Способ изготовления гистологических препаратов энуклеированного глаза Российский патент 2023 года по МПК G01N33/48 G01N1/28 

Изобретение относится к гистологическим исследованиям, касается способа изготовления гистологических препаратов и может быть использовано в офтальмологии для изготовления гистологических препаратов энуклеированного глаза.

Гистологические исследования представляют собой анализ биоматериала на тканевом уровне. Данный вид исследования проводится с целью выявления патологических изменений. От этого зависит тактика дальнейшего лечения, так как заболевания различной природы (злокачественного или доброкачественного характера, специфические воспаления) на начальных этапах своего развития могут быть схожи. Гистологические исследования широко используются во всех разделах медицинской практики - гинекологии, гастроэнтерологии, нефрологии, пульмонологии, урологии, дерматологии, оториноларингологии, офтальмологии и других. В плане диагностической эффективности гистологическое исследование является одним из наиболее эффективных способов для выявления многих заболеваний организма и постановки окончательного диагноза. Помимо диагностики различных новообразований, гистология применяется для дифференциации воспалительных процессов, происходящих в тканях.

При гистологической подготовке для проведения микроскопических (цитологических или гистологических) исследований патологии энуклеированного (изъятого) глазного яблока необходимо обеспечить выявление патологических нарушений глазного яблока на макроуровне, сохранность тканей (предотвращение токсикологических изменений) от момента изъятия органа до проведения исследований и представление образцов тканей в удобном виде для непосредественного исследования (приготовление микроскопических срезов). В противном случае еще до проведения исследований могут возникнуть различного рода артифициальные изменения, которые могут привести к необъективным выводам. К возможным артифициальным изменениям относятся: аутолиз (токсикологические изменения тканей глаза), механические повреждения глазной ткани при изготовлении гистологических препаратов, пропуск (неучет) имеющихся дефектов внутреннего строения глазного яблока (наличие воспалений и гнойных образований, патологических смещений внутренней структуры глаза, например, вывих хрусталика) и т.д.

Техника изготовления гистологических препаратов является сложным многоэтапным процессом, включающим такие процедуры как: фиксацию тканей (обработка фиксирующим раствором) для предотвращения аутолиза посредством инактивации аутолитических ферментов, обрезку глазного яблока, проводку (обезвоживание), заливку тканей в парафин и изготовление парафиновых срезов.

Известен «Способ изолированного выделения и изготовления гистологических структур стекловидного тела» [патент РФ №2734280]. Данный способ включает помещение аутопсированного глаза в раствор формалина, причем аутопсированный глаз человека устанавливают на подложку, затем, оставляя передний отрезок склеры интактным, склеру в четырех миллиметрах от лимба по кругу разрезают между прямыми мышцами и формируют из нее лепестки, которые затем отсекают, далее формируют лепестки сосудистой и сетчатой оболочек и отсекают их, производят последовательное окрашивание структур стекловидного тела, а именно корковых слоев, цистерн, каналов суспензией из солей малорастворимых металлов, окрашенные структуры стекловидного тела поэтапно отсепаровывают и иммобилизируют на адгезивно-метрическом планшете или в биопсийном мешочке, закладываемом в биопсийную кассету, фиксируют в растворе формалина, обезвоживают в спиртах восходящей концентрации, заливают в парафин, приготавливают гистологические срезы и окрашивают гематоксилин-эозином.

Такое изолированное выделение и изготовление гистологических структур обеспечивает изучение анатомо-топографических и гистологических особенностей стекловидного тела. Однако исследование лишь ограниченных структур тканей глаза, легко поддающихся отсечению и последующей обработке для приготовления гистологических препаратов, не позволяет выявить все патологические процессы.

Известен «Способ приготовления гистологических препаратов роговицы глаза» [патент РФ №2697475]. Данный способ включает забор биоматериала и его фиксацию в фиксирующем растворе, промывку от фиксатора, обезвоживание, заливку в парафин, приготовление срезов и их окрашивание, причем перед забором биоматериала производят предварительное введение в переднюю камеру глаза 10-12% раствора нейтрального забуференного формалина в качестве фиксирующего раствора, после 10-15 минутной предварительной фиксации проводят энуклеацию глаза с последующим забором биоматериала в дальнейшую обработку.

Реализация известного способа обеспечивает сохранность гистоструктуры роговицы глаза за счет предотвращения деформации биоматериала в виде расслоения и изгиба при взятии и дальнейшей обработке, но при изъятии роговицы возможно разрушение других структур глаза, что исключает возможность их использования для выявления всех патологий глаза.

Наиболее близким к заявляемому способу по назначению и совокупности существенных признаков является способ подготовки к микроскопическому исследованию глаза [Toxicologic Pathology of the Eye: Histologic Preparation and Alterations of the Anterior Segment. / Kenneth A. Schafer, James A. Render. // Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals. Springer NewYork, Heidelberg, Dordrecht, London 2013, P. 159-165.], который принят за прототип.

В рассматриваемом прототипе, в энуклеированном глазном яблоке производят внутриглазную инъекционную фиксацию, для чего в камеру стекловидного тела глазного яблока через склеру вводят небольшую иглу, через которую инъецируют фиксирующий раствор Девидсона, после чего само глазное яблоко помещают в тот же фиксатор и оставляют на время 24-48 часов - в зависимости от размеров глазного яблока. Затем производят обрезку глазного яблока, проводку, заливку (встраивание) ткани в парафин и изготовление срезов для микроскопического исследования.

Инъекционная фиксация позволяет лучше профиксировать внутренние ткани глазного яблока и предотвратить их затвердевание, особенно хрусталика, а совместная процедура внутренней (инъекционной) фиксации и внешней фиксации (помещение глазного яблока в фиксирующий раствор) обеспечивает более равномерную фиксацию всего объема ткани глазного яблока и ее сохранение с минимальными артефактами.

Основным недостатком известного способа является недостаточное качество гистологических препаратов из-за механических повреждений при проведении обрезки, что обусловлено следующим.

Во-первых, структурно глазное яблоко представляется в определенной степени полым органом, а обрезка требует в любом случае приложения некоторого усилия к режущему инструменту, который, в свою очередь, осуществляет давление на само глазное яблоко. Причем это усилие может быть довольно значительным, учитывая, что структура внутренних тканей различная, где, в том числе, есть и довольно жесткий хрусталик. Поэтому такое надавливание с усилием на глаз может привести как к образованию неровных краев среза, так и к смещению каких-либо внутренних структур глаза относительно друг друга, что, в свою очередь, приведет к возникновению артефактов. Особенно выражено это может быть в случае часто встречающейся в практике такой патологии глаза, как - вывих хрусталика в переднюю камеру глаза, когда хрусталик оказывается лишен какой-либо опоры и может повредить роговицу или просто выпасть.

Во-вторых, до момента разреза глазного яблока и визуального осмотра состояния его внутренних структур могут быть неизвестны какие-либо внутренние аномалии и патологии внутри глаза, например: кисты, гнойные образования, опухоли тканей, отслоение тканей, потеря объема стекловидного тела и т.д. Поэтому в процессе обрезки глазного яблока с такими патологиями могут уже происходить различные дополнительные (вторичные) изменения: разрыв новообразований, смещение каких-либо структур и тканей, нарушение исходной топографии отдельных структур глаза. Вследствие этого возможен и пропуск (неучет) отдельных патологий, что, в конечном счете, приводит к наличию артефактов и вносит погрешности в исследования.

Задача, на решение которой направлено изобретение, является минимизация возникновения дополнительных артефактов в процессе изготовления гистологических препаратов энуклеированного глаза и учет всех имеющихся патологий.

Технический результат, достигаемый при реализации заявленного изобретения, - повышение качества гистологических препаратов энуклеированного глазного яблока для достоверного выявления и диагностики патологических нарушений при заболеваниях глаз.

Для решения поставленной задачи в заявленном способе изготовления гистологических препаратов энуклеированного глаза, включающем внутриглазную инъекционную фиксацию энуклеированного глазного яблока раствором Дэвидсона с последующим помещением глазного яблока в тот же фиксирующий раствор, обрезку глазного яблока, проводку, заливку тканей в парафин и изготовление парафиновых срезов, по завершении фиксации производят аспирацию (изъятие) фиксирующего раствора из глазного яблока с последующим инъекционным введением в камеру стекловидного тела и в переднюю камеру глазного яблока раствора агара до их полного заполнения, а обрезку глазного яблока осуществляют после превращения введенного раствора агара в гелелеобразное состояние.

Агар - это образующий прочные гели гидроколлоид, получаемый из красных морских водорослей. Он является представителем класса загустителей, стабилизаторов и гелеобразующих веществ, и в настоящее время широко применяется в биотехнологии, а также в пищевой промышленности [ГОСТ 16280-2002. Межгосударственный стандарт. Агар пищевой. Технические условия.]. Раствор агара, введенный в камеры глазного яблока после аспирации фиксирующего раствора в соответствии с изобретением, заполняет все свободное пространство между внутренними структурами глазного яблока, что обеспечивает его высокую плотность и прочность, механически фиксирует все внутренние структуры глазного яблока, что исключает возникновение артефактов в момент резки глазного яблока из-за возможного смешения хрусталика и повреждения им окружающих тканей, механически связывает все внутренние структуры ткани глазного яблока, в том числе и возможные локальные патологии: гнойные образования, воспаления, что позволяет сохранить без искажения все имеющиеся артефакты, а также сохранить их взаимное пространственное расположение. Раствор агара не вступает в реакции с внутренними тканями глазного яблока, что исключает возникновение токсикологических или механических артефактов.

Гель, образовавшийся после охлаждения раствора агара, обеспечивает упругость, прочность и устойчивость тканей глазного яблока, что обусловливает более ровные края среза при обрезке глазного яблока из-за возможности более сильного нажима на режущий инструмент и исключает смещение структур глазного яблока (например, хрусталика) или повреждения (разрывы) возможных патологических новообразований в полости глазного яблока. Высокая степень прозрачности геля позволяет после обрезки глазного яблока рассмотреть все его внутренние структуры и визуализировать возможные артифициальные изменения.

Способ осуществляется следующим образом.

Производят фиксацию энуклеированного глазного яблока с использованием широко применяемого в гистологии раствора Дэвидсона. Для инъекционной фиксации фиксирующий раствор Дэвидсона вводят в две наибольшие по объему камеры глазного яблока - камеру стекловидного тела и внутреннюю камеру, которые соприкасаются с хрусталиком глаза, что позволит, в том числе, в наибольшей степени размягчить хрусталик в процессе фиксации. При этом введение фиксирующего раствора можно осуществить одновременно в обе камеры или раздельно. В первом варианте инъекцию фиксирующего раствора в камеру стекловидного тела осуществляют путем введения небольшой иглы (23-20G) через склеру в точке сразу сзади от экватора (в самой толстой части глазного яблока и параллельно лимбу), направляя иглу назад, чтобы избежать контакта с хрусталиком глаза, и раствор Дэвидсона медленно вводят через иглу до набухания глазного яблока. После этого без извлечения иглы с изменением ее направления в сторону радужной оболочки проникают в переднюю камеру глаза, вводя в нее фиксирующий раствор, максимально избегая контакта с хрусталиком глаза. Во втором варианте инъекцию фиксирующего раствора сначала осуществляют в камеру стекловидного тела (по описанной выше методике), а затем - в переднюю камеру глазного яблока через роговицу. В случае вывиха хрусталика или его выпадения (что устанавливается предварительным осмотром) фиксирующий раствор вводят только в камеру стекловидного тела. При этом, поскольку из-за указанных дефектов хрусталика камера стекловидного тела оказывается уже связанной (сообщающейся) с передней камерой глазного яблока, следовательно, фиксирующий раствор перетекает из камеры стекловидного тела и в переднюю камеру. Объем вводимого фиксирующего раствора может значительно варьироваться в зависимости от размера глазного яблока, а также степени повреждения стекловидного тела, и составлять - от нескольких десятых долей до единиц миллилитра.

После проведения инъекционной фиксации осуществляют внешнюю фиксацию путем погружения глазного яблока в раствор Дэвидсона на 24 часа (в случае глазного ябока мелких животных) или на 48 часов (в случае глазного яблока крупных животных, человека). По истечении времени фиксации производят аспирацию фиксирующего раствора из глазного яблока через небольшую иглу, которую вводят по методике, как и при проведении инъекции фиксирующего раствора. Затем без извлечения иглы (во избежание дополнительных травматических повреждений глазных тканей) на освобдившееся место в камеры глазного яблока вводят раствор агара.

Агар выпускается в виде порошка, как, например, по ГОСТ 16280-2002, или в соответствие с иными нормативами. Приготовление раствора агара осуществляется по стандартной методике, для чего порошок смешивают с водой и нагревают до кипения, вследствие чего он растворяется, образуя бесцветный прозрачный коллоидный раствор. В процессе остывания (приблизительно до +50°С) агар остается в виде раствора, а при дальнейшем остывании раствор агара переходит в гелеобразное состояние, образуя плотный (упругий) и прозрачный гель.

Таким образом, после перехода в глазном яблоке раствора агара в гелеобразное состояние приступают к обрезке глазного яблока. Обрезку глазного яблока и все последующие процедуры подготовки гистологических образцов (проводку и заливку тканей в парафин, а также изготовление парафиновых срезов) выполняют по стандартным методикам, используемым в гистологии.

Реализация заявленного способа обеспечивает повышение качества гистологических препаратов путем введения раствора агара в камеры глазного яблока после аспирации фиксирующего раствора, что позволяет сохранить структуру и целостность глазных тканей, значительно повысить информативность полученных срезов гистологических препаратов и точность диагноза.

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологическим исследованиям, и может быть использовано для изготовления гистологических препаратов энуклеированного глаза. Для этого фиксирующий раствор Дэвидсона вводят инъекционно в глазное яблоко. После чего глазное яблоко помещают в фиксирующий раствор Дэвидсона. По завершения процесса фиксации производят аспирацию фиксирующего раствора из глазного яблока с последующей инъекцией в камеру стекловидного тела и в переднюю камеру глазного яблока раствора агара до их полного заполнения. После превращения введенного раствора агара в гелеобразное состояние выполняют обрезку глазного яблока, проводку, заливку тканей в парафин и изготовление парафиновых срезов. Изобретение обеспечивает повышение качества гистологических препаратов энуклеированного глазного яблока для достоверного выявления и диагностики патологических нарушений при заболеваниях глаз.

Способ изготовления гистологических препаратов энуклеированного глаза, включающий фиксацию глазного яблока раствором Дэвидсона, при которой сначала фиксирующий раствор вводят инъекционно в глазное яблоко, после чего само глазное яблоко помещают в такой же фиксатор, обрезку глазного яблока, проводку, заливку тканей в парафин и изготовление парафиновых срезов, отличающийся тем, что по завершении фиксации производят аспирацию фиксирующего раствора из глазного яблока, после чего в камеру стекловидного тела и в переднюю камеру глазного яблока инъекционно вводят раствор агара до их полного заполнения, а обрезку глазного яблока осуществляют после превращения введенного раствора агара в гелеобразное состояние.