НАБОР ХАУСКИПИНГОВ ДЛЯ АНАЛИЗА ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПРИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/686 C12Q1/6876 C12N15/12 

Область техники настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к области генетики. В частности, настоящее изобретение относится к применению набора хаускипингов, состоящего из PSMD6, POLR2A и SARS1, для анализа экспрессии генов при болезни Паркинсона, где указанный набор хаускипингов стабильно экспрессируется в периферической крови человека, к набору праймеров и зондов для определения стабильной экспрессии указанного набора хаускипингов, а также к способу анализа экспрессии генов при болезни Паркинсона с использованием указанного набора хаускипингов.

Перечень последовательностей

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан на электронном носителе в машиночитаемом формате и посредством этого включен в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Включение посредством ссылки

Предпосылки к созданию настоящего изобретения были раскрыты авторами настоящего изобретения ранее в публикации Alieva, Anelya Kh. et al. "Housekeeping Genes for Parkinson's Disease in Humans and Mice" Cells, 2021, 10(9): 2252, опубликованной 30 августа 2021 г. Данный документ включен в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте и не является обстоятельством, препятствующим признанию патентоспособности настоящего изобретения, так как настоящая заявка на выдачу патента на изобретение подана в федеральный орган исполнительной власти по интеллектуальной собственности до истечения шести месяцев со дня раскрытия информации. Все остальные публикации, патенты и заявки на выдачу патента, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на выдачу патента была специально и отдельно указана как включенная посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Болезнь Паркинсона (БП) представляет собой возрастзависимое нейродегенеративное заболевание, которое характеризуется избирательной гибелью дофаминергических нейронов компактной части черной субстанции с накоплением в них аномальной формы синаптического белка α-синуклеина, а также патологией нигростриатного дофаминергического пути. Результатом снижения уровня дофамина в полосатом теле при БП является ряд двигательных расстройств, таких как брадикинезия. мышечная ригидность и другие. Широкая распространенность БП, инвалидизация больных, большие финансовые затраты на лечение и реабилитацию делают это заболевание социально значимым.

Важной особенностью данного заболевания является длительный скрытый период, в связи с чем необходим поиск прогностических биомаркеров. Одним из методов выявления биомаркеров БП является изучение изменения экспрессии генов в периферической крови и тканях пациентов, находящихся на ранней стадии заболевания и не подвергавшихся лечению.

На сегодняшний день выявлен ряд генов, изменение экспрессии которых позволяет выявлять и/или прогнозировать БП.

Известно, что в дебюте БП процесс поражения дофаминергических структур протекает на протяжении длительного времени без явных клинических проявлений, что. вероятно, объясняется включением разнообразных компенсаторных механизмов. Симптомы заболевания возникают только на достаточно «продвинутой» стадии нейропатологии, когда в дегенерацию вовлекается более 50% дофаминергических нейронов в черной субстанции, а уровень дофамина в стриатуме снижается более чем на 70%. Очевидно, что это накладывает серьезные ограничения на возможности оказания действенной помощи пациентам. Вот почему в настоящее время усилия исследователей направлены на разработку доклинической диагностики и превентивного лечения БП.

Например, в международной патентной публикации WO 2005/067391 А2 раскрыты молекулярные маркеры для обнаружения, прогноза и наблюдения за БП, где указанные молекулярные маркеры представляют собой один или несколько генов с измененным паттерном экспрессии.

Активное изучение экспрессии генов продолжается в настоящее время. Наиболее простой и широкоиспользуемый метод для анализа экспрессии генов на уровне мРНК является полуколичественный подход, основанный на реакции обратной транскрипции (RT) и количественной ПЦР в режиме реального времени (qPCR). Этот метод считается золотым стандартом исследования изменения экспрессии генов на уровне мРНК в биомедицинских исследованиях. Критически важным аспектом этого метода, как и других полуколичественных методов, является наличие референсных генов в качестве внутреннего контроля нормализации экспрессионных данных для гена-кандидата. Исходя из этого молено заключить, что точное определение изменения экспрессии генов-кандидатов зависит от правильного выбора внутренних референсных генов. Такие гены называются хаускипингами.

Из уровня техники известен ряд документов, раскрывающих использование генов хаускипингов для нормализации экспрессионных данных для гена-кандидата, изменение экспрессии которых связано с развитием БП.

В документе Bruckert, Geoffrey, et al. "Normalization of reverse transcription quantitative PCR data during ageing in distinct cerebral structures." Molecular neurobiology, 2016, 53(3): 1540-1550, описана нормализация данных количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-qPCR), в том числе в случае БП.

В документе George, Gincy, ct al. "Gene co-expression network analysis for identifying genetic markers in Parkinson's disease-a three-way comparative approach." Genomics, 2019. 1 11(4): 819-830, раскрыто исследование взаимодействия маркерных генов БП.

Процитированные источники подтверждают необходимое и важное значение генов хаускипингов для точного определения изменения экспрессии генов-кандидатов, связанных с БП. Однако авторами настоящего изобретения впервые было проведено исследование стабильности экспрессии хаускипингов в периферической крови пациентов с БП, подвергавшихся и не подвергавшихся лечению, а также в группе неврологически здоровых добровольцев.

Еще одним важнейшим шагом в данной области является возможность проведения анализа экспрессии генов при БП посредством исследования периферической крови человека, что очевидным образом облегчает процедуру диагностики. Проведение трапскриптомных исследований в головном мозге человека возможно только в тканях после вскрытия. Такие исследования, к сожалению, недостаточно хорошо отражают процессы, вовлеченные в патогенез заболевания особенно на ранних этапах. В связи с этим наиболее оптимальным подходом прижизненных исследований является исследование периферической крови, что позволяет изучать патогенез, в том числе, ранних стадиях заболевания. Таким образом, выявление хаускипингов для анализа экспрессии генов при БП, показывающих стабильную экспрессию в периферической крови человека, приводит к существенным преимуществам диагностических процедур.

Однако известно, что экспрессия наиболее распространенных хаускипингов может зависеть от внешних условий и изменяться при патологиях. К существенным недостаткам использования подобных хаускипингов в исследованиях является отсутствие их валидации в конкретных экспериментальных условиях, а также слепой перенос хаускипингов. подобранных для одного организма на другой, без сопутствующей тщательной проверки.

Это, в свою очередь, может накладывать отпечаток на получаемые результаты и/или приводить к ложным результатам в оценке изменения экспрессии генов-кандидатов.

В связи с этим в данной области техники сохраняется потребность в определении генов хаускипингов для анализа экспрессии генов при БП, показывающих валидность и стабильность экспрессии в периферической крови человека.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Поставленная на основании недостатков предшествующего уровня техники задача настоящего изобретения, состоящая в обнаружении хаускипингов для анализа экспрессии генов при болезни Паркинсона, показывающих валидность и стабильность экспрессии в периферической крови человека, была решена авторами настоящего изобретения посредством обнаружения определенного набора хаускипингов для анализа экспрессии генов при болезни Паркинсона, стабильно экспрессирующихся в периферической крови человека.

Таким образом, одним объектом настоящего изобретения является применение набора хаускипингов, состоящего из PSMD6, POLR2A и SARS1 для анализа экспрессии генов при болезни Паркинсона, где указанный набор хаускипингов стабильно экспрессируется в периферической крови человека.

Другим объектом настоящего изобретения является набор праймеров и зондов для определения стабильной экспрессии хаускипингов PSMD6, POLR2A и SARS1 в периферической крови человека, где набор праймеров и зондов представляет собой:

Другим объектом настоящего изобретения является способ анализа экспрессии генов при болезни Паркинсона, предусматривающий использование набора хаускипингов. состоящего из PSMD6, POLR2A и SARS1, в периферической крови человека с применением указанного набора праймеров и зондов.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 приведен пример обработки данных для анализа относительных уровней мРНК. Программное обеспечение RefFinder рассчитывает оценку референсных генов с использованием алгоритмов программ geNorm, Normfinder, BestKeeper и сравнительного метода ΔΔCt, а также значения Comprehensive Ranking. На основе этих оценок программа присваивает каждому гену соответствующую оценку и вычисляет среднее геометрическое их весов для общего окончательного рейтинга. Программа выбирает самый низкий балл среди рангов, присвоенных каждым алгоритмом отдельно, а затем присваивает окончательный общий балл. Чем ближе итоговая оценка к единице, тем стабильнее считается хаускипинг.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Определения

В контексте настоящего изобретения термин «хаускипинг» или «HKG» означает внутренний референсный ген, выполняющий роль внутреннего контроля нормализации экспрессионных данных для гена-кандидата. В качестве HKG чаще всего рассматриваю тс я гены со стабильной экспрессией во всех биологических образцах, и чья экспрессия не изменяется в экспериментальных условиях или в условиях болезни. Хаускипингами считаются гены, контролирующие базовый метаболизм и отвечающие за выживаемость клетки, поддержание гомеостаза клетки и/или другие фундаментальные процессы в клетке. Считается, что экспрессия этих генов не должна зависеть от влияния различных факторов, действующих на клетку, ткань и организм или же обладать минимальными различиями.

В контексте настоящего изобретения термин «ген-кандидат» означает ген, изменение экспрессии которого должно быть обнаружено при использования нормализации относительно экспрессии соответствующего хаускипинга.

В контексте настоящего изобретения термин «праймер» означает олигонуклеотид, способный выступать в роли точки инициации синтеза продукта удлинения праймера, представляющего собой комплементарную нить нуклеиновой кислоты (всех типов ДНК или РНК), в подходящих условиях амплификации (например, буфер, соль, температура и рН) в присутствии нуклеотидов и агента, полимеризующего нуклеиновые кислоты (например, ДНК-зависимую или РНК-зависимую полимеразу).

В контексте настоящего изобретения термин «прямой праймер» означает праймер, гибридизующийся (или отжигающийся) с последовательностью-мишеныо (например, матричная нить). Фраза «обратный праймер» означает праймер, гибридизующийся (или отжигающийся) с комплементарной нитью последовательности-мишени. Прямой праймер гибридизуется ближе к 5'-концу последовательности мишени, чем обратный праймер.

В контексте настоящего изобретения термин «зонд» означает олигонуклеотид, способный селективно гибридизоваться по меньшей мере с частью последовательности-мишени в соответствующих условиях амплификации (например, амплифицированной части последовательности-мишени).

В контексте настоящего изобретения термин «набор праймеров и зондов» означает комбинацию, включающую два или более праймеров, которые в совокупности служат затравкой для амплификации последовательности-мишени или нуклеиновой кислоты-мишени, и по меньшей мере одного зонда, способного обнаружить последовательность-мишень или нуклеиновую кислоту-мишень. В общем случае, зонд гибридизуется с нитью продукта амплификации (или ампликона), что приводит к образованию гибрида продукта апмлификации с зондом, который можно обнаружить с помощью стандартных способов, известных из уровня техники.

В контексте настоящего изобретения термины «последовательность-мишень» или «нуклеиновая кислота-мишень» используются взаимозаменяемо и означают объект, чье присутствие или отсутствие необходимо обнаружить.

Раскрытие настоящего изобретения

В настоящее время проводится активное изучение экспрессии генов. Наиболее простой и широкоиспользуемый метод для анализа экспрессии генов на уровне мРНК является полуколичественный подход, основанный на реакции обратной транскрипции (RT) и количественной ПЦР в режиме реального времени (qPCR). Этот метод считается золотым стандартом исследования изменения экспрессии генов на уровне мРНК в биомедицинских исследованиях. Критически важным аспектом этого метода, как и других полуколичественных методов, является наличие референсных генов в качестве внутреннего контроля нормализации экспрессионных данных для гена-кандидата. Исходя из этого можно заключить, что точное определение изменения экспрессии генов-кандидатов зависит от правильного выбора внутренних референсных генов. Такие гены называются хаускипингами.

Однако в предшествующем уровне техники не раскрыты данные исследований, направленных на подтверждение валидности и стабильности экспрессии хаускипингов для анализа экспрессии генов при болезни Паркинсона в периферической крови человека.

С целью решения поставленной задачи настоящего изобретения авторами настоящего изобретения был осуществлен поиск, отбор и исследование наиболее стабильных хаускипингов для анализа экспрессии генов при болезни Паркинсона в периферической крови человека.

Авторами настоящего изобретения впервые было проведено исследование стабильности экспрессии хаускипингов в периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона, подвергавшихся и не подвергавшихся лечению, а также в группе неврологически здоровых добровольцев. Цель проведенного исследования состояла в определении хаускипингов, действительно обладающих стабильными уровнями экспрессии в периферической крови человека вне зависимости от развития изучаемой патологии в организме, а также показывающих валидацию в конкретных экспериментальных условиях, что приводит к возможности слепого переноса хаускипингов, подобранных для одного организма на другой, без сопутствующей тщательной проверки.

На сегодняшний день как в литературе, так и в коммерческих панелях известны сотни референсных генов. При этом зачастую данные одного экспрессионного исследования не воспроизводят результаты других аналогичных работ, различия в получаемых результатах могут скрываться в выборе и стабильности хаускипингов. Ярким примером может служить сравнение результатов для хаускипинга Gapdh, который согласно более ранним сведениям был указан как один из наиболее стабильных хаускипингов, среди рассмотренных, однако, позже, в 2020 году та же группа ученых пришла к выводу, что Gapdh обладает весьма изменчивой экспрессией в процессе репрограммирования. Напротив, в более ранних работах Rpsl8 рассматривался как один из изменчивых хаускипингов, однако, в последующей работе Rpsl8 был отнесен к стабильным хаускипингам.

Таким образом, анализ имеющихся сведений по используемым хаускипингам не позволяет выявить хаускипинги, обладающие стабильной экспрессией и валидностью, однако, в связи с отсутствием возможности исследовать все возможные хаускипинги. необходим для сужения ряда хаускипингов, которые могут быть включены в исследование по определению стабильной экспрессии и валидности.

По этой причине авторами настоящего изобретения для отбора кандидатов в хаускипинги был проведен скрининг данных в PubMed. Поиск в MeSH по ключевым терминам «housekeeping gene» (фильтр: Humans) позволил выявить 26399 публикаций, начиная с 2000 года. Поиск по ключевым словам «housekeeping PCR» (фильтр: Humans) позволил выявить 880 результатов, начиная с 2000 года. Поиск по ключевым словам "housekeeping real time PCR" (фильтр: Humans) позволил выявить 562 результата, начиная с 2000 года. Поиск по ключевым словам «housekeeping real time PCR brain» (фильтр: Humans) позволил выявить 29 результатов, начиная с 2001 года. Дальнейшее ограничение по области применения хаускипингов из этих 29 результатов выявило 4 результата, непосредственно связанные с анализом хаускипингов в неопухолевых образцах.

Кроме того, для отбора потенциальных хаускипингов авторами настоящего изобретения были использованы данные по анализу референсных генов в тканях головного мозга, нейрональной линии, дифференцированной из костных мезенхимальных стволовых клеток, и тканях человека. Используя данные, приведенные в отобранных 7 работах, был составлен список потенциальных генов-хаускипингов для дальнейшего анализа, состоящий из 542 генов.

Далее авторами настоящего изобретения был проведен еще один дополнительный скрининг публикаций по запросу «gene expression Parkinson's disease rna» (фильтр: human) в базе данных PubMed и было выявлено 715 публикаций. В рандомном порядке был проанализирован раздел «материалы и методы» для 100 публикаций и был составлен список референсных генов, которые используются в исследованиях по анализу экспрессии генов.

Далее авторами настоящего изобретения были сопоставлены два сформированных списка и для последующего исследования стабильности экспрессии и валидности были отобраны гены, входящие в оба списка.

Далее авторами настоящего изобретения был проведен анализ отобранных хаускипингов с использованием установленных авторами настоящего изобретения подходов. Все потенциальные хаускипинги должны удовлетворять определенным условиям. Во-первых, в геноме не должно быть псевдогенов этих генов. Известно, что процессированные псевдогены, лишенные интронов и являющиеся почти полными копиями зрелых мРНК соответствующих генов, составляют 70% от всех псевдогенов. В связи с этим нельзя быть уверенным, что подобранные системы праймеров будут абсолютно специфичны к целевой мРНК.

В результате биоинформэтического анализа были выявлены псевдогены у таких широкоиспользуемых хаускипингов, как АСТВ, GUSB, PPIA, YWHAZ и GAPDH. Так, например, АСТВ имеет 22 псевдогена, а GAPDH - 47. Псевдогены способны амплифицироваться вместе с кДНК, полученной из таргетной РНК. С одной стороны, решением данной проблемы может служить обработка ДНКазами, однако, при этом сильно снижается выход выделенной РНК. Такой метод малоприменим, когда целью исследования является анализ изменения уровней низкопредставленных транскриптов. С другой стороны, можно исключить амплификацию геномной ДНК путем подбора праймеров на межэкзонные спайки, таким образом будет экспрессироваться только целевая кДНК, полученная из зрелой РНК, лишенной интронов. Однако, известно, что процессированные псевдогены, лишены интронов, являются почти полными копиями зрелых мРНК соответствующих генов и составляют 70% от всех псевдогенов. В связи с этим нельзя быть уверенным, что подобранные системы праймеров будут абсолютно специфичны к целевой мРНК и целесообразным является не использовать в работе гены, имеющие псевдогены.

Остальные отобранные по результатам анализа литературы хаускипинги прошли биоинформатический анализ. При этом важно отметить, что для генов PSMD7 (NM_002811.5) и HPRT1 (NM_000194.3) были обнаружены псевдогены in silico, однако, экспериментального подтверждения их существования на данный момент нет, поэтому авторы настоящего изобретения предположили возможность отбора этих генов для дальнейшего анализа. Кроме того, были подобраны праймеры таким образом, чтобы они не отжигались на область предполагаемых псевдогенов в геноме.

Вторым важным установленным авторами настоящего изобретения подходом было то, что под референсным геном подразумевается ген, экспрессия которого не изменяется вне зависимости от развития изучаемой патологии в организме.

Авторы изобретения еще раз отмечают, что проведенный предшествующий основной исследовательской работе обзор литературы вызван известностью на сегодняшний день сотен референсных генов как в литературе, так и в коммерческих панелях. При этом раскрытые сведения либо представляют собой результаты аналитической работы, либо не относятся к хаускипингам для анализа экспрессии генов при болезни Паркинсона в периферической крови человека, тогда как исследование стабильности экспрессии и валидности хаускипингов для анализа экспрессии генов при болезни Паркинсона в периферической крови человека было впервые проведено авторами настоящего изобретения. Кроме того, как уже отмечено выше, авторами настоящего изобретения был выявлен свой уникальный подход при выявлении подлежащего дальнейшему исследованию ряда хаускипингов. Как уже указано выше, хаускипинг должен удовлетворять нескольким условиям. В частности, уровни экспрессии хаускипингов должны быть стабильны вне зависимости от развития изучаемой патологии в организме. При этом, из имеющихся в данной области техники сведений авторами настоящего изобретения в ряд хаускипингов для исследования были включены хаускипинги PSMD7 (NM_002811.5) и HPRT (NM_000194.3), для которых обнаружены псевдогены in silico, что делает их включение в ряд хаускипингов для исследования неочевидным на основании установленного подхода к оценке хаускипингов.

В результате авторами настоящего изобретения были отобраны хаускипинги PSMD6, POLR2A, POLR2F, SARS1, PSMA5, HPRT1, PSMD7, AARS1, ВСАТ2 и TBP, для которых авторами настоящего изобретения посредством системы TaqMan были разработаны системы праймеров и зондов для анализа стабильности экспрессии отобранных хаускипингов (таблица 1) и проведен анализ изменения их относительных уровней мРНК в образцах периферической крови человека.

В результате исследования, впервые проведенного авторами настоящего изобретения с целью экспериментального выявления хаускипингов, которые показывают стабильную экспрессию и валидность при анализа экспрессии генов при болезни Паркинсона в периферической крови человека, подробно описанного далее в разделе «Примеры», авторами настоящего изобретения неожиданно на основании ранее имеющихся аналитический данных был выявлен строго определенный набор хаускипингов PSMD6, POLR2A и SARS1, показывающих стабильную экспрессию и валидность в периферической крови человека.

При этом, гены ТВР, POLR2F и BCAT2 неожиданным образом показали предельно низкий для их детекции уровень сигнала, в результате чего они были исключены из исследования, несмотря на отсутствие в представленной для обзора литературе каких-либо предпосылок к этому.

Для полученного набора хаускипингов авторами настоящего изобретения посредством системы TaqMan был разработан набор праймеров и зондов для определения стабильной экспрессии набора хаускипингов PSMD6, POLR2A и SARS1 в периферической крови человека при анализе экспрессии генов при болезни Паркинсона (таблица 2).

В результате исследовательской работы авторам настоящего изобретения удалось выявить строго определенный набор хаускипингов PSMD6, POLR2A и SARS1, показывающих стабильную экспрессию и валидность в периферической крови человека.

Кроме того, в ходе проведенного авторами настоящего изобретения исследования ими было неожиданно обнаружено, что выявленный в результате указанного исследования строго определенный набор хаускипингов показывает стабильную экспрессию независимо от наличия патологического процесса.

Данные результаты авторам настоящего изобретения удалось получить благодаря тому, что в рамках проведенной ими исследовательской работы изначально было сделано заключение о важном значении стабильной экспрессии хаускипинга независимо от наличия патологического процесса.

Таким образом, авторами настоящего изобретения получен строго определенный набор хаускипингов PSMD6, POLR2A и SARS1, позволяющий проводить изучение патологического процесса, обусловленного патогенезом болезни Паркинсона. у человека.

В результате неожиданно выявленного в ходе исследования набора хаускипингов PSMD6, POLR2A и SARS1, показывающего стабильную экспрессию при анализе экспрессии генов при болезни Паркинсона в периферической крови человека, а также посредством разработанного авторами настоящего изобретения набора праймеров и зондов для определения стабильной экспрессии указанного набора хаускипингов в периферической крови человека, авторами настоящего изобретения также был разработан способ анализа экспрессии генов при болезни Паркинсона, предусматривающий использование указанного набора хаускипингов в периферической крови человека с применением указанного набора праймеров и зондов.

Разработанный авторами настоящего изобретения набор праймеров и зондов, а также разработанный авторами настоящего изобретения способ анализа экспрессии генов при болезни Паркинсона обеспечивают эффективный анализ экспрессии генов при болезни Паркинсона благодаря использованию неожиданного выявленного в ходе исследования строго определенного набора хаускипингов PSMD6, POLR2A и SARS1, показывающих стабильную экспрессию и валидность в периферической крови человека.

Примеры

Список сокращений и обозначений

HKG - хаускипинг

Comprehensive score - комплексный балл

Gene rank - ранг гена

RT-qPCR - количественная ПЦР в режиме реального времени

Пример 1. Определение набора хаускипингов, показывающих стабильную экспрессию и валидность в периферической крови человека, для проведения анализа экспрессии генов при болезни Паркинсона

Было проанализировано 35 пациентов с болезнью Паркинсона, не подвергавшихся лечению, и 12 пациентов с болезнью Паркинсона, подвергавшихся лечению. Все пациенты находились на 1-2 стадии по шкале Хен и Яр. Средний возраст ± стандартное отклонение начала заболевания составлял 58,6±7,4 лет (разброс 46-71), средний возраст при включении в выборку составлял 59,2±7,1 лет (разброс 47-73).

У этих пациентов не было серьезных сопутствующих заболеваний, таких как тяжелые сердечно-сосудистые заболевания, злокачественная опухоль или сахарный диабет. Пациенты с болезнью Паркинсона, подвергавшиеся лечению, получали различные препараты с агонистами дофаминовых рецепторов (прамипексол в дозе 1,5 мг/день или пирибедил в дозе 150 мг/день, L-допа в дозе 150-200 мг/день или амантадин в дозе 300 мг/день) либо в виде монотераиии, либо в различных комбинациях.

Пациенты с болезнью Паркинсона были диагностированы в Научном центре неврологии (Москва, Россия). Они были отобраны и изучены в соответствии с Объединенной шкалой оценки болезни Паркинсона (UPDRS) Международного общества по борьбе с расстройствами здоровья (MDS) и шкалой Хен и Яр. Диагноз болезни Паркинсона основывался на критериях Банка головного мозга Британского общества болезни Паркинсона.

В качестве контроля были исследованы 44 неврологически здоровых добровольца.

Пациенты и неврологически здоровые добровольцы (русские, проживающие в Европейской части России) были отобраны в Научном центре неврологии (Москва, Россия). Все участники были обследованы на наличие частых мутаций во всех генах, ответственных за моногенные формы болезни Паркинсона, и не имели семейного анамнеза болезни Паркинсона. У всех участников не было серьезных сопутствующих заболеваний, таких как тяжелые сердечно-сосудистые заболевания, злокачественная опухоль или сахарный диабет.

Исследование проводили в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассамблеи - Этическими принципами медицинских исследований с участием людей. Все образцы крови были собраны с информированного согласия обследуемых лиц. Исследование одобрено этическим комитетом Научного центра неврологии (Москва, Россия), протокол 18/4 от 3 марта 2021 г.

Выделение РНК

Выделение тотальной РНК из 250 мкл каждого образца периферической крови проводили с использованием набора MiniPrep Kit для цельной крови (Zymo Research Corp., США).

Концентрацию выделенной РНК из образцов измеряли с помощью набора Quant-iT RNA BR Assay Kit и флуориметра Qubit 3.0 (Invitrogen, США). Качество РНК контролировали с помощью автоматической системы электрофореза Experion (Bio-Rad Laboratories). Индекс качества РНК был выше 8,5 во всех выборках.

Все процедуры проводили согласно рекомендациям производителей.

Анализ изменения относительных уровней мРНК

Анализ экспрессии генов проводили с использованием ПЦР в реальном времени с зондами TaqMan. Все образцы обрабатывали как можно более равномерно, чтобы свести к минимуму любые случайные смещения. Одноцепочечную ДНК синтезировали с использованием 120 нг тотальной РНК, 100 нг тРНК Escherichia coli в качестве носителя, специфических праймеров и набора RevertAid Н Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fischer Scientific, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Каждую реакцию проводили с тремя повторениями.

Праймеры и зонды для ПЦР в реальном времени выбирали с помощью программы Beacon Designer 7.0.2 и нуклеотидных последовательностей генов человека. Последовательности специфичных для генов праймеров и зондов перечислены в таблице 1.

кДНК, полученную в реакции обратной транскрипции, использовали в качестве матрицы для количественной ПЦР. Его разводили в 50 раз водным раствором тРНК из Escherichia coli (0,02 нг/мкл). ПЦР проводили с использованием системы StepOnePlus™ (Applied Biosystems, США), системы QuantStudio™ 3 (Thermo Fisher Scientific, США) и реагентов для ПЦР (Syntol, Россия). Температурный цикл ПЦР: 60 с при 50°С, 40 циклов по 15 с при 95°С и 40 с при 61°С; 30 с при 25°С. Термический цикл для образцов от крыс выполняли следующим образом: 600 с при 95°С и 45 циклов: 5 с при 95°С, а затем 10 с при 60°С. Реакцию повторяли три раза для каждой кДНК для корректировки различий в качестве образцов и эффективности обратной транскрипции.

Статистический анализ

Праймеры и зонды для анализа отбирали с помощью Beacon Designer 7.0 (Premier Biosoft International, США) и соответствующих последовательностей из базы данных NCBI. Специфичность праймеров и зондов проверяли с помощью Primer3, Primer-BLAST. Оценку экспрессии референсных генов проводили с использованием значений пороговых циклов амплификации и инструмента RefFinder.

Программа RefFinder рассчитывала оценку референсных генов с использованием алгоритмов программ geNorm, Normfinder, BestKeeper и сравнительного метода ΔΔCt.

На основе этих оценок программа присваивает каждому гену соответствующую оценку и вычисляет среднее геометрическое их весов для общего окончательного рейтинга. Программа выбирает самый низкий балл среди рангов, присвоенных каждым алгоритмом отдельно, а затем присваивает окончательный общий балл. Чем ближе итоговая оценка к единице, тем стабильнее считается хаускипинг. Результаты представлены в таблице 3.

Результаты

Для выявления наиболее стабильных хаускипингов в условиях болезни Паркинсона был проведен анализ стабильности хаускипингов отдельно в группе здоровых добровольцев и отдельно в группе пациентов с болезнью Паркинсона. Оценку стабильности проводили на основе расчета комплексного балла для каждого гена. В каждом конкретном случае (наличие/отсутствие патологии) наиболее стабильным является хаускипинг, обладающий минимальным комплексным баллом.

Результаты показывают, что стабильность экспрессии изучаемых хаускипингов различается в зависимости от наличия или отсутствия патологических процессов. Однако задача поставленного исследования состояла в определении хаускипингов, показывающих стабильную экспрессию независимо от наличия патологии. По этой причине возникла необходимость в проведении дальнейшего суммарного статистического анализа, с целью определения суммарного комплексного балла, значение которого позволит выявить хаускипинги, показывающие стабильную экспрессию независимо от наличия патологии.

Определение суммарного комплексного балла

Исходя из полученных результатов, что стабильность в условиях наличия и отсутствия патологии различается, при проведении работ по экспрессионному анализу необходимо использовать хаускипинги, чья экспрессия наиболее стабильна как при наличии, так и при отсутствии патологии. Исходя из этого, был посчитан итоговый ранг хаускипингов, основанный на расчете суммарного комплексного балла (таблица 4). Суммарный комплексный балл для каждого хаускипинга был суммирован из комплексных баллов, полученных при анализе группы добровольцев и пациентов с болезнью Паркинсона.

Так, например, в головном мозге в целом вне зависимости от наличия или отсутствия патологии наиболее стабильно экспрессирующимся является PSMD6 и занимает соответственно первое место (Gene rank=1) с суммарным комплексным баллом 4.56=2.11+2.45, где 2.1 представляет собой значение комплексного балла из столбика «здоровые добровольцы» таблицы 3, а 2.45 представляет собой значение комплексного балла из столбика «пациенты с болезнью Паркинсона» таблицы 1. Таким образом, ген с наиболее низким значением рассматривается как наиболее стабильно экспрессирующимся и занимает первое место в рейтинге (Gene rank=1).

Результаты

В результате проведенного исследования был определен набор хаускипингов, состоящий из PSMD6, POLR2A и SARS1, которые показывают стабильную экспрессию и валидность в периферической крови человека, независимо от наличия патологии. Выявление указанного набора хаускипингов является неожиданным результатом проведенного исследования, так как хаускипинги для исследования были в равной степени отобраны согласно установленному авторами настоящего изобретения подходу. При этом в представленной для обзора литературе отсутствовали какие-либо сведения о нестабильной экспрессии хаускипингов, которые не вошли в выявленный согласно проведенному исследованию набор хаускипингов, показывающих стабильную экспрессию и валидность в периферической крови человека.

Указанные специфические для периферической крови человека результаты основаны на широко распространенном в данной области техники подходе, что при анализе изменений экспрессии генов необходимо учитывать как минимум два хаускипинга и следует учитывать гены, расположенные на 1-м, 2-м и максимум на 3-м месте на основании полученного ранга гена.

В целом, исходя из полученных данных, хаускипинг PSMD6 имеет наиболее стабильную экспрессию среди всех изученных хаускипингов в периферической крови человека.

Таким образом, авторам настоящего изобретения удалось выявить набор хаускипингов, состоящий из PSMD6, POLR2A и SARS1, для применения для анализа экспрессии генов при болезни Паркинсона, где указанный набор хаускипингов стабильно экспрессируется в периферической крови человека, а также разработать набор праймеров и зондов для определения стабильной экспрессии набора хаускипингов, состоящего из PSMD6, POLR2A и SARS1, в периферической крови человека и способ анализа экспрессии генов при болезни Паркинсона. предусматривающий использование набора хаускипингов, состоящего из PSMD6, POLR2A и SARS1, в периферической крови человека с применением разработанного набора праймеров и зондов, где разработанные набор праймеров и зондов и способ анализа экспрессии обеспечивают эффективный анализ экспрессии генов при болезни Паркинсона в периферической крови человека.

Перечень ссылочных источников

1. VanGuilder, H.D., K.Е. Vrana, and W.M. Freeman, Twenty-five years of quantitative PGR for gene expression analysis. Biotechniques, 2008. 44(5): p. 619-26.

2. Dheda, K., et al., Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PGR. Biotechniques, 2004. 37(1): p. 112-4, 116, 118-9.

3. Takagi, S., et al., Suitable reference genes for the analysis of direct hyperplasia in mice. Biochem Biophys Res Commun, 2008. 377(4): p. 1259-64.

4. Tatsumi, K., et al., Reference gene selection for real-time RT-PCR in regenerating mouse livers. Biochem Biophys Res Commun, 2008. 374(1): p. 106-10.

5. Vandesompele, J.; De Preter, K.; Pattyn, F.; Poppe, В.; Van Roy, N.; De Paepe, A.; Speleman, F. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome biology 2002, 3, RESEARCH0034, doi: 10.1186/gb-2002-3-7-research0034.

6. Andersen, C.L.; Jensen, J.L.; Orntoft, T.F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer research 2004, 64. 5245-5250, doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-0496.

7. Pfaffl, M.W.; Tichopad, A.; Prgomet, C.; Neuvians, T.P. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper-Excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnology letters 2004, 26, 509-515, doi:10.1023/b:bile.0000019559.84305.47.

8. Silver, N.; Best, S.; Jiang, J.; Thein, S.L. Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR. BMC molecular biology 2006, 7, 33, doi:10.1186/1471-2199-7-33.

9. Nicot, N., et al., Housekeeping gene selection for real-lime RT-PCR normalization in potato during biotic and abiotic stress. J Exp Bot, 2005. 56(421): p. 2907-14.

10. Chervoneva, I., et al., Selection of optimal reference genes for normalization in quantitative RT-PCR. BMC Bioinformatics, 2010. 11: p. 253.

11. Thellin, O., et al., A decade of improvements in quantification of gene expression and internal standard selection. Biotechnol Adv, 2009. 27(4): p. 323-33.

12. Panina, Y., et al., Validation of Common Housekeeping Genes as Reference for qPCR Gene Expression Analysis During iPS Reprogramming Process. Sci Rep, 2018. 8(1): p. 8716.

13. Panina, Y., A. Germond, and T.M. Watanabe, Analysis of the stability of 70 housekeeping genes during iPS reprogramming. Sci Rep, 2020. 10(1): p. 21711.

14. Maurer-Morelli, C.V., el al., A comparison between different reference genes for expression studies in human hippocampal tissue. J Neurosci Methods, 2012. 208(1): p. 44-7.

15. Penna, I., et al., Selection of candidate housekeeping genes for normalization in human postmortem brain samples. Int J Mol Sci, 2011. 12(9): p. 5461-70.

16. Gebhardt, F.M., H.A. Scott, and P.R. Dodd, Housekeepers for accurate transcript expression analysis in Alzheimer's disease autopsy brain tissue. Alzheimers Dement, 2010. 6(6): p. 465-74.

17. Swijsen, A., et al., Validation of reference genes for quantitative real-time PCR studies in the dentate gyrus after experimental febrile seizures. BMC Res Notes, 2012. 5: p. 685.

18. Harrison, P.J., et al., Human brain weight is correlated with expression of the 'housekeeping genes' beta-2-microglobulin (beta2M) and TATA-binding protein (TBP). Neuropathol Appl Neurobiol, 2010. 36(6): p. 498-504.

19. He, Y.X., et al., Selection of suitable reference genes for reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction analysis of neuronal cells differentiated from bone mesenchymal stem cells. Mol Med Rep, 2015. 12(2): p. 2291-300.

20. Warrington, J.A., et al., Comparison of human adult and fetal expression and identification of 535 housekeeping/maintenance genes. Physiol Genomics, 2000. 2(3): p. 143-7.

21. Sasidharan, R. and M. Gerstein, Genomics: protein fossils live on as RNA. Nature. 2008. 453(7196): p. 729-31.

22. Torrents, D., et al., A genome-wide survey of human pseudogenes. Genome Res, 2003. 13(12): p. 2559-67.

23. Balaji, S. and A. Vanniarajan, Implication of Pseudo Reference Genes in Normalization of Data from Reverse Transcription-Quantitative PCR. Gene, 2020. 757: p. 144948.

24. Fahn, B.S., R. Elton, M.o.t. U.D. Committee, Unified Parkinson's Disease rating scale. Recent developments in Parkinson's disease. Florham Park, NY, Macmillan Health Care Information, 1987.

25. Goetz, C.G., et al., Movement Disorder Society Task Force report on the Hoehn and Yahr staging scale: status and recommendations. Mov Disord, 2004. 19(9): p. 1020-8.

26. Hughes, A.J., et al., Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson's disease: a clinico-pathological study of 100 cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 1992. 55: p. 181-184.

27. Suslov, O. and D.A. Steindler, PCR inhibition by reverse transcriptase leads to an over estimation of amplification efficiency. Nucleic Acids Res, 2005. 33(20): p. e181.

28. NCBI Database. 15 July 2019]; Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

29. Primer3. 15 July 2019]; Available from: http://bioinfo.ut.ee/primer3.

30. Primer-BLAST. 15 July 2019]; Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/.

31. Xie, F., et al., miRDeepFinder: a miRNA analysis tool for deep sequencing of plant small RNAs. Plant Mol Biol, 2012.

32. A.B. Ставровская, Д.Н. Воронков, А.С. Гущина, А.С. Ольшанский, Н.Г. Ямщикова, «Особенности моделирования ранней клинической стадии болезни Паркинсона», Экспериментальная неврология, DOI: 10.24411/2071-5315-2018-12057

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение Институт молекулярной

генетики Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»

<120> набор хаускипингов для анализа экспрессии генов при болезни

Паркинсона в периферической крови человека и его применение

POLR2A-зонд

5’-FAM-CCACCTGGTTGATGGAGTTCCGCACAGTC-BHQ1-3’

POLR2A-прямой праймер

5’-AGACTGCTGAGACTGGATACATCC-3’

POLR2A-обратный праймер

5’-AGGCCGTCTTCGCCGTAG-3’

PSMD6-Зонд

5’-FAM- AGGCGGTTTCTCCTGTCCCAGTCTCCTC -BHQ1-3’

PSMD6-прямой праймер

5’- AACACAGAAAAGGCCAAAAGCTTAAT -3’

PSMD6-обратный праймер

5’- AATAGCCACACAATAAAGACCCTGAT -3’

SARS1-зонд

5’-FAM-TCGCCACTCGCTGTCTGCCTTCACCA-BHQ1-3’

SARS1-прямой праймер

5’-CCCAGCCCTCATCCGAGAG-3’

SARS1-обратный праймер

5’-TGTTCAAGTTGTCTGCCCGAAATC-3’

<---

Настоящее изобретение относится к области генетики. Описан способ анализа экспрессии генов при болезни Паркинсона, предусматривающий выделение РНК из образца периферической крови, и применение набора праймеров и зондов для определения стабильности экспрессии хаускипингов PSMD6, POLR2A и SARS1 в периферической крови человека. Технический результат заключается в определении хаускипингов для анализа экспрессии генов при болезни Паркинсона, показывающих валидность и стабильность экспрессии в периферической крови человека. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл., 1 пр.

1. Набор праймеров и зондов для определения стабильной экспрессии хаускипингов PSMD6, POLR2A и SARS1 в периферической крови человека при анализе экспрессии генов при болезни Паркинсона, где набор праймеров и зондов представляет собой:

2. Способ анализа экспрессии генов при болезни Паркинсона, предусматривающий выделение РНК из образца периферической крови, и применение набора праймеров и зондов по п.1 для определения стабильности экспрессии хаускипингов PSMD6, POLR2A и SARS1 в периферической крови человека.