ЛИПИДНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА IN VIVO И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2023 года по МПК A61K9/51 A61K31/7105 A61K31/711 A61K47/22 A61K47/24 A61K47/28 A61K47/69 A61K48/00 C12N15/88 A61P1/16 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к липидным наночастицам для доставки лекарственного средства in vivo и к их применению.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В фармацевтической промышленности система доставки лекарственного средства (DDS), предназначенная для эффективной доставки необходимого количества лекарственного средства при сниженных побочных эффектах лекарственного средства и максимальном повышении эффективности и действий, является основной технологией с высокой добавленной стоимостью, которая может принести экономические выгоды, сопоставимые с разработкой новых лекарств и имеет большой потенциал для успеха, и ее цель состоит в том, чтобы улучшить качество лечения пациентов за счет повышения эффективности приема лекарств.

Технология солюбилизации малорастворимых лекарственных средств, относящаяся к технологии стимуляции всасывания лекарственных средств, которая является одной из основных технологий системы доставки лекарственного средства, считается наиболее разумным способом снижения стоимости разработки новых лекарственных веществ и в то же время увеличения дополнительной эффективности продаваемых в настоящее время лекарств. В частности, разработка улучшенных новых лекарственных средств за счет разработки технологии растворения лекарств в ситуации, когда условия для разработки новых лекарств плохие, как в Корее, является областью, которая может создать огромную добавленную стоимость при низких затратах.

Генная терапия с использованием генетической системы доставки лекарственного средства создана с большой надеждой изменить генетическое связывание и лечить многочисленные заболевания. При успешном и безопасном выполнении этой генной терапии эффективная доставка генов является одной из основных проблем, и было доказано, что вирусная система доставки эффективна для доставки генов. Однако из-за некоторых дефектов, таких как иммуногенность, ограничение размера встраиваемой ДНК и трудности массового производства, использование вирусов в качестве системы доставки генов ограничено. Невирусные носители генов, такие как катионные липосомы и полимеры, стали отмечать как альтернативные средства вирусной системы.

Улучшенный профиль стабильности и простота изготовления и функционирования полимерной системы доставки инициировали исследования по разработке и синтезу нетоксичного и биоразлагаемого полимерного носителя для эффективной и безопасной доставки генов. Поли(L-лизин), полиэтиленимин, звездчатый дендример, полиамидоаминовый дендример и катионная липосома и т.п. могут подвергаться самосборке и сжимать плазмидную ДНК (пДНК) в небольшую структуру, достаточную для проникновения в клетки посредством эндоцитоза, и поэтому они широко изучаются в качестве невирусной системы доставки генов.

Нуклеиновые кислоты, такие как антисмысловая РНК, миРНК (малая интерферирующая РНК) и т.п., представляют собой материал, способный ингибировать экспрессию специфических белков in vivo, и рассматриваются как важный инструмент для лечения рака, генетических заболеваний, инфекционных заболеваний, аутоиммунных заболеваний и т.п. (Novina and Sharp, Nature, 430, 161-164, 2004). Однако нуклеиновые кислоты, такие как миРНК, трудно доставить непосредственно в клетки, и они легко разлагаются ферментами в крови, поэтому предпринимается множество исследований для преодоления этих трудностей. На настоящий момент в основном используют способ доставки нуклеиновых кислот в клетки, представляющий собой способ переноса путем смешивания с положительно заряженным липидом или полимером (называемыми конъюгатом липид-ДНК (липоплекс) и конъюгатом полимер-ДНК (полиплекс), соответственно) (Hirko et al., Curr. Med. Chem., 10, 1185-93, 2003; Merdanetal., Adv. Drug. Deliv. Rev., 54, 715-58, 2002). Конъюгат липид-ДНК объединяют с нуклеиновой кислотой для эффективной доставки нуклеиновой кислоты в клетки, и, таким образом, он широко используется на клеточном уровне, но in vivo, при местном введении, во многих случаях имеет недостаток, заключающийся в индукции воспаления в организме (Filonand and Phillips, Biochim. Biophys. Acta, 1329, 345-56, 1997).

Кроме того, такая невирусная система доставки имеет проблему низкой эффективности трансфекции. Много усилий было направлено на повышение эффективности трансфекции, но это все еще далеко от того, чтобы система была стабильной. Кроме того, носитель невирусной системы доставки генов обладает значительно высокой цитотоксичностью из-за плохой биосовместимости и бионеразлагаемости.

Принимая во внимание такой предшествующий уровень техники, в результате того, что авторы настоящего изобретения попытались разработать новую частицу, которая имеет превосходную эффективность инкапсуляции и может эффективно доставлять анионное лекарственное средство, нуклеиновую кислоту и т.п. в целевой орган или клетку, они создали настоящее изобретение путем получения липидной наночастицы, содержащей ионизируемый липид, фосфолипид, холестерин и конъюгат липид-PEG (полиэтиленгликоль), и подтвердили, что эта липидная наночастица специфично доставляется в ткань печени, и лекарственное средство, такое как анионное соединение или нуклеиновая кислота, может быть инкапсулировано с высокой эффективностью.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

Задача настоящего изобретения заключается в предложении липидной наночастицы, содержащей ионизируемый липид, в котором связаны 6-членный гетероциклический амин и алкил-эпоксид, фосфолипид, холестерин и конъюгат липид-PEG (полиэтиленгликоль).

Другая задача настоящего изобретения заключается в предложении композиции для доставки лекарственного средства (анионного лекарственного средства, нуклеиновой кислоты или их комбинации), содержащей (1) липидную наночастицу и (2) анионное лекарственное средство, нуклеиновую кислоту или их комбинацию.

Еще одна задача настоящего изобретения заключается в предложении фармацевтической композиции для предупреждения или лечения заболевания печени, содержащей (1) липидную наночастицу и (2) анионное лекарственное средство, нуклеиновую кислоту или их комбинацию.

ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ

Подробно это будет описано ниже. С другой стороны, каждое описание и воплощение, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть применены к каждому другому описанию и воплощению. Другими словами, все комбинации различных элементов, раскрытых здесь, входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, не следует считать, что объем настоящего изобретения ограничен конкретным описанием, изложенным ниже.

В одном аспекте, для решения вышеуказанной задачи предложена липидная наночастица, содержащая ионизируемый липид, в котором объединены 6-членный гетероциклический амин и алкилэпоксид; фосфолипид; холестерин; и конъюгат липид-PEG (полиэтиленгликоль).

Липидная наночастица в соответствии с одним примером является специфичной для ткани печени и имеет превосходную биосовместимость и может с высокой эффективностью доставлять генный терапевтический агент и т.п., и, таким образом, ее можно эффективно использовать в родственных технических областях, таких как генная терапия, опосредованная липидными наночастицами, и технология диагностики с визуализацией.

Здесь «ионизируемый липид» или «липидоид» означает аминосодержащий липид, который может быть легко протонирован, и, например, это может быть липид, состояние заряда которого изменяется в зависимости от окружающего рН. Ионизируемый липид может представлять собой липид, в котором объединены 6-членный гетероциклический амин и алкил-эпоксид. В частности, ионизируемый липид может представлять собой соединение, имеющее характеристики, подобные липиду, получаемому реакцией 6-членного гетероциклического амина и алкил-эпоксида, и, более конкретно, это может быть соединение, получаемое реакцией раскрытия цикла эпоксида путем взаимодействия 6-членного гетероциклического амина с алкил-эпоксидом.

В одном примере ионизируемый липид может представлять собой липид, в котором 6-членный гетероциклический амин и алкил-эпоксид объединены путем их взаимодействия в молярном соотношении 1:n (n = количество первичных аминов, содержащихся в 6-членном гетероциклическом амине × 2 + количество вторичных аминов × 1). Согласно одному конкретному примеру, его можно получить путем смешивания 246 амина и 1,2-эпоксидодекана в молярном соотношении 1:4 и их взаимодействия в условиях от 700 до 800 об/мин и от 85 до 95 в течение от 2 до 4 суток.

Ионизируемый липид может быть протонирован (положительно заряжен) при рН ниже рКа катионного липида, и он может быть по существу нейтральным при рН выше рКа. В одном примере липидная наночастица может содержать протонированный ионизируемый липид и/или ионизируемый липид, обладающий нейтральностью.

Ионизируемый липид представляет собой ионизируемое соединение, имеющее характеристики, подобные липиду, и за счет электростатического взаимодействия с лекарственным средством (например, анионным лекарственным средством и/или нуклеиновой кислотой) может играть роль инкапсулирования лекарственного средства в липидную наночастицу с высокой эффективностью.

6-Членный гетероциклический амин может содержать структуру пиперазина или пиперидина.

6-Членный гетероциклический амин может быть цепочечным или нецепочечным амином, содержащим третичный амин, и согласно одному примеру он может представлять собой один или более видов, выбранных из группы, состоящей из

и

В одном примере 6-членный гетероциклический амин может представлять собой один или более видов, выбранных из группы, состоящей из 1,4-бис(3-аминопропил)-пиперазина, N-(3-аминопропил)пиперидина, (1-метил-4-пиперидинил)метанамина, 2-(4-метилпиперазин-1-ил)этиламина, 1-(2-аминоэтил)пиперазина и 1-(3-аминопропил)-пиперазина.

В зависимости от типа амина, входящего в состав ионизируемого липида, (1) эффективность инкапсуляции лекарственного средства, (2) PDI (индекс полидисперсности) и/или (3) эффективность доставки лекарственного средства в ткань печени и/или клетки, составляющие печень (например, гепатоциты), и/или LSEC (синусоидальные эндотелиальные клетки печени), липидной наночастицы могут быть разными.

Липидная наночастица, содержащая ионизируемый липид, содержащий амин, может иметь один или более видов следующих характеристик:

(1) инкапсулирование лекарственного средства с высокой эффективностью;

(2) однородный размер получаемых частиц (или низкое значение PDI); и/или

(3) превосходная эффективность доставки лекарственного средства в ткань печени и/или клетки, составляющие печень (например, гепатоциты и/или LSEC).

Согласно одному примеру, липидная наночастица, содержащая ионизируемый липид, содержащий 1,4-бис(3-аминопропил)пиперазин (например, Cas Nos. 7209-38-3), может иметь один или более видов следующих характеристик, по сравнению с липидной наночастицей, содержащей ионизируемый липид, содержащий другие типы аминов:

(1) инкапсулирование лекарственного средства с высокой эффективностью;

(2) однородный размер получаемых частиц (или низкое значение PDI); и/или

(3) превосходная эффективность доставки лекарственного средства в ткань печени и/или клетки, составляющие печень (например, гепатоциты и/или LSEC).

Алкил-эпоксид может иметь структуру химической формулы 1, приведенной ниже:

[Химическая формула 1]

Алкил-эпоксид может иметь число атомов углерода от С6 до С14, от С6 до С12, от С6 до С10, от С8 до С14, от С8 до С12, от С8 до С10, от С10 до С14, от С10 до С12 или С10, и, например, он может представлять собой 1,2-эпоксидодекан из С10. Устанавливая число атомов углерода алкил-эпоксида, содержащегося в ионизируемом липиде, в указанном выше диапазоне, можно обеспечить высокую эффективность инкапсуляции лекарственного средства, инкапсулируемого в липидную наночастицу.

В одном примере ионизируемый липид может иметь общую формулу химической формулы 2, приведенную ниже:

[Химическая формула 2]

Структура химической формулы 2 является одним из примеров структуры ионизируемого липида согласно одному примеру, и структура ионизируемого липида может быть разной в зависимости от типа 6-членного гетероциклического амина и алкил-эпоксида.

Согласно одному примеру, липидная наночастица, содержащая ионизируемый липид, имеющий структуру химической формулы 2, может иметь один или более видов следующих характеристик по сравнению с липидной наночастицей, содержащей другие типы ионизируемых липидов:

(1) инкапсулирование лекарственного средства с высокой эффективностью;

(2) однородный размер получаемых частиц (или низкое значение PDI); и/или

(3) превосходная эффективность доставки лекарственного средства в ткань печени и/или клетки, составляющие печень (например, гепатоциты и/или LSEC).

Согласно одному примеру, липидная наночастица может иметь рКа от 5 до 8, от 5,5 до 7,5, от 6 до 7 или от 6,5 до 7. рКа представляет собой константу диссоциации кислоты и относится к тому, что обычно используют в качестве индекса, указывающего силу кислоты целевого вещества. Значение рКа липидной наночастицы важно с точки зрения стабильности липидной наночастицы in vivo и высвобождения лекарственного средства из липидной наночастицы. В одном примере липидная наночастица, имеющая значение рКа в указанном выше диапазоне, может быть безопасно доставлена в орган-мишень (например печень) и/или клетку-мишень (гепатоцит и/или LSEC) in vivo и достичь органа-мишени и/или клетки-мишени, и после эндоцитоза проявляет положительный заряд для высвобождения инкапсулированного лекарственного средства посредством электростатического взаимодействия с анионным белком мембраны эндосомы.

Фосфолипид элементов липидной наночастицы согласно одному примеру играет роль покрытия и защиты ядра, образуемого взаимодействием ионизируемого липида и лекарственного средства в липидной наночастице, и может способствовать проникновению через клеточную мембрану и выходу из эндосомы во время внутриклеточной доставки лекарственного средства путем связывания с фосфолипидным бислоем клетки-мишени.

В качестве фосфолипида можно без ограничений использовать фосфолипид, который может способствовать слиянию липидной наночастицы согласно одному примеру, и, например, он может представлять собой один или более видов, выбранных из группы, состоящей из диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE), дистеароилфосфатидилхолина (DSPC), пальмитоилолеоилфосфатидилхолина (РОРС), фосфатидилхолина яиц (ЕРС), диолеоилфосфатидилхолина (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), диолеоилфосфатидилглицерина (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерина (DPPG), дистеароилфосфатидилэтаноламина (DSPE), фосфатидилэтаноламина (РЕ), дипальмитоилфосфатидилэтаноламина, 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (POPE), 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (РОРС), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-[фосфо-L-серина] (DOPS), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-[фосфо-L-серина] и тому подобного. В одном примере липидная наночастица, содержащая DOPE, может быть эффективной для доставки мРНК (малая интерферирующая РНК) (превосходная эффективность доставки лекарственного средства мРНК), а в другом примере липидная наночастица, содержащая DSPE, может быть эффективной для доставки миРНК (превосходная эффективность доставки лекарственного средства миРНК).

Холестерин элементов липидной наночастицы согласно одному примеру может придавать морфологическую жесткость липидному наполнению липидной наночастицы и быть диспергированным в ядре и поверхности наночастицы для повышения стабильности наночастицы.

Здесь «конъюгат липид-PEG (полиэтиленгликоль)», «липид-PEG», «PEG-липид», «PEG-липид» или «липид-PEG» относится к форме, в которой липид и PEG конъюгированы, и означает липид, в котором полимер полиэтиленгликоля (PEG), который является гидрофильным полимером, связан с одним концом. Конъюгат липид-PEG способствует стабильности частицы в сыворотке наночастицы внутри липидной наночастицы и играет роль предотвращения агрегации между наночастицами. Кроме того, конъюгат липид-PEG может защищать нуклеиновые кислоты от расщепляющего фермента во время доставки нуклеиновых кислот in vivo и повышать стабильность нуклеиновых кислот in vivo и увеличивать время полужизни лекарственного средства, инкапсулированного в наночастицу.

В конъюгате липид-PEG PEG может быть непосредственно конъюгирован с липидом или связан с липидом через линкерную группировку. Можно использовать любую линкерную группировку, подходящую для связывания PEG с липидом, и, например, она включает линкерную группировку, не содержащую сложного эфира, и линкерную группировку, содержащую сложный эфир. Не содержащая сложный эфир линкерная группировка включает не только амидо (-C(O)NH-), амино (-NR-), карбонил (-С(О)-), карбамат (-NHC(O)O-), мочевину (-NHC(O)NH-), дисульфид (-S-S-), простой эфир (-О-), сукцинил (-(O)ССН2СН2С(O)-), сукцинамидил (-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-), эфир, дисульфид, но также их комбинации (например, линкер, содержащий как карбаматную линкерную группировку, так и линкерную группировку амидо), но не ограничивается ими. Содержащая сложный эфир линкерная группировка включает, например, карбонат (-ОС(О)О-), сукциноил, фосфатный эфир (-О-(О)РОН-О-), сульфонатный эфир и их комбинации, но не ограничивается ими.

В одном примере средняя молекулярная масса конъюгата липид-PEG может составлять от 100 дальтон до 10000 дальтон, от 200 дальтон до 8000 дальтон, от 500 дальтон до 5000 дальтон, от 1000 дальтон до 3000 дальтон, от 1000 дальтон до 2600 дальтон, от 1500 дальтон до 2600 дальтон, от 1500 дальтон до 2500 дальтон, от 2000 до 2600 дальтон, от 2000 до 2500 дальтон или 2000 дальтон.

В качестве липида в конъюгате липид-PEG можно использовать, без ограничений, любой липид, способный связываться с полиэтиленгликолем, а также можно использовать фосфолипид и/или холестерин, которые являются другими элементами липидной наночастицы. В частности, липид в конъюгате липид-PEG может представлять собой церамид, димиристоилглицерин (DMG), сукциноил-диацилглицерин (s-DAG), дистеароилфосфатидилхолин (DSPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPC) или холестерин, но не ограничиваясь ими.

В одном примере конъюгат липид-PEG может представлять собой PEG, связанный с диалкилоксипропилом (PEG-DAA), PEG, связанный с диацилглицерином (PEG-DAG), PEG, связанный с фосфолипидом, таким как фосфатидилэтаноламин (PEG-РЕ), PEG, конъюгированный с церамидом (PEG-CER, конъюгат церамид-PEG, церамид-PEG, конъюгат PEG-церамид или PEG-церамид), холестерин или PEG, конъюгированный с его производным, PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, PEG-DSPE(DSPE-PEG) и их смесь, и, например, может представлять собой C16-PEG2000 церамид (N-пальмитоил-сфингозин-1-{сукцинил[метокси-(полиэтиленгликоль)2000]}), DMG-PEG 2000, 14:0 PEG2000 РЕ.

Согласно одному примеру, липидная наночастица, содержащая конъюгат керамид-PEG, может иметь один или более видов следующих характеристик по сравнению с липидной наночастицей, содержащей другие типы конъюгатов липид-PEG:

(1) инкапсулирование лекарственного средства с высокой эффективностью;

(2) однородный размер получаемых частиц (или низкое значение PDI); и/или

(3) превосходная эффективность доставки лекарственного средства в ткань печени и/или клетки, составляющие печень (например, гепатоциты и/или LSEC).

PEG в конъюгате липид-PEG представляет собой гидрофильный полимер и обладает способностью ингибировать адсорбцию белков сыворотки, увеличивает время циркуляции липидных наночастиц в организме и может играть роль предотвращения агрегации между наночастицами. Кроме того, конъюгат липид-PEG может проявлять скрытую функцию in vivo для предотвращения деградации наночастиц.

PEG может быть таким, чтобы функциональная группа связывалась со стороной, не связанной с липидом (функционализированный PEG). В этом случае функциональная группа, которая может быть использована, может представлять собой один или более видов, выбранных из группы, состоящей из сукцинильной группы, карбоновой кислоты, малеимида, аминогруппы, биотина, циануровой группы и фолата и т.п.

Согласно одному примеру, конъюгат липид-PEG может содержаться в липидной наночастице в количестве от 0,1 до 15 мольных % (мол. %), от 0,25 до 15 мол. %, от 0,5 до 15 мол. %, от 1 до 15 мол. %, от 1,5 до 15 мол. %, от 2 до 15 мол. %, от 2,5 до 15 мол. %, от 0,1 до 12,5 мол. %, от 0,25 до 12,5 мол. %, от 0,5 до 12,5 мол. %, от 1 до 12,5 мол. %, от 1,5 до 12,5 мол. %, от 2 до 12,5 мол. %, от 2,5 до 12,5 мол. %, от 0,1 до 10 мол. %, от 0,25 до 10 мол. %, от 0,5 до 10 мол. %, от 1 до 10 мол. %, от 1,5 до 10 мол. %, от 2 до 10 мол. %, от 2,5 до 10 мол. %, от 0,1 до 7,5 мол. %, от 0,25 до 7,5 мол. %, от 0,5 до 7,5 мол. %, от 1 до 7,5 мол. %, от 1,5 до 7,5 мол. %, от 2 до 7,5 мол. %, от 2,5 до 7,5 мол. %, от 0,1 до 5 мол. %, от 0,25 до 5 мол. %, от 0,5 до 5 мол. %, от 1 до 5 мол. %, от 1,5 до 5 мол. %, от 2 до 5 мол. %, от 2,5 до 5 мол. %, от 0,1 до 3 мол. %, от 0,25 до 3 мол. %, от 0,5 до 3 мол. %, от 1 до 3 мол. %, от 1,5 до 3 мол. %, от 2 до 3 мол. %, от 2,5 до 3 мол. %, от 0,1 до 2,5 мол. %, от 0,25 до 2,5 мол. %, от 0,5 до 2,5 мол. %, от 1 до 2,5 мол. %, от 1,5 до 2,5 мол. %, от 2 до 2,5 мол. %, от 0,1 до 4,5 мол. %, от 0,25 до 4,5 мол. %, от 0,5 до 4,5 мол. %, от 1 до 4,5 мол. %, от 1,5 до 4,5 мол. %, от 2 до 4,5 мол. %, от 2,5 до 4,5 мол. %, от 0,1 до 4 мол. %, от 0,25 до 4 мол. %, от 0,5 до 4 мол. %, от 1 до 4 мол. %, от 1,5 до 4 мол. %, от 2 до 4 мол. %, от 2,5 до 4 мол. %, от 0,1 до 3,5 мол. %, от 0,25 до 3,5 мол. %, от 0,5 до 3,5 мол. %, от 1 до 3,5 мол. %, от 1,5 до 3,5 мол. %, от 2 до 3,5 мол. %, от 2,5 до 3,5 мол. %, от 0,1 до 2,0 мол. %, от 0,1 до 1,5 мол. %, от 0,1 до 1,0 мол. %, от 0,5 до 2,0 мол. %, от 0,5 до 1,5 мол. %, от 0,5 до 1,0 мол. %, от 1,0 до 2,0 мол. %, от 1,0 до 1,5 мол. %, от 1,5 до 2,0 мол. %, 1,0 мол. % или 1,5 мол. %.

В одном примере эффект нацеливания на ткань печени, гепатоциты и/или LSEC (эффект доставки лекарственного средства) липидной наночастицы может зависеть от содержания конъюгата липид-PEG, содержащегося в липидной наночастице.

Например, липидная наночастица, содержащая конъюгат липид-PEG в количестве от 0,1 до 15 мол. %, от 0,25 до 15 мол. %, от 0,5 до 15 мол. %, от 1 до 15 мол. %, от 1,5 до 15 мол. %, от 2 до 15 мол. %, от 2,5 до 15 мол. %, от 0,1 до 12,5 мол. %, от 0,25 до 12,5 мол. %, от 0,5 до 12,5 мол. %, от 1 до 12,5 мол. %, от 1,5 до 12,5 мол. %, от 2 до 12,5 мол. %, от 2,5 до 12,5 мол. %, от 0,1 до 10 мол. %, от 0,25 до 10 мол. %, от 0,5 до 10 мол. %, от 1 до 10 мол. %, от 1,5 до 10 мол. %, от 2 до 10 мол. %, от 2,5 до 10 мол. %, от 0,1 до 7,5 мол. %, от 0,25 до 7,5 мол. %, от 0,5 до 7,5 мол. %, от 1 до 7,5 мол. %, от 1,5 до 7,5 мол. %, от 2 до 7,5 мол. %, от 2,5 до 7,5 мол. %, от 0,1 до 5 мол. %, от 0,25 до 5 мол. %, от 0,5 до 5 мол. %, от 1 до 5 мол. %, от 1,5 до 5 мол. %, от 2 до 5 мол. %, от 2,5 до 5 мол. %, от 0,1 до 3 мол. %, от 0,25 до 3 мол. %, от 0,5 до 3 мол. %, от 1 до 3 мол. %, от 1,5 до 3 мол. %, от 2 до 3 мол. %, от 2,5 до 3 мол. %, от 0,1 до 2,5 мол. %, от 0,25 до 2,5 мол. %, от 0,5 до 2,5 мол. %, от 1 до 2,5 мол. %, от 1,5 до 2,5 мол. %, от 2 до 2,5 мол. %, от 0,1 до 4,5 мол. %, от 0,25 до 4,5 мол. %, от 0,5 до 4,5 мол. %, от 1 до 4,5 мол. %, от 1,5 до 4,5 мол. %, от 2 до 4,5 мол. %, от 2,5 до 4,5 мол. %, от 0,1 до 4 мол. %, от 0,25 до 4 мол. %, от 0,5 до 4 мол. %, от 1 до 4 мол. %, от 1,5 до 4 мол. %, от 2 до 4 мол. %, от 2,5 до 4 мол. %, от 0,1 до 3,5 мол. %, от 0,25 до 3,5 мол. %, от 0,5 до 3,5 мол. %, от 1 до 3,5 мол. %, от 1,5 до 3,5 мол. %, от 2 до 3,5 мол. %, от 2,5 до 3,5 мол. %, от 0,1 до 10 мол. %, от 0,1 до 5,0 мол. %, от 0,1 до 4,5 мол. %, от 0,1 до 4,0 мол. %, от 0,1 до 3,5 мол. %, от 0,1 до 3,0 мол. %, от 0,1 до 2,5 мол. %, от 0,1 до 2,0 мол. %, от 0,1 до 1,5 мол. %, от 0,1 до 1,0 мол. %, от 0,5 до 10 мол. %, от 0,5 до 5,0 мол. %, от 0,5 до 4,5 мол. %, от 0,5 до 4,0 мол. %, от 0,5 до 3,5 мол. %, от 0,5 до 3,0 мол. %, от 0,5 до 2,5 мол. %, от 0,5 до 2,0 мол. %, от 0,5 до 1,5 мол. %, от 0,5 до 1,0 мол. %, от 1,0 до 10 мол. %, от 1,0 до 5,0 мол. %, от 1,0 до 4,5 мол. %, от 1,0 до 4,0 мол. %, от 1,0 до 3,5 мол. %, от 1,0 до 3,0 мол. %, от 1,0 до 2,5 мол. %, от 1,0 до 2,0 мол. %, от 1,0 до 1,5 мол. %, от 1,5 до 10 мол. %, от 1,5 до 5,0 мол. %, от 1,5 до 4,5 мол. %, от 1,5 до 4,0 мол. %, от 1,5 до 3,5 мол. %, от 1,5 до 3,0 мол. %, от 1,5 до 2,5 мол. %, от 1,5 до 2,0 мол. %, 1,0 мол. % или 1,5 мол. % (по сравнению с липидной наночастицей, содержащей конъюгат липид-PEG в количестве, выходящем за пределы вышеуказанного диапазона), может иметь превосходный эффект нацеливания на гепатоциты.

В качестве другого примера, липидная наночастица, содержащая конъюгат липид-PEG в количестве от 0,1 до 15 мол. %, от 0,25 до 15 мол. %, от 0,5 до 15 мол. %, от 1 до 15 мол. %, от 1,5 до 15 мол. %, от 2 до 15 мол. %, от 2,5 до 15 мол. %, от 0,1 до 12,5 мол. %, от 0,25 до 12,5 мол. %, от 0,5 до 12,5 мол. %, от 1 до 12,5 мол. %, от 1,5 до 12,5 мол. %, от 2 до 12,5 мол. %, от 2,5 до 12,5 мол. %, от 0,1 до 10 мол. %, от 0,25 до 10 мол. %, от 0,5 до 10 мол. %, от 1 до 10 мол. %, от 1,5 до 10 мол. %, от 2 до 10 мол. %, от 2,5 до 10 мол. %, от 0,1 до 7,5 мол. %, от 0,25 до 7,5 мол. %, от 0,5 до 7,5 мол. %, от 1 до 7,5 мол. %, от 1,5 до 7,5 мол. %, от 2 до 7,5 мол. %, от 2,5 до 7,5 мол. %, от 0,1 до 5 мол. %, от 0,25 до 5 мол. %, от 0,5 до 5 мол. %, от 1 до 5 мол. %, от 1,5 до 5 мол. %, от 2 до 5 мол. %, от 2,5 до 5 мол. %, от 0,1 до 3 мол. %, от 0,25 до 3 мол. %, от 0,5 до 3 мол. %, от 1 до 3 мол. %, от 1,5 до 3 мол. %, от 2 до 3 мол. %, от 2,5 до 3 мол. %, от 0,1 до 2,5 мол. %, от 0,25 до 2,5 мол. %, от 0,5 до 2,5 мол. %, от 1 до 2,5 мол. %, от 1,5 до 2,5 мол. %, от 2 до 2,5 мол. %, от 0,1 до 4,5 мол. %, от 0,25 до 4,5 мол. %, от 0,5 до 4,5 мол. %, от 1 до 4,5 мол. %, от 1,5 до 4,5 мол. %, от 2 до 4,5 мол. %, от 2,5 до 4,5 мол. %, от 0,1 до 4 мол. %, от 0,25 до 4 мол. %, от 0,5 до 4 мол. %, от 1 до 4 мол. %, от 1,5 до 4 мол. %, от 2 до 4 мол. %, от 2,5 до 4 мол. %, от 0,1 до 3,5 мол. %, от 0,25 до 3,5 мол. %, от 0,5 до 3,5 мол. %, от 1 до 3,5 мол. %, от 1,5 до 3,5 мол. %, от 2 до 3,5 мол. %, от 2,5 до 3,5 мол. %, от 0,1 до 10 мол. %, от 0,1 до 5,0 мол. %, от 0,1 до 4,5 мол. %, от 0,1 до 4,0 мол. %, от 0,1 до 3,5 мол. %, от 0,1 до 3,0 мол. %, от 0,1 до 2,5 мол. %, от 0,1 до 2,0 мол. %, от 0,1 до 1,5 мол. %, от 0,1 до 1,0 мол. %, от 0,5 до 10 мол. %, от 0,5 до 5,0 мол. %, от 0,5 до 4,5 мол. %, от 0,5 до 4,0 мол. %, от 0,5 до 3,5 мол. %, от 0,5 до 3,0 мол. %, от 0,5 до 2,5 мол. %, от 0,5 до 2,0 мол. %, от 0,5 до 1,5 мол. %, от 0,5 до 1,0 мол. %, от 1,0 до 10 мол. %, от 1,0 до 5,0 мол. %, от 1,0 до 4,5 мол. %, от 1,0 до 4,0 мол. %, от 1,0 до 3,5 мол. %, от 1,0 до 3,0 мол. %, от 1,0 до 2,5 мол. %, от 1,0 до 2,0 мол. %, от 1,0 до 1,5 мол. %, от 1,5 до 10 мол. %, от 1,5 до 5,0 мол. %, от 1,5 до 4,5 мол. %, от 1,5 до 4,0 мол. %, от 1,5 до 3,5 мол. %, от 1,5 до 3,0 мол. %, от 1,5 до 2,5 мол. %, от 1,5 до 2,0 мол. %, 1,0 мол. %, или 1,5 мол. % (по сравнению с липидной наночастицей, содержащей конъюгат липид-PEG в количестве, выходящем за пределы вышеуказанного диапазона), может иметь превосходный эффект нацеливания на LSEC.

Согласно одному примеру, холестерин может содержаться в липидной наночастице в количестве от 10 до 60 мол. %, от 20 до 60 мол. %, от 30 до 60 мол. %, от 30 до 55 мол. %, от 30 до 52,5 мол. %, от 30 до 52 мол. %, от 30 до 51 мол. %, от 30 до 50 мол. %, от 30 до 47,5 мол. %, от 30 до 45 мол. %, от 30 до 44 мол. %, от 30 до 43,5 мол. %, от 30 до 43 мол. %, от 30 до 41,5 мол. %, от 30 до 40 мол. %, от 30 до 39,5 мол. %, от 35 до 60 мол. %, от 35 до 55 мол. %, от 35 до 52,5 мол. %, от 35 до 52 мол. %, от 35 до 51 мол. %, от 35 до 50 мол. %, от 35 до 47,5 мол. %, от 35 до 45 мол. %, от 35 до 44 мол. %, от 35 до 43,5 мол. %, от 35 до 43 мол. %, от 35 до 41,5 мол. %, от 35 до 40 мол. %, от 35 до 39,5 мол. %, от 37 до 60 мол. %, от 37 до 55 мол. %, от 37 до 52,5 мол. %, от 37 до 52 мол. %, от 37 до 51 мол. %, от 37,5 до 50 мол. %, от 37,5 до 47,5 мол. %, от 37,5 до 45 мол. %, от 37,5 до 44 мол. %, от 37,5 до 43,5 мол. %, от 37,5 до 43 мол. %, от 37,5 до 41,5 мол. %, от 37,5 до 40 мол. %, от 37,5 до 39,5 мол. %, от 39,5 до 60 мол. %, от 39,5 до 55 мол. %, от 39,5 до 52,5 мол. %, от 39,5 до 52 мол. %, от 39,5 до 51 мол. %, от 39,5 до 50 мол. %, от 39,5 до 47,5 мол. %, от 39,5 до 45 мол. %, от 39,5 до 44 мол. %, от 39,5 до 43,5 мол. %, от 39,5 до 43 мол. %, от 39,5 до 41,5 мол. %, от 39,5 до 40 мол. %, от 40 до 60 мол. %, от 40 до 55 мол. %, от 40 до 52,5 мол. %, от 40 до 52 мол. %, от 40 до 51 мол. %, от 40 до 50 мол. %, от 40 до 47,5 мол. %, от 40 до 45 мол. %, от 40 до 44 мол. %, от 40 до 43,5 мол. %, от 40 до 43 мол. %, от 40 до 41,5 мол. %, от 41,5 до 60 мол. %, от 41,5 до 55 мол. %, от 41,5 до 52,5 мол. %, от 41,5 до 52 мол. %, от 41,5 до 51 мол. %, от 41,5 до 50 мол. %, от 41,5 до 47,5 мол. %, от 41,5 до 45 мол. %, от 41,5 до 44 мол. %, от 41,5 до 43,5 мол. %, от 41,5 до 43 мол. %, от 43 до 60 мол. %, от 43 до 55 мол. %, от 43 до 52,5 мол. %, от 43 до 52 мол. %, от 43 до 51 мол. %, от 43 до 50 мол. %, от 43 до 47,5 мол. %, от 43 до 45 мол. %, от 43 до 44 мол. %, от 43 до 43,5 мол. %, от 43,5 до 60 мол. %, от 43,5 до 55 мол. %, от 43,5 до 52,5 мол. %, от 43,5 до 52 мол. %, от 43,5 до 51 мол. %, от 43,5 до 50 мол. %, от 43,5 до 47,5 мол. %, от 43,5 до 45 мол. %, от 43,5 до 44 мол. %, от 45 до 60 мол. %, от 45 до 55 мол. %, от 45 до 52,5 мол. %, от 45 до 52 мол. %, от 45 до 51 мол. %, от 45 до 50 мол. %, от 45 до 47,5 мол. %, от 47,5 до 60 мол. %, от 47,5 до 55 мол. %, от 47,5 до 52,5 мол. %, от 47,5 до 52 мол. %, от 47,5 до 51 мол. %, от 47,5 до 50 мол. %, от 50 до 60 мол. %, от 50 до 55 мол. %, от 50 до 52,5 мол. %, от 50 до 52 мол. %, от 50 до 52,5 мол. % от 50 до 51,5 мол. %, от 51 до 60 мол. %, от 51 до 55 мол. %, от 51 до 52,5 мол. %, или от 51 до 52 мол. %, от 51 до 60 мол. %, от 51 до 55 мол. %, от 51 до 52,5 мол. %, или от 51 до 52 мол. %.

Согласно одному примеру, сумма конъюгата липид-PEG и холестерина может содержаться в липидной наночастице в количестве от 30 до 70 мол. %, от 40 до 70 мол. %, от 40 до 60 мол. %, от 40 до 55 мол. %, от 40 до 53,5 мол. %, от 40 до 50 мол. %, от 40 до 47,5 мол. %, от 40 до 45 мол. %, от 40 до 44,5 мол. %, от 42 до 60 мол. %, от 42 до 55 мол. %, от 42 до 53,5 мол. %, от 42 до 50 мол. %, от 42 до 47,5 мол. %, от 42 до 45 мол. %, от 42 до 44,5 мол. %, от 44 до 60 мол. %, от 44 до 55 мол. %, от 44 до 53,5 мол. %, от 44 до 50 мол. %, от 44 до 47,5 мол. %, от 44 до 45 мол. %, от 44 до 44,5 мол. %, от 44,5 до 60 мол. %, от 44,5 до 55 мол. %, от 44,5 до 53,5 мол. %, от 44,5 до 50 мол. %, от 44,5 до 47,5 мол. %, или от 44,5 до 45 мол. %.

Согласно одному примеру, ионизируемый липид может содержаться в липидной наночастице в количестве от 10 до 70 мол. %, от 10 до 60 мол. %, от 10 до 55 мол. %, от 10 до 50 мол. %, от 10 до 45 мол. %, от 10 до 42,5 мол. %, от 10 до 40 мол. %, от 10 до 35 мол. %, от 10 до 30 мол. %, от 10 до 26,5 мол. %, от 10 до 25 мол. %, от 10 до 20 мол. %, от 15 до 60 мол. %, от 15 до 55 мол. %, от 15 до 50 мол. %, от 15 до 45 мол. %, от 15 до 42,5 мол. %, от 15 до 40 мол. %, от 15 до 35 мол. %, от 15 до 30 мол. %, от 15 до 26,5 мол. %, от 15 до 25 мол. %, от 15 до 20 мол. %, от 20 до 60 мол. %, от 20 до 55 мол. %, от 20 до 50 мол. %, от 20 до 45 мол. %, от 20 до 42,5 мол. %, от 20 до 40 мол. %, от 20 до 35 мол. %, от 20 до 30 мол. %, от 20 до 26,5 мол. %, от 20 до 25 мол. %, от 25 до 60 мол. %, от 25 до 55 мол. %, от 25 до 50 мол. %, от 25 до 45 мол. %, от 25 до 42,5 мол. %, от 25 до 40 мол. %, от 25 до 35 мол. %, от 25 до 30 мол. %, от 25 до 26,5 мол. %, от 26,5 до 60 мол. %, от 26,5 до 55 мол. %, от 26,5 до 50 мол. %, от 26,5 до 45 мол. %, от 26,5 до 42,5 мол. %, 26.5 до 40 мол. %, от 26,5 до 35 мол. %, от 26,5 до 30 мол. %, от 30 до 60 мол. %, от 30 до 55 мол. %, от 30 до 50 мол. %, от 30 до 45 мол. %, от 30 до 42,5 мол. %, от 30 до 40 мол. %, от 30 до 35 мол. %, от 35 до 60 мол. %, от 35 до 55 мол. %, от 35 до 50 мол. %, от 35 до 45 мол. %, от 35 до 42,5 мол. %, от 35 до 40 мол. %, от 40 до 60 мол. %, от 40 до 55 мол. %, от 40 до 50 мол. %, от 40 до 45 мол. %, от 40 до 42,5 мол. %, от 42,5 до 60 мол. %, от 42,5 до 55 мол. %, от 42,5 до 50 мол. %, или от 42,5 до 45 мол. %.

Согласно одному примеру, фосфолипид может содержаться в липидной наночастице в количестве от 1 до 50 мол. %, от 5 до 50 мол. %, от 5 до 40 мол. %, от 5 до 30 мол. %, от 5 до 25 мол. %, от 5 до 20 мол. %, от 5 до 15 мол. %, от 5 до 13 мол. %, от 5 до 10 мол. %, от 10 до 30 мол. %, от 10 до 25 мол. %, от 10 до 20 мол. %, от 10 до 15 мол. %, от 10 до 13 мол. %, от 15 до 30 мол. %, от 15 до 25 мол. %, от 15 до 20 мол. %, от 20 до 30 мол. %, или от 20 до 25 мол. %.

Здесь «мол. % (мол. %, мольный процент)» выражают в процентах путем деления количества молей конкретного компонента на сумму молей всех компонентов с последующим умножением на 100 и выражают в виде формулы, например, это может быть Уравнение 1 ниже:

(Уравнение 1)

мол. % = (моли конкретного компонента) / (сумма молей всех компонентов) × 100

Липидная наночастица может содержать ионизируемый липид : фосфолипид : холестерин : конъюгат липид-PEG в молярном соотношении от 20 до 50 : от 10 до 30 : от 20 до 60 : от 0,1 до 10, в молярном соотношении от 20 до 50 : от 10 до 30 : от 20 до 60 : от 0,25 до 10, в молярном соотношении от 20 до 50 : от 10 до 30 : от 30 до 60 : от 0,25 до 10, в молярном соотношении от 20 до 50 : от 10 до 30 : от 30 до 60 : от 0,1 до 5, в молярном соотношении от 20 до 50 : от 10 до 30 : от 30 до 60 : от 0,5 до 5, в молярном соотношении от 25 до 45 : от 10 до 25 : от 40 до 50 : от 0,5 до 3, в молярном соотношении от 25 до 45 : от 10 до 20 : от 40 до 55 : от 0,5 до 3, в молярном соотношении от 25 до 45 : от 10 до 20 : от 40 до 55 : от 1,0 до 1,5, в молярном соотношении от 40 до 45 : от 10 до 15 : от 40 до 45 : от 0,5 до 3,0, в молярном соотношении от 40 до 45 : от 10 до 15 : от 40 до 45 : от 0,5 до 3, в молярном соотношении от 40 до 45 : от 10 до 15 : от 40 до 45 : от 1 до 1,5, в молярном соотношении от 25 до 30: от 17 до 22; от 50 до 55 : от 0,5 до 3,0, в молярном соотношении от 25 до 30: от 17 до 22; от 50 до 55 : от 1,0 до 2,5, или в молярном соотношении от 25 до 30: от 17 до 22; от 50 до 55 : от 1,5 до 2,5. Согласно одному примеру, при поддержании постоянной суммы молей конъюгата липид-PEG и холестерина среди компонентов, содержащихся в липидной наночастице, количество молей холестерина уменьшается настолько, насколько количество молей конъюгата липид-PEG увеличивается, и таким образом может поддерживаться молярное соотношение компонентов.

Здесь молярное соотношение означает соотношение молей, а «частей по массе» означает массовое соотношение, в котором содержится каждый компонент.

В одном примере липидная наночастица может содержать ионизируемый липид в количестве от 20 до 50 частей по массе, фосфолипид в количестве от 10 до 30 частей по массе, холестерин в количестве от 20 до 60 частей по массе (или от 20 до 60 частей по массе), и конъюгат липид-PEG от 0,1 до 10 частей по массе (или от 0,25 до 10 частей по массе, от 0,5 до 5 частей по массе). Липидная наночастица может содержать ионизируемый липид в количестве от 20 до 50% по массе, фосфолипид в количестве от 10 до 30% по массе, холестерин в количестве от 20 до 60% по массе (или от 30 до 60% по массе) и конъюгат липид-PEG от 0,1 до 10% по массе (или от 0,25 до 10% по массе, от 0,5 до 5% по массе) в расчете на общую массу наночастиц. В другом примере липидная наночастица может содержать ионизируемый липид в количестве от 25 до 50% по массе, фосфолипид в количестве от 10 до 20% по массе, холестерин в количестве от 35 до 55% по массе и конъюгат липид-PEG в количестве от 0,1 до 10% по массе (или от 0,25 до 10% по массе, от 0,5 до 5% по массе) в расчете на общую массу наночастиц.

Липидная наночастица, содержащая ионизируемый липид, холестерин, фосфолипид и/или конъюгат липид-PEG в указанном выше диапазоне (молярное соотношение, частей по массе и/или % по массе), может иметь превосходную (1) стабильность липидной наночастицы, (2) эффективность инкапсуляции лекарственного средства и/или (3) эффективность доставки лекарственного средства в ткань и/или клетки печени (например, гепатоциты и/или LSEC), по сравнению с липидной наночастицей, содержащей ионизируемый липид, холестерин, фосфолипид и/или или конъюгат липид-PEG за пределами вышеуказанного диапазона.

Липидная наночастица согласно одному примеру может иметь средний диаметр от 20 нм до 200 нм, от 20 до 180 нм, от 20 нм до 170 нм, от 20 нм до 150 нм, от 20 нм до 120 нм, от 20 нм до 100 нм, от 20 нм до 90 нм, от 30 нм до 200 нм, от 30 до 180 нм, от 30 нм до 170 нм, от 30 нм до 150 нм, от 30 нм до 120 нм, от 30 нм до 100 нм, от 30 нм до 90 нм, от 40 нм до 200 нм, от 40 до 180 нм, от 40 нм до 170 нм, от 40 нм до 150 нм, от 40 нм до 120 нм, от 40 нм до 100 нм, от 40 нм до 90 нм, от 50 нм до 200 нм, от 50 до 180 нм, от 50 нм до 170 нм, от 50 нм до 150 нм, от 50 нм до 120 нм, от 50 нм до 100 нм, от 50 нм до 90 нм, от 60 нм до 200 нм, 60 до 180 нм, от 60 нм до 170 нм, от 60 нм до 150 нм, от 60 нм до 120 нм, от 60 нм до 100 нм, от 60 нм до 90 нм, от 70 нм до 200 нм, от 70 до 180 нм, от 70 нм до 170 нм, от 70 нм до 150 нм, от 70 нм до 120 нм, от 70 нм до 100 нм, от 70 нм до 90 нм, от 80 нм до 200 нм, от 80 до 180 нм, от 80 нм до 170 нм, от 80 нм до 150 нм, от 80 нм до 120 нм, от 80 нм до 100 нм, от 80 нм до 90 нм, от 90 нм до 200 нм, от 90 до 180 нм, от 90 нм до 170 нм, от 90 нм до 150 нм, от 90 нм до 120 нм, или от 90 нм до 100 нм, для легкого введения в ткань печени, гепатоциты и/или LSEC (синусоидальные эндотелиальные клетки печени). Когда размер липидной наночастицы меньше вышеуказанного диапазона, трудно поддерживать стабильность, поскольку площадь поверхности липидной наночастицы чрезмерно увеличивается, и, таким образом, доставка в ткань-мишень и/или эффект лекарственного средства может быть снижен.

Эффект нацеливания на ткань печени, гепатоциты и/или LSEC (эффект доставки лекарственного средства) липидной наночастицы согласно одному примеру может зависеть от размера липидной наночастицы. Например, в случае липидной наночастицы диаметром от 40 до 120 нм, от 30 до 100 нм, от 35 до 95 нм, от 40 до 90 нм, от 45 до 90 нм, от 50 до 90 нм, от 55 до 85 нм, от 60 до 80 нм, от 70 до 90 нм, от 70 до 80 нм, от 50 до 70 нм или от 60 до 70 нм, эффект нацеливания на гепатоциты может быть превосходным (по сравнению с наночастицами, имеющими диаметр за пределами вышеуказанного диапазона). В качестве другого примера, в случае липидной наночастицы, имеющей диаметр от 20 до 200 нм, от 20 до 180 нм, от 40 до 180 нм, от 40 до 170 нм, от 50 до 160 нм, от 70 до 180 нм, от 70 до 170 нм, от 75 до 170 нм, от 75 до 165 нм, от 70 до 150 нм, от 70 до 130 нм, от 75 до 130 нм, от 80 до 120 нм, от 85 до 120 нм, примерно от 90 до 120 нм, от 90 до ПО нм, от 90 до 100 нм, от 80 до 110 нм, от 80 до 100 нм, от 85 до 95 нм, примерно 90 нм или 90 нм, эффект нацеливания на LSEC может быть превосходным (по сравнению с наночастицей, имеющей диаметр за пределами вышеуказанного диапазона).

Липидная наночастица может специфично нацеливаться на ткань печени. Липидная наночастица в соответствии с одним из примеров может очень похоже имитировать метаболическое поведение природных липопротеинов и благодаря этому может быть успешно применена для процесса липидного метаболизма в печени и терапевтического механизма посредством этого.

Липидная наночастица может нацеливаться на гепатоциты. Когда содержание липида-PEG, содержащегося в липидной наночастице, составляет от 0,1 до 15 мол. %, от 0,25 до 15 мол. %, от 0,5 до 15 мол. %, от 1 до 15 мол. %, от 1,5 до 15 мол. %, от 2 до 15 мол. %, от 2,5 до 15 мол. %, от 0,1 до 12,5 мол. %, от 0,25 до 12,5 мол. %, от 0,5 до 12,5 мол. %, от 1 до 12,5 мол. %, от 1,5 до 12,5 мол. %, от 2 до 12,5 мол. %, от 2,5 до 12,5 мол. %, от 0,1 до 10 мол. %, от 0,25 до 10 мол. %, от 0,5 до 10 мол. %, от 1 до 10 мол. %, от 1,5 до 10 мол. %, от 2 до 10 мол. %, от 2,5 до 10 мол. %, от 0,1 до 7,5 мол. %, от 0,25 до 7,5 мол. %, от 0,5 до 7,5 мол. %, от 1 до 7,5 мол. %, от 1,5 до 7,5 мол. %, от 2 до 7,5 мол. %, от 2,5 до 7,5 мол. %, от 0,1 до 5 мол. %, от 0,25 до 5 мол. %, от 0,5 до 5 мол. %, от 1 до 5 мол. %, от 1,5 до 5 мол. %, от 2 до 5 мол. %, от 2,5 до 5 мол. %, от 0,1 до 3 мол. %, от 0,25 до 3 мол. %, от 0,5 до 3 мол. %, от 1 до 3 мол. %, от 1,5 до 3 мол. %, от 2 до 3 мол. %, от 2,5 до 3 мол. %, от 0,1 до 2,5 мол. %, от 0,25 до 2,5 мол. %, от 0,5 до 2,5 мол. %, от 1 до 2,5 мол. %, от 1,5 до 2,5 мол. %, от 2 до 2,5 мол. %, от 0,1 до 4,5 мол. %, от 0,25 до 4,5 мол. %, от 0,5 до 4,5 мол. %, от 1 до 4,5 мол. %, от 1,5 до 4,5 мол. %, от 2 до 4,5 мол. %, от 2,5 до 4,5 мол. %, от 0,1 до 4 мол. %, от 0,25 до 4 мол. %, от 0,5 до 4 мол. %, от 1 до 4 мол. %, от 1,5 до 4 мол. %, от 2 до 4 мол. %, от 2,5 до 4 мол. %, от 0,1 до 3,5 мол. %, от 0,25 до 3,5 мол. %, от 0,5 до 3,5 мол. %, от 1 до 3,5 мол. %, от 1,5 до 3,5 мол. %, от 2 до 3,5 мол. %, от 2,5 до 3,5 мол. %, от 0,1 до 2,0 мол. %, от 0,1 до 1,5 мол. %, от 0,1 до 1,0 мол. %, от 0,5 до 2,0 мол. %, от 0,5 до 1,5 мол. %, от 0,5 до 1,0 мол. %, от 1,0 до 2,0 мол. %, от 1,0 до 1,5 мол. %, от 1,5 до 2,0 мол. %, 1,0 мол. % или 1,5 мол. %, эффективность доставки лекарственного средства (эффективность нацеливания на гепатоциты) в гепатоциты липидной наночастицей может быть превосходной.

Липидная наночастица может нацеливаться на LSEC (синусоидальные эндотелиальные клетки печени). Когда содержание липида-PEG, содержащегося в липидной наночастице, составляет от 0,1 до 15 мол. %, от 0,25 до 15 мол. %, от 0,5 до 15 мол. %, от 1 до 15 мол. %, от 1,5 до 15 мол. %, от 2 до 15 мол. %, от 2,5 до 15 мол. %, от 0,1 до 12,5 мол. %, от 0,25 до 12,5 мол. %, от 0,5 до 12,5 мол. %, от 1 до 12,5 мол. %, от 1,5 до 12,5 мол. %, от 2 до 12,5 мол. %, от 2,5 до 12,5 мол. %, от 0,1 до 10 мол. %, от 0,25 до 10 мол. %, от 0,5 до 10 мол. %, от 1 до 10 мол. %, от 1,5 до 10 мол. %, от 2 до 10 мол. %, от 2,5 до 10 мол. %, от 0,1 до 7,5 мол. %, от 0,25 до 7,5 мол. %, от 0,5 до 7,5 мол. %, от 1 до 7,5 мол. %, от 1,5 до 7,5 мол. %, от 2 до 7,5 мол. %, от 2,5 до 7,5 мол. %, от 0,1 до 5 мол. %, от 0,25 до 5 мол. %, от 0,5 до 5 мол. %, от 1 до 5 мол. %, от 1,5 до 5 мол. %, от 2 до 5 мол. %, от 2,5 до 5 мол. %, от 0,1 до 3 мол. %, от 0,25 до 3 мол. %, от 0,5 до 3 мол. %, от 1 до 3 мол. %, от 1,5 до 3 мол. %, от 2 до 3 мол. %, от 2,5 до 3 мол. %, от 0,1 до 2,5 мол. %, от 0,25 до 2,5 мол. %, от 0,5 до 2,5 мол. %, от 1 до 2,5 мол. %, от 1,5 до 2,5 мол. %, от 2 до 2,5 мол. %, от 0,1 до 4,5 мол. %, от 0,25 до 4,5 мол. %, от 0,5 до 4,5 мол. %, от 1 до 4,5 мол. %, от 1,5 до 4,5 мол. %, от 2 до 4,5 мол. %, от 2,5 до 4,5 мол. %, от 0,1 до 4 мол. %, от 0,25 до 4 мол. %, от 0,5 до 4 мол. %, от 1 до 4 мол. %, от 1,5 до 4 мол. %, от 2 до 4 мол. %, от 2,5 до 4 мол. %, от 0,1 до 3,5 мол. %, от 0,25 до 3,5 мол. %, от 0,5 до 3,5 мол. %, от 1 до 3,5 мол. %, от 1,5 до 3,5 мол. %, от 2 до 3,5 мол. %, от 2,5 до 3,5 мол. %, от 0,1 до 2,0 мол. %, от 0,1 до 1,5 мол. %, от 0,1 до 1,0 мол. %, от 0,5 до 2,0 мол. %, от 0,5 до 1,5 мол. %, от 0,5 до 1,0 мол. %, от 1,0 до 2,0 мол. %, от 1,0 до 1,5 мол. %, от 1,5 до 2,0 мол. %, 1,0 мол. %, или 1,5 мол. %, эффективность доставки лекарственного средства (эффективность нацеливания на LSEC) в LSEC липидной наночастицей может быть превосходной.

Здесь «нацеливание» и «локализация» в ткани печени, гепатоцитах и/или LSEC липидной наночастицы может означать интернализацию в ткань или клетки и может означать интернализацию внутри ядра, поскольку она может проникать через ядерную мембрану.

В качестве другого аспекта предложена композиция для доставки лекарственного средства, содержащая (1) липидную наночастицу и (2) анионное лекарственное средство, нуклеиновую кислоту или их комбинацию (комбинация анионного лекарственного средства и нуклеиновой кислоты). Лекарственное средство может представлять собой анионное лекарственное средство, нуклеиновую кислоту или их комбинацию (анионное лекарственное средство и нуклеиновая кислота).

Композиция для доставки лекарственного средства может представлять собой биоактивное вещество, такое как анионное лекарственное средство и/или нуклеиновая кислота, и т.п., которое может быть инкапсулировано внутри липидной наночастицы, и биоактивное вещество, такое как анионное лекарственное средство и/или нуклеиновая кислота, может быть инкапсулировано внутри липидной наночастицы со стабильной и высокой эффективностью и, таким образом, композиция для доставки может проявлять превосходный терапевтический эффект. Кроме того, существует преимущество, заключающееся в различном контроле типов лекарств, инкапсулируемых в липидные наночастицы, в зависимости от цели лечения.

Липидная наночастица может иметь анионное лекарственное средство и/или нуклеиновую кислоту, инкапсулированные внутри (липидной наночастицы). В отношении липидной наночастицы, в которой инкапсулированы анионное лекарственное средство и/или нуклеиновая кислота (внутри липидной наночастицы), она является такой же, как липидная наночастица, описанная выше.

В одном примере массовое соотношение ионизируемого липида и лекарственного средства (анионного лекарственного средства, нуклеиновой кислоты или их комбинации), содержащихся в липидной наночастице, может составлять от 1 до 20 : 1, от 1 до 15 : 1, от 1 до 10 : 1, от 5 до 20 : 1, от 5 до 15 : 1, от 5 до 10 : 1, от 7,5 до 20 : 1, от 7,5 до 15 : 1 или от 7,5 до 10 : 1.

В одном примере, когда (1) ионизируемый липид; и (2) лекарственное средство (анионное лекарственное средство, нуклеиновая кислота или их комбинация) содержатся в массовом соотношении в указанном выше диапазоне, эффективность инкапсуляции лекарственного средства (анионного лекарственного средства, нуклеиновой кислоты или их комбинации) внутри липидной наночастицы и/или эффективность доставки лекарственного средства может быть выше, чем у липидных наночастиц, содержащих (1) ионизируемый липид; и (2) анионное лекарственное средство, нуклеиновую кислоту или их комбинацию в массовом соотношении за пределами вышеуказанного диапазона.

Липидная наночастица, в которую инкапсулированы анионное лекарственное средство и/или нуклеиновая кислота, может иметь средний диаметр от 20 нм до 200 нм, от 20 до 180 нм, от 20 нм до 170 нм, от 20 нм до 150 нм, от 20 нм до 120 нм, от 20 нм до 100 нм, от 20 нм до 90 нм, от 30 нм до 200 нм, от 30 до 180 нм, от 30 нм до 170 нм, от 30 нм до 150 нм, от 30 нм до 120 нм, от 30 нм до 100 нм, от 30 нм до 90 нм, от 40 нм до 200 нм, от 40 до 180 нм, от 40 нм до 170 нм, от 40 нм до 150 нм, от 40 нм до 120 нм, от 40 нм до 100 нм, от 40 нм до 90 нм, от 50 нм до 200 нм, от 50 до 180 нм, от 50 нм до 170 нм, от 50 нм до 150 нм, от 50 нм до 120 нм, от 50 нм до 100 нм, от 50 нм до 90 нм, от 60 нм до 200 нм, 60 до 180 нм, от 60 нм до 170 нм, от 60 нм до 150 нм, от 60 нм до 120 нм, от 60 нм до 100 нм, от 60 нм до 90 нм, от 70 нм до 200 нм, 70 до 180 нм, от 70 нм до 170 нм, от 70 нм до 150 нм, от 70 нм до 120 нм, от 70 нм до 100 нм, от 70 нм до 90 нм, от 80 нм до 200 нм, от 80 до 180 нм, от 80 нм до 170 нм, от 80 нм до 150 нм, от 80 нм до 120 нм, от 80 нм до 100 нм, от 80 нм до 90 нм, от 90 нм до 200 нм, от 90 до 180 нм, от 90 нм до 170 нм, от 90 нм до 150 нм, от 90 нм до 120 нм, или от 90 нм до 100 нм, так что введение в ткань печени гепатоцитов и/или LSEC (синусоидальные эндотелиальные клетки печени) является легким.

Когда размер липидной наночастицы меньше нижнего предела вышеуказанного диапазона, (1) во время системной циркуляции липидной наночастицы, связывание аполипопротеинов (например, АроЕ (например, АроЕ3)), присутствующих в крови, снижается, и, следовательно, количество липидных наночастиц, попадающих в клетки, может быть уменьшено и/или (2) площадь поверхности липидной наночастицы чрезмерно увеличена, и поэтому трудно поддерживать стабильность и, следовательно, эффективность доставки лекарственного средства в ткань-мишень (или клетку-мишень) и/или терапевтический эффект лекарственного средства, которое несет липидная наночастица, может быть снижен.

Липидная наночастица, имеющая диаметр в вышеуказанном диапазоне, обладает превосходной эффективностью доставки лекарственного средства в орган-мишень и/или клетку по сравнению с липидной наночастицей, имеющей диаметр, превышающий верхний предел вышеуказанного диапазона.

В одном примере композиция для доставки лекарственного средства, включающая (1) липидную наночастицу и (2) анионное лекарственное средство, нуклеиновую кислоту или их комбинацию, может представлять собой композицию для доставки лекарственного средства в гепатоциты.

Согласно одному примеру диаметр липидной наночастицы, содержащейся в композиции для доставки лекарственного средства (анионного лекарственного средства, нуклеиновой кислоты или их комбинации) в гепатоциты, может составлять от 40 до 120 нм, от 30 до 100 нм, от 35 до 95 нм, от 40 до 90 нм, от 45 до 90 нм, от 50 до 90 нм, от 55 до 85 нм, от 60 до 80 нм, от 70 до 90 нм, от 70 до 80 нм, от 50 до 70 нм или 60 до 70 нм. При доставке лекарственного средства к гепатоцитам диаметр пор, ведущих от просвета синусоидов к гепатоцитам, составляет примерно 140 нм у млекопитающих и примерно 100 нм у человека, поэтому композиция для доставки лекарственного средства, имеющая диаметр в указанном диапазоне, может обладать превосходной эффективностью доставки лекарственного средства в гепатоциты по сравнению с липидной наночастицей, имеющей диаметр за пределами вышеуказанного диапазона.

Согласно одному примеру, липидная наночастица, входящая в состав композиции для доставки лекарственного средства в гепатоциты, может содержать конъюгат липид-PEG в количестве от 0,1 до 15 мол. %, от 0,25 до 15 мол. %, от 0,5 до 15 мол. %, от 1 до 15 мол. %, от 1,5 до 15 мол. %, от 2 до 15 мол. %, от 2,5 до 15 мол. %, от 0,1 до 12,5 мол. %, от 0,25 до 12,5 мол. %, от 0,5 до 12,5 мол. %, от 1 до 12,5 мол. %, от 1,5 до 12,5 мол. %, от 2 до 12,5 мол. %, от 2,5 до 12,5 мол. %, от 0,1 до 10 мол. %, от 0,25 до 10 мол. %, от 0,5 до 10 мол. %, от 1 до 10 мол. %, от 1,5 до 10 мол. %, от 2 до 10 мол. %, от 2,5 до 10 мол. %, от 0,1 до 7,5 мол. %, от 0,25 до 7,5 мол. %, от 0,5 до 7,5 мол. %, от 1 до 7,5 мол. %, от 1,5 до 7,5 мол. %, от 2 до 7,5 мол. %, от 2,5 до 7,5 мол. %, от 0,1 до 5 мол. %, от 0,25 до 5 мол. %, от 0,5 до 5 мол. %, от 1 до 5 мол. %, от 1,5 до 5 мол. %, от 2 до 5 мол. %, от 2,5 до 5 мол. %, от 0,1 до 3 мол. %, от 0,25 до 3 мол. %, от 0,5 до 3 мол. %, от 1 до 3 мол. %, от 1,5 до 3 мол. %, от 2 до 3 мол. %, от 2,5 до 3 мол. %, от 0,1 до 2,5 мол. %, от 0,25 до 2,5 мол. %, от 0,5 до 2,5 мол. %, от 1 до 2,5 мол. %, от 1,5 до 2,5 мол. %, от 2 до 2,5 мол. %, от 0,1 до 4,5 мол. %, от 0,25 до 4,5 мол. %, от 0,5 до 4,5 мол. %, от 1 до 4,5 мол. %, от 1,5 до 4,5 мол. %, от 2 до 4,5 мол. %, от 2,5 до 4,5 мол. %, от 0,1 до 4 мол. %, от 0,25 до 4 мол. %, от 0,5 до 4 мол. %, от 1 до 4 мол. %, от 1,5 до 4 мол. %, от 2 до 4 мол. %, от 2,5 до 4 мол. %, от 0,1 до 3,5 мол. %, от 0,25 до 3,5 мол. %, от 0,5 до 3,5 мол. %, от 1 до 3,5 мол. %, от 1,5 до 3,5 мол. %, от 2 до 3,5 мол. %, от 2,5 до 3,5 мол. %, от 0,1 до 2,0 мол. %, от 0,1 до 1,5 мол. %, от 0,1 до 1,0 мол. %, от 0,5 до 2,0 мол. %, от 0,5 до 1,5 мол. %, от 0,5 до 1,0 мол. %, от 1,0 до 2,0 мол. %, от 1,0 до 1,5 мол. %, от 1,5 до 2,0 мол. %, 1,0 мол. % или 1,5 мол. %, и липидная наночастица, содержащая конъюгат липид-PEG в указанном выше диапазоне, может обладать превосходной эффективностью доставки лекарственного средства конкретно в гепатоциты (или нацеливанием на гепатоциты).

Согласно одному примеру, липидная наночастица, входящая в состав композиции для доставки лекарственного средства в гепатоциты, может содержать ионизируемый липид : фосфолипид : холестерин : конъюгат липид-PEG в диапазоне, описанном выше, или в молярном соотношении от 20 до 50 : от 10 до 30 : от 30 до 60 : от 0,5 до 5, в молярном соотношении от 25 до 45 : от 10 до 25 : от 40 до 50 : от 0,5 до 3, в молярном соотношении от 25 до 45 : от 10 до 20 : от 40 до 55 : от 0,5 до 3 или в молярном соотношении от 25 до 45 : от 10 до 20 : от 40 до 55 : от 1,0 до 1,5. Липидная наночастица, содержащая компоненты в молярном соотношении в указанном выше диапазоне, может обладать превосходной эффективностью доставки лекарственного средства конкретно в гепатоциты (или нацеливанием на гепатоциты).

В одном примере композиция для доставки лекарственного средства, содержащая (1) липидную наночастицу и (2) анионное лекарственное средство, нуклеиновую кислоту или их комбинацию, могут представлять собой композицию для доставки лекарственного средства в LSEC.

Когда диаметр липидной наночастицы, содержащейся в композиции для доставки лекарственного средства в LSEC, подобен или немного меньше диаметра пор, эффект доставки лекарственного средства в LSEC может быть превосходным. В одном примере диаметр липидной наночастицы, входящей в состав композиции для доставки лекарственного средства в LSEC, может составлять от 20 до 200 нм, от 20 до 180 нм, от 40 до 180 нм, от 40 до 170 нм, от 50 до 160 нм, от 70 до 180 нм, от 70 до 170 нм, от 75 до 170 нм, от 75 до 165 нм, от 70 до 150 нм, от 70 до 130 нм, от 75 до 130 нм, от 80 до 120 нм, от 85 до 120 нм, примерно от 90 до 120 нм, от 90 до 110 нм, от 80 до 110 нм, от 80 до 100 нм, от 85 до 95 нм, примерно 90 нм или 90 нм.

Согласно одному примеру, липидная наночастица, входящая в состав композиции для доставки лекарственного средства в LSEC, может содержать конъюгат липид-PEG в количестве от 0,1 до 15 мол. %, от 0,25 до 15 мол. %, от 0,5 до 15 мол. %, от 1 до 15 мол. %, от 1,5 до 15 мол. %, от 2 до 15 мол. %, от 2,5 до 15 мол. %, от 0,1 до 12,5 мол. %, от 0,25 до 12,5 мол. %, от 0,5 до 12,5 мол. %, от 1 до 12,5 мол. %, от 1,5 до 12,5 мол. %, от 2 до 12,5 мол. %, от 2,5 до 12,5 мол. %, от 0,1 до 10 мол. %, от 0,25 до 10 мол. %, от 0,5 до 10 мол. %, от 1 до 10 мол. %, от 1,5 до 10 мол. %, от 2 до 10 мол. %, от 2,5 до 10 мол. %, от 0,1 до 7,5 мол. %, от 0,25 до 7,5 мол. %, от 0,5 до 7,5 мол. %, от 1 до 7,5 мол. %, от 1,5 до 7,5 мол. %, от 2 до 7,5 мол. %, от 2,5 до 7,5 мол. %, от 0,1 до 5 мол. %, от 0,25 до 5 мол. %, от 0,5 до 5 мол. %, от 1 до 5 мол. %, от 1,5 до 5 мол. %, от 2 до 5 мол. %, от 2,5 до 5 мол. %, от 0,1 до 3 мол. %, от 0,25 до 3 мол. %, от 0,5 до 3 мол. %, от 1 до 3 мол. %, от 1,5 до 3 мол. %, от 2 до 3 мол. %, от 2,5 до 3 мол. %, от 0,1 до 2,5 мол. %, от 0,25 до 2,5 мол. %, от 0,5 до 2,5 мол. %, от 1 до 2,5 мол. %, от 1,5 до 2,5 мол. %, от 2 до 2,5 мол. %, от 0,1 до 4,5 мол. %, от 0,25 до 4,5 мол. %, от 0,5 до 4,5 мол. %, от 1 до 4,5 мол. %, от 1,5 до 4,5 мол. %, от 2 до 4,5 мол. %, от 2,5 до 4,5 мол. %, от 0,1 до 4 мол. %, от 0,25 до 4 мол. %, от 0,5 до 4 мол. %, от 1 до 4 мол. %, от 1,5 до 4 мол. %, от 2 до 4 мол. %, от 2,5 до 4 мол. %, от 0,1 до 3,5 мол. %, от 0,25 до 3,5 мол. %, от 0,5 до 3,5 мол. %, от 1 до 3,5 мол. %, от 1,5 до 3,5 мол. %, от 2 до 3,5 мол. %, от 2,5 до 3,5 мол. %, от 0,1 до 2,0 мол. %, от 0,1 до 1,5 мол. %, от 0,1 до 1,0 мол. %, от 0,5 до 2,0 мол. %, от 0,5 до 1,5 мол. %, от 0,5 до 1,0 мол. %, от 1,0 до 2,0 мол. %, от 1,0 до 1,5 мол. %, от 1,5 до 2,0 мол. %, 1,0 мол. % или 1,5 мол. %, и липидная наночастица, содержащая конъюгат липид-PEG в указанном выше диапазоне, может обладать превосходной эффективностью доставки лекарственного средства конкретно в LSEC (или нацеливанием на LSEC).

Согласно одному примеру, липидная наночастица, входящая в состав композиции для доставки лекарственного средства в LSEC, может содержать ионизируемый липид : фосфолипид : холестерин : конъюгат липид-PEG в диапазоне, описанном выше, или в молярном соотношении от 20 до 50 : от 10 до 30 : от 30 до 60 : от 0,5 до 5, в молярном соотношении от 25 до 45 : от 10 до 25 : от 40 до 50 : от 0,5 до 3, в молярном соотношении от 25 до 45 : от 10 до 20 : от 40 до 55 : от 0,5 до 3 или в молярном соотношении от 25 до 45 : от 10 до 20 : от 40 до 55 : от 1,0 до 1,5. Липидная наночастица, содержащая компоненты в молярном соотношении в указанном выше диапазоне, может обладать превосходной эффективностью доставки лекарственного средства конкретно в LSEC (или нацеливанием на LSEC).

Липидная наночастица в соответствии с одним примером может высокоэффективно доставлять терапевтический агент в ткань печени, гепатоциты и/или LSEC за счет свойств, специфичных для ткани печени, и может быть эффективно использована для лекарственного средства для лечения заболеваний печени, в способе доставки гена для лечения и т.п., и терапевтического агента, опосредуемого печенью, которые опосредуют эту высокоэффективную ткань печени, гепатоциты и/или LSEC-специфические липидные наночастицы. Кроме того, липидная наночастица в соответствии с одним из примеров образует стабильный комплекс с генным лекарственным средством, таким как нуклеиновая кислота и т.п., и проявляет низкую цитотоксичность и эффективное поглощение клетками, и, таким образом, она эффективно доставляет генное лекарственное средство, такое как нуклеиновая кислота.

Липидная наночастица является такой, как описано выше.

Липидная наночастица в соответствии с одним из примеров проявляет положительный заряд в условиях кислого значения рН, показывая рКа от 5 до 8, от 5,5 до 7,5, от 6 до 7 или от 6,5 до 7, и может инкапсулировать лекарственное средство с высокой эффективностью посредством легкого образования комплекса с лекарственным средством за счет электростатического взаимодействия с терапевтическим агентом, таким как нуклеиновая кислота и анионное лекарственное средство (например белок), обладающим отрицательным зарядом, и может быть эффективно использована в качестве композиции для внутриклеточной или in vivo доставки лекарственного средства (например нуклеиновой кислоты).

Здесь «инкапсулирование» относится к инкапсулированию вещества для доставки для его эффективного окружения и внедрения in vivo, а эффективность инкапсуляции лекарственного средства (эффективность инкапсуляции) означает содержание лекарственного средства, инкапсулированного в липидной наночастице, по отношению к общему содержанию лекарственного средства, используемого для приготовления.

Эффективность инкапсулирования анионного или нуклеиновокислотного лекарственного средства композиции для доставки может составлять 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 94% или более, от более 80% до 99% или менее, от более 80% до 97% или менее, от более 80% до 95% или менее, от 85% или более до 95% или менее, от 87% или более до 95% или менее, от 90% или более до 95% или менее, от 91% или более до 95% или менее, от 91% или более до 94% или менее, от более 91% до 95% или менее, от 92% или более до 99% или менее, от 92% или более до 97% или менее, или от 92% или более до 95% или менее.

Согласно одному примеру, эффективность инкапсуляции можно рассчитать с помощью обычно используемых методов, и, например, эффективность инкапсуляции лекарственного средства можно рассчитать по следующему Уравнению 2, с обработкой липидной наночастицы тритоном-Х в соответствии с одним примером и измерением интенсивности флуоресценции обработанных тритоном-Х и не обработанных тритоном-X липидных наночастиц в определенной полосе длин волн (например, возбуждение: примерно 480-490 нм, испускание: примерно 520-530 нм).

(Уравнение 2)

Эффективность инкапсуляции лекарственного средства (%) = (Интенсивность флуоресценции (флуоресценция) обработанной тритоном-Х липидной наночастицы - Интенсивность флуоресценции (флуоресценция) не обработанной тритоном-Х липидной наночастицы) / (Интенсивность флуоресценции (флуоресценция) обработанной тритоном-Х липидной наночастицы) × 100

Композиция для доставки лекарственного средства согласно одному примеру может содержать мРНК Cas9 с высокой эффективностью инкапсуляции. Ранее известная композиция для доставки мРНК Cas9 имеет ограничения при использовании в качестве композиции для доставки мРНК Cas9, поскольку она содержит мРНК Cas9 в низком соотношении. С другой стороны, липидная наночастица в соответствии с одним из примеров может содержать мРНК Cas9 с высокой эффективностью инкапсуляции, в частности, эффективностью инкапсуляции 70% или более, и, таким образом, ее можно эффективно использовать для терапии редактирования генов.

Анионное лекарственное средство может представлять собой конъюгат анионный биополимер-лекарственное средство, такой как различные виды пептидов, белковые лекарственные средства, структуры белок-нуклеиновая кислота или конъюгаты гиалуроновая кислота-пептид, конъюгаты гиалуроновая кислота-белок, которые имеют анион, и т.п. Неограничивающими примерами белковых лекарственных средств могут быть факторы, индуцирующие апоптоз (например, цитохром С, каспаза 3/7/8/9 и т.д.) и включающие белки редактирования генов, такие как Cas 9, cpf1, которые представляют собой «ножницы» для редактирования генов, и различные внутриклеточные белки (например, факторы транскрипции) и т.п.

Нуклеиновая кислота может представлять собой одну или более видов, выбранных из группы, состоящей из малой интерферирующей РНК (миРНК), рибосомной рибонуклеиновой кислоты (рРНК), рибонуклеиновой кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК), аптамера, матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК), транспортной рибонуклеиновой кислоты (тРНК), антисмыслового олигонуклеотида, короткой шпилечной РНК (кшРНК), микроРНК, рибозима, пептид-нуклеиновой кислоты (ПНК), ДНКзима и единой направляющей РНК (sgRNA) для редактирования генов и т.п., но не ограничиваясь этим.

Здесь термин «миРНК» относится к двухцепочечной РНК (дуплексной РНК), которая может индуцировать РНКи (РНК-интерференцию) посредством расщепления специфической мРНК, или к одноцепочечной РНК, которая имеет двухцепочечную форму внутри одноцепочечной РНК. Она состоит из смысловой цепи РНК, имеющей последовательность, гомологичную мРНК гена-мишени, и антисмысловой цепи РНК, имеющей комплементарную ей последовательность. Поскольку миРНК может ингибировать экспрессию гена-мишени, ее обеспечивают с помощью эффективного метода нокдауна гена или метода генной терапии. Связывание между двойными цепями осуществляется за счет водородных связей между нуклеотидами, и не все нуклеотиды внутри двойной цепи должны быть комплементарными и полностью связанными.

Длина миРНК может составлять примерно от 15 до 60, в частности примерно от 15 до 50, примерно от 15 до 40, примерно от 15 до 30, примерно от 15 до 25, примерно от 16 до 25, примерно от 19 до 25, примерно от 20 до 25 или примерно от 20 до 23 нуклеотидов. Длина миРНК означает количество нуклеотидов на одной стороне двухцепочечной РНК, то есть количество пар оснований, а в случае одноцепочечной РНК означает длину двойной цепи внутри одноцепочечной РНК. Кроме того, миРНК может состоять из нуклеотидов, введенных с различными функциональными группами с целью повышения стабильности крови или ослабления иммунного ответа и т.п.

Здесь термин «антисмысловой олигонуклеотид» может быть модифицирован в положении одного или более оснований, Сахаров или каркасов для повышения эффективности (De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). Олигонуклеотидный каркас может быть модифицирован фосфоротиоатом, фосфотриэфиром, метилфосфонатом, короткоцепочечным алкилом, циклоалкилом, короткоцепочечным гетероатомным гетероциклическим межсахаридным связыванием и т.п. Кроме того, антисмысловой олигонуклеотид может содержать одну или более защищенных сахарных группировок. Антисмысловой олигонуклеотид может содержать модифицированное основание. Модифицированное основание включает гипоксантин, 6-метиладенин, 5-ме-пиримидин (в частности, 5-метилцитозин), 5-гидроксиметилцитозин (НМС), гликозил-НМС, гентиобиозил-НМС, 2-аминоаденин, 2-тиоурацил, 2-тиотимин, 5-бромурацил, 5-гидроксиметилурацил, 8-азагуанин, 7-деазагуанин, N6(6-аминогексил)аденин, 2,6-диаминопурин и т.п.

Здесь «одноцепочечная дезоксирибонуклеиновая кислота (оцДНК)» означает одноцепочечный олигонуклеотид, который избирательно связывается со специфической ДНК-мишенью и индуцирует антигенный эффект.

Здесь «аптамер» означает олигонуклеотид (как правило, примерно 20-80 нуклеотидов ДНК или РНК), который связывается со специфической мишенью. Предпочтительно здесь «аптамер» означает олигонуклеотидный аптамер (например ДНК- или РНК-аптамер).

Здесь «мРНК» означает синтетическую мРНК (мРНК, транскрибируемую in vitro), способную экспрессировать ген.

Здесь «кшРНК» означает одноцепочечную РНК длиной от 50 до 70 нуклеотидов и образует структуру «стебель-петля» (стебель/петля) in vivo. По обеим сторонам петли от 5 до 10 нуклеотидов комплементарно длинная РНК длиной от 19 до 29 нуклеотидов спаривается с образованием двухцепочечного стебля.

Здесь «микроРНК (miRNA)» означает одноцепочечную молекулу РНК, которая контролирует экспрессию гена и состоит из 21-23 нуклеотидов полной длины. миРНК представляет собой олигонуклеотид, который не экспрессируется в клетке и имеет короткую структуру «стебель-петля». миРНК имеет полную или частичную гомологию с одной, двумя или более мРНК (матричная РНК) и подавляет экспрессию гена-мишени за счет комплементарного связывания с мРНК.

Здесь «рибозим» является разновидностью РНК и представляет собой РНК, которая распознает нуклеотидную последовательность конкретной РНК и выполняет ту же функцию, что и фермент, разрезающий ее сам по себе. Рибозим представляет собой комплементарную нуклеотидную последовательность цепи матричной РНК-мишени и состоит из области, которая специфично связывается, и области, разрезающей РНК-мишень.

Здесь «ДНКзим» представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК, обладающую ферментативной активностью, а ДНКзим, состоящий из 10-23 нуклеотидов (ДНКзим 10-23), разрезает цепь РНК в определенном положении в физиологически сходных условиях. ДНКзим 10-23 разрезает любые доступные взаимодействию пурины и пиримидины без спаривания оснований. ДНКзим 10-23 состоит из активного сайта (каталитического домена) фермента, состоящего из 15 консервативных нуклеотидных последовательностей (например, 5'-GGCTAGCTACAACGA-3'), и домена связывания РНК-субстрата, состоящего из примерно 7-8 нуклеотидных последовательностей ДНК, которые распознают РНК-субстраты слева и справа от активного домена описанного выше фермента.

Здесь «ПНК (пептид-нуклеиновая кислота)» представляет собой молекулу, обладающую всеми свойствами нуклеиновых кислот и белков, и означает молекулу, способную комплементарно связываться с ДНК или РНК. О ПНК впервые сообщили в 1999 г. как об аналогичной ДНК, в которой азотистые основания связаны пептидными связями (документ [Nielsen РЕ, Egholm M, Berg RH, Buchardt О, "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide", Science 1991, Vol. 254: pp 1497-1500]). ПНК не встречается в природе и искусственно синтезируется химическим методом. ПНК вызывает реакцию гибридизации с природной нуклеиновой кислотой комплементарной нуклеотидной последовательности с образованием двойной цепи. Двойные цепи ПНК/ДНК более стабильны, чем двойные цепи ДНК/ДНК той же длины. В качестве каркаса пептидов чаще всего используют N-(2-аминоэтил)глицин, многократно связанный амидными связями, и в этом случае каркас пептид-нуклеиновой кислоты электрически нейтрален, в отличие от каркаса природной нуклеиновой кислоты. 4 нуклеотида, присутствующие в ПНК, имеют почти такой же пространственный размер и расстояние между нуклеотидами, как и в случае природной нуклеиновой кислоты. ПНК не только химически более стабильна, чем природная нуклеиновая кислота, но и биологически стабильна, поскольку она не расщепляется нуклеазой или протеазой.

Здесь «sgRNA» представляет собой олигонуклеотид (как правило, молекулу РНК), связывающийся со специфической ДНК-мишенью, и означает сложную единую молекулу РНК, состоящую из РНК с регулярно чередующимися короткими палиндромными повторами (крРНК (crispr RNA)) и транс-кодируемой крРНК (tracrRNA). Это молекула РНК, которая используется для распознавания специфической последовательности ДНК с помощью нуклеазы Cas9 в системе CRISPR и обеспечивает селективное расщепление гена, и содержит примерно 20-нуклеотидную (нт) последовательность, способную комплементарно связываться с ДНК, и имеет общую длину 100 нт.

Здесь «белок для редактирования генов» относится к Cas9, spCas9, cjCas9, casX, CasY и Cpf1 и т.п. и относится к белку, который распознает нуклеотидную последовательность ДНК-мишени с помощью sgRNA, чтобы вызвать расщепление ДНК.

Клетка-мишень, в которую лекарственное средство и/или нуклеиновая кислота доставляются липидной наночастицей согласно одному примеру, может представлять собой гепатоцит и/или LSEC in vivo или выделенные in vivo. Композиция для доставки лекарственного средства и/или комплекс лекарственного средства (анионного лекарственного средства, нуклеиновой кислоты или их комбинации) и липидной наночастицы согласно одному примеру могут нацеливаться или специфически нацеливаться на гепатоцит и/или LSEC. Соответственно, липидная наночастица или композиция для доставки лекарственного средства или нуклеиновой кислоты, содержащая липидную наночастицу в соответствии с одним примером, может быть предназначена для лечения острых или хронических заболеваний печени, таких как фиброз печени, цирроз печени, гепатит (например, гепатит А, гепатит В, гепатит С и др.), и, кроме того, она может быть использована в качестве композиции для доставки терапевтического агента (лекарственного средства), всасываемого через печень.

В другом аспекте предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения заболевания печени, содержащая (1) липидную наночастицу и (2) анионное лекарственное средство, нуклеиновую кислоту или их комбинацию.

Липидная наночастица, входящая в состав фармацевтической композиции для предупреждения или лечения заболевания печени, является такой же, как липидная наночастица, входящая в состав вышеупомянутой композиции для доставки лекарственного средства.

Анионное лекарственное средство и нуклеиновая кислота, входящие в состав фармацевтической композиции для предупреждения или лечения заболевания печени, являются такими же, как анионное лекарственное средство и нуклеиновая кислота, входящие в состав вышеупомянутой композиции для доставки лекарственного средства.

Фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения заболевания печени в соответствии с одним из примеров может содержать липидную наночастицу, в которую инкапсулированы анионное лекарственное средство и/или нуклеиновая кислота.

Заболевание печени может представлять собой одно или более видов, выбранных из группы, состоящей из ATTR-амилоидоза, гиперхолестеринемии, вирусной инфекции гепатита В, острой печеночной недостаточности, цирроза и фиброза печени.

Анионное лекарственное средство может иметь эффект предупреждения или лечения заболевания печени.

Нуклеиновая кислота может иметь эффект предупреждения или лечения заболевания печени и, например, она может представлять собой миРНК и/или микроРНК, которые могут ингибировать экспрессию, такие как (1) TTR (транстиретин) ((например, человеческий TTR (белок: номера доступа в GenBank NP_000362.1; ген: номера доступа в GenBank НМ_000371.4 и т.д.), мышиный TTR (белок: номер доступа в GenBank; NP_038725.1; ген: номер доступа в GenBank НМ_013697.5 и т.д.)), (2) PCSK9 (пропротеинконвертаза субтилизин/кексин типа 9) ((например, человеческий PCSK9 (белок: номер доступа в GenBank NP_777596.2; ген: номер доступа в GenBank НМ_174936.4 и т.д.), мышиный PCSK9 (белок: номер доступа в GenBank NP_705793.1; ген: номер доступа в GenBank НМ_153565.2 и т.д.), (3) HBV (вирус гепатита В) (например, HBV генотип А (например, номер доступа в GenBank: Х02763, Х51970 или AF090842); HBV генотип В (например, номер доступа в GenBank: D00329, AF100309, или АВ033554); HBV генотип С (например, номер доступа в GenBank: Х04615, М12906, AB014381, АВ042285, АВ042284, АВ042283, АВ042282, АВ026815, АВ026814, АВ026813, АВ026812 или АВ026811); HBV генотип D (например, номер доступа в GenBank: Х65259, М32138 или Х85254); HBV генотип E (например, номер доступа в GenBank: Х75657 или АВ032431); HBV генотип F (например, номер доступа в GenBank: Х69798, АВ036910 или AF223965); HBV генотип G (например, номер доступа в GenBank: AF160501, АВ064310 или AF405706), HBV генотип H (например, AY090454, AY090457 или AY090460) (4) Вах (BCL2 ассоциированный X)) ((например, человеческий Вах (белок: номера доступа в GenBank NP_001278357.1, NP_001278358.1, NP_001278359.1, NP_001278360,1, NP_004315.1; ген: номера доступа в GenBank НМ_001291428.2, НМ_001291429.2, НМ_001291430,1, НМ_001291431.2, НМ_004324.4, и т.д.), мышиный Вах (белок: номер доступа в GenBank NP_031553.1; ген: номер доступа в GenBank НМ_007527.3, и т.д.), (5) VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) (например, VEGFA ((например, человеческий VEGFA (белок: номера доступа в GenBank NP_001020537.2, NP_001020538.2, NP_001020539.2, NP_001020540.2, NP_001020541.2; ген: номера доступа в GenBank НМ_003376.6, НМ_001025366.3, НМ_001025367.3, НМ_001025368.3, НМ_001025369.3, и т.д.), мышиный VEGFA (белок: номер доступа в GenBank NP_001020421.2, NP_001020428.2, NP_001103736.1, NP_001103737.1, NP_001103738.1; ген: номер доступа в GenBank НМ_001025250.3, НМ_001025257.3, НМ_001110266.1, НМ_001110267.1, НМ_001110268.1 и т.д.); VEGFB ((например, человеческий VEGFB (белок: номера доступа в GenBank NP_001230662.1, NP_003368.1; ген: номера доступа в GenBank НМ_003377,5, НМ_001243733.2 и т.д.), мышиный VEGFB (белок: номер доступа в GenBank NP_001172093.1, NP_035827.1; ген: номер доступа в GenBank НМ_001185164.1, НМ_011697.3 и т.д.); VEGFC (например, человеческий VEGFC (белок: номера доступа в GenBank NP_005420,1; ген: номера доступа в GenBank НМ_005429.5 и т.д.), мышиный VEGFC (белок: номер доступа в GenBank; NP_033532.1; ген: номер доступа в GenBank НМ_009506.2 и т.д.)), и/или (6) PDGF (фактор роста тромбоцитов) (например, PDGFA ((например, человеческий PDGFA (белок: номера доступа в GenBank NP_002598.4, NP_148983.1,; ген: номера доступа в GenBank НМ_002607,5, НМ_033023.4 и т.д.), мышиный PDGFA (белок: номер доступа в GenBank NP_032834.1, NP_001350200,1; ген: номер доступа в GenBank НМ_008808.4, НМ_001363271.1 и т.д.)); PDGFB ((например, человеческий PDGFB (белок: номера доступа в GenBank NP_002599.1, NP_148937.1; ген: номера доступа в GenBank НМ_033016.3, НМ_002608.4 и т.д.), мышиный PDGFB (белок: номер доступа в GenBank NP_035187.2; ген: номер доступа в GenBank НМ_011057.4 и т.д.)); PDGFC ((например, человеческий PDGFC (белок: номера доступа в GenBank NP_057289.1; ген: номера доступа в GenBank НМ_016205.3 и т.д.), мышиный PDGFC (белок: номер доступа в GenBank NP_064355.1, NP_001344675.1; ген: номер доступа в GenBank НМ_019971.3, НМ_001357746.1 и т.д.)); PDGFD (например, человеческий PDGFD (белок: номера доступа в GenBank NP_079484.1, NP_149126.1; ген: номера доступа в GenBank НМ_033135.4, НМ_025208.5 и т.д.), мышиный PDGFD (белок: номер доступа в GenBank NP_082200,1, NP_001344326.1, NP_001344327.1; ген: номер доступа в GenBank НМ_027924.3, НМ_001357397.1, НМ_001357398.1 и т.д.)).

Фармацевтическую композицию можно вводить различными путями, включая парентеральное введение млекопитающим, в том числе людям, и парентеральное введение можно применять внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или местно, а дозировка варьируется в зависимости от состояния и массы тела пациента, степени заболевания, формы лекарственного средства, способа введения и времени, но могут быть соответствующим образом выбраны специалистами в данной области техники.

При изготовлении фармацевтической композиции в соответствии с одним примером, ее готовят с использованием разбавителя или эксципиента, такого как наполнитель, заполнитель, связующее вещество, смачивающее вещество, разрыхлитель, поверхностно-активное вещество и т.п., которые обычно используют.

Композиция для парентерального введения включает стерилизованный водный раствор, неводный растворитель, суспендированный растворитель, эмульсию, лиофилизированную композицию, суппозиторий и т.п.

В качестве неводного растворителя и суспендированного растворителя можно использовать пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, сложный эфир для инъекций, такой как этилолеат, и т.п. В качестве основы суппозитория используют витепсол, макрогол, твин 61, масло какао, лауриновое масло, глицерин, желатин и тому подобное.

Фармацевтическую композицию согласно одному примеру вводят в фармацевтически эффективной дозе. Здесь «фармацевтически эффективная доза» означает количество, достаточное для лечения заболевания с разумным соотношением польза/риск, применимое к медицинскому лечению, и уровень эффективной дозы может быть определен в зависимости от факторов, включая тип заболевания пациента, тяжесть, активность лекарственного средства, чувствительность к лекарственному средству, время введения, путь введения и скорость выведения, период лечения и сопутствующие лекарственные средства, а также другие факторы, хорошо известные в области медицины. Фармацевтическую композицию согласно одному примеру можно вводить в виде индивидуального терапевтического агента или можно вводить в комбинации с другими терапевтическими агентами, а также можно вводить последовательно или одновременно с обычными терапевтическими агентами, и можно вводить однократно или многократно. Важно вводить количество, способное обеспечить максимальный эффект при минимальном количестве без побочных эффектов, принимая во внимание все вышеперечисленные факторы, и это может быть легко определено специалистами в данной области.

В частности, эффективная доза соединения по настоящему изобретению может варьировать в зависимости от возраста, пола и массы тела пациента и может быть введена ежесуточно или через сутки, или введена путем разделения от 1 до 3 раз в сутки. Однако она может быть увеличена или уменьшена в зависимости от пути введения, тяжести ожирения, пола, массы тела, возраста и т.п., и, следовательно, указанная выше доза никоим образом не ограничивает объем настоящего изобретения.

В одном конкретном примере фармацевтическую композицию можно вводить в дозе от 0,1 до 100 мг/кг, от 0,1 до 50 мг/кг, от 1 до 10 мг/кг или от 1 до 5 мг/кг, исходя из концентрации лекарственного средства (анионного лекарственного средства, нуклеиновой кислоты или их комбинации), содержащегося в фармацевтической композиции.

Другой аспект относится к способу предупреждения или лечения заболевания печени, включающему введение композиции (например фармацевтической композиции для предупреждения или лечения заболевания печени), содержащей (1) липидную наночастицу и (2) анионное лекарственное средство, нуклеиновую кислоту или их комбинацию. Липидная наночастица, анионное лекарственное средство, нуклеиновая кислота, фармацевтическая композиция и заболевание печени являются такими как описано выше.

Согласно одному примеру, способ предупреждения или лечения заболевания печени может дополнительно включать подтверждение (отбор) пациента, нуждающегося в предупреждении и/или лечении заболевания печени, перед введением композиции.

Субъект, к которому применяют способ лечения, означает млекопитающее, включая мышей, домашний скот и т.п., включая людей, у которого имеется или может быть заболевание печени, но не ограничиваясь этим. Фармацевтическая композиция, содержащая липидную наночастицу согласно одному примеру, может эффективно доставлять анионное лекарственное средство и/или нуклеиновую кислоту в печень и, таким образом, может эффективно лечить субъекта.

Согласно одному примеру, может быть предоставлен способ предупреждения или лечения заболевания печени, включающий введение пациенту фармацевтически эффективной дозы композиции (например фармацевтической композиции для предупреждения или лечения заболевания печени), содержащей (1) липидную наночастицу и (2) анионное лекарственное средство, нуклеиновую кислоту или их комбинацию. Фармацевтически эффективная доза является такой как описано выше, и подходящая общая суточная доза может быть определена путем лечения в рамках корректного медицинского заключения и может быть введена однократно или разделена на несколько приемов. Однако, конкретная терапевтически эффективная доза для конкретного пациента будет применяться по-разному в зависимости от различных факторов, включая конкретную композицию, возраст пациента, массу тела, общее состояние здоровья, пол и диету, время введения, способ введения и скорость выведения композиции, период лечения и лекарственные средства, используемые вместе или одновременно с конкретной композицией, в дополнение к типу и степени ответа, который должен быть достигнут, и используется ли другой агент, если это необходимо, и аналогичных факторов, хорошо известных в области фармацевтики.

БЛАГОПРИЯТНЫЕ ЭФФЕКТЫ

Согласно одному примеру, липидная наночастица специфична для ткани печени, обладает превосходной биосовместимостью и может доставлять генно-терапевтический агент с высокой эффективностью, и, таким образом, ее можно эффективно использовать в родственных технических областях, таких как генная терапия, опосредованная липидными наночастицами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1а показан пример структуры липидной наночастицы согласно одному примеру, а на Фиг. 16 показано изображение наблюдения наночастицы согласно одному примеру с помощью Cryo-ТЕМ.

На Фиг. 2 показан результат ¹Н ЯМР (комнатная температура, 400 МГц) 246-С10 в CDCl₃.

На Фиг. 3а (от 241-С10 LNP до 243-С10 LNP) и Фиг. 3б (от 244-С10 LNP до 246-С10 LNP) показан результат измерения интенсивности флуоресценции каждой липидной наночастицы в растворе, имеющем диапазон рН от рН 4,1 до рН 9,6.

На Фиг. 4а и Фиг. 4б представлены результаты, показывающие эффективность внутриклеточной доставки генов каждой наночастицы. В частности, на Фиг. 4а показана интенсивность люминесценции, измеренная при трансформации инкапсулированной в LNP мРНК, кодирующей люциферазу (luc мРНК), в клетку HeLa с последующим растворением клетки, а на Фиг. 4б показана интенсивность люминесценции, измеренная при трансформации инкапсулированной в LNP luc мРНК в гепатоцит с последующим растворением клетки. На Фиг. 4б, +АроЕ относится к группе, обработанной АроЕ3, и -АроЕ относится к группе, не обработанной АроЕ3.

На Фиг. 5а показано распределение лекарственного средства при доставке in vivo у мыши, которой вводили от 244-С10 LNP до 246-С10 LNP с инкапсулированной Luc мРНК, и на Фиг. 5б показано распределение лекарственного средства при доставке к каждому органу мыши, удаленного из мыши, которой вводили 246-С10 LNP с инкапсулированной Luc мРНК.

На Фиг. 6 показана эффективность доставки лекарственного средства липидной наночастицы и размер наночастицы в зависимости от содержания липид-PEG, входящего в состав липидной наночастицы, у мыши, которой вводили 246-С10 LNP, содержащую липид-PEG в количестве от 1,0 до 2,5 мол. %.

На Фиг. 7 показан результат подтверждения возможности нацеливания на гепатоциты в зависимости от концентрации siFVII, вводимого инкапсулированным в липидную наночастицу посредством экспрессии FVII.

На Фиг. 8 показан размер липидной наночастицы и значение PDI липидной наночастицы в зависимости от содержания липид-PEG, входящего в состав липидной наночастицы (таблица слева), и показан результат подтверждения эффективности доставки лекарственного средства in vivo в гепатоцит посредством экспрессии FVII (график справа).

На Фиг. 9 показан размер липидной наночастицы и значение PDI липидной наночастицы в зависимости от содержания липид-PEG, входящего в состав липидной наночастицы (таблица слева), и показан результат подтверждения эффективности доставки лекарственного средства in vivo в LSEC посредством экспрессии FVIII (график справа).

На Фиг. 10 показан результат измерения эффективности внутриклеточной доставки миРНК липидной наночастицы, содержащей церамид-PEG или DSPE-PEG.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью следующих примеров, но его объем не ограничивается следующими примерами.

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно на примерах. Эти примеры предназначены только для более подробного описания настоящего изобретения, и специалистам в данной области техники будет очевидно, что объем настоящего изобретения не ограничивается этими примерами в соответствии с сущностью настоящего изобретения.

Пример 1. Получение ионизируемых липидов

Пример 1-1. Получение ионизируемых липидов

Ионизируемые липиды синтезировали путем взаимодействия соединений на основе аминов Таблицы 1 ниже, включающих 6-членный гетероциклический третичный амин, и 1,2-эпоксидодекана (далее С10) (Sigma-Aldrich, USA) в молярном соотношении 1:n (n = первичный амин × 2 + вторичный амин × 1).

В частности, каждый из аминов от 241 до 246 из Таблицы 1 и эпоксид (С10) добавляли в молярном соотношении 1:n (n = первичный амин × 2 + вторичный амин × 1) в 5 мл флаконе с магнитным стержнем и подвергали взаимодействию в мешалке при 750 об/мин и 90°С в течение 3 суток. Затем после очистки на колонке с тонкоизмельченным кремнеземом WELUX (Intertec, Корея) рассчитывали молекулярную массу каждого ионизируемого липида, полученного в результате этого взаимодействия, и их хранили в концентрации 100 мг/мл с использованием этанола. Ионизируемый липид, полученный с использованием амина 241 и С10, получил название «241-С10», а другие ионизируемые липиды, полученные с использованием других видов аминов, получили название таким же образом, т.е. «название используемого амина (241-246)-С10».

Пример 1-2. Подтверждение полученных ионизируемых липидов

Для подтверждения ионизируемых липидов, полученных в Примере 1-1, проводили 1H ЯМР. В частности, 5 мкг ионизируемого липида (246-С10), синтезированного в Примере 1-1, готовили путем разбавления в CDCl₃ (sigma, США) с концентрацией от 0,5 мл до 100 ммоль. Затем по 0,5 мл помещали в пробирку для ЯМР 400МГц и верхнюю часть герметично закрывали, а затем запечатывали парапленкой для получения спектров ЯМР с использованием Agilent 400MHZ FT-HMR (Agilent, USA), и результат показан на Фиг. 2. Как показано на Фиг. 2, можно видеть, что сигнал, представляющий каждую функциональную группу 246-С10, был насыщенным.

Кроме того, для подтверждения ионизируемых липидов (от 241-С10 до 246-С10), полученных в Примере 1-1, проводили МС-анализ. В частности, ионизируемые липиды разбавляли этанолом до концентрации 0,5 миллионных долей или менее и проводили МС-анализ. Для анализа использовали оборудование 6230 LC/MS от Agilent Technologies (Пало-Альто, США) и Zorbax SB-C18 (100 мм × 2,1 мм, внутренний диаметр, 3,5 мкм) от Agilent Technologies, которые использовали для разделительной пробирки, и проводили градиентную элюцию двумя растворителями: дистиллированной водой (А), содержащей 0,1% муравьиной кислоты, и ацетонитрилом (В). Градиент растворителя подвижной фазы поддерживали в течение 4 минут до увеличения соотношения органического растворителя ацетонитрила (В) сначала с 30% до 80% в течение 2 минут, с последующим снижением соотношения органического растворителя вновь до 30%, и стабилизировали. Скорость потока подвижной фазы составляла 300 мкл/мин, а затем объем ввода анализатора составлял 2 мкл. Результат проведения МС-анализа показан в Таблице 2 ниже. Как показано в Таблице 2, удалось подтвердить, что измеренное отношение m/z и рассчитанное отношение m/z ионизируемых липидов были почти идентичными.

На основании этого результата смогли подтвердить, что ионизируемые липиды были действительно получены в Примере 1-1.

Пример 2. Получение липидных наночастиц

Пример 2-1. Получение липидных наночастиц

Ионизируемые липиды (от 241-С10 до 246-С10), полученные в Примере 1-1, холестерин (холестериновый порошок, BioReagent, подходящий для культивирования клеток, ≥99%, sigma, Корея), фосфолипид (DSPC) (Avanti, США) и конъюгат липид-PEG (конъюгат церамид-PEG; С16 PEG2000 Ceramide, Avanti, США) растворяли в этаноле в молярном соотношении 42,5:13:43:1,5.

Этанол, в котором были растворены ионизируемые липиды, холестерин, фосфолипид и липид-PEG, и ацетатный буфер смешивали с помощью устройства для смешивания микрожидкостей (Benchtop Nanoassemblr; PNI, Канада) при скорости потока 12 мл/мин в объемном соотношении 1:3, тем самым получая липидные наночастицы (LNP).

Пример 2-2. Получение липидных наночастиц с инкапсулированными нуклеиновыми кислотами

Ионизируемые липиды (от 241-С10 до 246-С10), полученные в Примере 1-1, холестерин (холестериновый порошок, BioReagent, подходящий для культивирования клеток, ≥99%, sigma, Корея), фосфолипид (DSPC или DOPE) (18: 0 PC (DSPC), 18:1 (Δ9-Cis) PE (DOPE), Avanti, США, и конъюгат липид-PEG (конъюгат церамид-PEG; С16 PEG2000 Ceramid, Avanti, США) растворяли в этаноле. РНК-терапевтический агент, мРНК (мРНК люциферазы; SEQ ID NO: 1) в количестве 30 мкг разбавляли в 0,75 мл цитрата натрия, или миРНК (siFVII; SEQ ID NO: 2 и 3 смешивали в одинаковом молярном соотношении, или siFVIII; SEQ ID NO: от 4 до 11 смешивали в том же молярном соотношении, или siLuc: SEQ ID NO: 12 и 13 смешивали в том же молярном соотношении) в количестве 30 мкг разбавляли в 0,75 мл ацетата натрия (50 мМ) для приготовления водной фазы.

Используемые последовательности миРНК были следующими: SEQ ID NO: 2 (FVII целевая миРНК_смысловая; 5'-GGAUCAUCUCAAGUCUUACdtdt-3'), SEQ ID NO: 3 (FVII целевая миРНК_антисмысловая; 5'-GUAAGACUUGAGAUGAUCCdtdt-3'), SEQ ID NO: 4 (FVIII целевая миРНК_смысловая_1; 5'CUUAUAUCGUGGAGAAUUAdtdt-3') SEQ ID NO: 5 (FVIII целевая миРНК_антисмысловая_1; 5'-UAAUUCUCCACGAUAUAAGdtdt-3'), SEQ ID NO: 6 (FVIII целевая миРНК_смысловая_2; 5'-UCAAAGGAUUCGAUGGUAUdtdt-3'), SEQ ID NO: 7 (FVIII целевая миРНК_антисмысловая_2; 5'-AUACCAUCGAAUCCUUUGAdtdt-3'), SEQ ID NO: 8 (FVIII целевая миРНК_смысловая_3; 5'-CAAGAGCACUAGUGAUUAUdtdt-3'), SEQ ID NO: 9 (FVIII целевая миРНК_антисмысловая_3; 5'-AUAAUCACUAGUGCUCUUGdtdt-3'), SEQ ID NO: 10 (FVIII целевая миРНК_смысловая_4; 5'-GGGCACCACUCCUGAAAUAdtdt-3'), SEQ ID NO: 11 (FVIII целевая миРНК_антисмысловая_4; 5'-UAUUUCAGGAGUGGUGCCCdtdt-3'), SEQ ID NO: 12 (siLuc смысловая; 5'-AACGCUGGGCGUUAAUCAAdtdt-3'), SEQ ID NO: 13 (siLuc_антисмысловая; 5'-UUGAUUAACGCCCAGCGUUdtdt-3').

Водную фазу (ацетат натрия или цитрат натрия), в которой была растворена органическая фаза (этанол), в которой растворены ионизируемые липиды, холестерин, фосфолипид и конъюгат липид-PEG (далее липид-PEG), и был растворен РНК-терапевтический агент (нуклеиновая кислота), смешивали с помощью устройства для смешивания микрожидкостей (Benchtop Nanoassemblr; PNI, Канада) при скорости потока 12 мл/мин с получением липидных наночастиц (LNP), в которые была инкапсулирована нуклеиновая кислота. (1) Для получения липидной наночастицы, в которой инкапсулирована мРНК, ионизируемый липид : фосфолипид (DOPE) : холестерин : липид-PEG (церамид C16-PEG2000) растворяли в этаноле в молярном соотношении 26,5 : 20: от 52,5 до 51 : от 1,0 до 2,5 (подбирая содержание холестерина и липидов-PEG так, чтобы общая сумма молярного соотношения равнялась 100), а органическую фазу и водную фазу смешивали так, чтобы массовое соотношение мРНК (мРНК люциферазы; SEQ ID NO: 1) : ионизируемый липид составляло 1:10, и таким образом получали липидную наночастицу. (2) Для получения липидной наночастицы, в которой инкапсулирована миРНК, ионизируемый липид : фосфолипид (DSPC) : холестерин : липид-PEG (церамид C16-PEG2000) растворяли в этаноле в молярном соотношении 42,5 : 13 : от 44 до 39,5 : от 0,5 до 5,0 (подбирая содержание холестерина и липида-PEG так, чтобы общая сумма молярного соотношения равнялась 100), а органическую фазу и водную фазу смешивали так, чтобы массовое соотношение миРНК (siFVII; SEQ ID NO: 2 и 3 смешивали в том же молярном соотношении, или siFVIII; SEQ ID NO: 4-11 смешивали в том же молярном соотношении, или siLuc: SEQ ID NO: 12 и 13 смешивали в таком же соотношении): ионизируемый липид составляло 1:7,5, и таким образом была получена липидная наночастица (LNP).

Полученные LNP подвергали диализу против PBS в течение 16 часов с использованием диализной кассеты 3500 MWCO для удаления этанола и корректировки рН тела и рН наночастиц.

Липидные наночастицы, содержащие ионизируемый липид «241-С10», были названы «241-С10 LNP», а липидные наночастицы, полученные с использованием ионизируемого липида, содержащего амин (включая липидные наночастицы, в которые была инкапсулирована нуклеиновая кислота), были названы «содержащие название амина (от 214 до 246)-С10 LNP».

Пример 2-3. Результаты наблюдений липидных наночастиц с инкапсулированными нуклеиновыми кислотами

Липидные наночастицы, в которые были инкапсулированы siLuc (SEQ ID NO: 12 и 13), получали с использованием конъюгата церамид-PEG (церамид C16-PEG2000), как в Примере 2-2. Полученные липидные наночастицы (содержащие 1,5 мол. % конъюгата церамид-PEG) наносили на углеродную пленку Cu-grid 200 меш в количестве 60 мкг в расчете на концентрацию миРНК и погружали в этан, сжиженный с помощью витробота (около -170 градусов или меньше) и подвергали глубокой заморозке до получения, а затем наблюдали с помощью Cryo-TEM (Tecnai F20, FEI), и результат показан на Фиг. 16. Как показано на Фиг. 16, наблюдались сферические частицы твердой формы.

Пример 3. pKa липидных наночастиц

В настоящем примере pKa каждой липидной наночастицы (LNP), полученной в Примере 2-1, рассчитывали с помощью анализа TNS in vitro. Анионный TNS становится липофильным при взаимодействии с положительно заряженным ионизируемым липидом, и по мере приближения значения рН к значению рКа каждой LNP липофильность TNS снижается, и большее количество молекул воды гасит флуоресценцию TNS, и, следовательно, липидные наночастицы, обладающие pKa от 6,0 до 7,0, обладают превосходной эффективностью доставки лекарств in vivo, а липидные наночастицы, демонстрирующие «кривую s-типа» на графике, представляющем флуоресценцию в зависимости от рН, означают, что они легко взаимодействуют с мембраной эндосомы и могут легко покинуть эндосому во время подкисления.

Более конкретно, рН раствора, содержащего 20 мМ фосфата натрия, 25 мМ цитрата, 20 мМ ацетата аммония и 150 мМ NaCl с 0,1 н. NaOH и/или 0,1 н. HCl с интервалом 0,5 от рН 4,1 до рН 9,6 для приготовления растворов различных единиц рН. 100 мкл каждого раствора, имеющего каждый рН (рН с интервалом 0,5 от рН 4,1 до рН 9,6), добавляли в черный 96-луночный планшет, и каждый добавляли к раствору, имеющему рН в диапазоне, чтобы получить конечную концентрацию 6 микромоль с использованием исходного раствора TNS 300 микромоль. Липидные наночастицы от 241-С10 LNP до 246-С10 LNP добавляли в смешанный раствор так, чтобы конечная концентрация составляла 20 микромоль. Интенсивность флуоресценции измеряли путем возбуждения на 325 нм и испускания на 435 нм с помощью оборудования Tecan, а интенсивность флуоресценции для каждой липидной наночастицы отображали на Фиг. 3а и Фиг. 3б, а pKa для каждой липидной наночастицы рассчитывали как значение рН, достигающее половины максимальной флуоресценции, и результат показан в Таблице 3 ниже. Как показано на Фиг. 3б, можно видеть, что липидные наночастицы от 244-С10 LNP до 246-С10 LNP демонстрируют s-образную кривую флуоресцентного титрования посредством нелинейной регрессии.

Как показано в Таблице 3, было подтверждено, что липидные наночастицы в соответствии с одним из примеров показали диапазон рКа от 6,0 до 7,0, в котором in vivo безопасность и высвобождение лекарственного средства являются превосходными.

LNP, в которые была инкапсулирована нуклеиновая кислота, полученные по способу Примера 2-2, также показали ту же картину в зависимости от типа содержащихся ионизируемых липидов (типа амина, содержащегося в ионизируемых липидах).

Пример 4. Подтверждение характеристик липидных наночастиц

Пример 4-1. Измерение размера частиц

В настоящем примере измеряли размер липидных наночастиц (LNP; содержащая 1,5 мол. % липид-PEG), в которые была инкапсулирована мРНК, полученных в Примере 2-2. Ее разбавляли с помощью PBS так, чтобы концентрация РНК (мРНК люциферазы; SEQ ID NO: 1), содержащаяся в каждой липидной наночастице, полученной в Примере 2-2, составляла 1 мкг/мл, и диаметр и индекс полидисперсности (PDI) LNP измеряли с помощью динамического светорассеяния (DLS) в Malvern Zetasizer Nano (Malvern Instruments, UK), и результат описан в Таблице 4 ниже.

Как подтверждено в Таблице 4, липидные наночастицы в соответствии с одним примером показали размер частиц, который легко вводится в гепатоциты и обеспечивает отличное высвобождение лекарственного средства, и можно было обнаружить, что значения PDI были небольшими, а частицы были однородными в порядке 241-С10 LNP > 243-С10 LNP > 242-С10 LNP = 245-С10 LNP > 244-С10 LNP > 246-С10 LNP.

Пример 4-2. Измерение эффективности инкапсуляции

Эффективность инкапсуляции (эффективность инкапсуляции лекарственного средства, %) каждой LNP (содержащей 1,5 мол. % липид-PEG), в которой миРНК (siFVII миРНК) была инкапсулирована в качестве нуклеиновокислотного лекарственного средства, измеряли с помощью анализа Ribogreen (Quant-iT™ RiboGreen® RNA, Invitrogen). LNP, в которые было инкапсулировано нуклеиновокислотное лекарственное средство, полученные в Примере 2-2, разбавляли буферным раствором 1×ТЕ 50 мкл в 96-луночном планшете так, чтобы конечная концентрация миРНК составляла примерно 4-7 мкг/мл для группы, не обработанной Тритоном-Х (Triton-x LNP(-)), добавляли 1×TE буфер 50 мкл, и для группы, обработанной Тритоном-Х (Triton-x LNP(+)), добавляли 50 мкл 2% Тритон-Х буфера. При инкубации при 37°С в течение 10 минут инкапсулированная нуклеиновая кислота высвобождается путем деградации LNP с помощью Тритона-Х. Затем в каждую лунку добавляли реагент Ribogreen 100 мкл. Интенсивность флуоресценции (FL) Triton LNP(-) и Triton LNP(+) измеряли по ширине полосы длин волн (возбуждение: 485 нм, испускание: 528 нм) в Infinite® 200 PRO NanoQuant (Tecan), и эффективность инкапсуляции лекарственного средства (эффективность инкапсуляции, %) рассчитывали по следующему Уравнению 3. Эффективность инкапсуляции лекарственного средства (%) для каждой LNP показана в Таблице 5 ниже в виде среднего значения результатов, измеренных в двух повторностях.

(Уравнение 3)

Эффективность инкапсуляции лекарственного средства (%) = (Интенсивность флуоресценции Triton LNP(+) Интенсивность флуоресценции Triton LNP(-)) / (Интенсивность флуоресценции Triton LNP(+)) × 100

Как показано в Таблице 5, было подтверждено, что липидные наночастицы согласно одному примеру могут инкапсулировать лекарственное средство с высокой эффективностью.

Пример 5. Подтверждение внутриклеточной доставки нуклеиновой кислоты с помощью липидных наночастиц

Пример 5-1. Эффект доставки нуклеиновой кислоты в зависимости от типов ионизируемых липидов, входящих в состав LNP

За сутки до трансфекции LNP согласно одному примеру в клетки HeLa (Korea Cell Line Bank) разделяли на аликвоты по 0,01×10⁶ клеток/лунка в белом планшете (96 лунок) и культивировали в условиях 37°С, примерно 0,5-3% CO₂ в среде DMEM (SH30022, Hyclone, США). После перемешивания LNP (от 241-С10 LNP до 246-С10 LNP, содержащие 1,5 мол. % липид-PEG), в которых мРНК (luc мРНК; SEQ ID NO: 1), кодирующая ген люциферазы с АроЕ3, 0,1 мкг/мл, путем пипетирования и затем инкубирования при комнатной температуре в течение 10 минут, их обрабатывали (1 oong/лунку в расчете на мРНК, содержащуюся в липидных наночастицах) в клетках HeLa. АроЕ3 связывается с поверхностью LNP и играет роль в обеспечении возможности LNP проникать в клетку посредством эндоцитоза через рецептор LDL, экспрессируемый на поверхности клетки.

Через 24 часа, после обработки по 100 мкл/лунку раствора Bright-Glo™ Luciferase Assay (promega, США) и выдерживания их при комнатной температуре в течение 10 минут, измеряли интенсивность люминесценции растворенных клеток с помощью прибора для измерения люминесценции Infinite М200 (Tecan, США), и результат показан на Фиг. 4а. Как показано на Фиг. 4а, 244-С10 LNP, 245-С10 LNP и 246-С10 LNP, имеющие диапазон pKa от 6,0 до 7,0, показали сильную интенсивность люминесценции, и среди них 246-С10 LNP имела наибольшую интенсивность люминесценции, и, следовательно, можно видеть, что 246-С10 LNP обладает самой высокой эффективностью внутриклеточной доставки лекарственного средства.

Пример 5-2. Подтверждение доставки нуклеиновой кислоты в гепатоциты

Интенсивность люминесценции измеряли путем доставки luc мРНК в гепатоциты с использованием липидных наночастиц 246-С10, полученных в Примере 2-2, тем самым подтверждая экспрессию гена.

Более конкретно, после объединения 246-С10 LNP (содержащей 1,5 мол. % липид-PEG), в которой luc мРНК (SEQ ID NO: 1) была инкапсулирована с АроЕ3 5 мкг/мл, LNP вводили в клеточную линию гепатоцитов (Nexel, Корея), аликвоты по 1×105 клеток/лунку по 0,2 мкг/лунку, 0,5 мкг/лунку или 1 мкг/лунку в зависимости от концентрации мРНК, содержащейся в наночастице. Через 6 часов обрабатывали раствором Bright-Glo™ Luciferase Assay (promega, США) 100 мкг/лунку и оставляли при комнатной температуре на 10 минут, а затем измеряли интенсивность люминесценции растворенных клеток с помощью прибора для измерения люминесценции Infinite М200. (Tecan, США), и результат показан на Фиг. 4б.

Как показано на Фиг. 4b, было подтверждено, что липидная наночастица в соответствии с одним из примеров легко вводилась в клетки путем связывания с АроЕЗ, увеличивала количество доставляемого лекарственного средства (нуклеиновой кислоты) в зависимости от концентрации и могла доставлять лекарственное средство в гепатоциты с высокой эффективностью.

Пример 6. Подтверждение экспрессии in vivo с помощью липидных наночастиц

Как подтверждено в Примере 5-1, эффективность доставки лекарственного средства in vivo и биораспределение от 244-С10 LNP до 246-С10 LNP, демонстрирующие превосходный эффект экспрессии генов (эффект доставки генов) in vitro, подтверждали в настоящем примере.

Получали липидные наночастицы от 244-С10 до 246-С10 LNP (содержащие 1,5 мол. % липид-PEG), в которые была инкапсулирована luc мРНК (SEQ ID NO: 1) по способу Примера 2-2, и каждую наночастицу подвергали диализу в PBS в течение 16 часов для удаления этанола. Через 3 часа после внутривенного (в/в) введения липидной наночастицы, в которую инкапсулирована мРНК, самкам мышей линии C57BL/6 7-недельного возраста (Orient Bio) в количестве 0,1 мг/кг в расчете на мРНК, содержащуюся в липидной наночастице, внутрибрюшинно вводили люциферин 0,25 мг/кг, биолюминесценцию подтверждали с помощью оборудования IVIS (PerkinElmer, США), и результат отображали на Фиг. 5а.

Мышей, которым вводили LNP 246-С10 с инкапсулированной luc мРНК, умерщвляли и извлекали органы, а биораспределение липидных наночастиц подтверждали в каждом органе с помощью оборудования IVIS, и результат показан на Фиг. 5б.

Как показано на Фиг. 5а, мыши, которым вводили липидные наночастицы от 244-С10 LNP до 246-С10 LNP с инкапсулированными luc мРНК, проявляли высокую интенсивность люминесценции, что соответствует результату Примера 5-1. В частности, как показано на Фиг. 5а и Фиг. 5б, посредством системной визуализации и визуализации органов ex vivo было подтверждено, что LNP 246-С10 с инкапсулированной luc мРНК демонстрировали высокую интенсивность люминесценции, особенно в печени, и, таким образом, можно было подтвердить, что липидная наночастица в соответствии с одним из примеров показала высокое биораспределение в печени.

Пример 7. Подтверждение соотношения состава липидных наночастиц, оптимального для доставки нуклеиновых кислот

В настоящем примере необходимо было подтвердить соотношение состава липидных наночастиц с наиболее высокой эффективностью доставки лекарственного средства, особенно в печень, in vivo.

При получении липидной наночастицы липидную наночастицу (246-С10 LNP), в которую была инкапсулирована luc мРНК (SEQ ID NO: 1), получали по способу Примера 2-2 путем смешивания липид-PEG (С16-PEG2000 церамид) от 1,0 до 2,5 мол. %. Массовое соотношение ионизируемого липида к мРНК, содержащихся в липидной наночастице, составляло 10:1, а молярное соотношение ионизируемый липид (246-С10) : фосфолипид (DOPE) : холестерин : липид-PEG (C16-PEG2000 церамид) составляло в LNP 26,5 : 20 : от 52,5 до 51: от 1,0 до 2,5 (подбирая содержание холестерина и липид-PEG так, чтобы общая сумма молярного соотношения равнялась 100).

Для 246-С10 LNP, в которой липид-PEG содержался в количестве 1,0 мол. %, 1,5 мол. % или 2,5 мол. % и luc мРНК была инкапсулирована, аналогично способу Примера 6, через 3 часа после внутривенного (в/в) введения липидной наночастицы с инкапсулированной мРНК C57BL/6 самкам 7-недельных мышей (Orient Bio) в дозе 0,1 мг/кг в расчете на luc мРНК, содержащуюся в липидной наночастице, люциферин 0,25 мг/кг вводили внутрибрюшинно через оборудование IVIS (PerkinElmer, США) для подтверждения биолюминесценции, и результат отображали на Фиг. 6, а размер липидных наночастиц в соответствии с содержанием липид-PEG измеряли так же, как в методе Примера 4-1, и он изложен в Таблице 6 ниже и отображен на Фиг. 6.

Как показано на Фиг. 6, можно было подтвердить, что группа, которой вводили липидную наночастицу согласно одному примеру, имела превосходную эффективность доставки лекарственного средства в печень, а размер LNP, содержащих 1,5 мол. % липид-PEG, составлял примерно от 70 нм.

Пример 8. Подтверждение эффекта гепатоцит-специфической доставки лекарственного средства

Пример 8-1. Подтверждение нокаут-эффекта FVII с использованием липидных наночастиц

FVII экспрессируется специфически в гепатоцитах, и, следовательно, в настоящем примере способность нацеливания липидных наночастиц на гепатоциты в соответствии с одним примером была подтверждена эффектом нокаута FVII (фактор VII) с использованием siFVII.

Так, концентрация, основанная на концентрации миРНК, содержащейся в липидной наночастице, составляла 0,03 мг/кг, 0,1 мг/кг или 0,3 мг/кг через 3 суток после введения липидной наночастицы 246-С10 (содержащей липид-PEG 1,5 мол. %), в которую была инкапсулирована целевая миРНК FVII (SEQ ID NOs: 2 и 3), полученной в Примере 2-2, вводили внутривенно самкам мышей C57BL/6 7-недельного возраста 20 г, кровь собирали через хвостовую вену и анализ крови проводили по протоколу набора для анализа coaset FVII, и строили стандартную кривую по анализу крови мышей, которым вводили PBS, и измеряли экспрессию FVII, и результат показан на Фиг. 7. Как показано на Фиг. 7, поскольку экспрессия FVII ингибировалась in vivo в зависимости от концентрации миРНК, инкапсулированной в липидную наночастицу 246-С10, было подтверждено, что липидная наночастица в соответствии с одним из примеров может доставлять нуклеиновую кислоту в гепатоциты в качестве мишени.

Пример 8-2. Эффект доставки лекарств в гепатоциты в зависимости от содержания липид-PEG

Получали липидную наночастицу (246-С10 LNP), в которую был инкапсулирован siFVII (SEQ ID No: 2 и 3) по способу Примера 2-2, путем варьирования содержания липид-PEG, входящего в состав липидной наночастицы, от 0,5 до 5,0 мол. %. Массовое соотношение ионизируемый липид : миРНК, содержащихся в липидной наночастице, составляло 7,5:1, а молярное соотношение ионизируемый липид (246-С10) : фосфолипид (DSPC) : холестерин : липид-PEG (C16-PEG2000 церамид), входящих в состав LNP, составляло 42,5 : 13: от 44 до 39,5 : от 0,5 до 5,0 (подбирая содержание холестерина и липид-PEG таким образом, чтобы общая сумма молярного соотношения равнялась 100).

Диаметр и индекс полидисперсности липидных наночастиц, полученных выше, измеряли так же, как и в методе Примера 4-1, и они показаны в Таблице 7 ниже и на Фиг. 8 (таблица слева).

Так, концентрация, основанная на концентрации миРНК, содержащейся в липидной наночастице, составляла 0,2 мг/кг, через 3 дня после того, как была инкапсулирована липидная наночастица (содержащая липид-PEG от 0,5 до 5 мол. %), в которую был инкапсулирован siFVII, внутривенно вводили 7-недельным самкам мышей C57BL/6 весом 20 г, кровь собирали через хвостовые вены и, аналогично методу Примера 8-1, используя набор для анализа coaset FVII, измеряли экспрессию FVII, и результат отображали на Фиг. 8 (график справа). Как показано на Фиг. 8, было подтверждено, что при введении липидной наночастицы по одному примеру экспрессия FVII in vivo снижалась, а при введении липидной наночастицы с содержанием липид-PEG от 0,5 до 5,0 мол. % экспрессия FVII превосходно подавлялась.

Пример 9. Эффект LSEC-специфической доставки лекарственного средства

Поскольку FVIII специфически экспрессируется в LSEC (синусоидальных эндотелиальных клетках печени), в данном примере способность липидных наночастиц к LSEC нацеливаться в соответствии с одним из примеров была подтверждена эффектом нокаута FVIII (фактора VIII) с использованием siFVIII и лекарственного средства, и исследовали эффект доставки в зависимости от содержания липид-PEG.

Путем варьирования содержания липид-PEG в липидной наночастице от 0,5 до 5,0 мол. % получали липидные наночастицы (246-С10 LNP), в которые был инкапсулирован siFVIII (SEQ ID NOs: 4-11) методом Примера 2. Массовое соотношение ионизируемый липид : миРНК, входящих в состав липидной наночастицы, составляло 7,5:1, а соотношение ионизируемый липид (246-С10) : фосфолипид (DSPC) : холестерин : липид-PEG (С16- PEG2000 церамид) в составе LNP составляло 42,5 : 13 : от 44 до 39,5 : от 0,5 до 5,0 (подбирая содержание холестерина и липид-PEG таким образом, чтобы общая сумма молярного соотношения равнялась 100).

Диаметр и PDI липидных наночастиц, полученных выше, измеряли тем же способом, что и в Примере 4-1, и они показаны в Таблице 8 ниже и на Фиг. 9 (таблица слева).

Так, концентрация, основанная на концентрации миРНК, содержащейся в липидной наночастице, составляла 0,5 мг/кг, через 2 дня после введения липидной наночастицы (содержащей липид-PEG от 0,5 до 5 мол. %), в которую был инкапсулирован siFVIII, внутривенно вводили 7-недельным самкам мышей C57BL/6 массой 20 г, собирали кровь через хвостовые вены и аналогично методу Примера 8-1, используя набор для анализа coaset FVII, измеряли экспрессию FVIII и результат отображали на Фиг. 9 (график справа). Как показано на Фиг. 9, было подтверждено, что при введении липидной наночастицы в соответствии с одним из примеров экспрессия FVIII in vivo снижалась, и липидная наночастица в соответствии с одним из примеров могла нацеливаться на LSEC, а когда липидная наночастица с содержанием липид-PEG составляла от 0,5 до 5,0 мол. %, экспрессия FVIII превосходно подавлялась.

Пример 10. Эффект доставки лекарственного средства в зависимости от типов конъюгата липид-PEG

Липидные наночастицы (содержащие конъюгат липид-PEG от 0,25 до 10,0 мол. %), включающие конъюгат церамид-PEG (C16-PEG 2000 ceramide; Avanti, США) или PEG-DSPE (Avanti, США) в качестве конъюгата липид-PEG, получали аналогично способу Примера 2-2. Массовое соотношение ионизируемый липид : миРНК (siLuc), содержащихся в липидной наночастице, составляло 7,5:1, а молярное соотношение ионизируемый липид (2464-С10) : фосфолипид (DSPC) : холестерин: липид-PEG (церамид-PEG или PEG-DSPE), содержащихся в LNP, составляло 42,5 : 13 : от 44,25 до 34,5 : от 0,25 до 10 (содержание холестерина и липида-PEG регулируется таким образом, чтобы общая сумма молярного соотношения равнялась 100). Последовательность используемой siLuc (миРНК, нацеленная на ген люциферазы; SEQ ID NO: 12 и 13) была описана в Примере 2-2.

За сутки до трансфекции LNP в клетки согласно одному примеру, клетки HeLa (Korea Cell Line Bank) разделяли на аликвоты по 0,01×10⁶ клеток/лунка в белом планшете (96 лунок) и культивировали в условиях 37°С, примерно 0,5-3% СО₂ в среде DMEM (SH30022, Hyclone, США). Через 24 часа после обработки липидной наночастицы, в которой была инкапсулирована siLuc, в клеточной линии HeLa-Luc при длине волны 10 нм в зависимости от концентрации миРНК, раствор Bright-Glo™ Luciferase Assay (promega, США) обрабатывали по 100 мкг/лунку каждая и оставляли при комнатной температуре на 10 мин, а затем для растворенных клеток измеряли интенсивность люминесценции с помощью устройства для измерения люминесценции Infinite М200 (Tecan, США), и результат отображали на Фиг. 10. Измеренный результат был представлен средним значением ± стандартное отклонение (SD). Значение результата статистически проверяли методом Стьюдента, и случай р<0,05 и более определяли как статистически значимый.

Как показано на Фиг. 10, липидная наночастица в соответствии с одним примером обладала превосходным эффектом доставки нуклеиновой кислоты в клетки, и, в частности, в случае включения конъюгата церамид-PEG в качестве конъюгата липид-PEG эффект доставки нуклеиновой кислоты был превосходным.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation

<120> Липидные наночастицы для доставки лекарственного средства in vivo

и их применение

<130> OPP20204870KR

<150> KR 10-2020-0005642

<151> 2020-01-15

<150> KR 10-2020-0040586

<151> 2020-04-02

<160> 13

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1653

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> мРНК люциферазы

<400> 1

auggaagacg ccaaaaacau aaagaaaggc ccggcgccau ucuauccgcu ggaagaugga 60

accgcuggag agcaacugca uaaggcuaug aagagauacg cccugguucc uggaacaauu 120

gcuuuuacag augcacauau cgagguggac aucacuuacg cugaguacuu cgaaaugucc 180

guucgguugg cagaagcuau gaaacgauau gggcugaaua caaaucacag aaucgucgua 240

ugcagugaaa acucucuuca auucuuuaug ccgguguugg gcgcguuauu uaucggaguu 300

gcaguugcgc ccgcgaacga cauuuauaau gaacgugaau ugcucaacag uaugggcauu 360

ucgcagccua ccgugguguu cguuuccaaa aagggguugc aaaaaauuuu gaacgugcaa 420

aaaaagcucc caaucaucca aaaaauuauu aucauggauu cuaaaacgga uuaccaggga 480

uuucagucga uguacacguu cgucacaucu caucuaccuc ccgguuuuaa ugaauacgau 540

uuugugccag aguccuucga uagggacaag acaauugcac ugaucaugaa cuccucugga 600

ucuacugguc ugccuaaagg ugucgcucug ccucauagaa cugccugcgu gagauucucg 660

caugccagag auccuauuuu uggcaaucaa aucauuccgg auacugcgau uuuaaguguu 720

guuccauucc aucacgguuu uggaauguuu acuacacucg gauauuugau auguggauuu 780

cgagucgucu uaauguauag auuugaagaa gagcuguuuc ugaggagccu ucaggauuac 840

aagauucaaa gugcgcugcu ggugccaacc cuauucuccu ucuucgccaa aagcacucug 900

auugacaaau acgauuuauc uaauuuacac gaaauugcuu cugguggcgc uccccucucu 960

aaggaagucg gggaagcggu ugccaagagg uuccaucugc cagguaucag gcaaggauau 1020

gggcucacug agacuacauc agcuauucug auuacacccg agggggauga uaaaccgggc 1080

gcggucggua aaguuguucc auuuuuugaa gcgaagguug uggaucugga uaccgggaaa 1140

acgcugggcg uuaaucaaag aggcgaacug ugugugagag guccuaugau uauguccggu 1200

uauguaaaca auccggaagc gaccaacgcc uugauugaca aggauggaug gcuacauucu 1260

ggagacauag cuuacuggga cgaagacgaa cacuucuuca ucguugaccg ccugaagucu 1320

cugauuaagu acaaaggcua ucagguggcu cccgcugaau uggaauccau cuugcuccaa 1380

caccccaaca ucuucgacgc aggugucgca ggucuucccg acgaugacgc cggugaacuu 1440

cccgccgccg uuguuguuuu ggagcacgga aagacgauga cggaaaaaga gaucguggau 1500

uacgucgcca gucaaguaac aaccgcgaaa aaguugcgcg gaggaguugu guuuguggac 1560

gaaguaccga aaggucuuac cggaaaacuc gacgcaagaa aaaucagaga gauccucaua 1620

aaggccaaga agggcggaaa gaucgccgug uaa 1653

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FVII целевая миРНК_смысловая

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> дезоксирибонуклеотиды

<400> 2

ggaucaucuc aagucuuact t 21

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FVII целевая миРНК_антисмысловая

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> дезоксирибонуклеотиды

<400> 3

guaagacuug agaugaucct t 21

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FVIII целевая миРНК_смысловая_1

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> дезоксирибонуклеотиды

<400> 4

cuuauaucgu ggagaauuat t 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FVIII целевая миРНК_антисмысловая_1

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> дезоксирибонуклеотиды

<400> 5

uaauucucca cgauauaagt t 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FVIII целевая миРНК_смысловая_2

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> дезоксирибонуклеотиды

<400> 6

ucaaaggauu cgaugguaut t 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FVIII целевая миРНК_антисмысловая_2

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> дезоксирибонуклеотиды

<400> 7

auaccaucga auccuuugat t 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FVIII целевая миРНК_смысловая_3

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> дезоксирибонуклеотиды

<400> 8

caagagcacu agugauuaut t 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FVIII целевая миРНК_антисмысловая_3

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> дезоксирибонуклеотиды

<400> 9

auaaucacua gugcucuugt t 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FVIII целевая миРНК_смысловая_4

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> дезоксирибонуклеотиды

<400> 10

gggcaccacu ccugaaauat t 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FVIII целевая миРНК_антисмысловая_4

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> дезоксирибонуклеотиды

<400> 11

uauuucagga guggugccct t 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> siFluc_смысловая

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> дезоксирибонуклеотиды

<400> 12

aacgcugggc guuaaucaat t 21

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> siFluc_антисмысловая

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> дезоксирибонуклеотиды

<400> 13

uugauuaacg cccagcguut t 21

<---

Группа изобретений относится к липидным наночастицам для доставки лекарственного средства in vivo и к их применению. Липидная наночастица содержит ионизируемый липид, в котором связаны 6-членный гетероциклический амин и алкил-эпоксид, фосфолипид; холестерин, и конъюгат липид-PEG (полиэтиленгликоль) в количестве от 0,5 до 5 мол.%. Липидные наночастицы специфичны для ткани печени, гепатоцита и/или LSEC (синусоидальной эндотелиальной клетки печени), обладают превосходной биосовместимостью и могут с высокой эффективностью доставлять генно-терапевтический агент. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 10 ил., 8 табл., 10 пр.

1. Липидная наночастица, специфично нацеленная на ткань печени, гепатоцит и/или LSEC (синусоидальную эндотелиальную клетку печени), содержащая ионизируемый липид, в котором связаны 6-членный гетероциклический амин и алкил-эпоксид; фосфолипид; холестерин; и конъюгат липид-PEG (полиэтиленгликоль), где 6-членный гетероциклический амин выбран из группы, состоящей из

где алкил-эпоксид имеет число атомов углерода от С6 до С14,

где фосфолипид представляет собой один или более видов, выбранных из группы, состоящей из диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE), дистеароилфосфатидилхолина (DSPC), пальмитоилолеоилфосфатидилхолина (POPC), фосфатидилхолина яиц (EPC), диолеоилфосфатидилхолина (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), диолеоилфосфатидилглицерина (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерина (DPPG), дистеароилфосфатидилэтаноламина (DSPE), фосфатидилэтаноламина, дипальмитоилфосфатидилэтаноламина, 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (POPE), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-[фосфо-L-серина] (DOPS) и 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-[фосфо-L-серина],

где указанная липидная наночастица содержит конъюгат липид-PEG в количестве от 0,5 до 5 мол.%.

2. Липидная наночастица по п. 1, где алкил-эпоксид представляет собой 1,2-эпоксидодекан.

3. Липидная наночастица по п. 1, где фосфолипид представляет собой DOPE или DSPC.

4. Липидная наночастица по п. 1, где липид в конъюгате липид-PEG представляет собой один или более видов, выбранных из группы, состоящей из церамида, димиристоилглицерина (DMG), сукциноил-диацилглицерина (s-DAG), дистеароилфосфатидилхолина (DSPC), дистеароилфосфатидилэтаноламина (DSPE) и холестерина.

5. Липидная наночастица по п. 1, содержащая ионизируемый липид : фосфолипид : холестерин : конъюгат липид-PEG в молярном соотношении от 20 до 50 : от 10 до 30 : от 30 до 60 : от 0,5 до 5.

6. Липидная наночастица по п. 1, имеющая pKa от 6,0 до 7,0.

7. Липидная наночастица по п. 1, специфично нацеленная на ткань печени.

8. Липидная наночастица по п. 1, нацеленная на гепатоцит.

9. Липидная наночастица по п. 1, нацеленная на LSEC.

10. Композиция для доставки лекарственного средства, специфично нацеленная на ткань печени, содержащая (1) липидную наночастицу по любому из пп. 1-9 и (2) анионное лекарственное средство, нуклеиновую кислоту или их комбинацию.

11. Композиция для доставки лекарственного средства по п. 10, где анионное лекарственное средство, нуклеиновая кислота или их комбинация инкапсулированы внутри липидной наночастицы.

12. Композиция для доставки лекарственного средства по п. 10, где липидная наночастица имеет средний диаметр от 30 нм до 150 нм.

13. Композиция для доставки лекарственного средства по п. 10, где анионное лекарственное средство представляет собой один или более видов, выбранных из группы, состоящей из пептида, лекарственного белка, структуры белок-нуклеиновая кислота и конъюгата анионный биополимер-лекарственное средство.

14. Композиция для доставки лекарственного средства по п. 10, где нуклеиновая кислота представляет собой один или более видов, выбранных из группы, состоящей из малой интерферирующей рибонуклеиновой кислоты (миРНК), рибосомной рибонуклеиновой кислоты (рРНК), рибонуклеиновой кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК), аптамера, матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК), транспортной рибонуклеиновой кислоты (тРНК), антисмыслового олигонуклеотида, короткой шпилечной РНК (кшРНК), микроРНК, рибозима, пептид-нуклеиновой кислоты (ПНК) и ДНКзима.