:gltA(G413D) был назван СА08-1687 и депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов (КССМ) в соответствии с Будапештским договором 28 сентября 2020 года, с регистрационным номером КССМ12794Р. Кроме того, АТСС СА08-0072:gltA(G413D,K415H) был назван СА08-1689 и депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов (КССМ) в соответствии с Будапештским договором 28 октября 2020 года с регистрационным номером КССМ12796Р.

Исходя из вышеизложенного, специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение, может понять, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без изменения технических концепций или существенных характеристик настоящего изобретения. Таким образом, примеры осуществления изобретения, раскрытые здесь, предназначены только для иллюстративных целей и не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Напротив, предполагается, что настоящее изобретение охватывает не только указанные примеры осуществления изобретения, но также различные альтернативы, модификации, эквиваленты и другие воплощения, которые могут быть включены в соответствии с сущностью и объемом настоящего изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> НОВЫЙ ВАРИАНТ ЦИТРАТСИНТАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ВАЛИНА C ЕГО

ПРИМЕНЕНИЕМ

<130> OPA21398

<150> KR 10-2021-0031642

<151> 2021-03-10

<160> 38

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 437

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> ATCC 14067 GltA AA

<400> 1

Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu

1 5 10 15

His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu

20 25 30

Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu

35 40 45

Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys

50 55 60

Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr

65 70 75 80

Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr

85 90 95

Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe

100 105 110

Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser

115 120 125

Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala

130 135 140

Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro

145 150 155 160

Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys

165 170 175

Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro

180 185 190

Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg

195 200 205

Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met

210 215 220

Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln

225 230 235 240

Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn

245 250 255

Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu

260 265 270

His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys

275 280 285

Asn Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Ala Phe Met Asn Lys Val Lys Asn

290 295 300

Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys

305 310 315 320

Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile

325 330 335

Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu

340 345 350

Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Tyr Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr

355 360 365

Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe

370 375 380

Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly

385 390 395 400

Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Gly Asn Lys Ile

405 410 415

Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Asn Glu Ser Arg Lys Leu Val

420 425 430

Pro Arg Glu Glu Arg

435

<210> 2

<211> 1314

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> ATCC 14067 GltA NT

<400> 2

atgtttgaaa gggatatcgt ggctactgat aacaacaagg ctgtcctgca ctaccccggt 60

ggcgagttcg aaatggacat catcgaggct tctgagggta acaacggtgt tgtcctgggc 120

aagatgctgt ctgagactgg actgatcact tttgacccag gttatgtgag cactggctcc 180

accgagtcga agatcaccta catcgatggc gatgcgggaa tcctgcgtta ccgcggctat 240

gacatcgctg atctggctga gaatgccacc ttcaacgagg tttcttacct acttatcaac 300

ggtgagctac caaccccaga tgagcttcac aagtttaacg acgagattcg ccaccacacc 360

cttctggacg aggacttcaa gtcccagttc aacgtgttcc cacgcgacgc tcacccaatg 420

gcaaccttgg cttcctcggt taacattttg tctacctact accaggatca gctgaaccca 480

ctcgatgagg cacagcttga taaggcaacc gttcgcctca tggcaaaggt tccaatgctg 540

gctgcgtacg cacaccgcgc acgcaagggt gctccttaca tgtacccaga caactccctc 600

aacgcgcgtg agaacttcct gcgcatgatg ttcggttacc caactgagcc atacgagatc 660

gacccaatca tggtcaaggc tctggacaag ctgctcatcc tgcacgctga ccacgagcag 720

aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780

atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840

ctggagatgc tcgaagacat caagaacaac cacggtggcg acgcaaccgc gttcatgaac 900

aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatgggct tcggacaccg cgtttacaag 960

aattacgatc cacgtgcagc aatcgtcaag gagaccgcac acgagatcct cgagcacctc 1020

ggtggcgacg atcttctgga tctggcaatc aagctggaag aaattgcact ggctgatgat 1080

tacttcatct cccgcaagct ctacccgaac gtagacttct acaccggcct gatctaccgc 1140

gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200

tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcaggca acaagatcaa ccgcccacgc 1260

caggtctaca ccggcaacga atcccgcaag ttggttcctc gcgaggagcg ctaa 1314

<210> 3

<211> 52

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> ATCC 14067 GltA 362~413

<400> 3

Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu

1 5 10 15

Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe

20 25 30

Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu

35 40 45

Gly Ala Ala Asp

50

<210> 4

<211> 437

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> ATCC 13032 GltA AA

<400> 4

Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu

1 5 10 15

His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu

20 25 30

Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu

35 40 45

Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys

50 55 60

Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr

65 70 75 80

Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr

85 90 95

Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe

100 105 110

Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser

115 120 125

Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala

130 135 140

Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro

145 150 155 160

Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys

165 170 175

Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro

180 185 190

Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg

195 200 205

Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met

210 215 220

Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln

225 230 235 240

Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn

245 250 255

Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu

260 265 270

His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys

275 280 285

Ser Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Glu Phe Met Asn Lys Val Lys Asn

290 295 300

Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys

305 310 315 320

Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile

325 330 335

Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu

340 345 350

Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Tyr Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr

355 360 365

Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe

370 375 380

Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly

385 390 395 400

Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Gly Asn Lys Ile

405 410 415

Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Asn Glu Ser Arg Lys Leu Val

420 425 430

Pro Arg Glu Glu Arg

435

<210> 5

<211> 1314

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> ATCC13032 GltA NT

<400> 5

atgtttgaaa gggatatcgt ggctactgat aacaacaagg ctgtcctgca ctaccccggt 60

ggcgagttcg aaatggacat catcgaggct tctgagggta acaacggtgt tgtcctgggc 120

aagatgctgt ctgagactgg actgatcact tttgacccag gttatgtgag cactggctcc 180

accgagtcga agatcaccta catcgatggc gatgcgggaa tcctgcgtta ccgcggctat 240

gacatcgctg atctggctga gaatgccacc ttcaacgagg tttcttacct acttatcaac 300

ggtgagctac caaccccaga tgagcttcac aagtttaacg acgagattcg ccaccacacc 360

cttctggacg aggacttcaa gtcccagttc aacgtgttcc cacgcgacgc tcacccaatg 420

gcaaccttgg cttcctcggt taacattttg tctacctact accaggacca gctgaaccca 480

ctcgatgagg cacagcttga taaggcaacc gttcgcctca tggcaaaggt tccaatgctg 540

gctgcgtacg cacaccgcgc acgcaagggt gctccttaca tgtacccaga caactccctc 600

aatgcgcgtg agaacttcct gcgcatgatg ttcggttacc caaccgagcc atacgagatc 660

gacccaatca tggtcaaggc tctggacaag ctgctcatcc tgcacgctga ccacgagcag 720

aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780

atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840

ctggagatgc tcgaagacat caagagcaac cacggtggcg acgcaaccga gttcatgaac 900

aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatgggct tcggacaccg cgtttacaag 960

aactacgatc cacgtgcagc aatcgtcaag gagaccgcac acgagatcct cgagcacctc 1020

ggtggcgacg atcttctgga tctggcaatc aagctggaag aaattgcact ggctgatgat 1080

tacttcatct cccgcaagct ctacccgaac gtagacttct acaccggcct gatctaccgc 1140

gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200

tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcaggca acaagatcaa ccgcccacgc 1260

caggtctaca ccggcaacga atcccgcaag ttggttcctc gcgaggagcg ctaa 1314

<210> 6

<211> 437

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> ATCC13869 GltA AA

<400> 6

Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu

1 5 10 15

His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu

20 25 30

Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu

35 40 45

Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys

50 55 60

Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr

65 70 75 80

Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr

85 90 95

Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe

100 105 110

Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser

115 120 125

Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala

130 135 140

Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro

145 150 155 160

Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys

165 170 175

Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro

180 185 190

Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg

195 200 205

Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met

210 215 220

Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln

225 230 235 240

Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn

245 250 255

Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu

260 265 270

His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys

275 280 285

Asn Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Ala Phe Met Asn Lys Val Lys Asn

290 295 300

Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys

305 310 315 320

Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile

325 330 335

Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu

340 345 350

Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Cys Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr

355 360 365

Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe

370 375 380

Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly

385 390 395 400

Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Gly Asn Lys Ile

405 410 415

Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Lys Glu Ser Arg Lys Leu Val

420 425 430

Pro Arg Glu Glu Arg

435

<210> 7

<211> 1314

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> ATCC13869 GltA NT

<400> 7

atgtttgaaa gggatatcgt ggctactgat aacaacaagg ctgtcctgca ctaccccggt 60

ggcgagttcg aaatggacat catcgaggct tctgagggta acaacggtgt tgtcctgggc 120

aagatgctgt ctgagactgg actgatcact tttgacccag gttatgtgag cactggctcc 180

accgagtcga agatcaccta catcgatggc gatgcgggaa tcctgcgtta ccgcggctat 240

gacatcgctg atctggctga gaatgccacc ttcaacgagg tttcttacct acttatcaac 300

ggtgagctac caaccccaga tgagcttcac aagtttaacg acgagattcg ccaccacacc 360

cttctggacg aggacttcaa gtcccagttc aacgtgttcc cacgcgacgc tcacccaatg 420

gcaaccttgg cttcctcggt taacattttg tctacctact accaggatca gctgaaccca 480

ctcgatgagg cacagcttga taaggcaacc gttcgcctca tggcaaaggt tccaatgctg 540

gctgcgtacg cacaccgcgc acgcaagggt gctccttaca tgtacccaga caactccctc 600

aacgcgcgtg agaacttcct gcgcatgatg ttcggttacc caaccgagcc atacgagatc 660

gacccaatca tggtcaaggc tctggacaag ctgctcatcc tgcacgctga ccacgagcag 720

aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780

atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840

ctggagatgc tcgaagacat caagaacaac cacggtggcg acgcaaccgc gttcatgaac 900

aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatgggct tcggacaccg cgtttacaag 960

aactacgatc cacgtgcagc aatcgtcaag gagaccgcac acgagatcct cgagcacctc 1020

ggtggcgacg atcttctgga tctggcaatc aagctggaag aaattgcact ggctgatgat 1080

tgcttcatct cccgcaagct ctacccgaac gtagacttct acaccggcct gatctaccgc 1140

gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200

tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcaggca acaagatcaa ccgcccacgc 1260

caggtctaca ccggcaagga atcccgcaag ttggttcctc gcgaggagcg ctaa 1314

<210> 8

<211> 437

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATCC 14067 GltA G413D AA

<400> 8

Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu

1 5 10 15

His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu

20 25 30

Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu

35 40 45

Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys

50 55 60

Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr

65 70 75 80

Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr

85 90 95

Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe

100 105 110

Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser

115 120 125

Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala

130 135 140

Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro

145 150 155 160

Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys

165 170 175

Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro

180 185 190

Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg

195 200 205

Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met

210 215 220

Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln

225 230 235 240

Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn

245 250 255

Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu

260 265 270

His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys

275 280 285

Asn Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Ala Phe Met Asn Lys Val Lys Asn

290 295 300

Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys

305 310 315 320

Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile

325 330 335

Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu

340 345 350

Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Tyr Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr

355 360 365

Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe

370 375 380

Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly

385 390 395 400

Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Asp Asn Lys Ile

405 410 415

Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Asn Glu Ser Arg Lys Leu Val

420 425 430

Pro Arg Glu Glu Arg

435

<210> 9

<211> 1314

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATCC 14067 GltA G413D NT

<400> 9

atgtttgaaa gggatatcgt ggctactgat aacaacaagg ctgtcctgca ctaccccggt 60

ggcgagttcg aaatggacat catcgaggct tctgagggta acaacggtgt tgtcctgggc 120

aagatgctgt ctgagactgg actgatcact tttgacccag gttatgtgag cactggctcc 180

accgagtcga agatcaccta catcgatggc gatgcgggaa tcctgcgtta ccgcggctat 240

gacatcgctg atctggctga gaatgccacc ttcaacgagg tttcttacct acttatcaac 300

ggtgagctac caaccccaga tgagcttcac aagtttaacg acgagattcg ccaccacacc 360

cttctggacg aggacttcaa gtcccagttc aacgtgttcc cacgcgacgc tcacccaatg 420

gcaaccttgg cttcctcggt taacattttg tctacctact accaggatca gctgaaccca 480

ctcgatgagg cacagcttga taaggcaacc gttcgcctca tggcaaaggt tccaatgctg 540

gctgcgtacg cacaccgcgc acgcaagggt gctccttaca tgtacccaga caactccctc 600

aacgcgcgtg agaacttcct gcgcatgatg ttcggttacc caactgagcc atacgagatc 660

gacccaatca tggtcaaggc tctggacaag ctgctcatcc tgcacgctga ccacgagcag 720

aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780

atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840

ctggagatgc tcgaagacat caagaacaac cacggtggcg acgcaaccgc gttcatgaac 900

aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatgggct tcggacaccg cgtttacaag 960

aattacgatc cacgtgcagc aatcgtcaag gagaccgcac acgagatcct cgagcacctc 1020

ggtggcgacg atcttctgga tctggcaatc aagctggaag aaattgcact ggctgatgat 1080

tacttcatct cccgcaagct ctacccgaac gtagacttct acaccggcct gatctaccgc 1140

gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200

tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcagaca acaagatcaa ccgcccacgc 1260

caggtctaca ccggcaacga atcccgcaag ttggttcctc gcgaggagcg ctaa 1314

<210> 10

<211> 437

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATCC13032 GltA G413D AA

<400> 10

Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu

1 5 10 15

His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu

20 25 30

Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu

35 40 45

Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys

50 55 60

Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr

65 70 75 80

Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr

85 90 95

Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe

100 105 110

Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser

115 120 125

Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala

130 135 140

Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro

145 150 155 160

Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys

165 170 175

Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro

180 185 190

Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg

195 200 205

Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met

210 215 220

Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln

225 230 235 240

Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn

245 250 255

Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu

260 265 270

His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys

275 280 285

Ser Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Glu Phe Met Asn Lys Val Lys Asn

290 295 300

Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys

305 310 315 320

Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile

325 330 335

Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu

340 345 350

Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Tyr Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr

355 360 365

Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe

370 375 380

Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly

385 390 395 400

Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Asp Asn Lys Ile

405 410 415

Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Asn Glu Ser Arg Lys Leu Val

420 425 430

Pro Arg Glu Glu Arg

435

<210> 11

<211> 1314

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATCC13032 GltA G413D NT

<400> 11

atgtttgaaa gggatatcgt ggctactgat aacaacaagg ctgtcctgca ctaccccggt 60

ggcgagttcg aaatggacat catcgaggct tctgagggta acaacggtgt tgtcctgggc 120

aagatgctgt ctgagactgg actgatcact tttgacccag gttatgtgag cactggctcc 180

accgagtcga agatcaccta catcgatggc gatgcgggaa tcctgcgtta ccgcggctat 240

gacatcgctg atctggctga gaatgccacc ttcaacgagg tttcttacct acttatcaac 300

ggtgagctac caaccccaga tgagcttcac aagtttaacg acgagattcg ccaccacacc 360

cttctggacg aggacttcaa gtcccagttc aacgtgttcc cacgcgacgc tcacccaatg 420

gcaaccttgg cttcctcggt taacattttg tctacctact accaggacca gctgaaccca 480

ctcgatgagg cacagcttga taaggcaacc gttcgcctca tggcaaaggt tccaatgctg 540

gctgcgtacg cacaccgcgc acgcaagggt gctccttaca tgtacccaga caactccctc 600

aatgcgcgtg agaacttcct gcgcatgatg ttcggttacc caaccgagcc atacgagatc 660

gacccaatca tggtcaaggc tctggacaag ctgctcatcc tgcacgctga ccacgagcag 720

aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780

atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840

ctggagatgc tcgaagacat caagagcaac cacggtggcg acgcaaccga gttcatgaac 900

aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatgggct tcggacaccg cgtttacaag 960

aactacgatc cacgtgcagc aatcgtcaag gagaccgcac acgagatcct cgagcacctc 1020

ggtggcgacg atcttctgga tctggcaatc aagctggaag aaattgcact ggctgatgat 1080

tacttcatct cccgcaagct ctacccgaac gtagacttct acaccggcct gatctaccgc 1140

gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200

tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcagaca acaagatcaa ccgcccacgc 1260

caggtctaca ccggcaacga atcccgcaag ttggttcctc gcgaggagcg ctaa 1314

<210> 12

<211> 437

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATCC13869 GltA G413D AA

<400> 12

Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu

1 5 10 15

His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu

20 25 30

Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu

35 40 45

Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys

50 55 60

Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr

65 70 75 80

Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr

85 90 95

Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe

100 105 110

Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser

115 120 125

Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala

130 135 140

Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro

145 150 155 160

Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys

165 170 175

Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro

180 185 190

Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg

195 200 205

Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met

210 215 220

Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln

225 230 235 240

Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn

245 250 255

Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu

260 265 270

His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys

275 280 285

Asn Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Ala Phe Met Asn Lys Val Lys Asn

290 295 300

Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys

305 310 315 320

Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile

325 330 335

Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu

340 345 350

Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Cys Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr

355 360 365

Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe

370 375 380

Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly

385 390 395 400

Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Asp Asn Lys Ile

405 410 415

Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Lys Glu Ser Arg Lys Leu Val

420 425 430

Pro Arg Glu Glu Arg

435

<210> 13

<211> 1314

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATCC13869 GltA G413D NT

<400> 13

atgtttgaaa gggatatcgt ggctactgat aacaacaagg ctgtcctgca ctaccccggt 60

ggcgagttcg aaatggacat catcgaggct tctgagggta acaacggtgt tgtcctgggc 120

aagatgctgt ctgagactgg actgatcact tttgacccag gttatgtgag cactggctcc 180

accgagtcga agatcaccta catcgatggc gatgcgggaa tcctgcgtta ccgcggctat 240

gacatcgctg atctggctga gaatgccacc ttcaacgagg tttcttacct acttatcaac 300

ggtgagctac caaccccaga tgagcttcac aagtttaacg acgagattcg ccaccacacc 360

cttctggacg aggacttcaa gtcccagttc aacgtgttcc cacgcgacgc tcacccaatg 420

gcaaccttgg cttcctcggt taacattttg tctacctact accaggatca gctgaaccca 480

ctcgatgagg cacagcttga taaggcaacc gttcgcctca tggcaaaggt tccaatgctg 540

gctgcgtacg cacaccgcgc acgcaagggt gctccttaca tgtacccaga caactccctc 600

aacgcgcgtg agaacttcct gcgcatgatg ttcggttacc caaccgagcc atacgagatc 660

gacccaatca tggtcaaggc tctggacaag ctgctcatcc tgcacgctga ccacgagcag 720

aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780

atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840

ctggagatgc tcgaagacat caagaacaac cacggtggcg acgcaaccgc gttcatgaac 900

aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatgggct tcggacaccg cgtttacaag 960

aactacgatc cacgtgcagc aatcgtcaag gagaccgcac acgagatcct cgagcacctc 1020

ggtggcgacg atcttctgga tctggcaatc aagctggaag aaattgcact ggctgatgat 1080

tgcttcatct cccgcaagct ctacccgaac gtagacttct acaccggcct gatctaccgc 1140

gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200

tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcagaca acaagatcaa ccgcccacgc 1260

caggtctaca ccggcaagga atcccgcaag ttggttcctc gcgaggagcg ctaa 1314

<210> 14

<211> 437

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATCC 14067 GltA G413D, K415H AA

<400> 14

Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu

1 5 10 15

His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu

20 25 30

Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu

35 40 45

Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys

50 55 60

Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr

65 70 75 80

Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr

85 90 95

Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe

100 105 110

Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser

115 120 125

Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala

130 135 140

Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro

145 150 155 160

Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys

165 170 175

Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro

180 185 190

Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg

195 200 205

Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met

210 215 220

Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln

225 230 235 240

Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn

245 250 255

Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu

260 265 270

His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys

275 280 285

Asn Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Ala Phe Met Asn Lys Val Lys Asn

290 295 300

Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys

305 310 315 320

Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile

325 330 335

Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu

340 345 350

Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Tyr Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr

355 360 365

Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe

370 375 380

Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly

385 390 395 400

Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Asp Asn His Ile

405 410 415

Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Asn Glu Ser Arg Lys Leu Val

420 425 430

Pro Arg Glu Glu Arg

435

<210> 15

<211> 1314

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATCC 14067 GltA G413D, K415H NT

<400> 15

atgtttgaaa gggatatcgt ggctactgat aacaacaagg ctgtcctgca ctaccccggt 60

ggcgagttcg aaatggacat catcgaggct tctgagggta acaacggtgt tgtcctgggc 120

aagatgctgt ctgagactgg actgatcact tttgacccag gttatgtgag cactggctcc 180

accgagtcga agatcaccta catcgatggc gatgcgggaa tcctgcgtta ccgcggctat 240

gacatcgctg atctggctga gaatgccacc ttcaacgagg tttcttacct acttatcaac 300

ggtgagctac caaccccaga tgagcttcac aagtttaacg acgagattcg ccaccacacc 360

cttctggacg aggacttcaa gtcccagttc aacgtgttcc cacgcgacgc tcacccaatg 420

gcaaccttgg cttcctcggt taacattttg tctacctact accaggatca gctgaaccca 480

ctcgatgagg cacagcttga taaggcaacc gttcgcctca tggcaaaggt tccaatgctg 540

gctgcgtacg cacaccgcgc acgcaagggt gctccttaca tgtacccaga caactccctc 600

aacgcgcgtg agaacttcct gcgcatgatg ttcggttacc caactgagcc atacgagatc 660

gacccaatca tggtcaaggc tctggacaag ctgctcatcc tgcacgctga ccacgagcag 720

aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780

atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840

ctggagatgc tcgaagacat caagaacaac cacggtggcg acgcaaccgc gttcatgaac 900

aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatgggct tcggacaccg cgtttacaag 960

aattacgatc cacgtgcagc aatcgtcaag gagaccgcac acgagatcct cgagcacctc 1020

ggtggcgacg atcttctgga tctggcaatc aagctggaag aaattgcact ggctgatgat 1080

tacttcatct cccgcaagct ctacccgaac gtagacttct acaccggcct gatctaccgc 1140

gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200

tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcagaca accacatcaa ccgcccacgc 1260

caggtctaca ccggcaacga atcccgcaag ttggttcctc gcgaggagcg ctaa 1314

<210> 16

<211> 437

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATCC13032 GltA G413D, K415H AA

<400> 16

Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu

1 5 10 15

His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu

20 25 30

Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu

35 40 45

Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys

50 55 60

Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr

65 70 75 80

Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr

85 90 95

Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe

100 105 110

Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser

115 120 125

Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala

130 135 140

Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro

145 150 155 160

Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys

165 170 175

Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro

180 185 190

Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg

195 200 205

Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met

210 215 220

Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln

225 230 235 240

Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn

245 250 255

Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu

260 265 270

His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys

275 280 285

Ser Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Glu Phe Met Asn Lys Val Lys Asn

290 295 300

Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys

305 310 315 320

Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile

325 330 335

Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu

340 345 350

Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Tyr Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr

355 360 365

Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe

370 375 380

Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly

385 390 395 400

Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Asp Asn His Ile

405 410 415

Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Asn Glu Ser Arg Lys Leu Val

420 425 430

Pro Arg Glu Glu Arg

435

<210> 17

<211> 1314

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATCC13032 GltA G413D, K415H NT

<400> 17

atgtttgaaa gggatatcgt ggctactgat aacaacaagg ctgtcctgca ctaccccggt 60

ggcgagttcg aaatggacat catcgaggct tctgagggta acaacggtgt tgtcctgggc 120

aagatgctgt ctgagactgg actgatcact tttgacccag gttatgtgag cactggctcc 180

accgagtcga agatcaccta catcgatggc gatgcgggaa tcctgcgtta ccgcggctat 240

gacatcgctg atctggctga gaatgccacc ttcaacgagg tttcttacct acttatcaac 300

ggtgagctac caaccccaga tgagcttcac aagtttaacg acgagattcg ccaccacacc 360

cttctggacg aggacttcaa gtcccagttc aacgtgttcc cacgcgacgc tcacccaatg 420

gcaaccttgg cttcctcggt taacattttg tctacctact accaggacca gctgaaccca 480

ctcgatgagg cacagcttga taaggcaacc gttcgcctca tggcaaaggt tccaatgctg 540

gctgcgtacg cacaccgcgc acgcaagggt gctccttaca tgtacccaga caactccctc 600

aatgcgcgtg agaacttcct gcgcatgatg ttcggttacc caaccgagcc atacgagatc 660

gacccaatca tggtcaaggc tctggacaag ctgctcatcc tgcacgctga ccacgagcag 720

aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780

atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840

ctggagatgc tcgaagacat caagagcaac cacggtggcg acgcaaccga gttcatgaac 900

aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatgggct tcggacaccg cgtttacaag 960

aactacgatc cacgtgcagc aatcgtcaag gagaccgcac acgagatcct cgagcacctc 1020

ggtggcgacg atcttctgga tctggcaatc aagctggaag aaattgcact ggctgatgat 1080

tacttcatct cccgcaagct ctacccgaac gtagacttct acaccggcct gatctaccgc 1140

gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200

tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcagaca accacatcaa ccgcccacgc 1260

caggtctaca ccggcaacga atcccgcaag ttggttcctc gcgaggagcg ctaa 1314

<210> 18

<211> 437

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATCC13869 GltA G413D, K415H AA

<400> 18

Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu

1 5 10 15

His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu

20 25 30

Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu

35 40 45

Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys

50 55 60

Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr

65 70 75 80

Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr

85 90 95

Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe

100 105 110

Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser

115 120 125

Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala

130 135 140

Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro

145 150 155 160

Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys

165 170 175

Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro

180 185 190

Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg

195 200 205

Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met

210 215 220

Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln

225 230 235 240

Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn

245 250 255

Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu

260 265 270

His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys

275 280 285

Asn Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Ala Phe Met Asn Lys Val Lys Asn

290 295 300

Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys

305 310 315 320

Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile

325 330 335

Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu

340 345 350

Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Cys Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr

355 360 365

Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe

370 375 380

Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly

385 390 395 400

Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Asp Asn His Ile

405 410 415

Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Lys Glu Ser Arg Lys Leu Val

420 425 430

Pro Arg Glu Glu Arg

435

<210> 19

<211> 1314

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATCC13869 GltA G413D, K415H NT

<400> 19

atgtttgaaa gggatatcgt ggctactgat aacaacaagg ctgtcctgca ctaccccggt 60

ggcgagttcg aaatggacat catcgaggct tctgagggta acaacggtgt tgtcctgggc 120

aagatgctgt ctgagactgg actgatcact tttgacccag gttatgtgag cactggctcc 180

accgagtcga agatcaccta catcgatggc gatgcgggaa tcctgcgtta ccgcggctat 240

gacatcgctg atctggctga gaatgccacc ttcaacgagg tttcttacct acttatcaac 300

ggtgagctac caaccccaga tgagcttcac aagtttaacg acgagattcg ccaccacacc 360

cttctggacg aggacttcaa gtcccagttc aacgtgttcc cacgcgacgc tcacccaatg 420

gcaaccttgg cttcctcggt taacattttg tctacctact accaggatca gctgaaccca 480

ctcgatgagg cacagcttga taaggcaacc gttcgcctca tggcaaaggt tccaatgctg 540

gctgcgtacg cacaccgcgc acgcaagggt gctccttaca tgtacccaga caactccctc 600

aacgcgcgtg agaacttcct gcgcatgatg ttcggttacc caaccgagcc atacgagatc 660

gacccaatca tggtcaaggc tctggacaag ctgctcatcc tgcacgctga ccacgagcag 720

aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780

atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840

ctggagatgc tcgaagacat caagaacaac cacggtggcg acgcaaccgc gttcatgaac 900

aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatgggct tcggacaccg cgtttacaag 960

aactacgatc cacgtgcagc aatcgtcaag gagaccgcac acgagatcct cgagcacctc 1020

ggtggcgacg atcttctgga tctggcaatc aagctggaag aaattgcact ggctgatgat 1080

tgcttcatct cccgcaagct ctacccgaac gtagacttct acaccggcct gatctaccgc 1140

gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200

tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcagaca accacatcaa ccgcccacgc 1260

caggtctaca ccggcaagga atcccgcaag ttggttcctc gcgaggagcg ctaa 1314

<210> 20

<211> 172

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> IlvN AA

<400> 20

Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln

1 5 10 15

Asp Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg

20 25 30

Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Ala Lys Thr Glu Thr Leu Gly

35 40 45

Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu

50 55 60

Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val

65 70 75 80

Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys

85 90 95

Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn

100 105 110

Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile

115 120 125

Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp Val Met

130 135 140

Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu

145 150 155 160

Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile

165 170

<210> 21

<211> 520

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> IlvN NT

<400> 21

atggctaatt ctgacgtcac ccgccacatc ctgtccgtac tcgttcagga cgtagacgga 60

atcatttccc gcgtatcagg tatgttcacc cgacgcgcat tcaacctcgt gtccctcgtg 120

tctgcaaaga ccgaaacact cggcatcaac cgcatcacgg ttgttgtcga cgccgacgag 180

ctcaacattg agcagatcac caagcagctc aacaagctga tccccgtgct caaagtcgtg 240

cgacttgatg aagagaccac catcgcccgc gcaatcatgc tggttaaggt ctctgcggat 300

agcaccaacc gtccgcagat cgtcgacgcc gcgaacatct tccgcgcccg agtcgtcgac 360

gtggctccag actctgtggt tattgaatcc acaggcaccc caggcaagct ccgcgcactg 420

cttgatgtga tggaaccatt cggaatccgc gaactgatcc aatccggaca gattgcactc 480

aaccgcggtc cgaagaccat ggctccggcc aagatctaaa 520

<210> 22

<211> 172

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IlvN A42V AA

<400> 22

Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln

1 5 10 15

Asp Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg

20 25 30

Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Val Lys Thr Glu Thr Leu Gly

35 40 45

Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu

50 55 60

Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val

65 70 75 80

Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys

85 90 95

Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn

100 105 110

Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile

115 120 125

Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp Val Met

130 135 140

Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu

145 150 155 160

Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile

165 170

<210> 23

<211> 519

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IlvN A42V NT

<400> 23

atggctaatt ctgacgtcac ccgccacatc ctgtccgtac tcgttcagga cgtagacgga 60

atcatttccc gcgtatcagg tatgttcacc cgacgcgcat tcaacctcgt gtccctcgtg 120

tctgtaaaga ccgaaacact cggcatcaac cgcatcacgg ttgttgtcga cgccgacgag 180

ctcaacattg agcagatcac caagcagctc aacaagctga tccccgtgct caaagtcgtg 240

cgacttgatg aagagaccac catcgcccgc gcaatcatgc tggttaaggt ctctgcggat 300

agcaccaacc gtccgcagat cgtcgacgcc gcgaacatct tccgcgcccg agtcgtcgac 360

gtggctccag actctgtggt tattgaatcc acaggcaccc caggcaagct ccgcgcactg 420

cttgatgtga tggaaccatt cggaatccgc gaactgatcc aatccggaca gattgcactc 480

aaccgcggtc cgaagaccat ggctccggcc aagatctaa 519

<210> 24

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Общая формула 1

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)

<223> Xaa представляет собой N или S.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)

<223> Xaa представляет собой A или E.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (73)

<223> Xaa представляет собой Y или C.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (127)

<223> Xaa представляет собой K или H.

<400> 24

Xaa Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Xaa Phe Met Asn Lys Val Lys Asn

1 5 10 15

Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys

20 25 30

Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile

35 40 45

Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu

50 55 60

Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Xaa Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr

65 70 75 80

Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe

85 90 95

Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly

100 105 110

Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Asp Asn Xaa

115 120 125

<210> 25

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 1

<400> 25

tcgagctcgg tacccccgtt cgtatgatcg gttccgcaca ggcc 44

<210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 2

<400> 26

cgtgggcggt tgatcttgtt gtctgctgca c 31

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 3

<400> 27

gtgcagcaga caacaagatc aaccgcccac g 31

<210> 28

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 4

<400> 28

ctctagagga tccccgccgt aagcagcctc tggtggaatg gtcagc 46

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 5

<400> 29

atgtttgaaa gggatatcgt ggct 24

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 6

<400> 30

ttagcgctcc tcgcgaggaa cc 22

<210> 31

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 7

<400> 31

tcgagctcgg tacccccgcg tcaccaaagc gga 33

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 8

<400> 32

gtccctcgtg tctgtaaaga ccgaaacact 30

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 9

<400> 33

agtgtttcgg tctttacaga cacgagggac 30

<210> 34

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 10

<400> 34

ctctagagga tccccttaga tcttggccgg agcca 35

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 11

<400> 35

ccgcgtcacc aaagcgga 18

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 12

<400> 36

ttagatcttg gccggagcca 20

<210> 37

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 13

<400> 37

cgtgggcggt tgatgtggtt gtctgctgca c 31

<210> 38

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 14

<400> 38

gtgcagcaga caaccacatc aaccgcccac g 31

<---

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой полипептид, вовлеченный в получение L-валина, в котором аминокислота, соответствующая положению 413 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена аспарагиновой кислотой, где полипептид имеет идентичность последовательности 80% или более с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. Изобретение касается также способа получения L-валина с использованием микроорганизма рода Corynebacterium, который содержит указанный полипептид. Изобретение позволяет получать L-валин с высокой степенью эффективности. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 8 табл., 3 пр.

1. Полипептид, вовлеченный в получение L-валина, в котором аминокислота, соответствующая положению 413 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена аспарагиновой кислотой, где полипептид имеет идентичность последовательности 80% или более с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.

2. Полипептид по п. 1, который имеет идентичность последовательности 90% или более с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.

3. Полипептид по п. 1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.

4. Полипептид по п. 1, который содержит аминокислотную последовательность общей формулы 1, приведенной ниже:

общая формула 1

X1N HGGDATX2FMN KVKNKEDGVR LMGFGHRVYK NYDPRAAIVK

ETAHEILEHL GGDDLLDLAI KLEEIALADD X3FISRKLYPN VDFYTGLIYR

AMGFPTDFFT VLFAIGRLPG WIAHYREQLG AADNX4 (SEQ ID NO: 24),

где в приведенной выше общей формуле 1:

X1 представляет собой аспарагин или серин;

X2 представляет собой аланин или глутаминовую кислоту;

X3 представляет собой тирозин или цистеин; и

X4 представляет собой лизин или гистидин.

5. Полипептид по п. 1, который имеет идентичность последовательности 90% или более с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, 10, 12 или 14.

6. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пп. 1-5.

7. Микроорганизм рода Corynebacterium, для получения L-валина содержащий полипептид, вовлеченный в получение L-валина, в котором глицин, который представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 413 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменен аспарагиновой кислотой, где полипептид имеет идентичность последовательности 80% или более с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, или полинуклеотид, кодирующий данный полипептид.

8. Микроорганизм по п. 7, который обладает способностью продуцировать L-валин.

9. Микроорганизм по п. 7, который представляет собой Corynebacterium glutamicum.

10. Способ получения L-валина, включающий культивирование в среде микроорганизма рода Corynebacterium, который содержит полипептид, вовлеченный в получение L-валина, в котором глицин, который представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 413 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменен аспарагиновой кислотой, где полипептид имеет идентичность последовательности 80% или более с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид.

11. Способ по п. 10, дополнительно включающий выделение L-валина из культуральной среды или культивируемого микроорганизма.

12. Композиция для получения L-валина, содержащая

(1) микроорганизм рода Corynebacterium, который содержит полипептид, вовлеченный в получение L-валина, в котором глицин, который представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 413 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменен аспарагиновой кислотой, где полипептид имеет идентичность последовательности 80% или более с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид; и

(2) среду, на которой выращивают микроорганизм; или эксципиент.