ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к молекулам анти-Siglec-9 антител или их связывающим фрагментам. Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим молекулы антител или их связывающих фрагментов, векторам экспрессии, клеткам-хозяевам и способам получения молекул антител или их связывающих фрагментов. Также представлены фармацевтические композиции, содержащие молекулы антител или их связывающих фрагментов. Молекулы анти-Siglec-9 антител или их связывающих фрагментов по настоящему изобретению могут быть использованы (отдельно или в комбинации с другими агентами или терапевтическими методами) для лечения рака, острого или хронического гепатита В. Таким образом, настоящее изобретение также относится к молекулам анти-Siglec-9 антител или их связывающих фрагментов, или к фармацевтическим композициям, содержащим молекулы анти-Siglec-9 антител или их связывающих фрагментов, для применения при лечении рака, острого или хронического гепатита B.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Во время злокачественной трансформации, гликозилирование сильно изменено по сравнению со здоровой тканью из-за дифференциальной экспрессии, например, гликозилтрансфераз, гликозидаз и транспортеров моносахаридов в микроокружении рака Активация и изменение концевых структур сиаловой кислоты является отличительной чертой рака.

Образцы структур сиаловой кислоты распознаются с помощью распознающих рецепторов, называемых Siglec. Siglec представляют собой связывающую структуру сиаловой кислоты, иммуномодуляторные, часто ингибирующие рецепторы, экспрессируемые преимущественно на иммунных клетках. В последние годы несколько экспериментальных моделей предоставили доказательства того, что Siglec вовлечены в прогрессирование рака и ускользание от иммунологического надзора. Эти экспериментальные модели также предполагают, что Siglec, такие как, например, Siglec-9, могут быть таргетированы для улучшения противоопухолевого иммунитета.

Ввиду постоянной потребности в улучшенных стратегиях для таргетирования заболеваний, таких как рак, очень желательны новые композиции для регуляции активности Siglec-9.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Аспект А

В одном аспекте A1, настоящее изобретение относится к молекуле анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента.

Структурные свойства

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1, настоящее изобретение относится к молекуле анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента, где молекула антитела или связывающего фрагмента содержит, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть определяющих комплементарность областей (CDR) (или вместе все CDR) из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и/или вариабельной области легкой цепи (VL), содержащих аминокислотную последовательность, показанную в Табл. 6, где одна или несколько CDR (или в совокупности все CDR) могут иметь одну, две, три, четыре, пять, шесть или несколько замен, например аминокислотных замен (например, консервативных аминокислотных замен), вставок или делеций относительно аминокислотной последовательности показанной в табл. 6.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1, настоящее изобретение относится к молекуле анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента, где молекула антитела или связывающего фрагмента содержит, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть определяющих комплементарность областей (CDR) (или вместе все CDR) из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и/или вариабельной области легкой цепи (VL), содержащих аминокислотную последовательность, показанную в табл. 5, где одна или несколько CDR (или в совокупности все CDR) могут иметь одну, две, три, четыре, пять, шесть или несколько замен, например аминокислотных замен (например, консервативных аминокислотных замен), вставок или делеций относительно аминокислотной последовательности, показанной в табл. 5.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1, настоящее изобретение относится к молекуле анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента, где молекула антитела или связывающего фрагмента содержит, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть определяющих комплементарность областей (CDR) (или вместе все CDR) из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и/или вариабельной области легкой цепи (VL), содержащих аминокислотную последовательность, показанную в табл. 1, где одна или несколько CDR (или в совокупности все CDR) могут иметь одну, две, три, четыре, пять, шесть или несколько замен, например аминокислотных замен (например, консервативных аминокислотных замен), вставок или делеций относительно аминокислотной замены, показанной в табл. 1.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1, настоящее изобретение относится к молекуле анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента, включающему:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую одну, две или три из: определяющей комплементарность области 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции, определяющей комплементарность области 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 51 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции, и определяющей комплементарность области 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или последовательность, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции; и /или вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую одну, две или три из: определяющей комплементарность области 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции, определяющей комплементарность области 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или последовательности, содержащей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции, и определяющей комплементарность области 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1, настоящее изобретение относится к молекуле анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента, включающему:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую одну, две или три из: определяющей комплементарность области 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или последовательности, содержащей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции, определяющей комплементарность области 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 45 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции, и определяющей комплементарность области 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции; и/или вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую одну, две или три из: определяющей комплементарность области 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции, определяющей комплементарность области 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или последовательности, содержащей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции, определяющей комплементарность области 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1, настоящее изобретение относится к молекуле анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента, включающему:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую одну, две или три из: определяющей комплементарность области 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или последовательности, содержащей или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции, определяющей комплементарность области 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции, и определяющей комплементарность области 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции; и/или вариабельную область легкой цепи (VL), содержащая одну, две или три из: определяющей комплементарность области 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции, определяющей комплементарность области 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или последовательности, содержащей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции, и определяющей комплементарность области легкой цепи 3 (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 или последовательности, содержащей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1, настоящее изобретение относится к молекуле анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента, включающему:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены); и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены).

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1, настоящее изобретение относится к молекуле анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента, включающему:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 51 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены); и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, определяющие консервативные аминокислотные замены).

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1, настоящее изобретение относится к молекуле анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента, включающему:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 45 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены); и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены).

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1 настоящее изобретение относится к молекуле анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента, включающему:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены); и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, определяющие консервативные аминокислотные замены).

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1 настоящее изобретение относится к молекуле анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента, включающему:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 1, определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или последовательности, имеющей одну, две или три аминокислотные замены, и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательность SEQ ID NO: 3; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 или последовательности, имеющей одну или две аминокислотные замены, определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре определяющие аминокислотные замены.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1 молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента содержит:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 1, определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 51, и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3; и

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52, определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1 молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента содержит:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 45, и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3; и

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46, определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1 молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента содержит:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 1, определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3; и

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 4, определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:5, и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1 молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента содержит:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 51 и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3; и

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52, определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6;

где одна, две, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь аминокислот в CDR были вставлены, удалены или заменены.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1, молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента содержит:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 1, определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 45, и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3; и

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46, определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6;

где одна, две, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь аминокислот в CDR были вставлены, удалены или заменены.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1, молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента содержит:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:1, определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3; и

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 4, определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:5, и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6;

где одна, две, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь аминокислот в CDR были вставлены, удалены или заменены.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1, молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, около 85%, 90%, 95% или 99% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 47.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1, молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, около 85%, 90%, 95% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 7.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1 молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента содержит вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, или аминокислотную последовательность имеющею, по меньшей мере, 85%, 90%, 95% или 99% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 48.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1 молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента представляет собой вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, примерно 85%, 90%, 95% или 99% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 8.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1, молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47, или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, примерно, примерно 85%, 90%, 95% или 99% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 47; и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:48, или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, примерно 85%, 90%, 95% или 99% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 48.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1, молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, примерно 85%, 90%, 95% или 99% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 7; и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, примерно 85%, 90%, 95% или 99% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 8.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1, молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1, молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1, молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента представляет собой гуманизированную молекулу анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента.

Функциональные свойства

В некоторых вариантах осуществления аспекта A1, молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента имеет одно или несколько (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9) из следующих свойств:

(i) связывается с Siglec-9 человека со значением EC50 менее примерно 10 нМ, 1 нМ, 0,9 нМ, 0,8 нМ, 0,7 нМ, 0,6 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,2 нМ, 0,1 нМ, или 0,05 нМ, например, когда молекулу антитела или его связывающего фрагмента тестируют в виде двухвалентной молекулы с использованием ELISA, например, как описано в примере 3;

(ii) связывается с Siglec-9 человека с константой диссоциации (KD) менее примерно 10 нМ, 1 нМ, 0,9 нМ, 0,8 нМ, 0,7 нМ, 0,6 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,2 нМ или 0,1 нМ, когда молекулу антитела или его связывающего фрагмента тестируют в виде двухвалентной молекулы с использованием поверхностного плазмонного резонанса, например Carterra LSA, например, как описано в примере 4;

(iii) связывается с моноцитами CD14+ человека со значением ЕС50 менее примерно 10 нМ, 1 нМ, 0,9 нМ, 0,8 нМ, 0,7 нМ, 0,6 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,2 нМ или 0,1 нМ, например, когда молекулу антитела или его связывающего фрагмента тестируют в виде двухвалентной молекулы с использованием проточного цитометра, например, как описано в примере 5;

(iv) ингибирует взаимодействие между Siglec-9 и одним или несколькими лигандами Siglec-9, например, ингибирует связывание опухолевых клеток A549, экспрессирующих сиаловую кислоту, с Siglec-9, например, когда молекулу антитела или его связывающего фрагмента тестируют в виде двухвалентной молекулы с использованием ELISA, например, как описано в примере 6;

(v) увеличивает пролиферацию анти-CD3/анти-CD28-стимулированных CD8+ Т-клеток, например, когда молекулу антитела или его связывающего фрагмента тестируют в виде двухвалентной молекулы в анализе активации Т-клеток с использованием Cell Trace Violet и проточного цитометра, например, как описано в примере 7;

(vi) активирует маркеры активации CD69 и CD25 анти-CD3/анти-CD28-стимулированных CD8+ Т-клеток, например, когда молекулу антитела или его связывающего фрагмента тестируют в виде двухвалентной молекулы в анализе активации Т-клеток с использованием окрашивания и проточного цитометра, например, как описано в примере 7;

(vii) увеличивает пролиферацию анти-CD3/анти-CD28-стимулированных CD4+ Т-клеток, например, когда молекулу антитела или его связывающего фрагмента тестируют в виде двухвалентной молекулы в анализе активации Т-клеток с использованием Cell Trace Violet и проточного цитометра, например, как описано в примере 7;

(viii) активирует маркеры активации CD69 и CD25 анти-CD3/анти-CD28-стимулированных CD4+ Т-клеток, например, когда молекулу антитела или его связывающего фрагмента тестируют в виде двухвалентной молекулы в анализе активации Т-клеток с использованием окрашивания и проточного цитометра, например, как описано в примере 7; или

(ix) повышает активность уничтожения, опосредованную NK-клетками, например, увеличивает уничтожение клеток K562 NK92-клетками, сверхэкспрессирующими Siglec-9, например, когда молекулу антитела или его связывающего фрагмента тестируют в виде двухвалентной молекулы с использованием клеток K562, меченных Calcein-AM, например, как описано в Примере 8.

В одном аспекте А2, настоящее изобретение относится к молекуле антитела или его связывающего фрагмента, которые конкурируют за связывание с Siglec-9 человека с молекулой антитела или его связывающим фрагментом, описанным в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления аспекта А2, настоящее описание относится к молекуле антитела или его связывающего фрагмента, который конкурирует за связывание с Siglec-9 человека с молекулой антитела или его связывающего фрагмента, который содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательность SEQ ID NO:1, определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3; и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VLCDR1) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (VLC DR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления аспекта A2, настоящее изобретение относится к молекуле антитела или его связывающего фрагмента, который конкурирует за связывание с Siglec-9 человека с молекулой антитела или его связывающего фрагмента, который содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

В одном аспекте A3, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей молекулу антитела или его связывающего фрагмента, описанную в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или стабилизатор.

В одном аспекте A4, настоящее изобретение относится к молекулам анти-Siglec-9 антитела или его связывающего фрагмента, описанным в настоящем документе, или к фармацевтическим композициям, содержащим молекулы анти-Siglec-9 антитела или его связывающего фрагмента, описанные в настоящем документе, для применения при лечении заболевания, выбранного из группы, состоящей из рака, острого и хронического гепатита В. В некоторых вариантах осуществления аспекта А4, рак выбран из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого, колоректального рака, рака молочной железы, эпителиального рака яичников, гепатоцеллюлярной карциномы и рака простаты.

В одном аспекте A5, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей вариабельную область тяжелой и/или легкой цепи молекулы антитела или его связывающего фрагмента, описанной в настоящем документе.

В одном аспекте A6, настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему описанную в настоящем документе нуклеиновую кислоту.

В одном аспекте A7, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту, описанную в настоящем документе, или вектор экспрессии, описанный в настоящем документе.

В одном аспекте A8, настоящее описание относится к способу получения молекулы антитела, включающий культивирование описанной в настоящем документе клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии гена.

Аспект В

В одном аспекте B1, настоящее изобретение относится к молекуле анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента.

Структурные свойства

В некоторых вариантах осуществления аспекта B1, настоящее изобретение относится к молекуле анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента, где молекула антитела или связывающего фрагмента содержит, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть определяющих комплементарность областей (CDR) (или вместе все CDR) из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и/или вариабельной области легкой цепи (VL), содержащих аминокислотную последовательность, показанную в табл. 2, где одна или несколько CDR (или в совокупности все CDR) могут иметь одну, две, три, четыре, пять, шесть или несколько замен, например аминокислотных замен (например, консервативных аминокислотных замен), вставок или делеций относительно аминокислотной последовательности, показанной в табл. 2.

В некоторых вариантах осуществления аспекта B1, настоящее изобретение относится к молекуле анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента, содержащей:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую одну, две или три из: определяющей комплементарность области 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30 или последовательности, содержащей или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции, определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31 или последовательности, содержащей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции, и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32 или последовательности, содержащей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции; и/или вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую одну, две или три из: определяющей комплементарность области 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33 или последовательности, содержащей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставок или делеций, определяющей комплементарность области 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, или последовательности, содержащей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции и аминокислотной последовательности области 3 комплементарности легкой цепи (VLCDR3) SEQ ID NO: 35 или последовательности, содержащей или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), вставки или делеции.

В некоторых вариантах осуществления аспекта B1, настоящее изобретение относится к молекуле анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента, содержащей:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32, или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены); и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность определяющей комплементарность области 3 легкой цепи (VLCDR3) SEQ ID NO: 35, или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены).

В некоторых вариантах осуществления аспекта B1, настоящее изобретение относится к молекуле анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента, содержащей:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены); и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены), и определяющей комплементарность области 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены (например, консервативные аминокислотные замены).

В некоторых вариантах осуществления аспекта B1, настоящее изобретение относится к молекуле анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента, содержащей:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30, определяющей комплементарность области 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31 или последовательности, имеющей одну, две или три аминокислотные замены, и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33 или последовательности, имеющей одну или две аминокислотные замены, определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34 и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены.

В некоторых вариантах осуществления аспекта B1, молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента содержит:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30, определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31, и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32; и

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33, определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах осуществления аспекта B1, молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента содержит:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30, определяющую комплементарность области 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31, и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32; и

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33, определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35;

где одна, две, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь аминокислот в CDR были вставлены, удалены или заменены.

В некоторых вариантах осуществления аспекта B1, молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, примерно 85%, 90%, 95% или 99% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 36.

В некоторых вариантах осуществления аспекта B1, молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента представляет собой вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, примерно 85%, 90%, 95% или 99% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 37.

В некоторых вариантах осуществления аспекта B1 молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, примерно 85%, 90%, 95% или 99% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 36; и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, примерно 85%, 90%, 95% или 99% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 37.

В некоторых вариантах осуществления аспекта B1, молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37.

В некоторых вариантах осуществления аспекта B1, молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента представляет собой гуманизированную молекулу анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента.

Функциональные свойства

В некоторых вариантах осуществления аспекта B1, молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента имеет одно или несколько (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) из следующих свойств:

(i) связывается с Siglec-9 человека со значением EC50 менее примерно 10 нМ, 1 нМ, 0,9 нМ, 0,8 нМ, 0,7 нМ, 0,6 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,2 нМ, 0,1 нМ или 0,05 нМ, например, когда молекулу антитела или его связывающего фрагмента тестируют в виде двухвалентной молекулы с помощью ELISA, например, как описано в примере 3;

(ii) связывается с Siglec-9 человека с константой диссоциации (KD) менее примерно 10 нМ, 1 нМ, 0,9 нМ, 0,8 нМ, 0,7 нМ, 0,6 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,2 нМ или 0,1 нМ, когда молекулу антитела или его связывающего фрагмента тестируют в виде двухвалентной молекулы с использованием поверхностного плазмонного резонанса, например Carterra LSA, например, как описано в примере 4;

(iii) связывается с моноцитами CD14+ человека со значением ЕС50 менее примерно 10 нМ, 1 нМ, 0,9 нМ, 0,8 нМ, 0,7 нМ, 0,6 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,2 нМ или 0,1 нМ, например, когда молекулу антитела или его связывающего фрагмента тестируют в виде двухвалентной молекулы с использованием проточного цитометра, например, как описано в примере 5;

(iv) ингибирует взаимодействие между Siglec-9 и одним или несколькими лигандами Siglec-9, например, ингибирует связывание опухолевых клеток A549, экспрессирующих сиаловую кислоту, с Siglec-9, например, когда молекулу антитела или его связывающего фрагмента тестируют в виде двухвалентной молекулы с использованием ELISA, например, как описано в примере 6;

(v) увеличивает пролиферацию анти-CD3/анти-CD28-стимулированных CD8+ Т-клеток, например, когда молекулу антитела или его связывающего фрагмента тестируют в виде двухвалентной молекулы в анализе активации Т-клеток с использованием Cell Trace Violet и проточного цитометра, например, как описано в примере 7;

(vi) активирует маркеры активации CD69 и CD25 анти-CD3/анти-CD28-стимулированных CD8+ Т-клеток, например, когда молекулу антитела или его связывающего фрагмента тестируют в виде двухвалентной молекулы в анализе активации Т-клеток с использованием окрашивания и проточного цитометра, например, как описано в примере 7;

(vii) увеличивает пролиферацию анти-CD3/анти-CD28-стимулированных CD4+ Т-клеток, например, когда молекулу антитела или его связывающего фрагмента тестируют в виде двухвалентной молекулы в анализе активации Т-клеток с использованием Cell Trace Violet и проточного цитометра, например, как описано в примере 7;

(viii) активирует маркеры активации CD69 и CD25 анти-CD3/анти-CD28-стимулированных CD4+ Т-клеток, например, когда молекулу антитела или его связывающего фрагмента тестируют в виде двухвалентной молекулы в анализе активации Т-клеток с использованием окрашивания и проточного цитометра, например, как описано в примере 7;

(ix) повышает активность уничтожения, опосредованную NK-клетками, например, увеличивает уничтожение клеток K562 NK92 клетками, сверхэкспрессирующими Siglec-9, например, когда молекулу антитела или его связывающего фрагмента тестируют в виде двухвалентной молекулы с использованием клеток K562, меченных Calcein-AM, например, как описано в примере 8; или

(x) связывается с Siglec-7 человека.

В одном аспекте B2, настоящее изобретение относится к молекуле антитела или его связывающего фрагмента, которые конкурируют за связывание с Siglec-9 человека с молекулой антитела или его связывающего фрагмента, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления аспекта B2, настоящее описание относится к молекуле антитела или его связывающего фрагмента, которая конкурирует за связывание с Siglec-9 человека с молекулой антитела или его связывающего фрагмента, которая содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30, определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности п SEQ ID NO: 31, и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32; и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33, определяющую комплементарность области 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34 и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления аспекта B2, настоящее изобретение относится к молекуле антитела или его связывающего фрагмента, которая конкурирует за связывание с Siglec-9 человека с молекулой антитела или его связывающего фрагмента, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37.

В одном аспекте B3, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей молекулу антитела или его связывающего фрагмента, описанную в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или стабилизатор.

В одном аспекте B4, настоящее изобретение относится к молекулам анти-Siglec-9 антитела или его связывающего фрагмента, описанным в настоящем документе, или к фармацевтическим композициям, содержащим молекулы анти-Siglec-9 антитела или его связывающего фрагмента, описанные в настоящем документе, для применения при лечении заболевания, выбранного из группы, состоящей из рака, острого и хронического гепатита В. В некоторых вариантах осуществления, рак выбран из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого, колоректального рака, рака молочной железы, эпителиального рака яичников, гепатоцеллюлярной карциномы и рака предстательной железы.

В одном аспекте B5, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей вариабельную область тяжелой и/или легкой цепи молекулы антитела или его связывающего фрагмента, описанной в настоящем документе.

В одном аспекте B6, настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему описанную в настоящем документе нуклеиновую кислоту.

В одном аспекте B7, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту, описанную в настоящем документе, или вектор экспрессии, описанный в настоящем документе.

В одном аспекте B8, настоящее описание относится к способу получения молекулы антитела, включающий культивирование описанной в настоящем документе клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии генов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1: Реакционная способность моноклональных антител (68D4 и 224B1; сравнительные моноклональные антитела mAbA и 5C6 и отрицательный контроль 53C3) по отношению к Siglec-5, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-15 и Siglec-9 по результатам анализа ELISA. Связывание определяют измерением накопленного окрашенного продукта при 450 нм после остановки реакции (n=3).

Фиг. 2: Кривые связывания моноклональных антител (68D4 и 224B1; сравнительные моноклональные антитела mAbA и 5C6 и отрицательный контроль 53C3) по отношению к Siglec-9, по результатам анализа ELISA. Связывание моноклонального антитела с Siglec-9, определяемое измерением накопленного окрашенного продукта при 450 нм после остановки реакции, представлено в зависимости от концентрации оцениваемого моноклонального антитела. Значения ЕС50, определенные с помощью трехпараметрического анализа в GraphPad Prism (GraphPad Software), приведены в правом нижнем углу графиков. (n=3).

Фиг. 3: Кривые связывания моноклональных антител (68D4 и 224B1; сравнительные моноклональные антитела mAbA и 5C6 и отрицательный контроль 53C3) с Siglec-9, демонстрируемого на моноцитах CD14+ человека при анализе с помощью проточной цитометрии. Средний сигнал флуоресценции вторичного антитела, связанного с популяцией CD14+, построен в зависимости от концентрации оцениваемого моноклонального антитела. Значения EC50, определенные с помощью трехпараметрического анализа в GraphPad Prism (GraphPad Software), приведены в правом нижнем углу графиков.

Фиг. 4: Титрование моноклональных антител (68D4 и 224B1; сравнительные моноклональные антитела mAbA и 5C6 и отрицательный контроль 53C3) для определения блокирования связывания опухолевых клеток A549, демонстрирующих сиаловую кислоту, с Siglec-9. Опухолевые клетки флуоресцентно нагружают Calcein-AM перед экспериментом по связыванию, и связывание определяют по высвобождаемой флуоресценции при лизисе клеток. Флуоресценция, высвобождаемая в отсутствие антитела, была установлена как 100% связывание. Данные подгоняют с помощью трехпараметрического анализа в GraphPad Prism (GraphPad Software); n =3.

Фиг. 5: Анализ активации CD8+ Т-клеток. Титрование моноклональных антител (68D4 и 224B1; сравнительные моноклональные антитела mAbA и 5C6 и отрицательный контроль 53C3) и их влияние на пролиферацию (A), активацию маркеров активации CD69 (B) и CD25 (C) CD8+ T-клеток (ко-стимулированных анти-CD3 и анти-CD28 антителами), происходящих из модели трансгенных мышей Siglec-9. Пролиферацию и уровни маркеров активации на CD8+ T-клетках анализируют с помощью проточной цитометрии.

Фиг. 6: Анализ активации CD4+ T-клеток. Титрование моноклональных антител (68D4 и 224B1; сравнительные моноклональные антитела mAbA и 5C6 и отрицательный контроль 53C3) и его влияние на пролиферацию (A), усиление маркеров активации CD69 (B) и CD25 (C) CD4+ T-клеток (ко-стимулированных анти-CD3 и анти-CD28 антителами), происходящих из модели трансгенных мышей Siglec-9. Пролиферацию и уровни маркеров активации на CD4+ T-клетках анализируют с помощью проточной цитометрии.

Фиг. 7: Титрование моноклональных антител (68D4 и 224B1; сравнительные моноклональные антитела mAbA и 5C6 и отрицательный контроль 53C3) для определения уничтожения клеток K562, меченных Calcein-AM, NK92-клетками. Уничтожение определяют по высвобожденной флуоресценции при лизисе клеток K562. Специфический лизис рассчитывают как: (ячейка для тестирования лизиса - спонтанный лизис)/(максимальный лизис - спонтанный лизис) × 100%. Флуоресценцию, высвобождаемую при добавлении детергента Triton X-100 и инкубации только клеток K562 используют для определения максимального лизиса и спонтанного лизиса, соответственно. Данные анализируют с помощью анализа одного участка (всего) в GraphPad Prism (GraphPad Software), n=3.

Фиг. 8: Гуманизация антитела 68D4 кролика. Показаны выравнивания вариабельного домена легкой цепи IgG 263E11 человека (SEQ ID NO: 54), последовательностей зародышевой линии человека KV1-5/J4 (SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 56), rb 68D4 (SEQ ID NO: 8) и полученного трансплантата 68D4-hum (SEQ ID NO: 48); и вариабельного домена тяжелой цепи IgG 263E11 человека (SEQ ID NO: 53), последовательности зародышевой линии человека VH3-23 /J4 (SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58), rb 68D4 (SEQ ID NO: 7) и полученного трансплантата 68D4-hum (SEQ ID NO: 47).

Фиг. 9: Кривые связывания моноклональных антител (68D4 кролика; гуманизированные 68D4 и сравнительное моноклональное антитело mAbA) с Siglec-9, согласно анализу ELISA. Связывание моноклонального антитела с Siglec-9, по данным измерения накопленного окрашенного продукта при 450 нм после остановки реакции, наносят на график зависимости от концентрации оцениваемого моноклонального антитела.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение, иллюстративно описанное ниже, может быть с успехом реализовано на практике в отсутствие какого-либо элемента или элементов, ограничения или ограничений, конкретно не описанных в настоящем документе.

Настоящее изобретение будет описано в отношении конкретных вариантов осуществления и со ссылкой на определенные чертежи, но изобретение не ограничивается ими, а ограничивается только формулой изобретения.

Если термин «содержащий» используется в настоящем описании и формуле изобретения, он не исключает другие элементы. Для целей настоящего изобретения, термин «состоящий из» считается предпочтительным вариантом осуществления термина «содержащий» Если далее определено, что группа включает, по меньшей мере, определенное количество вариантов осуществления, это также следует понимать как описание группы, которая предпочтительно состоит только из этих вариантов осуществления.

Когда неопределенный или определенный артикль используется при обращении к существительному в единственном числе, например, «a», «an» или «the», это включает множественное число этого существительного, если не указано иное. Термины «примерно» или «приблизительно» в контексте настоящего изобретения обозначают интервал точности, который будет понятен специалисту в данной области техники для обеспечения технического эффекта рассматриваемого признака. Термин указывает отклонение от указанного числового значения ±20%, предпочтительно ±10%, и более предпочтительно, ±5%.

Технические термины используются в соответствии с их здравым смыслом. Если определенным терминам придается конкретное значение, ниже будут даны определения терминов, в контексте которых эти термины используются.

Siglec-7 человека (эталонная последовательность NCBI: Q9Y286.1) имеет следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 60):

MLLLLLLPLLWGRERVEGQKSNRKDYSLTMQSSVTVQEGMCVHVRCSFSYPVDSQTDSDPVHGYWFRAGNDISWKAPVATNNPAWAVQEETRDRFHLLGDPQTKNCTLSIRDARMSDAGRYFFRMEKGNIKWNYKYDQLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCFQNLTCSVPWACEQGTPPMISWMGTSVSPLHPSTTRSSVLTLIPQPQHHGTSLTCQVTLPGAGVTTNRTIQLNVSYPPQNLTVTVFQGEGTASTALGNSSSLSVLEGQSLRLVCAVDSNPPARLSWTWRSLTLYPSQPSNPLVLELQVHLGDEGEFTCRAQNSLGSQHVSLNLSLQQEYTGKMRPVSGVLLGAVGGAGATALVFLSFCVIFIVVRSCRKKSARPAADVGDIGMKDANTIRGSASQGNLTESWADDNPRHHGLAAHSSGEEREIQYAPLSFHKGEPQDLSGQEATNNEYSEIKIPK

Siglec-9 человека (ссылочная последовательность NCBI: NP_055256.1) является членом CD33-родственного семейства Siglec, и также называется Ig-подобным лектином 9, связывающим сиаловую кислоту, CD329, CDw329, FOAP-9 и OBBP-LIKE. Siglec-9 человека содержит 463 аминокислоты, имеющие следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 9):

mlllllpllw greraegqts klltmqssvt vqeglcvhvp csfsypshgw iypgpvvhgy wfregantdq dapvatnnpa ravweetrdr fhllgdphtk nctlsirdar rsdagryffr mekgsikwny khhrlsvnvt althrpnili pgtlesgcpq nltcsvpwac eqgtppmisw igtsvspldp sttrssvltl ipqpqdhgts ltcqvtfpga svttnktvhl nvsyppqnlt mtvfqgdgtv stvlgngssl slpegqslrl vcavdavdsn pparlslswr gltlcpsqps npgvlelpwv hlrdaaeftc raqnplgsqq vylnvslqsk atsgvtqgvv ggagatalvf lsfcvifvvv rscrkksarp aagvgdtgie danavrgsas qgpltepwae dsppdqpppa sarssvgege lqyaslsfqm vkpwdsrgqe atdteyseik ihr

Siglec-9 представляет собой ингибирующий иммунный рецептор, экспрессируемый в микроокружении опухоли клетками адаптивной и врожденной иммунной системы (например, NK-клетками, CD8+- и CD4+ Т-клетками и макрофагами). Было показано, что ингибиторная передача сигналов через этот рецептор запускается экспрессией лигандов, активированных на опухолевых клетках и строме опухоли. (Läubli et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Sep 30;111(39):14211-6). Важно отметить, что CD8+ и CD4+ опухоль-инфильтрирующие лимфоциты (TIL) у больных CRC (колоректальным раком) и NSCLC (немелкоклеточным раком легкого) показывают активацию Siglec-9, особенно в тех TIL, которые экспрессируют высокие уровни PD-1 (Stanczak et al., J Clin Invest. 2018 Nov 1;128(11):4912-4923). Кроме того, блокирование Siglec-9 было предложено как потенциальный способ контроля репликации вируса гепатита В. (Zhao et al., Front Immunol. 2018 May 30; 9: 1124).

Некоторые аспекты настоящего изобретения основаны, по меньшей мере, частично, на идентификации молекул анти-Siglec-9 антитела или их связывающих фрагментов, которые

- ингибируют взаимодействие между Siglec-9 и одним или несколькими лигандами Siglec-9; и/или

- увеличивают пролиферацию анти-CD3/анти-CD28 стимулированных CD8+ Т-клеток ; и/или

- активируют маркеры активации CD69 и CD25 анти-CD3/анти-CD28 стимулированных CD8+ Т-клеток; и/или

- увеличивают пролиферацию анти-CD3/анти-CD28 стимулированных CD4+ Т-клеток ; и/или

- активируют маркеры активации CD69 и CD25 анти-CD3/анти-CD28 стимулированных CD4+ Т-клеток ; и /или

- увеличивают уничтожающую активность, опосредованную NK-клетками.

Как упоминалось выше, в настоящем изобретении рассматриваются молекулы анти-Siglec-9 антител или их связывающие фрагменты. Полноразмерное антитело включает константный домен и вариабельный домен. Константная область не обязательно должна присутствовать в антигенсвязывающем фрагменте антитела.

Таким образом, связывающие фрагменты могут включать части интактного полноразмерного антитела, такие как антигенсвязывающая или вариабельная область полного антитела Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, F(ab')2, Id и Fv; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечного антитела (например, scFv); фрагменты мультиспецифического антитела, такие как биспецифические, триспецифические и мультиспецифические антитела (например, диатела, триантела, тетратела); минитела; хелатирующие рекомбинантные антитела; тритела или битела; интратела; нанотела; малые модульные иммунофармацевтические препараты (SMIP); слитые белки связывающего домена иммуноглобулина; антитела верблюжьих; антитела, содержащие VHH; и любые другие полипептиды, образованные из фрагментов антител. Специалисту в данной области известно, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела.

Гуманизированные антитела также входят в настоящее описание.

В настоящем документе описаны полипептиды, имеющие указанные последовательности или последовательности, по существу идентичные или подобные им, например, последовательности, имеющие, по меньшей мере, примерно 85%, 90%, 95% или 99% идентичность последовательности указанной последовательности.

Определение доли идентичности между двумя последовательностями предпочтительно осуществляется с использованием математического алгоритма Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873-5877. Такой алгоритм включен в программу BLASTp (Protein BLAST) из Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, доступную на NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Определение доли идентичности может быть выполнено со стандартными параметрами программы BLASTp. Для общих параметров в поле «Максимальное количество последовательностей-мишеней» можно установить значение 100, в поле «Короткие запросы» можно установить галочку, в поле «Порог ожидания» можно установить значение 10, в поле «Размер слова» можно установить значение «3», и «Максимальное количество совпадений в диапазоне запроса» можно установить на «0». Для параметров оценки, в поле «Матрица» может быть установлено значение «BLOSUM62», в поле «Цена гэпа» может быть установлено значение «Существование: 11 Расширение: 1», в поле «Композиционные корректировки» можно установить значение «Условная композиционная корректировка матрицы замен». Для параметров «Фильтры и маскирование» в поле «Области низкой сложности» может быть не отмечено, поле «Маска только для таблицы поиска» может быть не отмечено, и поле «Маскировать буквы нижнего регистра» может быть не отмечено.

В соответствии с описанием, «консервативная аминокислотная замена» представляет собой аминокислотную замену, при которой аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим похожую боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих похожие боковые цепи, определены в данной области техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

Как уже упоминалось, изобретение также относится, в некоторых вариантах осуществления, к нуклеиновой кислоте, кодирующей молекулы антитела или его связывающих фрагментов, векторы, содержащие такие нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, содержащие такие нуклеиновые кислоты или векторы.

Молекулы антител или их связывающие фрагменты могут кодироваться одной нуклеиновой кислотой (например, одной нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептиды легкой и тяжелой цепей антитела) или двумя или несколькими отдельными нуклеиновыми кислотами, каждая из которых который кодирует другую часть молекулы антитела или фрагмента антитела. Нуклеиновые кислоты могут представлять собой ДНК, кДНК, РНК и подобные.

Описанные в настоящем документе нуклеиновые кислоты могут быть вставлены в векторы. «Вектор» представляет собой любую молекулу или композицию, которая обладает способностью переносить последовательность нуклеиновой кислоты в подходящую клетку, где может происходить синтез кодируемого полипептида.

Настоящее описание в некоторых аспектах дополнительно относится к клетке-хозяину (например, выделенной или очищенной клетке), содержащей нуклеиновую кислоту или вектор по настоящему изобретению. Клеткой- хозяином может быть любой тип клеток, способных трансформироваться нуклеиновой кислотой или вектором по изобретению с целью получения кодируемого им полипептида.

Молекулы анти-Siglec-9 антител или их анти-Siglec-9 связывающих фрагментов могут быть включены в состав композиций, особенно фармацевтических композиций. Такие композиции содержат терапевтически эффективное количество антитела или его связывающего фрагмента в смеси с фармацевтически приемлемым носителем, эксципиентом или стабилизатором.

Кроме того, молекулы анти-Siglec-9 антител или их анти-Siglec-9 связывающих фрагментов, и фармацевтические композиции, как описано в настоящем документе, можно вводить в способах лечения пациентов с заболеванием, выбранным из группы, состоящей из рака, острого и хронического гепатита В. Это заболевание может характеризоваться активацией одного или нескольких лигандов Siglec-9.

Лечение немелкоклеточного рака легкого, колоректального рака, рака молочной железы, эпителиального рака яичников, гепатоцеллюлярной карциномы и рака предстательной железы могут быть особенно эффективно при использовании молекул анти-Siglec-9 антител или анти-Siglec-9 связывающих фрагментов или фармацевтических композиций, как описано в настоящем документе.

Предпочтительные варианты осуществления аспектов B1-B8 настоящего изобретения относятся к:

1. Молекула анти-Siglec-9 антитела или его анти-Siglec-9 связывающего фрагмента, содержащая:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены, определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены, и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены; и

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены, определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены, и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35 или последовательности, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены.

2. Молекула антитела или его связывающего фрагмента по пункту 1, содержащая:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VHCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30, определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (VHCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31, и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VHCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32; и

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VLCDR1) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33, определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (VLCDR2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VLCDR3) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35.

3. Молекула антитела или его связывающего фрагмента по пунктам 1 или 2, содержащая вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, примерно 85%, 90%, 95% или 99% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 36.

4. Молекула антитела или его связывающего фрагмента по любому из пунктов 1-3, содержащая вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере, примерно 85%, 90%, 95% или 99% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 37.

5. Молекула антитела или его связывающего фрагмента по любому из пунктов 1-4, содержащая вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислоту последовательность SEQ ID NO: 37.

6. Молекула антитела или его связывающего фрагмента по любому из пунктов 1-5, обладающая одним или несколькими (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) из следующих свойств:

(i) связывается с Siglec-9 человека со значением EC50 менее примерно 10 нМ, 1 нМ, 0,9 нМ, 0,8 нМ, 0,7 нМ, 0,6 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,2 нМ, 0,1 нМ, или 0,05 нМ, например, когда молекулу антитела или его связывающего фрагмента тестируют в виде двухвалентной молекулы с помощью ELISA, например, как описано в примере 3;