Способ моделирования нагруженного метаболизма при сочетанном субхроническом воздействии тяжелых металлов Российский патент 2023 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании сочетанного действия тяжелых металлов, в частности, кадмия, марганца и свинца на функциональное состояние организма.

В мировом масштабе загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами продолжает расти и воздействие на человека и животных через воздух, продукты питания или питьевую воду становится все более глобальным явлением. Наибольшую потенциальную опасность для здоровья населения промышленно развитых городов представляет собой низкоуровневое сочетанное воздействие тяжёлых металлов. Как известно, такие металлы, как кадмий, свинец и марганец являются одними из наиболее опасных токсикантов окружающей среды, способных оказывать канцерогенное, мутагенное, тератогенное или невротоксичное действие на живой организм [1]. Экспериментальные и эпидемиологические исследования указывают на то, что последствия многофакторного влияния, вызванные несколькими тяжелыми металлами, могут сильно отличаться от эффектов, возникающих на фоне однофакторной токсической экспозиции [2-4]. Рядом авторов сообщалось о синергетических, аддитивных и антагонистических взаимодействиях между металлами [5, 6].

Таким образом, оценка комбинированных эффектов, вызванных путем одновременного воздействия малых доз нескольких металлов, имеет большое теоретическое значение и практическую ценность для разработки профилактических и терапевтических мер. В связи с этим, необходима разработка способов моделирования «нагруженного метаболизма», наиболее приближенных к реальным условиям. Следует отметить, что в большинстве экспериментальных исследований, как правило, используют высокие дозы отдельных ксенобиотиков, что значительно отличается от естественных концентраций и путей поступления в организм [7, 8]. Однако исследования с использованием низкоуровневого воздействия комбинации тяжелых металлов становятся все более актуальными и приближенными к реальному воздействию [9-11].

Патентный поиск свидетельствует об отсутствии способов моделирования «нагруженного метаболизма» при сочетанном субхроническом воздействии тяжелых металлов. Существующие патенты, как правило, направлены на моделирование различных патологий (коагулопатии, ангиопатии, нефропатии, энцефалопатии) путем токсического воздействия ряда тяжелых металлов [12-14].

Известен способ моделирования хронической токсической нефропатии, который достигается путем ежедневного введения лабораторным животным с помощью внутрижелудочного зонда ацетата свинца в дозе 40 мг/кг веса в пересчете на металл, где на единицу раствора, равную 0,2 мл, приходится 8 мг свинца, что приводит к выраженным изменениям в структуре почечной ткани [15].

Недостатком данного способа является выбор вводимой дозы препарата животным. При ежедневном введении ацетата свинца (40 мг/кг) в течение 16 дней дозировка токсиканта достигает примерно 1/7ЛД_50, что является достаточной высокой дозой для организма грызунов, вызывая токсическое отравление.

Известен способ моделирования ангиопатии у экспериментальных животных. Данный способ заключается в том, что животным вводят раствор сульфата кадмия подкожно ежедневно 1 раз в сутки в течение 1 месяца в дозах 0,8, 1,0 или 1,5 мг/кг веса животного в пересчете на металл, где на единицу раствора, равную 0,1 мл, приходится 0,08, 0,1 или 0,15 мг кадмия, что приводит к развитию хронической кадмиевой ангиопатии [16].

Главным недостатком данного способа является подкожный метод введения соли сульфата кадмия. Во-первых, данный способ воздействия является менее физиологичным, а во-вторых, повторные инъекции в одно и то же место вызывают атрофию жировой ткани, что приводит к нарушению абсорбции препарата. Следует отметить, что пероральное поступление токсического вещества (введение в питьевую воду, внутрижелудочное введение) является наиболее приближенным к естественным условиям интоксикации при загрязнении окружающей среды металлополютантами.

Представленные модели в целом могут быть использованы для изучения уже сложившегося конкретного заболевания, однако они не являются показательными для изучения состояния предпатологии.

Технической задачей предлагаемого изобретения является максимальное приближение разработанной модели «нагруженного метаболизма» к низкоуровневому воздействию тяжелых металлов на организм человека в условиях загрязнения окружающей среды.

Данная модель даст возможность изучить состояние гомеостатических механизмов, а также апробировать в данной модели возможные эффективные профилактические и терапевтические меры.

Техническая задача достигается тем, что способ моделирования «нагруженного метаболизма» осуществляется путем сочетанного субхронического воздействия тяжелых металлов.

Способ реализован следующим образом.

С целью моделирования хронического низкоуровневого сочетанного воздействия тяжелых металлов крысы получали вместе с питьевой водой соль кадмия (CdCl₂) в дозировке 7,5 мг/л, марганца (MnCl₂) в дозировке 2,5 мг/л и свинца (Pb(CH₃COO)₂ х 3H₂O в дозировке 25 мг/л. Указанные дозировки в пересчете на концентрацию металла составляли Cd - 4,59 мг/л, Mn - 1,09 мг/л и Pb - 13,65 мг/л. Длительность воздействия составляла 30 дней. Все животные на протяжении эксперимента получали стандартный рацион в виде гранулированного комбикорма.

В ходе эксперимента у животных ежедневно оценивалось потребление воды, еженедельно масса тела. По окончании эксперимента проводилась оценка поведения с помощью тестов «Открытое поле» и «Черно-белая камера»; проводился гематологический и биохимический анализ крови на приборах URIT-2900 Vet Plus (Китай) и CS-T240 (Китай), соответственно; оценка элементного статуса с помощью масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ «STATISTICA 10.0» (StatSoft) и Microsoft Excel 2016. Данные представлены в виде медианы (Me) и 25-75 центилей. Для оценки статистической значимости различий в группах животных использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Различия считались достоверными при р<0,05.

Пример. Половозрелые самцы крыс линии Wistar весом 210 ± 20 г вместе с питьевой водой в течение 30 дней получали соль кадмия (CdCl₂) в дозировке 7,5 мг/л, марганца (MnCl₂) в дозировке 2,5 мг/л и свинца (Pb(CH₃COO)₂ х 3H₂O в дозировке 25 мг/л. По истечении времени эксперимента у животных оценивалось функциональное состояние организма, включавшее анализ потребления воды, массы тела, поведения, гематологических и биохимических показателей крови, элементного статуса организма.

Результаты исследования показали, что крысы, получавшие низкие дозы тяжелых металлов статистически значимо потребляли меньше воды, чем интактные животные (табл. 1). В связи с этим, возможно, что подопытные животные были слегка обезвожены. Масса тела животных, получавших смесь металлов, практически не отличалась от веса животных контрольной группы в течение всего эксперимента. При рассмотрении массовых коэффициентов внутренних органов животных было установлено, что относительный вес печени был достоверно выше в группе крыс, подвергшихся комбинированному низкоуровневому воздействию металлов на 10 % (р=0,03). В отношении других органов (почки, легкие, мозг, сердце, селезенка) отличий от контрольных значений выявлено не было.

В ходе поведенческого анализа было установлено увеличение горизонтальной двигательной активности (ГДА) лабораторных животных опытной группы при сравнении с контролем: уровень ГДА по периферии был статистически значимо больше контрольных значений на 50 % (р=0,01), так же отмечалась тенденция к увеличению ГДА полупериферии и ГДА в центральной области арены. Следует отметить, что суммарная ГДА была достоверно выше в опыте на 67 % (р=0,05) (фигура 1). У животных, подвергшихся воздействию металлов, отмечалось также увеличение вертикальной двигательной активности (ВДА), что характеризовалось достоверно более высоким уровнем ВДА с опорой на 100 % относительно контроля (р=0,05) (фигура 2). Уровень эмоционального напряжения у животных опытной группы был выше относительно контроля. Это сопровождалось статистически достоверно более высокой частотой длинного и суммарного груминга - на 100 % (р=0,003) и 500 % (р=0,02) выше контроля, соответственно. Также отмечалась тенденция к увеличению актов дефекации у животных, подвергавшихся комбинированному воздействию металлов (фигура 3).

Согласно полученным результатам у животных опытной группы был установлен статистически достоверно более низкий уровень эритроцитов (ниже на 10 % при р=0,05) и гемоглобина (ниже на 6 % при р=0,01), а также отмечалась тенденция к снижению уровня лейкоцитов (таблица 2). Практически все изучаемые биохимические параметры крови не отличались от контрольных значений и находились в пределах рекомендуемых норм. Исключением явилось содержание мочевины, уровень, который был достоверно выше у животных опытной группы на 28 % (р=0,02) относительно контроля.

В ходе проведенного анализа установлено статистически достоверно более высокая концентрация свинца в сыворотке крови лабораторных животных, подвергшихся низкоуровневому сочетанному воздействию металлов, превышающая контрольные значения более чем в 4 раза (р=0,04) (фигура 4). На фоне этого также отмечалось достоверно более высокое содержание сывороточного кадмия (выше более чем в 3 раза при р=0,002), прослеживалась тенденция к повышению уровня марганца.

Таким образом, можно сделать заключение, что предложенный способ является патентоспособными и может быть использован для моделирования «нагруженного метаболизма» при сочетанном субхроническом воздействии тяжелых металлов.

Источники информации

1. Katsnelson B.A. Further development of the theory and mathematical description of combined toxicity: An approach to classifying types of action of three-factorial combinations (a case study of manganese-chromium-nickel subchronic intoxication) / B.A. Katsnelson, V.G. Panov, I.A. Minigaliyeva, A.N. Varaksin, L.I. Privalova, T.V. Slyshkina, S.V. Grebenkina // Toxicology. - 2015. - № 334. - Р. 33-44.

2. Zhou F. Toxicity assessment due to prenatal and lactational exposure to lead, cadmium and mercury mixtures / F. Zhou, G. Yin, Y. Gao, D. Liu, J. Xie, L. Ouyang, Y. Fan, H. Yu, Z. Zha, K. Wang, L. Shao, C. Feng, G. Fan // Environment International. - 2019. - № 133. - Р. 105192.

3. Oladipo O.O. Dyslipdemia induced by chronic low dose co-exposure to lead, cadmium and manganese in rats: the role of oxidative stress / O.O. Oladipo, J.O. Ayo, S.F. Ambali, B. Mohammed, T. Aluwong // Environmental Toxicology and Pharmacology. - 2017. - № 53. - Р. 199-205.

4. Lee M.S. Umbilical Cord Blood Metal Mixtures and Birth Size in Bangladeshi Children / M.S. Lee, K.D. Eum, M. Golam, Q. Quamruzzaman, M.L. Kile, M. Mazumdar, D.C. Christiani // Environmental Health Perspectives. - 2021. - V. 129. - № 5. - Р. 57006.

5. Lu C. Toxicity interactions between manganese (Mn) and lead (Pb) or cadmium (Cd) in a model organism the nematode C. elegans / C. Lu, K.R. Svoboda, K.A. Lenz, C. Pattison, H. Ma // Environmental Science and Pollution Research. - 2018. - V. 25. - № 16. - Р.15378-15389.

6. Zhu H. Biochemical and histopathological effects of subchronic oral exposure of rats to a mixture of five toxic elements / H. Zhu, Y. Jia, H. Cao, F. Meng, X. Liu // Food and Chemical Toxicology. - 2014. - № 71. - Р. 166-175.

7. Аndjelkovic M. Toxic Effect of Acute Cadmium and Lead Exposure in Rat Blood, Liver, and Kidney / M. Аndjelkovic, A. Buha Djordjevic, E. Antonijevic, B. Antonijevic, M. Stanic, J. Kotur-Stevuljevic, V. Spasojevic-Kalimanovska, M. Jovanovic, N. Boricic, D. Wallace, Z. Bulat / International Journal of Environmental Research and Public Health. - 2019. - V. 16. - № 2. - Р. 274.

8. Lebedová, J. Impact of acute and subchronic inhalation exposure to PbO nanoparticles on mice / J. Lebedová, Z. Nováková, Z. Večeřa, M. Buchtová, J. Dumková, B. Dočekal, L. Bláhová, P. Mikuška, I. Míšek, A. Hampl, K. Hilscherová // Nanotoxicology. - 2018. - V. 12. - № 4. - Р. 290-304.

9. Казакова Т.В. Суммарное накопление тяжелых металлов - микроэлементов в шерсти в связи с молочной продуктивностью коров / Т.В. Казакова, Маршинская О.В., Мирошников С.А., Нотова С.В., Завьялов О.А., Фролов А.Н., Тяпугин Е.А. // Животноводство и кормопроизводство. - 2020. - Т.103. - № 2. - С. 8-15.

10. Miroshnikov S. The total accumulation of heavy metals in body in connection with the dairy productivity of cows / S. Miroshnikov, S. Notova, T. Kazakova, O. Marshinskaia // Environmental Science and Pollution Research. - 2021. - V. 28. - № 36. - Р. 49852-49863.

11. Jia Q. Analysis of search strategies for evaluating low-dose heavy metal mixture induced cognitive deficits in rats: An early sensitive toxicological approach / Q. Jia, Y. Zhang, S. Liu, Z. Li, F. Zhou, L. Shao, C. Feng, G. Fan // Ecotoxicology and environmental safety. - 2020. - № 202. - Р. 110900.

12. Патент на изобретение RU № 2746831 Способ моделирования хронической коагулопатии у животных в эксперименте / Э.М. Гаглоева, В.Б. Брин // Заявка 2020101224 от 10.01.2020, опубл. 21.04.2021, бюл. № 12.

13. Патент на изобретение RU № 2286607 Способ моделирования хронической токсической нефропатии / Л.Р. Датиева, Ф.С. Дзугкоева // Заявка 2005109451 от 01.04.2005, опубл. 27.10.2006, бюл. № 30.

14. Патент на изобретение RU № 2341828 Способ моделирования отдаленной токсической энцефалопатии / Л.М. Соседова, Н.Л. Якимова, Г.Д. Хамуев, Е.А. Титов, В.С. Рукавишников // Заявка 2007116507 от 02.05.2007, опубл. 20.12.2008, бюл. № 35.

15. Патент на изобретение RU № 2358327 Способ моделирования хронической токсической нефропатии / А.К. Митциев, В.Б. Брин // Заявка 2008108864 от 06.03.2008, опубл. 10.06.2009, бюл. № 16.

16. Патент на изобретение RU № 2454731 Способ моделирования кадмиевой ангиопатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении / Ж.Р. Битарова, Ф.С. Дзугкоева // Заявка 2011101273 от 12.01.2011, опубл. 27.06.2012, бюл. № 18.

Таблица 1 Показатели Группы Достоверность контроль опыт р Количество потребляемой воды, мл/сут 27,0 (25,0-34,0) 20,0 (17,0-26,0) 0,03 Масса печени, г 3,72 (3,6-3,86) 4,08 (3,84-4,39) 0,03

Таблица 2 Показатели Группы Достоверность контроль опыт р WBC, 10⁹/л 10,8 (9,98-11,84) 9,38 (9,02-10,21) 0,67 Neo, % 26,0 (21,0-27,5) 30,1 (23,2-33,9) 0,53 Lym, % 66,9 (65,5-69,1) 60,1 (58,8-71,8) 0,53 Mon, % 3,3 (2,0-4,3) 2,6 (1,6-4,7) 1,0 Eos, % 1,7 (1,6-2,1) 2,2 (1,5-3,0) 0,75 Bas, % 0,9 (0,5-1,1) 0,9 (0,8-1,1) 0,91 RBC, 10¹²/л 8,45 (8,42-8,56) 7,67 (7,27-8,25) 0,05 HGB, г/л 143,0 (141,0-144,0) 134,0 (129,0-134,0) 0,01 PLT, 10⁹/л 494,0 (460,0-585,0) 509,0 (460,0-615,0) 0,93 Мочевина, ммоль/л 5,4 (4,6-7,2) 6,4 (6,2-8,5) 0,02

Изобретение относится к экспериментальной биологии, экологии и токсикологии и представляет собой способ моделирования нагруженного метаболизма при сочетанном субхроническом воздействии тяжелых металлов. Способ включает введение половозрелым самцам крыс линии Wistar в питьевую воду хлорида кадмия CdCl₂ в дозировке 7,5 мг/л, хлорида марганца MnCl₂ в дозировке 2,5 мг/л и ацетата свинца Pb(CH₃COO)₂ × 3H₂O в дозировке 25 мг/л в течение 30 дней. Использование изобретения позволит снизить течение метаболических процессов организма при сочетанном действии тяжелых металлов, в частности кадмия, марганца и свинца. 4 ил., 2 табл., 1 пр.

Способ моделирования нагруженного метаболизма при сочетанном субхроническом воздействии тяжелых металлов, характеризующийся тем, что проводят ежедневное поение половозрелых самцов крыс линии Wistar с добавлением в питьевую воду хлорида кадмия CdCl₂ в дозировке 7,5 мг/л, хлорида марганца MnCl₂ в дозировке 2,5 мг/л и ацетата свинца Pb(CH₃COO)₂ × 3H₂O в дозировке 25 мг/л в течение 30 дней.