7-ТРИАЗОЛИЛ-ЗАМЕЩЕННЫЕ ГИДРОКСИСПИРОСТАНЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2023 года по МПК C07J71/00 A61K31/58 A61P35/00 

Изобретение относится к новым химическим соединениям, конкретно к 6-кето- и 6β-гидрокси замещенным (3S,5R,6S,7R,22S,25R)-7β-(4-арил-1H-1,2,3-триазол-1-ил)спиростан-3β,5α-диолам, структурной формулы (I),

(I)

обладающим цитотоксичностью в отношении опухолевых клеток человека.

Изобретение относится к области химии и медицины, в частности к средствам химической терапии онкологических заболеваний. Химическая терапия онкологических заболеваний является одной из основных проблем современной медицины, что связано как с недостаточной эффективностью многих препаратов, так и с сопутствующими их применению побочными эффектами. Кроме того, опухолевые клетки, пережившие химиотерапию, нередко проявляют лекарственную устойчивость к широкому спектру препаратов. Таким образом, поиск противоопухолевых агентов новых структурных типов остается важной и актуальной задачей.

Природный стероидный сапогенин диосгенин (25R)-спирост-5-ен-3β-ол) (II) является одним из самых распространенных и доступных растительных стероидов, компонент растений видов Dioscorea, Smilax и Trigonella spp. [M. Satour, A.C. Mitaine-Offer, M.A. Lacaille-Dubois. The Dioscorea genus: a review of bioactive steroidal saponins, J. Nat. Med., 61 (2007) 91-1014; L. Xu, D.K. Xu, Z.Y. Li, Y. Gao, H.J. Chen, Synthesis and potent cytotoxic activity of a novel diosgenin derivative and its phytosomes against lung cancer cells, Beilstein J. Nanotech. 10 (2019) 1933-1942.]. Диосгенин (II) используется как исходное соединение в синтезе стероидных медицинских препаратов таких как преднизолон, норэтистерон, дексаметазон и др. Исследования биологической активности диосгенина (II) показали, что соединение обладает широким спектром противоопухолевой активности на различных опухолевых клетках, проявляя свой эффект путем ингибирования клеточной пролиферации и индукции апоптоза [C. Corbiere, B. Liagre, F. Terro, J.-L. Beneytout, Induction of antiproliferative effect by diosgenin through activation of p53, release of apoptosis-inducing factor (AIF) and modulation of caspase-3 activity in different human cancer cells, Cell Res. 14 (3) (2004) 188-196], и блокированием клеточного цикла [M.-J. Liu, Z. Wang, Y. Ju, R.-S. Wong, Q.-Y. Wu, Diosgenin induces cell cycle arrest and apoptosis in human leukemia K562 cells with the disruption of Ca2+ homeostasis, Cancer Chemother. Pharmacol. 55 (1) (2005) 79-90]. Кроме того, диосгенин (II) обладает противовоспалительной активностью [Y. Chen, X.S. Xu, Y.Y. Zhang, K. Liu, F. Huang, B.L. Liu, J.P. Kou, Diosgenin regulates adipokine expression in perivascular adipose tissue and ameliorates endothelial dysfunction via regulation of AMPK. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 155 (2016) 155-165] и эффективен при лечении сердечно-сосудистых заболеваний [H. Li, W. Huang, Y. Wen, G. Gong, Q. Zhao, G. Yu, Anti-thrombotic activity and chemical characterization of steroidal saponins from Dioscorea zingiberensis C.H. Wright, Fitoterapia 81 (8) (2010) 1147-1156]. Использование диосгенина (II) в качестве терапевтического агента затруднено в связи с низкой растворимостью и биодоступностью [Okawara M., Tokudome Y., Todo H., Sugibayashi K., Hashimoto F. (2014) Effect of betacyclodextrin derivatives on the diosgenin absorption in Caco-2 cell monolayer and rats. Biological & pharmaceutical bulletin; 37: 54-9].

Известны успешные попытки структурной модификации диосгенина (II) для улучшения биологического (противоопухолевого) эффекта. Так, получены гибридные соединения диосгенина и метотрексата (MTX-DG), которые проявили антипролиферативные свойства в отношении метотрексат-резистентных клеток MDA-MB-231 [B.Cai, A. Liao, K.-K. Lee, J.-S. Ban, H.-S. Yang, Y.J. Im, C. Chun. Design, synthesis of methotrexate-diosgenin conjugates and biological evaluation of their effect on methotrexate transport-resistant cells. // Steroids. - 2016. - V 116. - P. 45-51].

Противоопухолевые и апоптозиндуцирующие свойства в отношении линии клеток рака простаты PC показали С(3)-гидрокси-производные диосгенина, включающие остатки индометацина (DG-I) и мефенаминовой кислоты (DG-M) [A. Sethia, P. Singha, N .Yadavb, P. Yadava, M. Banerjeeb, R.P. Singha. Greener approach for synthesis of novel steroidal prodrugs using Ionic liquid, their DFT study and apoptosis activity in prostate cancer cell line. // J. Mol. Struct. - 2019. - V. 1180. - Pp. 733-740].

Коньюгат диосгенина и куркумина (DG-KK), включающий триазольный линкер, ингибировал образование амилоидных β-олигомеров, возникновение которых в нервной ткани сопровождает развитие болезни Альцгеймера [J.E. Chojnacki, K. Liu, J.M. Saathoff, S. Zhang. Bivalent ligands incorporating curcumin and diosgenin as multifunctional compounds against Alzheimer's disease. // Bioorg. Med. Chem. - 2015. - V. 23. - P. 7324-7331].

1,4-Дизамещенные 1,2,3-триазолы диосгенина (DG-N), соединенные с С(3)-гидроксильной группой метиленовым фрагментом показали цитотоксические свойства в отношении линий клеток HBL-100, A549, HT-29, HCT-116 [Masood-ur-Rahman Y. Mohammad, K.M. Fazili, K.A. Bhat, T. Ara, Synthesis and biological evaluation of novel 3-O-tethered triazoles of diosgenin as potent antiproliferative agent, Steroids 118 (2017) 1-8.].

В работах [M.E. Mironov, O.S. Oleshko, M.A. Pokrovskii, T.V. Rybalova, V.K. Pechurov, A.G. Pokrovskii, S.V Cheresis, S.V Mishinov, V.V. Stupak, E.E. Shults. 6-(4'-Aryl-1',2',3'-triazolyl)-spirostan-3,5-diol and 6-(4'-Aryl-1',2',3'-triazolyl)-7-hydroxy-1,4-spirostadien-3-one: Synthesis and analysis of their cytotoxicity // Steroids. 2019. V. 151. Article N 108460; M.E. Mironov, T.V. Rybalova, M.A. Pokrovskii, F. Emaminia, E.R. Gandalipov, A.G. Pokrovskii, E.E. Shults. Synthesis of fully functionalized spirostanic 1,2,3-triazoles by the three component reaction of diosgenin azides with acetophenones and aryl aldehydes and their biological evaluation as antiproliferative agents // Steroids. 2023. V. 190. Article N 109133] мы показали, что соединения, полученные модификацией диосгенина (II) с введением триазольного фрагмента в положение С-6 и гидроксильных групп в положение С-5 и С-7 обладали цитотоксичностью в отношении клеточных линий рака груди MDA-MB-231, BT-474 или MCF-7, а также подавляли рост клеточных линий глиобластомы (U-87MG, SNB-19, T98G).

Модификация с введением в структуру одновременно триазольного фрагмента и гидроксильной группы представляет значительные перспективы для получения противоопухолевых агентов, в том числе ингибиторов роста клеточных линий глиобластомы.

Диосгенин (II) выбран в качестве исходного соединения и аналога по строению и свойствам.

Задачей изобретения является создание нового эффективного средства, обладающего противоопухолевым действием. Поставленная задача решается новыми химическими соединениями - 6-кето- и 6β-гидрокси замещенными (3S,5R,6S,7R,22S,25R)-7β-(4-арил-1H-1,2,3-триазол-1-ил)спиростан-3β,5α-диолами, структурной формулы (Ia-с).

Соединения (Ia-с) синтезировали по схеме 1 из спиростанового трибромида (III), синтез которого из диосгенина (II) проводили по методикам, описанным в [A.M. Dawidar, A.A. Saleh, M.M. Abdel-Malek. Hydroxylation of Δ⁵-steroids with N-bromosuccinimide to 5α,6β-diol. J. Natursch. 1980, 35B, 102-106; A.Z. Castro, J.E. Tacoronte, F.C. Manchado, L. A. de la Paz, M.T. Cabrera, Ecdysteroid analogs based on steroidal sapogenins I. Synthesis of bromo-derivatives from diosgenin. Preliminary study of their biological activity. Revista CENIC Ciencias Químicas, 2002, Vol. 33, No. 1, P. 19-24].

По предлагаемому методу реакцией трибромида (III) c азидом натрия при перемешивании в ДМФА при комнатной температуре синтезировали стероидный азид (IV) (выход 96%). Взаимодействие азида (IV) с арилацетиленами (Va,b) в присутствии иодида меди и диизопропилэтиламина приводило к 3β-О-Ацетил-23,23-дибром-5α-гидрокси-7β-(4-арил-1H-1,2,3-триазол-1-ил)спиростан-6-онам (VIa,b) (выход 79-86%). Дегалогенирование цинком в уксусной кислоте давало спиростановые триазолы (VIIa,b) (выход 79-97%). 3-Гидроксипроизводные 5α-гидрокси-7β-(4-арил-1H-1,2,3-триазол-1-ил)спиростан-6-онов (Ia,b) получали действием 5N водн. раствора щелочи (выход 71-72%). Последующее восстановление 7-триазолил-6-кетоспиростандиола (Ia) боргидридом натрия позволило синтезировать триазолозамещенный спиростановый триол (Ic) (выход 94%) (схема 1).

Биологическая активность соединений (Ia-с) изучалась путем определения способности к подавлению роста опухолевых клеток.

Цитотоксическую активность устанавливали путем определения GI₅₀ - доза, ингибирующая жизнеспособность опухолевых клеток на 50%. Использовали клеточные линии глиобластомы SNB-19, T-98-G и для сравнения использовали клетки MCF-7 (рак молочной железы). Для определения GI₅₀ использовали стандартный МТТ тест, как описано в рекомендациях [Mosmann Т. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J Immunol Methods, 1983, v. 16 (1), p. 55-63; Wilson J.K., Sargent J.M., Elgie A.W., Hill J.G., Taylor C.G. A feasibility study of the MTT assay for chemosensitivity testing in ovarian malignancy // Br. J. Cancer, 1990, v. 62 (2), p. 189-194]. По результатам трех независимо проведенных экспериментов рассчитывали средние значения МИК и стандартная погрешность (M±SEM). Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ “Statistika 8.0”, уровень достоверности определяли по t-критерию Стьюдента. Результаты изучения цитотоксичности приведены в таблице 1.

Из данных таблицы следует, что соединения (Ia-с) обладают значительной цитотоксичностью в отношении трех опухолевых клеточных линий. Цитотоксичность новых соединений в отношении опухолевых клеток человека превышала значение для исходного природного соединения диосгенина (II). При этом, 6-кетопроиводные (Ia,b) обладали наибольшей цитотоксичностью в отношении клеточной линии рака молочной железы MCF-7 (GI₅₀=3.5-3.8 μM) и была выше, чем у препарата сравнения доксорубицина. Восстановление 6-кето-группы до гидроксильной группы (соединение Ic) сопровождалось увеличением цитотоксичности в отношении клеточных линий глиобластомы (GI₅₀=5.8-11 μM). Активность соединения Ic на линии глиобластомы была аналигична активности применяемого в медицине препарата доксорубицин.

Таким образом, соединения (Ia-с), получаемые из доступного растительного спиростанола диосгенина (II). подавляют рост опухолевых клеток человека, в том числе клеточных линий глиобластомы. Указанная модификация

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Методика получения (3S,5R,6S,7R,22S,25R)-6-кето-7β-(4-фенил-1H-1,2,3-триазол-1-ил)спиростан-3β,5α-диола (Ia).

1) Синтез (3S,5R,7R,22S,25R)-7β-азидо-23,23-дибром-5α-гидроксиспиростан-6-он-3β-ил ацетата (IV). К раствору 3.74 г (5.15 ммоль) (3S,5R,7S,22S,25R)-7α,23,23-трибром-5α-гидроксиспиростан-6-он-3β-ол ацетата (III) в 20 мл ДМФА добавили 0.674 г (10.40 ммоль) NaN₃. Перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в токе аргона 8 ч, после чего продукт экстрагировали 50 мл EtOAc и промыли насыщенным водным раствором NaCl (50 мл×7). Органическую фазу сушили MgSO₄, растворитель удалили в вакууме, остаток хроматографировали на силикагеле (20:1), элюент - хлороформ. Получили 3.403 г (4.95 ммоль) соединения (IV) в виде аморфного желтого твердого вещества. Выход 96%. Т.пл. 145°С. -84.96 (с 0.23, CHCl₃). ИК-спектр (KBr, ν, см^-1): 3446 (O-H), 2104 (N₃), 1730 (С=O), 2955, 2933, 2876, 1379 (C-H), 1045 (C-O-C). Спектр ЯМР ¹Н (400 MHz, CDCl₃), δ_H (J, Hz): 0.81 (3H, с, H-19), 0.83 (3H, д, J=6.72, H-27), 1.00 (3H, c, H-18), 1.22 (1H, м, H-1), 1.26 (3H, д, J=6.85, H-21), 1.37 (1H, т.д, J=12.76, 2.82, H-2), 1.55 (4H, м, H-2,11,12,14), 1.67 (2H, д.д, J=12.63, 6.31, H-15), 1.73 (1H, д.д, J=14.78, 6.04, H-11), 1.83 (4H, м, H-1,8,12, 17), 1.92 (2H, м, H-4,4), 2.00 (3H, c, OC(O)CH₃), 2.05 (1H, м, H-9), 2.35 (2H, m, H-15, 25), 2.55 (1H, д.д, J=13.84, 2.55, H-24), 2.65 (1H, д.д, J=13.70, 11.69, H-24), 2.79 (1H, кв, J=6.58, H-20), 3.37 (1H, c, H-OH), 3.47 (1H, т, J=11.28, H-26), 3.57 (1H, д.д, J=10.21, 4.43, H-26), 4.25 (1H, д, J=10.61, H-7), 4.39 (1H, д.д, J=15.72, 7.25, H-16), 4.99 (1H, м, H-3) м.д. Спектр ЯМР ¹³С (125 МГц, CDCl₃), δ_C: 14.05 (C-19), 15.43 (C-27), 16.79 (C-18), 18.11 (C-21), 21.37 (C-C(O)CH₃), 21.40 (C-2), 26.15 (C-12), 29.81 (C-11), 30.41 (C-25), 32.56 (C-4), 33.39 (C-15), 39.65 (C-1), 39.80 (C-20), 42.28 (C-8), 42.30 (C-10), 43.12 (C-13), 43.60 (C-9), 52.59 (C-24), 55.20 (C-14), 63.25 (С-17), 65.60 (C-26), 66.72 (C-7), 70.08 (C-3), 70.51 (C-23), 80.44 (C-5), 80.80 (C-16), 109.23 (C-22), 171.34 (C-C(O)CH₃), 206.07 (C-6) м.д. Масс-спектр, m/z (I_отн., %): 685 (4), 80 (100), 82 (99), 581 (49), 18 (49), 79 (46), 81 (46), 420 (42), 583 (35), 91 (29), 422 (27). Найдено: m/z 685.1346 [M]⁺. Рассчитано для C₂₉H₄₁N₃Br₂O₆: М=685.1357.

2) (3S,5R,7R,22S,25R)-3β-О-Ацетил-23,23-дибром-5α-гидрокси-7β-(4-фенил-1H-1,2,3-триазол-1-ил)спиростан-6-он (VIa). К раствору 1.63 г (2.37 ммоль) соединения (IV) и 0.26 мл (2.37 ммоль) фенилацетилена (Va) в 10 мл ДМФА добавили 0.090 г (0.47 ммоль) CuI и 0.08 мл (0.47 ммоль) (i-Pr)₂NEt. Перемешивали реакционную смесь 8 ч при температуре масляной бани 90°С, охлаждали и экстрагировали 30 мл EtOAc и промыли насыщенным водным раствором NaCl (20 мл×7). Органическую фазу сушили MgSO₄, растворитель удалили в вакууме, остаток хроматографировали на силикагеле (20:1), элюент - хлороформ - метанол (100:1). Получили 1.599 г (2.03 ммоль) соединения (VIa) в виде аморфного желто-коричневого твердого вещества. Выход 86%. Т.пл. 200-203°С. -95.90 (с 0.32, CHCl₃). ИК-спектр (KBr, ν, см^-1): 3419 (O-H), 1734 (C=O), 2955, 2931, 2875, 1379 (C-H), 1049 (C-O-C). Спектр ЯМР ¹Н (400 MHz, CDCl₃), δ_H (J, Hz): 0.77 (3H, д, J=6.58, H-27), 0.90 (3H, c, H-19), 0.92 (3H, c, H-18), 1.18 (2H, м, H=15,15), 1.26 (3H, д, J=6.85, H-21), 1.26-1.47 (3H, м, H-1,2,12), 1.62 (3H, м, H-2,4,11), 1.71-1.85 (5H, м, H-1,4,11,14, 17), 1.96 (4H, м, H-12,OC(O)CH₃), 2.29 (2H, м, H-8,25), 2.41 (1H, д.д, J=13.83, 2.55, H-24), 2.47 (1H, м, H-9), 2.53 (1H, д.д, J=13.57, 11.82, H-24), 2.67 (1H, кв., J=6.45, H-20), 3.34 (1H, т, J=11.28, H-26), 3.49 (1H, д.д, J=10.75, 4.57, H-26), 4.17 (1H, д.д, J=15.31, 7.52, H-16), 5.27 (1H, м, H-3), 6.43 (1H, м, H-7), 6.93 (1H, уш.с, H-OH), 7.30 (1H, т, J=7.39, H-4''), 7.39 (2H, т, J=7.66, H-3'',5''), (1H, с, H-5'), 7.75 (2H, д, J=7.52, H-2'',6'') м.д. Спектр ЯМР ¹³С (125 МГц, CDCl₃), δ_C: 14.17 (C-19), 15.30 (C-27), 16.55 (C-18), 18.06 (C-21), 21.24 (С-C(O)CH₃), 21.41 (C-2), 26.42 (C-12), 29.97 (C-11), 30.26 (C-15), 30.33 (C-25), 32.43 (C-4), 39.22 (С-1), 39.48 (C-20), 42.65 (C-10), 43.16 (C-13), 43.85 (C-8,9), 52.22 (C-24), 54.27 (C-14), 62.85 (C-17), 65.36 (C-26), 68.50 (C-7), 70.14 (C-3), 70.52 (C-23), 80.07 (C-5), 80.26 (C-16), 108.87 (C-22), 120.24 (С-5'), 125.80 (C-3'',5''), 128.19 (C-4''), 128.83 (C-2'',6''), 129.79 (C-1''), 146.63 (C-4'), 170.66 (С-C(O)CH₃), 203.61 (C-6) м.д. Масс-спектр, m/z (I_отн., %): 787 (7), 43 (100), 145 (54), 91 (47), 105 (40), 629 (35), 116 (33), 762 (32), 95 (30), 80 (28). Найдено: m/z 787.1818 [M]⁺. Рассчитано для C₃₇H₄₇N₃Br₂O₆: М=787.1826.

3) (3S,5R,7R,22S,25R)-3β-O-Ацетил-5α-гидрокси-7β-(4-фенил-1H-1,2,3-триазол-1-ил)-спиростан-6-он (VIIa). К раствору 0.93 г (1.18 ммоль) соединения (VIa) в 15 AcOH прибавили 2.5 г (39.68 ммоль) цинковой пыли, кипятили реакционную смесь 3 ч. Профильтровали реакционную смесь через бумажный фильтр, экстрагировали EtOAc (40 мл), последовательно промыли H₂O (40 мл), насыщенным водным раствором NaHCO₃ (2×40 мл), водой (2×40 мл), органическую фазу сушили MgSO₄. Осушитель отфильтровали и упарили в вакууме, остаток хроматографировали на силикагеле (20:1), элюент - хлороформ. Получили 0.586 г (79%) соединения (VIIa) в виде аморфного желтого твердого вещества. Т.пл. 179°С. -70.59 (с 0.32, CHCl₃). ИК-спектр (KBr, ν, см^-1): 3437 (O-H), 1734 (C=O), 2950, 2929, 2874, 1379 (C-H), 1049 (C-O-C). Спектр ЯМР ¹Н (600 MHz, CDCl₃), δ_H (J, Hz): 0.69 (3H, c, H-18), 0.71 (3H, д, J=6.06, H-27), 0.88 (3H, c, H-19), 0.92 (3H, д, J=5.65, H-21), 1.24-1.43 (7H, м, H-1,2,12,15,15,23,24), 1.48-1.62 (6H, м, H-2,4,11, 23,24, 25), 1.76 (5H, м, H-1,4,14,17,20), 1.92 (3H, c, H-C(O)CH₃), 1.98 (2H, м, H-11,12), 2.22 (1H, м, H-8), 2.49 (1H, м, H-9), 3.23 (1H, т, J=10.90, H-26), 3.39 (1H, д, J=8.48, H-26), 4.23 (1H, м, H-16), 5.22 (1H, м, H-3),6.44 (1H, м, H-7), 6.97 (1H, м, H-OH), 7.27 (1H, т, J=7.67, H-4''), 7.36 (2H, т, J=7.27, H-3'',5''), 7.62 (1H, c, H-7'), 7.72 (2H, т, J=7.27, H-2'',6'') м.д. Спектр ЯМР ¹³С (150 МГц, CDCl₃), δ_C: 14.27 (C-19), 14.38 (C-21), 16.38 (C-18), 17.02 (C-27), 21.42 (C-2), 21.50 (С-C(O)CH₃), 26.47 (C-12), 28.63 (C-24), 30.05 (С-11), 30.20 (С-25), 30.63 (C-15), 31.13 (C-23), 32.48 (C-4), 39.43 (C-1), 41.56 (C-20), 41.99 (C-13), 42.70 (C-10), 44.00 (C-8,9), 54.52 (C-14), 61.05 (C-17), 66.72 (C-26), 68.52 (C-7), 70.28 (C-3), 80.10 (C-5), 80.36 (C-16), 108.99 (C-22), 120.14 (C-5'), 125.65 (C-3'',5''), 128.11 (C-4''), 128.81 (C-2'',6''), 129.91 (C-1''), 146.60 (C-4'), 170.59 (C С-C(O)CH₃), 203.72 (C-6) м.д. Масс-спектр, m/z (I_отн., %): 631 (2), 543 (100), 603 (94), 544 (50), 605 (38), 489 (26), 533 (20), 473 (16), 517 (16), 515 (14). Найдено: m/z 631.3645 [M]⁺. Рассчитано для C₃₇H₄₉N₃O₆: М=631.3616.

4) (3S,5R,7R,22S,25R)-3β,5α-Дигидрокси-7β-(4-фенил-1H-1,2,3-триазол-1-ил)спиростан-6-он (Ia). К раствору 0.586 г (0.93 ммоль) соединения (VIIa) в 15 мл MeOH и 5 мл CH₂Cl₂ прибавили 5.42 мл 5N водного раствора NaOH. Перемешивали реакционную смесь 4 ч, экстрагировали 50 мл EtOAc, трижды промыли 50 мл насыщенного водного раствора NaCl, органическую фазу сушили MgSO₄. Осушитель отфильтровали, растворитель упарили в вакууме, остаток хроматографировали на силикагеле (20:1), элюент - смесь хлороформа и метанола (100:1). В результате получили 0.396 г (0.67 ммоль) белого аморфного соединения (Ia). Выход: 72%. Т.пл. 325-326°С. -64.71 (с 0.14, CHCl₃). ИК-спектр (KBr, ν, см^-1): 3491 (O-H), 1722 (C=O), 2949, 2929, 2872, 1371 (C-H), 1051 (C-O-C). Спектр ЯМР ¹Н (500 MHz, CDCl₃-CD₃OD), δ_H (J, Hz): 0.69 (3H, c, H-18), 0.71 (3H, д, J=6.06, H-27), 0.88 (3H, c, H-19), 0.92 (3H, д, J=5.65, H-21), 1.24-1.43 (7H, м, H-1,2,12,15,15,23,24), 1.48-1.62 (6H, м, H-2,4,11, 23,24, 25), 1.76 (5H, м, H-1,4,14,17,20), 1.92 (3H, c, H-C(O)CH₃), 1.98 (2H, м, H-11,12), 2.22 (1H, м, H-8), 2.49 (1H, м, H-9), 3.23 (1H, т, J=10.90, H-26), 3.39 (1H, д, J=8.48, H-26), 4.23 (1H, м, H-16), 5.22 (1H, м, H-3),6.44 (1H, м, H-7), 6.97 (1H, м, H-OH), 7.27 (1H, т, J=7.67, H-4''), 7.36 (2H, т, J=7.27, H-3'',5''), 7.62 (1H, c, H-7'), 7.72 (2H, т, J=7.27, H-2'',6'') м.д. Спектр ЯМР ¹³С (125 МГц, CDCl₃-CD₃OD), δ_C: 14.26 (C-19,21), 16.32 (C-18), 16.90 (C-27), 21.43 (C-2), 28.52 (C-24), 29.66 (C-12), 30.04 (С-25), 30.20 (C-11), 30.77 (C-15), 31.01 (C-23), 35.64 (C-4), 39.41 (C-1), 41.47 (C-20), 41.92 (C-13), 42.46 (C-10), 44.10 (C-8,9), 54.72 (C-14), 60.90 (C-17), 66.27 (C-3), 66.71 (C-26), 68.25 (C-7), 80.00 (C-5), 80.35 (C-16), 109.16 (C-22), 120.05 (C-5'), 125.75 (C-3'',5''), 128.32 (C-4''), 128.79 (C-2'',6''), 130.01 (C-1''), 147.28 (C-4'), 204.69 (C-6) м.д. Масс-спектр, m/z (I_отн., %): 589 (38), 561 (100), 91 (72), 116 (44), 105 (44), 93 (43), 69 (40), 81 (40), 562 (39), 589 (38). Найдено: m/z 589.3512 [M]⁺. Рассчитано для C₃₅H₄₇N₃O₅: М=589.3510.

Пример 2. Методика получения (3S,5R,6S,7R,22S,25R)-6-кето-7β-(4-пиридин-2-ил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)спиростан-3β,5α,6β-триола (Ib).

1) Исходное соединение (IV) получали из (III) в условиях примера 1.

2) (3S,5R,7R,22S,25R)-3β-О-Ацетил-23,23-дибром-5α-гидрокси-7β-[4-(пиридин-2-ил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил]спиростан-6-он- (VIb). К раствору 0.544 г (0.79 ммоль) соединения (IV) и 0.082 г (0.79 ммоль) 2-этитнлпиридина (Vb) в 10 мл ДМФА добавили 0.030 г (0.16ммоль) CuI и 0.027 мл (0.16ммоль) (i-Pr)₂NEt. Перемешивали реакционнуюсмесь 8 ч при температуре масляной бани 90°С, охлаждали и экстрагировали 30 мл EtOAc и промыли насыщенным водным раствором NaCl (20 мл×7). Органическую фазу сушили MgSO₄, растворитель удалили в вакууме, остаток хроматографировали на силикагеле (20:1), элюент - хлороформ - метанол (100:1). Получили 0.493 г (0.63 ммоль) соединения (VIb) в виде аморфного желто-коричневого твердого вещества. Выход 79%. Т.пл. 235°С (разл.)-86.01 (с 0.23, CHCl₃). ИК-спектр (KBr, ν, см^-1): 3434 (O-H), 1734 (C=O), 2956, 2933, 2875, 1379 (C-H), 1049 (C-O-C). Спектр ЯМР ¹Н (400 MHz, CDCl₃), δ_H (J, Hz): 0.78 (3H, д, J=6.50, H-27), 0.93 (3H, c, H-19), 0.96 (3H, c, H-18), 1.24 (2H, м, H=15,15), 1.25 (3H, д, J=6.77, H-21), 1.32-1.56 (3H, м, H-1,2,12), 1.63 (2H, м, H-2,11), 1.74 м (2H, м, H-14,17), 1.78-1.92(3H,м, Н-1,4,4), 1.98 (5Н, м, Н-11,12,OC(O)CH₃), 2.30 м (2Н, м, Н-8,25), 2.42 (1Н, д.д, J=13.67, 3.45, H-24), 2.45 (1Н, м, Н-9), 2.50 (1H, д.д, J=13.73, 11.61, H-24), 2.68 (1H, кв., J=6.50, H-20), 3.34 (1H, т, J=11.21, H-26), 3.49 (1H, д.д, J=10.61, 4.58, H-26),4.19 (1H, д.д, J=15.19, 7.43, H-16), 5.33 (1H, м, H-3), 6.23 (1Н, уш.с, Н-ОН), 6.40 (1H, м, H-7), 7.22 (1H, д.д, J=6.70, 5.04, H-4''), 7.79 (1H, т.д., J=7.83, 1.66, H-5''), 8.04 (1H, д, J=7.43, H-6''), 8.08 (1H, c, H-5') 8.57 (1H, д, J=4.11, H-3''). м.д. Спектр ЯМР ¹³С (100 МГц, CDCl₃), δ_C: 14.16 (C-19), 15.34 (C-27), 16.85 (C-18), 18.09 (C-21), 21.29 (С-C(O)CH₃), 21.38 (C-2), 26.47 (C-12), 29.96 (C-11), 30.37 (C-15), 30.54 (C-25), 32.79 (C-4), 39.39 (С-1), 39.54 (C-20), 42.53 (C-10), 43.22 (C-13), 43.91 (C-8,9), 52.36 (C-24), 54.57 (C-14), 62.94 (C-17), 65.45 (C-26), 68.58 (C-7), 69.90 (C-3), 70.41 (C-23), 80.20 (C-5), 80.39 (C-16), 108.99 (C-22), 120.09 (C-6''), 122.80 (C-5'), 123.03 (С-4''), 137.21 (C-5''), 147.54 (C-4'), 149.45 (C-3''), 149.59 (C-1''), 170.74 (С-C(O)CH₃), 202.86 (C-6) м.д. Масс-спектр, m/z (I_отн., %):788 (48), 82 (100), 790 (91), 104 (54), 118 (52), 792 (52), 628 (49), 789 (48), 93 (45), 131 (42). Найдено: m/z 788.1768 [M]⁺. Рассчитано для C₃₆H₄₆N₄Br₂O₆: М=788.1779.

3) (3S,5R,7R,22S,25R)-3β-О-Ацетил-5α-гидрокси-7β-[4-(пиридин-2-ил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил]спиростан-6-он (VIIb). Краствору 0.320 г (0.41 ммоль) соединения (VIb) в 15 AcOH прибавили 2.640 г (40.62 ммоль) цинковой пыли, кипятили реакционную смесь 3 ч. Профильтровали реакционную смесь через бумажный фильтр, экстрагировали EtOAc (30 мл), последовательно промыли H₂O (30 мл), насыщенным водным раствором NaHCO₃ (2×30 мл), водой (2×30 мл), органическую фазу сушили MgSO₄. Осушитель отфильтровали и упарили в вакууме, остаток хроматографировали на силикагеле (20:1), элюент - хлороформ. Получили 0.249 г (97%) соединения (VIIb) в виде аморфного желтого твердого вещества. Т.пл. 209°С (разл.). -88.90 (с 0.23, CHCl₃). ИК-спектр (KBr, ν, см^-1): 3435 (O-H), 1734 (C=O), 2951, 2874, 1367 (C-H), 1039 (C-O-C). Спектр ЯМР ¹Н (500 MHz, CDCl₃), δ_H (J, Hz): 0.68 (6H, м, H-18,27), 0.85 (3H, c, H-19), 0.90 (3H, д, J=4.35, H-21), 1.22-1.84 (18H, м, H-1,1,2,2,4,4,11,12,14,15,15,17,20,23,23,24,24,25), 1.91 (3H, c, H-C(O)CH₃), 1.95 (2H, м, H-11,12), 2.27 (1H, м, H-8), 2.47 (1H, м, H-9), 3.19 (1H, т, J=10.71, H-26), 3.37 (1H, д, J=8.03, H-26), 4.22 (1H, м, H-16), 5.31 (1H, м, H-3), 6.39 (1H, д, J=9.87, H-7), 6.75 (1H, м, H-OH), 7.16 (1H, м, H-4''), 7.73 (1H, т, J=6.86, H-5''), 7.94 (1H, м, H-6''), 8.04 (1H, c, H-5'), 8.51 (1H, м, H-3'') м.д. Спектр ЯМР ¹³С (150 МГц, CDCl₃), δ_C: 14.07 (C-19), 14.31 (C-21), 16.42 (C-18), 16.98 (C-27), 21.32 (C-2), 21.39 (С-C(O)CH₃), 26.40 (C-12), 28.55 (C-24), 29.91 (С-11), 30.07 (С-25), 30.69 (C-15), 30.92 (C-23), 32.63 (C-4), 39.40 (C-1), 41.41 (C-20), 41.86 (C-13), 42.45 (C-10), 43.61, 43.88 (C-8,9), 54.54 (C-14), 60.86 (C-17), 66.64 (C-26), 68.47 (C-7), 70.05 (C-3), 79.95 (C-5), 80.32 (C-16), 109.01 (C-22), 119.93 (C-6''), 122.55 (C-5'), 122.86 (C-4''), 137.11 (C-5''), 147.16 (C-4'), 149.27 (C-3''), 149.37 (C-1''), 170.64 (C С-C(O)CH₃), 202.99 (C-6) м.д. Масс-спектр, m/z (I_отн., %): 632 (84), 518 (100), 139 (46), 633 (33), 519 (33), 490 (33), 489 (28), 393 (23), 147 (22), 93 (22). Найдено: m/z 632.3565 [M]⁺. Рассчитано для C₃₆H₄₈N₄O₆: М=632.3568.

4) (3S,5R,7R,22S,25R)-3β,5α-Дигидрокси-7β-[4-(пиридин-2-ил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил]-спиростан-6-он (Ib). К раствору 0.186 г (0.29 ммоль) соединения (VIIb) в 6 мл MeOH и 2 мл CH₂Cl₂ прибавили 0.242 мл 5N водного раствора NaOH. Перемешивали реакционную смесь 4 ч, экстрагировали 30 мл EtOAc, трижды промыли 30 мл насыщенного водного раствора NaCl, органическую фазу сушили MgSO₄. Осушитель отфильтровали, растворитель упарили в вакууме, остаток хроматографировали на силикагеле (20:1), элюент - смесь хлороформа и метанола (100:1). В результате получили 0.123 г (0.21 ммоль) белого аморфного соединения (Ia). Выход: 71%. Т.пл. 294°С (разл.). -61.06 (с 0.23, CHCl₃). ИК-спектр (KBr, ν, см^-1): 3414 (O-H), 1734 (C=O), 2951, 2929, 2872, 1381 (C-H), 1053 (C-O-C). Спектр ЯМР¹Н (500 MHz, CDCl₃), δ_H (J, Hz): 0.70 (3H, д, J=6.36, H-27), 0.74 (3H, c, H-18), 0.89 (3H, c, H-19), 0.92 (3H, д, J=6.53, H-21), 1.21-1.89 (20H, м, H-1,1,2,2,4,4, 11,11,12,12,14,15,15,17,20,23,23,24,24,25), 2.32 (1H, м, H-8), 2.44 (1H, м, H-9), 3.20 (1H, т, J=11.04, H-26), 3.39 (1H, д, J=8.48, H-26), 4.07 (1H, м, H-3), 4.23 (1H, д.д, J=14.72, 7.53, H-16), 6.14 (1H, м, H-7), 7.22 (1H, д.д, J=6.53, 5.02, H-4''), 7.79 (1H, т.д, J=7.70, 1.34, H-5''), 8.12 (1H, c, H-5'), 8.14 (1Н, д, J=8.03, H-6''), 8.56 (1H, д, J=4.68, H-3'') м.д. Спектр ЯМР ¹³С (125 МГц, CDCl₃-CD₃OD), δ_C: 14.07 (C-19), 14.31 (C-21), 16.42 (C-18), 16.98 (C-27), 21.32 (C-2), 21.39 (С-C(O)CH₃), 26.40 (C-12), 28.55 (C-24), 29.91 (С-11), 30.07 (С-25), 30.69 (C-15), 30.92 (C-23), 32.63 (C-4), 39.40 (C-1), 41.41 (C-20), 41.86 (C-13), 42.45 (C-10), 43.61, 43.88 (C-8,9), 54.54 (C-14), 60.86 (C-17), 66.64 (C-26), 68.47 (C-7), 70.05 (C-3), 79.95 (C-5), 80.32 (C-16), 109.01 (C-22), 119.93 (C-6''), 122.55 (C-5'), 122.86 (C-4''), 137.11 (C-5''), 147.16 (C-4'), 149.27 (C-3''), 149.37 (C-1''), 202.99 (C-6) м.д. Масс-спектр, m/z (I_отн., %): 590 (85), 55 (100), 475 (84), 69 (72), 104 (59), 118 (59), 93 (49), 139 (47), 447 (43), 81 (42). Найдено: m/z 590.3469 [M]⁺. Рассчитано для C₃₄H₄₆N₄O₅: М=590.3463.

Пример 3. Методика получения (3S,5R,6S,7R,22S,25R)-7β-(4-фенил-1H-1,2,3-триазол-1-ил)спиростан-3β,5α,6β-триола (Ic).

(3S,5R,6S,7R,22S,25R)-7β-(4-Фенил-1H-1,2,3-триазол-1-ил)спиростан-3β,5α,6β-триол (Ic). К охлажденному до 0°С раствору 0.188 г (0.32 ммоль) соединения (Ia) в 20 мл метанола прибавили 0.251 г (6.79 ммоль) NaBH₄. Реакционную смесь перемешивали при температуре 0°С 2 ч, затем еще 2 ч при комнатной температуре после чего экстрагировали 20 мл EtOAc, промыли насыщенным водным раствором NaCl (20 мл×3), органическую фазу сушили MgSO₄. Осушитель отфильтровали, растворитель упарили в вакууме, остаток хроматографировали на силикагеле (20:1), элюент - смесь хлороформа и метанола (100:1). В результате получили 0.177 г (0.096 ммоль) соединения (I) в виде белого аморфного твердого вещества. Выход: 94%. Т.пл. 271°С.-38.23 (с 0.36, CHCl₃). ИК-спектр (KBr, ν, см^-1): 3431 (O-H), 2949, 2929, 2872, 1379 (C-H), 1051 (C-O-C). Спектр ЯМР ¹Н (600 MHz, CDCl₃), δ_H (J, Hz): 0.65 (3H, д, J=6.04, H-27), 0.68 (2H, м, H-15,15), 0.71 (3H, c, H-18), 0.86 (3H, д, J=6.58, H-21), 1.21 (5H, c, H-1,19,24), 1.35-1.52 (10H, м, H-2,2,4,11,12,12,14,23,24,25,), 1.57-1.70 (5H, м, H-1,9,11,17,20), 1.77 (1H, м, H-4), 1.99 (1H, уш.с, H-OH), 2.03 (1H, т, J=12.09, H-23), 2.33 (1H, к, J=10.61, H-8), 2.63 (1H, уш.с, H-OH), 3.15 (1H, т, J=10.88, H-26), 3.31 (2H, м, H-6,26), 4.06 (2H, м, H-3,16), 5.08 (1H, д, J=11.69, H-7), 7.27 (1H, т, J=6.98, H-4''), 7.32 (2H, т, J=6.98, H-3'',5''), 7.65 (2H, д, J=7.39, H-2'',6''), 7.97 (1H, c, H-5') м.д. Спектр ЯМР ¹³С (100 МГц, CDCl₃-CD₃OD), δ_C: 14.27 (C-21), 16.49 (C-18), 16.89 (C-27), 17.14 (С-19), 20.94 (C-2), 28.43 (C-24), 30.05 (С-25), 30.32 (C-4), 30.95 (С-12), 31.26 (C-15), 32.47 (C-11), 35.82 (С-8), 37.78 (С-10), 39.88 (С-1), 40.25 (С-23), 41.47 (С-20), 41.49 (С-13), 45.33 (С-9), 53.85 (С-14), 60.79 (С-17), 64.28 (С-7), 66.64 (С-26), 67.03 (С-3), 75.86 (С-5), 76.83 (С-6), 80.56 (С-16), 109.12 (С-22), 121.29 (С-5'), 125.42 (C-3'',5''), 128.02 (C-4''), 128.79 (2'',6''), 130.25 (C-1''), 146.54 (C-4') м.д. Масс-спектр, m/z (I_отн., %): 591 (18), 139 (100), 69 (54), 81 (38), 91 (35), 69 (34), 95 (30), 79 (28), 105 (25), 117 (24). Найдено: m/z 591.3664 [M]⁺. Рассчитано для C₃₅H₄₉N₃O₅: М=591.3667.

Пример 4. Определение ингибирующей активности (цитотоксичности) новых соединений в отношении роста опухолевых клеток человека. Культуры клеток. В работе использовали линии опухолевых клеток человека SNB-19, T98G (линии глиобластомы) и MCF-7 (аденокарцинома молочной железы). Клетки культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки крови эмбрионов крупного рогатого скота, 2 ммоль/л L-глутамина, 80 мкг/мл гентамицина и 30 мг/мл линкомицина при температуре 37°С в CO₂ инкубаторе. Исследуемые вещества растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и добавляли к клеточной культуре в необходимых концентрациях. Клетки, инкубируемые без препаратов, использовались в качестве контроля. Клетки помещали на 96-луночные микропланшеты и культивировали при 37°С в среде 5% СО2/95% воздуха в течение 72 часов. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа конверсии МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-фенил-2Н-тетразолия бромид]. В каждую лунку добавляли 1% МТТ. Через четыре часа добавляли ДМСО и перемешивали в течение 15 мин. Оптическую плотность (D) образцов измеряли на многолуночном спектрофотометре BioRad 680 (США) при длине волны 570 нм. Из полученных данных рассчитывали 50% цитотоксическую дозу GI₅₀ каждого соединения (т.е. концентрацию соединения, вызывающую гибель 50% клеток в культуре или снижающую оптическую плотность в два раза по сравнению с контрольными лунками). Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ Microsoft Excel-2007, STATISTICA 6.0 и GraphPad Prism 5.0. Результаты представлены в таблице 1 в виде среднего значения ± отклонение от среднего (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM)). Достоверность различий (р) оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Различия с p<0,05 считались достоверными. Экспериментальные результаты представлены как средние значения данных, полученные из трех независимо проведенных экспериментов.

Таблица 1. Цитотоксическая активность исследуемых соединений на различных линиях опухолевых клеток. Соединение Цитотоксичность соединений (GI₅₀, μM) в отношении клеточных линий^[a,б] Клеточные линии SNB-19 T-98-G MCF-7 (Ia) 15.8±2.16 34±13.5 3.5±0.14 (Ib) 8.8±0.56 36±6.28 3.8±0.18 (Ic) 5.8±0.10 11±1.13 12±1.47 Диосгенин (II) 62.48±10.2 >100 41±3.38 Доксорубицин 7.62 ± 0.69 12.27±2.53 5.11±0.54 Примечание: ^[a] GI₅₀: концентрация, при которой наблюдается 50% ингибирование роста опухолевых клеток после 72 ч инкубирования.
^[б] Экспериментальные результаты представлены как средние значения данных, полученные из трех независимо проведенных экспериментов.

Изобретение относится к новым химическим соединениям, конкретно к 7-(4-арил-1,2,3-триазол-1-ил)гидроксиспиростанам общей формулы (I). Техническим результатом изобретения является получение новых соединений спиростанового ряда, обладающих способностью к ингибированию роста опухолевых клеток человека на уровне препарата доксорубицина. Соединения получают из доступного растительного спиростенола диосгенина. Указанные свойства позволяют использовать соединения в медицине в качестве антипролиферативного агента. 1 ил., 1 табл., 4 пр.

(I)

7-(4-Арил-1,2,3-триазол-1-ил)гидроксиспиростаны общей формулы (I),

(I)

обладающие цитотоксичностью в отношении опухолевых клеток человека.