Область изобретения
Настоящее изобретение относится к варианту префенатдегидратазы и способу получения аминокислот с разветвленной цепью с его использованием.
Описание родственной области техники
L-аминокислоты являются основными структурными единицами белков и используются в качестве важных веществ для фармацевтического сырья и пищевых добавок, кормов для животных, питательных веществ, пестицидов, бактерицидов и т.п. Поэтому промышленное производство аминокислот стало экономически важным промышленным процессом.
Различные исследования были проведены для эффективного получения аминокислот, например, в попытках разработки микроорганизмов, продуцирующих аминокислоты с высокой эффективностью, или технологии процесса ферментации. В частности, разработаны подходы, специфические для целевого вещества, такие как увеличение экспрессии генов, кодирующих ферменты, вовлеченные в биосинтез аминокислот, или удаление генов, не являющихся необходимыми для биосинтеза аминокислоты в штаммах рода Corynebacterium (патент США №9109242 В2, патент США №8030036 В2). В дополнение к этим способам также используют способ удаления гена, не вовлеченного в продуцирование аминокислоты, и способ удаления гена, специфическая функция которого в продуцировании аминокислоты не известна.
Аминокислоты с разветвленной цепью относятся к трем аминокислотам - валину, лейцину и изолейцину, которые, как известно, в основном метаболизируются в мышцах и используются в качестве источника энергии во время активности. Поскольку известно, что аминокислоты с разветвленной цепью играют важную роль в поддержании мышц и увеличении мышечной массы во время активности, их потребление увеличивается.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить вариант префенатдегидратазы, в котором аминокислота, соответствующая положению 182 относительно N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на другую аминокислоту.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить полинуклеотид, кодирующий вариант, и включающий его вектор.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить микроорганизм рода Corynebacterium, включающий один или более из указанных варианта, полинуклеотид а и вектора.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения аминокислот с разветвленной цепью, включающий стадию культивирования микроорганизма в среде.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ
Настоящее изобретение будет подробно описано далее. Тем не менее, каждое описание и воплощение, раскрытое в этом изобретении, также может быть применимо к другим описаниям и воплощениям. То есть, все комбинации различных элементов, раскрытые в этом описании изобретения, входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, объем настоящего изобретения не ограничен конкретным описанием, представленным ниже.
Кроме того, специалистам в данной области техники понятно, или они способны определить с использованием не более чем рутинного экспериментирования множество эквивалентов конкретных воплощений раскрытого здесь изобретения. Кроме того, эти эквиваленты следует интерпретировать как входящие в объем настоящего изобретения.
В одном аспекте настоящего изобретения предложен вариант префенатдегидратазы, в котором аминокислота, соответствующая положению 182 относительно N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на другую аминокислоту.
Вариант префенатдегидратазы относится к варианту, в котором аминокислота, соответствующая положению 182 относительно N-конца префенатдегидратазы с SEQ ID NO: 1, заменена на другую аминокислоту в полипептиде, обладающем активностью префенатдегидратазы, или в префенатдегидратазе.
Использованный здесь термин "префенатдегидратаза" представляет собой фермент, который катализирует следующую реакцию:
Префенатдегидратаза в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой префенатдегидратазу или полипептид, обладающий активностью префенатдегидратазы, в отношении которого произведена модификация для получения варианта префенатдегидратазы, предложенного в настоящем изобретении. В частности, она может представлять собой встречающийся в природе полипептид или полипептид дикого типа, или его зрелый полипептид, и может включать его вариант или его функциональный фрагмент, но префенатдегидратаза в соответствии с настоящим изобретением может включать любой из них, без ограничения, при условии что он может представлять собой исходную форму относительно варианта префенатдегидратазы по настоящему изобретению.
В настоящем изобретении префенатдегидратаза может представлять собой, без ограничения, полипептид с SEQ ID NO: 1. В одном из воплощений префенатдегидратаза может представлять собой полипептид, имеющий приблизительно 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентичности последовательности с полипептидом с SEQ ID NO: 1, и любой из них включен в объем префенатдегидратазы, при условии что он обладает активностью, идентичной или соответствующей полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
Последовательность префенатдегидратазы по настоящему изобретению может быть получена в GenBank в NCBI (Национальный центр биотехнологической информации), которая представляет собой известную базу данных. В частности, префенатдегидратаза может представлять собой полипептид, кодируемый геном pheA, но не ограничен этим.
Используемый здесь "вариант" относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, отличающуюся от таковой для данного варианта перед модификацией путем консервативной замены и/или модификации одной или более чем одной аминокислоты, но с сохранением функций или свойств. Такой вариант как правило может быть идентифицирован путем модификации одной или более чем одной аминокислоты аминокислотной последовательности полипептида и путем оценки свойств модифицированного полипептида. Иначе говоря, способность варианта может быть увеличена, не изменена или уменьшена по сравнению с полипептидом до модификации. Некоторые варианты могут включать варианты, в которых один или более чем один фрагмент, такой как N-концевая лидерная последовательность или транс мембранный домен, удален. Другие варианты могут включать варианты, в которых удален фрагмент из N- и/или С-конца зрелого белка. Термин "вариант" может быть использован взаимозаменяемо с терминами, такими как модификация, модифицированный полипептид, модифицированный белок, мутант и мутеин и дивергент, но не ограничены ими, при условии что термин используют в значении вариации.
Кроме того, вариант может включать делеции или вставки аминокислот, которые обладают минимальным влиянием на свойства и вторичную структуру полипептида. Например, по N-концу варианта может быть конъюгирована сигнальная (или лидерная) последовательность, которая котрансляционно или посттрансляционно вовлечена в перенос белков. Кроме того, вариант может быть конъюгирован с другими последовательностями или линкерами для идентификации, очистки или синтеза полипептида.
Вариант, предложенный в настоящем изобретении, может представлять собой вариант префенатдегидратазы, в котором аминокислота, соответствующая положению 182 относительно N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на другую аминокислоту, но не ограничен этим.
Аминокислота, соответствующая положению 182 относительно N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, может представлять собой аргинин.
Вариант, предложенный в настоящем изобретении, может включать замену аминокислоты, соответствующей положению 182 относительно N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, на другую аминокислоту, отличную от аргинина, но не ограничен этим.
"Другая аминокислота" не ограничена при условии того, что аминокислота отличается от аминокислоты до замены. С другой стороны, когда в описании настоящего изобретения используют термин 'замещенный конкретной аминокислотой', то очевидно, что аминокислота заменена на аминокислоту, отличную от аминокислоты перед заменой, даже тогда, когда отдельно не указано, что аминокислота заменена на другую аминокислоту.
В одном из воплощений вариант по настоящему изобретению может представлять собой вариант, в котором аминокислота, соответствующая положению 182 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, которая представляет собой референсный белок, заменена на аминокислоту, отличную от аминокислоты перед заменой, среди гидрофобных аминокислот или алифатических аминокислот.
В частности, вариант может представлять собой вариант, в котором аминокислота, соответствующая положению 182 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на одну аминокислоту из гидрофобных (неполярных) аминокислот или алифатических аминокислот.Алифатическая аминокислота может представлять собой, например, аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глицина, аланина, валина, лейцина и изолейцина, но не ограничивается ими. Гидрофобная (неполярная) аминокислота может представлять собой, например, аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глицина, метионина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, пролина, фенилаланина, тирозина и триптофана, но не ограничивается ими.
В одном из воплощений вариант по настоящему изобретению может представлять собой вариант, в котором аминокислота, соответствующая положению 182 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на аминокислоту, отличную от аминокислоты перед заменой, среди аминокислот малого размера, но не ограничивается ими.
Используемый здесь термин "аминокислота малого размера" включает глицин, аланин, серии, треонин, цистеин, валин, лейцин, изолейцин, пролин и аспарагин, которые представляют собой аминокислоты с относительно небольшим размером среди 20 аминокислот, и конкретно может относиться к глицину, аланину, серину, треонину, цистеину, валину, лейцину, изолейцину и пролину, но не ограничивается ими. Более конкретно, он может относиться к глицину, аланину, валину, лейцину, изолейцину, серину и треонину, например, аланину, серину, глицину, но не ограничивается ими.
Более конкретно, в варианте по настоящему изобретению замена на другую аминокислоту может представлять собой замену на аланин, но не ограничивается им.
Используемый здесь термин "соответствующий" относится к аминокислотным остаткам в положениях, перечисленных в полипептиде, или аминокислотным остаткам, которые подобны, идентичны или гомологичны остаткам, перечисленным в полипептиде. Идентификация аминокислоты в соответствующем положении может определять конкретную аминокислоту в последовательности, которая относится к конкретной последовательности. Используемый здесь термин "соответствующая область" как правило относится к подобному или соответствующему положению в родственном белке или референсном белке.
Например, любая аминокислотная последовательность выравнивается с SEQ ID NO: 1, и на основании этого выравнивания каждый аминокислотный остаток аминокислотной последовательности может быть пронумерован со ссылкой на аминокислотный остаток, соответствующий аминокислотному остатку в SEQ ID NO: 1. Например, алгоритм выравнивания последовательности, такой как описано в настоящем изобретении, может определять положение аминокислоты или положение, в котором модификация, такая как замена, вставка или делеция, имеет место, путем сравнения с интересующей последовательностью (также называемой "референсная последовательность").
Например, для таких выравниваний может быть использован алгоритм Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), программа Needleman в пакете EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277) и т.п, но не ограничиваться ими, и подходящим образом может быть использована программа для выравнивания последовательностей, алгоритм попарного сравнения последовательностей и т.п., известные в данной области техники.
В одном из воплощений вариант по настоящему изобретению может иметь приблизительно 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более чем 99% идентичности последовательности с полипептидом с SEQ ID NO: 1, в котором аминокислота, соответствующая положению 182 в SEQ ID NO: 1, заменена на другую аминокислоту.
В одном из воплощений вариант по настоящему изобретению может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,7% или 99,9% или более чем 99,9% гомологии или идентичности с аминокислотной последовательностью, описанной в SEQ ID NO: 5.
В частности, вариант по настоящему изобретению может иметь, содержать или состоять из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5, или может по существу состоять из данной аминокислотной последовательности.
В одном из воплощений вариант по настоящему изобретению может включать аминокислотную последовательность, имеющую аланин в качестве аминокислоты, соответствующей положению 182, на основе аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и имеющую по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,7% или 99,9% или более чем 99,9% гомологии или идентичности с аминокислотной последовательностью, описанной в SEQ ID NO: 5. Кроме того, очевидно, что варианты, имеющие аминокислотные последовательности, в которых некоторые последовательности удалены, модифицированы, заменены, консервативно заменены или добавлены, также включены в объем настоящего изобретения, при условии что аминокислотные последовательности имеют такую гомологию или идентичность и демонстрируют эффективность, соответствующую эффективности варианта по настоящему изобретению.
Например, вариант может включать вариант, имеющий вставку или делецию последовательности, которые не изменяют функцию варианта по настоящему изобретению, по N-концу, С-концу и/или внутри аминокислотной последовательности, или природную мутацию, молчащую мутацию или консервативную замену.
"Консервативная замена" означает замену одной аминокислоты на другую аминокислоту, обладающую подобными структурными и/или химическими свойствами. Такая аминокислотная замена как правило может быть осуществлена на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильно ста и/или амфипатической природы остатков. Как правило, консервативная замена вряд ли может влиять или не влияет на активность белков или полипептидов.
Использованный здесь термин "гомология" или "идентичность" означает степень сходства между двумя данными аминокислотными последовательностями или последовательностями оснований, и она может быть выражена в процентах. Часто термины "гомология" и "идентичность" можно использовать взаимозаменяемо.
Гомологию или идентичность последовательностей консервативного полинуклеотид а или полипептида определяют путем стандартных алгоритмов выравнивания, и можно использовать вместе с штрафом за пропуск в последовательности, установленный в используемой программе. По существу, гомологичные или идентичные последовательности как правило могут обладать способностью к гибридизации с полными последовательностями или частью последовательностей в умеренно строгих или очень строгих условиях. Понятно, что гибридизация также включает гибридизацию полинуклеотид а с полинуклеотидом, включающим общий кодон или кодон в соответствии с вырожденностью кодонов.
Имеют ли любые две полинуклеотидные или полипептидные последовательности гомологию, сходство или идентичность может быть, например, определено с использованием известного компьютерного алгоритма, такого как программа "FASTA", например, с использованием параметров по умолчанию, таких как Pearson et al., (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]:2444. Альтернативно, гомология, сходство или идентичность могут быть определены с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), осуществляемого в программе Needleman пакета EMBOSS (EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277) (версия 5.0.0 или более поздняя) (включающий программный пакет GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, и [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Например, для определения гомологии, сходства или идентичности могут быть использованы BLAST от Национального Центра Биотехнологической Информации или ClustalW.
Гомологию, сходство или идентичность между полинуклеотидами или полипептидами можно определить путем сравнения информации о последовательностях с использованием, например, компьютерной программы GAP, такой как Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443, как раскрыто, например, в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. В общем, программа GAP определяет величину, получаемую путем деления количества выровненных одинаковых символов (т.е. нуклеотидов или аминокислот) на общее количество символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать: (1) матрицу двоичного сравнения (содержащую величину 1 в случае идентичности и 0 в случае неидентичности) и взвешенную матрицу сравнения в соответствии с Gribskov et al. (1986), Nucl. Acids Res. 14:6745 (или версия EDNAFULL (EMBOSS в NCBI NUC4.4) матрица замен), как раскрыто в Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) штраф 3,0 за каждый пропуск и дополнительно штраф 0,10 за каждый символ в каждом пропуске (или штраф за внесение пропуска 10 и штраф за удлинение пропуска 0,5) и (3) отсутствие штрафа за концевые пропуски.
В одном из воплощений вариант по настоящему изобретению может обладать активностью префенатдегидратазы. В одном из воплощений вариант по настоящему изобретению может обладать активностью с увеличением способности продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью по сравнению с префенатдегидратазой дикого типа или немодифицированной префенатдегидратазой. В одном из воплощений вариант по настоящему изобретению может обладать активностью с уменьшением уровня продукции побочных продуктов в пути продуцирования аминокислот с разветвленной цепью по сравнению с префенатдегидратазой дикого типа или немодифицированной префенатдегидратазой. В одном из воплощений вариант по настоящему изобретению может обладать ослабленной активностью по сравнению с префенатдегидратазой дикого типа или немодифицированной префенатдегидратазой, но не ограничиваться этим.
В еще одном аспекте в соответствии с настоящим изобретением предложен полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему изобретению.
Использованный здесь термин "полинуклеотид" представляет собой цепь ДНК или РНК, имеющую определенную длину или больше в виде полимера из нуклеотидов, в котором нуклеотидные мономеры связаны в длинную цепь посредством ковалентных связей, и более конкретно, он означает полинуклеотидный фрагмент, кодирующий вариант.
Полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему изобретению, может включать нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 5. В одном из воплощений в соответствии с настоящим изобретением полинуклеотид по настоящему изобретению может иметь или включать последовательность SEQ ID NO: 6. Кроме того, полинуклеотид по настоящему изобретению может состоять из или по существу состоять из последовательности SEQ ID NO: 6.
В полинуклеотиде по настоящему изобретению различные модификации могут быть осуществлены в кодирующей области, при условии что аминокислотная последовательность варианта по настоящему изобретению не изменена, в соответствии с вырожденностью кодонов или кодонами, предпочтительными для организмов, которые предназначены для экспрессирования варианта по настоящему изобретению. В частности, полинуклеотид по настоящему изобретению может иметь или включать нуклеотидную последовательность, имеющую 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, и менее чем 100% гомологии или идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 6, или может состоять из или по существу состоять из нуклеотидной последовательности, имеющей 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, и менее чем 100% гомологии или идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 6, но не ограничен этим.
В этой связи в последовательности, имеющей такую гомологию или идентичность, кодон, кодирующий аминокислоту, соответствующую положению 182 в SEQ ID NO: 6, может представлять собой один из кодонов, кодирующих аланин.
Кроме того, полинуклеотид по настоящему изобретению может включать зонд, который может быть получен из известной генной последовательности, например, последовательности без ограничения, при условии что она представляет собой последовательность, которая может гибридизоваться с последовательностью, комплементарной всей или части полинуклеотидной последовательности в соответствии с настоящим изобретением в строгих условиях. "Строгие условия" означают условия, при которых возможна специфическая гибридизация между полинуклеотидами. Эти условия, в частности, описаны в литературе (см. J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8). Их примеры включают условия, при которых полинуклеотиды, имеющие более высокую гомологию или идентичность, а именно, полинуклеотиды, имеющие 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более или 99% или более гомологии или идентичности, гибридизуются друг с другом, тогда как полинуклеотиды, имеющие меньшую гомологию или идентичность, не гибридизуются друг с другом, или условия отмывки при обычной гибридизации по Саузерну, при которой отмывку осуществляют однократно, в частности, два или три раза при концентрации соли и температуре, эквивалентных 60°С, 1 × SSC (раствор цитрата и хлорида натрия), 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), в частности, 60°С, 0,1× SSC, 0,1% SDS, более конкретно, 68°С, 0,1 × SSC, 0,1% SDS.
Для гибридизации требуется, чтобы две нуклеиновые кислоты содержали комплементарные последовательности, хотя ошибки спаривания между основаниями возможны в зависимости от строгости условий гибридизации. Термин "комплементарный" используют для описания взаимодействия между нуклеотидными основаниями, которые могут гибридизоваться друг с другом. Например, в случае ДНК, аденозин комплементарен тимину, а цитозин комплементарен гуанину. Таким образом, полинуклеотид по настоящему изобретению может включать по существу подобные последовательности нуклеиновых кислот, а также выделенные фрагменты нуклеиновых кислот, комплементарные всей последовательности.
В частности, полинуклеотид, имеющий гомологию или идентичность с полинуклеотидом по настоящему изобретению, может быть детектирован с использованием условий гибридизации, включающих стадию гибридизации при значении Tm 55°С и вышеописанные условия. Значение Tm может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но не ограничивается ими, и может быть подходящим образом скорректировано специалистом в данной области техники в зависимости от задачи.
Подходящая строгость условий для гибридизации полинуклеотидов зависит от длины и степени комплементарности полинуклеотида, и эти переменные хорошо известны в данной области техники (например, Sambrook et al., выше).
В еще одном аспекте в соответствии с настоящим изобретением предложен вектор, включающий полинуклеотид по настоящему изобретению. Вектор может представлять собой экспрессионный вектор для экспрессии полинуклеотида в клетках-хозяевах, но не ограничен этим.
"Вектор" по настоящему изобретению относится к конструкции ДНК, включающей полинуклеотидную последовательность, кодирующую интересующий полипептид, который функционально связан с подходящей областью для контролирования экспрессии (последовательностью, контролирующей экспрессию), таким образом чтобы обеспечивать экспрессию интересующего полипептида в подходящей клетке-хозяине. Область, контролирующая экспрессию, может включать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую операторную последовательность для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт для связывания с рибосомой на мРНК, и последовательность, регулирующую прекращение транскрипции и трансляции. Вектор может быть трансформирован в подходящую клетку-хозяина и затем может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина, или может быть интегрирован в сам геном.
Вектор, используемый в настоящем изобретении, не ограничен конкретным образом, и может быть использован любой вектор, известный в данной области техники. Примеры обычно используемых векторов могут включать природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора могут быть использованы pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A и Charon21A и т.п. В качестве плазмидного вектора могут быть использованы система pDC, система pBR, система pUC, система pBluescriptll, система pGEM, система pTZ, система pCL, система рЕТ и т.п. В частности, может быть использован вектор pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC и т.п.
Например, полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид, может быть встроен в хромосому с использованием вектора для внутриклеточного встраивания хромосом. Встраивание полинуклеотида в хромосому может быть осуществлено без ограничения любым способом, известным в данной области техники, например, при помощи гомологичной рекомбинации. Вектор может дополнительно включать селективный маркер для идентификации встраивания в хромосому. Селективный маркер предназначен для отбора клеток, трансформированных векторами, то есть для идентификации встраивания интересующей молекулы нуклеиновой кислоты, и могут быть использованы маркеры, которые подтверждают селективные фенотипы, такие как резистентность к лекарственным средствам, потребность в питательных веществах, резистентность к цитотоксическим агентам или экспрессия поверхностных полипептидов. В среде, обработанной селективным агентом, только клетки, экспрессирующие селективный маркер, выживают или демонстрируют отличающиеся фенотипические характеристики, и, таким образом, трансформированные клетки могут быть отобраны.
Используемый здесь термин "трансформация" означает, что вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, вводят в клетку-хозяина или микроорганизм таким образом, что полипептид, кодируемый полинуклеотидом, может экспрессироваться в данной клетке-хозяине. Трансформированный полинуклеотид может быть расположен путем встраивания в хромосому клетки-хозяина или быть расположен за пределами хромосомы, при условии что он может экспрессироваться в клетке-хозяине. Полинуклеотид включает ДНК и РНК, кодирующие интересующий полипептид. Полинуклеотид может быть введен в любой форме, при условии что он может быть введен в клетку-хозяина и затем экспрессироваться. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генетическую конструкцию, содержащую все элементы, требующиеся для ее автономной экспрессии. Экспрессионная кассета обычно может включать промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, сигнал прекращения транскрипции, сайт связывания с рибосомой и сигнал прекращения трансляции. Экспрессионная кассета может находиться в форме экспрессионного вектора, способного к саморепликации. Кроме того, полинуклеотид без ограничения может быть введен в клетку-хозяина сам по себе и функционально связан с последовательностью, требующейся для его экспрессии в клетке-хозяине.
Кроме того, использованный здесь термин "функционально связанный" означает, что последовательность полинуклеотида функционально связана с промоторной последовательностью, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего интересующий вариант по настоящему изобретению.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен микроорганизм рода Corynebacterium, включающий вариант по настоящему изобретению, полинуклеотид по настоящему изобретению или вектор по настоящему изобретению.
Микроорганизм по настоящему изобретению может включать вариант полипептида по настоящему изобретению, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, или вектор, включающий полинуклеотид по настоящему изобретению.
Используемый здесь термин "микроорганизм" или "штамм" включает все микроорганизмы дикого типа или естественным образом или искусственно генетически модифицированные микроорганизмы, и он может представлять собой микроорганизм, в котором конкретный механизм ослаблен или усилен вследствие встраивания чужеродного гена или путем усиления или инактивации активности эндогенного гена, и может представлять собой микроорганизм, включающий генетическую модификацию, для продуцирования интересующего полипептида, белка или продукта.
Штамм по настоящему изобретению может представлять собой штамм, включающий любой один или более из варианта по настоящему изобретению, полинуклеотида по настоящему изобретению и вектора, включающего полинуклеотид по настоящему изобретению; штамм, модифицированный для экспрессии варианта по настоящему изобретению или полинуклеотида по настоящему изобретению; штамм (например рекомбинантный штамм), экспрессирующий вариант по настоящему изобретению или полинуклеотид по настоящему изобретению; или штамм (например рекомбинантный штамм), обладающий активностью варианта по настоящему изобретению, но не ограничиваться этим.
Штамм по настоящему изобретению может представлять собой штамм, обладающий способностью продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью.
Штамм по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, обладающий способностью от природы продуцировать префенатдегидратазау или аминокислоты с разветвленной цепью, или микроорганизм, полученный путем введения варианта по настоящему изобретению или кодирующего его полинуклеотида (или вектора, включающего полинуклеотид) в родительский штамм, не обладающий способностью продуцировать префенатдегидратазу или аминокислоты с разветвленной цепью, и/или путем придания родительскому штамму способности продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью, но не ограничиваться этим.
Например, штамм по настоящему изобретению может представлять собой клетку или микроорганизм, экспрессирующий вариант по настоящему изобретению путем трансформации полинуклеотидом по настоящему изобретению или вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему изобретению, и для задач в соответствии с настоящим изобретением штамм по настоящему изобретению может включать все микроорганизмы, способные продуцировать аминокислоту с разветвленной цепью, путем включения варианта по настоящему изобретению. Например, штамм по настоящему изобретению может представлять собой рекомбинантный штамм, обладающий усиленной способностью продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью, в котором вариант префенатдегидратазы экспрессируется путем введения полинуклеотида, кодирующего вариант по настоящему изобретению, в природный микроорганизм дикого типа или микроорганизм-продуцент аминокислот с разветвленной цепью. Рекомбинантный штамм, обладающий усиленной способностью продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью, может представлять собой микроорганизм, обладающий усиленной способностью продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью по сравнению с природным микроорганизмом дикого типа или микроорганизмом с немодифицированной префенатдегидратазой (то есть, микроорганизмом, экспрессирующим префенатдегидратазу дикого типа), но не ограничивается этим.
Например, микроорганизм с немодифицированной префенатдегидратазой, представляющий собой целевой штамм для сравнения того, увеличена ли способность продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью, может представлять собой штамм Corynebacterium glutamicum АТСС13032. В еще одном примере микроорганизм с немодифицированной префенатдегидратазой, представляющий собой целевой штамм для сравнения того, увеличена ли способность продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью, может представлять собой CJL-8109, KCCM12739P (СА10-3101) или KCCM11201P, но не ограничивается этим.
Например, рекомбинантный штамм может обладать увеличенной способностью продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью приблизительно на 1% или более, и, в частности, приблизительно на 3% или приблизительно на 5% более по сравнению с родительским штаммом перед модификацией или немодифицированным микроорганизмом, но не ограничивается этим, при условии что он обладает увеличенным количеством+величиной по сравнению с продуцированием родительским штаммом до модификации или немодифицированным микроорганизмом.
В еще одном примере рекомбинантный штамм может обладать приблизительно 50% или менее, в частности приблизительно 30% или менее или приблизительно 10% или менее, продукцией побочных продуктов, образующихся в пути продуцирования аминокислот с разветвленной цепью, по сравнению с родительским штаммом перед модификацией или немодифицированным микроорганизмом, но не ограничивается этим.
Термин "приблизительно" включает все диапазоны ±0,5, ±0,4, ±0,3, ±0,2, ±0,1 и т.п., и он включает все числовые величины диапазонов, эквивалентные или близкие числовой величине непосредственно после термина "приблизительно", но не ограничивается этим.
Использованный здесь термин "аминокислота с разветвленной цепью" относится к аминокислоте, имеющей разветвленную алкильную группу в боковой цепи, и включает валин, лейцин и изолейцин. В частности, в настоящем изобретении аминокислота с разветвленной цепью может представлять собой аминокислоту с L-разветвленной цепью, и аминокислота с L-разветвленной цепью может представлять собой одну или более чем одну, выбранную из L-валина, L-лейцина и L-изолейцина, но не ограничиваться этим.
В настоящем изобретении побочные продукты, образующиеся в пути продуцирования аминокислот с разветвленной цепью, относятся к веществам, отличным от аминокислот с разветвленной цепью, в частности, ароматическим аминокислотам, и более конкретно, одной или более чем одной из выбранных из L-тирозина и L-фенилаланина, но не ограничены ими.
Термин "немодифицированный микроорганизм" не исключает штаммы, включающие мутации, которые в природе могут возникать у микроорганизмов, и может относиться к штамму дикого типа или самому по себе природному штамму, или может представлять собой штамм до того, как характеристики изменятся путем генетической модификации вследствие природных или искусственных факторов. Например, немодифицированный микроорганизм может представлять собой штамм, в который вариант префенатдегидратазы по настоящему изобретению не введен или еще не был введен. Термин "немодифицированный микроорганизм" может быть использован взаимозаменяемо с терминами "штамм перед модификацией", "микроорганизм перед модификацией", "немутантный штамм", "немодифицированный штамм", "немутантный микроорганизм" или "референсный микроорганизм".
В одном из воплощений микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium stationis, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris или Corynebacterium flavescens.
Микроорганизм по настоящему изобретению может дополнительно включать вариацию для увеличения способности продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью.
В одном из воплощений микроорганизм по настоящему изобретению может включать модификацию активности одной или более чем одной из изопропилмалатсинтазы, гомосериндегидрогеназы, треониндегидратазы, аминотрансферазы аминокислоты с разветвленной цепью и цитратсинтазы.
В одном из воплощений микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, в котором активность одной или более чем одной из изопропилмалатсинтазы, гомосериндегидрогеназы, аминотрансферазы аминокислоты с разветвленной цепью и треониндегидратазы дополнительно усилена.
Тем не менее, микроорганизм не ограничен вышеприведенным описанием, и специалист в данной области техники может подходящим образом выбрать дополнительные модификации, включенные в микроорганизм в соответствии с продуцируемыми аминокислотами с разветвленной цепью.
Использованный здесь термин "усиление" полипептидной активности означает, что активность полипептида увеличена по сравнению с собственной активностью. Усиление может быть использовано взаимозаменяемо с терминами, такими как активация, повышающая регуляция, сверхэкспрессия, увеличение и т.п. Здесь активация, усиление, повышающая регуляция, сверхэкспрессия и увеличение могут включать как случаи, при которых демонстрировалась активность, которая исходно не проявлялась, так и демонстрацию увеличенной активности по сравнению с собственной активностью или активностью до модификации. "Собственная активность" означает активность конкретного полипептида, исходно проявляемую родительским штаммом до изменения характеристик или немодифицированным микроорганизмом, когда свойство изменяется путем генетической вариации вследствие природных или искусственных факторов. Последняя может быть использована взаимозаменяемо с "активностью до модификации". Тот факт, что активность полипептида "усилена", "подвергнута повышающей регуляции", "сверхэкспрессируется" или "увеличена" по сравнению с собственной активностью, означает, что активность полипептида улучшена по сравнению с активностью и/или концентрацией (уровнем экспрессии) конкретного полипептида, исходно демонстрируемой родительским штаммом до изменения характеристики или немодифицированным микроорганизмом.
Усиление может быть достигнуто путем введения чужеродного полипептида или путем усиления собственной активности и/или концентрации (уровня экспрессии) полипептида. Усиление активности полипептида можно подтвердить по увеличению степени активности и уровня экспрессии соответствующего полипептида или количества продукта, продуцируемого из соответствующего полипептида.
Для усиления активности полипептида могут быть применимы различные способы, хорошо известные в данной области техники, и способ не ограничен при условии того, что он может усиливать активность интересующего полипептида по сравнению с активностью микроорганизма перед модификацией. В частности, может быть использована генетическая инженерия и/или белковая инженерия, хорошо известные специалистам в данной области техники, которые представляют собой обычные способы молекулярной биологии, но способ не ограничен ими (например, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, и т.п.).
В частности, усиление активности полипептида по настоящему изобретению может быть достигнуто путем:
1) увеличения числа копий полинуклеотида, кодирующего полипептид, в клетках;
2) замены области, регулирующей экспрессию гена, кодирующего полипептид, на хромосоме на последовательность, демонстрирующую сильную активность;
3) модификации стартового кодона генного транскрипта, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей область 5'-UTR;
4) модификации аминокислотной последовательности полипептида таким образом, что активность полипептида усиливается;
5) модификации полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, таким образом, что активность полипептида усиливается (например, модификация полинуклеотидной последовательности гена полипептида таким образом, что кодируется полипептид, модифицированный для усиления активности полипептида);
6) введения чужеродного полинуклеотида, демонстрирующего активность полипептида, или чужеродного полинуклеотида, кодирующего полипептид;
7) оптимизации кодона полинуклеотида, кодирующего полипептид;
8) анализа третичной структуры полипептида для выбора экспонируемого сайта и для осуществления модификации или химической модификации экспонируемого сайта; или
9) комбинации двух или более чем двух, выбранных из 1)-8), но не ограничиваясь конкретно ими.
Более конкретно, 1) увеличение числа копий в клетке полинуклеотида, кодирующего полипептид, может быть осуществлено путем введения вектора, который реплицируется и функционирует независимо от клетки-хозяина и функционально связан с полинуклеотидом, кодирующим соответствующий полипептид в клетке-хозяине. В качестве альтернативы, увеличение может быть достигнуто путем введения одной копии или двух копий полинуклеотидов, кодирующих соответствующий полипептид, в хромосому клетки-хозяина. Введение в хромосому может быть осуществлено путем введения вектора, способного встраивать полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина, в клетку-хозяина, но не ограничиваясь этим. Вектор является таким как описано выше.
2) Замена области, контролирующей экспрессию (или последовательности, контролирующей экспрессию) гена, кодирующего полипептид, на хромосоме на последовательность, демонстрирующую сильную активность, может быть достигнута, например, путем возникновения вариации в последовательности путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или путем их комбинации, или путем замены на последовательность, демонстрирующую более сильную активность, таким образом, что дополнительно усиливается активность области, контролирующей экспрессию. Область, контролирующая экспрессию, не ограничена конкретно ими и может включать промотор, операторную последовательность, последовательность, кодирующую сайт связывания с рибосомой, последовательность, контролирующую прекращение транскрипции или трансляции и т.п. Например, замена может представлять собой замену исходного промотора на сильный промотор, но не ограничиваться этим.
Примеры известных сильных промоторов включают промоторы cj1-cj7 (патент США №7662943 В2), промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор PR фага лямбда, промотор PL, промотор tet, промотор gap А, промотор SPL7, промотор SPL13(sm3) (патент США №10584338 В2), промотор O2 (патент США №10273491 В2), промотор tkt, промотор уссА, но не ограничиваются ими.
3) Модификация стартового кодона гена транскрипта, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей область 5'-UTR, может представлять собой, например, замену на последовательность оснований, кодирующую другой стартовый кодон, обладающий более высоким уровнем экспрессии полипептида, чем эндогенный стартовый кодон, но не ограничивается этим.
4) и 5) Модификация аминокислотной последовательности или полинуклеотидной последовательности может быть осуществлена путем вариации последовательности путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены аминокислотной последовательности полипептидной или полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, или путем их комбинации или путем замены на аминокислотную последовательность или полинуклеотидную последовательность, модифицированную таким образом, чтобы обладать более сильной активностью, или аминокислотную последовательность или полинуклеотидную последовательность, модифицированную таким образом, что активность полипептида усиливается, но не ограничивается этим. Замена может быть в частности осуществлена путем встраивания полинуклеотида в хромосому путем гомологичной рекомбинации, но не ограничиваясь этим. Используемый здесь вектор может дополнительно включать селективный маркер для подтверждения встраивания в хромосому. Селективный маркер является таким как описано выше.
6) Введение чужеродного полинуклеотида, обладающего активностью полипептида, может представлять собой введение в клетку-хозяина чужеродного полинуклеотида, кодирующего полипептид, который демонстрирует активность, идентичную или подобную активности полипептида. Чужеродный полинуклеотид не ограничен своим происхождением или последовательностью при условии того, что он демонстрирует активность, идентичную или подобную активности полипептида. Способ, используемый для введения, может быть осуществлен специалистами в данной области техники путем подходящего выбора способа трансформации, известного в данной области техники. Когда введенный полинуклеотид экспрессируется в клетке-хозяине, может продуцироваться полипептид, и его активность может быть увеличена.
7) Оптимизация кодонов полинуклеотида, кодирующего полипептид, может представлять собой оптимизацию кодонов эндогенного полинуклеотида для увеличения транскрипции или трансляции в клетке-хозяине, или оптимизацию кодонов чужеродного полинуклеотида таким образом, чтобы обеспечить оптимизированную транскрипцию и трансляцию в клетке-хозяине.
8) Анализ третичной структуры полипептида для отбора экспонируемого сайта и осуществления модификации или химической модификации экспонируемого сайта может быть осуществлен, например, для определения кандидата белка-матрицы в соответствии со степенью сходства последовательности путем сравнения информации о последовательности анализируемого полипептида с базой данных, в которой хранится информация о последовательностях известных белков, для подтверждения структуры, основанной на информации, и для отбора и модификации или химической модификации экспонируемого фрагмента, который предполагается модифицировать или химически модифицировать.
Такое усиление полипептидной активности может представлять собой увеличение активности или концентрации (уровня экспрессии) соответствующего полипептида относительно активности или концентрации полипептида, экспрессируемого в штамме дикого типа или микробном штамме до модификации, или увеличение количества продукта, продуцируемого из соответствующего полипептида, но не ограничивается этим.
В микроорганизме по настоящему изобретению частичная или полная модификация полинуклеотида может быть вызвана путем (а) гомологичной рекомбинации с использованием вектора для встраивания хромосомы в микроорганизм или редактирования генома с использованием сконструированной нуклеазы (например, CRISPR-Cas9) и/или (б) обработки светом, таким как ультрафиолетовые лучи и излучение и т.п, и/или химические вещества, но не ограничивается этим. Способ модификации части или всего гена может включать способ с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Например, путем введения нуклеотидной последовательности или вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, гомологичную интересуемому гену, в микроорганизм для того, чтобы вызвать гомологичную рекомбинацию, часть или весь ген может быть удален. Введенная нуклеотидная последовательность или вектор может включать доминирующий селективный маркер, но не ограничиваться этим.
Используемый здесь термин "ослабление" активности полипептида представляет собой концепцию, включающую как случаи, когда активность уменьшается по сравнению с эндогенной активностью, так и отсутствие активности. Ослабление может быть использовано взаимозаменяемо с такими терминами, как инактивация, дефицит, понижающая регуляция, уменьшение, сокращение, затухание и т.п.
Ослабление может также включать случай, когда активность самого полипептида уменьшена или отсутствует по сравнению с активностью полипептида, исходно демонстрируемой микроорганизмом, вследствие вариации полинуклеотида, кодирующего полипептид и т.п, представляя собой случай, когда общий уровень внутриклеточной полипептидной активности и/или концентрации (уровня экспрессии) является низким вследствие ингибирования экспрессии гена полинуклеотида, кодирующего полипептид, или путем ингибирования трансляции в полипептид, по сравнению с природным штаммом, представляя собой случай, когда полинуклеотид вообще не экспрессируется, и/или случай, когда какая-либо полипептидная активность отсутствует даже при экспрессии полинуклеотида. Используемый здесь термин "эндогенная активность" означает активность конкретного полипептида, исходно проявляемая родительским штаммом перед изменением характеристики или микроорганизмом дикого типа или немодифицированным микроорганизмом, когда характеристика изменена вследствие генетической модификации, вызванной природными или искусственными факторами. Эндогенная активность может быть использована взаимозаменяемо с "активностью перед модификацией". Тот факт, что активность полипептида "инактивирована, устранена, уменьшена, подвергнута понижающей регуляции, снижена или ослаблена" по сравнению с эндогенной активностью означает, что активность полипептида уменьшена по сравнению с активностью конкретного полипептида, исходно демонстрируемой родительским штаммом до изменения характеристики или немодифицированным микроорганизмом.
Такое ослабление активности полипептида может быть осуществлено любым способом, известным в данной области техники, но способ не ограничен этим, и может быть достигнуто путем применения различных способов, хорошо известных в данной области техники (например Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014; 15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, и т.п.).
В частности, ослабление полипептида по настоящему изобретению может быть достигнуто путем:
1) удаления всего гена или его части, кодирующих полипептид;
2) модификации области, регулирующей экспрессию (или последовательности, регулирующей экспрессию) для уменьшения экспрессии гена, кодирующего полипептид;
3) модификации аминокислотной последовательности, составляющей полипептид, для устранения или ослабления активности полипептида (например, делеция/замена/вставка одной или более чем одной аминокислоты в аминокислотную последовательность);
4) модификации генной последовательности, кодирующей полипептид, для устранения или ослабления активности полипептида (например, делеция/замена/вставка одного или более чем одного основания нуклеиновой кислоты в последовательность оснований нуклеиновых кислот гена полипептида для кодирования полипептида, который модифицирован для устранения или ослабления активности полипептида);
5) модификации стартового кодона генного транскрипта, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей область 5'-UTR;
6) введения антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего полипептид;
7) добавления последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно на переднем конце последовательности Шайна-Дальгарно гена, кодирующего полипептид, с образованием вторичной структуры, к которой рибосома не может прикрепляться;
8) добавления промотора, транскрибируемого в обратном направлении относительно 3'-конца открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующего полипептид (инжиниринг путем обратной транскрипции, RTE); или
9) комбинации двух или более чем двух, выбранных из 1)-8), но конкретно не ограничиваясь этим.
Например,
1) делеция части или всего гена, кодирующего полипептид, может быть осуществлена путем удаления всего полинуклеотида, кодирующего эндогенный интересующий полипептид в хромосоме, замена на полинуклеотид, из которого некоторые нуклеотиды удалены, или замена на маркерный ген.
Дополнительно, 2) модификация области, регулирующей экспрессию (или последовательности, регулирующей экспрессию), может быть осуществлена путем модификации области, регулирующей экспрессию (или последовательности, регулирующей экспрессию), путем делеции, вставки, неконсервативной замены или консервативной замены, или их комбинации; или путем замены на последовательность, демонстрирующую более слабую активность. Область, регулирующая экспрессию, включает промотор, операторную последовательность, последовательность, кодирующую сайт связывания с рибосомой, и последовательность, регулирующую прекращение транскрипции и трансляции, но не ограничена ими.
Дополнительно, 3) модификация стартового кодона генного транскрипта, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей область 5'-UTR, может представлять собой, например, замену на последовательность оснований, кодирующую другой стартовый кодон, обладающий более низким уровнем экспрессии полипептида по сравнению с эндогенным стартовым кодоном, но не ограничивается этим.
Дополнительно, 4) и 5) модификация аминокислотной последовательности или полинуклеотидной последовательности может быть осуществлена путем модификации в последовательности путем делеции, вставки или неконсервативной или консервативной замены аминокислотной последовательности полипептида или полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, или их комбинации, или замены на аминокислотную последовательность или полинуклеотидную последовательность, модифицированную таким образом, чтобы демонстрировать более слабую активность, или аминокислотную последовательность или полинуклеотидную последовательность, модифицированную таким образом, чтобы не обладать активностью, таким образом, что активность полипептида ослаблена, но не ограничивается этим. Например, экспрессия гена может быть подавлена или ослаблена путем введения в полинуклеотидную последовательность модификации и формирования стоп-кодона, но не ограничивается этим.
Дополнительно, 6) введение антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего полипептид, можно найти в литературе, например [Weintraub, Н. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986].
Дополнительно, 7) добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно (SD), относительно переднего конца последовательности Шайна-Дальгарно гена, кодирующего полипептид, с образованием вторичной структуры, с которой не может связываться рибосома, что делает невозможным трансляцию мРНК или замедляет скорость трансляции мРНК.
Дополнительно, 8) добавление промотора, который должен подвергаться транскрипции в обратном направлении относительно 3' конца открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующего полипептид (инжиниринг путем обратной транскрипции, RTE), может быть осуществлено для ослабления активности путем формирования антисмыслового нуклеотида, комплементарного транскрипту гена, кодирующего полипептид.
В микроорганизме по настоящему изобретению вариант, полинуклеотид, вектор и аминокислоты с разветвленной цепью являются такими как описано в других аспектах.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения аминокислот с разветвленной цепью, включающий стадию культивирования в среде микроорганизма рода Corynebacterium в соответствии с настоящим изобретением.
Использованный здесь термин "культивирование" означает выращивание микроорганизма рода Corynebacterium в соответствии с настоящим изобретением в надлежащим образом контролируемых условиях окружающей среды. Процесс культивирования в соответствии с настоящим изобретением может быть осуществлен в подходящей культуральной среде и условиях культивирования, известных в данной области техники. Такой процесс культивирования может быть легко скорректирован для применения специалистами в данной области техники в соответствии с выбранным штаммом. В частности, культивирование может периодическим или непрерывным и/или с подпиткой культуры, но не ограничиваться этим.
Использованный здесь термин "среда" относится к смеси веществ, содержащей в качестве основного ингредиента питательные вещества, требующиеся для культивирования микроорганизма рода Corynebacterium по настоящему изобретению, и среда обеспечивает питательные вещества и факторы роста, включающие воду, которые необходимы для жизнедеятельности и роста. В частности, в качестве среды и других условий культивирования, используемых для культивирования микроорганизма рода Corynebacterium по настоящему изобретению, могут быть использованы любые без какого-либо конкретного ограничения при условии того, что они представляет собой среду, используемую для обычного культивирования микроорганизмов. Микроорганизм рода Corynebacterium по настоящему изобретению может быть культивирован в обычной среде, содержащей подходящие источники углерода, источники азота, источники фосфора, неорганические вещества, аминокислоты и/или витамины, при контролировании температуры, рН и т.п. в аэробных условиях.
В частности, среду для культивирования микроорганизма рода Corynebacterium можно найти в литературе ["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)].
В настоящем изобретении источники углерода включают углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, сахароза, мальтоза и т.п; сахарные спирты, такие как маннит, сорбит и т.п; органические кислоты, такие как пировиноградная кислота, молочная кислота, лимонная кислота и т.п; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин, лизин и т.п. Кроме того, могут быть использованы природные органические питательные вещества, такие как гидролизат крахмала, мелассы, сырые мелассы, рисовые отруби, маниока, выжимки сахарного тростника и жидкий кукурузный экстракт. В частности, могут быть использованы углеводы, такие как глюкоза и стерилизованные предварительно обработанные мелассы (т.е. мелассы, преобразованные в восстанавливающий сахар), и без ограничения могут быть использованы подходящие количества других источников углерода различным образом. Эти источники углерода могут быть использованы сами по себе или в комбинации двух или более чем двух из них, но не ограничиваться этим.
В качестве источников азота могут быть использованы источники неорганического азота, такие как аммиак, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония, нитрат аммония и т.п; и источники органического азота, такие как аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин, глутамин и т.п, пептон, NZ-амин, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, гидролизат казеина, рыба или продукты ее разложения и обезжиренный соевый жмых или продукты его разложения и т.п. Эти источники азота могут быть использованы сами по себе или в комбинации двух или более чем двух из них, но не ограничиваться этим.
Источники фосфора могут включать первичный кислый фосфат калия, вторичный кислый фосфат калия или соответствующие натрий-содержащие соли. В качестве неорганических соединений могут быть использованы хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция и т.п. Дополнительно к этим соединениям могут быть включены аминокислоты, витамины и/или подходящие предшественники. Эти компоненты или предшественники могут быть добавлены в среду партиями или непрерывным образом, но не ограничиваться этим.
Кроме того, во время культивирования микроорганизма рода Corynebacterium по настоящему изобретению рН среды может быть отрегулирован путем добавления в среду подходящим образом соединений, таких как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота или серная кислота. Во время культивирования пенообразование может быть подавлено путем использования пеногасителя, такого как сложный эфир полигликоля и жирной кислоты. Кислород или содержащий кислород газ могут быть введены в среду для поддержания в среде аэробного состояния, или газ можно не вводить, или азот, водород или газообразный диоксид углерода могут быть введены для поддержания анаэробного и микроаэробного состояния среды, но не ограничиваться этим.
При культивировании в соответствии с настоящим изобретением температуру среды для культивирования можно поддерживать при от 20°С до 45°С, в частности от 25°С до 40°С, и культивирование микроорганизмов можно осуществлять в течение от приблизительно 10 часов до приблизительно 160 часов, но не ограничиваться этим.
Аминокислоты с разветвленной цепью, продуцируемые при культивировании в соответствии с настоящим изобретением, могут секретироваться в среду или могут оставаться в клетках.
Способ получения аминокислот с разветвленной цепью по настоящему изобретению дополнительно может включать стадию приготовления микроорганизма рода Corynebacterium по настоящему изобретению, стадию приготовления среды для культивирования штамма или комбинацию этих стадий (в любой последовательности), например, до стадии культивирования.
Способ получения аминокислот с разветвленной цепью по настоящему изобретению дополнительно может включать стадию выделения аминокислот с разветвленной цепью из культуральной среды (среды, в которой осуществлялось культивирование) или из микроорганизма рода Corynebacterium по настоящему изобретению. Стадия выделения может быть дополнительно включена после стадии культивирования.
Выделение может быть осуществлено для сбора интересующих аминокислот с разветвленной цепью подходящим способом, известным в данной области техники, в соответствии со способом культивирования микроорганизма по настоящему изобретению, например, периодическим способом культивирования, непрерывным способом культивирования или культивированием с подпиткой. Например, может быть использовано центрифугирование, фильтрование, обработка агентом, осаждающим белок (способ высаливания), экстракция, ультразвуковое разрушение, ультрафильтрация, диализ, различные виды хроматографии, такие как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография и аффинная хроматография, ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) или их комбинация. Интересующие аминокислоты с разветвленной цепью могут быть выделены из среды или микроорганизма подходящим способом, известным в данной области техники.
Кроме того, способ получения аминокислот с разветвленной цепью по настоящему изобретению дополнительно может включать стадию очистки. Очистка может быть осуществлена подходящим способом, известным в данной области техники. Например, когда способ получения аминокислот с разветвленной цепью по настоящему изобретению включает как стадию выделения, так и стадию очистки, тогда стадия выделения и стадия очистки могут быть осуществлены с перерывами (или непрерывно) независимо от последовательности или могут быть осуществлены одновременно или путем объединения в одну стадию, но не ограничиваться этим.
В способе по настоящему изобретению вариант, полинуклеотид, вектор, микроорганизм и т.п. являются такими как описано в других аспектах.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена композиция для получения аминокислот с разветвленной цепью, включающая вариант по настоящему изобретению, полинуклеотид, кодирующий вариант, вектор, включающий полинуклеотид, или микроорганизм рода Corynebacterium, включающий полинуклеотид по настоящему изобретению; среду, в которой микроорганизм был культивирован; или комбинацию двух или более чем двух из них.
Композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать любые подходящие эксципиенты, обычно используемые в композициях для получения аминокислот с разветвленной цепью. Такие эксципиенты могут представлять собой, например, консервант, увлажнитель, диспергирующий агент, суспендирующий агент, буферный агент, стабилизатор или изотонический агент, но не ограничиваться этим.
В композиции по настоящему изобретению вариант, полинуклеотид, вектор, штамм, среда, аминокислоты с разветвленной цепью и т.п. являются такими как описано в других аспектах.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение микроорганизма, включающего один или более чем один из варианта префенатдегидратазы по настоящему изобретению, полинуклеотида, кодирующего вариант префенатдегидратазы, и вектора, включающего полинуклеотид, для получения аминокислот с разветвленной цепью.
При применении по настоящему изобретению вариант, полинуклеотид, вектор, микроорганизм и т.п. являются такими как описано в других аспектах.
Далее описание настоящего изобретения будет описано более подробно со ссылкой на Примеры и Экспериментальные Примеры. Однако, эти Примеры и Экспериментальные Примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения, и предполагается, что объем настоящего изобретения не ограничен этими Примерами и Экспериментальными Примерами.
Пример 1: Обнаружение вариации pheA
Пример 1-1. Конструирование вектора, включающего pheA
Для конструирования библиотеки мутантов pheA, обладающих активностью префенатдегидратазы, сначала конструировали рекомбинантный вектор, включающий pheA. Для амплификации гена pheA (SEQ ID NO: 2), кодирующего белок pheA (SEQ ID NO: 1, Uniprot ID: P10341), имеющий происхождение из Corynebacterium glutamicum дикого типа, осуществляли ПЦР с использованием хромосомы штамма Corynebacterium glutamicum АТСС13032 дикого типа в качестве матрицы и праймеров с SEQ ID NO: 3 и 4 в условиях 25 циклов денатурации при 94°С в течение 1 минуты, отжига при 58°С в течение 30 секунд, полимеризации при 72°С в течение 1 минуты с полимеразой ДНК Pfu. Конкретные последовательности используемых праймеров перечислены в Таблице 1. Продукт амплификации клонировали в вектор Е. coli pCR2.1 с использованием набора для клонирования ТОРО Cloning Kit (Invitrogen) с получением 'pCR-pheA'.
Пример 1-2. Конструирование библиотеки мутантов pheA
На основе вектора, полученного в Примере 1-1, библиотеку мутантов pheA конструировали с использованием набора для ПЦР сниженной точности (clontech Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit). Реакцию ПЦР осуществляли с использованием SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 в качестве праймеров в условиях, при которых могут возникать от 0 до 3 мутаций на 1000 п.о. В частности, реакцию ПЦР осуществляли путем предварительного нагревания при 94°С в течение 30 секунд, а затем при помощи 25 циклов при 94°С в течение 30 секунд и при 68°С в течение 1 минуты и 30 секунд. Полученный таким образом продукт ПЦР использовали в качестве мегапраймера (от 50 до 125 нг), а затем путем 25 циклов при 95°С в течение 50 секунд и при 60°С в течение 50 секунд, и при 68°С в течение 12 минут, и затем обработки DpnI и трансформации в Е. coli DH5α при помощи способа теплового шока и высевания на твердую среду LB (Луриа-Бертани), содержащую канамицин (25 мг/л). Отбирали 20 типов трансформированных колоний и получали плазмиды с последующим анализом последовательности. В результате было подтверждено, что вариации были введены в разные положения с частотой 2 мутации/кб. Собирали приблизительно 20000 трансформированных колоний Е. coli и выделяли плазмиды, которые были названы "pTOPO-pheA-library".
Пример 2: Оценка конструированной библиотеки и отбор варианта
Пример 2-1. Отбор мутантных штаммов с увеличенной или уменьшенной продукцией L-лейцина и L-фенилаланина
pTOPO-pheA-library, полученную в Примере 1-2, трансформировали в Corynebacterium glutamicum АТСС13032 дикого типа путем электропорации, и затем высевали на питательную среду (Таблица 2), содержащую 25 мг/л канамицина. Отбирали 10000 колоний штамма, в который встроен мутантный ген. Каждая отобранная колония была названа от ATCC13032/pTOPO_pheA(mt)1 до АТСС 13032/pTOPO_pheA(mt) 10,000.
Для идентификации колоний, демонстрирующих увеличенную продукцию L-лейцина и увеличенную или уменьшенную продукцию L-фенилаланина, представляющего собой ароматическую аминокислоту, среди полученных 10000 колоний оценивали ферментационный титр для каждой колонии следующим образом.
Каждую колонию инокулировали в колбу с угловыми перегородками объемом 250 мл, содержащую 25 мкг/мл канамицина в 25 мл автоклавированной среды для продуцирования (Таблица 2), с использованием платиновой петли и затем культивировали при 30°С в течение 60 часов при встряхивании при 200 об/мин. После завершения культивирования продукцию L-лейцина и L-фенилаланина среди ароматических аминокислот измеряли способом с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, SHIMAZDU LC20A).
Среди полученных 10000 колоний отобрали один тип штамма (ATCC13032/pTOPO_pheA(mt)3891) с наиболее улучшенной способностью продуцировать L-лейцин и уменьшенной продукцией L-фенилаланина по сравнению с штаммом Corynebacterium glutamicum (АТСС13032) дикого типа. Концентрации L-лейцина (Leu) и L-фенилаланина (Phe), продуцированные в выбранном штамме, представлены в Таблице 3 ниже.
Как показано в Таблице 3, было подтверждено, что Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pTOPO_pheA(mt)3891 с вариациями в гене pheA демонстрировали приблизительно 1,4-кратное увеличение в продукции L-лейцина и приблизительно 7-кратное уменьшение в продукции L-фенилаланина по сравнению с родительским штаммом.
Пример 2-2. Идентификация вариаций в штаммах, обладающих увеличенной или уменьшенной продукцией L-лейцина и L-фенилаланина
Для идентификации вариаций гена pheA в отобранном мутантном штамме ATCC13032/pTOPO_pheA(mt)3891 ДНК каждого мутантного штамма, использованные в качестве матрицы и праймеров с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, описанные в Таблице 1, использовали для ПЦР в условиях денатурации при 94°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами при 94°С в течение 30 секунд, при 55°С в течение 30 секунд и при 72°С в течение 1 минуты и 30 секунд и затем при 72°С в течение 5 минут.Затем осуществляли секвенирование ДНК.
В результате секвенирования было подтверждено, что штамм ATCC13032/pTOPO_pheA(mt)3891 имеет замену GCG на CGC, которые представляют собой нуклеотиды в положениях 544-546 гена pheA, свидетельствуя о том, что он кодирует вариант (далее названный как R182A), в котором аланин заменен на аргинин, который представляет собой аминокислоту в положении 182 белка pheA. Аминокислотная последовательность варианта pheA (R182A) и последовательность оснований кодирующего его варианта pheA являются такими как в SEQ ID NO: 5 и 6.
Таким образом, в следующих Примерах попытались подтвердить, влияет ли вариант (R182A) на продукцию L-лейцина и ароматической аминокислоты в микроорганизме рода Corynebacterium.
Пример 3: Проверка способности продуцировать L-лейцин и L-фенилаланин отобранных мутантных штаммов
Пример 3-1. Конструирование встраиваемого вектора, включающего вариант pheA
Для встраивания варианта, отобранного в Примере 2, в штамм предполагалось конструирование встраиваемого вектора. Вектор для введения варианта pheA (R182A) конструировали с использованием способа сайт-направленного мутагенеза. Для получения варианта R182A с использованием хромосомы Corynebacterium glutamicum дикого типа в качестве матрицы использовали пару праймеров с SEQ ID NO: 7 и 8 и пару праймеров с SEQ ID NO: 9 и 10 для осуществления ПЦР. В частности, ПЦР осуществляли в условиях денатурации при 94°С в течение 5 минут с последующими 30 циклами при 94°С в течение 30 секунд, при 55°С в течение 30 секунд и при 72°С в течение 1 минуты 30 секунд и затем при 72°С в течение 5 минут. Конкретные последовательности используемых праймеров перечислены в Таблице 4.
Полученный в результате продукт ПЦР клонировали в линейный вектор pDCM2 (Публикация Корейской заявки на патент №KR 10-2020-0136813 А), расщепленный ферментом рестрикции SmaI, путем слияния гомологичной последовательности концевых 15 оснований между фрагментами ДНК с использованием фермента In-Fusion для конструирования вектора 'pDCM2-pheA(R182A)', в котором аминокислота в положении 182 в pheA заменена на аланин.
Пример 3-2. Введение варианта в штамм АТСС13032 и его оценка
Вектор pDCM2-pheA(R182A), сконструированный в Примере 3-1, трансформировали в АТСС 13032 путем электропорации, и штаммы, в которых вектор был встроен в хромосому путем рекомбинации гомологичной последовательности, были отобраны на среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Отобранные первичные штаммы вновь подвергали вторичному кроссоверу и отбирали штаммы, в которые был введен целевой вариант гена. Наконец, был ли данный вариант гена pheA введен в трансформированный штамм подтверждали путем осуществления ПЦР с использованием праймеров с SEQ ID NO: 3 и 4 и затем анализа нуклеотидной последовательности, тем самым идентифицируя введение данного варианта в штамм. В общей сложности получили 3 типа штаммов, и они названы ATCC13032_pheA_R182A.
Для оценки способности продуцировать L-лейцин и ароматическую аминокислоту в общей сложности для 3 полученных таким образом штаммов оценивали титр в колбе для ферментации. Каждую платиновую петлю родительского штамма Corynebacterium glutamicum АТСС13032 и полученного ATCC13032_pheA_R182A инокулировали в колбу с угловыми перегородками объемом 250 мл, содержащую 25 мл среды для продуцирования и затем культивировали при 30°С в течение 60 часов при встряхивании при 200 об/мин с получением L-лейцина. После завершения культивирования продукции L-лейцина, L-тирозина и L-фенилаланина измеряли посредством ВЭЖХ. Концентрация лейцина в культуральной среде для каждого тестируемого штамма представлена в Таблице 5 ниже.
Как показано в Таблице 5, ATCC13032_pheA_R182A демонстрировал приблизительно 1,5-кратное увеличение выхода L-лейцина по сравнению с родительским штаммом Corynebacterium glutamicum АТСС 13032. ATCC13032_pheA_R182A демонстрировал приблизительно 8-кратное уменьшение продукции L-фенилаланина.
Пример 4: Проверка способности продуцировать лейцин и фенилаланин отобранным вариантом pheA в штамме, продуцирующем лейцин
Штамм дикого типа рода Corynebacterium продуцирует только следовые количества лейцина, в случае если он продуцирует лейцин. Соответственно, получали штамм, продуцирующий лейцин, имеющий происхождение из АТСС 13032, и отобранные варианты вводили для осуществления эксперимента для проверки способности продуцировать лейцин и фенилаланин. Подробный экспериментальный способ является следующим.
Пример 4-1. Получение штамма CJL-8109, продуцирующего L-лейцин
В качестве штаммов для продуцирования высоких концентраций L-лейцина получали штаммы, имеющие происхождение из АТСС13032, каждый из которых включал (1) вариант (R558H), в котором гистидином был заменен аргинин, представляющий собой аминокислоту в положении 558 белка Leu А, путем замены А на G, который представляет собой нуклеотид в положении 1673 гена leuA, (2) вариант (G561D), в котором аспарагиновой кислотой была заменен глицин, представляющий собой аминокислоту в положении 561 белка LeuA, путем замены AT на GC, которые представляют собой нуклеотиды в положениях 1682 и 1683 гена leuA, или (3) вариант (Р247С), в котором цистеином был заменен пролин, который представляет собой аминокислоту в положении 247 белка LeuA, путем замены TG на СС, которые представляют собой нуклеотиды в положениях 739 и 740 гена leuA.
В частности, вектор pDCM2-leuA (Р247С, R558H, G561D), включающий варианты гена leuA, трансформировали в Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 путем электропорации, и штаммы, в которых вектор был встроен в хромосому путем рекомбинации гомологичной последовательности, отбирали в среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Отобранные первичные штаммы вновь подвергали вторичному кроссоверу, и отбирали штаммы, в которые был введен вариант гена leuA. Наконец, введен ли вариант в трансформированный штамм подтверждали путем осуществления ПЦР (при 94°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами при 94°С в течение 30 секунд/при 55°С в течение 30 секунд/при 72°С в течение 90 секунд и при 72°С в течение 5 минут) с использованием праймеров с SEQ ID NO: 11 и 12 в соответствии с Таблицей 6 и затем анализа нуклеотидной последовательности, тем самым идентифицируя введение вариантов Р247С, R558H, G561D. Штамм АТСС13032_leuA_(Р247С, R558H, G561D), трансформированный вектором pDCM2-leuA(P247C, R558H, G561D), был назван 'CJL-8105'.
Для увеличения продуктивности по L-лейцину в полученном штамме CJL-8105, получали штамм, в который введен вариант ilvE (V156A), кодирующий аминотрансферазу аминокислоты с разветвленной цепью (Корейский патент № KR 10-2143964 В1). В частности, вектор pDCM2-ilvE(V156A), включающий вариант гена ilvE, трансформировали в Corynebacterium glutamicum CJL-8105 путем электропорации, и штаммы, в которых вектор был встроен в хромосому путем рекомбинации гомологичной последовательности, отбирали в среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Отобранные первичные штаммы вновь подвергали вторичному кроссоверу и отбирали штаммы, в которые был введен вариант гена ilvE. Наконец, введен ли данный вариант в трансформированный штамм подтверждали путем осуществления ПЦР (при 94°С в течение 5 минут, 30 циклов при 94°С 30 секунд/при 55°С 30 секунд/при 72°С 90 секунд, затем при 72°С в течение 5 минут) с использованием праймеров с SEQ ID NO: 13 и 14 из Таблицы 7 ниже и затем анализа нуклеотидной последовательности, тем самым идентифицируя введение варианта V156A. Штамм, трансформированный вектором pDCM2-ilvE(V156A), был назван 'CJL-8108'.
Для увеличения продуктивности по L-лейцину в полученном штамме CJL-8108, получали штамм, в который был введен вариант gltA (M312I; SEQ ID NO: 25) с ослабленной активностью цитратсинтазы. В частности, вектор pDCM2-gltA(M312I), включающий вариант гена gltA, трансформировали в Corynebacterium glutamicum CJL-8108 путем электропорации, и штаммы, в которых вектор был встроен в хромосому путем рекомбинации гомологичной последовательности, отбирали в среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Отобранные первичные штаммы вновь подвергали вторичному кроссоверу и отбирали штаммы, в которые был введен вариант гена gltA. Наконец, введен ли данный вариант в трансформированный штамм, подтверждали путем осуществления ПЦР (при 94°С в течение 5 минут, 30 циклов при 94°С 30 секунд/при 55°С 30 секунд/при 72°С 90 секунд, с последующими 72°С в течение 5 минут) с использованием праймеров с SEQ ID NO: 15 и 16 из Таблицы 8, и затем анализа нуклеотидной последовательности, тем самым идентифицируя введение варианта M312I. Штамм трансформированный вектором pDCM2-gltA(M312I), был назван 'CJL-8109'.
Пример 4-2. Введение варианта pheA в штамм CJL-8109 и оценка
Штамм CJL-8109, продуцирующий L-лейцин, трансформировали вектором pDCM2-pheA(R182A), полученным в Примере 3-1, и штаммы, в которых вектор был встроен в хромосому путем рекомбинации гомологичной последовательности, отбирали в среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Отобранные первичные штаммы вновь подвергали вторичному кроссоверу и отбирали штаммы, в которые был введен целевой вариант гена. Наконец, введен ли данный вариант гена pheA в трансформированный штамм подтверждали путем осуществления ПЦР с использованием праймеров с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 и затем анализа нуклеотидной последовательности, тем самым идентифицируя что вариант pheA введен в штамм. Полученный CJL8109_pheA_R182A был назван СА13-8116 и депонирован в Корейский центр культур микроорганизмов (КССМ), представляющий собой Международный депозитарий, в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры, 22 января 2021 года под № КССМ12943Р.
Оценивали способность продуцировать лейцин полученными штаммами СА13-8116 и АТСС13032, CJL-8109. Тем же самым образом, как в Примере 2, осуществляли культивирование в колбе и после завершения культивирования продукцию лейцина измеряли способом с использованием ВЭЖХ, и результаты культивирования представлены в Таблице 9 ниже.
Как показано в Таблице 9, было подтверждено, что штамм Corynebacterium glutamicum СА13-8116, продуцирующий L-лейцин, включающий дополнительный вариант R182A в гене pheA, продемонстрировал приблизительно 4-кратное увеличение способности продуцировать L-лейцин по сравнению с родительским штаммом Corynebacterium glutamicum АТСС 13032. Также было подтверждено, что штамм Corynebacterium glutamicum СА13-8116, продуцирующий L-лейцин, продемонстрировал приблизительно 1,2-кратное увеличение способности продуцировать L-лейцин, по сравнению с родительским штаммом Corynebacterium glutamicum CJL-8109. СА13-8116 продемонстрировал приблизительно 5,4-кратное уменьшение способности продуцировать L-фенилаланин по сравнению с родительским штаммом Corynebacterium glutamicum CJL-8109.
Эти результаты свидетельствуют о том, что аминокислота в положении 182 аминокислотной последовательности белка pheA представляет собой важный сайт для увеличения продукции L-лейцина.
Пример 5: Проверка способности продуцировать лейцин и фенилаланин выбранным вариантом pheA в штамме, продуцирующем изолейцин
Для проверки того, демонстрирует ли отобранный вариант эффект в отношении лейцина и изолейцина, который представляет собой типичную аминокислоту с разветвленной цепью, провели эксперимент для подтверждения способности продуцировать изолейцин путем введения данного варианта в штамм рода Corynebacterium, продуцирующий изолейцин. Подробный экспериментальный способ является следующим.
Пример 5-1. Получение штамма СА10-3101, продуцирующего L-изолейцин
Штамм, продуцирующий L-изолейцин, был разработан из Corynebacterium glutamicum АТСС13032 дикого типа. В частности, для того чтобы вызвать обратное ингибирование треонина, который представляет собой предшественник изолейцина в пути биосинтеза, аргинин, который представляет собой аминокислоту в положении 407 в hom, который представляет собой ген, кодирующий гомосериндегидрогеназу, был заменен на гистидин (US 2020-0340022 Al). В частности, для получения штаммов, в которые введен вариант hom (R407H), осуществляли ПЦР с использованием хромосомы Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы и праймеров с SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20. Последовательности используемых здесь праймеров представлены в Таблице 10 ниже.
PfuUltra™, представляющую собой высокоточную ДНК-полимеразу (Stratagene), использовали в качестве полимеразы для реакции ПЦР и осуществляли ПЦР путем повторения 28 циклов денатурации при 95°С в течение 30 секунд; отжига при 55°С в течение 30 секунд; и полимеризации при 72°С в течение 1 минуты. В результате получили соответственно фрагмент ДНК длиной 1000 п.о. в области 5' против хода транскрипции и фрагмент ДНК длиной 1000 п.о. в области 3' по ходу транскрипции, с центром в варианте гена hom. ПЦР осуществляли с использованием амплифицированных двух фрагментов ДНК в качестве матриц и праймеров с SEQ ID NO: 17 и 20. ПЦР оссуществляли в условиях денатурации при 95°С в течение 5 минут; 28 циклов денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 55°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 2 минут; и полимеризации при 72°С в течение 5 минут.
В результате был амплифицирован фрагмент ДНК длиной 2 кб, представляющий собой фрагмент ДНК, включающий вариант гена hom, кодирующий вариант гомосериндегидрогеназы, в котором аргинин в положении 407 заменен на гистидин. Продукт амплификации очищали с использованием набора для очистки после ПЦР (QIAGEN) и использовали в качестве встраиваемого фрагмента ДНК для конструирования вектора. Очищенный продукт амплификации обрабатывали ферментом рестрикции smal. Вектор pDCM2 подвергали тепловой обработке при 65°С в течение 20 минут и продукт амплификации со встраиванием фрагмента ДНК готовили в мольном отношении концентраций (М) 1:2, и клонирование осуществляли с использованием набора для клонирования путем слияния (TaKaRa) в соответствии с инструкцией от производителя, тем самым конструируя вектор pDCM2-R407H для встраивания варианта hom(R407H) в хромосому.
Полученный вектор трансформировали в Corynebacterium glutamicum АТСС13032 путем электропорации, подвергали вторичному кроссоверу и получили штамм, включающий вариант hom(R407H) на хромосоме, который назвали Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 hom(R407H).
Для того чтобы вызвать обратное ингибирование L-изолейцином и увеличить активность в полученном штамме АТСС13032 hom(R407H), получали штаммы, в которые введены варианты (Т381А, F383A) ilvA, который представляет собой ген, кодирующий L-треониндегидратазу. Более конкретно, для получения штаммов, в которые введены варианты ilvA (Т381А, F383A), осуществляли ПЦР с использованием хромосомы Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы и праймеров с SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24. Последовательности используемых здесь праймеров представлены в Таблице 11 ниже.
PfuUltra™, представляющую собой высокоточную ДНК-полимеразу (Stratagene), использовали в качестве полимеразы для реакции ПЦР, и осуществляли ПЦР путем повторения 28 циклов денатурации при 95°С в течение 30 секунд; отжига при 55°С в течение 30 секунд; и полимеризации при 72°С в течение 1 минуты. Как результат, получили соответственно фрагмент ДНК длиной 1126 п. о. в области 5' против хода транскрипции и фрагмент ДНК длиной 286 п. о. в области 3' по ходу транскрипции, с центром в варианте гена ilvA. ПЦР осуществляли с использованием амплифицированных двух фрагментов ДНК в качестве матриц и праймеров с SEQ ID NO: 21 и 24. ПЦР осуществляли в условиях денатурации при 95°С в течение 5 минут; 28 циклов денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 55°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 2 минут; и полимеризации при 72°С в течение 5 минут.
В результате был амплифицирован фрагмент ДНК длиной 1,4 кб, представляющий собой фрагмент ДНК, включающий вариант гена ilvA, кодирующий вариант треониндегидратазы, в котором треонин в положении 381 заменен на аланин, и фенилаланин в положении 383 заменен на аланин. Продукт амплификации очищали с использованием набора для очистки после ПЦР (QIAGEN) и использовали в качестве встраиваемого фрагмента ДНК для конструирования вектора. Очищенный продукт амплификации обрабатывали ферментом рестрикции smaI. Вектор pDCM2 подвергали тепловой обработке при 65°С в течение 20 минут и продукт амплификации со встраиванием фрагмента ДНК готовили в мольном отношении концентраций (М) 1:2, и клонирование осуществляли с использованием набора для клонирования путем слияния (TaKaRa) в соответствии с инструкцией от производителя, тем самым конструируя вектор pDCM2-ilvA(T381A, F383A) для встраивания вариантов ilvA(T381A, F383A) в хромосому.
Полученный вектор трансформировали в Corynebacterium glutamicum АТСС13032 hom(R407H) путем электропорации, подвергали вторичному кроссоверу и получили штамм, включающий варианты ilvA(T381A, F383A) на хромосоме, который назвали Corynebacterium glutamicum СА10-3101.
Пример 5-2. Введение варианта pheA в штамм СА10-3101 и оценка
Штамм СА10-3101, продуцирующий L-изолейцин, трансформировали вектором pDCM2-pheA(R182A), полученным в Примере 3-1, и штаммы, в которых каждый вектор был встроен в хромосому путем рекомбинации гомологичной последовательности, отбирали в среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Отобранные первичные штаммы вновь подвергали вторичному кроссоверу и отбирали штаммы, в которые был введен целевой вариант гена. Наконец, введен ли данный вариант гена pheA в трансформированный штамм подтверждали путем проведения ПЦР с использованием праймеров с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 из Таблицы 1 и затем анализа нуклеотидной последовательности, тем самым идентифицируя, что вариант pheA введен в штамм.
Оценивали способность продуцировать L-изолейцин и L-фенилаланин полученными штаммами CA10-3101_pheA_R182A и АТСС13032, СА10-3101. Родительский штамм и варианты pheA инокулировали в колбе с угловыми перегородками объемом 250 мл, содержащей 25 мл среды для продуцирования изолейцина, соответственно, и культивировали при 32°С в течение 60 часов при встряхивании при 200 об/мин для продуцирования L-изолейцина. Состав среды для продуцирования, использованной в этом Примере, был следующим.
<Среда для продуцирования>
10% Глюкоза, 0,2% дрожжевой экстракт, 1,6% сульфат аммония, 0,1% однозамещенный фосфат калия, 0,1% гептагидрат сульфата магния, 10 мг/л гептагидрата сульфата железа, 10 мг/л моногидрата сульфата марганца, 200 мкг/л биотина, рН 7,2
После завершения культивирования продукцию L-изолейцина и L-фенилаланина измеряли с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), и концентрация L-изолейцина и побочных продуктов в культуральной среде для каждого тестируемого штамма представлены в Таблице 12 ниже.
Как показано в Таблице 12, было подтверждено, что штамм, продуцирующий L-изолейцин, включающий дополнительный вариант R182A в гене pheA, продемонстрировал приблизительно 1,1-кратное увеличение способности продуцировать L-изолейцин по сравнению с родительским штаммом Corynebacterium glutamicum СА10-3101, и штамм CA10-3101_pheA_R182A продемонстрировал уменьшение содержания побочного продукта L-фенилаланина.
Эти результаты свидетельствуют о том, что аминокислота в положении 182 аминокислотной последовательности белка pheA представляет собой важный сайт для увеличения продукции L-изолейцина.
Пример 6: Проверка способности продуцировать валил и фенилаланин выбранным вариантом pheA в штамме, продуцирующем валин
Для проверки того, демонстрирует ли отобранный вариант также эффект в отношении L-валина, который представляет собой типичную аминокислоту с разветвленной цепью, такую как лейцин, провели эксперимент для подтверждения способности продуцировать валин и фенилаланин путем введения отобранного варианта в штамм KCCM11201P рода Corynebacterium, продуцирующий валин. Подробный экспериментальный способ является следующим.
Пример 6-1. Введение варианта pheA в штамм КССМ11201Р и оценка
Для проверки того, проявляет ли соответствующий вариант эффект в отношении увеличения способности продуцировать L-валин, использовали штамм Corynebacterium glutamicum KCCM11201P (US 8465962 В2), продуцирующий L-валин. Штамм KCCM11201P, продуцирующий валин, трансформировали вектором pDCM2-pheA(R182A), полученным в Примере 3-1, и штаммы, в которых каждый вектор был встроен в хромосому путем рекомбинации гомологичной последовательности, отбирали в среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Отобранные первичные штаммы вновь подвергали вторичному кроссоверу и отбирали штаммы, в которые был введен целевой вариант гена. Наконец, введен ли данный вариант гена pheA в трансформированный штамм подтверждали путем осуществления ПЦР с использованием праймеров с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 из Таблицы 1 и затем анализа нуклеотидной последовательности, тем самым идентифицируя, что вариант pheA введен в штамм. Полученные штаммы были названы KCCM11201P - pheA(R182A), соответственно.
Оценивали способность продуцировать валин полученными штаммами KCCM11201P - pheA(R182A). Тем же самым образом, как в Примере 2, осуществляли культивирование в колбе и после завершения культивирования продукцию валина измеряли способом с использованием ВЭЖХ, и результаты культивирования представлены в Таблице 13 ниже.
Как показано в Таблице 13, было подтверждено, что Corynebacterium glutamicum KCCM11201P - pheA(R182A), продуцирующий L-валин, включающий дополнительный вариант R182A в гене pheA, демонстрировал приблизительно 1,1-кратное увеличение способности продуцировать L-валин по сравнению с родительским штаммом Corynebacterium glutamicum KCCM11201P. Было подтверждено, что KCCM11201P - pheA(R182A) демонстрировал приблизительно 5,36-кратное уменьшение способности продуцировать L-фенилаланин по сравнению с родительским штаммом Corynebacterium glutamicum KCCM11201P. Эти результаты свидетельствуют о том, что аминокислота в положении 182 аминокислотной последовательности белка pheA представляет собой важный сайт для увеличения продукции L-валина.
Референсный Пример 1: Проверка эффекта варианта gltA(M312I) в отношении продуцирования лейцина
Референсный Пример 1-1. Конструирование встраиваемого вектора, включающего вариант gltA
Вектор для встраивания варианта gltA (M312I; SEQ ID NO: 25) конструировали с использованием способа сайт-направленного мутагенеза.
ПЦР осуществляли с использованием хромосомы Corynebacterium glutamicum дикого типа в качестве матрицы и пары праймеров с SEQ ID NO: 27 и 28 и пары праймеров с SEQ ID NO: 29 и 30.
ПЦР осуществляли в условиях денатурации при 94°С в течение 5 минут с последующими 30 циклами при 94°С в течение 30 секунд, при 55°С в течение 30 секунд и при 72°С в течение 1 минуты 30 секунд, а затем полимеризации при 72°С в течение 5 минут. Полученный в результате фрагмент гена клонировали в линейный вектор pDCM2, расщепленный ферментом рестрикции SmaI, с использованием фермента In-Fusion путем слияния гомологичной последовательности концевых 15 оснований между фрагментами ДНК, тем самым конструируя вектор pDCM2-gltA(M312I) с заменой метионина, который представляет собой аминокислоту в положении 312, на изолейцин.
Референсный Пример 1-2. Введение варианта в штамм АТСС13032 и оценка
АТСС13032 дикого типа трансформировали вектором pDCM2-gltA(M312I), полученным в Референсном Примере 1-1, и штаммы, в которых вектор был встроен в хромосому путем рекомбинации гомологичной последовательности, отбирали в среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Отобранные первичные штаммы вновь подвергали вторичному кроссоверу и отбирали штаммы, в которые был введен целевой вариант гена. Наконец, введен ли данный вариант гена gltA в трансформированный штамм подтверждали путем осуществления ПЦР с использованием праймеров с SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 (Пример 4-1, Таблица 8) и затем анализа нуклеотидной последовательности, тем самым идентифицируя что вариант (SEQ ID NO: 26) введен в штамм. Полученный штамм был назван АТСС13032_gltA_М3121.
Для оценки способности продуцировать лейцин полученным штаммом ATCC13032_gltA_M312I оценивали ферментационный титр в колбе. Одну платиновую петлю каждого родительского штамма Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 и полученного АТСС13032_gltA_M312I инокулировали в колбу с угловыми перегородками объемом 250 мл, содержащую 25 мл среды для продуцирования, и затем культивировали при 30°С в течение 60 часов при встряхивании при 200 об/мин для продуцирования лейцина. После завершения культивирования продукцию лейцина измеряли посредством ВЭЖХ. Концентрация лейцина в культуральной среде для каждого тестируемого штамма представлена в Таблице 15 ниже.
- Среда для продуцирования: 100 г глюкозы, 40 г (NH4)2SO4, 2,5 г соевого белка, 5 г сухого вещества кукурузного экстракта, 3 г мочевины, 1 г KH2PO4, 0,5 г MgSO4⋅7H2O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамина хлоргидрата, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида, 30 г СаСО3 (в расчете на 1 л дистиллированной воды), рН 7,0
На основе вышеизложенного было подтверждено, что замена M312I в gltA представляет собой эффективный вариант для увеличения продукции лейцина.
Референсный Пример 2: Проверка эффектов вариантов ilvA(T381A, F383A) в отношении продуцирования изолейцина
Референсный Пример 2-1. Конструирование pECCG117-ilvA(F383A)
Для амплификации ilvA (SEQ ID NO: 32), который представляет собой ген, кодирующий треониндегидратазу (SEQ ID NO: 31), сайты для фермента рестрикции BamHI вводили по обоим концам праймеров (SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34) для амплификации от области промотора (приблизительно 300 п. о. против хода транскрипции относительно стартового кодона) до терминаторной области (приблизительно 100 п. о. по ходу транскрипции относительно стартового кодона) на основе последовательности ilvA, о которой ранее сообщалось, что в нее введен вариант F383A (World J Microbiol Biotechnol (2015) 31:1369-1377). Кроме того, праймеры (SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36) использовали для встраивания варианта F383A в ilvA. Последовательности используемых здесь праймеров представлены в Таблице 16 ниже.
ПЦР осуществляли с использованием хромосомы Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 дикого типа в качестве матрицы и праймеров с SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36. ПЦР осуществляли в условиях денатурации при 95°С в течение 5 минут с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 55°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 90 секунд и затем полимеризации при 72°С в течение 5 минут.
В результате получили соответственно фрагмент ДНК длиной 1460 п.о. в области 5' против хода транскрипции и фрагмент ДНК длиной 276 п.о. в области 3' по ходу транскрипции с центром в варианте гена ilvA.
ПЦР осуществляли с использованием двух амплифицированных фрагментов ДНК в качестве матриц и праймеров с SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36.
Как результат, был амплифицирован фрагмент ДНК длиной 1531 п.о., включающий вариант ilvA с заменой фенилаланина на аланин в положении 383. Вектор pECCG117 (Корейский патент №10-0057684) и фрагмент ДНК ilvA обрабатывали ферментом рестрикции BamHI и лигировали с использованием ДНК-лигазы и затем клонировали с получением плазмиды, которая была названа pECCG117-ilvA(F383A).
Референсный Пример 2-2: Дополнительное введение случайной мутации в pECCG117 ilvA(F383A)
Для получения варианта гена, кодирующего L-треониндегидратазу, получали плазмиду с вариантом гена ilvA с использованием набора для случайного мутагенеза (Agilent Technologies, USA). ПЦР осуществляли с использованием хромосомы ilvA (F383A) в соответствии с Референсным Примером 2-1 в качестве матрицы и праймеров с SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36. ПЦР осуществляли в условиях денатурации при 95°С в течение 2 минут с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 55°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 90 секунд, и затем полимеризации при 72°С в течение 10 минут.
В результате был амплифицирован фрагмент ДНК длиной 1531 п.о., который представляет собой вариант ilvA, кодирующий L-треониндегидратазу с дополнительной случайной мутацией в дополнение к варианту, в котором фенилаланин в положении 383 заменен на аланин. Вектор pECCG117 и фрагмент ДНК варианта ilvA обрабатывали ферментом рестрикции BamHI, лигировали с использованием ДНК-лигазы и затем клонировали с получением группы плазмид.
Референсный Пример 2-3: Получение штамма CJILE-301
pECCGl 17-ilvA(F383A) вводили в штамм Corynebacterium glutamicum АТСС13032 hom(R407H) дикого типа, и штамм, в который была введена полученная плазмида, был назван АТСС13032 hom(R407H)/pECCG117-ilvA(F383A). Кроме того, группу плазмид варианта, полученную в Референсном Примере 2-2, вводили в штамм Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 hom(R407H), который затем высевали на минимальную среду. Получали некоторый уровень гибели, и, как результат, уровень гибели достигал 70%, и жизнеспособные клетки инокулировали и культивировали в среде для посева, и в итоге был отобран вариант штамма, демонстрирующий более высокую способность продуцировать изолейцин по сравнению с контрольным АТСС13032 hom(R407H)/pECCG117-ilvA(F383A) и который был назван Corynebacterium glutamicum CJLE-301.
Плазмиду выделяли из штамма CJILE-301 и ген ilvA секвенировали. В результате было подтверждено, что А, который представляет собой основание в последовательности в положении 1141 гена ilvA, заменен на G, кодируя вариант белка с заменой Т на А в положении 381 белка ilvA, дополнительно к замене F на А в положении 383 белка ilvA. Эта последовательность представлена в SEQ ID NO: 38.
Референсный Пример 2-4: Введение варианта ilvA (Т381А, F383A)
Для введения варианта ilvA (Т381А, F383A) в штамм дикого типа получали праймеры с SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 24 (Пример 5-1, Таблица 11).
Для получения штамма, в который введен вариант ilvA (Т381А, F383A), осуществляли ПЦР с использованием плазмиды ДНК, экстрагированной из штамма CJILE-301, в качестве матрицы и праймеров с SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 24.
PfuUltra™, представляющую собой высокоточную ДНК-полимеразу (Stratagene), использовали в качестве полимеразы для реакции ПЦР и осуществляли ПЦР путем повторения 28 циклов денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 55°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 2 минут.
В результате получили фрагмент гена длиной 1411 п.о., включающий терминаторную область длиной приблизительно 100 п.о. гена ilvA длиной 1311 п.о.
Продукт амплификации очищали с использованием набора для очистки после ПЦР и использовали в качестве встраиваемого фрагмента ДНК для конструирования вектора. Очищенный продукт амплификации обрабатывали ферментом рестрикции smaI. Вектор pDCM2 подвергали тепловой обработке при 65°С в течение 20 минут и продукт амплификации со встраиванием фрагмента ДНК готовили в мольном отношении концентраций (М) 1:2 и клонирование осуществляли с использованием набора для клонирования путем слияния в соответствии с инструкцией от производителя, тем самым конструируя вектор pDCM2-T381A_F383A для встраивания вариантов Т381А, F383A в хромосому.
Полученный вектор трансформировали в Corynebacterium glutamicum АТСС13032 hom(R407H) путем электропорации и подвергали вторичному кроссоверу и получили штамм, включающий варианты ilvA(T381A, F383A; SEQ ID NO: 37) на хромосоме, который был назван СА10-3101.
Штамм СА10-3101 депонировали в Корейский центр культур микроорганизмов (KCCM), представляющий собой Международный депозитарий, в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры 27 мая 2020 года под № KCCM12739P.
Штамм KCCM12739P инокулировали в колбу с угловыми перегородками объемом 250 мл, содержащую 25 мл среды для продуцирования изолейцина и затем культивировали при 32°С в течение 60 часов при встряхивании при 200 об/мин с получением L-изолейцина. Состав использованной среды для продуцирования был следующим.
<Среда для продуцирования>
10% глюкоза, 0,2% дрожжевой экстракт, 1,6% сульфат аммония, 0,1% однозамещенный фосфат калия, 0,1% гептагидрат сульфата магния, 10 мг/л гептагидрат сульфата железа, 10 мг/л моногидрат сульфата марганца, 200 мкг/л биотина, рН 7,2
После завершения культивирования концентрации L-изолейцина и L-треонина в культуральной среде измеряли с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), и результаты представлены в Таблице 17 ниже.
Как показано в Таблице 17, было подтверждено, что родительский штамм Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 hom(R407H) не может продуцировать L-изолейцин, тогда как вариант штамма АТСС13032 hom(R407H) ilvA(T381A, F383A) продуцировал L-изолейцин в концентрации 3,9 г/л с демонстрацией значительного увеличения продуктивности по L-изолейцину по сравнению с родительским штаммом.
В соответствии с вышеизложенным было подтверждено, что вариант ilvA(T381A, F383A) представляет собой эффективный вариант для увеличения продукции изолейцина.
Референсный Пример 3: Проверка эффекта leuA(P247C, R558H, G561D) в отношении продуцирования лейцина
Референсный Пример 3-1. Получение штамма CJL-8100
Вектор pDCM2-leuA(R558H, G561D), включающий варианты гена leuA, как раскрыто в KR 10-2018-0077008А, трансформировали в Corynebacterium glutamicum АТСС13032 дикого типа путем электропорации, и штаммы, в которых вектор был встроен в хромосому путем рекомбинации гомологичной последовательности, отбирали в среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Отобранные первичные штаммы вновь подвергали вторичному кроссоверу и отбирали штаммы, в которые был введен вариант гена leuA. Наконец, введен ли данный вариант в трансформированный штамм подтверждали путем осуществления ПЦР (при 94°С в течение 5 минут с последующими 30 циклами при 94°С в течение 30 секунд/при 55°С в течение 30 секунд/при 72°С в течение 90 секунд, при 72°С в течение 5 минут) с использованием праймеров с SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 43 и затем анализа нуклеотидной последовательности, тем самым идентифицируя, что варианты R558H, G561D были введены. Штамм АТСС13032_leuA_(R558H, G561D), трансформированный вектором pDCM2-leuA(R558H, G561D), был назван 'CJL-8100'.
Последовательности праймеров, использованных в Референсном Примере 3, представлены в Таблице 18 ниже.
Референсный Пример 3-2. Конструирование встраиваемого вектора, включающего вариант leuA
Конструировали вектор для встраивания варианта Р247С в штамм CJL-8100, продуцирующий L-лейцин, в котором два варианта (R558H, G561D) введены в LeuA.
ПЦР осуществляли с использованием хромосомы штамма CJL-8100 в качестве матрицы и пары праймеров с SEQ ID NO: 39 и 40 и пары праймеров с SEQ ID NO: 41 и 42. ПЦР осуществляли в условиях денатурации при 94°С в течение 5 минут с последующими 30 циклами при 94°С в течение 30 секунд, при 55°С в течение 30 секунд и при 72°С в течение 1 минуты и 30 секунд и затем при 72°С в течение 5 минут. Полученный в результате фрагмент ПЦР клонировали в линейный вектор pDCM2, расщепленный ферментом рестрикции SmaI с использованием фермента In-Fusion путем слияния гомологичной последовательности концевых 15 оснований между фрагментами ДНК, тем самым конструируя вектор pDCM2-leuA(P247C, R558H, G561D), включающий вариант leuA, кодирующий вариант LeuA, в котором аргинин, представляющий собой аминокислоту в положении 558 аминокислотной последовательности LeuA штамма дикого типа, был заменен на гистидин, а глицин, представляющий собой аминокислоту в положении 561, был заменен на аспарагиновую кислоту, а также с заменой пролина (Pro), представляющего собой аминокислоту в положении 247 в LeuA, на цистеин (Cys).
Референсный Пример 3-3. Введение варианта LeuA (Р247С) в штамм CJL-8100 и оценка
CJL-8100, который представляет собой штамм, продуцирующий L-лейцин, трансформировали вектором pDCM2-leuA(P247C, R558H, G561D), полученным в Референсном Примере 3-2, и штаммы, в которых вектор был встроен в хромосому путем рекомбинации гомологичной последовательности, отбирали в среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Отобранные первичные штаммы вновь подвергали вторичному кроссоверу и отбирали штаммы, в которые был введен целевой вариант гена. Наконец, введен ли данный вариант гена leuA в трансформированный штамм подтверждали путем осуществления ПЦР (при 94°С в течение 5 минут с последующими 30 циклами при 94°С в течение 30 секунд/при 55°С в течение 30 секунд/при 72°С в течение 90 секунд, и затем при 72°С в течение 5 минут) с использованием праймеров с SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 45 и затем анализа нуклеотидной последовательности. В результате анализа секвенирования было подтверждено, что варианты leuA введены в штамм, где варианты leuA кодируют вариант LeuA (Р247С, R558H, G561D), в котором аргинин, который представляет собой аминокислоту в положении 558 в LeuA, был заменен на гистидин, глицин, который представляет собой аминокислоту в положении 561 в LeuA, был заменен на аспарагиновую кислоту, и пролин (Pro), который представляет собой аминокислоту в положении 247 в LeuA, был заменен на цистеин (Cys), путем замены G на А, который представляет собой нуклеотид в положении 1673, замены GC на AT, которые представляют собой нуклеотиды в положениях 1682 и 1683, и замены СС на TG, которые представляют собой нуклеотиды в положениях 739 и 740 гена leuA на хромосоме штамма. Полученный CJL8100 leuA Р247С был назван 'СА13-8105' и депонирован в Корейский центр культур микроорганизмов (KCCM), представляющий собой Международный депозитарий, в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры 29 апреля 2020 года под № KCCM12709P.
Аминокислотная последовательность варианта LeuA (Р247С, R558H, G561D), включающего в общей сложности 3 типа вариаций, и последовательность оснований варианта leuA, кодирующего его, являются такими как представлено в SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47, соответственно.
Оценивали способность АТСС 13032 продуцировать L-лейцин полученными штаммами CJL-8100 и СА13-8105. В частности, осуществляли культивирование в колбе тем же самым образом, как в Примере 2-1. После завершения культивирования продукцию L-лейцина родительским штаммом и вариантами штаммов измеряли посредством ВЭЖХ, и результаты представлены в Таблице 19 ниже.
Как показано в Таблице 19, штамм Corynebacterium glutamicum CJL8100, продуцирующий L-лейцин, демонстрировал приблизительно 130% увеличение способности продуцировать L-лейцин по сравнению с родительским штаммом АТСС13032. Штамм СА13-8105, полученный путем введения дополнительного варианта leuA_P247C в штамм CJL8100, продемонстрировал приблизительно 150% увеличение способности продуцировать L-лейцин по сравнению с родительским штаммом CJL8100.
На основе этого результата подтвердили, что варианты LeuA(R558H, G561D, Р247С) представляют собой эффективные варианты для увеличения продукции лейцина.
Специалистам в данной области техники понятно, что настоящее изобретение может быть осуществлено в другой конкретной форме без изменения его технической сущности или существенных характеристик. В этой связи следует понимать, что вышеприведенное воплощение не является ограничивающим, но иллюстративно во всех аспектах. Объем изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, нежели предшествующим описанием, и, таким образом, подразумевается то, что все изменения и модификации, которые находятся в пределах значения и диапазона формулы изобретения или эквивалентов таких значений и диапазонов формулы изобретения, охватываются формулой изобретения.
Эффект изобретения
Когда используют вариант префенатдегидратазы по настоящему изобретению, возможно получение аминокислот с разветвленной цепью с высоким выходом по сравнению со случаем, когда его не используют.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> ВАРИАНТ ПРЕФЕНАТДЕГИДРАТАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ С
РАЗВЕТВЛЕННОЙ ЦЕПЬЮ С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
<130> OPA21407
<150> KR 10-2021-0014077
<151> 2021-02-01
<160> 47
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 315
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PheA_WT
<400> 1
Met Ser Asp Ala Pro Thr Val Val Ala Tyr Leu Gly Pro Ala Gly Thr
1 5 10 15
Phe Thr Glu Glu Ala Leu Tyr Lys Phe Ala Asp Ala Gly Val Phe Gly
20 25 30
Asp Gly Glu Ile Glu Gln Leu Pro Ala Lys Ser Pro Gln Glu Ala Val
35 40 45
Asp Ala Val Arg His Gly Thr Ala Gln Phe Ala Val Val Ala Ile Glu
50 55 60
Asn Phe Val Asp Gly Pro Val Thr Pro Thr Phe Asp Ala Leu Asp Gln
65 70 75 80
Gly Ser Asn Val Gln Ile Ile Ala Glu Glu Glu Leu Asp Ile Ala Phe
85 90 95
Ser Ile Met Val Arg Pro Gly Thr Ser Leu Ala Asp Val Lys Thr Leu
100 105 110
Ala Thr His Pro Val Gly Tyr Gln Gln Val Lys Asn Trp Met Ala Thr
115 120 125
Thr Ile Pro Asp Ala Met Tyr Leu Ser Ala Ser Ser Asn Gly Ala Gly
130 135 140
Ala Gln Met Val Ala Glu Gly Thr Ala Asp Ala Ala Ala Ala Pro Ser
145 150 155 160
Arg Ala Ala Glu Leu Phe Gly Leu Glu Arg Leu Val Asp Asp Val Ala
165 170 175
Asp Val Arg Gly Ala Arg Thr Arg Phe Val Ala Val Gln Ala Gln Ala
180 185 190
Ala Val Ser Glu Pro Thr Gly His Asp Arg Thr Ser Val Ile Phe Ser
195 200 205
Leu Pro Asn Val Pro Gly Ser Leu Val Arg Ala Leu Asn Glu Phe Ala
210 215 220
Ile Arg Gly Val Asp Leu Thr Arg Ile Glu Ser Arg Pro Thr Arg Lys
225 230 235 240
Val Phe Gly Thr Tyr Arg Phe His Leu Asp Ile Ser Gly His Ile Arg
245 250 255
Asp Ile Pro Val Ala Glu Ala Leu Arg Ala Leu His Leu Gln Ala Glu
260 265 270
Glu Leu Val Phe Val Gly Ser Trp Pro Ser Asn Arg Ala Glu Asp Ser
275 280 285
Thr Pro Gln Thr Asp Gln Leu Ala Lys Leu His Lys Ala Asp Glu Trp
290 295 300
Val Arg Ala Ala Ser Glu Gly Arg Lys Leu Asn
305 310 315
<210> 2
<211> 948
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pheA_WT
<400> 2
atgagcgacg caccaactgt tgtggcctat ttggggcctg ccggaacctt caccgaagaa 60
gccctctaca aatttgccga cgccggcgta ttcggcgacg gtgagatcga gcagctacca 120
gccaaatcgc cacaagaagc tgtcgacgcc gtccgccacg gcaccgccca gttcgcggtg 180
gtcgccatcg aaaacttcgt cgacggcccc gtcaccccca ccttcgacgc ccttgaccag 240
ggctccaacg tgcaaatcat cgccgaagaa gaactcgaca tcgccttttc catcatggtc 300
cggccaggga cttcgcttgc cgacgtcaaa accctcgcca cccacccggt tgggtaccaa 360
caagtgaaaa actggatggc aaccaccatt ccggacgcca tgtatctttc agcaagctcc 420
aacggcgccg gcgcacaaat ggttgccgaa ggaaccgccg acgcagccgc agcgccctcc 480
cgcgcagccg aactcttcgg actggaacgc cttgttgatg atgtcgccga cgtccgtggc 540
gcccgcaccc gcttcgttgc tgtccaagcc caagcagccg tttccgaacc gaccggccac 600
gaccgcacct ccgtcatttt ctccctaccg aatgtgccag gcagcctcgt gcgcgccctc 660
aacgaattcg ccatccgcgg cgttgacctc acccgcatcg aatcccgccc cacccgcaaa 720
gtcttcggaa cctaccgctt ccacctggac atatccggac atatccgcga tatccccgtc 780
gccgaagccc tccgcgcact ccacctccaa gccgaagaac tcgtcttcgt cggctcctgg 840
ccctccaacc gtgcggaaga cagcacgccc caaaccgacc aactagctaa gctacacaag 900
gcggacgaat gggttcgcgc agcaagcgaa ggaaggaaac ttaactag 948
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 3
ttgaggtcct tggctgg 17
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 4
cgcaacacga tggagctg 18
<210> 5
<211> 315
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PheA_R182A
<400> 5
Met Ser Asp Ala Pro Thr Val Val Ala Tyr Leu Gly Pro Ala Gly Thr
1 5 10 15
Phe Thr Glu Glu Ala Leu Tyr Lys Phe Ala Asp Ala Gly Val Phe Gly
20 25 30
Asp Gly Glu Ile Glu Gln Leu Pro Ala Lys Ser Pro Gln Glu Ala Val
35 40 45
Asp Ala Val Arg His Gly Thr Ala Gln Phe Ala Val Val Ala Ile Glu
50 55 60
Asn Phe Val Asp Gly Pro Val Thr Pro Thr Phe Asp Ala Leu Asp Gln
65 70 75 80
Gly Ser Asn Val Gln Ile Ile Ala Glu Glu Glu Leu Asp Ile Ala Phe
85 90 95
Ser Ile Met Val Arg Pro Gly Thr Ser Leu Ala Asp Val Lys Thr Leu
100 105 110
Ala Thr His Pro Val Gly Tyr Gln Gln Val Lys Asn Trp Met Ala Thr
115 120 125
Thr Ile Pro Asp Ala Met Tyr Leu Ser Ala Ser Ser Asn Gly Ala Gly
130 135 140
Ala Gln Met Val Ala Glu Gly Thr Ala Asp Ala Ala Ala Ala Pro Ser
145 150 155 160
Arg Ala Ala Glu Leu Phe Gly Leu Glu Arg Leu Val Asp Asp Val Ala
165 170 175
Asp Val Arg Gly Ala Ala Thr Arg Phe Val Ala Val Gln Ala Gln Ala
180 185 190
Ala Val Ser Glu Pro Thr Gly His Asp Arg Thr Ser Val Ile Phe Ser
195 200 205
Leu Pro Asn Val Pro Gly Ser Leu Val Arg Ala Leu Asn Glu Phe Ala
210 215 220
Ile Arg Gly Val Asp Leu Thr Arg Ile Glu Ser Arg Pro Thr Arg Lys
225 230 235 240
Val Phe Gly Thr Tyr Arg Phe His Leu Asp Ile Ser Gly His Ile Arg
245 250 255
Asp Ile Pro Val Ala Glu Ala Leu Arg Ala Leu His Leu Gln Ala Glu
260 265 270
Glu Leu Val Phe Val Gly Ser Trp Pro Ser Asn Arg Ala Glu Asp Ser
275 280 285
Thr Pro Gln Thr Asp Gln Leu Ala Lys Leu His Lys Ala Asp Glu Trp
290 295 300
Val Arg Ala Ala Ser Glu Gly Arg Lys Leu Asn
305 310 315
<210> 6
<211> 948
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pheA_R182A
<400> 6
atgagcgacg caccaactgt tgtggcctat ttggggcctg ccggaacctt caccgaagaa 60
gccctctaca aatttgccga cgccggcgta ttcggcgacg gtgagatcga gcagctacca 120
gccaaatcgc cacaagaagc tgtcgacgcc gtccgccacg gcaccgccca gttcgcggtg 180
gtcgccatcg aaaacttcgt cgacggcccc gtcaccccca ccttcgacgc ccttgaccag 240
ggctccaacg tgcaaatcat cgccgaagaa gaactcgaca tcgccttttc catcatggtc 300
cggccaggga cttcgcttgc cgacgtcaaa accctcgcca cccacccggt tgggtaccaa 360
caagtgaaaa actggatggc aaccaccatt ccggacgcca tgtatctttc agcaagctcc 420
aacggcgccg gcgcacaaat ggttgccgaa ggaaccgccg acgcagccgc agcgccctcc 480
cgcgcagccg aactcttcgg actggaacgc cttgttgatg atgtcgccga cgtccgtggc 540
gccgcgaccc gcttcgttgc tgtccaagcc caagcagccg tttccgaacc gaccggccac 600
gaccgcacct ccgtcatttt ctccctaccg aatgtgccag gcagcctcgt gcgcgccctc 660
aacgaattcg ccatccgcgg cgttgacctc acccgcatcg aatcccgccc cacccgcaaa 720
gtcttcggaa cctaccgctt ccacctggac atatccggac atatccgcga tatccccgtc 780
gccgaagccc tccgcgcact ccacctccaa gccgaagaac tcgtcttcgt cggctcctgg 840
ccctccaacc gtgcggaaga cagcacgccc caaaccgacc aactagctaa gctacacaag 900
gcggacgaat gggttcgcgc agcaagcgaa ggaaggaaac ttaactag 948
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 7
gtgaattcga gctcggtacc cgtggcatgg atgaaaag 38
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 8
ttggacagca acgaagcggg tcgcggcgcc acggac 36
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 9
gtcgccgacg tccgtggcgc cgcgacccgc ttcgttg 37
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 10
ggtcgactct agaggatccc cgtggctgtc catgattc 38
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 11
tatgcttcac cacatgactt c 21
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 12
aaatcatttg agaaaactcg agg 23
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 13
gtcacccgat cgtctgaag 19
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 14
gtcttaaaac cggttgat 18
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 15
caatgctggc tgcgtacgc 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 16
ctcctcgcga ggaaccaact 20
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 17
tcgagctcgg taccccgctt ttgcactcat cgagc 35
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 18
cacgatcaga tgtgcatcat cat 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 19
atgatgatgc acatctgatc gtg 23
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 20
ctctagagga tccccgagca tcttccaaaa ccttg 35
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 21
tcgagctcgg tacccatgag tgaaacatac gtgtc 35
<210> 22
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 22
gcgcttgagg tactctgcca gcgcgatgtc atcatccgg 39
<210> 23
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 23
ccggatgatg acatcgcgct ggcagagtac ctcaagcgc 39
<210> 24
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 24
ctctagagga tcccccgtca ccgacacctc caca 34
<210> 25
<211> 437
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GltA_M312I
<400> 25
Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu
1 5 10 15
His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu
20 25 30
Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu
35 40 45
Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys
50 55 60
Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr
65 70 75 80
Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr
85 90 95
Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe
100 105 110
Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser
115 120 125
Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala
130 135 140
Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro
145 150 155 160
Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys
165 170 175
Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro
180 185 190
Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg
195 200 205
Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met
210 215 220
Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln
225 230 235 240
Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn
245 250 255
Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu
260 265 270
His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys
275 280 285
Ser Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Glu Phe Met Asn Lys Val Lys Asn
290 295 300
Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Ile Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys
305 310 315 320
Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile
325 330 335
Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu
340 345 350
Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Tyr Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr
355 360 365
Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe
370 375 380
Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly
385 390 395 400
Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Gly Asn Lys Ile
405 410 415
Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Asn Glu Ser Arg Lys Leu Val
420 425 430
Pro Arg Glu Glu Arg
435
<210> 26
<211> 1314
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gltA_M312I
<400> 26
atgtttgaaa gggatatcgt ggctactgat aacaacaagg ctgtcctgca ctaccccggt 60
ggcgagttcg aaatggacat catcgaggct tctgagggta acaacggtgt tgtcctgggc 120
aagatgctgt ctgagactgg actgatcact tttgacccag gttatgtgag cactggctcc 180
accgagtcga agatcaccta catcgatggc gatgcgggaa tcctgcgtta ccgcggctat 240
gacatcgctg atctggctga gaatgccacc ttcaacgagg tttcttacct acttatcaac 300
ggtgagctac caaccccaga tgagcttcac aagtttaacg acgagattcg ccaccacacc 360
cttctggacg aggacttcaa gtcccagttc aacgtgttcc cacgcgacgc tcacccaatg 420
gcaaccttgg cttcctcggt taacattttg tctacctact accaggacca gctgaaccca 480
ctcgatgagg cacagcttga taaggcaacc gttcgcctca tggcaaaggt tccaatgctg 540
gctgcgtacg cacaccgcgc acgcaagggt gctccttaca tgtacccaga caactccctc 600
aatgcgcgtg agaacttcct gcgcatgatg ttcggttacc caaccgagcc atacgagatc 660
gacccaatca tggtcaaggc tctggacaag ctgctcatcc tgcacgctga ccacgagcag 720
aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780
atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840
ctggagatgc tcgaagacat caagagcaac cacggtggcg acgcaaccga gttcatgaac 900
aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatcggct tcggacaccg cgtttacaag 960
aactacgatc cacgtgcagc aatcgtcaag gagaccgcac acgagatcct cgagcacctc 1020
ggtggcgacg atcttctgga tctggcaatc aagctggaag aaattgcact ggctgatgat 1080
tacttcatct cccgcaagct ctacccgaac gtagacttct acaccggcct gatctaccgc 1140
gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200
tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcaggca acaagatcaa ccgcccacgc 1260
caggtctaca ccggcaacga atcccgcaag ttggttcctc gcgaggagcg ctaa 1314
<210> 27
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 27
gtgaattcga gctcggtacc cgcgggaatc ctgcgttacc gc 42
<210> 28
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 28
tgtaaacgcg gtgtccgaag ccgatgaggc ggacgccgtc tt 42
<210> 29
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 29
aagacggcgt ccgcctcatc ggcttcggac accgcgttta ca 42
<210> 30
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 30
ggtcgactct agaggatccc cttagcgctc ctcgcgagga ac 42
<210> 31
<211> 436
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IlvA_WT
<400> 31
Met Ser Glu Thr Tyr Val Ser Glu Lys Ser Pro Gly Val Met Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Glu Leu Ile Arg Ala Ala Asp Ile Gln Thr Ala Gln Ala Arg
20 25 30
Ile Ser Ser Val Ile Ala Pro Thr Pro Leu Gln Tyr Cys Pro Arg Leu
35 40 45
Ser Glu Glu Thr Gly Ala Glu Ile Tyr Leu Lys Arg Glu Asp Leu Gln
50 55 60
Asp Val Arg Ser Tyr Lys Ile Arg Gly Ala Leu Asn Ser Gly Ala Gln
65 70 75 80
Leu Thr Gln Glu Gln Arg Asp Ala Gly Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly
85 90 95
Asn His Ala Gln Gly Val Ala Tyr Val Cys Lys Ser Leu Gly Val Gln
100 105 110
Gly Arg Ile Tyr Val Pro Val Gln Thr Pro Lys Gln Lys Arg Asp Arg
115 120 125
Ile Met Val His Gly Gly Glu Phe Val Ser Leu Val Val Thr Gly Asn
130 135 140
Asn Phe Asp Glu Ala Ser Ala Ala Ala His Glu Asp Ala Glu Arg Thr
145 150 155 160
Gly Ala Thr Leu Ile Glu Pro Phe Asp Ala Arg Asn Thr Val Ile Gly
165 170 175
Gln Gly Thr Val Ala Ala Glu Ile Leu Ser Gln Leu Thr Ser Met Gly
180 185 190
Lys Ser Ala Asp His Val Met Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu Leu
195 200 205
Ala Gly Val Val Ser Tyr Met Ala Asp Met Ala Pro Arg Thr Ala Ile
210 215 220
Val Gly Ile Glu Pro Ala Gly Ala Ala Ser Met Gln Ala Ala Leu His
225 230 235 240
Asn Gly Gly Pro Ile Thr Leu Glu Thr Val Asp Pro Phe Val Asp Gly
245 250 255
Ala Ala Val Lys Arg Val Gly Asp Leu Asn Tyr Thr Ile Val Glu Lys
260 265 270
Asn Gln Gly Arg Val His Met Met Ser Ala Thr Glu Gly Ala Val Cys
275 280 285
Thr Glu Met Leu Asp Leu Tyr Gln Asn Glu Gly Ile Ile Ala Glu Pro
290 295 300
Ala Gly Ala Leu Ser Ile Ala Gly Leu Lys Glu Met Ser Phe Ala Pro
305 310 315 320
Gly Ser Val Val Val Cys Ile Ile Ser Gly Gly Asn Asn Asp Val Leu
325 330 335
Arg Tyr Ala Glu Ile Ala Glu Arg Ser Leu Val His Arg Gly Leu Lys
340 345 350
His Tyr Phe Leu Val Asn Phe Pro Gln Lys Pro Gly Gln Leu Arg His
355 360 365
Phe Leu Glu Asp Ile Leu Gly Pro Asp Asp Asp Ile Thr Leu Phe Glu
370 375 380
Tyr Leu Lys Arg Asn Asn Arg Glu Thr Gly Thr Ala Leu Val Gly Ile
385 390 395 400
His Leu Ser Glu Ala Ser Gly Leu Asp Ser Leu Leu Glu Arg Met Glu
405 410 415
Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Arg Leu Glu Pro Gly Thr Pro Glu Tyr
420 425 430
Glu Tyr Leu Thr
435
<210> 32
<211> 1311
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ilvA_WT
<400> 32
atgagtgaaa catacgtgtc tgagaaaagt ccaggagtga tggctagcgg agcggagctg 60
attcgtgccg ccgacattca aacggcgcag gcacgaattt cctccgtcat tgcaccaact 120
ccattgcagt attgccctcg tctttctgag gaaaccggag cggaaatcta ccttaagcgt 180
gaggatctgc aggatgttcg ttcctacaag atccgcggtg cgctgaactc tggagcgcag 240
ctcacccaag agcagcgcga tgcaggtatc gttgccgcat ctgcaggtaa ccatgcccag 300
ggcgtggcct atgtgtgcaa gtccttgggc gttcagggac gcatctatgt tcctgtgcag 360
actccaaagc aaaagcgtga ccgcatcatg gttcacggcg gagagtttgt ctccttggtg 420
gtcactggca ataacttcga cgaagcatcg gctgcagcgc atgaagatgc agagcgcacc 480
ggcgcaacgc tgatcgagcc tttcgatgct cgcaacaccg tcatcggtca gggcaccgtg 540
gctgctgaga tcttgtcgca gctgacttcc atgggcaaga gtgcagatca cgtgatggtt 600
ccagtcggcg gtggcggact tcttgcaggt gtggtcagct acatggctga tatggcacct 660
cgcactgcga tcgttggtat cgaaccagcg ggagcagcat ccatgcaggc tgcattgcac 720
aatggtggac caatcacttt ggagactgtt gatccctttg tggacggcgc agcagtcaaa 780
cgtgtcggag atctcaacta caccatcgtg gagaagaacc agggtcgcgt gcacatgatg 840
agcgcgaccg agggcgctgt gtgtactgag atgctcgatc tttaccaaaa cgaaggcatc 900
atcgcggagc ctgctggcgc gctgtctatc gctgggttga aggaaatgtc ctttgcacct 960
ggttctgtcg tggtgtgcat catctctggt ggcaacaacg atgtgctgcg ttatgcggaa 1020
atcgctgagc gctccttggt gcaccgcggt ttgaagcact acttcttggt gaacttcccg 1080
caaaagcctg gtcagttgcg tcacttcctg gaagatatcc tgggaccgga tgatgacatc 1140
acgctgtttg agtacctcaa gcgcaacaac cgtgagaccg gtactgcgtt ggtgggtatt 1200
cacttgagtg aagcatcagg attggattct ttgctggaac gtatggagga atcggcaatt 1260
gattcccgtc gcctcgagcc gggcacccct gagtacgaat acttgaccta a 1311
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 33
ggatccgact gagcctgggc aactgg 26
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 34
ggatccccgt caccgacacc tccaca 26
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 35
acatcacgct ggcagagtac ctcaa 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 36
ttgaggtact ctgccagcgt gatgt 25
<210> 37
<211> 436
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IlvA_T381A, F383A
<400> 37
Met Ser Glu Thr Tyr Val Ser Glu Lys Ser Pro Gly Val Met Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Glu Leu Ile Arg Ala Ala Asp Ile Gln Thr Ala Gln Ala Arg
20 25 30
Ile Ser Ser Val Ile Ala Pro Thr Pro Leu Gln Tyr Cys Pro Arg Leu
35 40 45
Ser Glu Glu Thr Gly Ala Glu Ile Tyr Leu Lys Arg Glu Asp Leu Gln
50 55 60
Asp Val Arg Ser Tyr Lys Ile Arg Gly Ala Leu Asn Ser Gly Ala Gln
65 70 75 80
Leu Thr Gln Glu Gln Arg Asp Ala Gly Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly
85 90 95
Asn His Ala Gln Gly Val Ala Tyr Val Cys Lys Ser Leu Gly Val Gln
100 105 110
Gly Arg Ile Tyr Val Pro Val Gln Thr Pro Lys Gln Lys Arg Asp Arg
115 120 125
Ile Met Val His Gly Gly Glu Phe Val Ser Leu Val Val Thr Gly Asn
130 135 140
Asn Phe Asp Glu Ala Ser Ala Ala Ala His Glu Asp Ala Glu Arg Thr
145 150 155 160
Gly Ala Thr Leu Ile Glu Pro Phe Asp Ala Arg Asn Thr Val Ile Gly
165 170 175
Gln Gly Thr Val Ala Ala Glu Ile Leu Ser Gln Leu Thr Ser Met Gly
180 185 190
Lys Ser Ala Asp His Val Met Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu Leu
195 200 205
Ala Gly Val Val Ser Tyr Met Ala Asp Met Ala Pro Arg Thr Ala Ile
210 215 220
Val Gly Ile Glu Pro Ala Gly Ala Ala Ser Met Gln Ala Ala Leu His
225 230 235 240
Asn Gly Gly Pro Ile Thr Leu Glu Thr Val Asp Pro Phe Val Asp Gly
245 250 255
Ala Ala Val Lys Arg Val Gly Asp Leu Asn Tyr Thr Ile Val Glu Lys
260 265 270
Asn Gln Gly Arg Val His Met Met Ser Ala Thr Glu Gly Ala Val Cys
275 280 285
Thr Glu Met Leu Asp Leu Tyr Gln Asn Glu Gly Ile Ile Ala Glu Pro
290 295 300
Ala Gly Ala Leu Ser Ile Ala Gly Leu Lys Glu Met Ser Phe Ala Pro
305 310 315 320
Gly Ser Val Val Val Cys Ile Ile Ser Gly Gly Asn Asn Asp Val Leu
325 330 335
Arg Tyr Ala Glu Ile Ala Glu Arg Ser Leu Val His Arg Gly Leu Lys
340 345 350
His Tyr Phe Leu Val Asn Phe Pro Gln Lys Pro Gly Gln Leu Arg His
355 360 365
Phe Leu Glu Asp Ile Leu Gly Pro Asp Asp Asp Ile Ala Leu Ala Glu
370 375 380
Tyr Leu Lys Arg Asn Asn Arg Glu Thr Gly Thr Ala Leu Val Gly Ile
385 390 395 400
His Leu Ser Glu Ala Ser Gly Leu Asp Ser Leu Leu Glu Arg Met Glu
405 410 415
Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Arg Leu Glu Pro Gly Thr Pro Glu Tyr
420 425 430
Glu Tyr Leu Thr
435
<210> 38
<211> 1311
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ilvA_T381A, F383A
<400> 38
atgagtgaaa catacgtgtc tgagaaaagt ccaggagtga tggctagcgg agcggagctg 60
attcgtgccg ccgacattca aacggcgcag gcacgaattt cctccgtcat tgcaccaact 120
ccattgcagt attgccctcg tctttctgag gaaaccggag cggaaatcta ccttaagcgt 180
gaggatctgc aggatgttcg ttcctacaag atccgcggtg cgctgaactc tggagcgcag 240
ctcacccaag agcagcgcga tgcaggtatc gttgccgcat ctgcaggtaa ccatgcccag 300
ggcgtggcct atgtgtgcaa gtccttgggc gttcagggac gcatctatgt tcctgtgcag 360
actccaaagc aaaagcgtga ccgcatcatg gttcacggcg gagagtttgt ctccttggtg 420
gtcactggca ataacttcga cgaagcatcg gctgcagcgc atgaagatgc agagcgcacc 480
ggcgcaacgc tgatcgagcc tttcgatgct cgcaacaccg tcatcggtca gggcaccgtg 540
gctgctgaga tcttgtcgca gctgacttcc atgggcaaga gtgcagatca cgtgatggtt 600
ccagtcggcg gtggcggact tcttgcaggt gtggtcagct acatggctga tatggcacct 660
cgcactgcga tcgttggtat cgaaccagcg ggagcagcat ccatgcaggc tgcattgcac 720
aatggtggac caatcacttt ggagactgtt gatccctttg tggacggcgc agcagtcaaa 780
cgtgtcggag atctcaacta caccatcgtg gagaagaacc agggtcgcgt gcacatgatg 840
agcgcgaccg agggcgctgt gtgtactgag atgctcgatc tttaccaaaa cgaaggcatc 900
atcgcggagc ctgctggcgc gctgtctatc gctgggttga aggaaatgtc ctttgcacct 960
ggttctgtcg tggtgtgcat catctctggt ggcaacaacg atgtgctgcg ttatgcggaa 1020
atcgctgagc gctccttggt gcaccgcggt ttgaagcact acttcttggt gaacttcccg 1080
caaaagcctg gtcagttgcg tcacttcctg gaagatatcc tgggaccgga tgatgacatc 1140
gcgctggcag agtacctcaa gcgcaacaac cgtgagaccg gtactgcgtt ggtgggtatt 1200
cacttgagtg aagcatcagg attggattct ttgctggaac gtatggagga atcggcaatt 1260
gattcccgtc gcctcgagcc gggcacccct gagtacgaat acttgaccta a 1311
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 39
aacacgaccg gcatcccgtc gc 22
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 40
aaatcatttg agaaaactcg agg 23
<210> 41
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 41
gtgaattcga gctcggtacc caaatcattt gagaaaactc gaggc 45
<210> 42
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 42
ggtgatcatc tcaacggtgg aacacaggtt gatgatcatt gggtt 45
<210> 43
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 43
aacccaatga tcatcaacct gtgttccacc gttgagatga tcacc 45
<210> 44
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 44
ggtcgactct agaggatccc caagaaggca acatcggaca gc 42
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 45
atccattcaa tggagtctgc g 21
<210> 46
<211> 616
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> leuA_P247C, R558H, G561D
<400> 46
Met Ser Pro Asn Asp Ala Phe Ile Ser Ala Pro Ala Lys Ile Glu Thr
1 5 10 15
Pro Val Gly Pro Arg Asn Glu Gly Gln Pro Ala Trp Asn Lys Gln Arg
20 25 30
Gly Ser Ser Met Pro Val Asn Arg Tyr Met Pro Phe Glu Val Glu Val
35 40 45
Glu Asp Ile Ser Leu Pro Asp Arg Thr Trp Pro Asp Lys Lys Ile Thr
50 55 60
Val Ala Pro Gln Trp Cys Ala Val Asp Leu Arg Asp Gly Asn Gln Ala
65 70 75 80
Leu Ile Asp Pro Met Ser Pro Glu Arg Lys Arg Arg Met Phe Glu Leu
85 90 95
Leu Val Gln Met Gly Phe Lys Glu Ile Glu Val Gly Phe Pro Ser Ala
100 105 110
Ser Gln Thr Asp Phe Asp Phe Val Arg Glu Ile Ile Glu Lys Gly Met
115 120 125
Ile Pro Asp Asp Val Thr Ile Gln Val Leu Val Gln Ala Arg Glu His
130 135 140
Leu Ile Arg Arg Thr Phe Glu Ala Cys Glu Gly Ala Lys Asn Val Ile
145 150 155 160
Val His Phe Tyr Asn Ser Thr Ser Ile Leu Gln Arg Asn Val Val Phe
165 170 175
Arg Met Asp Lys Val Gln Val Lys Lys Leu Ala Thr Asp Ala Ala Glu
180 185 190
Leu Ile Lys Thr Ile Ala Gln Asp Tyr Pro Asp Thr Asn Trp Arg Trp
195 200 205
Gln Tyr Ser Pro Glu Ser Phe Thr Gly Thr Glu Val Glu Tyr Ala Lys
210 215 220
Glu Val Val Asp Ala Val Val Glu Val Met Asp Pro Thr Pro Glu Asn
225 230 235 240
Pro Met Ile Ile Asn Leu Cys Ser Thr Val Glu Met Ile Thr Pro Asn
245 250 255
Val Tyr Ala Asp Ser Ile Glu Trp Met His Arg Asn Leu Asn Arg Arg
260 265 270
Asp Ser Ile Ile Leu Ser Leu His Pro His Asn Asp Arg Gly Thr Gly
275 280 285
Val Gly Ala Ala Glu Leu Gly Tyr Met Ala Gly Ala Asp Arg Ile Glu
290 295 300
Gly Cys Leu Phe Gly Asn Gly Glu Arg Thr Gly Asn Val Cys Leu Val
305 310 315 320
Thr Leu Ala Leu Asn Met Leu Thr Gln Gly Val Asp Pro Gln Leu Asp
325 330 335
Phe Thr Asp Ile Arg Gln Ile Arg Ser Thr Val Glu Tyr Cys Asn Gln
340 345 350
Leu Arg Val Pro Glu Arg His Pro Tyr Gly Gly Asp Leu Val Phe Thr
355 360 365
Ala Phe Ser Gly Ser His Gln Asp Ala Val Asn Lys Gly Leu Asp Ala
370 375 380
Met Ala Ala Lys Val Gln Pro Gly Ala Ser Ser Thr Glu Val Ser Trp
385 390 395 400
Glu Gln Leu Arg Asp Thr Glu Trp Glu Val Pro Tyr Leu Pro Ile Asp
405 410 415
Pro Lys Asp Val Gly Arg Asp Tyr Glu Ala Val Ile Arg Val Asn Ser
420 425 430
Gln Ser Gly Lys Gly Gly Val Ala Tyr Ile Met Lys Thr Asp His Gly
435 440 445
Leu Gln Ile Pro Arg Ser Met Gln Val Glu Phe Ser Thr Val Val Gln
450 455 460
Asn Val Thr Asp Ala Glu Gly Gly Glu Val Asn Ser Lys Ala Met Trp
465 470 475 480
Asp Ile Phe Ala Thr Glu Tyr Leu Glu Arg Thr Ala Pro Val Glu Gln
485 490 495
Ile Ala Leu Arg Val Glu Asn Ala Gln Thr Glu Asn Glu Asp Ala Ser
500 505 510
Ile Thr Ala Glu Leu Ile His Asn Gly Lys Asp Val Thr Val Asp Gly
515 520 525
Arg Gly Asn Gly Pro Leu Ala Ala Tyr Ala Asn Ala Leu Glu Lys Leu
530 535 540
Gly Ile Asp Val Glu Ile Gln Glu Tyr Asn Gln His Ala His Thr Ser
545 550 555 560
Asp Asp Asp Ala Glu Ala Ala Ala Tyr Val Leu Ala Glu Val Asn Gly
565 570 575
Arg Lys Val Trp Gly Val Gly Ile Ala Gly Ser Ile Thr Tyr Ala Ser
580 585 590
Leu Lys Ala Val Thr Ser Ala Val Asn Arg Ala Leu Asp Val Asn His
595 600 605
Glu Ala Val Leu Ala Gly Gly Val
610 615
<210> 47
<211> 1851
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> leuA_P247C, R558H, G561D
<400> 47
atgtctccta acgatgcatt catctccgca cctgccaaga tcgaaacccc agttgggcct 60
cgcaacgaag gccagccagc atggaataag cagcgtggct cctcaatgcc agttaaccgc 120
tacatgcctt tcgaggttga ggtagaagat atttctctgc cggaccgcac ttggccagat 180
aaaaaaatca ccgttgcacc tcagtggtgt gctgttgacc tgcgtgacgg caaccaggct 240
ctgattgatc cgatgtctcc tgagcgtaag cgccgcatgt ttgagctgct ggttcagatg 300
ggcttcaaag aaatcgaggt cggtttccct tcagcttccc agactgattt tgatttcgtt 360
cgtgagatca tcgaaaaggg catgatccct gacgatgtca ccattcaggt tctggttcag 420
gctcgtgagc acctgattcg ccgtactttt gaagcttgcg aaggcgcaaa aaacgttatc 480
gtgcacttct acaactccac ctccatcctg cagcgcaacg tggtgttccg catggacaag 540
gtgcaggtga agaagctggc taccgatgcc gctgaactaa tcaagaccat cgctcaggat 600
tacccagaca ccaactggcg ctggcagtac tcccctgagt ccttcaccgg cactgaggtt 660
gagtacgcca aggaagttgt ggacgcagtt gttgaggtca tggatccaac tcctgagaac 720
ccaatgatca tcaacctgtg ttccaccgtt gagatgatca cccctaacgt ttacgcagac 780
tccattgaat ggatgcaccg caatctaaac cgtcgtgatt ccattatcct gtccctgcac 840
ccgcacaatg accgtggcac cggcgttggc gcagctgagc tgggctacat ggctggcgct 900
gaccgcatcg aaggctgcct gttcggcaac ggcgagcgca ccggcaacgt ctgcctggtc 960
accctggcac tgaacatgct gacccagggc gttgaccctc agctggactt caccgatata 1020
cgccagatcc gcagcaccgt tgaatactgc aaccagctgc gcgttcctga gcgccaccca 1080
tacggcggtg acctggtctt caccgctttc tccggttccc accaggacgc tgtgaacaag 1140
ggtctggacg ccatggctgc caaggttcag ccaggtgcta gctccactga agtttcttgg 1200
gagcagctgc gcgacaccga atgggaggtt ccttacctgc ctatcgatcc aaaggatgtc 1260
ggtcgcgact acgaggctgt tatccgcgtg aactcccagt ccggcaaggg cggcgttgct 1320
tacatcatga agaccgatca cggtctgcag atccctcgct ccatgcaggt tgagttctcc 1380
accgttgtcc agaacgtcac cgacgctgag ggcggcgagg tcaactccaa ggcaatgtgg 1440
gatatcttcg ccaccgagta cctggagcgc accgcaccag ttgagcagat cgcgctgcgc 1500
gtcgagaacg ctcagaccga aaacgaggat gcatccatca ccgccgagct catccacaac 1560
ggcaaggacg tcaccgtcga tggccgcggc aacggcccac tggccgctta cgccaacgcg 1620
ctggagaagc tgggcatcga cgttgagatc caggaataca accagcacgc ccacacctcg 1680
gatgacgatg cagaagcagc cgcctacgtg ctggctgagg tcaacggccg caaggtctgg 1740
ggcgtcggca tcgctggctc catcacctac gcttcgctga aggcagtgac ctccgccgta 1800
aaccgcgcgc tggacgtcaa ccacgaggca gtcctggctg gcggcgttta a 1851
<---
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен полипептид, вовлеченный в продуцирование аминокислоты с разветвленной цепью, где аминокислота, соответствующая положению 182 относительно N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на аланин (Ala). Также предложены полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид, вектор экспрессии, содержащий указанный полинуклеотид, микроорганизм Corynebacterium glutamicum для продуцирования аминокислоты с разветвленной цепью, содержащий одно или более из указанных полипептида, полинуклеотида и вектора. Также предложен способ получения аминокислоты с разветвленной цепью с использованием указанного микроорганизма. Изобретение позволяет получить аминокислоту с разветвленной цепью с высоким выходом. 5 н. и 6 з.п. ф-лы, 19 табл., 6 пр.
1. Полипептид, вовлеченный в продуцирование аминокислоты с разветвленной цепью, где аминокислота, соответствующая положению 182 относительно N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на аланин (Ala).
2. Полипептид по п. 1, где полипептид имеет 99% или более чем 99% гомологии или идентичности с SEQ ID NO: 5.
3. Полипептид по п. 1, обладающий ослабленной активностью по сравнению с префенатдегидратазой с SEQ ID NO: 1.
4. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пп. 1-3.
5. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п. 4.
6. Микроорганизм рода Corynebacterium для продуцирования аминокислоты с разветвленной цепью, содержащий одно или более из полипептида по любому из пп. 1-3, полинуклеотида, кодирующего данный полипептид, и вектора, включающего данный полинуклеотид.
7. Микроорганизм по п. 6, представляющий собой Corynebacterium glutamicum.
8. Микроорганизм по п. 6, где аминокислота с разветвленной цепью выбрана из L-лейцина, L-изолейцина и L-валина.
9. Способ получения аминокислоты с разветвленной цепью, включающий стадию культивирования микроорганизма по п. 6 в среде.
10. Способ по п. 9, дополнительно включающий стадию выделения аминокислоты с разветвленной цепью из микроорганизма или из среды.
11. Способ по п. 9, где аминокислота с разветвленной цепью выбрана из L-лейцина, L-изолейцина и L-валина.
| База данных UniProtKB, P10341 - PHEA_CORGL, 11.07.2002 | |||
| Prephenate dehydratase | |||
| Термос с дополнительным подогревом | 1928 |
|
SU10341A1 |
| NELMS J | |||
| et al | |||
| Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы | 1923 |
|
SU12A1 |
