ФИКСИРУЮЩИЙ РАСТВОР И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗЦА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ Российский патент 2023 года по МПК G01N1/28 G01N1/30 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к фиксирующему раствору для гистологической фиксации биологических образцов и к способу получения биологических образцов для исследования, например, с помощью микроскопии.

Предшествующий уровень техники

Изобретение, в частности, но не исключительно, относится к фиксирующему раствору, подходящему для фиксации живых организмов, в частности паразитологических образцов, таких как, например, яйца гельминтов или лямблия кишечная.

Для подобных вариантов применения фиксирующий раствор требуется для уничтожения организма (который может быть патогенным) и для сохранения его клеточной структуры, чтобы затем его можно было исследовать микроскопически, обычно после окрашивания краской, такой как трипановый синий, раствор Люголя или, например, с помощью трихромного окрашивания. На микроскопический вид образца после окрашивания влияет фиксирующий раствор, но трудно или невозможно предсказать влияние данного состава фиксатора на окрашивающие свойства.

В фиксирующем растворе (например, в водном растворе в виде формалина) широко используется формальдегид, но он является токсичным, канцерогенным и обычно опасным для окружающей среды.

Используют другие фиксаторы, но во многих случаях они также опасны.

Совсем недавно были разработаны неопасные фиксаторы, например, раскрытые в GB 2528426A (Reardon) и WO 92/19951A (Streck Lab), но остается потребность в фиксирующем растворе, который будет надежно убивать паразитические организмы, такие как гельминты, которые имея прочный внешний слой, обладают высокой устойчивостью к проникновению фиксатора. Если исключить высокотоксичные химические вещества, такие как формальдегид, трудно добиться гибели клеток за короткое время.

Вследствие этого, целью настоящего изобретения является предоставление относительно неопасного фиксатора, который в частности подходит для гистологической фиксации паразитологических образцов.

Дополнительной целью изобретения является предоставление фиксатора и способа получения биологических образцов, которые приводят к хорошим окрашивающим свойствам.

Сущность изобретения

Соответственно, в изобретении представлен водный фиксирующий раствор для биологических образцов, содержащий:

a) C₂-C₆ карбоновую кислоту в концентрации 0,5 M или более,

b) C₂-C₆ соль карбоновой кислоты или галогенидную соль в концентрации 0,02 M или более, предпочтительно 0,04 M или более.

Необязательно, указанной C₂-C₆ карбоновой кислотой является уксусная кислота.

Необязательно, концентрация C₂-C₆ карбоновой кислоты составляет 0,9 M или более, более предпочтительно 1,3 M или более. Необязательно, концентрация C₂-C₆ карбоновой кислоты составляет не более 3,5 M.

Обнаружено, что подобные концентрации карбоновой кислоты (особенно уксусной кислоты) приводят к быстрой гибели биологических организмов, таких как яйца гельминтов, например, без необходимости в токсичной добавке, такой как формальдегид.

В необязательном, но предпочтительном варианте осуществления концентрация уксусной кислоты составляет менее 10% мас/об. Концентрацию ниже этого предела классифицируют как некоррозионную.

Соль карбоновой кислоты или галогенидная соль компонента b) может, например, представлять собой соль щелочного или щелочноземельного металла или аммония, другого катиона, который придает приемлемую растворимость.

Необязательно, компонентом b) является галогенидная соль кальция или магния.

Более предпочтительно, компонент b) содержит хлорид кальция в концентрации по меньшей мере 0,06 M, предпочтительно по меньшей мере 0,08 M, предпочтительно по меньшей мере 0,1 M и/или бромид кальция в концентрации по меньшей мере 0,06 M, предпочтительно по меньшей мере 0,08 M, предпочтительно по меньшей мере 0,1 M.

Обнаружено, что подобные галогенидные соли помогают сохранять клеточную структуру, возможно осморегулирующий эффект с участием галогенидных солей, противодействующий тургорному эффекту карбоновой кислоты.

Необязательно, фиксатор дополнительно содержит: c) бензойную кислоту или сорбиновую кислоту или их соли в бактериостатической или фунгистатической концентрации.

Необязательно, компонент c) представляет собой соль бензойной кислоты в концентрации по меньшей мере 5 мМ, более предпочтительно по меньшей мере 10 мМ.

Компонент c) согласно определению выше может способствовать предохранению образца от распада.

Необязательно, фиксатор дополнительно содержит: d) биоцидный эфирный масляный компонент в концентрации по меньшей мере 50 мкг/мл.

Биоцидное эфирное масло может быть, например, бактериостатическим или бактерицидным или фунгистатическим или фунгицидным.

Необязательно, указанный биоцидный эфирный масляный компонент d) представляет собой одно или несколько из: ментола, тимола, пулегола, дигидрокарвеола, пиперитола, ментона, ментена, o-цимена, p-цимена, цитронеллаля, карвакрола, эвгенола, 4-карво-ментола (термпинен-4-ола), аллицина или камфоры. Необязательно, эфирный масляный компонент представлен в своей природной стереоизомерной или энантиомерной форме.

Желательно, чтобы указанный биоцидный эфирный масляный компонент d) содержал ментол и тимол.

Обнаружено, что подобные эфирные масла облегчают гибель клеток и, таким образом, сокращают время, необходимое для фиксации.

В предпочтительных, но необязательных вариантах осуществления:

i) указанным компонентом карбоновой кислоты a) является уксусная кислота в концентрации 0,8-1,75 M,

ii) указанным компонентом галогенидной соли b) является хлорид кальция в концентрации 70-100 мМ плюс бромид кальция в концентрации 30-50 мМ, а

iii) указанным компонентом соли бензойной кислоты d) является бензоат в концентрации 5-15 мМ.

В особенно предпочтительных, но все же необязательных вариантах осуществления:

i) указанным компонентом карбоновой кислоты a) является уксусная кислота в концентрации 1,2-1,75 M,

ii) указанным компонентом галогенидной соли b) является хлорид кальция в концентрации 70-100 мМ плюс бромид кальция в концентрации 30-50 мМ, а

iii) указанным компонентом соли бензойной кислоты d) является бензоат в концентрации 5-15 мМ.

Приведенные выше варианты осуществления преимущественно могут приводить к особенно хорошим окрашивающим свойствам.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления:

i) указанным компонентом карбоновой кислоты a) является уксусная кислота в концентрации 0,8-1,75 M,

ii) указанным компонентом галогенидной соли b) является хлорид кальция и/или бромид кальция в суммарной концентрации 1,0-4,5 M, а

iii) указанным компонентом соли бензойной кислоты d) является бензоат в концентрации 5-125 мМ.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления компонент b) представляет собой галогенидную соль в концентрации 0,3-6 M, предпочтительно 1-5 M, наиболее предпочтительно 1-4 M.

Обнаружено, что подобные варианты осуществления подходят для использования в качестве флотационного раствора, имеющего плотность, достаточно большую для плавания цист или яиц, или других интересующих организмов, тем самым облегчая их разделение и идентификацию.

В подобных вариантах осуществления фиксатор необязательно содержит неполярное растворенное вещество, которое увеличивает плотность фиксирующего раствора до более 1,1 г/мл, предпочтительно более 1,2 г/мл, наиболее предпочтительно 1,2-1,4 г/мл. В одном из вариантов осуществления, плотность водного фиксирующего раствора является достаточной для плавания яиц или личинок, или цист, или ооцист в паразитологическом образце и предпочтительно находится в диапазоне 1,2-1,4 г/мл, более предпочтительно 1,25-1,35 г/мл.

Предпочтительно неполярное растворенное вещество представляет собой растворимый углевод, предпочтительно сахар, предпочтительно сахарозу или глюкозу, или фруктозу, или мальтозу, или любую их комбинацию.

В дополнительном аспекте изобретения, которому требуется защита, представлен способ получения биологического образца для исследования, включающий фиксацию образца водным фиксирующим раствором согласно определению выше.

Необязательно, биологический образец представляет собой живой организм. Необязательно, биологический образец представляет собой паразитологический образец.

В предпочтительном варианте осуществления биологический образец окрашивают после фиксации, например, азокрасителем, или иодом, или трихромным красителем. Также можно использовать другие красители.

Другие предпочтительные признаки определены в формуле изобретения.

В рамках данной заявки явно подразумевается, что различные аспекты, варианты осуществления, примеры и альтернативы, изложенные в предыдущих абзацах, в формуле изобретения и/или в следующем описании, и, в частности, их индивидуальные признаки, могут быть взяты независимо или в любой комбинации. То есть все варианты осуществления и/или признаки любого варианта осуществления или примера могут быть объединены любым подходящим способом и/или в любой комбинации, если такие признаки не являются несовместимыми. Заявитель оставляет за собой право изменить любой первоначально поданный пункт формулы изобретения или подать любой новый пункт, соответственно, включая право изменить любой первоначально поданный пункт, чтобы он зависел и/или включал любой признак любого другого пункта, хотя и не заявленного изначально таким образом.

Подробное описание изобретения

Было проведено исследование для проверки эффективности ряда составов фиксатора согласно изобретению, чтобы определить как их эффективность для разрушения клетки (то есть сделать инертной с точки зрения инфекционности), так и для сохранения клеточной морфологии в течение продолжительного периода времени.

Для достижения этого использовали три типа окраски, а именно:

1. Окрашивание раствором Люголя - для определения морфологии.

2. Окрашивание трипановым синим - для определения жизнеспособности.

3. Трихромное окрашивание - широко используемая лабораторная процедура.

Сначала все вещества протестировали с использованием живого образца лямблии кишечной, которая представляет собой жгутиковый простейший паразит, широко распространенный по всему миру. Его обильные количества и хрупкие внутренние структуры делают его подходящим кандидатом для тестирования. Образцы Триchuris suis (власоглав) также протестировали с помощью наиболее подходящего состава (Пример 8), главным образом, чтобы увидеть, способен ли фиксатор разрушать обычные яйца гельминтов за приемлемое время.

ПРИМЕР 1

Получили 200 мл фиксатора следующего состава:

• 185 мл дистиллированной воды

• 15 мл ледяной уксусной кислоты (7,5% раствор - 1,3 M)

• 0,06 г бензоата натрия - 2 мМ

• 2,22 г хлорида кальция - 100 мМ

ПРИМЕР 2

Получили 200 мл фиксатора следующего состава:

• 181 мл дистиллированной воды

• 19 мл ледяной уксусной кислоты (9,5% раствор - 1,65 M)

• 0,36 г бензоата натрия - 12 мМ

• 3,00 г хлорида кальция - 100 мМ

• 4,72 г бромида кальция

ПРИМЕР 3

Получили 200 мл фиксатора следующего состава:

• 181 мл дистиллированной воды

• 19 мл ледяной уксусной кислоты (9,5% раствор - 1,65 M)

• 0,36 г бензоата натрия - 12 мМ

• 1,8 г хлорида кальция - 0,9%

• 1,8 г бромида кальция - 0,9%

ПРИМЕР 4

Получили 200 мл фиксатора следующего состава:

• 190 мл дистиллированной воды

• 10 мл ледяной уксусной кислоты (5% раствор - 0,87 M)

• 0,36 г бензоата натрия - 12 мМ

• 1,8 г хлорида кальция - 0,9%

• 1,8 г бромида кальция - 0,9%

ПРИМЕР 5

Получили 200 мл фиксатора следующего состава:

• 181 мл дистиллированной воды

• 19 мл ледяной уксусной кислоты (9,5% раствор - 1,65 M)

• 0,36 г бензоата натрия - 12 мМ

• 1,8 г хлорида кальция - 0,9%

• 1,8 г бромида кальция - 0,9%

• 0,04 г кристаллов ментола - 200 мкг/мл (приблизительно половина максимальной растворимости)

• 0,125 г тимола - 625 мкг/мл (приблизительно 70% максимальной растворимости)

ПРИМЕР 6

Получили 200 мл фиксатора следующего состава:

• 181 мл дистиллированной воды

• 19 мл ледяной уксусной кислоты (9,5% раствор - 1,65 M)

• 0,36 г бензоата натрия - 12 мМ

• 1,8 г хлорида кальция - 0,9%

• 1,8 г бромида кальция - 0,9%

• 0,02 г кристаллов ментола - 100 мкг/мл (приблизительно четверть максимальной растворимости)

• 0,07 г тимола - 350 мкг/мл (приблизительно 39% максимальной растворимости)

ПРИМЕР 7

Получили 200 мл фиксатора следующего состава:

• 190 мл дистиллированной воды

• 10 мл ледяной уксусной кислоты (5% раствор - 0,87 M)

• 0,36 г бензоата натрия - 12 мМ

• 1,8 г хлорида кальция - 0,9%

• 1,8 г бромида кальция - 0,9%

• 0,02 г кристаллов ментола - 100 мкг/мл (приблизительно четверть максимальной растворимости)

• 0,07 г тимола - 350 мкг/мл (приблизительно 39% максимальной растворимости)

ПРИМЕР 8

Получили 200 мл фиксатора следующего состава:

• 185 мл дистиллированной воды

• 15 мл ледяной уксусной кислоты (7,5% раствор - 1,3 M)

• 0,36 г бензоата натрия - 12 мМ

• 1,8 г хлорида кальция - 0,9%

• 1,8 г бромида кальция - 0,9%

• 0,02 г кристаллов ментола - 100 мкг/мл (приблизительно четверть максимальной растворимости)

• 0,07 г тимола - 350 мкг/мл (приблизительно 39% максимальной растворимости)

ПРИМЕР 9

Получили 200 мл фиксатора следующего состава:

• 185 мл дистиллированной воды

• 15 мл ледяной уксусной кислоты (7,5% раствор - 1,3 M)

• 0,36 г бензоата натрия - 12 мМ

• 1,8 г хлорида кальция - 0,9%

• 1,8 г бромида кальция - 0,9%

• 0,04 г кристаллов ментола - 200 мкг/мл (приблизительно четверть максимальной растворимости)

ПРИМЕР 10

Получили 200 мл фиксатора следующего состава:

• 185 мл дистиллированной воды

• 15 мл ледяной уксусной кислоты (7,5% раствор - 1,3 M)

• 0,36 г бензоата натрия - 12 мМ

• 1,8 г хлорида кальция - 0,9%

• 1,8 г бромида кальция - 0,9%

• 0,07 г тимола - 350 мкг/мл (приблизительно 39% максимальной растворимости)

ПРИМЕР 11

Получили 200 мл фиксатора следующего состава:

• 185 мл дистиллированной воды

• 15 мл ледяной уксусной кислоты (7,5% раствор - 1,3 M)

• 0,36 г бензоата натрия - 12 мМ

• 1,8 г хлорида кальция - 0,9%

• 1,8 г бромида кальция - 0,9%

• 0,2 мл Triton X-100 - 0,001%

(Использование поверхностно-активного вещества Triton® отвергает использование ELISA).

ПРИМЕР 12

Образцы живой гиардии получили и проверили на морфологию, чтобы обеспечить правильную клеточную структуру и так далее.

В каждый из тестовых растворов (3,3 мл), содержащихся в концентраторе фекальных паразитов Mini Parasep SF®, вводили по 200 мкл живой гиардии.

Это было выполнено в двух повторениях с:

a. одним образцом, содержащим только фиксатор (Образец 1); и

b. одним образцом, содержащим фиксатор, смешанный с соответствующим образцом необработанных фекалий (Образец 2).

Непосредственно за этим проводили центрифугирование при 400 g в течение 2 минут. Затем со дна каждой центрифужной пробирки брали 15 мкл образца, которые помещали на предметное стекло микроскопа с добавлением 15 мкл красителя трипанового синего. Поскольку основной причиной этого шага была жизнеспособность цист, каждый образец центрифугировали сразу после добавления живой гиардии и помещали прямо после центрифугирования.

Образцы оставляли на период 24 часа, а затем 15 мкл брали для проверки морфологии раствором Люголя и трипановым синим из образца 1.

Образцы оставляли на период 48 часов, а затем 15 мкл снова брали для проверки морфологии раствором Люголя из образца 1.

Образцы оставляли на период 5 дней, а затем 15 мкл снова брали для проверки морфологии раствором Люголя из обоих образцов.

Для всех образцов, которые продемонстрировали хорошую морфологию проводили трихромное окрашивание, причем образцы брали из образца 1.

Дополнительное тестирование морфологии проводили для всех образцов, которые прошли эту точку после периода в 2 месяца.

результаты для составов приведенных выше примеров показаны в таблице 1.0 ниже вместе со сравнительными результатами для 10% формалина, коммерчески доступных фиксаторов SAF (на основе формальдегида, содержащих метанол, а также ≤ 2% уксусную кислоту), Alcorfix (содержащего метанол, этанол, изопропанол, сульфат цинка и 4,8% уксусную кислоту), PVA (содержащего метанол, этанол и сульфат цинка) и Safefix (содержащего 1-(цис-3-хлораллил)-3,5,7-триаза-1-азониадамантан хлорид), а также дистиллированной воды, в качестве контроля.

ТАБЛИЦА 1.0

Фиксатор Жизнеспособность клеток через 2 мин
(трипановый синий) Жизнеспособность клеток через 24 часа
(трипановый синий) Клеточная структура через 24 часа
(раствор Люголя) Клеточная структура через 48 часов
(раствор Люголя) Клеточная структура через 1 неделю
(раствор Люголя) Клеточная структура через 1 неделю
(трихромное окрашивание) Клеточная структура через 2 месяца
(раствор Люголя) 10% Формалин Прозрачный (перекрестное связывание - тест недействителен) Хорошая структура Прекрасная структура Хорошая структура Хорошая четкость Хорошая структура SAF Прозрачный (перекрестное связывание - тест недействителен) Прекрасная структура Прекрасная структура Прекрасная структура Приемлемая четкость Допустимая структура Alcorfix Минимально синего в клеточной стенке (начало гибели клеток) Проникновение темно синего (гибель клетки) Прекрасная структура Прекрасная структура Прекрасная структура Хорошая четкость Прекрасная структура PVA Прозрачный (Клетка жизнеспособна) Проникновение темно синего (гибель клетки) Прекрасная структура Хорошая структура Прекрасная структура Хорошая четкость Прекрасная структура SafeFix Прозрачный (Клетка жизнеспособна) Прозрачный (Клетка выглядит жизнеспособной) Допустимая структура Прекрасная структура Хорошая структура Слабая структура Дистиллированная вода Прозрачный (Клетка жизнеспособна) Прозрачный (Клетка жизнеспособна) Прекрасная структура Допустимая структура Слабая структура Слабая четкость Слабая/полный распад клетки Пример 1 Темно синий в клеточной стенке (гибель клетки) Темно синий в клеточной стенке и светло синяя цитоплазма (гибель клетки) Прекрасная структура Прекрасная структура Прекрасная структура Хорошая четкость Хорошая структура Пример 2 Темно синий в клеточной стенке (гибель клетки) Темно синий в клеточной стенке и светло синяя цитоплазма (гибель клетки) Прекрасная структура Прекрасная структура Прекрасная структура Приемлемая четкость Прекрасная структура Пример 3 Темно синий в клеточной стенке (гибель клетки) Темно синий в клеточной стенке и светло синяя цитоплазма (гибель клетки) Прекрасная структура Прекрасная структура Прекрасная структура Приемлемая четкость Хорошая структура Пример 4 Темно синий в клеточной стенке (гибель клетки) Темно синий в клеточной стенке и светло синяя цитоплазма (гибель клетки) Прекрасная структура Прекрасная структура Прекрасная структура Слабая четкость Прекрасная структура Пример 5 Темно синий в клеточной стенке (гибель клетки) Темно синий в клеточной стенке и темно синяя цитоплазма (гибель клетки) Прекрасная структура Прекрасная структура Прекрасная структура Приемлемая четкость Прекрасная структура Пример 6 Темно синий в клеточной стенке (гибель клетки) Темно синий в клеточной стенке и светло синяя цитоплазма (гибель клетки) Прекрасная структура Прекрасная структура Прекрасная структура Приемлемая четкость Прекрасная структура Пример 7 Темно синий в клеточной стенке (гибель клетки) Темно синий в клеточной стенке и светло синяя цитоплазма (гибель клетки) Прекрасная структура Прекрасная структура Прекрасная структура Хорошая четкость Хорошая структура Пример 8 Темно синий в клеточной стенке (гибель клетки) Темно синий в клеточной стенке и светло синяя цитоплазма (гибель клетки) Прекрасная структура Прекрасная структура Прекрасная структура Прекрасная четкость Прекрасная структура Пример 9 Темно синий в клеточной стенке (гибель клетки) Темно синий в клеточной стенке и светло синяя цитоплазма (гибель клетки) Прекрасная структура Прекрасная структура Прекрасная структура Хорошая четкость Хорошая структура Пример 10 Темно синий в клеточной стенке (гибель клетки) Темно синий в клеточной стенке и светло синяя цитоплазма (гибель клетки) Прекрасная структура Прекрасная структура Прекрасная структура Хорошая четкость Хорошая структура Пример 11 Темно синий в клеточной стенке (гибель клетки) Темно синий в клеточной стенке и темно синяя цитоплазма похожая на Alcorfix (гибель клетки) Прекрасная структура Допустимая структура Прекрасная структура Слабая четкость

Фиксаторы примеров 5-11 показали особенно хорошие результаты, состав Примера 8 в настоящее время считается наилучшим.

Предпочтительный водный фиксирующий раствор согласно настоящему изобретению можно использовать, например, с концентраторами фекальных паразитов.

Подобные устройства присутствуют на рынке, например, как устройства Parasep® или ParaPRO® или устройства, показанные, например, в WO2017/187165A на имя авторов настоящей заявки.

В подобных устройствах обычно используют смесительную камеру и приемную камеру, разделенные фильтром.

При использовании фиксирующий раствор и фекальный образец вводят в смесительную камеру и взбалтывают в контакте для разжижения образца. Затем разжиженный образец фильтруют, а фильтрат (содержащий, например, яйца и цисты, которые проходят через фильтр) собирают в приемной камере.

Фиксирующий раствор обеспечивает, что фильтрат не является биологически опасным. Затем фильтрат можно исследовать под микроскопом для идентификации, например, яиц и цист.

Например, можно использовать устройство Mini Parasep®, которое обычно будет содержать 3,3 мл фиксирующего раствора внутри пробирки для смешивания. 0,5-1,0 г образца фекалий добавляют в пробирку для смешивания перед закупориванием пробирки вертикальным фильтром, прикрепленным к центрифужной пробирке. Затем образец встряхивают, переворачивают и обычно центрифугируют в течение 2 минут при 400 g (в зависимости от варианта фильтра). Затем фильтр и пробирку для смешивания можно удалить, а образец взять из осадка, находящегося на дне центрифужной пробирки. Затем его помещают на предметное стекло микроскопа, где перед исследованием образца на наличие паразитических организмов можно добавить краситель.

В некоторых случаях нужно, чтобы в фиксирующем растворе плавали яйца и цисты, чтобы их можно было более легко идентифицировать и выделить из раствора. Подобные растворы известны как флотационные растворы.

Подобные флотационные растворы, например, можно использовать в устройстве Mini Parasep® следующим образом:

образец фекалий 0,5-1,0 г добавляют в пробирку для смешивания перед закупориванием пробирки вертикальным фильтром, прикрепленным к центрифужной пробирке. Затем образец встряхивают, переворачивают и сжимают руками, чтобы создать в сосуде давление, что способствует фильтрации образца. Раствор оставляют на 3 минуты, прежде чем использовать инокуляционную петлю для удаления слоя из верхней части жидкости (которая будет содержать большую часть яиц и цист паразитов, если таковые имеются). Затем его помещают на предметное стекло микроскопа, где перед исследованием образца на наличие паразитических организмов можно добавить краситель.

Следующие примеры относятся к составам флотационных растворов, объемы фиксатора являются приблизительными, тогда как массы и (в случае ледяной уксусной кислоты) объем компонентов являются точными. Значения удельного веса (плотность по сравнению с чистой водой) также являются точными.

Серию фиксирующих растворов с высоким удельным весом получали следующим образом.

ПРИМЕР 13

Получали приблизительно 500 мл фиксатора следующего состава:

• 231,25 мл деионизированной воды

• 250 г тростникового сахара

• 18,75 мл ледяной уксусной кислоты (раствор 3,75 о/о% - 0,66 M)

• 0,45 г бензоата натрия - 0,09% (6,25 мМ)

• 2,25 г хлорида кальция - 0,45% (0,041 М)

• 2,25 г гидрата бромида кальция - 0,41% (0,021 М)

• 0,025 г ментола - 0,005%

• 0,0875 г тимола - 0,0175%

удельный вес полученного фиксатора составлял 1,265.

Этот состав был одним из наиболее эффективных составов высокой плотности в примерах 13-28. В варианте этого состава (Пример 28) использовали более высокую долю тростникового сахара, чтобы повысить удельный вес фиксирующего раствора приблизительно до 1,29.

ПРИМЕР 14

Получали приблизительно 500 мл фиксатора следующего состава:

• 231,25 мл деионизированной воды

• 250 г тростникового сахара

• 18,75 мл ледяной уксусной кислоты (раствор 3,75 о/о% - 0,66 M)

• 1,8 г бензоата натрия - 0,36% (25 мМ)

• 40 г хлорида кальция - 8,0% (0,72 M)

• 2,25 г гидрата бромида кальция - 0,41% (0,021 М)

• 0,025 г ментола - 0,005%

• 0,0875 г тимола - 0,0175%

удельный вес полученного фиксатора составлял 1,245.

ПРИМЕР 15

Получали приблизительно 500 мл фиксатора следующего состава:

• 231,25 мл деионизированной воды

• 230 г тростникового сахара

• 18,75 мл ледяной уксусной кислоты (раствор 3,75 о/о% - 0,66 M)

• 0,5 г бензоата натрия - 0,10% (6,9 мМ)

• 60 г хлорида кальция - 12,0% (1,08 M)

• 2,25 г гидрата бромида кальция - 0,41% (0,021 М)

• 0,025 г ментола - 0,005%

• 0,0875 г тимола - 0,0175%

удельный вес полученного фиксатора составлял 1,272

ПРИМЕР 16

Получали приблизительно 500 мл фиксатора следующего состава:

• 231,25 мл деионизированной воды

• 200 г тростникового сахара

• 18,75 мл ледяной уксусной кислоты (раствор 3,75 о/о% - 0,66 M)

• 0,5 г бензоата натрия - 0,10% (6,9 мМ)

• 60 г хлорида кальция - 12,0% (1,08 M)

• 2,25 г гидрата бромида кальция - 0,41% (0,021 М)

• 0,025 г ментола - 0,005%

• 0,0875 г тимола - 0,0175%

удельный вес полученного фиксатора составлял 1,297.

ПРИМЕР 17

Получали приблизительно 500 мл фиксатора следующего состава:

• 231,25 мл деионизированной воды

• 180 г тростникового сахара

• 18,75 мл ледяной уксусной кислоты (раствор 3,75 о/о% - 0,66 M)

• 0,25 г бензоата натрия - 0,050% (3,5 мМ)

• 80 г хлорида кальция - 16,0% (1,44 M)

• 2,25 г гидрата бромида кальция - 0,41% (0,021 М)

• 0,025 г ментола - 0,005%

• 0,0875 г тимола - 0,0175%

удельный вес полученного фиксатора составлял 1,324.

ПРИМЕР 18

Получали приблизительно 850 мл фиксатора следующего состава:

• 462,5 мл деионизированной воды

• 200 г тростникового сахара

• 37,5 мл ледяной уксусной кислоты (раствор 4,4 о/о% - 0,66 M)

• 0,50 г бензоата натрия - 0,059% (3,5 мМ)

• 390 г дигидрата хлорида кальция - 34,7% (3,12 M)

• 4,5 г гидрата бромида кальция - 0,48% (0,024 M)

• 0,050 г ментола - 0,0059%

• 0,175 г тимола - 0,021%

удельный вес полученного фиксатора составлял 1,310.

ПРИМЕР 19

Получали приблизительно 400 мл фиксатора следующего состава:

• 231,25 мл деионизированной воды

• 50 г тростникового сахара

• 18,75 мл ледяной уксусной кислоты (раствор 4,7 о/о% - 0,82 M)

• 0,25 г бензоата натрия - 0,063% (4,33 мМ)

• 250 г дигидрата хлорида кальция - 47,1% (4,25 M)

• 2,25 г гидрата бромида кальция - 0,52% (0,026 M)

• 0,025 г ментола - 0,0063%

• 0,0875 г тимола - 0,022%

удельный вес полученного фиксатора составлял 1,360.

ПРИМЕР 20

Получали приблизительно 450 мл фиксатора следующего состава:

• 231,25 мл деионизированной воды

• 25 г тростникового сахара

• 21 мл ледяной уксусной кислоты (раствор 4,7 о/о% - 0,82 M)

• 0,25 г бензоата натрия - 0,055% (3,89 мМ)

• 250 г дигидрата хлорида кальция - 42,0% (3,78 M)

• 2,25 г гидрата бромида кальция - 0,46% (0,023 M)

• 0,025 г ментола - 0,0056%

• 0,0875 г тимола - 0,019%

удельный вес полученного фиксатора составлял 1,330.

ПРИМЕР 21

Получали приблизительно 850 мл фиксатора следующего состава:

• 462,5 мл деионизированной воды

• 360 г тростникового сахара

• 37,5 мл ледяной уксусной кислоты (раствор 4,4 о/о% - 0,77 M)

• 0,50 г бензоата натрия - 0,059% (4,08 мМ)

• 200 г дигидрата хлорида кальция - 17,8% (1,60 M)

• 4,5 г гидрата бромида кальция - 0,49% (0,024 M)

• 0,050 г ментола - 0,0059%

• 0,175 г тимола - 0,021%

удельный вес полученного фиксатора составлял 1,308.

ПРИМЕР 22

Получали приблизительно 950 мл фиксатора следующего состава:

• 550 мл деионизированной воды

• 360 г тростникового сахара

• 37,5 мл ледяной уксусной кислоты (раствор 3,9 о/о% - 0,69 M)

• 200 г дигидрата хлорида кальция - 15,9% (1,43 M)

• 4,5 г гидрата бромида кальция - 0,44% (0,022 M)

• 0,050 г ментола - 0,0053%

• 0,175 г тимола - 0,018%

удельный вес полученного фиксатора составлял 1,280.

ПРИМЕР 23

Получали приблизительно 820 мл фиксатора следующего состава:

• 500 мл деионизированной воды

• 280 г тростникового сахара

• 37,5 мл ледяной уксусной кислоты (4,5 о/о% раствор - 0,80 M)

• 200 г дигидрата хлорида кальция - 18,4% (1,66 M)

• 4,5 г гидрата бромида кальция - 0,51% (0,025 M)

• 0,050 г ментола - 0,0061%

• 0,175 г тимола - 0,021%

удельный вес полученного фиксатора составлял 1,270.

ПРИМЕР 24

Получали приблизительно 800 мл фиксатора следующего состава:

• 500 мл деионизированной воды

• 200 г тростникового сахара

• 37,5 мл ледяной уксусной кислоты (раствор 4,9 о/о% - 0,82 M)

• 240 г хлорида кальция - 30,9% (2,70 M)

• 4,5 г гидрата бромида кальция-0,52% (0,027 M)

• 0,050 г ментола - 0,0063%

• 0,175 г тимола - 0,022%

удельный вес полученного фиксатора составлял 1,330.

ПРИМЕР 25

Получали приблизительно 420 мл фиксатора следующего состава:

• 231,25 мл деионизированной воды

• 100 г тростникового сахара

• 18,75 мл ледяной уксусной кислоты (раствор 4,5 о/о% - 0,78 M)

• 0,45 г бензоата натрия - 0,11% (7,44 мМ)

• 15 г хлорида кальция - 3,57% (0,32 M)

• 2,25 г гидрата бромида кальция - 0,49% (0,025 M)

• 0,025 г ментола - 0,0059%

• 0,0875 г тимола - 0,021%

• 30 г лимонной кислоты - 7,1% (0,037 M)

удельный вес полученного фиксатора составлял 1,288.

ПРИМЕР 26

Получали приблизительно 400 мл фиксатора следующего состава:

• 250 мл деионизированной воды

• 100 г тростникового сахара

• 20,0 мл ледяной уксусной кислоты (раствор 5,0 о/о% - 0,87 M)

• 0,45 г бензоата натрия - 0,11% (7,44 мМ)

• 90 г хлорида кальция - 22,5% (2,03 M)

• 2,25 г гидрата бромида кальция - 0,52% (0,026 M)

• 0,025 г ментола - 0,0063%

• 0,0875 г тимола - 0,022%

• 60 г лимонной кислоты - 15,0% (0,78 M)

удельный вес полученного фиксатора составлял 1,296.

ПРИМЕР 27

Получали приблизительно 420 мл фиксатора следующего состава:

• 250 мл деионизированной воды

• 50 г тростникового сахара

• 20,0 мл ледяной уксусной кислоты (раствор 4,8 о/о% - 0,83 M)

• 0,45 г бензоата натрия - 0,11% (7,44 мМ)

• 200 г дигидрата хлорида кальция - 36,0% (3,24 M)

• 2,25 г гидрата бромида кальция - 0,49% (0,025 M)

• 0,025 г ментола - 0,0059%

• 0,0875 г тимола - 0,021%

• 60 г лимонной кислоты - 14,3% (0,74 M)

удельный вес полученного фиксатора составлял 1,337.

ПРИМЕР 28

Получали приблизительно 5100 мл фиксатора следующего состава:

• 2300 мл деионизированной воды

• 3750 г тростникового сахара

• 375 мл ледяной уксусной кислоты (раствор 7,4 о/о% - 1,3 M)

• 4,5 г бензоата натрия - 0,88% (6,1 мМ)

• 60 г хлорида кальция - 1,2% (0,11 М)

• 30 г гидрата бромида кальция - 0,59% (0,027 M)

• 0,25 г ментола - 0,049%

• 0,875 г тимола - 0,017%

удельный вес полученного фиксатора составлял приблизительно 1,29.

Наиболее предпочтительным является состав SG из примеров 14-28.

В примерах галогениды магния можно заменить на галогениды кальция.

Считается, что аналогичные результаты были бы получены, если бы концентрации уксусной кислоты в примерах колебались примерно на ± 0,3 М или более, и что приемлемые результаты были бы получены в более широких диапазонах, которые определены в формуле изобретения. Считается, что аналогичные результаты были бы получены, если бы концентрации остальных компонентов в примерах колебались по меньшей мере ± 10%, возможно, ± 20% или более от их заявленных значений, и что приемлемые результаты были бы получены в более широком диапазоне концентраций.

Обычно верхний предел концентрации галогенидной соли определяется только растворимостью каждой конкретной соли в фиксирующем растворе.

Изобретение относится к фиксирующему раствору для гистологической фиксации биологических образцов, в частности паразитологических образцов, и может быть использовано для их исследования, например, с помощью микроскопии. Водный фиксирующий раствор для биологических образцов содержит C2-C6 карбоновую кислоту в концентрации 0,9 M или более, щелочноземельную галогенидную соль в концентрации 0,02 M или более, и биоцидный эфирный масляный компонент в концентрации по меньшей мере 50 мкг/мл. Изобретение также относится к способу получения биологического образца для исследования, включающему фиксацию образца указанным водным фиксирующим раствором. Изобретение сокращает время, необходимое для фиксации, обеспечивает быструю гибель биологических организмов, таких как яйца гельминтов, без необходимости в токсичной добавке, такой как формальдегид, при сохранении клеточной структуры, а также приводит к хорошим окрашивающим свойствам. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 1 табл., 28 пр.

1. Водный фиксирующий раствор для биологических образцов, содержащий:

a) C₂-C₆ карбоновую кислоту в концентрации 0,9 M или более;

b) щелочноземельную галогенидную соль в концентрации 0,02 M или более; и

c) биоцидный эфирный масляный компонент в концентрации по меньшей мере 50 мкг/мл.

2. Водный фиксирующий раствор по п. 1, в котором указанной C₂-C₆ карбоновой кислотой является уксусная кислота, и/или в котором концентрация C₂-C₆ карбоновой кислоты составляет 1,3 M или более; и/или в котором указанной C₂-C₆ карбоновой кислотой является уксусная кислота, а концентрация уксусной кислоты составляет менее 10% мас./об.

3. Водный фиксирующий раствор по п. 1 или 2, в котором концентрация щелочноземельной галогенидной соли составляет 0,04 M или более; и/или компонент b) представляет собой галогенидную соль кальция или магния.

4. Водный фиксирующий раствор по п. 1, в котором компонент b) содержит хлорид кальция в концентрации по меньшей мере 0,06 M и/или бромид кальция в концентрации по меньшей мере 0,06 M.

5. Водный фиксирующий раствор по любому предыдущему пункту, дополнительно содержащий неполярное растворенное вещество, которое увеличивает плотность фиксирующего раствора до более 1,1 г/мл, предпочтительно более 1,2 г/мл, наиболее предпочтительно 1,2-1,4 г/мл.

6. Водный фиксирующий раствор по п. 5, в котором неполярное растворенное вещество представляет собой растворимый углевод, предпочтительно сахар, предпочтительно сахарозу или глюкозу, или фруктозу, или мальтозу, или любую их комбинацию.

7. Водный фиксирующий раствор по любому предыдущему пункту, в котором указанный биоцидный эфирный масляный компонент c) представляет собой одно или несколько из: ментола, тимола, пулегола, дигидрокарвеола, пиперитола, ментона, ментена, o-цимена, p-цимена, цитронеллаля, карвакрола, эвгенола, 4-карво-ментола (термпинен-4-ола), аллицина или камфоры; или

указанный биоцидный эфирный масляный компонент с) содержит ментол и тимол.

8. Водный фиксирующий раствор по любому предыдущему пункту, дополнительно содержащий:

d) бензойную кислоту или сорбиновую кислоту или их соли в бактериостатической или фунгистатической концентрации.

9. Водный фиксирующий раствор по п. 8, в котором компонентом d) является соль бензойной кислоты, и при этом

i) указанным компонентом карбоновой кислоты a) является уксусная кислота в концентрации 0.9-1,75 M,

ii) указанным компонентом щелочноземельной галогенидной соли b) является хлорид кальция в концентрации 70-100 мМ плюс бромид кальция в концентрации 30-50 мМ, и

iii) указанным компонентом соли бензойной кислоты d) является бензоат в концентрации 5-15 мМ.

10. Водный фиксирующий раствор по п. 8, в котором компонентом d) является соль бензойной кислоты, и при этом:

i) указанным компонентом карбоновой кислоты a) является уксусная кислота в концентрации 1,2-1,75 M;

ii) указанным компонентом щелочноземельной галогенидной соли b) является хлорид кальция в концентрации 70-100 мМ плюс бромид кальция в концентрации 30-50 мМ; и

iii) указанным компонентом соли бензойной кислоты d) является бензоат в концентрации 5-15 мМ.

11. Водный фиксирующий раствор по п. 8, в котором компонентом d) является соль бензойной кислоты, и при этом:

i) указанным компонентом карбоновой кислоты a) является уксусная кислота в концентрации 0.9-1,75 M,

ii) указанным компонентом галогенидной соли b) является хлорид кальция и/или бромид кальция в суммарной концентрации 1,0-4,5 M, и

iii) указанным компонентом соли бензойной кислоты d) является бензоат в концентрации 5-125 мМ.

12. Способ получения биологического образца для исследования, включающий фиксацию образца водным фиксирующим раствором по любому предыдущему пункту.

13. Способ по п. 12, в котором биологический образец представляет собой живой организм; и/или в котором биологический образец представляет собой паразитологический образец.

14. Способ по п. 13, в котором плотность водного фиксирующего раствора является достаточной для плавания яиц или личинок, или цист, или ооцист в паразитологическом образце и предпочтительно находится в диапазоне 1,2-1,4 г/мл, более предпочтительно 1,25-1,35 г/мл.

15. Способ по любому из пп. 12-14, в котором биологический образец окрашивают после фиксации; и/или в котором биологический образец после фиксации окрашивают азокрасителем, или иодом, или трихромным красителем.