СПОСОБ СНИЖЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК АДЕНОКАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2023 года по МПК G01N33/48 C12N5/95 A61K31/00 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицины, в частности онкологии, и может быть использовано для снижения количества опухолевых стволовых клеток (далее - ОСК).

Согласно современным представлениям в области исследований злокачественных новообразований - опухоли имеют иерархическую организацию и состоят из клеток гетерогенных по своим генетическим, эпигенетическим, функциональным и фенотипическим свойствам (Lawson D.A., Kessenbrock K., Davis Ryan et al. Tumour heterogeneity and metastasis at single-cell resolution // Nature cell biology. - 2018. - V. 20. - P. 1349-1360). Среди всех опухолевых клеток наибольшее внимание привлекает небольшая популяция опухолевых стволовых клеток (ОСК), которые обладают свойствами неограниченного самообновления и плюрипотентности. ОСК не только ответсвенны за образование первичной опухоли, но также отвечают за её устойчивость к терапии, метастазирование и рецедивирование. Действительно, многочисленные исследования показывают, что традиционные способы лечения злокачественных новообразований не приводят к длительной ремиссии из-за неспособности уничтожить популяцию ОСК (Marotta L., Polyak K. Cancer stem cells: a model in the making // Current Opinion in Genetics & Development. - 2009. - V. 19. -P. 44 - 50; Creighton C. J., Li X., Landis M. et al. Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2009. - V. 106. - N. 33. - P.13820-13825). Поэтому первостепенное значение для современной онкологии имеет поиск и разработка способов и средств терапии, целенаправленно воздействующих на популяцию ОСК.

Для идентификации ОСК в опухолях разных локализаций и их выделения используется целый ряд иммунофенотипических и функциональных маркеров. В частности, ОСК молочной железы могут быть выявлены по иммунофенотипу CD44⁺СD24^-/low (Al-Hajj M., Wicha M.S., Benito-Hernandez A., et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2003. - V. 100. - No 7. - P. 3983-3988; Fillmore C.M., Kuperwasser C. Human breast cancer cell lines contain stem-like cells that self-renew, give rise to phenotypically diverse progeny and survive chemotherapy// Breast Cancer Res. - 2008. -V. 10. - No 2. - Article R25). Показано, что CD44⁺СD24^-/low ОСК рака молочной железы (РМЖ) являются более радио- и химиорезистентными по сравнению с остальными клетками РМЖ, кроме того эти клетки инициируют развитие опухоли и способствуют метастазированию (Camerlingo R., Ferraro G. A., Francesco de F. et al. The role of CD44+ /CD24-/low biomarker for screening, diagnosis and monitoring of breast cancer // Oncology reports. - 2014.- V.31. - P. 1127-1132; Li W.,Ma H., Zhang J. et al. Unraveling the roles of CD44/ CD24 and ALDH1 as cancer stem cell markers in tumorigenesis and metastasis // Scientific reports. - 2017. - doi: 10.1038/s41598-017-14364-2; Sheridan C., Kishimoto H., Fuch K.R. et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis // Breast Cancer Research. - 2006. - V. 8. - No. - 5. - P. 1-13; Rajeev V., Wen C. C., Shih-Chieh H. et al. Tumorigenic and Metastatic Role of CD44^−/low/CD24^−/low Cells in Luminal Breast Cancer // Cancers (Basel). - 2020. - V.12. - No.5. - P. 1239-1262). В этой связи актуальной задачей является разработка новых способов, позволяющих снизить количество ОСК РМЖ, что в итоге приведет к увеличению эффективности противоопухолевой терапии РМЖ.

Одним из известных способов элиминации ОСК РМЖ является стимуляция дифференцировки этих клеток. Известно соединение полностью транс-ретиноевая кислота (ATRA), которое обладает функцией индуктора клеточной дифференциации. На культуре клеток РМЖ человека линии MCF-7 показано, что ATRA эффективно снижает долю CD44⁺СD24^- клеток в 1,8 раза по сравнению с необработанным контролем и способствует 16-кратному снижению способности ОСК к самообновлению по сравнению с контролем по критерию скорости формирования сфероидов (Zeng W.G., Hu P., Wang J.N. et al. All-trans retinoic acid effectively inhibits breast cancer stem cells growth in vitro // Chinese Journal of Oncology. - 2013. - V. 35. - No. 2. - P. 89-93).

Ограничениями для использования ATRA в качестве терапии РМЖ является низкая биодоступность вследствие плохого растворения в водных растворах и короткого времени жизни, а также из-за отсутствия специфичности к опухолевым клеткам и развития резистентности к действию этого соединения (Ferreira R., Napoli J., Enver T. et al. Advances and challenges in retinoid delivery systems in regenerative and therapeutic medicine // Nature communications. - 2020. - V. 26. - N. 11. - P. 4265-4278; Borges G.S.M., Lima F.A., Carneiro G. et al. All-trans retinoic acid in anticancer therapy: how nanotechnology can enhance its efficacy and resolve its drawbacks // Expert Opinion on Drug Delivery. - 2021. - V. 18. - P. 1335-1354).

Еще одной стратегией в снижении ОСК РМЖ является воздействие на ключевые сигнальные пути, которые поддерживают и регулируют самообновление ОСК и их резистентность к традиционным способам терапии. Так, например, известен способ снижения количества ОСК РМЖ с помощью флавоноида кверцетина (3,3',4',5,7- пентагидроксифлавонона). Этот флавоноид содержится во многих овощах, фруктах и злаках и является одним из естественных антиоксидантов. Показано, что после инкубации с кверцетином снижается жизнеспособность CD44⁺СD24^- клеток рака молочной железы человека линии MCF-7 и количество образованных маммосфер по сравнению с таковыми в контроле. Также известно, что кверцетин ингибирует онкогенность и метастическую способность клеток MCF-7 in vivo. Считается, что после обработки кверцетином значительно снижается экспрессия белков сигнального пути PI3K/Akt/mTOR, который регулирует клеточный цикл в ОСК и, следовательно, происходит ингибирование пролиферации ОСК (Li X., Zhou N., Liu Z. et al. Quercetin suppresses breast cancer stem cells (CD44⁺/CD24^-) by inhibiting the PI3K/Akt/mTOR-signaling pathway // Life Sci. - 2018. - V. 1. - No. 196. - P. 56-62).

Несмотря на широкую фармакологическую активность кверцетина известно, что при дозах выше 945 мг/м² это соединение обладает желудочно-кишечной токсичностью, проявляющейся в виде рвоты, клинически значимой нефротоксичностью, проявляющейся в снижении скорости клубочковой фильтрации и повышении уровня креатинина в сыворотке крови и сердечно-сосудистой токсичностью, проявляющейся в повышении кровяного давления и снижении уровня калия в сыворотке крови (Ferry D.R., Smith A., Malkhandi J. et al. Phase I clinical trial of the flavonoid quercetin: pharmacokinetics and evidence for in vivo tyrosine kinase inhibition // Clin Cancer Res. - 1996. - V.2. - No. 4. - P.659-668).

Известно вещество памоат пирвиния (pyrvinium pamoate - PP), которое на протяжении 50 лет применялось в качестве антигельминтного препарата. Доказана его противоопухолевая активность в отношении клеток РМЖ человека in vitro. Показано, что трехдневная инкубация опухолевых клеток с PP приводит к заметному снижению CD44⁺СD24^-/low ОСК по сравнению с контролем. Механизмом противоопухолевого действия PP является ингибирование активности сигнального пути Wnt, важного для пролиферации и дифференцировки, а также поддержания самообновления ОСК (Xu L., Zhang L., Hu C. et al. WNT pathway inhibitor pyrvinium pamoate inhibits the self-renewal and metastasis of breast cancer stem cells // International Journal of Oncology. - 2016. - V. 48. - No. 3. - P. 1175-1186).

Недостатком PP является его низкая абсорбция и системная токсичность. Еще одна проблема при использовании данного метода элиминации ОСК заключается в том, что при приеме внутрь всасывание PP из кишечника минимально, а фармацевтической технологии для улучшения доставки PP в опухоль в настоящий момент не известно (Xu L., Zhang L., Hu C., et al. WNT pathway inhibitor pyrvinium pamoate inhibits the self-renewal and metastasis of breast cancer stem cells // International Journal of Oncology. - 2016. - V. 48. - No. 3. - P. 1175-1186; Smith T.S., Kinkel A.W., Gryczko C. M. et al. Absorption of pyrvinium pamoate // Clin Pharmacol Ther. - 1976. - V. 19. - No. 6. - P. 802-806).

Известен способ снижения доли ОСК РМЖ на основе использования палбоциклиба, который является ингибитором циклинзависимой киназы (CDK) 4/6, высокоактивной в ОСК РМЖ и служащей одним из ключевых регуляторов клеточного цикла. Палбоциклиб снижает долю CD44⁺СD24^-/low клеток линии MCF-7 и многих других клеточных линий РМЖ (Kishino E., Ogata R., Saiton W. et al. Anti‑cell growth and anti‑cancer stem cell activity of the CDK4/6 inhibitor palbociclib in breast cancer cells // Breast Cancer. - 2019. - V. 27. - No. 3. - P. 415-425). Механизм действия ингибиторов циклинзависимых киназ обусловлен селективным подавлением активности генов циклин D-CDK4/6 Rb сигнального пути, контролирующих клеточный цикл.

Недостатком способа терапии с использованием палбоциклиба является возникновение гематологических (нейропения, лейкопения) осложнений, а также таких побочных эффектов как тошнота, рвота, диарея и лекарственное поражение печени (Laurenti E., Frelin C., Xie S. et al. CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells // Cell Stem Cell. - 2015. - V. 16. - No. 3. - P. 302-313; Кононенко И. Б., Снеговой А.В., Сельчук В.Ю. Ингибиторы циклин-зависимых киназ: эффективность и безопасность // Медицинский совет - 2019. - № 10. - С. 42-55).

Известен способ снижения доли ОСК на основе использования липофильных статинов, которые в многочисленных исследованиях показали себя как потенциальные противоопухолевые соединения, так как обладают антипролиферативными, антиангиогенными, антиметастазирующими и проапоптотическими свойствами во многих типах злокачественных новообразованиях, включая РМЖ (Dulak J., Jozkowiez A. Anti-angiogenic and anti-inflammatory effects of statins: relevance to anti-cancer therapy // Curr. Cancer Drug Targets. - 2005. - V. 5. - No.8. - P. 579-594). Так широко известно соединение из класса статинов - симвастин, который эффективно снижает процент CD44⁺СD24^-/low/ALDH+ ОСК клеток лекарственно - устойчивой линии клеток MCF-7/ADR, которая обогащена ОСК. Механизмом действия симвастина является подавление сигнальных медиаторов Stat3, содержание которых повышено в ОСК (Gopalan A., Yu W., Sanders B.G. et al. Eliminating drug resistant breast cancer stem-like cells with combination // Cancer Letters. - 2013. - V. 328. - P. 258-296).

К нежелательным эффектам лечения симвастином относят временное увеличение активности остеокластов и возникновение побочных эффектов со стороны ЖКТ (Sondergaard T.E., Pedersen P.T., Andersen T.L. et al. A phase II clinical trial does not show that high dose simvastatin has beneficial effect on markers of bone turnover in multiple myeloma // Hematol Oncol. - 2009. - V. 1. - No. 1. - P. 17-22).

Известен способ снижения ОСК РМЖ с использованием генной терапии. В этом случае пациенту вводят фармацевтическую композицию, содержащую адениннуклеотидный транслокатор 2 (АНТ2) малой интерферирующей РНК (siRNA), способный ингибировать пролиферацию опухолевых клеток, особенно сверхэкспрессирующих ANT2, который тесно связан с развитием и прогрессированием злокачественных новообразований (Патент на изобретение US8399426B2. Kim C.W., Jang J.Y. Method for treating breast cancer using adenine nucleotide translocator 2 (ANT2) siRNA or ANT2 shRNA).

Тем не менее существует ряд недостатков метода генной терапии с использованием синтетической siRNA для ингибирования пролиферации ОСК. Так siRNA имеет низкую скорость внутриклеточной передачи, индуцирует неспецифическую реакцию цитотоксичности, имеет короткий период полураспада in vivo - это предполагает, что эффект не является постоянным, и, следовательно, инъекцию необходимо повторять. И, кроме того, синтез siRNA требует высоких затрат.

Известны и другие способы снижения количества ОСК РМЖ, где применяется композиция (WO/2017/188690), которая включает фенилацетальдегид или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента. Механизмом действия фенилацетальдегида является ингибирование экспрессии ряда генов, таких как Nanog, C-myc, Oct4, Sox2, Snail и CD44, которые, как известно, экспрессируются в ОСК РМЖ, а также в ингибировании продукции IL-6 и IL-8 и сигнального пути STAT3 (Li D.-S., Choi H. S., Jung D.K. Composition for inhibiting growth of breast cancer stem cells, comprising phenylacetaldehyde). Известен способ уменьшения количества CD44⁺СD24^- ОСК и количества колоний клеток РМЖ линии MCF-7 и MCF-7/ADR (US9617545 B2) с помощью применения ингибиторов экспрессии генов EXT1, LDHB, CD109, EFEMP2, RASIP1 или SERPINE1 в качестве активного ингредиента, которые в конечном итоге приводят к подавлению сигнальной системы Wnt/PI3K/Akt (Lee Y.-M. Method for treating breast cancer by targeting breast cancer stem cell). Еще один способ снижения доли ОСК РМЖ основан на введении к опухолевым клеткам ингибитора лизинспецифической деметилазы 1 (LSD 1). LSD1 сверхэкспресссируется в ОСК и поэтому ее ингибирование приводит к значительному снижению количества CD44⁺СD24^- ОСК (US10220053 B, Rao S., Zafar A. Methods and compositions for modulating cancer stem cells).

Однако во всех известных способах в качестве соединения снижающего количество ОСК РМЖ не используются синтезированные соединения из класса бензимидазолов.

Известен способ снижения количества ОСК с помощью препарата флубендазол (Hou Z.-J., Luo X., Zang W. et al. Flubendazole, FDA-approved antihelmintic, targets breast cancer stem-like cells // Oncotarget. - 2015. - V.6. - No.8. - P. 6326-6340). Данное соединение является членом семейства бензимидазолов, имеет типичную бензимидазольную часть, но с добавлением атома фтора в основную структуру, чем и отличается от других бензимидазолов. Флубендазол широко используется как эффективное противогельминтное средство. Недавние исследования показали, что флубендазол подавляет пролиферацию опухолевых клеток, а также снижает количество CD44⁺СD24^-/low клеток РМЖ линии MCF-7 на 25%.

Недостатки способа снижения количества ОСК с помощью флубендазола - низкая биодоступность из-за высокой липофильности соединения.

Известно соединение мебендазол (Mebendazole - MBZ) - производное бензимидазола, которое уже много лет широко применяется как антигельминтное и фунгицидное средство (Coi H.S., Ko Y.S., Jin H. et al. Anticancer Effect of Benzimidazole Derivatives, Especially Mebendazole, on Triple-Negative Breast Cancer (TNBC) and Radiotherapy-Resistant TNBC In Vivo and In Vitro // Molecules. - 2021. - V. 26. - No. 17: 5118). Показано, что MBZ значительно снижает экспрессию маркеров ОСК РМЖ CD44 и OCT-3/4 в клетках РМЖ линии MDA-MB-231, а также снижает способность этих клеток к колониеобразованию и метастазированию.

Мебендазол эффективен в отношении тройного негативного РМЖ, на долю которого приходится примерно 15% случаев РМЖ, в то время как о его влиянии на наиболее распространенный люминальный подтип РМЖ, который составляет более 50% случаев, не известно.

Кроме того, во всех известных способах не используются димерные бисбензимидазолы, получаемые методом химического синтеза.

Известны соединения производные бисбензимидазолов - димерные бисбензимидазолы (dimeric bisbenzimidazoles) серии DBPA (Koval V.S., Arutyunyan A.F., Salyanov V.I. et al. DNA sequence-specific ligands. XVIII. Synthesis, physico-chemical properties; genetic, virological, and biochemical studies of fluorescent dimeric bisbenzimidazoles DBPA(n) // Bioorganic & Medicinal Chemistry. - 2020. - V. 28. - No. 7. - P. 115378 - 115386), в которых для улучшения водной растворимости в структуру олигометиленового линкера, соединяющего бисбензимидазольные блоки, введен остаток 1,4-пиперазина, а концевые фрагменты соединений содержат N,N-диметиламинопропилкарбоксамидные группы. Показано, что водорастворимые DBPA(n) (где n-число метиленовых групп в линкере) проявляют широкий спектр биологической активности: являются AT специфичными ДНК-лигандами, ингибируют гистоноподобный белок H-NS в клетках E.Coli, проявляют противовирусную активность в отношении интегразы ВИЧ-1 и поэтому могут быть использованы в качестве исходных структур для создания новых биологически активных соединений, механизм действия которых связан с блокированием ферментов, нацеленных на ДНК, или с регуляцией факторов транскрипции. Немаловажным свойством этих соединений является их относительно низкая токсичность в отношении нормальных клеток человека.

Однако отсутствуют данные о действии известных соединений серии DBPA на популяцию ОСК.

Прототипами предлагаемого технического решения являются:

- Способ снижения количества стволовых клеток рака молочной железы (RU 2702910 С1). Способ заключается в 72-часовом воздействии на опухолевые клетки in vitro ДНК-связывающих лигандов - водонерастворимых димерных бисбензимидазолов серии DB(n). Проводят инкубацию с водонерастворимым димерным бисбензимидазолом с 5 метиленовыми звеньями в составе линкера DB (5) или водонерастворимым димерным бисбензимидазолом с 7 метиленовыми звеньями DB (7) in vitro при температуре +37°С в течение 3-х суток, после чего регистрируют снижение абсолютного и относительного количества CD44⁺CD24^-/low ОСК.

- Способ снижения клоногенной активности стволовых клеток рака молочной железы под влиянием DB(5) и DB(7) при их одиночном применении или в комбинации с ионизирующим излучением in vitro (RU 2700695 C1). Способ включает инкубацию предварительно отсортированных стволовых клеток с указанными соединениями в течение 72 ч, отмывку от этих соединений и подсчет числа выросших колоний через 8 суток. При комбинированном воздействии время инкубации с соединениями остается тем же - 72 ч, но через 24 после начала инкубации клетки облучают в дозе 4 Гр и через 8 суток после окончания инкубации (10 суток после облучения) регистрируют синергическое снижение клоногенной активности опухолевых стволовых клеток.

Однако, в известных способах используются соединения серии DB(n), которые труднорастворимы в водных растворах, что существенно влияет на проведение клеточных исследований in vitro и затрудняет их использование в условиях in vivo.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в снижении количества ОСК.

Технический результат достигается тем, что также, как и в известных способах в течение 72 часов воздействуют на опухолевые клетки рака молочной железы человека линии MCF-7 in vitro с помощью ДНК-связывающих лигандов - димерных бисбензимидазолов.

Особенность заявляемого способа заключается в том, что используют водорастворимые димерные бисбензимидазолы серии DBPA(n): проводят инкубацию с водорастворимым димерным бисбензимидазолом с 1 метиленовой группой в составе линкера DBPA(1) или водорастворимым димерным бисбензимидазолом с 4 метиленовыми группами в составе линкера DBPA(4) in vitro при температуре +37°С в течение 72 часов, после чего с помощью метода проточной цитофлуориметрии оценивают абсолютное и относительное количество CD44⁺СD24^-/lowопухолевых стволовых клеток и регистрируют его уменьшение по сравнению с контролем.

Изобретение иллюстрируется подробным описанием, примерами и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг.1. - Пример выделения клеток линии MCF-7 на основе показателей прямого и бокового светорассеяния c помощью проточной цитометрии. Выделен регион клеток для последующего анализа интенсивности флуоресценции с антителами к CD24 и CD44, меченными различными флуорохромами.

Фиг. 2. - Пример распределения клеток MCF-7 по интенсивности флуоресценции с антителами к CD24 и CD44, меченными фикоэритрином и флуоресцеинизотиоционатом, соответственно. Выделен регион, содержащий CD44⁺СD24^-/low клетки.

Фиг. 3. - Фотоиллюстрация клеток линии МСF-7, полученная с помощью флуоресцентной микроскопии (увеличение объектива x40) (λ_{возбуждения} =330-380 нм, λ_{эмиссии}> 420 нм.: а) контрольные клетки; б) клетки, инкубированные с DBPA(1) в концентрации 20 мкМ/л в течение 72 ч, в) клетки, инкубированные с DBPA(4) в концентрации 20 мкМ/л в течение 72 ч.

Фиг. 4. - Диаграмма: средняя интенсивность флуоресценции CD44⁺CD24^-/low ОСК и остальных (не стволовых) клеток линии MCF-7, инкубированных с DBPA(1) или DBPA(4) в концентрации 20 мкМ, по данным витального исследования с помощью проточной цитофлуориметрии.*р<0,001 при сравнении с интенсивностью контрольной аутофлуоресценцией; ^p<0,01 при сравнении с флуоресценцией соответствующего соединения в популяции ОСК

Фиг. 5. - Диаграмма: изменение абсолютного количества CD44⁺СD24^-/low ОСК после действия DBPA(1) или DBPA(4) в концентрации 20 мкМ. Указаны величины р при сравнении экспериментальных групп, продемонстрировавших статистически значимые различия.

Фиг. 6. - Диаграмма: изменение относительного количества CD44⁺СD24^-/low ОСК после действия DBPA(1) или DBPA(4) в концентрации 20 мкМ. Указаны величины р при сравнении экспериментальных групп, продемонстрировавших статистически значимые различия.

Способ осуществляют следующим образом.

Последовательные этапы выполнения.

I этап - Пробоподготовка для выявления CD44⁺СD24^-/low клеток.

Клетки аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7 рассевают в культуральные флаконы (25 см²) с добавлением 6 мл полной питательной среды DMEM («Панэко», Россия), содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота («Biosera» Франция), пенициллин (50000 ед/л), стрептомицин (50 мг/л) и глютамин (292 мг/л) («Панэко», Россия).

Через 24 часа во флакон с клетками добавляют водорастворимые ДНК-связывающие лиганды DBPA(n), в которых два бисбензимидазольных блока соединены между собой линкером с числом метиленовых групп (n) 1 или 4, до конечной концентрации 20 мкМ.

После добавления DBPA(n) клетки культивируют в стандартных условиях при 37°C в CO₂ инкубаторе в течение 72 часов.

Затем клетки извлекают из флаконов с помощью смеси растворов версена и трипсина (1:1, «Панэко», Россия) в холодный (+4°С) раствор Хэнкса («Панэко», Россия).

Производят подсчет количества клеток, выросших во флаконе с помощью камеры Горяева.

Затем клетки разводят в соотношении 1 млн клеток на 100 мкл холодного раствора Хэнкса, в который добавляют антитела к CD44, меченные флуоресцеинизотиоцитатом (ФИТЦ) (Becton Dickinson, США), и антитела к CD24, меченные фикоэритрином (Becton Dickinson, США), из расчета по 20 мкл антител на 1 млн клеток.

Пробы инкубируют с антителами 30 минут на льду в темноте.

После окончания инкубации пробы центрифугируют в течение 5 минут при 200xg и к получившемуся осадку добавляют холодный раствор Хэнкса.

II этап - Получение данных с помощью проточной цитометрии.

Подготовленный образец, как описано выше на I этапе, анализируют на проточном цитофлуориметре, оснащенном лазерами с длинами волн 364 нм и 488 нм.

Для измерения флуоресценции ФИТЦа, используют узкополосные фильтры 530/30 нм, для фикоэритрина - 585/42, для DBPA(n) - 424/44нм.

В каждом образце анализируют данные об интенсивности прямого и бокового светорассеяния, флуоресценции ФИТЦа, фикоэритрина и DBPA(n). Полученные результаты записывают в цифровом виде.

Сохраненные данные обрабатывают с помощью программы CellQuestPro (Becton Dickinson, США).

III этап - Обработка данных, собранных с помощью проточной цитометрии.

Строят график точечного распределения клеток по прямому (forward scatter - FSC) и боковому светорассеянию (side scatter - SSC). На графике выделяют регион неповрежденных клеток, формирующих группу по показателям светорассеяния (Фиг.1).

Строят график распределения клеток из выделенного региона по интенсивности флуоресценции антител к CD44 и CD24. На графике выделяют регион клеток с иммунофенотипом CD44⁺СD24^-/low и определяют в нем количество клеток (Фиг.2).

Далее определяют среднюю интенсивность флуоресценции DBPA(n) отдельно в ОСК, которые были выделены в регионе клеток с иммунофенотипом CD44⁺СD24^-/low и в остальных клетках.

Рассчитывают относительное количество (долю) CD44⁺СD24^-/low клеток путем деления количества клеток с иммунофенотипом CD44⁺СD24^-/low на общее число клеток. Абсолютное количество CD44⁺СD24^-/low клеток получают путем умножения доли этих клеток на общее количество клеток, выросших во флаконе.

Примеры выполнения.

Пример 1 - Субклеточное распределение DBPA(1) и DBPA(4) в опухолевых клетках MCF-7 после 72-х часовой инкубации.

Субклеточное распределение DBPA(n) изучали через 72 ч инкубации этих соединений в концентрации 20 мкМ с клетками линии MCF-7 с помощью флуоресцентной микроскопии. Для этого к части клеток добавляли DBPA(1,4) в концентрации 20 мкМ, к другим клеткам добавляли в том же объеме дистиллированную воду, формируя таким образом группы «DBPA(1)», «DBPA(4)» и «контроль». Клетки инкубировали при 37°C в CO₂ инкубаторе в течение 72 часов, затем анализировали на микроскопе. Анализ проводили на флуоресцентном микроскопе Optiphot-2 (Nicon, Япония) при увеличении объектива 40х с использованием блока флуоресцентных фильтров UV-2А (длина волны возбуждения флуоресценции составляла 330-380 нм, регистрации - более 420 нм). Показано, что по сравнению с нефлуоресцириующими контрольными клетками, флуоресцентная микроскопия позволяла визуализировать ярко-флуоресцирующие клетки после инкубации их с DBPA(1,4) (Фиг. 3). Соединения накапливались внутри клеток и проникали в клеточные ядра, где распределялись достаточно равномерно. Цитоплазма относительно слабо окрашивалась этими соединениями, которые распределялись там в виде небольших гранул.

Данный пример показывает, что соединения DBPA(1,4) накапливаются внутри клеток и, что важно, достигают клеточных ядер.

Пример 2 - Интенсивность связывания DBPA(1) и DBPA(4) с CD44⁺СD24^-/low ОСК и остальной массой опухолевых клеток после 72-х часовой инкубации.

Благодаря способности DBPA(n) образовывать флуоресцирующие комплексы с двуцепочечной ДНК и при этом иметь схожие друг с другом спектры поглощения в УФ-области и флуоресценции существует возможность использования проточной цитометрии с УФ-лазером для количественной оценки связывания исследуемых соединений с клетками. Витальное исследование связывания DBPA(n) c CD44⁺СD24^-/-low ОСК и остальными клетками с помощью проточной цитофлуориметрии показало, что в обеих клеточных популяциях интенсивность флуоресценции значительно увеличивается при инкубации как с DBPA(1), так и с DBPA(4) по сравнению с контролем (р<0,001). При этом средняя интенсивность флуоресценции DBPA(1) в CD44⁺СD24^low/- ОСК составила 525±31 отн. ед., в остальных клетках 137±15 отн. ед. Накопление DBPA(4) в CD44⁺СD24^low/- ОСК составило 430±12 отн. ед., в остальных клетках 105±8 отн. ед.. Важно, что, исследуемые DBPA(1) и DBPA(4) накапливались в ОСК интенсивнее в 3,8 и 4,0 раза, чем в остальных клетках, соответственно (p<0,01 в обоих случаях) (Фиг. 4).

Приведенный пример показывает, что несмотря на высокую экспрессию в ОСК транспортеров откачки многих химических веществ, соединения DBPA(1 и 4) не только не откачиваются из ОСК как многие традиционные химиопрепараты, а, наоборот, накапливаются интенсивнее в ОСК, чем в остальных клетках .

Пример 3 - Снижение абсолютного количества CD44⁺СD24^-/low ОСК после действия DBPA(1,4).

Эффекты действия исследуемых DBPA(1,4) на ОСК оценивали через 72 часа после инкубации клеток с соединениями по изменению абсолютного количества клеток с иммунофенотипом CD44⁺СD24^-/low. Установлено, что как DBPA(1), так и DBPA(4) значительно снижают абсолютное количество CD44⁺СD24^-/low клеток по сравнению с контролем (Фиг. 5). Так, DBPA(1) в приводит к снижению абсолютного количества ОСК в 25,2 раз по сравнению с контролем (р=0,011). Использование DBPA(4) также значимо снижает абсолютное количество CD44⁺СD24^-/low клеток в 1,9 раза по сравнению с контролем (р=0,049).

Абсолютное количество CD44⁺СD24^-/lowклеток в контроле составляло в среднем (±SE) 3002±439/флакон, в группе DBPA(1) - 119±35/флакон, в группе DBPA(4) - 1550±220/флакон.

Данный пример доказывает способность DBPA(1,4) снижать количество ОСК РМЖ.

Пример 4 - Снижение относительного количества CD44⁺СD24^-/low ОСК после действия DBPA(1).

Для соединения DBPA(1) показана способность снижать относительное количество CD44⁺СD24^-/low клеток по сравнению с контролем (Фиг.6). Так инкубация клеток с DBPA(1) снижает долю ОСК в 3,7 раза по сравнению с контролем (р=0,015), Относительное количество CD44⁺СD24^-/lowклеток в контроле составляло в среднем (±SE) 0,22±0,01 /флакон, в группе DBPA(1) - 0,06±0,01/флакон, в группе DBPA(4) - 0,25±0,03/флакон.

Таким образом, пример №1 показывает возможность связывания DBPA(1,4) с опухолевыми клетками, что позволяет изучать их действие на популяции опухолевых клеток, а пример №2 подтверждает эффективность действия DBPA(1,4) на ОСК благодаря тому, что данные соединения не откачиваются из ОСК, а накапливаются и задерживаются внутри этих клеток, тем самым оказывая элиминирующее действие на ОСК. Вместе результаты из примеров №3 и №4 показывают, что новый способ, заключающийся в 72 часовом воздействии на клетки MCF-7 водорастворимых димерных бисбензимидазолов позволяет снижать количество ОСК.

В соответствии с концепцией ОСК, все ключевые характеристики злокачественных новообразований, делающие их смертельно опасными заболеваниями, определяются именно ОСК.

Предложенный способ позволяет повысить химио-и радиочувствительность опухоли в целом, что в свою очередь будет способствовать повышению эффективности лечения.

Изобретение относится к области медицины, в частности онкологии и может быть использовано для снижения количества CD44⁺СD24^-/low опухолевых стволовых клеток (ОСК). Для снижения количества стволовых клеток проводят инкубацию клеток аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7 в течение 72 часов при температуре +37°С при воздействии на клетки in vitro соединений: водорастворимого димерного бисбензимидазола с 1 метиленовой группой в составе линкера DBPA (1) или водорастворимого димерного бисбензимидазола с 4 метиленовыми группами DBPA (4) и через 72 часа определяют количество CD44⁺СD24^-/low ОСК. Предложенный способ позволяет повысить химио- и радиочувствительность опухоли в целом, что, в свою очередь, будет способствовать повышению эффективности лечения. 6 ил., 4 пр.

Способ снижения количества CD44⁺СD24^-/low опухолевых стволовых клеток аденокарциномы молочной железы человека, заключающийся в 72-часовом воздействии на опухолевые клетки in vitro ДНК-связывающих лигандов, отличающийся тем, что используют симметричные водорастворимые димерные бисбензимидазолы (dimeric bisbenzimidazoles – DB), которые содержат N,N–диметиламинопропилкарбоксамидные группы (amid - A) на концах молекул и 1,4-пиперазин (piperazine - P) в олигометиленовом линкере (DBPA(n)), где n - число метиленовых звеньев в линкере, соединяющем два бисбензимидазольных блока: через 24 часа после посева клеток проводят их инкубацию с водорастворимым димерным бисбензимидазолом, содержащим N,N–диметиламинопропилкарбоксамидные группы (amid – A) на концах молекул и 1,4-пиперазин (piperazine - P) в олигометиленовом линкере с 1 метиленовой группой в составе линкера (DBPA(1)) в концентрации 20 мкМ или водорастворимым димерным бисбензимидазолом, содержащим N,N–диметиламинопропилкарбоксамидные группы (amid - A) на концах молекул и 1,4-пиперазин (piperazine - P) в олигометиленовом линкере с 4 метиленовыми группами в составе линкера (DBPA(4)) в концентрации 20мкМ in vitro при температуре +37°С в течение 72 часов, после чего с помощью метода проточной цитофлуориметрии оценивают абсолютное и относительное количество CD44⁺СD24^-/low опухолевых стволовых клеток и регистрируют его уменьшение по сравнению с контролем.