Способ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у женщин с ожирением на основе генотипирования полиморфизма rs469994 (G>A) гена ZNRF3 Российский патент 2025 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у женщин с ожирением.

Сахарный диабет 2 типа и ожирение являются самыми распространенными нарушениями обмена веществ в мире [Czech M.P. Insulin action and resistance in obesity and type 2 diabetes. Nat Med. 2017 Jul 11; 23 (7): 804-814. doi: 10.1038/nm.4350]. Связь между эпидемиологией ожирения и сахарного диабета 2 типа с семидесятых годов XX века описывают термином “diabesity”, подчеркивая таким образом важное предикторное значение ожирения в развитии сахарного диабета 2 типа [Brunton S.A. Diabesity. Clin Diabetes. 2022 Fall; 40 (4): 392-393. doi: 10.2337/cd22-0088; Ng ACT, Delgado V, Borlaug BA, Bax JJ. Diabesity: the combined burden of obesity and diabetes on heart disease and the role of imaging. Nat Rev Cardiol. 2021 Apr; 18 (4): 291-304. doi: 10.1038/s41569-020-00465-5]. E3-убиквитинпротеинлигаза ZNRF3 катализирует убиквитинилирование с последующей деградацией компонентов Wnt-рецепторного комплекса, необходимого в том числе для поддержания пула бета-клеток поджелудочной железы. В этой связи представляет интерес полиморфный вариант rs469994 (G>A) гена ZNRF3, способный по данным ресурса GTEx Portal [https://gtexportal.org/home/] влиять на экспрессию генов в поджелудочной железе и других тканях, имеющих патогенетическое значение для развития сахарного диабета 2 типа.

Известен cпособ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа, по патенту на изобретение EA 030585 B1 (опубл. 31.08.2018), включающий следующие этапы: определяют у пациента клинико-анамнестические и лабораторные данные, представляющие собой индекс массы тела (ИМТ); окружность талии (ОТ); наличие артериальной гипертензии (АГ); наличие сахарного диабета у близких родственников; триглицериды (ТГ); холестерин высокой плотности (ХС ЛВП); систолическое артериальное давление (САД) и/или диастолическое артериальное давление (ДАД); уровень сахара в крови, полученные значения оценивают с использованием балльной шкалы: ИМТ<25 кг/м² - 0 баллов, 25-30 кг/м² - 1 балл, >30 кг/м² - 2 балла; ОТ у мужчин <94 см - 0 баллов, 94-102 см - 2 балла, >102 см - 3 балла; ОТ у женщин <80 см - 0 баллов, 80-88 см - 2 балла, >88 см - 3 балла; наличие АГ: нет - 0 баллов, да - 1 балл; наличие сахарного диабета у близких родственников: нет 0 баллов, да - 2 балла; выявление ТГ>1,7 ммоль/л: нет - 0 баллов, да - 1 балл; выявление ХС ЛВП>1,0 ммоль/л: нет - 1 балл, да - 0 баллов; показания САД>140 мм рт.ст. и/или ДАД>90 мм рт.ст.: нет - 0 баллов, да - 1 балл; уровень сахара в крови >5,6 ммоль/л: нет - 0 баллов, да - 3 балла, суммируют полученные баллы и при сумме баллов <8 прогнозируют низкий, а при сумме баллов >8 - высокий риск развития СД 2 типа у пациента в течение ближайших 10 лет.

Недостаток метода заключается в том, что он не учитывает индивидуальную генетическую предрасположенность к заболеванию и имеет ограничение прогноза риска развития сахарного диабета 2 типа во времени.

Известен способ прогнозирования развития сахарного диабета 2 типа у лиц, проживающих в Башкортостане (патент на изобретение RU 2688208 C1, опубл. 21.05.2019), включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, генотипирование методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, отличающийся тем, что проводят амплификацию участка rs2107538 гена хемокина CCL5 и участка rs6749704 гена хемокина CCL20 и при выявлении генотипов С/Т или Т/Т полиморфного локуса rs2107538 гена CCL5 или генотипа С/С полиморфного локуса rs6749704 гена CCL20 прогнозируют риск развития сахарного диабета 2 типа у обследуемого.

Недостаток метода заключается в том, что он может быть использован только для жителей Башкортостана и непригоден для прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у жителей других регионов России ввиду имеющихся межэтнических генетических различий в частотах минорных аллелей однонуклеотидных полиморфизмов и величин неравновесия по сцеплению между ними.

Известен способ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у больных гипертонической болезнью по патенту на изобретение RU 2521202 (опубл. 27.06.2014), включающий забор образца периферической венозной крови, выделение ДНК и анализ полиморфизма гена лимфотоксина α (+250G/A Ltα), по результатам которого прогнозируют риск развития сахарного диабета 2 типа у больных гипертонической болезнью: высокий - в случае обнаружения аллеля +250G Ltα, низкий - в случае обнаружения генотипа +250А/A Ltα.

Однако данный способ не пригоден для выявления предрасположенности к развитию сахарного диабета 2 типа у лиц без гипертонической болезни.

Наиболее близок по результату исследования способ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у жителей Центральной России на основе генотипирования полиморфизма rs11073891 гена ANPEP (патент на изобретение RU 2803636 C1, опубл. 18.09.2023), включающий забор образца периферической венозной крови и экстракцию ДНК с последующим анализом полиморфного варианта гена аминопептидазы ANPEP rs11073891 (А>С). Прогнозируют повышенный риск развития сахарного диабета 2 типа в случае выявления генотипа rs11073891-А/А, а при обнаружении генотипов rs11073891-А/С или rs11073891-С/С - низкий риск развития сахарного диабета 2 типа.

Однако данный способ не учитывает пол и индекс массы тела пациентов.

Технический результат заключается в получении критериев оценки риска развития сахарного диабета 2 типа у женщин с ожирением по данным о генетическом полиморфизме rs469994 (G>A) гена ZNRF3.

Технический результат достигается тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs469994 (G>A) гена ZNRF3 и прогнозируют повышенный риск развития сахарного диабета 2 типа в случае выявления генотипов rs469994-G/A или rs469994-А/А, а при обнаружении генотипа rs469994-G/G - низкий риск развития сахарного диабета 2 типа у женщин с ожирением.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл. Экстрагированные из крови образцы ДНК хранились в морозильниках Thermo Fisher Scientific (США) при -20°С.

2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 10 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма rs469994 (G>A) гена ZNRF3 - генотипирование методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. Использовали следующие последовательности праймеров: прямой F: 5'-TGCAGCCTCACAGAAATATTCC-3', обратный R: 5'-CAGAGGGATGTGAGGAAAGTT-3', ZNRF3-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-FAM-TGGCACATCAGTCCTCACG-RTQ1-3', ZNRF3-А-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-ROX- TGGCACATCAGTCCTCACA-BHQ-3'. Праймеры и зонды были синтезированы компанией «Синтол» (г. Москва). Реакцию амплификации проводили в 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl₂ (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: денатурация 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, состоящая из денатурации 15 сек при 95°С, отжига 30 сек при t=53°С и элонгации 60 сек при 62°С. Детекция флуоресценции проводилась на стадии элонгации по каналам FAM и ROX. Анализ результатов генотипирования проводили с помощью программного обеспечения для амплификатора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) версии Bio-Rad CFX Manager 2.1. Статистические расчеты проводили с помощью программы SNPStats (Solé, X., Guinó, E., Valls, J., Iniesta, R., & Moreno, V. (2006). SNPStats: a web tool for the analysis of association studies. Bioinformatics, 22 (15), 1928-1929).

4. Прогнозирование повышенного риска развития сахарного диабета 2 типа у женщин с ожирением в случае выявления генотипов rs469994-G/A или rs469994-А/А и пониженного риска развития этого заболевания при выявлении генотипа rs469994-G/G.

Возможность использования предложенного способа для определения риска развития сахарного диабета 2 типа у женщин с ожирением подтверждает анализ результатов наблюдений 856 женщин с ожирением, у 672 из которых установлен сахарный диабет 2 типа. В исследование включались лица славянской национальности Центральной России. Диагноз СД2 был установлен врачами-эндокринологами ОБУЗ ГК БСМП на основе клинического и лабораторно-инструментального обследования. Установлено, что генотип rs469994-G/G значимо чаще встречался в группе контроля (34,8%) по сравнению с больными СД2 (24,1%). Носительство генотипов rs469994-G/A (OR=1,52, 95% CI 1,05-2,21, P=0,0059) и rs469994-А/А ZNRF3 (OR=2,11, 95% CI 1,31-3,40, P=0,0059) ассоциировалось с повышенным риском развития сахарного диабета 2 типа (таблица 1).

Таблица 1

Ассоциация полиморфного варианта rs469994 гена ZNRF3 с риском развития сахарного диабета 2 типа у женщин с ожирением

Ген
SNP ID Генотип, аллель n (%) Р¹ OR (95% CI)² Контроль
(n=184) Пациенты с СД2
(n=672) ZNRF3
rs469994
G>A G/G 64 (34,8%) 162 (24,1%) 0,0059 1,00 G/A 88 (47,8%) 339 (50,5%) 1,52 (1,05-2,21) A/A 32 (17,4%) 171 (25,4%) 2,11 (1,31-3,40) A 41,3% 50,7% 0,001 1,46 (1,16-1,84) ¹Уровень значимости ассоциации;
²Отношения шансов и 95% доверительный интервал. Жирным выделены статистически значимые значения Р и OR (95% CI).

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено генетическое обследование женщин славянского происхождения, уроженок Центральной России и не являющихся родственницами между собой: проведено генетическое обследование по локусу rs469994 (G>A) гена ZNRF3.

Донор-доброволец В., женщина 46 лет, с индексом массы тела 32,1 кг/м², что классифицируется как ожирение I степени, обратилась в ОБУЗ «Курская областная клиническая станция переливания крови» комитета здравоохранения Курской области 22.02.2019 г. для сдачи крови. Пациентке было предложено принять участие в научном исследовании для выявления генетической предрасположенности к сахарному диабету 2 типа. У женщины была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs469994 (G>A) гена ZNRF3 был выявлен генотип rs469994-G/G ZNRF3, что позволило отнести женщину в группу лиц с низким риском развития сахарного диабета 2 типа. Анализ крови подтвердил факт отсутствия нарушений углеводного обмена: концентрация глюкозы крови натощак 4,4 ммоль/л, гликированный гемоглобин 5,1%, что соответствует норме. Дальнейшее наблюдение не выявило диагноз сахарного диабета 2 типа.

Пациентке М., женщине 45 лет, при прохождении профилактического осмотра на базе поликлиники ОБУЗ «Курской городской клинической больницы скорой медицинской помощи» 21.10.2017 г. было предложено пройти тестирование на предмет предрасположенности к сахарному диабету 2 типа в связи с имеющимися факторами риска - ожирением II степени (индекс массы тела 36,3 кг/м²). У женщины была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного варианта rs469994 (G>A) гена ZNRF3 был выявлен генотип rs469994-G/А ZNRF3, что позволило отнести пациентку в группу лиц с высоким риском развития сахарного диабета 2 типа. Тем не менее, профилактические мероприятия по снижению массы тела женщиной не проводились. С жалобами на общую слабость, сухость во рту, жажду до 3 л в сутки, учащенное мочеиспускание, генитальный зуд, 02.08.2019 г. пациентка М. была доставлена бригадой скорой медицинской помощи в эндокринологическое отделение, где получала стационарное лечение по 15.08.2019 г. При поступлении концентрация глюкозы крови составила 16,3 ммоль/л, гликированный гемоглобин 10,8%. Клинический диагноз: сахарный диабет, 2 тип, впервые выявленный, фаза декомпенсации от 02.08.2019 г., фаза компенсации от 15.08.2019 г. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<7,0%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <7,0 ммоль/л, через 2 ч после еды <9,0 ммоль/л.

Пациентка П., женщина 41 год, проходила медосмотр в поликлинике ОБУЗ «Курской городской клинической больницы скорой медицинской помощи» 07.09.2017 г. В связи с фактом отягощенной наследственности по сахарному диабету 2 типа (этим заболеванием страдает отец) и наличием фактора риска диабета - ожирения III степени (индекс массы тела 42 кг/м²) женщине было предложено пройти тестирование на предмет предрасположенности к сахарному диабету 2 типа. У женщины была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного варианта rs469994 (G>A) гена ZNRF3 был выявлен генотип rs469994-А/А ZNRF3, что позволило отнести пациентку в группу лиц с высоким риском развития сахарного диабета 2 типа. Профилактические мероприятия по снижению массы тела женщиной не проводились. С жалобами на сухость во рту, умеренную жажду, полиурию, никтурию, головокружение, тошноту, сердцебиение, кожный зуд 25.07.2019 г. пациентка П. была доставлена бригадой скорой медицинской помощи в эндокринологическое отделение, где получала стационарное лечение по 09.08.2019 г. При поступлении концентрация глюкозы крови составила 13,8 ммоль/л, гликированный гемоглобин 9,2%. Клинический диагноз: сахарный диабет, 2 тип, впервые выявленный, фаза декомпенсации от 25.07.2019 г., фаза компенсации от 09.08.2019 г. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<6,5%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <6,5 ммоль/л, через 2 ч после еды <8,0 ммоль/л.

Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди женщин с ожирением группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития сахарного диабета 2 типа.

Резюме

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что аллель rs469994-A гена ZNRF3 является генетическим фактором риска развития сахарного диабета 2 типа (OR=1,46, Р=0,001) у женщин с ожирением.

Использование предложенного способа позволит прогнозировать развитие сахарного диабета 2 типа у женщин с ожирением, что даст возможность осуществлять мероприятия по профилактике данного заболевания - регулярный контроль уровня глюкозы в крови, нормализацию массы тела, достаточную физическую активность, правильное питание с ежедневным включением в рацион свежих овощей и фруктов и ограничением рафинированных углеводов и жиров.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у женщин с ожирением. Осуществляют забор образца периферической венозной крови и экстракцию ДНК. Проводят анализ полиморфного варианта rs469994 (G>A) гена ZNRF3. В случае выявления генотипов rs469994-G/A или rs469994-А/А прогнозируют повышенный риск развития сахарного диабета 2 типа. При обнаружении генотипа rs469994-G/G прогнозируют низкий риск развития сахарного диабета 2 типа. Способ обеспечивает получение новых критериев оценки риска развития сахарного диабета 2 типа у женщин с ожирением по данным о генетическом полиморфизме rs469994 (G>A) гена ZNRF3. 1 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у женщин с ожирением, включающий забор образца периферической венозной крови, отличающийся тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs469994 (G>A) гена ZNRF3 и прогнозируют повышенный риск развития сахарного диабета 2 типа в случае выявления генотипов rs469994-G/A или rs469994-А/А, а при обнаружении генотипа rs469994-G/G – низкий риск развития сахарного диабета 2 типа у женщин с ожирением.