МИКРООРГАНИЗМ, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ЛИЗИН, И СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ЛИЗИНА Российский патент 2023 года по МПК C12N1/21 C07K14/34 C12P13/08 C12N15/63 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. В частности, настоящее изобретение относится к штаммам, продуцирующим L-лизин в большом количестве, а также к способам их конструирования и их применению.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

L-лизин, сокращенно лизин, является наиболее важной незаменимой аминокислотой в питании человека и животных и широко используется в таких отраслях, как медицина, здравоохранение, пищевая промышленность, корма для животных и косметика. Лизин в основном продуцируется путем микробной ферментации. В настоящее время основные продуцирующие штаммы включают микроорганизмы, такие как Escherichia coli и Corynebacterium glutamicum. Благодаря физиологическому превосходству Corynebacterium glutamicum, он стал наиболее важным продуцирующим штаммом в промышленности. С постоянным развитием биотехнологии в последние годы также постоянно появляются способы метаболической инженерии Corynebacterium glutamicum для улучшения его выхода лизина, которые включают модификации синтетических путей лизина, ослабление синтетических конкурирующих путей лизина и т.д. Кислотообразующая способность лизина продуцировать штаммы в промышленных масштабах в настоящее время достигла более высокого уровня.

Однако в промышленности по-прежнему сохраняется потребность в штаммах, продуцирующих лизин, с более высокой продуцирующей способностью (выход и конверсия) в целях дальнейшего снижения производственных издержек. Следовательно, в данной области техники существует острая потребность в новых способах конструирования штаммов, продуцирующих лизин, чтобы дополнительно повысить выход лизина.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является обеспечение нового штамма, продуцирующего лизин, способа конструирования штамма и способа продуцирования лизина сконструированным штаммом, продуцирующим лизин.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к штамму, продуцирующему L-лизин, где по сравнению со штаммом дикого типа, содержащим эндогенный полипептид, штамм, продуцирующий L-лизин, имеет по меньшей мере одну из следующих характеристик (i)-(iii):

(i) сниженная или отсутствующая полипептидная активность эндогенного полипептида;

(ii) сниженный или отсутствующий уровень экспрессии кодирующего гена эндогенного полипептида;

(iii) сниженный или отсутствующий уровень экспрессии полинуклеотида, представляющего интерес;

причем указанный эндогенный полипептид представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, или полипептид, кодируемый последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, необязательно по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1; и

указанный полинуклеотид, представляющий интерес, представляет собой полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, или полинуклеотид, кодируемый последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, необязательно по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2.

В конкретном варианте осуществления в штамме полипептид, имеющий 98 % или более гомологии с полипептидом, представленным в SEQ ID NO: 1, и имеющий домен FhuF на С-конце, является инактивированным.

В конкретном варианте осуществления изобретения штамм представляет собой Corynebacterium glutamicum.

В конкретном варианте осуществления полипептид, представленный в SEQ ID NO: 1, в штамме является инактивированным.

В конкретном варианте осуществления инактивация полипептида означает, что по сравнению с эндогенным полипептидом транскрипция или экспрессия кодирующего гена полипептида снижена по меньшей мере на 30 %, предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 50 %, например по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70 %, по меньшей мере на 80 %, по меньшей мере на 90 %, по меньшей мере на 95 %, по меньшей мере на 96 %, по меньшей мере на 97 %, по меньшей мере на 98 % или по меньшей мере на 99 %, или кодирующий ген полипептида является нокаутированным; или

активность полипептида снижена по меньшей мере на 30 %, предпочтительно по меньшей мере на 40 %, более предпочтительно по меньшей мере на 50 %, например, по меньшей мере на 60 %, по меньшей мере на 70 %, по меньшей мере на 80 %, по меньшей мере на 90 %, по меньшей мере на 95 %, по меньшей мере на 96 %, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98 % или по меньшей мере на 99 %.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения по сравнению со штаммом, продуцирующим L-лизин, содержащим эндогенный полипептид, выход L-лизина штамма, продуцирующего L-лизин, увеличен по меньшей мере на 5 %, предпочтительно по меньшей мере на 15 %, более предпочтительно по меньшей мере на 20%, более предпочтительно по меньшей мере на 25 %, более предпочтительно по меньшей мере на 30 % и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 35 %.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения по сравнению со штаммом, продуцирующим L-лизин, содержащим эндогенный полипептид, штамм, продуцирующий L-лизин, имеет конверсию глюкозы, увеличенную по меньшей мере на 10%, предпочтительно на 20 % и более предпочтительно на 30 %, в процессе продуцирования L-лизина.

В предпочтительном варианте осуществления эндогенный полипептид может быть инактивирован одним или комбинацией следующих способов: частичным нокаутом или полным нокаутом кодирующего гена полипептида; мутациями кодирующего гена; изменениями промоторов или кодонов в трансляционной регуляторной области или кодирующей области кодирующего гена для ослабления его транскрипции или трансляции; изменениями последовательности кодирующего гена для уменьшения стабильности его мРНК или дестабилизации структуры белка, который он кодирует; или любыми другими способами инактивации эндогенного полипептида путем модификации кодирующей области гена и прилегающих к ней вышележащих и нижележащих областей и т.д.

В предпочтительном варианте осуществления кодирующая последовательность гена вызывает мутацию со сдвигом рамки, миссенс-мутацию, делецию, изменение инициаторного кодона и т.д.

В предпочтительном варианте осуществления один или более генов, выбранных из группы, состоящей из следующих генов, штамма, продуцирующего лизин, являются усиленными или сверхэкспрессированными:

a₁. ген lysC, кодирующий аспартаткиназу, которая ослабляет ингибирование лизина по типу обратной связи;

b₁. ген dapA, кодирующий дигидродипиридинсинтазу, которая ослабляет ингибирование лизина по типу обратной связи;

c₁. ген dapB, кодирующий дигидродипиколинатредуктазу;

d₁. ген ddh, кодирующий диаминопимелатдегидратазу;

e₁. dapD, кодирующий тетрагидродипиколинатсукцинилазу, и dapE, кодирующий сукцинилдиаминопимелатдеацилазу;

f₁. ген asd, кодирующий аспартат-полуальдегиддегидратазу;

g₁. ген ppc, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксилазу; или

h₁. ген pntAB, кодирующий ниацинамидадениндинуклеотидтрансгидрогеназу.

В предпочтительном варианте осуществления один или более генов, выбранных из группы, состоящей из следующих генов, штамма являются ослабленными, или их экспрессия снижена:

a₂. ген adhE, кодирующий этанолдегидратазу;

b₂. ген ackA, кодирующий ацетаткиназу;

c₂. ген pta, кодирующий фосфатацетилтрансферазу;

d₂. ген ldhA, кодирующий лактатдегидратазу;

e₂. ген focА, кодирующий транспортер формиата;

f₂. ген pflB, кодирующий пируватформиатлиазу;

g₂. ген poxB, кодирующий пируватоксидазу;

h₂. ген thrA, кодирующий аспартаткиназу I/гомосериндегидратазу I в качестве бифункционального фермента;

i₂. ген thrB, кодирующий гомосеринкиназу;

j₂. ген ldcC, кодирующий лизиндекарбоксилазу; и

h₂. ген cadA, кодирующий лизиндекарбоксилазу.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу конструирования штамма, продуцирующего L-лизин, включающий стадии:

модификации штамма дикого типа, содержащего эндогенный полипептид, для того, чтобы снизить или обеспечить отсутствие полипептидной активности эндогенного полипептида штамма дикого типа; или

модификации штамма дикого типа, содержащего эндогенный полипептид, для того, чтобы снизить или обеспечить отсутствие уровня экспрессии кодирующего гена эндогенного полипептида штамма дикого типа; или

модификации штамма дикого типа для того, чтобы снизить или обеспечить отсутствие уровня экспрессии полинуклеотида, представляющего интерес, в штамме дикого типа,

где эндогенный полипептид представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, или полипептид, кодируемый последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, необязательно по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1; и

полинуклеотид, представляющий интерес, представляет собой полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, или полинуклеотид, кодируемый последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, необязательно по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2.

В конкретном варианте осуществления штамм является модифицированным, где полипептид, имеющий 98 % или более гомологии с полипептидом, представленным в SEQ ID NO: 1, и имеющий домен FhuF на С-конце, является инактивированным.

В конкретном варианте осуществления изобретения штамм представляет собой Corynebacterium glutamicum.

В конкретном варианте осуществления штамм является модифицированным, где полипептид, представленный в SEQ ID NO: 1, является инактивированным.

В конкретном варианте осуществления инактивация полипептида означает, что по сравнению с эндогенным полипептидом транскрипция или экспрессия кодирующего гена полипептида снижена по меньшей мере на 30 %, предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 50 %, например, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70 %, по меньшей мере на 80 %, по меньшей мере на 90 %, по меньшей мере на 95 %, по меньшей мере на 96 %, по меньшей мере на 97 %, по меньшей мере на 98 % или по меньшей мере на 99 %, или кодирующий ген полипептида является нокаутированным; или активность полипептида снижена по меньшей мере на 30 %, предпочтительно по меньшей мере на 40 %, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, например, по меньшей мере на 60 %, по меньшей мере на 70 %, по меньшей мере на 80 %, по меньшей мере на 90 %, по меньшей мере на 95 %, по меньшей мере на 96 %, по меньшей мере на 97 %, по меньшей мере на 98 % или по меньшей мере на 99 %.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения по сравнению со штаммом, продуцирующим L-лизин, содержащим эндогенный полипептид, выход L-лизина штамма, продуцирующего L-лизин, увеличен по меньшей мере на 5 %, предпочтительно по меньшей мере на 15 %, более предпочтительно по меньшей мере на 20%, более предпочтительно по меньшей мере на 25 %, более предпочтительно по меньшей мере на 30 % и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 35 %.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения по сравнению со штаммом, продуцирующим L-лизин, содержащим эндогенный полипептид, штамм, продуцирующий L-лизин, имеет конверсию глюкозы, увеличенную по меньшей мере на 10%, предпочтительно на 20 % и более предпочтительно на 30 %, в процессе продуцирования L-лизина.

В предпочтительном варианте осуществления эндогенный полипептид может быть инактивирован одним или комбинацией следующих способов: частичным нокаутом или полным нокаутом кодирующего гена полипептида; мутациями кодирующего гена; изменениями промоторов или кодонов в трансляционной регуляторной области или кодирующей области кодирующего гена для ослабления его транскрипции или трансляции; изменениями последовательности кодирующего гена для уменьшения стабильности его мРНК или дестабилизации структуры белка, который он кодирует; или любыми другими способами инактивации эндогенного полипептида путем модификации кодирующей области гена в клетке и прилегающих к ней вышележащих и нижележащих областей и т.д.

В предпочтительном варианте осуществления кодирующая последовательность гена полипептида вызывает мутацию со сдвигом рамки, миссенс-мутацию, делецию, изменение инициаторного кодона и т.д.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает усиление или сверхэкспрессию одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из следующих генов, в штамме:

a₁. ген lysC, кодирующий аспартаткиназу, которая ослабляет ингибирование лизина по типу обратной связи;

b₁. ген dapA, кодирующий дигидродипиридинсинтазу, которая ослабляет ингибирование лизина по типу обратной связи;

c₁. ген dapB, кодирующий дигидродипиколинатредуктазу;

d₁. ген ddh, кодирующий диаминопимелатдегидратазу;

e₁. dapD, кодирующий тетрагидродипиколинатсукцинилазу, и dapE, кодирующий сукцинилдиаминопимелатдеацилазу;

f₁. ген asd, кодирующий аспартат-полуальдегиддегидратазу;

g₁. ген ppc, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксилазу; или

h₁. ген pntAB, кодирующий ниацинамидадениндинуклеотидтрансгидрогеназу.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает ослабление одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из следующих генов, в штамме или снижение экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из следующих генов, в штамме:

a₂. ген adhE, кодирующий этанолдегидратазу;

b₂. ген ackA, кодирующий ацетаткиназу;

c₂. ген pta, кодирующий фосфатацетилтрансферазу;

d₂. ген ldhA, кодирующий лактатдегидратазу;

e₂. ген focА, кодирующий транспортер формиата;

f₂. ген pflB, кодирующий пируватформиатлиазу;

g₂. ген poxB, кодирующий пируватоксидазу;

h₂. ген thrA, кодирующий аспартаткиназу I/гомосериндегидратазу I в качестве бифункционального фермента;

i₂. ген thrB, кодирующий гомосеринкиназу;

j₂. ген ldcC, кодирующий лизиндекарбоксилазу; и

h₂. ген cadA, кодирующий лизиндекарбоксилазу.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу продуцирования L-лизина, включающему:

1) культивирование штамма, продуцирующего L-лизин, в соответствии с первым аспектом или штамма, продуцирующего L-лизин, сконструированного способом в соответствии со вторым аспектом, для того, чтобы штамм, продуцирующий L-лизин, стал продуцировать L-лизин;

2) необязательно отделение L-лизина от культурального раствора, полученного на стадии 1).

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к применению штамма, продуцирующего L-лизин, в соответствии с первым аспектом или штамма, продуцирующего L-лизин, полученного способом в соответствии со вторым аспектом, в продуцировании L-лизина.

Следует понимать, что в пределах объема, представленного в данном документе, каждый из вышеупомянутых технических признаков и каждый из технических признаков, конкретно описанных ниже (например, примеры) в данном изобретении, могут быть объединены друг с другом для создания новых или предпочтительных технических решений, которые не будут повторяться здесь один за другим из-за ограниченного объема.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

После обширных и интенсивных исследований в настоящем изобретении неожиданно был обнаружен ген, кодирующий гипотетический белок, и было обнаружено, что инактивация этого гена может значительно увеличить выход лизина, тем самым, приводя к получению штамма, высокопродуктивного в отношении лизина. Основываясь на этих выводах, осуществляли настоящее изобретение.

Полипептид, представленный в SEQ ID NO: 1

Полипептид, представленный в SEQ ID NO: 1

согласно настоящему изобретению, получен из Corynebacterium glutamicum, который кодирует нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2

Полипептид также аннотирован как (2Fe-2S)-связывающий белок из-за присутствия домена FhuF на его С-конце. Анализ BLAST (программа для обнаружения сходства последовательностей белков путем их локального выравнивания) показал, что этот полипептид является высококонсервативным в различных Corynebacteria glutamicum и имеет домен FhuF на каждом C-конце. Следовательно, полипептид обладает одинаковыми функциями в разных Corynebacteria glutamicum.

Определения терминов

Полинуклеотид, обычно относящийся к полирибонуклеотиду и полидезоксирибонуклеотиду, может представлять собой немодифицированную РНК или ДНК или модифицированную РНК или ДНК. Нуклеотидная последовательность, описанная в настоящем документе, может представлять собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, или может представлять собой нуклеотидную последовательность, гибридизованную с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, в жестких условиях, или может представлять собой нуклеотидную последовательность, гибридизованную с зондом, полученным из SEQ ID NO: 2. Термин "жесткие условия", представленный в настоящем документе, относится к условиям, при которых может происходить специфическая гибридизация, в то время как неспецифическая гибридизация не происходит. Например, промывку проводят в физиологическом растворе при определенной концентрации за один раз, и предпочтительно за два или три раза, и соответствующая концентрация составляет 1×SSC, 0,1% SDS, предпочтительно 0,1×SSC, 0,1% SDS при 60°C и более предпочтительно 0,1×SSC, 0,1% SDS при 68°C; длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации, обычно от 100 п. о. (пар оснований) до 1 т. о. (тысяча пар оснований).

Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются в настоящем документе взаимозаменяемо и представляют собой полимер из аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным. Он может содержать модифицированные аминокислоты и может прерываться неаминокислотами. Термин также включает аминокислотные полимеры, которые были модифицированы (например, путем образования дисульфидной связи, гликозилированием, липидизацией, ацетилированием, фосфорилированием или любыми другими манипуляциями, такими как конъюгация с меченым компонентом).

Термин "экспрессия" включает любые стадии, включающие продуцирование полипептида, включая, но не ограничиваясь ими: транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.

Термины "идентичность последовательности" и «процент идентичности», используемые в настоящем документе, относятся к проценту нуклеотидов или аминокислот, которые являются одинаковыми (т.е. идентичными) между двумя или более полинуклеотидами или полипептидами. Идентичность последовательности между двумя или более полинуклеотидами или полипептидами может быть определена путем выравнивания нуклеотидных последовательностей полинуклеотидов или аминокислотных последовательностей полипептидов и оценки количества положений, в которых нуклеотидные или аминокислотные остатки идентичны в выровненных полинуклеотидах или полипептидах, и сравнения количества этих положений с количеством положений, в которых нуклеотидные или аминокислотные остатки отличаются в выровненных полинуклеотидах или полипептидах. Полинуклеотиды могут отличаться в одном положении, например, содержанием другого нуклеотида (т.е. заменой или мутацией) или удалением нуклеотида (т.е. вставкой или делецией нуклеотида в одном или двух полинуклеотидах). Полипептиды могут отличаться в одном положении, например, содержанием другой аминокислоты (т.е. заменой или мутацией) или удалением аминокислоты (т.е. вставкой или делецией аминокислоты в одном или двух полипептидах). Идентичность последовательности может быть рассчитана путем деления количества положений, в которых нуклеотидные или аминокислотные остатки идентичны, на общее количество нуклеотидных или аминокислотных остатков в полинуклеотидах или полипептидах. Например, процент идентичности может быть рассчитан путем деления количества положений, в которых нуклеотидные или аминокислотные остатки идентичны, на общее количество нуклеотидных или аминокислотных остатков в полинуклеотидах или полипептидах, и умножения результата на 100.

Термин "дикий тип/эндогенный" в данном контексте означает, что полипептид или полинуклеотид находится в немодифицированном состоянии, т.е. в естественном состоянии, в микроорганизме. Например, полипептид, полинуклеотидная последовательность или микроорганизм, которые могут быть выделены из одного источника в природе и которые не были намеренно модифицированы человеком в лаборатории, являются встречающимися в природе. В данном контексте термины "встречающийся в природе" и "дикий тип" являются синонимами.

В некоторых вариантах осуществления изобретения штамм дикого типа, используемый в данном документе, относится к штамму, содержащему эндогенный полипептид, который представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, или полипептид, кодируемый последовательностью, имеющей по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1.

В конкретном варианте осуществления изобретения штамм дикого типа представляет собой Corynebacterium glutamicum, содержащую эндогенный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение генетически модифицирует штамм дикого типа с получением рекомбинантного штамма, имеющего по меньшей мере одну из следующих характеристик (i)-(iii) по сравнению со штаммом дикого типа:

(i) сниженная или отсутствующая полипептидная активность эндогенного полипептида;

(ii) сниженный или отсутствующий уровень экспрессии кодирующего гена эндогенного полипептида и

(iii) сниженный или отсутствующий уровень экспрессии полинуклеотида;

причем указанный эндогенный полипептид представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, или полипептид, кодируемый последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, необязательно по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1; и

указанный полинуклеотид представляет собой полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, или полинуклеотид, кодируемый последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, необязательно по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2.

Основываясь на информации, представленной в настоящем изобретении, специалисту в данной области техники должно быть понятно, что настоящее изобретение улучшает выход лизина штамма путем инактивации полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, Corynebacterium glutamicum. Таким образом, формулировка "полипептид, представленный в SEQ ID NO: 1, является инактивированным", описанная в настоящем документе, означает, что по сравнению со штаммом дикого типа экспрессия полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, снижена, ослаблена или даже полностью отсутствует, или означает, что продуцируется ген, который не экспрессируется, или хотя ген экспрессируется, продукт экспрессии не обладает активностью или имеет сниженную активность.

В конкретном варианте осуществления по сравнению с полипептидом дикого типа или эндогенным полипептидом транскрипция или экспрессия мутированного гена или активность белка, кодируемого мутированным геном, снижена по меньшей мере на 30 %, предпочтительно по меньшей мере на 40 %, более предпочтительно по меньшей мере на 50 %, например, по меньшей мере на 60 %, по меньшей мере на 70 %, по меньшей мере на 80 %, по меньшей мере на 90 %, по меньшей мере на 95 %, по меньшей мере на 96 %, по меньшей мере на 97 %, по меньшей мере на 98 % или по меньшей мере на 99 %, или кодирующий ген полипептида дикого типа или эндогенного полипептида является нокаутированным.

Термин "модификация", используемый в настоящем документе, относится к любой генетической манипуляции в отношении штамма дикого типа или родительского штамма, включая, но не ограничиваясь ими, различные молекулярно-биологические средства. Термины "модификация", "редактирование гена" и "генетическая модификация", используемые в настоящем документе, могут быть взаимозаменяемыми.

Термин "инактивация", используемый в настоящем документе, может быть реализован путем модификаций, включая, но не ограничиваясь ими, делецию части или всего кодирующего гена, мутацию со сдвигом рамки считывания гена, ослабление интенсивности транскрипции или трансляции или использование гена или аллеля, кодирующего соответствующий фермент или белок с более низкой активностью, или инактивацию соответствующего гена или фермента, и необязательно применение этих способов в комбинации. Экспрессия гена может быть снижена путем принятия подходящих способов культивирования или генетических модификаций (мутаций) сигнальных структур экспрессии гена. Например, сигнальные структуры экспрессии генов представляют собой гены-регуляторы, активные гены, гены-операторы, промоторы, аттенюаторы, сайты связывания рибосом, инициаторные кодоны и терминаторы.

Основываясь на информации, представленной в настоящем изобретении, специалисту в данной области техники будет понятно, что выход лизина может быть улучшен путем инактивации кодирующего гена полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, или путем обеспечения того, что полипептид, представленный в SEQ ID NO: 1, не может нормально функционировать в клетке. Специалист в данной области техники может достичь вышеуказанной цели с помощью технических средств, известных в данной области техники. Это может быть достигнуто, например, путем дефекта фермент-кодирующего гена на хромосоме или путем модификации одной последовательности контроля экспрессии, такой как промотор или последовательность SD (последовательность Шайна-Дальгарно); или это может быть достигнуто путем введения аминокислотной замены (миссенс-мутация) или терминатора (нонсенс-мутация) в кодирующую область, или введения вставки или делеции одного или двух оснований (мутация со сдвигом рамки) в кодирующую область или удаления части гена (Journal of Biological Chemistry 1997, 272: 8611-8617). Настоящее изобретение включает, но не ограничивается ими, вышеуказанные способы.

Термин "конверсия глюкозы", используемый в данном документе, относится к молярному соотношению глюкозы в качестве субстрата, превращенного в лизин в качестве продукта.

Термин "штамм, продуцирующий лизин", используемый в настоящем документе, относится к штамму, который продуцирует лизин, когда бактерии культивируют в среде, и может накапливать лизин или может секретировать лизин в среду, то есть можно получить внеклеточный свободный лизин. Например, штаммы могут быть встречающимися в природе штаммами, продуцирующими лизин, или могут быть сконструированными штаммами, продуцирующими лизин, полученными с помощью генетических модификаций. Модификации включают, но не ограничиваются ими, модификацию, согласно которой один или более генов, выбранных из группы, состоящей из следующих генов, штамма являются усиленными или сверхэкспрессированными:

a₁. ген lysC, кодирующий аспартаткиназу, которая ослабляет ингибирование лизина по типу обратной связи;

b₁. ген dapA, кодирующий дигидродипиридинсинтазу, которая ослабляет ингибирование лизина по типу обратной связи;

c₁. ген dapB, кодирующий дигидродипиколинатредуктазу;

d₁. ген ddh, кодирующий диаминопимелатдегидратазу;

e₁. dapD, кодирующий тетрагидродипиколинатсукцинилазу, и dapE, кодирующий сукцинилдиаминопимелатдеацилазу;

f₁. ген asd, кодирующий аспартат-полуальдегиддегидратазу;

g₁. ген ppc, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксилазу; и

h₁. ген pntAB, кодирующий ниацинамидадениндинуклеотидтрансгидрогеназу.

Кроме того, модификации включают, но не ограничиваются ими, модификацию, при которой один или более генов, выбранных из группы, состоящей из следующих генов, штамма являются ослабленными, или их экспрессии снижены:

a₂. ген adhE, кодирующий этанолдегидратазу;

b₂. ген ackA, кодирующий ацетаткиназу;

c₂. ген pta, кодирующий фосфатацетилтрансферазу;

d₂. ген ldhA, кодирующий лактатдегидратазу;

e₂. ген focА, кодирующий транспортер формиата;

f₂. ген pflB, кодирующий пируватформиатлиазу;

g₂. ген poxB, кодирующий пируватоксидазу;

h₂. ген thrA, кодирующий аспартаткиназу I/гомосериндегидратазу I в качестве бифункционального фермента;

i₂. ген thrB, кодирующий гомосеринкиназу;

j₂. ген ldcC, кодирующий лизиндекарбоксилазу; и

h₂. ген cadA, кодирующий лизиндекарбоксилазу.

В некоторых вариантах осуществления изобретения сконструированные штаммы, продуцирующие лизин, полученные с помощью генетических модификаций, которые обладают сниженной или отсутствующей активностью белка, сниженным или отсутствующим уровнем экспрессии гена, кодирующего белок, сниженной или отсутствующей активностью фермента или сниженным или отсутствующим уровнем экспрессии гена, кодирующего фермент, включают рекомбинантные штаммы, модифицированные следующими способами генной инженерии: введение слабого промотора или слабого сайта связывания рибосом в штамм, нокаут гена или нокдаун кодирующего гена белка или фермента и вставка случайного фрагмента в кодирующий ген белка или фермента для провоцирования потери активности белка или фермента.

В некоторых вариантах осуществления изобретения повышенная активность белка, повышенный уровень экспрессии гена, кодирующего белок, повышенная активность фермента или повышенный уровень экспрессии гена, кодирующего фермент, в сконструированных штаммах, продуцирующих лизин, полученных с помощью генетических модификаций, реализуют путем модификаций, включающих следующие способы генной инженерии: введение сильных промоторов или сильных сайтов связывания рибосом, введение рекомбинантных векторов экспрессии неинтегральных белков или ферментов и введение рекомбинантных векторов экспрессии хромосомно-интегрированных белков или ферментов.

Термин "вектор" относится к конструкции ДНК, содержащей последовательности ДНК, функционально связанные с соответствующими контрольными последовательностями, чтобы экспрессировать представляющий интерес ген в подходящем хозяине. Термин "рекомбинантный вектор экспрессии" относится к конструкции ДНК, используемой для экспрессии, например, полинуклеотида, кодирующего желаемый полипептид. Рекомбинантный вектор экспрессии может включать, например: i) набор генетических элементов, обладающих регулирующим действием в отношении экспрессии генов, таких как промоторы и энхансеры; ii) структуру или кодирующую последовательность, которая транскрибируется в мРНК и транслируется в белок; и iii) транскрипционные субъединицы, которые соответствующим образом транскрибируют и транслируют последовательности инициации и терминации. Рекомбинантные векторы экспрессии сконструированы любым подходящим способом. Природа вектора не является существенной, и может быть использован любой вектор, включая плазмиды, вирусы, фаги и транспозоны. Потенциальные векторы, используемые в настоящем документе, включают, но не ограничиваются ими, хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК, такие как бактериальные плазмиды, фаговые ДНК, дрожжевые плазмиды и векторы, полученные из комбинаций плазмид и фаговых ДНК, и ДНК из вирусов, таких как вакцины, аденовирусы, оспы птиц, бакуловирусы, SV40 и псевдобешенство. В некоторых вариантах осуществления "рекомбинантный вектор экспрессии", используемый в настоящем документе, относится к мутантному вектору.

Термины "трансформация, трансфекция и трансдукция", используемые в настоящем документе, имеют значения, обычно понятные специалисту в данной области техники, а именно, способ введения экзогенной ДНК в хозяина. Способы трансформации, трансфекции и трансдукции включают любой способ введения нуклеиновой кислоты в клетку. Эти способы включают, но не ограничиваются ими, электропорацию, осаждение фосфатом кальция (CaPO₄), осаждение хлоридом кальция (CaCl₂), микроинъекцию, способ на основе полиэтиленгликоля (ПЭГ), способ на основе ДЭАЭ (диэтиламиноэтил)-декстрана, способ на основе катионной липосомы и способ на основе ацетата лития-ДМСО (диметилсульфоксид).

Штаммы, описанные в настоящем документе, могут быть культивированы обычными способами в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, культуру на планшете, культуру во встряхиваемой колбе, культуру в замкнутой среде, непрерывную культуру, культуру с подпиткой и т.д. Кроме того, различные условия культивирования, такие как температура, время и значение рН среды, могут быть надлежащим образом отрегулированы в соответствии с конкретными ситуациями.

Если иное не определено или четко не указано контекстом, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют те же значения, которые обычно понимаются специалистом в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Преимущества настоящего изобретения:

1. Настоящее изобретение относится к новому способу конструирования штаммов, продуцирующих лизин, тем самым открывая новые идеи для конструирования штаммов, продуцирующих L-лизин в большом количестве;

2. Как выход лизина, так и конверсия глюкозы штаммов, продуцирующих лизин, сконструированных в настоящем документе, в некоторой степени улучшены; и

3. Стоимость продуцирования лизина способом, описанным в настоящем документе, в некоторой степени снижена.

Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано со ссылкой на конкретные примеры. Следует понимать, что эти примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Экспериментальные способы, для которых конкретные условия не указаны в следующих примерах, как правило, выполняют в соответствии с обычными условиями, такими как те, которые описаны в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), или как те, которые рекомендованы производителями.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, которое обычно подразумевается специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, также могут быть использованы для осуществления или тестирования настоящего изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны в настоящем документе.

Пример 1. Конструирование мутантного вектора гена lysC в Corynebacterium glutamicum

Из-за регуляции по типу обратной связи ключевых генов Corynebacterium glutamicum дикого типа ATCC13032 не может накапливать лизин. В литературе сообщалось, что штаммы, освобожденные от ингибирования по типу обратной связи аспартаткиназы (кодируемой геном lysC), могут накапливать лизин. С учетом этого авторы изобретения сначала сконструировали штамм с некоторой способностью к синтезу лизина путем мутации аспартаткиназы (Thr, мутированный в Ile в положении 311). В соответствии с опубликованной геномной последовательностью Corynebacterium glutamicum ATCC13032, праймеры lysC-F1/R1 и lysC-F2/R2 были сконструированы соответственно, а вышележащие и нижележащие гомологичные фрагменты плеча для мутации lysC (где основание C было мутировано в T в положении 932 гена lysC) были получены с помощью ПЦР-амплификации с использованием генома ATCC13032 в качестве матрицы. Вышеуказанные фрагменты ПЦР извлекали, а затем лигировали с вектором pK18mobsacB, который расщепляли ферментом EcoRI и BamHI с получением pK18-lysC в качестве мутантного вектора гена lysC.

Пример 2. Конструирование мутантного штамма гена lysC в Corynebacterium glutamicum

Получали компетентные клетки Corynebacterium glutamicum ATCC13032. Плазмиду pK18-lysC, как сконструировано выше, трансформировали в этот штамм. Штамм покрывали твердой средой LBHIS (2,5 г/л дрожжевого порошка, 5 г/л пептона, 5 г/л хлорида натрия, 18,5 г/л сердечно-мозгового экстракта, 91 г/л сорбита), содержащей 25 мкг/мл канамицина, и культивировали при 30°С с получением первых рекомбинантных трансформантов. Правильные трансформанты переносили в среду LB (среда Лурия-Бертани), содержащую 5 г/л глюкозы, и культивировали в течение ночи. Затем культуру переносили в среду LB, содержащую 100 г/л сахарозы, и культивировали при 30°С в течение 6 часов, а затем покрывали средой LB, содержащей 100 г/л сахарозы, для скрининга с получением SCgL30 в качестве мутантного штамма lysC.

Пример 3. Конструирование вектора с нокаутом кодирующего гена из полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, Corynebacterium glutamicum

Согласно заявленной последовательности генома Corynebacterium glutamicum ATCC13032, праймеры SEQ ID NO: 1-F1/R1 и SEQ ID NO: 1-F2/R2 были сконструированы соответственно, а вышележащие и нижележащие гомологичные плечи гена для полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, были получены с помощью ПЦР-амплификации с использованием генома ATCC13032 в качестве матрицы. Вышеуказанные фрагменты ПЦР выделяли, а затем лигировали с вектором pK18mobsacB, который расщепляли ферментом EcoRI и BamHI с получением pK18-SEQ ID NO: 1 в качестве мутантного вектора гена для полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1.

Пример 4. Конструирование штамма с делецией полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, Corynebacterium glutamicum

Получали компетентные клетки штамма SCgL30. Плазмиду pK18-SEQ ID NO: 1, как сконструировано выше, трансформировали в этот штамм. Штамм покрывали твердой средой LBHIS, содержащей 5 г/л глюкозы и 25 мкг/мл канамицина, и культивировали при 30°С с получением первых рекомбинантных трансформантов. Правильные трансформанты переносили в среду LB, содержащую 5 г/л глюкозы, и культивировали в течение ночи. Затем культуру переносили в среду LB, содержащую 100 г/л сахарозы, и культивировали при 30°С в течение 6 часов, а затем покрывали средой LB, содержащей 100 г/л сахарозы, для скрининга с получением SCgL31 в качестве штамма с делецией полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1.

Пример 5. Влияние делеции полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, на синтез лизина из Corynebacterium glutamicum

Для того чтобы проверить, как нокаут гена для полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, в Corynebacterium glutamicum повлиял на продукцию лизина штаммом, проводили ферментационные тесты на SCgL30 и SCgL31, соответственно. Ферментационная среда представляла собой среду CGXII со следующими основными ингредиентами (г/л): (NH₄)₂SO₄, 20; мочевина, 5; KH₂PO₄, 1; K₂HPO₄×3H₂O, 1,3; 3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота (MOPS), 42; CaCl₂, 0,01; FeSO₄×7H₂O, 0,01; MnSO₄×H₂O, 0,01; ZnSO₄×7H₂O, 0,001; CuSO₄, 0,0002; NiCl×6H₂O, 0,00002; MgSO₄×7H₂O, 0,25; протокатеховая кислота, 0,03; витамин B₁, 0,0001; биотин, 0,0002; и глюкоза, 80. Штаммы сначала инокулировали в среду LB, содержащую 10 г/л глюкозы, и культивировали в течение ночи. Культуры инокулировали в виде посевов в 24-луночный планшет, содержащий 600 мкл ферментационной среды в каждой лунке с исходной ОП (оптическая плотность), контролируемой на уровне 0,5, и культивировали при 30°С в течение 29 часов. Скорость вращения планшетного шейкера составляла 800 об/мин. Для каждого штамма было установлено по три образца. После ферментации измеряли выход лизина и потребление глюкозы. Результаты приведены в таблице 1. Как выход Lys, так и конверсия глюкозы были значительно улучшены после нокаута полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1.

Таблица 1. Штаммы Лизин
(г/л) Конверсия
(мМ/М×100 %) SCgL30 3,80 59,40 SCgL31 4,20 65,32

Пример 6. Конструирование штамма с ослабленным полипептидом SEQ ID NO: 1 на основе dCas9

Прежде всего, ген Cas9 плазмиды pCas9 (LIU, Jiao, et al. Development of a CRISPR/Cas9 genome editing toolbox for Corynebacterium glutamicum. Microbial cell factories, 2017, 16.1: 205) подвергали мутации в D10A и H840A, при этом удаляя сайт рестрикции фермента BsaI из каркаса плазмиды с получением плазмиды pdCas9. Затем кассету экспрессии gRNA‐ccdB амплифицировали из pnCas9(D10A)‐AID‐gRNA‐ccdBTS (WANG, Yu, et al. Expanding targeting scope, editing window, and base transition capability of base editing in Corynebacterium glutamicum. Biotechnology and bioengineering, 2019, 116: 3016-3029) и клонировали в том же положении pdCas9 с получением pdCas9gRNA-ccdB в качестве плазмиды CRISPRi, которую можно эффективно сконструировать.

Вышеуказанную ослабленную систему на основе dCas9 использовали для конструирования ослабленного вектора полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, и его контрольного вектора. Согласно заявленной последовательности генома Corynebacterium glutamicum ATCC13032, были сконструированы праймеры dCas-F/R, соответственно. Два праймера денатурировали и гибридизировали с получением комплементарных фрагментов. Вышеуказанные фрагменты лигировали с плазмидой pdCas9-ccdB, которую расщепляли ферментом BsaI через Goldengate с конструированием pdCas-SEQ ID NO: 1 в качестве ослабленного вектора с gRNA (гРНК) полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1. В соответствии с последовательностью pdCas9gRNA-ccdB были сконструированы праймеры Cas-1, Cas-2, Cas-3 и Cas-4. Два плазмидных фрагмента получали с помощью ПЦР-амплификации и рекомбинировали с помощью Vazyme в качестве рекомбиназы с получением pdCas9 в качестве контрольного вектора без каких-либо комплементарных областей на gRNA. Вышеупомянутые рекомбинантные векторы pdCas-SEQ ID NO: 1 и pdCas9 трансформировали в штаммы SCgL30 соответственно с получением SCgL30/pdCas-SEQ ID NO: 1 в качестве ослабленного штамма полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, и SCgL30/pdCas9 в качестве контрольного штамма.

Пример 7. Влияние ослабления полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, на синтез лизина из Corynebacterium glutamicum

Для того чтобы проверить, как ослабление экспрессии гена полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, в Corynebacterium glutamicum повлияло на продукцию лизина штаммом, были проведены ферментационные тесты на SCgL30/pdCas9 и SCgL30/pdCas-SEQ ID NO: 1, соответственно. Ингредиенты ферментационной среды были следующими (г/л): глюкоза, 80; дрожжевой порошок, 8; мочевина, 9; K₂HPO₄, 1,5; MnSO₄, 0,01; MgSO₄, 0,6; FeSO₄, 0,01; и MOPS, 42. Штаммы сначала инокулировали в среду LB, содержащую 10 г/л глюкозы, и культивировали в течение ночи. Культуры инокулировали в виде посевов в 24-луночный планшет, содержащий 600 мкл ферментационной среды в каждой лунке с исходной ОП, контролируемой на уровне 0,5, и культивировали при 30°С в течение 29 часов. Скорость вращения планшетного шейкера составляла 800 об/мин. Для каждого штамма было установлено по три образца. После ферментации измеряли выход лизина и потребление глюкозы. Результаты приведены в таблице 2. Как выход Lys, так и конверсия глюкозы были значительно улучшены после ослабления полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1. Результаты теста ОТ-ПЦР показали, что уровень транскрипции полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, в штамме SCgL30/pdCas-SEQ ID NO: 1 был снижен на 31 % по сравнению с контрольным штаммом.

Таблица 2. Штаммы Лизин
(г/л) Конверсия
(мМ/М×100 %) SCgL30/pdCas9 1,33 23,15 SCgL30/pdCas-SEQ ID NO: 1 1,67 30,00

Пример 8. Применение делеции полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, в штаммах, продуцирующих лизин в большом количестве

(1) Конструирование штамма с делецией полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, в штамме, продуцирующем лизин в большом количестве

Методику гомологичной рекомбинации на основе pK18mobsacB использовали для мутации треонина в положении 311 аспартаткиназы (кодируемой геном lysC) в геноме Corynebacterium glutamicum ATCC13032 в изолейцин, для мутации последовательности центральной области в положениях 279-317 промотора гена пируваткарбоксилазы (кодируемой геном pyc) из CGATGTTTGATTGGGGGAATCGGGGGTTACGATACTAGG в CGGGCCTTGATTGTAAGATAAGACATTTAGTATAATTAG и для мутации последовательности центральной области в положениях 292-300 промотора гена диаминопимелатдегидрогеназы (кодируемой геном ddh) из ATGCATCTC в CCTTGTTAT для конструирования SCgL40 в виде штаммов, продуцирующих лизин в большом количестве. Получали компетентные клетки штамма SCgL40. Плазмиду pK18-SEQ ID NO: 1, как сконструировано выше, трансформировали в этот штамм. Штамм покрывали средой LBHIS, содержащей 5 г/л глюкозы и 25 мкг/мл канамицина, и культивировали при 30°С в течение 6 часов. Затем культуру покрывали средой LB, содержащей 100 г/л сахарозы, для скрининга с получением SCgL31 в виде штамма с делецией полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1.

(2) Влияние делеции полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, на синтез лизина высокопродуктивными штаммами

Для того чтобы проверить, как делеция полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, повлияла на продукцию L-лизина высокопродуктивным штаммом, были проведены ферментационные тесты на SCgL45 и SCgL40, соответственно. Ингредиенты ферментационной среды были следующими (г/л): глюкоза, 80 г/л; дрожжевой порошок, 1 г/л; соевый пептон, 1 г/л; NaCl, 1 г/л; сульфат аммония, 1 г/л; мочевина, 10 г/л; K₂HPO₄×3H₂O, 1 г/л; MgSO₄×7H₂O, 0,45 г/л; FeSO₄×7H₂O, 0,05 г/л; биотин, 0,4 мг/л; витамин B1, 0,1 мг/л; MOPS, 40 г/л; исходный pH 7,2. Штаммы сначала инокулировали в жидкую среду TSB и культивировали в течение 8 часов. Культуры инокулировали в виде посевов в 24-луночный планшет, содержащий 800 мкл ферментационной среды в каждой лунке с первоначальной ОП₆₀₀, контролируемой на уровне около 0,1, и культивировали при 30°С в течение 21 часа. Скорость вращения планшетного шейкера составляла 800 об/мин. Для каждого штамма было установлено по три образца. После ферментации измеряли выход L-лизина и потребление глюкозы и рассчитывали конверсию из глюкозы в сахарную кислоту L-лизина. Ингредиенты среды TSB были следующими (г/л): глюкоза, 5 г/л; дрожжевой порошок, 5 г/л; соевый пептон, 9 г/л; мочевина, 3 г/л; янтарная кислота, 0,5 г/л; K₂HPO₄×3H₂O, 1 г/л; MgSO₄×7H₂O, 0,1 г/л; биотин, 0,01 мг/л; витамин B1, 0,1 мг/л; и MOPS, 20 г/л. Результаты приведены в таблице 3. Как выход лизина, так и конверсии сахарной кислоты штаммов были значительно улучшены после удаления полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1.

Таблица 3. Штаммы Лизин
(г/л) Конверсия
(мМ/М×100 %) SCgL40 6,07 74,07 SCgL45 8,53 122,16

Для того чтобы дополнительно подтвердить эффект, возникающий в результате делеции полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, в высокопродуктивных штаммах, вышеупомянутые два штамма подвергали ферментационным тестам в ферментерах объемом 5 л. Ингредиенты ферментационной среды были следующими (г/л): глюкоза, 60 г/л; меласса, 15 г/л; кукурузная плазма, 1,5 г/л; KCl, 0,5 г/л; сульфат аммония, 20 г/л; фосфорная кислота, 0,5 г/л; сульфат железа, 150 мг/л; сульфат марганца, 150 мг/л; MgSO₄×7H₂O, 1 г/л; биотин, 1 мг/л; витамин B1, 5 мг/л; маточный раствор глюкозы с подпиткой и маточный раствор сульфата аммония. Штаммы сначала активировали в твердой среде TSB, и инокулировали в жидкую среду TSB, и культивировали в течение 12 часов. 200 мл вышеуказанных культур инокулировали в виде посевов в ферментеры объемом 5 л, содержащие 1,8 л ферментационной среды, и ферментировали при 370C в течение 24 часов. Выход L-лизина оценивали во время ферментации. Результаты ферментации показали, что выход лизина штамма SCgL40 после ферментации в течение 24 часов составлял 30 г/л, тогда как выход лизина штамма SCgL45 с делецией полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, достигал 48 г/л, что являлось значительно улучшенным значением.

Праймеры, используемые в настоящих Примерах, перечислены в таблице ниже:

SEQ ID NO Наименование Последовательность (5’-3’) 3 lysC-F1 ATGACATGATTACGAATTCACACTCCTCTGGCTAGGTAG 4 lysC-R1 ATGATGTCGGTGGTGCCGTCT 5 lysC-F2 ACGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCC 6 lysC-R2 GGTCGACTCTAGAGGATCCACGCAGGTGCCTGAGACCTT 7 SEQ ID NO:1-F1 ATGACATGATTACGAATTCATCTCTGTGCACTCATCTAC 8 SEQ ID NO:1-R1 TGCTAATTCCTCGAGCGTGA 9 SEQ ID NO:1-F2 CACGCTCGAGGAATTAGCACGAGCTGGATGCTGCATGAT 10 SEQ ID NO:1-R2 AGTTATTGGTGCCCTTCGATTCCAAAAGTGCAGCCTAGA 11 dCas-F TTCATGCTAATTCCTCGAGCGTGA 12 dCas-R AAACTCACGCTCGAGGAATTAGCA 13 Cas-1 ACAGGTACAGTGTAATTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC 14 Cas-2 TCAGTCACCTCCTAGCTGAC 15 Cas-3 GTCAGCTAGGAGGTGACTGA 16 Cas-4 TGAATTACACTGTACCTGTT

Пример 9. Сравнение гомологий полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, в различных Corynebacteria glutamicum

Выравнивание последовательностей и анализ полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1, проводили на основе базы данных NCBI. Результаты показали, что идентичность последовательности ДНК и идентичность аминокислотной последовательности этого полипептида в различных Corynebacteria glutamicum достигали 98,01 % и 98,56 % или более, соответственно, что указывает на то, что полипептид являлся высококонсервативным в Corynebacterium glutamicum. Кроме того, анализ последовательностей показал, что белок содержал С-концевой домен FhuF (2Fe-2S-содержащая редуктаза железа в цитоплазме Escherichia coli) на С-конце, и этот домен присутствовал во всех гомологичных последовательностях в вышеуказанной Corynebacteria glutamicum. Следовательно, либо делеция, либо ослабление вышеуказанных гомологичных генов в различных Corynebacteria glutamicum способствовали синтезу лизина.

Все документы, упомянутые в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылки, также как каждый из документов включен посредством ссылки по отдельности. Здесь следует понимать, что после ознакомления с содержанием, описанного выше, специалист в данной области техники может вносить различные изменения или модификации в настоящее изобретение, и эти эквиваленты также входят в объем, определенный формулой изобретения, прилагаемой к настоящему изобретению

.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese

Academy of Sciences

<120> МИКРООРГАНИЗМ, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ЛИЗИН, И СПОСОБ

ПРОДУЦИРОВАНИЯ ЛИЗИНА

<130> 6A17-2028701IB

<141> 2021-01-13

<150> 2020100422032

<151> 2020-01-15

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 217

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 1

Met Ser Ile Trp Lys Arg Leu Leu Val Gln Tyr Pro Arg Phe Ala Asp

1 5 10 15

Thr Leu Thr Ala Gly Gln Pro Ile Thr Leu Glu Glu Leu Ala Thr Pro

20 25 30

Glu Val Ile Leu Glu Ala Val Ala Lys Gly Gln Glu Ile Phe Gly Ile

35 40 45

Glu Gln Pro Lys His Ala Ala Gln Leu Trp Phe His Ser Leu Cys Thr

50 55 60

Ala Ile Val Gly Pro Ala Val Thr Ala Met Val Glu Phe Asp Val Ile

65 70 75 80

Pro Ser Leu Asp Ile Arg Arg Gly Gln Leu His Asn Ile Asp Gly Tyr

85 90 95

Trp Phe Gly Phe Arg Pro Glu Glu Met Leu Val Asp Ala Ser Leu His

100 105 110

Leu Ser Gly Thr Gln Phe Gly Glu Ser Ile Arg Val Val Ile Asp Ala

115 120 125

Leu Cys Ala Ala Thr Asp Leu Arg Pro Ala Pro Leu Trp Ala Val Ala

130 135 140

Ser Asp Ala Leu Gly Ile Ala Ala Ser Gly Ala Gly Val Glu Ala Phe

145 150 155 160

Glu Glu Glu His Ala Arg Glu Val Ala Glu Ala Leu Ile Glu Gly Met

165 170 175

Asn Ser Val Asn Ser Val Pro Ser Pro Arg Phe Asn Asp Asp Asp Tyr

180 185 190

Phe Ile Arg Ala Gly Cys Cys Met Ile Phe His Ser Pro Arg Ala Asp

195 200 205

Phe Cys Thr Ser Cys Pro Gln Lys Arg

210 215

<210> 2

<211> 654

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 2

atgagcatct ggaaacgtct gttagtgcag tacccgcgct tcgccgacac cctcacagcc 60

ggccaaccca tcacgctcga ggaattagca accccggaag tgatcttgga agctgttgcc 120

aaaggccaag aaattttcgg cattgagcag ccaaaacatg cagcacaact ctggtttcac 180

tccctgtgca ccgcaattgt cggccccgcc gtcaccgcca tggtggaatt cgatgtcatc 240

cccagcctcg acatacgtcg aggtcagctg cataacatcg acggttactg gttcggcttc 300

aggccggagg agatgcttgt cgacgcctcc ctccacctgt cgggcaccca attcggcgag 360

agtatccgcg tggtgattga tgcattatgc gctgccacgg atctgcgacc ggcacccctg 420

tgggcggttg cctcagatgc gttgggaatc gcagctagcg gcgcaggtgt cgaggccttt 480

gaagaagaac atgcccgcga ggtggcggaa gccctcattg aaggaatgaa tagtgtgaac 540

tcagttccat cgccgcggtt taacgacgac gattatttca ttcgagctgg atgctgcatg 600

attttccact caccacgagc tgatttttgc acgtcgtgcc cacagaagag gtga 654

<210> 3

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 3

atgacatgat tacgaattca cactcctctg gctaggtag 39

<210> 4

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 4

atgatgtcgg tggtgccgtc t 21

<210> 5

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 5

acggcaccac cgacatcatc ttcacctgcc ctcgttcc 38

<210> 6

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 6

ggtcgactct agaggatcca cgcaggtgcc tgagacctt 39

<210> 7

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 7

atgacatgat tacgaattca tctctgtgca ctcatctac 39

<210> 8

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 8

tgctaattcc tcgagcgtga 20

<210> 9

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 9

cacgctcgag gaattagcac gagctggatg ctgcatgat 39

<210> 10

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 10

agttattggt gcccttcgat tccaaaagtg cagcctaga 39

<210> 11

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 11

ttcatgctaa ttcctcgagc gtga 24

<210> 12

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 12

aaactcacgc tcgaggaatt agca 24

<210> 13

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 13

acaggtacag tgtaattcag ttttagagct agaaatagc 39

<210> 14

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 14

tcagtcacct cctagctgac 20

<210> 15

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 15

gtcagctagg aggtgactga 20

<210> 16

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 16

tgaattacac tgtacctgtt 20

<---

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой бактерию Corynebacterium glutamicum, продуцирующую L-лизин, способ конструирования такой бактерии и способ продуцирования L-лизина с использованием такой бактерии. Изобретение позволяет получать L-лизин с высокой степенью эффективности. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 4 табл., 9 пр.

1. Бактерия Corynebacterium glutamicum, продуцирующая L-лизин, где по сравнению со штаммом дикого типа, содержащим эндогенный полипептид, бактерия, продуцирующая L-лизин, имеет по меньшей мере одну из следующих характеристик (i)-(iii):

(i) сниженная или отсутствующая полипептидная активность эндогенного полипептида;

(ii) сниженный или отсутствующий уровень экспрессии кодирующего гена эндогенного полипептида и

(iii) сниженный или отсутствующий уровень экспрессии полинуклеотида, представляющего интерес;

причем указанный эндогенный полипептид представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, или полипептид, кодируемый последовательностью, имеющей по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1; и

указанный полинуклеотид, представляющий интерес, представляет собой полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, или полинуклеотид, кодируемый последовательностью, имеющей по меньшей мере 90% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2.

2. Бактерия, продуцирующая L-лизин, по п. 1, где в указанной бактерии полипептид, имеющий 98 % или более гомологии с полипептидом, представленным в SEQ ID NO: 1, и имеющий домен FhuF на C-конце, является инактивированным.

3. Бактерия, продуцирующая L-лизин, по п. 2, где полипептид, представленный в SEQ ID NO: 1, в бактерии является инактивированным.

4. Бактерия, продуцирующая L-лизин, по п. 2 или 3, где инактивация полипептида означает, что по сравнению с эндогенным полипептидом транскрипция или экспрессия кодирующего гена полипептида снижена по меньшей мере на 30 %, или кодирующий ген полипептида является нокаутированным; или активность полипептида снижена по меньшей мере на 30 %.

5. Бактерия, продуцирующая L-лизин, по любому из пп. 1-4, где по сравнению со штаммом, продуцирующим L-лизин, содержащим эндогенный полипептид, выход L-лизина бактерии, продуцирующей L-лизин, увеличен по меньшей мере на 5 %; и

предпочтительно по сравнению со штаммом, продуцирующим L-лизин, содержащим эндогенный полипептид, бактерия, продуцирующая L-лизин, имеет конверсию глюкозы, увеличенную по меньшей мере на 10 %, в процессе продуцирования L-лизина.

6. Бактерия, продуцирующая L-лизин, по любому из пп. 1-5, где один или более генов, выбранных из группы, состоящей из следующих генов бактерии, продуцирующей L-лизин, являются усиленными или сверхэкспрессированными:

a₁) ген lysC, кодирующий аспартаткиназу, которая ослабляет ингибирование лизина по типу обратной связи;

b₁) ген dapA, кодирующий дигидродипиридинсинтазу, которая ослабляет ингибирование лизина по типу обратной связи;

c₁) ген dapB, кодирующий дигидродипиколинатредуктазу;

d₁) ген ddh, кодирующий диаминопимелатдегидратазу;

e₁) dapD, кодирующий тетрагидродипиколинатсукцинилазу, и dapE, кодирующий

сукцинилдиаминопимелатдеацилазу;

f₁) ген asd, кодирующий аспартат-полуальдегиддегидратазу;

g₁) ген ppc, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксилазу; и

h₁) ген pntAB, кодирующий ниацинамидадениндинуклеотидтрансгидрогеназу;

необязательно один или более генов, выбранных из группы, состоящей из следующих генов бактерии, продуцирующей L-лизин, являются ослабленными, или их экспрессия снижена:

a₂) ген adhE, кодирующий этанолдегидратазу;

b₂) ген ackA, кодирующий ацетаткиназу;

c₂) ген pta, кодирующий фосфатацетилтрансферазу;

d₂) ген ldhA, кодирующий лактатдегидратазу;

e₂) ген focA, кодирующий транспортер формиата;

f₂) ген pflB, кодирующий пируватформиатлиазу;

g₂) ген poxB, кодирующий пируватоксидазу;

h₂) ген thrA, кодирующий аспартаткиназу I/гомосериндегидратазу I в качестве бифункционального фермента;

i₂) ген thrB, кодирующий гомосеринкиназу;

j₂) ген ldcC, кодирующий лизиндекарбоксилазу; и

h₂) ген cadA, кодирующий лизиндекарбоксилазу.

7. Способ конструирования бактерии Corynebacterium glutamicum, продуцирующей L-лизин, включающий стадии:

модификации штамма дикого типа, содержащего эндогенный полипептид, для того, чтобы снизить или обеспечить отсутствие полипептидной активности эндогенного полипептида штамма дикого типа; или

модификации штамма дикого типа, содержащего эндогенный полипептид, для того, чтобы снизить или обеспечить отсутствие уровня экспрессии кодирующего гена эндогенного полипептида штамма дикого типа; или

модификации штамма дикого типа для того, чтобы снизить или обеспечить отсутствие уровня экспрессии полинуклеотида, представляющего интерес, в штамме дикого типа;

где эндогенный полипептид представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, или полипептид, кодируемый последовательностью, имеющей по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:1; и

полинуклеотид, представляющий интерес, представляет собой полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, или полинуклеотид, кодируемый последовательностью, имеющей по меньшей мере 90% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2.

8. Способ конструирования по п. 7, где бактерия является модифицированной, и где полипептид, имеющий 98 % или более гомологии с полипептидом, представленным в SEQ ID NO: 1, и имеющий домен FhuF на C-конце, является инактивированным.

9. Способ по п. 7 или 8, где бактерия является модифицированной, и где полипептид, представленный в SEQ ID NO: 1, является инактивированным.

10. Способ по п. 8 или 9, где инактивация полипептида означает, что по сравнению с эндогенным полипептидом транскрипция или экспрессия кодирующего гена полипептида снижена по меньшей мере на 30 %, или кодирующий ген полипептида является нокаутированным; или

снижение или отсутствие активности полипептида означает, что активность полипептида снижена по меньшей мере на 30 %.

11. Способ по любому из пп. 7-10, дополнительно включающий усиление или сверхэкспрессирование одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из следующих генов, в бактерии:

a₁) ген lysC, кодирующий аспартаткиназу, которая ослабляет ингибирование лизина по типу обратной связи;

b₁) ген dapA, кодирующий дигидродипиридинсинтазу, которая ослабляет ингибирование лизина по типу обратной связи;

c₁) ген dapB, кодирующий дигидродипиколинатредуктазу;

d₁) ген ddh, кодирующий диаминопимелатдегидратазу;

e₁) dapD, кодирующий тетрагидродипиколинатсукцинилазу, и dapE, кодирующий

сукцинилдиаминопимелатдеацилазу;

f₁) ген asd, кодирующий аспартат-полуальдегиддегидратазу;

g₁) ген ppc, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксилазу; и

h₁) ген pntAB, кодирующий ниацинамидадениндинуклеотидтрансгидрогеназу;

необязательно способ конструирования дополнительно включает ослабление одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из следующих генов, в бактерии или снижение экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из следующих генов, в бактерии:

a₂) ген adhE, кодирующий этанолдегидратазу;

b₂) ген ackA, кодирующий ацетаткиназу;

c₂) ген pta, кодирующий фосфатацетилтрансферазу;

d₂) ген ldhA, кодирующий лактатдегидратазу;

e₂) ген focA, кодирующий транспортер формиата;

f₂) ген pflB, кодирующий пируватформиатлиазу;

g₂) ген poxB, кодирующий пируватоксидазу;

h₂) ген thrA, кодирующий аспартаткиназу I/гомосериндегидратазу I в качестве бифункционального фермента;

i₂) ген thrB, кодирующий гомосеринкиназу;

j₂) ген ldcC, кодирующий лизиндекарбоксилазу; и

h₂) ген cadA, кодирующий лизиндекарбоксилазу.

12. Способ продуцирования L-лизина, включающий:

1) культивирование бактерии Corynebacterium glutamicum, продуцирующей L-лизин, по любому из пп. 1-6 или бактерии Corynebacterium glutamicum, продуцирующей L-лизин, сконструированной способом по любому из пп. 7-11, для того, чтобы бактерия, продуцирующая L-лизин, стала продуцировать L-лизин; и

2) необязательно отделение L-лизина из культурального раствора, полученного на стадии 1).