СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННОГО УВЕЛИЧЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2023 года по МПК G01N33/48 C12M1/42 C12N5/95 

Изобретение относится к области медицины, в частности к экспериментальным исследованиям в онкологии, и может быть использовано для ингибирования радиационно-индуцированного увеличения количества опухолевых стволовых клеток (далее – ОСК).

Лучевая терапия является одним из основных методов лечения злокачественных новообразований, в том числе рака молочной железы (РМЖ). Но несмотря на достигнутый прогресс современных методов лечения у части больных наблюдается развитие резистентности к противоопухолевой терапии с последующим рецидивированием опухолевого процесса и метастазированием, которое является одной из основных причин гибели онкологических больных. Поэтому, основная цель в борьбе со злокачественными новообразованиями заключается в преодолении терапевтической резистентности и предотвращении рецидива заболевания.

В настоящее время имеются убедительные доказательства того, что опухоли, в том числе и РМЖ, имеют иерархическую организацию и управляются небольшой долей клеток, обладающей свойствами стволовых – опухолевыми стволовыми клетками (ОСК) или опухоль-инициирующими (Kakarala M., Wicha M. Implications of the Cancer Stem-Cell Hypothesis for Breast Cancer Prevention and Therapy // J Clin Oncol. – 2008. – V. 26. – Nj/ 17. – P. 2813–2820; Taurina S., Alkalif H. Breast cancers, mammary stem cells, and cancer stem cells, characteristics, and hypotheses // Neoplasia. – 2020. – V. 22. – No. 12. – P. 663-678). Эти клетки не только отвечают за инициацию, рост и развитие опухолей, но также участвуют в метастазировании и формировании резистентности к лечению, включая лучевую терапию (ЛТ) (Zhu P., Fan Z. Cancer stem cells and tumorigenesis// Biophysics Reports. – 2018. – V 4. – No 4. – P. 178-188; Lytle N.K., Barber A.G., Reya T. Stem cells fate in cancer growth, progression and therapy resistance// Nature Reviews – 2018. – V.18. – P. 669-680; Zeng X., Liu C., Wan H. et al. Breast cancer stem cells, heterogeneity, targeting therapies and therapeutic implications// Pharmacological Research. – 2021. – V. 163. – P. 105320-105362). Поэтому полагают, что именно ОСК определяют эффективность лечения злокачественных новообразований.

Для идентификации и выделения ОСК в опухолях разных локализаций используется целый ряд иммунофенотипических и функциональных маркеров. Так, для ОСК молочной железы характерен иммунофенотип CD44⁺CD24^-/low (Al-Hajj M., Wicha M.S., Benito-Hernandez A., et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 2003. – V. 100. – No 7. – P. 3983–3988; Fillmore C.M., Kuperwasser C. Human breast cancer cell lines contain stem-like cells that self-renew, give rise to phenotypically diverse progeny and survive chemotherapy// Breast Cancer Res. - 2008. –V. 10. - No 2. – Article R25). Показано, что CD44⁺CD24^-/low клетки инициируют развитие опухоли, являются более радио- и химиорезистентными по сравнению с остальными (не стволовыми) клетками РМЖ, способствуют метастазированию и, более того, воздействие редкоионизирующего излучения может приводить к увеличению их количества (Camerlingo R., Ferraro G. A., Francesco de F. et al. The role of CD44+ /CD24-/low biomarker for screening, diagnosis and monitoring of breast cancer // Oncology reports. – 2014.- V.31. – P. 1127-1132; Li W., Ma H., Zhang J. et al. Unraveling the roles of CD44/ CD24 and ALDH1 as cancer stem cell markers in tumorigenesis and metastasis // Scientific reports. – 2017. – doi: 10.1038/s41598-017-14364-2; Sheridan C., Kishimoto H., Fuch K.R. et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis // Breast Cancer Research. – 2006. – V. 8. – No. – 5. – P. 1-13, Philips T.M., McBride W., Pajonk F. The Response of CD24 ^−/low /CD44⁺ Breast Cancer–Initiating Cells to Radiation // JNCI: Journal of the National Cancer Institute. – 2006. – V. 98. – P. 1777-1785; Замулаева И.А., Матчук О.Н., Селиванова Е.И. и др. Увеличение количества опухолевых стволовых клеток под действием редкоионизирующего излучения // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2014. – Т. 54. – № 3. – с. 256-264; Churyukina K. A., Zhuze A.L., Ivanov A.A. et al. Effects of dimeric bisbenzimidazoles and ionizing radiation on MCF-7 breast cancer stem cells // Biophysics – 2020 – Vol.65. – No 1. – P. 87-96). Поэтому актуальной задачей является разработка новых способов терапии, чтобы не только элиминировать радиорезистентные ОСК, существовавшие ранее в опухоли, но и ингибировать образование новых ОСК, индуцированных облучением.

В настоящее время выделяют два основных и тесно связанных друг с другом механизма которые участвуют в формировании пула ОСК после облучения – это процесс эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), который усиливается под влиянием радиационного воздействия, и радиационная инициация программы дедифференцировки опухолевых клеток в ОСК (Zhang X, Li X, Zhang N. et al. Low doses ionizing radiation enhances the invasiveness of breast cancer cells by inducing epithelial-mesenchymal transition // Biochem Biophys Res Commun – 2011. – V. 412. –No. 1. – P. 188–92; De Bacco F, Luraghi P, Medico E. et al. Induction of MET by ionizing radiation and its role in radioresistance and invasive growth of cancer // J Natl Cancer Inst. – 2011. – V. 103. – No. 8. – P. 645-661; Lagadec C., Vlashi E., Donna L. D. et al. Radiation-induced reprograming of breast cancer cells // Stem cells. – 2012. – V. 30. – No. 5. – P. 833-844; Li F., Zhou K., Gao L. et al. Radiation induces the generation of cancer stem cells: A novel mechanism for cancer radioresistance (Review) // Oncology letters. – 2016. – V. 12. – P. 3059-3065). Поэтому многие известные способы элиминации/снижения роста критически важной популяции ОСК после противоопухолевых воздействий, в том числе ионизирующего излучения, нацелены на эти механизмы.

Известен способ повышения чувствительности ОСК к лучевой терапии на основе воздействия ретиноида третионина, также известного как полностью транс-ретиноевая кислота (all-trans-retinoic acid – ATRA). Показано, что предварительная инкубация с ATRA радиационно-резистентных клеток РМЖ линии MCF7/C6, обогащенных ОСК с иммунофенотипом CD44⁺/CD24^-/low/ALDH⁺ , ингибирует их клоногенную выживаемость после облучения в дозе 2Гр. Вероятным механизмом действия ATRA является индукция дифференцировки ОСК РМЖ (Yan Y., Li Z., Chen C. et al. All-trans retinoic acids induce differentiation and sensitize a radioresistant breast cancer cells to chemotherapy // BMC Complementary and Alternative Medicine. – 2016. – V. 16. – No. 113. – P. 113-124).

Ограничениями для использования ATRA с целью терапии РМЖ является низкая биодоступность из-за плохого растворения в водных растворах и короткого времени жизни, а также отсутствие специфичности к опухолевым клеткам и развитие резистентности (Ferreira R., Napoli J., Enver T. et al. Advances and challenges in retinoid delivery systems in regenerative and therapeutic medicine // Nature communications. – 2020. – V. 26. – N. 11. – P. 4265-4278; Borges G.S.M., Lima F.A., Carneiro G. et al. All-trans retinoic acid in anticancer therapy: how nanotechnology can enhance its efficacy and resolve its drawbacks // Expert Opinion on Drug Delivery. – 2021. – V. 18. – P. 1335-1354).

Известен способ снижения доли CD44⁺/CD24^- ОСК РМЖ после облучения с помощью ингибитора TGF-β (transforming growth factor beta – трансформирующего фактора роста-бета) – TGF-βRI SB431542 так как показано, что дедифференцировка в ОСК обусловлена передачей сигналов TGF-β, уровень которого резко увеличивается в опухолевых клетках после облучения. Предварительная инкубация клеток РМЖ линий MCF-7 и MDA-MB-231 перед облучением с ингибитором TGF-β предотвращает повышенную пролиферацию клеток с фенотипом CD44⁺/CD24^- и увеличивает экспрессию E-кадгерина, маркера эпителиальных клеток (Yadav P., Shankar B. S. Radio resistance in breast cancer cells is mediated through TGF-β signalling, hybrid epithelial-mesenchymal phenotype and cancer stem cells // Biomedicine & Pharmacotherapy. – 2019. – V. 111. – P. 119-130).

Ограничениями применения ингибиторов TGF-β является увеличение рисков кровотечений и сердечной токсичности (Ciardiello D., Elez E., Taberneo J. et al. Clinical development of therapies targeting TGFβ: current knowledge and future perspectives // Annals of oncology. – 2020. – V. 31. – No.10. – P. 1336-1349).

Известен способ блокирования радиационно-индуцированного увеличения ОСК с использованием ингибитора альдегиддегидрогеназы дисульфирама (Disulfiram – DSF) и меди (Cu²⁺). Показано, что комплекс DSF-Cu блокирует радиационно-индуцированное увеличение экспрессии генов стволовости ERBB2, SOX9 и С-MYK, значимо снижает количество ALDH⁺ и CD44⁺/CD24^- ОСК РМЖ линии MDA-MB-231 и количество образованных ими маммосфер, а также спонтанное метастазирование в легкие in vivo. Комплекс DSF-Cu действует как мощный индуктор апоптоза и ингибитор активации пути NF-kB, который регулирует гены стволовости и участвует в ответе опухолевых клеток на стрессовые воздействия (например, на ЛТ) (Wang Y., Li W., Patel S.S. Blocking the formation of radiation–induced breast cancer stem cells // Oncotarget. – 2014. – V. 5. – No.11. – P. 3743-3755).

Ограничениями использования DSF-Cu является возникновение желудочно-кишечной токсичности, такой как мукозит, вызванной, комплексообразованием меди и дисульфирама в кишечнике (Cvek B. Nonprofit drugs as the salvation of the world’s healthcare systems: the case of Antabuse (disulfiram) // Drug Discovery Today. – 2012. – V. 17. – No. 9/10. – P. 409-412).

Известно соединение рапамацин (сиролимус), которое является противогрибковым антибиотиком, обладающим иммуносупрессивной и противоопухолевой активностью за счет ингибирования пути mTOR. Показано, что рапамицин ингибирует радиационно-индуцированное самообновление ОСК РМЖ линий MDA-MB-453 и MDA-MB-468 и снижает их способность к образованию маммосфер (Lai Y., Yu X., Lin X. Inhibition of mTOR sensitizes breast cancer stem cells to radiation-induced repression of self-renewal through the regulation of MnSOD and Akt // Int.Journal of molecular medicine. – 2016. – V. 37. – P. 369-377).

Недостатком способа ингибирования радиационно-индуцированного роста ОСК на основе рапамацина является возникновение таких неблагоприятных эффектов как гемолитико-уремический синдром, тромбоцитопения и микроангиопатии (Alalawi F., Sharma A., Halawa A. et al. m-TOR Inhibitors in the Current Practice // Journal of clinical and experimental nerphology. – 2017. –V. 2. – No.1. – doi: 10.21767/2472-5056.100026).

Известен способ повышения чувствительности ОСК РМЖ к ионизирующему излучению основанный на использовании среды, кондиционированной мезенхимальными стволовыми клетками (MCK-KC). Доказано, что комбинированное применение MCK-KC и облучения в дозе 4Гр значительно снижает популяцию ALDH⁺ ОСК РМЖ линии MDA-MB-231. Кроме того, показано, что добавление MCK-KC до облучения ингибирует радиационно-индуцированную миграцию опухолевых клеток, снижает экспрессию виментина и N-кадгерина (мезенхимальных маркеров) in vitro и снижает метастазирование in vivo. Ингибирующее действие MCK-KC в комбинации с облучением на рост и миграцию опухолевых клеток, вероятно связано с блокированием радиационно-индуцированного ЭМП и ингибированием сигнального пути Stat3 (He N., Kong Y., Lei X. et al. MSCs inhibit tumor progression and enhance radiosensitivity of breast cancer cells by down-regulating Stat3 signaling pathway // Cell Death & Disease. – 2018. – No.1026. – doi: 10.1038/s41419-018-0949-3).

Несмотря на эффективность применения МСК для противоопухолевой терапии, доказанную в известном способе, существуют и противоположные данные о том, что МСК способствуют прогрессированию опухоли и метастазированию (Ramasamary R., Lam E. W-F., Soeiro I. et al. Mesenchymal stem cells inhibit proliferation and apoptosis of tumor cells: impact on in vivo tumor growth // Leukemia – 2007. – V. 21. – No.2. – P. 304-310; Wong R. S. Y. Mesenchymal Stem Cells: Angels or Demons? // J Biomed Biotechnol. – 2011. – V.2011. – doi: 10.1155/2011/459510). Противоречивость данных о влиянии МСК на опухолевый процесс ограничивает их использование в клеточной терапии рака.

Известен способ снижения радиационно-индуцированного количества ОСК, заключающийся в добавление к клеткам РМЖ до облучения химиотерапевтического препарата адриамицина (доксорубиуцина). Показано, что адриамицин эффективно ингибирует дедифференцировку опухолевых клеток РМЖ линий SUM159PT и MDA-MB-231 в ALDH⁺ОСК после облучения (Zhang L., Dratver M., Yazal T. Mebendazole Potentiates Radiation Therapy in Triple-Negative Breast Cancer // Int J Radiat Oncol Biol Phys. – 2019. – V. 103. – No.1. – P. 195-207).

Однако, известно, что адриамицин обладает кардиотоксичностью. Этот побочный эффект ограничивает его применение в сочетании с ионизирующим излучением, которое также повышает риск сердечно-сосудистых заболеваний из-за неизбежного попадания сердечных структур в поле облучения при радиотерапии опухолей молочной железы (Ichikawa Y, Ghanefar M, Bayeva M, et al. Cardiotoxicity of doxorubicin is mediated through mitochondrial iron accumulation // J Clinical Invest. – 2014. – V.124. –P. 617–630. Octavia Y, Tocchetti CG, Gabrielson KL, et al. Doxorubicin-induced cardiomyopathy: From molecular mechanisms to therapeutic strategies // J Mol Cell Cardiol. – 2012. – V.52. – P. 1213–1225).

Известны и другие способы блокирования радиационно-индуцированного увеличения популяции ОСК. Так, известен способ снижения количества ОСК РМЖ и увеличения их чувствительности к облучению, котoрый включает активацию протеинкиназного сигналинга и переход ОСК из мезенхимального состояния в эпителиальный (US10398672B2, Pattabiraman D., Bierie B., Tam W.L. et al. Methods and compositions for targeting cancer stem cells). В патенте WO2016100858 для повышения чувствительности опухолевых клеток к химио-и радиотерапии, а также для предотвращения дедифференцировки в ОСК после облучения применяют композиции, ингибирующие экспрессию интегрина альфа-V или интегрина β3 (Cheresh D.A., Gozo M., Yebra M. et al. Method for inhibiting alpha-V Beta-3 expression on cancer stem cells and inhibiting progression to a cancer stem cell phenotype).

Однако во всех известных способах в качестве ингибиторов радиационно-индуцированного увеличения популяции ОСК не используются димерные бисбензимидазолы, получаемые методом химического синтеза.

Известно соединение мебендазол (Mebendazole – MBZ) – производное бензимидазола, которое уже много лет широко применяется как антигельминтное средство широкого спектра действия и входит в класс структурно родственных препаратов, разрушающих тубулин. MBZ эффективно снижает пул ОСК трижды негативного РМЖ и блокирует индуцированную ионизирующим излучением дедифференцировку опухолевых клеток в радиорезистентные ОСК. Кроме того, MBZ повышает чувствительность клеток трижды негативного РМЖ к ионизирующему излучению in vivo и in vitro (Zhang L., Dratver M., Yazal T. Mebendazole Potentiates Radiation Therapy in Triple-Negative Breast Cancer // Int J Radiat Oncol Biol Phys. – 2019. – V. 103. – No.1. – P. 195-207).

Мебендазол эффективен в отношении трижды негативного РМЖ, на долю которого приходится примерно 15% случаев РМЖ, в то время как о его влиянии на наиболее распространенный люминальный подтип РМЖ, который составляет более 50% случаев, не известно.

Известны соединения производные бисбензимидазолов – димерные бисбензимидазолы (dimeric bisbenzimidazoles) серии DBPA, в которых для улучшения водной растворимости в структуру олигометиленового линкера, соединяющего бисбензимидазольные блоки, введен остаток 1,4–пиперазина, а концевые фрагменты соединений содержат N,N-диметиламинопропилкарбоксамидные группы. Показано, что DBPA(n) (где n-число метиленовых групп в линкере) являются AT специфичными ДНК-лигандами, способными блокировать белки, которые взаимодействуют с ДНК, влияют на структуру хроматина и факторы транскрипции (Koval V.S., Arutyunyan A.F., Salyanov V.I. et al. DNA sequence-specific ligands. XVIII. Synthesis, physico-chemical properties; genetic, virological, and biochemical studies of fluorescent dimeric bisbenzimidazoles DBPA(n) // Bioorganic & Medicinal Chemistry. – 2020. – V. 28. – No. 7. – P. 115378 – 115386). Учитывая, что репарация радиационных повреждений ДНК основана на взаимодействии ДНК с множеством белков/белковых комплексов, и эффективность пострадиационной репарации сильно зависит от структуры хроматина, можно было предположить, что соединения серии DBPA(n) обладают радиосенсибилизирующими свойствами, в том числе в отношении опухолевых клеток и, отдельно, ОСК. Однако данные о действии DBPA(n) в комбинации с ионизирующим излучением на опухолевые клетки, и отдельно ОСК, отсутствуют.

Прототипами предлагаемого технического решения являются:

- Способ ингибирования радиационно-индуцированного ЭМП опухолевых клеток рака молочной железы человека in vitro, основанный на применении синтетических водонерастворимых димерных бисбензимидазолов (dimeric bisbenzimidazoles – DB) (Zamulaeva I., Churyukina K., Matchuk O., Ivanov A., Saburov V., Zhuze A. Dimeric bisbenzimidazoles DB(n) in combination with ionizing radiation decrease number and clonogenic activity of MCF-7 breast cancer stem cells // AIMS Biophysics. – 2020. – V. 7. – N. 4. – P. 339-361). Эти соединения представляют собой флуоресцентные химические производные бисбензимидазолов, в структуре которых присутствуют два 2,6’-замещенных бензимидазола, соединенные олигометиленовым линкером разной длины – DB(n), где n - число метиленовых групп в линкере (Иванов А. А., Салянов В.И., Стрельцов С.А., Черепанова Н.А., Громова Е.С., Жузе А.Л. Лиганды, специфичные к определенным последовательностям пар оснований ДНК. XIV. Синтез флуоресцентных биологически активных димерных бисбензимидазолов – DB(3,4,5,7,11) // Биоорганическая химия. – 2011. – Т. 37. – № 4. – С. 530–541; Иванов А.А., Салянов В.И., Жузе А.Л. Лиганды, специфичные к определенным последовательностям пар оснований ДНК. XV. Синтез и спектральные характеристики новой серии димерных бисбензимидазолов – DB(1,2,6,8,9, 10,12) // Биоорганическая химия. – 2016. – Т. 42. – № 2. – С. 205–213). Способ доказывает способность DB(5) и DB(7) уменьшать радиационно-индуцированный ЭМП опухолевых клеток линии MCF-7 по критерию снижения экспрессии виментина – белка промежуточных филаментов клеток соединительной ткани, а также снижать количество ОСК после комбинированного действия DB(n) и γ-излучения по сравнению с одиночным γ-облучением, т.е. доказывает способность DB(5, 7) нивелировать стимулирующее действие ионизирующего излучения на популяцию ОСК.

- Способ снижения клоногенной активности стволовых клеток рака молочной железы под влиянием DB(5) и DB(7) при их одиночном применении или в комбинации с ионизирующим излучением in vitro (Патент на изобретение №2700695. Замулаева И.А., Чурюкина К.А., Жузе А.Л., Иванов А.А. Способ снижения клоногенной активности стволовых клеток рака молочной железы). Способ включает инкубацию предварительно отсортированных стволовых клеток с указанными соединениями в течение 72 ч, отмывку от этих соединений и подсчет числа выросших колоний через 8 суток. При комбинированном воздействии время инкубации с соединениями остается тем же – 72 ч, но через 24 после начала инкубации клетки облучают в дозе 4Гр и через 8 суток после окончания инкубации (10 суток после облучения) регистрируют синергическое снижение клоногенной активности ОСК.

Однако, в известных способах используются соединения серии DB(n), которые труднорастворимы в водных растворах, что существенно влияет на проведение клеточных исследований in vitro и затрудняет их использование в условиях in vivo, а также в известных способах отсутствуют данные о влиянии водорастворимых димерных бисбензимидазолов, в том числе DBPA(1) и DBPA(4), на количество ОСК РМЖ.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в снижении радиационно-индуцированного увеличения количества ОСК за счет использования водорастворимых димерных бисбензимидазолов.

Технический результат достигается тем, что также, как и в известных способах клетки рака молочной железы человека линии MCF-7 инкубируют 24 часа с ДНК-связывающими соединениями из серии димерных бисбензимидазолов, затем облучают на фоне этих соединений, а после облучения инкубируют клетки еще 48 часов с соединениями.

Особенность заявляемого способа заключается в том, что в качестве ДНК-связывающих лигандов используют симметричные водорастворимые димерные бисбензимидазолы (dimeric bisbenzimidazoles – DB), которые содержат N,N–диметиламинопропилкарбоксамидные группы (amid - A) на концах молекул и 1,4-пиперазин (piperazine -P) в олигометиленовом линкере (DBPA(n)), где n число метиленовых звеньев в линкере, соединяющим два бисбензимидазольных блока: через 24 часа после посева клеток проводят их инкубацию с водорастворимым димерным бисбензимидазолом, содержащим N,N–диметиламинопропилкарбоксамидные группы (amid – A) на концах молекул и 1,4-пиперазин (piperazine -P) в олигометиленовом линкере с 1 метиленовой группой в составе линкера (DBPA(1)) в концентрации 20мкМ или водорастворимым димерным бисбензимидазолом, содержащим N,N– диметиламинопропилкарбоксамидные группы (amid - A) на концах молекул и 1,4-пиперазин (piperazine -P) в олигометиленовом линкере с 4 метиленовыми группами в составе линкера (DBPA(4)) в концентрации 20мкМ, далее через сутки клетки облучают в дозе 4 Гр, через двое суток после облучения определяют снижение радиационно-индуцированного увеличения количества CD44⁺СD24^-/low опухолевых стволовых клеток и снижение радиационно-индуцированной экспрессии белка промежуточных филаментов – виментина по сравнению с контролем – идентичными клетками, не подвергавшимися воздействию DBPA(1) или DBPA(4) перед облучением.

Изобретение иллюстрируется подробным описанием, примерами и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг. 1 – Изменение относительного количества CD44⁺СD24^-/low ОСК после комбинированного действия DBPA(1) или DBPA(4) в концентрации 20 мкМ/л и γ-излучения в дозе 4Гр. Указаны величины р при сравнении экспериментальных групп, продемонстрировавших статистически значимые различия.

Фиг. 2 – Изменение абсолютного количества CD44⁺СD24^-/low ОСК после комбинированного действия DBPA(1) или DBPA(4) в концентрации 20 мкМ/л и γ-излучения в дозе 4Гр. Указаны величины р при сравнении экспериментальных групп, продемонстрировавших статистически значимые различия.

Фиг. 3 – Интенсивность связывания клеток линии MCF-7 с антителами к виментину после одиночного и комбинированного действия DBPА(1) или DBPА(4) и облучения в дозе 4Гр по данным проточной цитометрии. Сплошная горизонтальная линия показывает среднюю интенсивность флуоресценции клеток после обработки контрольными иммуноглобулинами (изотипический контроль неспецифического связывания). Пунктирные линии отмечают стандартную ошибку (± SE) средней интенсивности флуоресценции в контроле неспецифического связывания. *p=0,03 при сравнении с интактным контролем, ^p=0,02 при сравнении с контролем неспецифического связывания

Способ осуществляют следующим образом.

Этапы выполнения.

I. Пробоподготовка для выявления CD44⁺СD24^-/low клеток и оценки экспрессии виментина.

Клетки аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7 рассевают в культуральные флаконы (25 см²) с добавлением 6 мл полной питательной среды DMEM («Панэко», Россия), содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота («Biosera» Франция), пенициллин (50000 ед/л), стрептомицин (50 мг/л) и глютамин (292 мг/л) («Панэко», Россия).

Через 24 часа во флакон с клетками добавляют водорастворимые ДНК-связывающие лиганды DBPA(n), в которых два бисбензимидазольных блока соединены между собой линкером с числом метиленовых групп (n) 1 или 4, до конечной концентрации 20 мкМ.

Через 24 после добавления DBPA(1,4) часть флаконов с клетками подвергают γ-облучению от источника ⁶⁰Со в дозе 4 Гр, мощность дозы 0,8 Гр/мин. Таким образом формируя группы «Контроль», «4Гр», «DB(5)+4Гр» и «DB(7)+4Гр».

После облучения клетки культивируют в стандартных условиях в CO₂ инкубаторе в течение 48 часов.

В конце этого периода клетки извлекают из флаконов с помощью смеси растворов версена и трипсина (1:1, «Панэко», Россия) в холодный (+4^оС) раствор Хэнкса («Панэко», Россия).

Производят подсчет количества клеток, выросших во флаконе с помощью камеры Горяева.

Далее часть проб готовят для оценки экспрессии виментина: отбирают аликвоты по 250 тыс. клеток, фиксируют в холодном ацетоне (+4^оС) в течение не менее 24 ч, отмывают от фиксатора и инкубируют с моноклональными антителами к виментину, мечеными фикоэритрином (ФЭ, Becton Dickinson, США) в течение 1ч при комнатной температуре в соотношении 5 мкл антител/250 тыс. клеток. Для контроля неспецифического связывания используют моноклональные антитела того же изотипа к гемоцианину улитки, конъюгированные с ФЭ (BD Biosciences, США). После инкубации клетки отмывают от несвязавшихся антител в фосфатно-солевом буфере (phosphate buffered saline – PBS). Для этого в пробы добавляют PBS и центрифугируют в течение 5 минут при 200xg. После центрифугирования сливают надосадок и повторно добавляют к осадку PBS и центрифугируют в течение 5 минут при 200xg. Сливают PBS и к получившемуся осадку добавляют холодный PBS и немедленно анализируют с помощью проточного цитофлуориметра FACS Calibur (BD, США).

Другую часть проб окрашивают антителами для выявления CD44⁺СD24^-/low клеток:

клетки разводят в соотношении 1 млн клеток на 100 мкл холодного раствора Хэнкса, в который добавляют антитела к CD44, меченные ФИТЦ (Becton Dickinson, США), и антитела к CD24, меченные ФЭ (Becton Dickinson, США), из расчета по 20 мкл антител на 1 млн клеток. Пробы инкубируют с антителами 30 минут на льду в темноте. После окончания инкубации пробы центрифугируют в течение 5 минут при 200xg и к получившемуся осадку добавляют холодный раствор Хэнкса.

II. Получение данных с помощью проточной цитометрии.

Образцы, подготовленные, как описано на I этапе, анализируют на проточном цитофлуориметре, оснащенном лазерами с длинами волн 364 нм и 488 нм.

Для измерения флуоресценции ФИТЦа, используют узкополосные фильтры 530/30 нм, для ФЭ – 585/42 нм.

В образцах анализируют данные об интенсивности прямого и бокового светорассеяния, флуоресценции ФИТЦа и ФЭа или только ФЭ. Полученные результаты записывают в цифровом виде.

Сохраненные данные обрабатывают с помощью программы CellQuestPro (Becton Dickinson, США).

III. Обработка данных, собранных с помощью проточной цитометрии.

Строят график точечного распределения клеток по прямому (forward scatter - FSC) и боковому светорассеянию (side scatter – SSC). На графике выделяют регион клеток, формирующих группу по показателям светорассеяния.

Для определения экспрессии виментина строят график распределения клеток из региона выделенных клеток по интенсивности флуоресценции антител к виментину и определяют в нем среднюю интенсивность флуоресценции ФЭ.

Для определения количества CD44⁺СD24^-/low клеток строят график распределения клеток из региона выделенных клеток по интенсивности флуоресценции антител к CD44 и CD24. На графике выделяют регион клеток с иммунофенотипом CD44⁺СD24^-/low и определяют в нем количество клеток.

Рассчитывают относительное количество (долю) CD44⁺СD24^-/low клеток путем деления количества клеток с иммунофенотипом CD44⁺СD24^-/low на общее число выделенных клеток. Абсолютное количество CD44⁺СD24^-/low клеток получают путем умножения доли этих клеток на общее количество клеток, выросших во флаконе.

Пример 1.

Снижение относительного количества CD44+СD24^-/low ОСК после комбинированного действия DBPA(1,4) и γ-излучения.

Установлено, что однократное облучение в дозе 4 Гр приводит к увеличению относительного количества CD44⁺СD24^-/low клеток в среднем в 2,0 раза по сравнению с контролем (p=0,04) (Фиг.1). Для соединений DBPA(1) и DBPA(4) показана способность снижать относительное количество CD44⁺СD24^-/low клеток после облучения. Так предварительная инкубация клеток с DBPA(1) перед облучением снижает долю ОСК в 1,7 раза по сравнению с одиночным действием облучения (р=0,041), с DBPA(4) – в 4,1 раза (р=0,005).

Относительное количество CD44⁺СD24^-/low клеток в контроле составляло в среднем (±SE) 0,22±0,01 /флакон, в группе облучение – 0,41±0,05/флакон, DBPA(1)+4 Гр – 0,24±0,03/флакон, DBPA(4)+4Гр – 0,10±0,02/флакон.

Данный пример, доказывает способность DBPA(1) и DBPA(4) ингибировать радиационно-индуцированный увеличение популяции ОСК.

Пример 2.

Снижение абсолютного количества CD44⁺СD24^-/low ОСК после комбинированного действия DBPA(1,4) и γ-излучения.

Эффекты комбинированного действия исследуемых DBPA(1, 4) и γ-излучения на ОСК оценивали через 48 часов после облучения по изменению абсолютного количества клеток с иммунофенотипом CD44⁺СD24^-/low. Установлено, что в комбинации с ионизирующим излучением как DBPA(1), так и DBPA(4) значительно снижают абсолютное количество CD44⁺СD24^-/low клеток по сравнению с одиночным облучением и контролем (Фиг. 2). Так, DBPA(1) в комбинации с облучением приводит к снижению абсолютного количества ОСК в 3,0 раза по сравнению с контролем и в 2,8 раза по сравнению с облучением (р=0.027 и р=0.029, соответственно). Использование DBPA(4) в комбинации с облучением приводит к ещё более выраженному эффекту: различия по сравнению с контролем достигают 13 раз (p=0,003) и 12 раз по сравнению с одиночным облучением (р=0,004).

Абсолютное количество CD44⁺СD24^-/lowклеток в контроле составляло в среднем (±SE) 3002±439/флакон, в группе облучение – 2734±510/флакон, DBPA(1)+4 Гр – 986±145/флакон, DBPA(4)+4Гр – 229±69/флакон.

Данный пример, во-первых доказывает, что однократное облучение в дозе 4 Гр не эффективно в отношении ОСК, так как не приводит к значимому снижению их количества по сравнению с контролем, во-вторых, доказывает, что комбинированное применение DBPA(1) и DBPA(4) и облучения значительно снижает абсолютное количество ОСК.

Пример 3.

Изменение белковой экспрессии виментина после одиночного и комбинированного действия DB(5) или DB(7) и γ-излучения.

По результатам оценки белковой экспрессии виментина – маркера ЭМП, характерного для высокоонкогенных клеток с мезенхимальным фенотипом, способных к миграции и инвазии, в общей культуре опухолевых клеток MCF-7 показано, что в интактном контроле связывание антител к виментину не отличается от неспецифического связывания, что указывает на отсутствие экспрессии виментина в общей массе опухолевых клеток этой линии. При этом через 48 после облучения в дозе 4 Гр наблюдается специфическое связывание антител к виментину – одного из основных маркеров ЭМП (р=0,03), что свидетельствует об индукции ЭМП под влиянием γ-излучения. Соединения DBPA(1,4) блокируют радиационно-индуцированный ЭМП, снижая уровень связывания антител к виментину до контрольных значений неспецифического связывания (Фиг.3).

Пример №3 подтверждает данные большинства исследований о том, что однократное ионизирующее излучение индуцирует ЭМП, который, в свою очередь играет непосредственную роль в способности опухолевых клеток к миграции/метастазированию и является одним из основных механизмов, участвующих в формировании пула ОСК после облучения. Пример впервые доказывает возможность ингибирования радиационно-индуцированного ЭМП с помощью соединений DBPА(1) или DBPА(4).

Все приведенные примеры доказывают, что новый способ, заключающийся в комбинированном воздействии водоростворимых димерных бисбензимидазолов DBPА(1, 4) и ионизирующего излучения на клетки рака молочной железы человека линии MCF-7, эффективно ингибирует радиационно-индуцированное увеличение популяции ОСК и ЭМП.

Несмотря на всю эффективность в отношении первичного опухолевого очага, облучение активирует в клетках злокачественных новообразований ряд сигнальных путей и механизмов, приводящих к увеличению количества ОСК, которые являются причиной прогрессирования опухоли и метастазирования. Поэтому ингибирование радиационно-индуцированного увеличения популяции ОСК является столь же важной частью противоопухолевого лечения, как и основная терапия.

Таким образом, предложенный способ позволяет активировать в клетках злокачественных новообразований ряд сигнальных путей и механизмов и может стать новым инструментом в борьбе со злокачественными новообразованиями и повысить эффективность лечения.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и может быть использовано для ингибирования радиационно-индуцированного увеличения количества CD44⁺СD24^-/low опухолевых стволовых клеток (ОСК). ОСК рака молочной железы человека инкубируют 24 часа до облучения и 48 часов после с водорастворимыми димерными бисбензимидазолами серии DBPA(n) с 1 или 4 метиленовыми группами в составе линкера DBPA, после чего регистрируют снижение радиационно-индуцированного увеличения количества CD44⁺CD24^-/low ОСК, которые являются более радио- и химиорезистентными по сравнению с остальными опухолевыми клетками, а также снижение радиационно-индуцированной экспрессии виментина, который является маркером эпителиально-мезенхимального перехода, обеспечивающего формирование пула ОСК после облучения. Способ позволяет активировать в клетках злокачественных новообразований ряд сигнальных путей и может стать новым инструментом в борьбе со злокачественными новообразованиями. 3 ил., 3 пр.

Способ ингибирования радиационно-индуцированного увеличения количества CD44⁺СD24^-/low опухолевых стволовых клеток рака молочной железы человека, включающий 72-часовое воздействие на опухолевые клетки ДНК-связывающих лигандов и облучения, отличающийся тем, что в качестве ДНК-связывающих лигандов используют симметричные водорастворимые димерные бисбензимидазолы (dimeric bisbenzimidazoles – DB), которые содержат N,N–диметиламинопропилкарбоксамидные группы (amid - A) на концах молекул и 1,4-пиперазин (piperazine -P) в олигометиленовом линкере (DBPA(n)), где n число метиленовых звеньев в линкере, соединяющем два бисбензимидазольных блока: через 24 часа после посева клеток проводят их инкубацию с водорастворимым димерным бисбензимидазолом, содержащим N,N–диметиламинопропилкарбоксамидные группы (amid – A) на концах молекул и 1,4-пиперазин (piperazine - P) в олигометиленовом линкере с 1 метиленовой группой в составе линкера (DBPA(1)) в концентрации 20мкМ, или водорастворимым димерным бисбензимидазолом, содержащим N,N– диметиламинопропилкарбоксамидные группы (amid - A) на концах молекул и 1,4-пиперазин (piperazine - P) в олигометиленовом линкере с 4 метиленовыми группами в составе линкера (DBPA(4)) в концентрации 20мкМ, далее через сутки клетки облучают в дозе 4 Гр, через двое суток после облучения определяют снижение радиационно-индуцированного увеличения количества CD44⁺СD24^-/low опухолевых стволовых клеток и снижение радиационно-индуцированной экспрессии белка промежуточных филаментов – виментина по сравнению с контролем – идентичными клетками, не подвергавшимися воздействию DBPA(1) или DBPA(4) перед облучением.