Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее раскрытие принадлежит к области биомедицины и биотехнологии, и относится к семейству липидных соединений и их терапевтическим фармацевтическим системам доставки.
Предпосылки
Экзогенным биомолекулам и некоторым фармацевтическим молекулам трудно достичь цитоплазмы через клеточную мембрану для обеспечения лечебного эффекта. мРНК относится к одну из типов биомолекул с отрицательным зарядом, которые должны преодолеть барьер клеточной мембраны для трансляции в белок и выполнения их биологической функции. Таким образом, эффективная доставка биомолекул in vivo является важной задачей.
Липидные наночастицы (LNP) относятся к виду новой технологии доставки молекул нуклеиновых кислот, включающей, как правило, четыре компонента: (1) ионизируемый липид, который объединяется с мРНК в частицу, имеющую такой же размер, как бактерия, и высвобождает мРНК из эндосомы в цитоплазму; (2) PEG-липид, который улучшает период полужизни липидных наночастиц (LNP) в крови; (3) холестерин, который улучшает стабильность наночастиц; (4) фосфолипид, который способствует образованию двойной липидной структуры (липидного бислоя). Функция липидных наночастиц (LNP) заключается не только в защите мРНК от расщепления ферментом РНК (РНКазой) или распознавании Toll-подобными рецепторами (TLR), но также в избегании чрезмерной реакции врожденной иммунной системы. Ионизируемый липид может ускорять поглощение клетками и помогать фармацевтическим молекулам высвобождаться из эндосомы с обеспечением терапевтического эффекта.
Первое лекарственное средство LNP-siRNA, инкапсулированное в катионный липид MC3, было одобрено для коммерциализации, что подтверждает, что LNP могут эффективно доставлять фармацевтические препараты на основе нуклеиновых кислот in vivo с приемлемым до некоторой степени профилем безопасности. В последние годы исследования также продемонстрировали большой потенциал LNP для применения в области фармацевтических препаратов и вакцин на основе мРНК. Разработка систем доставки на основе LNP, в основном, нацелена на ионизируемый липид, его формулу и способы преодоления токсичности некоторых липидных препаратов.
Заявка PCT/US2016/052352, опубликованная как WO2017/049245, раскрывает соединения и композиции, а также их применение для внутриклеточной доставки терапевтических агентов, включая несколько новых липидных структур, которые могут доставлять молекулу мРНК в клетку-мишень. Заявка PCT/US2010/038224, опубликованная как WO2010/144740, раскрывает химическую структуру MC3, которая может инкапсулировать фармацевтические препараты на основе siRNA с высокой эффективностью, и избегать разложения и удаления во время доставки. В настоящее время система доставки на основе LNP считается ключевой технологией для содействия терапевтическому применению фармацевтических препаратов на основе нуклеиновых кислот.
Сущность изобретения
Для рассматриваемого технического вопроса было необходимо открыть новые ионизируемые липидные соединения для повышения эффективности доставки и снижения токсичности фармацевтических препаратов на основе нуклеиновых кислот, таких как мРНК и миРНК (siRNA). Настоящее раскрытие обеспечивает семейство новых ионизируемых липидных соединений, которые образуют алифатическую цепь за счет сложноэфирной группы глицерина и простой эфирной группы. Эффекты доставки таких липидов лучше, чем у ионизируемого липида с алифатической цепью. Новые ионизируемые липиды комбинируют с другими липидными ингредиентами и формируют липидные наночастицы, которые эффективно доставляют мРНК или другие фармацевтические агенты in vivo туда, где осуществляется предполагаемая биологическая функция. Например, доставка миРНК в клетку играет свою роль в терапии, направленной на сайленсинг генов; доставка мРНК в клетку может обеспечить эффективную трансляцию в белок или антиген для вакцинотерапии или фармацевтической терапии; доставка антитела in vivo также играет определенную роль в терапии; а доставка мРНК Cas 9 in vivo играет определенную роль в редактировании генов.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлен график, показывающий изменение массы тела крысиных самцов при оценке безопасности LNP.
На фиг. 2 показано изменение массы тела крысиных самок при оценке безопасности LNP.
На фиг. 3 показано изменение потребления пищи у крысиных самцов при оценке безопасности LNP.
На фиг. 4 показано изменение потребления пищи у крысиных самок при оценке безопасности LNP.
На фиг. 5 показан титр антител IgG, вызываемых LNP-мРНК, в исследовании иммуногенности.
Подробное описание изобретения
Настоящее раскрытие обеспечивает семейство новых ионизируемых липидов, способы их синтеза, и фармацевтические молекулы, смешанные и инкапсулированные с использованием смеси, содержащей ионизируемый липид, PEG-липид, структурный липид (такой как холестерин) и фосфолипид, что приводит к образованию системы доставки на основе наночастиц, которую можно использовать для доставки в клетки in vitro и для доставки в клетки целевых органов in vivo.
В одном варианте осуществления настоящее раскрытие относится к соединению следующей формулы (I):
(I),
где R1 выбран из -R1’-X,
R1’ представляет собой -(CH2)0-6-, и X представляет собой амино, гидроксил, этинил, циано, -C(O)(CH2)1-3NRaRb, -C(O)O(CH2)1-3NRaRb, -OC(O)(CH2)1-3NRaRb, -C(O)NH(CH2)1-3NRaRb, NHC(O)(CH2)1-3NRaRb, -NHC(O)CH(NRaRb)(CH2)1-3NRaRb, C3-7-циклоалкил, 4-7-членную гетероциклическую группу, C6-10-арил или 5-10-членный гетероарил, при этом указанный циклоалкил, гетероциклическая группа, арил или гетероарил необязательно замещены следующими группами: -(CH2)1-3OH, -(CH2)1-3NRaRb, -(CH2)1-3C(O)NRaRb; или X также может представлять собой:
Ra и Rb независимо выбраны из H, C1-3-алкила, -(CH2)1-3NH2, (CH2)1-3NH(CH2)1-3NH2; или Ra и Rb вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5-10-членный гетероцикл, который включает 1-3 гетероатома, выбранных из N, O или S, при этом указанный гетероцикл необязательно замещен следующими группами: C1-6-алкильной группой, C1-6-алкилгалогенидной группой, C1-6-алкилгидроксильной группой и C1-6-алкиламиногруппой;
R2 и R3 независимо выбраны из H, C2-18-алкила, C4-18-алкенила или
каждый M независимо выбран из -CH2-, -CH=CH-, -NH-, -C(O)-, -O-, C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)NH- или -NHC(O)-;
каждый R независимо выбран из H, R’, -OR* или -R’’OR*;
каждый R’ независимо выбран из C1-10-алкила или C3-12-алкенила;
каждый R’’ независимо выбран из C1-10-алкила или C3-12-алкенила;
каждый R* независимо выбран из C1-10-алкила или C3-12-алкенила; n и m независимо представляют собой целые числа, независимо выбранные из чисел от 1 до 9;
или его соли или изомеру.
В одном из вариантов осуществления ионизируемый липид представляет собой соединение формулы (I), где:
R’ представляет собой -(CH2)2-3-, и X представляет собой гидроксил, -C(O)(CH2)2-3NRaRb, -C(O)O(CH2)2-3NRaRb, -C(O)NH(CH2)2-3NRaRb или 5-10-членный гетероарил, который необязательно замещен одной или несколькими из следующих групп: -(CH2)2-3OH, -(CH2)2-3NRaRb, -(CH2)2-3C(O)NRaRb; или X также может представлять собой:
;
Ra и Rb независимо выбраны из H, C1-3-алкила, -(CH2)2-3NH2, (CH2)2-3NH(CH2)2-3NH2; или Ra и Rb вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5-10-членный гетероцикл, включающий 1-3 гетероатома, выбранных из N или O, при этом указанный гетероцикл необязательно замещен одной или несколькими из следующих групп: C1-6-алкильной группой, C1-6-алкилгалогенидной группой, C1-6-алкилгидроксильной группой и C1-6-алкиламиногруппой.
В одном варианте осуществления ионизируемый липид представляет собой соединение формулы (I), где:
каждый M независимо выбран из -CH2-, -CH=CH-, -C(O)O-, -OC(O)-, C(O)NH- или -NHC(O)-.
В одном варианте осуществления соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (II):
(II),
где:
каждый R* независимо выбран из C2-10-алкила, предпочтительно C6-10-алкила, предпочтительно C6-алкила.
В одном варианте осуществления ионизируемый липид представляет собой соединение формулы (II), где:
каждый M независимо выбран из -C(O)O- или -OC(O)-, предпочтительно -C(O)O-. В одном варианте осуществления ионизируемый липид представляет собой соединение формулы (II), где:
R1 выбран из -R1’-X, R1’ представляет собой -(CH2)1-6-, и X представляет собой гидроксил.
В одном варианте осуществления ионизируемый липид представляет собой соединение формулы (II), где:
R1 выбран из -R1’-X, R1’ представляет собой -(CH2)1-6-, и X представляет собой -C(O)(CH2)2-3NRaRb, -C(O)O(CH2)2-3NRaRb, -C(O)NH(CH2)2-3NRaRb,
Ra и Rb независимо выбраны из H, C1-3-алкила, -(CH2)2-3NH2; или Ra и Rb вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5-10-членный гетероцикл, содержащий 1-3 гетероатома, выбранных из N или O, предпочтительно морфолинил или пиперидинил, при этом указанный гетероцикл необязательно замещен C1-6-алкилгидроксилом.
В одном варианте осуществления ионизируемый липид представляет собой соединение формулы (II), где:
R1 выбран из -R1’-X, R1’ представляет собой -(CH2)1-6-, X представляет собой 5-6-членную гетероароматическую группу, предпочтительно триазолил, при этом указанная гетероароматическая группа необязательно замещена одной или несколькими из следующих групп: -(CH2)2-3OH, -(CH2)2-3NRaRb и -(CH2)2-3C(O)NRaRb,
Ra и Rb независимо выбраны из H, C1-3-алкила, -(CH2)2-3NH2, (CH2)2-3NH(CH2)2-3NH2, или Ra и Rb вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5-10-членный гетероцикл, содержащий 1-3 гетероатома, выбранных из N или O, предпочтительно морфолинил, пиперазинил или пиперидинил, при этом указанный гетероцикл необязательно замещен одной или несколькими из следующих групп: C1-6-алкил и гидроксил.
В одном варианте осуществления ионизируемый липид представляет собой соединение формулы (II), где:
R1 выбран из -R1’-X, R1’ представляет собой -(CH2)1-6-, и X представляет собой
.
В одном варианте осуществления ионизируемый липид представляет собой соединение формулы (II), где:
каждый n равен 7, m равен 7.
В одном варианте осуществления соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (III):
(III).
В одном варианте осуществления ионизируемый липид представляет собой соединение формулы (III), где:
каждый R’ независимо выбран из C1-10-алкила, предпочтительно C2-8-алкила.
В одном варианте осуществления ионизируемый липид представляет собой соединение формулы (III), где:
каждый M независимо выбран из -C(O)O- или -OC(O)-, предпочтительно -C(O)O-. В одном варианте осуществления ионизируемый липид представляет собой соединение формулы (IV):
(IV).
В одном варианте осуществления ионизируемый липид представляет собой соединение формулы (IV), где:
каждый R* независимо выбран из C2-10-алкила, предпочтительно C6-10-алкила, предпочтительно C6-алкила.
В одном варианте осуществления ионизируемый липид представляет собой соединение формулы (IV), где:
каждый M независимо выбран из -C(O)O- или -OC(O)-, предпочтительно -C(O)O-.
В одном варианте осуществления ионизируемый липид представляет собой соединение формулы (V):
(V).
В одном варианте осуществления ионизируемый липид представляет собой соединение формулы (V), где:
каждый R* независимо выбран из C2-10-алкила, предпочтительно C6-10-алкила, предпочтительно C6-алкила.
В одном варианте осуществления ионизируемый липид представляет собой соединение формулы (V), где:
каждый M независимо выбран из -CH=CH-, -C(O)O- или -OC(O)-, предпочтительно -CH=CH- или -C(O)O-.
В одном варианте осуществления ионизируемый липид представляет собой соединение формулы (V), где:
каждый R’ независимо выбран из C1-10-алкила или C3-12-алкенила, предпочтительно C10-алкила или C8-алкенила.
В другом варианте осуществления соединение представляет собой соль любого из предшествующих вариантов осуществления.
В другом варианте осуществления соединение представляет собой стереоизомер любого из предшествующих вариантов осуществления.
В одном варианте осуществления указанное соединение выбрано из следующих соединений, их солей или стереоизомеров: A1, A5, A6, A7, A9, A10, A11, A12, A13, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42, A43, A44, A45, A46, A47 и 48.
В одном варианте осуществления изобретение относится к композиции, содержащей ионизируемое липидное соединение по п. 1 в смеси с PEG-липидом, структурным липидом и фосфолипидом.
В одном варианте осуществления фосфолипиды выбраны по меньшей мере из любой из следующих групп: 1,2-дилинолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DLPC), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-фосфохолин (DMPC), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DPPC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC), 1,2-диундеканоил-sn-глицеро-фосфохолин (DUPC), 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (POPC), 1,2-ди-О-октадеценил-sn-глицеро-3-фосфохолин (18:0 Diether PC), 1-олеоил-2-холестерилгемисукциноил-sn-глицеро-3-фосфохолин (OChemsPC), 1-гексадецил-sn-глицеро-3-фосфохолин (C16 Lyso PC), 1,2-дилиноленоил-sn-глицеро-3-фосфохолин, 1,2-диарахидоноил-sn-глицеро-3-фосфохолин, 1,2-дидокозагексаеноил-sn-глицеро-3-фосфохолин, 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (ME 16.0 PE), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин, 1,2-дилинолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин, 1,2-дилиноленоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин, 1,2-диарахидоноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин, 1,2-дидокозагексаеноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин, 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфор-rac-(1-глицерин), натриевая соль (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламин (POPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламин (DMPE), 1-стеароил-2-олеоил-фосфатидилэтаноламин (SOPE), 1-стеароил-2-олеоил-фосфатидилхолин (SOPC), сфингомиелин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидная кислота, пальмитоилолеоилфосфатидилхолин, лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилэтаноламин (LPE). Один или несколько указанных фосфолипидов можно использовать в смеси.
В одном варианте осуществления PEG-липид выбран по меньшей мере из любой из следующих групп: PEG-модифицированный фосфатидилэтаноламин, PEG-модифицированная фосфатидная кислота, PEG-модифицированный церамид, PEG-модифицированный диалкиламин, PEG-модифицированный диацилглицерин, PEG- модифицированный диалкилглицерин. Один или несколько PEG-липидов можно использовать в смеси.
В одном варианте осуществления структурный липид выбран по меньшей мере из любой из следующих групп: холестерин, фекостерин, ситостерин, эргостерин, кампестерин, стигмастерин, брассикастерин, томатидин, урсоловая кислота, альфа-токоферол. Один или несколько структурных липидов можно использовать с смеси.
В одном варианте осуществления в композиции содержание ионизируемого липидного соединения составляет от 20% до 80%, содержание PEG-липида составляет от 1% до 10%, содержание структурного липида составляет от 10% до 50% и содержание фосфолипида составляет от 5% до 30%, при этом каждое из этих процентных содержаний рассчитывается на основе мольного процентного содержания всех липидов в композиции. В другом варианте осуществления содержание ионизируемого липидного соединения составляет 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% или 80%, рассчитанное на основе мольного процентного содержания всех липидов в композиции. В другом варианте осуществления содержание PEG-липида составляет 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5% или 10%, рассчитанное, исходя из мольного процентного содержания всех липидов в композиции. В другом варианте осуществления содержание структурного липида составляет 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50%, рассчитанное, исходя из мольного процентного содержания всех липидов в композиции. В другом варианте осуществления содержание фосфолипида составляет 5%, 10%, 15%, 20%, 25% или 30%, рассчитанное, исходя из мольного процента всех липидов в композиции.
В одном варианте осуществления композиция находится в форме липидной наночастицы.
В другом варианте осуществления липидная наночастица также содержит активный ингредиент. Активный ингредиент может быть выбран по меньшей мере из любого из следующего: ДНК, РНК, белок или активная фармацевтическая молекула.
В одном варианте осуществления РНК выбирают по меньшей мере из любой из следующих: мРНК (mRNA), малая интерферирующая РНК (siRNA), ассиметричная интерферирующая РНК (aiRNA), микро-РНК (miRNA), двухцепочечная РНК (dsRNA), антисмысловая РНК (aRNA), длинная некодирующая РНК (lncRNA), антисмысловой нуклеотид (ASO) или олигонуклеотид.
В одном варианте осуществления белок выбирают по меньшей мере из любого из следующих: антитело, фермент, рекомбинантный белок, полипептид и короткоцепочечный полипептид.
Раскрытие также относится к способу получения липидных наночастиц, включающему стадию (1): смешивание ионизируемого липидного соединения, PEG-липида, структурного липида и фосфолипида в этаноле с образованием липидной смеси.
Способ может дополнительно включать стадию (2): смешивание липидной смеси с активным ингредиентом при помощи смесителя с образованием липидных наночастиц.
В одном варианте осуществления ионизируемое липидное соединение, PEG-липид или PEG-модифицированный липид, структурный липид и фосфолипид растворяют и смешивают в этаноле, затем смешивают с активным ингредиентом при помощи смесителя с образованием липидной наночастицы.
В одном варианте осуществления настоящее раскрытие относится к ионизируемому соединению для применения в изготовлении липидной наночастицы.
В одном варианте осуществления липидная наночастица является нейтральной и незаряженной в нейтральной среде и положительно заряженной после протонирования в кислой среде.
В одном варианте осуществления липидная наночастица является такой, как определено в настоящем описании.
В одном варианте осуществления раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая липидную наночастицу и фармацевтически приемлемый носитель.
В одном варианте осуществления раскрытие относится к липидной наночастице или ее фармацевтической композиции для применения в изготовлении лекарственного средства.
В одном варианте осуществления лекарственное средство также содержит активный ингредиент, при этом активный ингредиент содержит по меньшей мере одно из ДНК, РНК, белка и активной фармацевтической молекулы.
В одном варианте осуществления РНК выбирают по меньшей мере одного из следующего: mRNA, siRNA, aiRNA, miRNA, dsRNA, aRNA и lncRNA.
В одном варианте осуществления настоящее раскрытие относится к липидной наночастице для применения в изготовлении лекарственного средства, инкапсулировании активного ингредиента в указанную липидную наночастицу.
В одном варианте осуществления раскрытие относится к применению лекарственного средства, при этом лекарственное средство можно применять у человека путем внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, подкожной инъекции, микроигольного пластыря, перорального введения, перорального и назального спрея или смазывания.
Структуры типичных ионизируемых липидных соединений по настоящему раскрытию показаны следующим образом:
По сравнению с предшествующим уровнем техники, таким как PCT/US2016/052352 (опубликовано как WO2017/049245) и PCT/US2010/038224 (опубликовано как WO2010/144740), ионизируемые липиды по настоящему раскрытию отличаются от ионизируемых липидов, раскрытых в этих документах, в одном или нескольких аспектах:
1. Иная химическая структура: 1 или 2 алифатические цепи, которые соединены с азотом (N) третичного амина, содержат сложноэфирную группу, образованную с другой насыщенной или ненасыщенной алифатической цепью, имеющей структуру глицерина, чтобы дать новую алифатическую цепь с простыми эфирными группами, при этом результаты показывают, что в таком случае эффективность трансфекции выше, чем у ионизируемого липида, имеющего алифатические цепи без простых эфирных групп;
2. Иные метаболиты: алифатическая цепь ионизируемых липидов по настоящему раскрытию состоит из сложноэфирной группы, глицерина и коротких алифатических цепей. Метаболиты таких молекул представляют собой низкомолекулярные соединения, такие как короткие жирные кислоты, жирные спирты или простые эфиры, которые легче метаболизируются и выводятся, и хуже накапливаются в условиях in vivo, а также обладают более низкой токсичностью.
3. Новая структура промежуточного алкинильного соединения: промежуточное алкинильное соединение образовано пропаргиламином и бромированной алифатической цепью, которая может вступать в реакцию клик-химии со многими азидосоединениями с образованием семейств новых ионизируемых алифатических соединений.
4. Ионизируемые липиды по настоящему раскрытию легко синтезировать и легко получать исходное сырье: исходным сырьевым материалом является глицерин, короткие жирные спирты и жирные кислоты, которые являются относительно недорогостоящими и которые легко синтезировать.
Определения
Когда указан числовой диапазон, он включает каждое значение и поддиапазон в пределах указанного диапазона. Например, «C1-6-алкил» включает C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C1-5, C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-5, C2-4, C2-3, C3-6, C3-5, C3-4, C4-6, C4-5 и C5-6-алкил.
Термин «алкил» относится к линейному или разветвленному насыщенному алкилу, содержащему один или несколько атомов углерода (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более атомов углерода). В частности, «C1-10-алкил» относится к линейному или разветвленному насыщенному алкилу, содержащему 1-10 атомов углерода. «C2-18-алкил» относится к произвольно замещенному линейному или разветвленному насыщенному алкилу, содержащему 2-18 атомов углерода. Если не указано иное, указанный алкил в данном описании относится к незамещенному и замещенному алкилу.
Термин «алкенил» относится к линейному или разветвленному алкилу, содержащему два или более атомов углерода и по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более атомов углерода). Алкенил может включать одну, две, три, четыре или более углерод-углеродных двойных связей. В частности, «C3-12-алкенил» относится к линейному или разветвленному насыщенному алкенилу, содержащему 3-12 атомов углерода и по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь. В частности, «C4-18-алкенил» относится к линейному или разветвленному насыщенному алкенилу, содержащему 4-18 атомов углерода и по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь. Если не указано иное, указанный алкенил в данном описании относится к незамещенному и замещенному алкенилу.
Термин «галоген» относится к фтору (F), хлору (Cl), брому (Br) и йоду (I).
Термин «C1-6-алкилгалогенид» относится к вышеупомянутому «C1-6-алкилу», замещенному одной или несколькими галогеновыми группами. Пример указанного алкилгалогенида включает, без ограничения, -CF3, -CH2F, -CHF2, -CHFCH2F, -CH2CHF2, -CF2CF3, -CCl3, -CH2Cl, -CHCl2 и 2,2,2-трифтор-1,1-диметил-этил.
Термин «C3-7-циклоалкил» относится к неароматической циклической углеводородной группе, содержащей 3-7 атомов углерода в цикле и 0 гетероатомов. Примеры циклоалкильных групп включают, без ограничения: циклопропил (C3), циклопропенил (C3), циклобутил (C4), циклобутенил (C4), циклопентил (C5), циклопентенил (C5), циклогексил (C6), циклогексенил (C6), циклогексадиенил (C6), циклогептил (C7), циклогептенил (C7), циклогептадиенил (C7), циклогептатриенил (C7) и т.д. Циклоалкильная группа может быть необязательно замещена одним или несколькими заместителями, например замещена 1-5 заместителями, 1-3 заместителями или 1 заместителем.
Термин «4-10-членный гетероциклил» относится к 4-10-членной неароматической кольцевой системе, содержащей кольцевой атом углерода и 1-3 кольцевых гетероатома, где каждый гетероатом независимо выбран из азота, кислорода, серы, бора, фосфора и кремния. Аналогичным образом, термин «4-7-членный гетероциклил» и «5-10-членный гетероциклил» также имеют одинаковое определение, за исключением того, что общее количество атомов углерода и гетероатомов варьируется для каждой такой группы. В гетероциклиле, содержащем один или несколько атомов азота, точкой присоединения может быть атом углерода или азота, если позволяет валентность. Примеры 3-членных гетероциклильных групп, содержащих один гетероатом, включают, без ограничения: азиридинил, оксиранил и тиоренил. Примеры 4-членных гетероциклильных групп, содержащих один гетероатом, включают, без ограничения: азетидинил, оксетанил и тиетанил. Примеры 5-членных гетероциклильных групп, содержащих один гетероатом, включают, без ограничения: тетрагидрофуранил, дигидрофурил, тетрагидротиенил, дигидротиенил, пирролидинил, дигидропирролил и пирролил-2,5-дион. Примеры 5-членных гетероциклильных групп, содержащих два гетероатома, включают, без ограничения: диоксоланил, оксасульфуранил, дисульфуранил и оксазолидин-2-кетон. Примеры 5-членных гетероциклильных групп, содержащих три гетероатома, включают, без ограничения: триазолинил, оксадиазолинил и тиадиазолинил. Примеры 6-членных гетероциклильных групп, содержащих один гетероатом, включают, без ограничения: пиперидинил, тетрагидропиранил, дигидропиридил и тианил. Примеры 6-членных гетероциклильных групп, содержащих два гетероатома, включают, без ограничения: пиперазинил, морфолинил, дитианил, диоксанил. Примеры 6-членных гетероциклильных групп, содержащих три гетероатома, включают, без ограничения: гексагидротриазинил. Примеры 7-членных гетероциклильных групп, содержащих один гетероатом, включают, без ограничения: азепанил, оксепанил и тиепанил.
Термин «C6-10-арил» относится к моноциклической или полициклической (например, бициклической) 4n+2 ароматической кольцевой системе (например, содержащей 6 или 10 р-электронов в циклическом расположении), содержащей 6-10 кольцевых атомов углерода и 0 гетероатомов. В некоторых вариантах осуществления арил имеет шесть атомов углерода в кольце («C6-арил»; например, фенил). В некоторых вариантах осуществления арил имеет десять атомов углерода в кольце («С10-арил»; например, нафтил, такой как 1-нафтил и 2-нафтил).
Термин «5-10-членный гетероарил» относится к 5-10-членной моноциклической или бициклической 4n + 2 ароматической кольцевой системе (например, включающей 6 или 10 общих для этих колец р электронов в циклическом расположении), содержащей кольцевой атом углерода и 1-4 гетероатома, где каждый гетероатом независимо выбран из азота, кислорода и серы. В гетероарильных группах, которые содержат один или несколько атомов азота, точкой присоединения может быть атом углерода или азота, как позволяет валентность. Гетероарильная бициклическая система может включать один или несколько гетероатомов в одном или двух кольцах. Гетероарил также включает кольцевую систему, где вышеупомянутое гетероарильное кольцо является конденсированным с одной или несколькими циклоалкильными или гетероциклильными группами, где точка присоединения находится на указанном гетероарильном кольце, и количество атомов углерода все еще продолжает обозначать количество атомов углерода в гетероарильной кольцевой системе. Примеры 5-членных гетероарильных групп, содержащих один гетероатом, включают, без ограничения: пирролил, фуранил и тиофенил. Примеры 5-членных гетероарильных групп, содержащих два гетероатома, включают, без ограничения: имидазолил, пиразолил, оксазолил, изоксазолил, тиазолил и изотиазолил. Примеры 5-членных гетероарильных групп, содержащих три гетероатома, включают, без ограничения: триазолил, оксадиазолил (например, 1,2,4-оксадиазолил) и тиадиазолил. Примеры 5-членных гетероарильных групп, содержащих четыре гетероатома, включают, без ограничения: тетразолил. Примеры 6-членных гетероарильных групп, содержащих один гетероатом, включают, без ограничения: пиридинил. Примеры 6-членных гетероарильных групп, содержащих два гетероатома, включают, без ограничения: пиридазинил, пиримидинил и пиразинил. Примеры 6-членных гетероарильных групп, содержащих три или четыре гетероатома, включают, без ограничения: триазинил и тетразинил. Примеры 7-членных гетероарильных групп, содержащих один гетероатом, включают, без ограничения: азепинил, оксепинил и тиепинил. Примеры 5,6-бициклических гетероарильных групп включают, без ограничения: индолил, изоиндолил, индазолил, бензотриазолил, бензотиенил, изобензотиенил, бензофуранил, бензоизофуранил, бензимидазолил, бензоксазолил, бензизоксазолил, бензоксадиазолил, бензотиазолил, бензизотиазолил, бензотиадиазолил, индолизинил и пуринил. Примеры 6,6 бициклических гетероарильных групп включают, без ограничения: нафтиридинил, птерридинил, хинолинил, изохинолинил, циннолинил, хиноксалинил, фталазинил и хиназолинил.
Термин «изомер» относится к различным соединениям с одинаковой молекулярной формулой. Настоящее раскрытие, в частности, охватывает стереоизомеры, при этом термин «стереоизомер» относится к изомерам, которые различаются только расположением атомов в пространстве.
В некоторых ситуациях соединения по настоящему раскрытию могут образовывать соли, которые также входят в объем настоящего раскрытия. Термин «соль (одна или несколько)» относится к кислотным и/или основным солям, образованным неорганическими и/или органическими кислотами и основаниями. Соли соединений по раскрытию предпочтительно представляют собой фармацевтически приемлемые соли. Термин «фармацевтически приемлемые соли» относится к тем карбоксилатным солям, солям присоединения аминокислоты соединений по настоящему раскрытию, которые являются, согласно результатам обоснованной клинической оценки, подходящими для применения в контакте с тканями пациентов без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.п., соизмеримых с приемлемым отношением польза/риск и эффективных для предполагаемого использования, а также к цвиттерионным формам, где это возможно, соединений по настоящему изобретению.
Фармацевтически приемлемые соли присоединения оснований образуются с металлами или аминами, такими как гидроксиды щелочных и щелочноземельных металлов или органические амины. Примерами металлов, используемых в качестве катионов, являются натрий, калий, магний, кальций и т.п. Примерами подходящих аминов являются N,N'-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, N-метилглюкамин и прокаин.
Соли присоединения оснований к кислым соединениям получают путем введения в контакт соединения в форме свободной кислоты с достаточным количеством желательного основания для получения соли обычным способом. Свободная кислотная форма может быть регенерирована путем введения в контакт образовавшейся солевой формы с кислотой и выделения свободной кислоты обычным способом. Свободные кислотные формы отчасти отличаются от соответствующих им солевых форм некоторыми физическими свойствами, такими как растворимость в полярных растворителях, но в других отношениях для целей настоящего описания соли эквивалентны соответствующей им свободной кислоте.
Соли могут быть получены из неорганических кислот, например сульфат, пиросульфат, бисульфат, сульфит, бисульфит, нитрат, фосфат, моногидрофосфат, дигидрофосфат, метафосфат, пирофосфат, хлорид, бромид, йодид, таких как хлористоводородная, азотная, серная, бромистоводородная, иодистоводородная, фосфорная и т.п. Типичные соли включают гидробромид, гидрохлорид, сульфат, бисульфат, нитрат, ацетат, оксалат, валерат, олеат, пальмитат, стеарат, лаурат, борат, бензоат, лактат, фосфат, тозилат, цитрат, малеат, фумарат, сукцинат, тартрат, нафтилат мезилат, глюкогептонат, лактобионат, лаурилсульфонат и изетионат и т.п. Соли также могут быть получены из органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, алкандионовые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и др. и т.п. Типичные соли включают ацетат, пропионат, каприлат, изобутират, оксалат, малонат, сукцинат, суберат, себацат, фумарат, малеат, манделат, бензоат, хлорбензоат, метилбензоат, динитробензоат, фталат, бензолсульфонат, толуолсульфактат, фенилацетат, цитрат, лактат, малеат, тартрат, метансульфонат и т.п. Фармацевтически приемлемые соли могут включать катионы на основе щелочных и щелочноземельных металлов, таких как натрий, литий, калий, кальций, магний и т.п., а также нетоксичные катионы аммония, четвертичного аммония и амина, включая, без ограничения, аммоний, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний, метиламин, диметиламин, триметиламин, триэтиламин, этиламин и т.п. Также, предусмотрены соли аминокислот, такие как аргинат, глюконат, галактуронат и т.п. (см., например, работу Berge S. M. et al., “Pharmaceutical Salts,”J. Pharm. Sci., 1977; 66:1-19, которая включена в настоящее описание посредством ссылки.)
Примеры фармацевтически приемлемых нетоксичных сложных эфиров соединений по данному раскрытию включают сложные (C1-C6)алкильные эфиры, в которых алкильная группа представляет собой линейную или разветвленную цепь. Приемлемые сложные эфиры также включают сложные (C5-C7)циклоалкиловые эфиры, а также сложные арилалкиловые эфиры, такие как, без ограничения, бензил. Сложные (C1-C4)алкиловые эфиры являются предпочтительными. Сложные эфиры соединений по настоящему раскрытию могут быть получены в соответствии с общепринятыми способами “March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition”. M. B. Smith & J. March, John Wiley & Sons, 2001. Примеры фармацевтически приемлемых нетоксичных амидов соединений по данному раскрытию включают амиды, полученные из аммиака, первичных (C1-C6)алкиламинов и вторичных (C1-C6)диалкиламинов, где алкильные группы представляют собой линейную или разветвленную цепь. В случае вторичных аминов амин также может быть в форме 5- или 6-членного гетероцикла, содержащего один атом азота. Предпочтительными являются амиды, полученные из аммиака, первичных (C1-C3)алкиламинов и вторичных (C1-C2)диалкиламинов. Амиды соединений по настоящему раскрытию могут быть получены в соответствии с общепринятыми способами, такими как “March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition”. M. B. Smith & J. March, John Wiley & Sons, 2001.
Термин «приемлемый носитель» относится к подходящему носителю, использующему современные материалы для целей настоящего раскрытия, без неспецифической токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.п., в соответствии с разумным соотношением польза/риск.
ПРИМЕРЫ
Для того, чтобы цель, технологический протокол и преимущества настоящего раскрытия стали более ясны, настоящее раскрытие будет более подробно проиллюстрировано с помощью следующих далее примеров, а также чертежей.
Пример 1 - Синтез A1
Гексадекана бромид (2,22 г, 7,28 ммоль) растворяли в 50 мл абсолютного этанола, добавляли N,N-диизопропилэтиламин (DIEA, 1,17 г, 9,10 ммоль) и соединение алканоламина (2 г, 6,07 ммоль), реакция протекала при 80 ℃ в течение 18 ч. После завершения реакции растворитель удаляли путем концентрирования, реакционную смесь разбавляли 200 мл этилацетата (EA), один раз промывали 200 мл воды, экстрагировали, органический слой сушили, концентрировали и пропускали через колонку с силикагелем для очистки (DCM:MeOH = 3% - 5%) с получением 1,2 г маслянистого продукта. MS(ES): m/z (M+H)+ 553.5. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 4.06 (t, 2H), 3.57 (t, 2H), 2.62 (bs, 2H), 2.50 (br, 4H), 2.29 (m, 2H), 1.68-1.25 (m, 52H), 0.88 (m, 6H).
Пути синтеза для следующих примеров и синтеза A5-A7, A9-A13, A15-A32 были разработаны на основе этого примера, большинство из них состояли в следующем: реакция замещения происходит через бромированное соединение или соединение кетена и соединение первичного/вторичного амина (например, соединение алканоламина).
Пример 2 – Синтез A5
A5 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 0,75 г маслянистого продукта. MS(ES): m/z (M+H)+ 835.80. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 4.87 (m, 2H), 3.79 (t, 2H), 2.67 (br, 2H), 2.45 (br, 4H), 2.27 (t, 4H), 1.70-1.25 (m, 78H), 0.90 (m, 12H).
Пример 3 – Синтез A6
A6 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 0,51 г маслянистого продукта. MS(ES): m/z (M+H)+ 611.55. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 4.05 (t, 4H), 3.78 (m, 2H), 2.65 (t, 2H), 2.43 (br, 4H), 2.29 (m, 4H), 1.69-1.31 (m, 50H), 0.90 (m, 6H).
Пример 4 - Синтез A7
A7 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 2,45 г маслянистого продукта. MS(ES): m/z (M+H)+ 703.68. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 5.38-5.31 (m, 4H), 4.86 (m, 1H), 3.79 (t, 2H), 2.77 (m, 2H), 2.67 (br, 2H), 2.45 (br, 4H), 2.27 (m, 2H), 2.04 (m, 4H), 1.70-1.25 (m, 58H), 0.90 (m, 9H).
Пример 5 - Синтез A9
A9 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 1,6 г маслянистого продукта. MS(ES): m/z (M+H)+ 577.54. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 5.38-5.33 (m, 4H), 4.06 (t, 2H), 3.60 (t, 2H), 2.77 (t, 2H), 2.66 (m, 2H), 2.54 (bs, 4H), 2.30 (m, 2H), 2.05 (m, 4H), 1.68-1.25 (m, 42H), 0.88 (m, 6H).
Пример 6 - Синтез A10
A10 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 0,4 г маслянистого продукта. MS(ES): m/z (M+H)+ 693.63. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 5.36 (m, 4H), 5.10 (m, 1H), 3.56 (t, 4H), 3.46-3.40 (br, 4H), 2.76 (t, 2H), 2.64 (br, 4H), 2.51 (bs, 4H), 2.32 (m, 2H), 2.05 (m, 6H), 1.67-1.25 (m, 44H), 0.88 (m, 9H).
Пример 7 - Синтез A11
A11 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 0,5 г маслянистого продукта. MS(ES): m/z (M+H)+ 713.62. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 5.10 (m, 1H), 4.05 (d, 4H), 4.03 (t, 4H), 3.54 (m, 2H), 3.43 (s, 2H), 3.16 (t, 2H), 3.10 (br, 4H), 2.32 (t, 4H), 1.66-1.27 (m, 50H), 0.88 (m, 9H).
Пример 8 - Синтез A12
A12 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 2,68 г маслянистого продукта. MS(ES): m/z (M+H)+ 591.56, 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 5.37-5.35 (m, 4H), 4.05 (t, 2H), 3.78 (t, 2H), 2.77 (t, 2H), 2.64 (m, 2H), 2.41 (bs, 4H), 2.31 (m, 2H), 2.03 (m, 4H), 1.68-1.25 (m, 44H), 0.88 (m, 6H).
Пример 9 - Синтез A13
A13 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 1,2 г маслянистого продукта. MS(ES): m/z (M+H)+ 825.74; 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 5.12 (m, 1H), 4.86 (m, 1H), 3.65-3.40 (m, 10H), 2.72 (br, 2H), 2.60 (br, 4H), 2.34-2.26 (m, 4H), 1.62-1.25 (m, 64H), 0.88 (m, 12H).
Пример 10 - Синтез A15
A15 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 0,4 г маслянистого продукта. MS(ES): m/z (M+H)+ 707.64. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 5.34 (m, 4H), 5.10 (m, 1H), 3.79 (t, 2H), 3.56-3.41 (m, 8H), 2.80 (t, 2H), 2.77 (t, 2H), 2.46 (br, 4H), 2.32 (m, 2H), 2.05 (m, 4H), 1.67-1.25 (m, 46H), 0.88 (m, 9H).
Пример 11 - Синтез A16
A16 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 0,59 г маслянистого продукта. MS(ES): m/z (M+H)+ 727.63. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 5.10 (m, 1H), 4.05 (dd, 2H), 3.77 (t, 2H), 3.54 (dd, 4H), 3.46-3.38 (m, 4H), 3.19 (t, 2H), 3.01 (br, 4H), 2.32 (t, 4H), 1.66-1.27 (m, 52H), 0.88 (m, 9H).
Пример 12 - Синтез A17
A17 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 1,1 г маслянистого продукта. MS(ES): m/z (M+H)+ 839.76; 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 5.12 (m, 1H), 4.86 (m, 1H), 3.79 (t, 2H), 3.55 (t, 4H), 3.41 (m, 4H), 2.67 (br, 2H), 2.44 (br, 4H), 2.32-2.26 (t, 4H), 1.62-1.25 (m, 66H), 0.88 (m, 12H).
Пример 13 - Синтез A18
A18 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 1,44 г маслянистого продукта. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 5.11 (t,2H), 3.57-3.37 (m, 18Н), 2.57 (t, 2H), 2.44 (t, 4H), 2.32 (m, 4H), 1.62-1.27 (m, 52H), 0.88 (m, 12H), MS(ES): m/z (M+H)+ 829.70.
Пример 14 - Синтез A19
A19 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 2,3 г маслянистого продукта. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 5.06 (t, 2H), 3.72 (t, 2H), 3.50-3.33 (m, 16H), 2.27 (t, 2H), 2.25-2.24 (m, 8H), 1.56-1.19 (m, 52H), 0.88 (m, 12H), MS(ES): m/z (M+H)+ 843.72.
Пример 15 - Синтез A20
A20 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 0,95 г маслянистого продукта. MS (ES):m/z (MH+) 821.75; 1H ЯМР (400 МГц, CDC13) δ:ppm: 5.29 (m, 4H), 4.03 (s, 2H), 3.51(t, 2H), 3.30-3.27 (m, 12H), 2.70 (m, 2H), 2.57 (t, 2H), 2.46 (br, 4H), 2.21 (m, 2H), 1.30 -1.19 (br.m, 52H), 0.89 (m, 12H).
Пример 16 - Синтез A21
A21 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 0,68 г маслянистого продукта. MS (ES): m/z (MH+) 835.76; 1H ЯМР (400 МГц, CDC13) δ:ppm: 5.35 (m, 4H), 4.10 (s, 2H), 3.79 (t, 2H), 3.30 (m, 12H), 2.76 (br,m, 4H), 2.50 (br, 4H), 2.28 (m, 2H), 2.05 (m, 4H), 1.61 (br, 4H), 1.57 (m, 4H), 1.54-1.24 (br.m, 54H), 0.88 (m, 12H).
Пример 17 - Синтез A22
A22 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 0,43 г маслянистого продукта. 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ:ppm: 4.03 (s, 2H), 3.98 (t, 2H), 3.72 (t, 2H), 3.28 (m, 12H), 2.65 (t, 2H), 2.45 (t, 4H), 2.25-2.20 (m, 4H), 1.66-1.19 (m, 60H), 0.83 (m, 12H), MS(ES):m/z (M+H)+ 855.75.
Пример 18 - Синтез A23
A23 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 1,8 г маслянистого продукта. 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ:ppm: 4.10 (s, 2H), 4.06 (t, 2H), 3.56 (t, 2H), 3.36-3.34 (m, 12H), 2.61 (t, 2H), 2.49 (t, 4H), 2.30 (m, 4H), 1.67-1.26 (m, 58H), 0.88 (m, 12H), MS(ES):m/z (M+H)+841.74.
Пример 19 - Синтез A24
A24 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 0,72 г маслянистого продукта. 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ:ppm: 4.10 (s, 4H), 3.67 (br, 2H), 3.35 (m, 24H), 2.80-2.50 (br, 6H), 2.28 (m, 4H), 1.67-1.23 (m, 68H), 0.89 (m, 18H). MS(ES): m/z (M+H)+ 1085.94.
Пример 20 - Синтез A25
A25 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 0,3 г маслянистого продукта. 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ:ppm: 5.23 (m, 1H), 5.05 (t, 1H), 4.11 (br, 4H), 3.78 (t, 2H), 3.49-3.34 (br,m, 16H), 3.15 (t, 2H), 3.01 (t, 4H), 2.26 (m, 2H), 2.10 (m, 2H), 2.01 (m, 2H), 1.79-1.18 (br,m, 52H), 0.83 (br,m, 12H), MS(ES): m/z (M+H)+ 842.73.
Пример 21 - Синтез A26
A26 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1, при этом получали 0,46 г маслянистого продукта. 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ:ppm: 5.03 (m, 2H), 3.75 (t, 2H), 3.48-3.34 (br,m, 16H), 2.91 (br, 2H), 2.72 (br, 4H), 2.27 (t, 4H), 1.85 (m, 2H), 1.58-1.10 (br,m, 48H), 0.81 (br,m, 6H), MS(ES): m/z (M+H)+ 787.65.
Пример 22 - Синтез A27
Cbz-1,3-пропилендиаминоктаноат синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 1. Cbz-1,3-пропилендиаминоктаноат (3,5 г, 5,9 ммоль), безводный карбонат натрия (0,94 г, 8,8 ммоль), KI (0,19 г 1,18 ммоль) растворяли в 30 мл абсолютного этанола и 30 мл абсолютного ацетонитрила, затем добавляли бромид и подвергали совместной реакции при 75°C в течение 24 ч. После завершения реакции растворитель удаляли путем концентрирования, реакционную смесь разбавляли 200 мл дихлорметана, промывали 200 мл воды, экстрагировали, органический слой сушили, концентрировали и пропускали через колонку с силикагелем для очистки (DCM : MeOH = 3% - 10%) с получением маслянистого Cbz-аминного продукта. Cbz-амин (2,1 г, 2,43 ммоль) растворяли в 20 мл абсолютного метанола и 20 мл этилацетата, затем добавляли палладий (0,35 г, 10%), после трехкратной замены водорода гидрирование происходило при комнатной температуре в течение 20 ч. После завершения реакции палладий удаляли фильтрованием, растворитель концентрировали и удаляли, экстрагировали и получали аминный продукт. Полученный аминный продукт (1,1 г, 1,51 ммоль) растворяли в 20 мл абсолютного этанола, добавляли кетон-метиламин (0,22 г, 1,51 ммоль), раствор перемешивали и подвергали реакции при комнатной температуре в течение 20 ч. После завершения реакции растворитель концентрировали и удаляли, фильтрат сушили, концентрировали и пропускали через колонку с силикагелем для очистки (DCM:MeOH = 3% - 10%) с получением A27 (0,6 г маслянистого продукта). 1H ЯМР (d-DMSO) δ:ppm: 4.99 (p, 1H), 3.98 (t, 2H), 3.50-3.31 (m, 8H), 3.10 (d, 3H), 2.49 (dt, 8H), 2.26 (m, 4H), 1.52 (dd, 6H), 1.43 (m, 6H), 1.26 (m, 40H), 0.84 (m, 9H), MS(ES):m/z (M+H)+ 835.66.
Пример 23 - Синтез A28
A28 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 22, при этом получали 1,3 г маслянистого продукта. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 5.04 (t, 2H), 3.61 (t, 2H), 3.50-3.31 (m, 16H), 3.21 (s, 3H), 2.71 (t, 2H), 2.55 (t, 4H), 2.28-2.24 (m, 4H), 1.86-1.19 (m, 54H), 0.82 (m, 12H), MS(ES): m/z (M+H)+951.75.
Пример 24 - Синтез A29
A29 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 22, при этом получали 0,11 г маслянистого продукта. 1H ЯМР (d-DMSO) δ:ppm: 5.00 (m, 2H), 3.60-3.30 (m, 16H), 3.11 (s, 3H), 2.63-2.49 (m, 10H), 2.36 (m, 2H), 2.26 (m, 4H), 1.80 (m, 2H), 1.46-1.26 (m, 54H), 0.85 (t, 12H), MS(ES): m/z (M+H)+ 1103.81.
Пример 25 - Синтез A30
A30 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 22, при этом получали 0,34 г маслянистого продукта. 1H ЯМР (d-DMSO) δ:ppm: 4.99 (m, 4H), 3.60-3.30 (m, 32H), 2.63-2.40 (m, 20H), 2.25 (m, 8H), 1.80-1.20 (m, 110H), 0.81 (m, 24H), MS(ES): m/z (M+H)+ 1915.5.
Пример 26 - Синтез A31
A31 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 22, при этом получали 0,7 г маслянистого продукта. 1H ЯМР (d-DMSO) δ:ppm: 5.05 (m, 2H), 3.60-3.30 (m, 20H), 2.63-2.40 (m, 12H), 2.2 (m, 6H), 1.80-1.20 (m, 64H), 0.85 (m, 12H), MS(ES): m/z (M+H)+ 1134.95.
Пример 27 - Синтез A32
A32 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 22, при этом получали 1,5 г маслянистого продукта. 1H ЯМР (d-DMSO) δ:ppm: 5.1 (m, 2H), 3.60-3.30 (m, 24H), 2.5 (m, 4H), 2.4 (m, 4H), 2.3 (m, 4H), 2.2 (m, 6H), 1.95 (m, 2H), 1.8 (m, 2H), 1.5-1.6 (m, 8H), 1.2-1.4 (m, 48H), 0.9 (m, 8H), MS(ES): m/z (M+H)+ 1174.88.
Пример 28 - Синтез A34
Промежуточный алкинильный липид синтезировали с использованием стадий реакции, аналогичных примеру 1. Сложный бромоксиэфир (11 г), карбонат натрия (2,5 г), KI (0,4 г) растворяли в 50 мл ацетонитрила, добавляли алкинамин (0,65 г). После завершения реакции реакционную смесь концентрировали для удаления ацетонитрила, перемешивали и экстрагировали 150 мл этилацетата и воды, органический слой сушили, концентрировали и пропускали через колонку с силикагелем для очистки (PE:EA = 10:1-5:1) с получением алкинильного промежуточного липида.
Стадии получения A34: соединение 3-азидопропанол-1 (0,5 г), безводный сульфат меди (0,15 г), аскорбат натрия (0,24 г) и алкинильное соединение (0,08 г) растворяли в 10 мл THF и 10 мл воды, после протекания реакции при комнатной температуре реакционную смесь концентрировали для удаления THF, разбавляли 100 мл дихлорметана, фильтровали для удаления нерастворенного материала, фильтрат перемешивали и экстрагировали водой, органический слой сушили, концентрировали и пропускали через колонку с силикагелем для очистки (DCM:MeOH = 1%-2%) с получением 0,39 г A34. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 7.56 (s, 1H), 5.12 (p, 2H), 4.50 (m, 2H), 3.77 (s, 2H), 3.62-3.43 (m, 18H), 2.44 (s, 4H), 2.32 (t, 4H), 2.13 (tt, 2H), 1.70-1.50 (m, 16H), 1.26(m, 36H), 0.87 (m, 12H); MS(ES): m/z (M+H)+ 925.37.
Пример 29 - Синтез A35
A35 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 28, при этом получали 2,2 г продукта. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 7.50 (d, 1H), 5.11 (p, 2H), 4.45 (t, 2H), 3.77 (s, 2H), 3.68-3.43 (m, 20H), 2.82 (t, 2H), 2.49 (m, 4H), 2.41 (s, 4H), 2.32 (t, 4H), 1.70-1.50 (m, 20H), 1.26 (m, 32H), 0.88 (m, 12H); MS(ES): m/z (M+H)+ 980.45.
Пример 30 - Синтез A36
A36 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 28, при этом получали 2,4 г продукта. 1H ЯМР (500 МГц, DMSO) δ: ppm: 7.86 (s, 1H), 5.00 (p, J = 5.2 Гц, 2H), 4.41 (t, J = 6.3 Гц, 2H), 3.62 (s, 2H), 3.55 – 3.41 (m, 10H), 3.42 – 3.35 (m, 8H), 2.68 (d, J = 5.9 Гц, 4H), 2.36 (s, 4H), 2.32 – 2.27 (m, 4H), 2.25 (t, J = 7.3 Гц, 4H), 1.55 – 1.48 (m, 4H), 1.46 – 1.43 (m, 6H), 1.41 – 1.36 (m, 4H), 1.25 (dd, J = 16.2, 4.5 Гц, 38H), 1.10 (s, 1H), 0.84 (t, J = 6.9 Гц, 12H). MS(ES):m/z (M+H)+ 979.47.
Пример 31 - Синтез A37
A37 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 28, при этом получали 1,7 г продукта. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 7.59 (d, 1H), 5.10 (p, 2H), 4.46 (t, 2H), 3.75 (s, 2H), 3.75-3.43 (m, 20H), 2.94-2.87 (t, 4H), 2.69-2.43 (m, 4H), 2.41 (s, 4H), 2.33 (t,4H), 1.70-1.50 (m, 22H), 1.26 (m, 32H), 0.88 (m, 12H); MS(ES): m/z (M+H)+ 1037.54.
Пример 32 - Синтез A38
A32 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 28, при этом получали 2,5 г продукта. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 7.53 (d, 1H), 5.11 (p,2H), 4.42 (t,2H), 3.76 (s, 2H), 3.68-3.41 (m, 20H), 2.83 (t, 2H), 2.49 (s, 6H), 2.32 (t, 4H), 1.70-1.50 (m, 20H), 1.26 (m, 32H), 0.87(m, 12H); MS(ES): m/z (M+H)+ 953.45.
Пример 33 - Синтез A39
A39 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 28, при этом получали 1,7 г продукта. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 7.59 (d,1H), 5.11 (p,2H), 4.47 (t,2H), 3.73 (s,2H), 3.70-3.41 (m,24H), 2.78 (t,2H), 2.51 (4,4H), 2.42 (m,2H),2.32 (t,4H), 1.59-1.25 (m,59H),0.87 (m,12H); MS(ES): m/z (M+H)+ 1036.56.
Пример 34 - Синтез A40
A40 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 28, при этом получали 1,4 г продукта. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 7.53 (d,1H), 5.11 (p,2H), 4.47 (t,2H), 3.72 (s,2H), 3.70-3.40 (m,22H), 2.66 (t,2H), 2.65-2.55 (m,6H), 2.32 (t,4H), 1.59-1.25 (m,44H), 0.87 (m,12H); MS(ES): m/z (M+H)+ 1052.54.
Пример 35 - Синтез A42
Содержащее алкинильную группу промежуточное липидное соединение синтезировали с использованием стадий реакции, аналогичных примеру 1. Сложный эфир бромоксиэфира (10,6 г), карбонат натрия (2,42 г), KI (0,4 г) растворяли в 50 мл ацетонитрила, добавляли бензилаланин (2,04 г), после окончания реакции, протекающей при кипячении с обратным холодильником, реакционную смесь концентрировали для удаления ацетонитрила, перемешивали и экстрагировали этилацетатом и водой, органический слой сушили, концентрировали и пропускали через колонку с силикагелем для очистки (DCM:MeOH = 2% -3%) с получением 7,5 г A42-I.
Промежуточное соединение A42-I (2 г), палладий на угле (0,5 г) растворяли в 50 мл метанола, после окончания реакции гидрирования при комнатной температуре реакционную смесь фильтровали для удаления палладия на угле, фильтрат сушили, концентрировали с получением 1,7 г A42-II.
Стадии получения A42: промежуточное соединение A42-II (1,5 г), DCC (0,54 г), DMAP (0,21 г) растворяли в 50 мл дихлорметана, добавляли морфолинэтанол (0,23 г), после окончания реакции при комнатной температуре реакционную смесь перемешивали и экстрагировали дихлорметаном и водой, органический слой сушили, концентрировали и пропускали через колонку с силикагелем для очистки (DCM:MeOH = 1%-3%) с получением 1,1 г A42. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 5.12 (p,2H), 4.41 (t,2H), 3.76 (t,2H), 3.55-3.40 (m,20H), 3.01-2.76 (m,10H), 2.49 (t,6H), 2.32 (t,4H), 1.59-1.25 (m,52H), 0.87 (m,12H); MS(ES): m/z (M+H)+ 971.44.
Пример 36 - Синтез A43
A43 синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 35, с получением 0,5 г продукта. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 5.12 (p, 2H), 4.41 (t, 2H), 3.76 (t, 2H), 3.55-3.40 (m, 20H), 3.01-2.76 (m, 10H), 2.49 (t, 2H), 2.32 (t, 4H), 1.59-1.25 (m, 54H), 0.87 (m, 12H); MS(ES): m/z (M+H)+ 942.44.
Пример 37 - Синтез A44
Boc-защищенное промежуточное соединение пиперазин-этанольного сложного эфира синтезировали согласно примеру 35.
Стадии получения A44: Boc-защищенное промежуточное соединение пиперазин-этанольного сложного эфира (1,1 г) растворяли в 200 мл 2 моль/л гидроэтанола, после окончания реакции при комнатной температуре реакционную смесь сушили, концентрировали с получением 0,8 г A44. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 5.10 (p, 2H), 4.35 (t, 2H), 3.60-3.40 (m, 18H), 3.01-2.85 (m, 6H), 2.65-2.50 (t, 10H), 2.32 (t, 4H), 1.59-1.25 (m, 52H), 0.87 (m,12H); MS(ES): m/z (M+H)+ 970.45
Пример 38 - Синтез A45
A44 синтезировали с использованием стадий реакции, аналогичных примеру 37. [121] Стадии получения A45: A44 (1,6 г), карбонат натрия (0,17 г), KI (0,054 г) растворяли в 50 мл ацетонитрила, добавляли бромэтанол (0,2 г), после окончания реакции, проводимой при кипячении с обратным холодильником, реакционную смесь концентрировали для удаления ацетонитрила, перемешивали и экстрагировали этилацетатом и водой, органический слой сушили, концентрировали и пропускали через колонку с силикагелем для очистки (DCM:MeOH = 3%-5%) с получением 1,1 г A45. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 5.10 (p, 2H), 4.35 (t, 2H), 3.60-3.40 (m, 18H), 3.32 (t,2H), 3.01-2.90 (m, 6H), 2.53 (t, 2H), 2.49-2.35 (t, 10H), 2.32 (t, 4H), 1.59-1.25 (m, 52H), 0.87 (m, 12H); MS(ES): m/z (M+H)+ 1014.50.
Пример 39 - Синтез A46
A42-II синтезировали, используя стадии реакции, аналогичные примеру 35.
Стадии получения A46-I: A42-II (1,5 г), DCC (0,39 г), PFP-OH (0,35 г) растворяли в 50 мл дихлорметана, после окончания реакции при комнатной температуре реакционную смесь концентрировали для удаления DCM, разбавляли этилацетатом, фильтровали для удаления белого нерастворенного вещества, перемешивали и экстрагировали 10% раствором карбоната натрия, органический слой сушили, концентрировали и пропускали через колонку с силикагелем для очистки (DCM:MeOH = 1%-3%) с получением 1,2 г A46-I.
Стадии получения A46-II: моно Boc-диаминодипропиламин (0,23 г), DIEA (0,19 г), A46-I (1 г) растворяли в 20 мл дихлорметана, после окончания реакции при комнатной температуре добавляли дихлорметан и раствор карбоната натрия, перемешивали и экстрагировали, органический слой сушили, концентрировали и пропускали через колонку с силикагелем для очистки (DCM:MeOH = 1%-3%) с получением 0,8 г A46-II. [125] Стадии получения A46: A46 синтезировали аналогично стадиям получения A44 в примере 37. 1H ЯМР (CDCl3) δ:ppm: 5.10 (p, 2H), 3.60-3.40 (m, 18H), 3.37 (t, 2H), 2.70-2.55 (m, 10H), 2.50 (t, 2H), 2.32 (t, 4H), 1.72 (m, 4H), 1.59-1.25 (m, 52H), 0.87 (m, 12H); MS(ES): m/z (M+H)+ 971.48.
Пример 40 - Синтез A47
Стадии получения A47-I: A47-I синтезировали в соответствии со стадиями, используемыми для получения A42-I в примере 35.
Стадии получения A47-II: A47-II синтезировали в соответствии со стадиями, используемыми для получения A42-II в примере 35.
Стадии получения A47-III: A47-III синтезировали в соответствии со стадиями, используемыми для получения A46-I в примере 39.
Стадии получения A47-IV: A47-IV синтезировали в соответствии со стадиями, используемыми для получения A46-II в примере 39.
Стадии получения A47: 1,1 г A47 синтезировали в соответствии со стадиями, используемыми для получения A44 в примере 37. 1H ЯМР (400 МГц, CD3OD) δ:ppm: 5.10 (m, 2H), 3.53 (m, 8H), 3.44 (m, 9H), 3.20-3.0 (m, 16H), 2.34 (t, 4H), 2.09 (m, 4H), 1.98 (dt, 4H), 1.84 (dd, 4H), 1.71 (s, 4H), 1.63 (dd, 4H), 1.53 (m, 8H), 1.40-1.20 (m, 40H), 0.88 (m, 12H); MS(ES):m/z (M+H)+1071.65.
Пример 41 - Синтез A48
Стадии получения A48-I: A48-I синтезировали в соответствии со способами, используемыми для получения A42-I в примере 35.
Стадии получения A48-II: A48-II синтезировали в соответствии со способами, используемыми для получения A42-II в примере 35.
Стадии получения A48-III: A48-III синтезировали в соответствии со способами, используемыми для получения A46-II в примере 39.
Стадии получения A48: 0,5 г A48 синтезировали в соответствии со способами, используемыми для получения A44 в примере 37. 1H ЯМР (400 МГц, CD3OD) δ:ppm: 7.78 (m, 7H), 5.08 (m, 8H), 3.87 (m, 1H), 3.0-2.91 (m, 2H), 2.71 (m, 4H), 2.50 (m, 12H), 1.84 (dd, 4H), 1.71(m, 4H), 1.63-1.53 (m, 12H), 1.40-1.20 (m, 36H), 0.88 (m, 6H); MS(ES):m/z (M+H)+ 799.35
Сравнительные примеры - MC3, A2, A3, A4, A8 и A33
MC3, A2, A3, A4, A8 и A33 использовали для сравнительного примера. Поскольку MC3, A2, A3, A4, A8 и A33 являются известными катионными липосомами, способы их синтеза в настоящем документе не описываются. Структуры MC3, A2, A3, A4, A8 и A33 показаны ниже:
MC3
A2
A3
A4
A8
A33
Пример 42 - Получение липидных наночастиц
Липидные наночастицы получали с использованием следующих ингредиентов: (1) ионизируемое липидное соединение, коммерчески доступное или синтезированное, например MC3 (приобретенное у фирмы Avanti), A1-A33 синтезировали на собственном предприятии; (2) фосфолипид (например, DOPE или DSPC, приобретенный у фирмы Avanti); (3) PEG-липид (например, PEG-DMG, приобретенный у фирмы Avanti или синтезированный на собственном предприятии); (4) структурный липид (например, холестерин, приобретенный у фирмы Sigma-Aldrich); (5) эффективный состав/активный ингредиент (например, мРНК люциферазы, siRNA, мРНК S-белка SARS-CoV-2, мРНК Cas 9 и т.д.)
Способ получения и инкапсулирования: (1) ионизируемый липид, фосфолипид, пегилированный липид и структурный липид растворяли и смешивали в этаноле при 50%, 10%, 1,5% и 38,5% последовательно и соответственно; (2) микрожидкостный чип или смеситель Т-типа использовали для равномерного смешивания липидной смеси и активного ингредиента (мРНК) в соотношении 1:3 с получением липидных наночастиц. Процент инкапсулирования отражает степень инкапсулирования инкапсулированного вещества. Чем выше процент инкапсулирования, тем меньше вероятность разложения инкапсулированного вещества во время доставки in vivo.
Таблица 1. Характеристики ионизируемого липида и его липидной наночастицы
Пример 43 - Эксперименты для подтверждения эффективности трансфекции
Наночастицу, инкапсулированную различными соединениями катионных липидов и мРНК люциферазы в соответствии со способом в примере 42, тестировали на интенсивность флуоресценции или общее количество фотонов мРНК люциферазы, инкапсулированной различными LNP.
Экспериментальное животное: мыши SPF линии BALB/c, самки в возрасте 6-8 недель, массой тела 18-22 г были приобретены у Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd., с лицензией на производство: SXCK (JING) 2016-0006. Все животные содержались на адаптивном питании в течение более 7 дней перед экспериментами, имели свободный доступ к пище и воде в течение периода эксперимента, освещение 12/12 ч с чередованием света и темноты, комнатная температура 20-26°C, влажность 40-70%.
Методика эксперимента: самкам мышей BALB/c вводили различные LNP с инкапсулированной мРНК люциферазы четырьмя различными способами, включающими подкожную инъекцию (под подмышкой), инъекцию в хвостовую вену, внутрибрюшинную инъекцию, внутримышечную инъекцию (передняя большеберцовая мышца задней лапы мыши); через 3, 6, 24, 48 часов после введения использовали систему визуализации флуоресценции in vivo (торговая марка: Bruker, модель: XTREME) для обнаружения биолюминесценции, при этом конкретные стадии представляли собой следующие: подготовка субстрата: брали надлежащее количество субстрата Luciferin (торговая марка: Promega) и добавляли солевой раствор для приготовления раствора 10 мг/мл, избегая света, каждой мыши внутрибрюшинно вводили 100 мкл раствора. Мыши свободно двигались в течение 5-10 мин после введения субстрата, затем их помещали в бокс для анестезии и использовали 2,5% изофлуран для анестезии. Находящуюся под наркозом мышь помещали в камеру, устанавливали параметры биолюминесценции и делали снимки, а затем регулировали верхние и нижние параметры снимка, затем собирали данные по концентрированному распределению флуоресценции (например, интенсивность флуоресценции, среднее количество фотонов и общее количество фотонов) и обрабатывали данные. Статистический анализ: результат визуализации in vivo был показан в виде интенсивности флуоресценции или среднего общего количества фотонов у разных животных в одной и той же тестируемой группе, которые использовали для определения того, была ли высокой или низкой интенсивность флуоресценции или общее количество фотонов мРНК люциферазы, инкапсулированной различными LNP.
Интенсивность флуоресценции и общее количество фотонов отражают эффективность трансфекции LNP, при этом более высокое значение относится к более высокой эффективности доставки инкапсулированного вещества в клетку посредством LNP.
Таблица 2. Экспрессия люциферазы, индуцированная наночастицами на основе ионизируемого липида A1-A9
Примечание: способ введения: (1) внутримышечная инъекция; (2) инъекция в хвостовую вену; доза: 10 мкг/мышь; время обнаружения: 3, 6 и 24 ч после введения.
Таблица 3. Экспрессия люциферазы, индуцированная наночастицами на основе ионизируемого липида A18-A33
Примечание: способ введения: внутримышечная инъекция; доза: 1 мкг/мышь; время обнаружения: 3, 6 и 24 ч после введения.
Таблица 4. Экспрессия люциферазы, индуцированная наночастицами на основе ионизируемого липида A20-A25, A33.
Примечание: способ введения: внутримышечная инъекция; доза: 5 мкг/мышь; время обнаружения: 3, 6 и 24 ч после введения.
Пример 44 - Оценка безопасности LNP
Крыс линии Wistar, включая 4 самца и 4 самки, с разницей в массе тела не более 10%, отбирали и произвольно разделяли на две группы: контрольную группу, получающую растворитель, и группу, получающую тестируемое вещество. A18 использовали в группе, получающей тестируемое вещество, и условия инкапсуляции и размер препарата LNP показаны в таблице 5. При измерении использовали концентрацию 2 мг/мл. Каждое животное инъецировали 3 раза в день, при этом объем каждой инъекции составил 250 мкл. Интервал между введениями составил 4 часа. Введение выполняли попеременно в левую и правую ногу. Общий уровень дозы составил 1,50 мг на крысу, что в 1200 раз превышало максимальный уровень дозы на единицу массы тела для человека (при условии, что максимальный уровень дозы для человека составляет 0,25 мг). Клиническое наблюдение регистрировали следующим образом. В течение 24 часов после введения клиническое наблюдение осуществляли каждый час. В период 24-72 часов после введения клиническое наблюдение осуществляли каждые 6 часов. В период 4-14 дней после введения клиническое наблюдение осуществляли 1 раз в сутки. Регистрировали симптомы токсичности, время появления и исчезновения симптомов, и время смерти (если таковая имела место). Массу тела регистрировали один раз в день после введения, и потребление пищи регистрировали каждые 2 дня после введения. Через 14 дней после введения всех оставшихся животных взвешивали, затем умерщвляли и извлекали основные органы путем препарирования. Взвешивали сердце, печень, селезенку, легкие, почки, тимус, лимфатический узел и рассчитывали относительную массу органа (масса органа/масса тела субъекта Ч 100%; также известная как коэффициент органа). После препарирования сердце, печень, селезенку, легкие, почки, кишечник, тимус, лимфатический узел, мышечную ткань в месте инъекции и другие органы с наблюдаемыми патологическими изменениями сохраняли в фиксирующем растворе, и патологию каждого органа исследовали по окрашиванию H&E. Баллы тяжести поражения присваивали в соответствии с таблицей ниже.
Таблица 5. Условие инкапсуляции и размер препарата LNP
Результаты изменения массы тела показаны на фиг. 1-2. В частности, масса тела самцов крыс в контрольной группе, получавшей растворитель, продолжала увеличиваться. Масса тела крыс в группе, получавшей тестируемое вещество, сначала снизилась, затем восстановилась до уровня до введения на 4-й - 6-й день и впоследствии продолжила увеличиваться. Результаты изменений в потреблении корма показаны на фиг. 3-4. Потребление корма на крысу в контрольной группе, получавшей растворитель, в течение 24 часов было стабильным, находясь в диапазоне 18-35 грамм. Первоначальное потребление корма крысами в группе, получавшей тестируемое вещество, первоначально снизилось и вернулось к нормальным уровням на 4-й - 7-й день. Результаты относительной массы органов показаны в таблице 6. По сравнению с контрольной группой, получавшей растворитель, коэффициенты для сердца, печени, почек, селезенки, тимуса и лимфатических узлов у крыс в группе, получавшей тестируемое вещество, не показали значительного различия. Результаты гистологических изменений показаны в таблице 8. По сравнению с крысами в контрольной группе, получавшей растворитель (один самец и одна самка), в сердце, печени, почках, селезенке, тимусе и лимфатических узлах у крыс в группе, получавшей тестируемое вещество, патологических изменений не было. Для группы, получавшей тестируемое вещество, не было других аномальных патологических изменений, за исключением пролиферации частичных интерстициальных клеток в легких и небольшого количества инфильтрации воспалительных клеток в мышечной ткани. Основываясь на приведенных выше результатах, у крыс наблюдались лишь незначительные патологические изменения в легких и ногах после введения в 1200 раз превышающей дозы LNP.
Таблица 6. Тест на острую токсичность LNP у крыс (относительная масса органа)
чень
па носит.
0,004
0,144
0,045
0,029
0,010
0,006
0,038
0,001
0,127
0,013
0,212
0,029
0,048
0,015
0,025
0,024
0,006
0,142
Всего: средняя относительная масса органов самца, самки крысы.
Таблица 7. Стандарт оценки тяжести поражения
(отсутствуют)
(минимальные)
(легкие)
(умеренные)
(тяжелые)
(серьезные)
Таблица 8. Гистопатологические результаты теста на острую токсичность LNP у крыс
це
чень
ка
Примечание: «-» означает отсутствие отклонений от нормы.
Пример 45 - Изучение иммунитета, вызываемого мРНК, инкапсулированной в LNP
мРНК S-белка SARS-CoV-2 получали in vitro методом транскрипции T7 с использованием липидных наночастиц, инкапсулированных ионизируемым липидом A7, A18 и A33, в соответствии со способом синтеза, описанным в примере 42, и в таблице 9 показаны условия их инкапсулирования, процент инкапсулирования и размер.
Таблица 9. Результат инкапсулирования
Программа иммунизации:
3 полученных препарата LNP использовали в тесте иммунизации мышей BALB/c. Эксперимент проводили следующим образом. Самкам мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель (9 мышей в каждой группе) дважды вводили препараты LNP в день 0 и день 14 путем внутримышечной инъекции. Объем инъекции составил 50 мкл. Через 7 дней селезенки мышей изолировали для отделения лимфоцитов селезенки. Т-лимфоциты, секретирующие INFγ, детектировали методом ELISPOT (метод иммуноферментных пятен от англ. Enzyme-linked Immune Absorbent Spot), и результат показан в таблице 10, иллюстрирующей, что мРНК индуцировала более сильный клеточный иммунный ответ у мышей BALB/c. Через 14 дней после второй иммунизации специфическое антитело IgG к S-белку детектировали с помощью непрямого ELISA. ЕС50 антител IgG рассчитывали путем подгонки кривых титров антител, как показано на фиг. 5. Результаты показали, что все A7, A18 и A33 индуцировали более высокие титры антител IgG у мышей BALB/c. [147] Специфическую процедуру ELISPOT проводили в соответствии с инструкциями к набору Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit.
Таблица 10. Количество Т-лимфоцитов, секретирующих INFγ, после введение различных препаратов LNP, рассчитанное при помощи ELISPOT
Конкретная процедура непрямого ELISA для определения титра специфических к S-белку IgG-антител:
1. внесение покровного антигена: S-белок разбавляли до 2 нг/мкл покрывающим буфером, 100 мкл/лунку, покрывали в течение ночи при 4°C;
2. промывали планшет 3 раза 1X PBST, каждый раз промывали 5 мин;
3. блокировали блокирующим 1% раствором BSA, 200 мкл/лунку, и оставляли отстаиваться в течение 1 часа при 37°C;
4. промывали планшет 3 раза 1X PBST, каждый раз промывали 5 мин;
5. тестируемую сыворотку разбавляли буфером для разбавления путем двойного разбавления, 100 мкл/лунку, инкубировали в течение 1 ч при 37°C, и устанавливали контрольную группу отрицательной сыворотки и бланковую (пустую) контрольную группу без сыворотки;
6. промывали планшет 3 раза 1X PBST, каждый раз промывали 5 мин;
7. вторичные антитела против IgG разбавляли 1:1000, 100 мкл/лунку, инкубировали в течение 1 ч при 37°C;
8. промывали планшет 3 раза 1X PBST, каждый раз промывали 5 мин;
9. добавляли свежий раствор хромогена TMB, 100 мкл/лунку, инкубировали в течение надлежащего времени при 37°C;
10. добавляли 2 моль/л раствора серной кислоты для терминации, 50 мкл/лунку.
11. использовали меченый ферментом инструмент для измерения поглощения при 450 нм (OD450).
ELISA для обнаружения антител
Обнаружение антител через 14 дней после первой иммунизации
1. образец: мышиная сыворотка, полученная через 14 дней после первой иммунизации в группе, подвергнутой иммунизации, в контрольной группе, получавшей растворитель, смешанная сыворотка от 6 мышей в каждой группе;
2. антигенный белок: S-белок (R683A, R685A) SARS-CoV-2 (COVID-19), His Tag (SPN-C52H4);
3. покровный антигенный белок: 2 нг/мкл, 100 мкл/лунку;
4. вторая иммунизация: козий антимышиный IgG (H+L), конъюгат с HRP, разведение 1:1000.
Обнаружение антител через 14 дней после второй иммунизации.
1. образец: мышиная сыворотка, полученная через 14 дней после второй иммунизации в группе, подвергнутой иммунизации, в контрольной группе, получавшей растворитель, смешанная сыворотка от 6 мышей в каждой группе;
2. антигенный белок: S-белок (R683A, R685A) SARS-CoV-2 (COVID-19), His Tag (SPN-C52H4);
3. покрывной антигенный белок: 2 нг/мкл, 100 мкл/лунку;
4. вторая иммунизация: козий антимышиный IgG (H+L), конъюгат с HRP, разведение 1:1000;
5. результат показан на фиг. 5.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СОЕДИНЕНИЯ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ДОСТАВКИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ АГЕНТОВ | 2018 |
|
RU2798342C2 |
| ОКИСЛЕННЫЕ ЛИПИДЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И НАРУШЕНИЙ | 2004 |
|
RU2362567C2 |
| ФУЗОГЕННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ДОСТАВКИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ МОЛЕКУЛ | 2018 |
|
RU2808990C2 |
| ОКИСЛЕННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ЛИПИДОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2009 |
|
RU2532546C2 |
| СОЕДИНЕНИЯ И КОМПОЗИЦИИ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ ЭНДОСОМАЛЬНЫХ TOLL-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ | 2017 |
|
RU2759678C2 |
| СОЕДИНЕНИЯ НА ОСНОВЕ ПЛАТИНЫ И ЛИПИДОВ И НАНОЧАСТИЦЫ | 2014 |
|
RU2737735C2 |
| СОЕДИНЕНИЯ НА ОСНОВЕ ПЛАТИНЫ И ЛИПИДОВ И НАНОЧАСТИЦЫ | 2014 |
|
RU2679896C2 |
| СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ НАЦЕЛЕННОЙ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА И УСИЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ siPHK | 2012 |
|
RU2632888C2 |
| ЛИПИДНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА IN VIVO И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2020 |
|
RU2799045C1 |
| СОЕДИНЕНИЯ ПИПЕРИДИНИЛА, СЕЛЕКТИВНО СВЯЗЫВАЮЩИЕ ИНТЕГРИНЫ | 2003 |
|
RU2333210C2 |
Изобретение относится к соединению следующей формулы (II) или формулы (III), или соединению, представляющему собой одно из A7, A9, A10, A12, A15, A20, A21, A22, A23, A24, A27, A30, A31, A32 и A48, которые могут найти применение в композициях для введения фармацевтических препаратов на основе нуклеиновых кислот, таких как мРНК и миРНК. В формулах (II) и (III) R1 выбран из -R1’-X, R1’ представляет собой -(CH2)0-6- и X представляет собой гидроксил, C(O)O(CH2)1-3NRaRb, -C(O)NH(CH2)1-3NRaRb, NHC(O)(CH2)1-3NRaRb, -NHC(O)CH(NRaRb)(CH2)1-3NRaRb или 5-6-членный гетероарил, содержащий 1-3 гетероатома, независимо выбранных из N, при этом указанный гетероарил необязательно замещен следующими группами: -(CH2)1-3OH, -(CH2)1-3NRaRb и -(CH2)1-3C(O)NRaRb; или X также может представлять собой 
или 
Ra и Rb независимо выбраны из H, C1-3-алкила, -(CH2)1-3NH2 и (CH2)1-3NH(CH2)1-3NH2; или Ra и Rb вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5-10-членный гетероцикл, который включает 1-3 гетероатома, выбранных из N или O, при этом указанный гетероцикл необязательно замещен C1-6-алкилгидроксилом; каждый M независимо выбран из C(O)O- или -C(O)NH-; каждый R’ независимо выбран из C1-10-алкила или C3-12-алкенила; каждый R* независимо выбран из C1-10-алкила; n и m независимо выбраны из целого числа в диапазоне от 1 до 9. Изобретение относится также к композициям, содержащим указанное ионизируемое липидное соединение, и способу получения липидной наночастицы на его основе. 4 н. и 37 з.п. ф-лы, 5 ил., 10 табл., 45 пр.
1. Соединение следующей формулы (II) или формулы (III), или соединение представляет собой одно из A7, A9, A10, A12, A15, A20, A21, A22, A23, A24, A27, A30, A31, A32 и A48:
где R1 выбран из -R1’-X,
R1’ представляет собой -(CH2)0-6- и X представляет собой гидроксил, C(O)O(CH2)1-3NRaRb, -C(O)NH(CH2)1-3NRaRb, NHC(O)(CH2)1-3NRaRb, -NHC(O)CH(NRaRb)(CH2)1-3NRaRb или 5-6-членный гетероарил, содержащий 1-3 гетероатома, независимо выбранных из N, при этом указанный гетероарил необязательно замещен следующими группами: -(CH2)1-3OH, -(CH2)1-3NRaRb и -(CH2)1-3C(O)NRaRb; или X также может представлять собой
или 
Ra и Rb независимо выбраны из H, C1-3-алкила, -(CH2)1-3NH2 и (CH2)1-3NH(CH2)1-3NH2; или Ra и Rb вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5-10-членный гетероцикл, который включает 1-3 гетероатома, выбранных из N или O, при этом указанный гетероцикл необязательно замещен C1-6-алкилгидроксилом;
каждый M независимо выбран из C(O)O- или -C(O)NH-;
каждый R’ независимо выбран из C1-10-алкила или C3-12-алкенила;
каждый R* независимо выбран из C1-10-алкила;
n и m независимо выбраны из целого числа в диапазоне от 1 до 9;
2. Соединение по п. 1, где R1’ представляет собой -(CH2)2-3-, X представляет собой гидроксил, -C(O)O(CH2)2-3NRaRb, C(O)NH(CH2)2-3NRaRb или 5-6-членный гетероарил, содержащий 1-3 гетероатома, независимо выбранных из N, где указанный гетероарил необязательно замещен следующими группами: -(CH2)2-3OH, -(CH2)2-3NRaRb, -(CH2)2-3C(O)NRaRb; или X может представлять собой
или 
;
Ra и Rb независимо выбраны из H, C1-3-алкила, -(CH2)2-3NH2 или (CH2)2-3NH(CH2)2-3NH2; или Ra и Rb вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5-10-членный гетероцикл, включающий 1-3 гетероатома, выбранных из N или O, при этом указанный гетероцикл необязательно замещен C1-6-алкилгидроксилом.
3. Соединение по п. 1, где в формуле (II) каждый R* независимо выбран из C2-10-алкила.
4. Соединение по п. 1, где в формуле (II) каждый R* независимо выбран из C6-10-алкила.
5. Соединение по п. 1, где в формуле (II) каждый R* независимо выбран из C6-алкила.
6. Соединение по любому из пп. 1-5, где каждый М независимо выбран из -C(O)O-.
7. Соединение по любому из пп. 1-5, где R1 выбран из -R1’-X, R1’ представляет собой -(CH2)1-6- и X представляет собой гидроксил.
8. Соединение по любому из пп. 1-5, где R1 выбран из -R1’-X, R1’ представляет собой -(CH2)1-6- и X представляет собой C(O)O(CH2)2-3NRaRb или -C(O)NH(CH2)2-3NRaRb,
Ra и Rb независимо выбраны из H, C1-3-алкила, -(CH2)2-3NH2; или Ra и Rb вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5-10-членный гетероцикл, содержащий 1-3 гетероатома, выбранных из N или O, при этом указанный гетероцикл необязательно замещен C1-6-алкилгидроксилом.
9. Соединение по п. 8, где Ra и Rb вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют морфолинил или пиперидинил.
10. Соединение по любому из пп. 1-5, где R1 выбран из R1'-X, R1' представляет собой -(CH2)1-6-, X представляет собой 5-6-членную гетероароматическую группу, содержащую 1-3 гетероатома, независимо выбранных из N, при этом указанная гетероароматическая группа необязательно замещена следующими группами: -(CH2)2-3OH, -(CH2)2-3NRaRb, -(CH2)2-3C(O)NRaRb,
Ra и Rb независимо выбраны из H, C1-3-алкила, -(CH2)2-3NH2, -(CH2)2-3NH(CH2)2-3NH2 или Ra и Rb вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5-10-членный гетероцикл, содержащий 1-3 гетероатома, выбранных из N или O, при этом указанный гетероцикл необязательно замещен следующими группами: C1-6-алкилгидроксил.
11. Соединение по п. 10, где X представляет собой триазолил.
12. Соединение по п. 10, где Ra и Rb вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют морфолинил, пиперазинил или пиперидинил.
13. Соединение по любому из пп. 1-5, где R1 выбран из -R1’-X, R1’ представляет собой -(CH2)1-6- и X представляет собой
или 
14. Соединение по любому из пп. 1-5, где каждый n равен 7 и m равен 7.
15. Соединение по п. 1, где в формуле (III) каждый R’ независимо выбран из C1-10-алкила.
16. Соединение по п. 1, где в формуле (III) каждый R’ независимо выбран из C2-8-алкила.
17. Соединение по п. 15 или 16, где каждый М независимо выбран из -C(O)O-.
18. Соединение по п. 1, где соединение, которое имеет формулу (II) или формулу (III), представляет собой одно из
19. Композиция для введения фармацевтических препаратов на основе нуклеиновых кислот, таких как мРНК и миРНК, содержащая ионизируемое липидное соединение по любому из пп. 1-18 и фосфолипид.
20. Композиция по п. 19, где фосфолипид выбран из 1,2-дилинолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DLPC), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-фосфохолина (DMPC), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DOPC), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DPPC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DSPC), 1,2-диундеканоил-sn-глицеро-фосфохолина (DUPC), 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (POPC), 1,2-ди-О-октадеценил-sn-глицеро-3-фосфохолина (18:0 Diether PC), 1-олеоил-2-холестерилгемисукциноил-sn-глицеро-3-фосфохолина (OChemsPC), 1-гексадецил-sn-глицеро-3-фосфохолина (C16 Lyso PC), 1,2-дилиноленоил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,2-диарахидоноил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,2-дидокозагексаеноил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DOPE), 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (ME 16.0 PE), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, 1,2-дилинолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, 1,2-дилиноленоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, 1,2-диарахидоноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, 1,2-дидокозагексаеноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфор-rac-(1-глицерин) натриевой соли (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерина (DPPG), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламина (POPE), дистеароилфосфатидилэтаноламина (DSPE), дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламина (DMPE), 1-стеароил-2-олеоил-фосфатидилэтаноламина (SOPE), 1-стеароил-2-олеоил-фосфатидилхолина (SOPC), сфингомиелина, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола, фосфатидной кислоты, пальмитоилолеоилфосфатидилхолина, лизофосфатидилхолина, лизофосфатидилэтаноламина (LPE) или их комбинации.
21. Композиция по п. 19 или 20, дополнительно содержащая PEG-липид.
22. Композиция по п. 21, где PEG-липид выбран из PEG-модифицированного фосфатидилэтаноламина, PEG-модифицированной фосфатидной кислоты, PEG-модифицированного церамида, PEG-модифицированного диалкиламина, PEG-модифицированного диацилглицерина, PEG-модифицированного диалкилглицерина или их комбинации.
23. Композиция по п. 21, дополнительно содержащая структурный липид.
24. Композиция по п. 23, где структурный липид выбран из холестерина, фекостерина, ситостерина, эргостерина, кампестерина, стигмастерина, брассикастерина, томатидина, урсоловой кислоты, альфа-токоферола или их комбинации.
25. Композиция по п. 23, дополнительно содержащая активный ингредиент, который выбран по меньшей мере из одного из ДНК, РНК, белок или активная фармацевтическая молекула.
26. Композиция по п. 25, где содержание ионизируемого липидного соединения составляет от 20 до 80%, PEG-липида – от 1 до 10%, структурного липида – от 10 до 50% и фосфолипида – от 5 до 30%, при этом каждое из этих процентных содержаний рассчитано на основе мольного процентного содержания всех липидов в композиции.
27. Композиция по п. 25, где содержание ионизируемого липидного соединения составляет от 20 до 80%, PEG-липида – от 1 до 5%, структурного липида – от 10 до 50% и фосфолипида – от 5 до 30%, при этом каждое из этих процентных содержаний рассчитано на основе мольного процентного содержания всех липидов в композиции.
28. Композиция по п. 25, где активный агент представляет собой РНК и РНК выбрана по меньшей мере из одной из мРНК, siRNA, aiRNA, miRNA, dsRNA, aRNA или lncRNA.
29. Композиция по п. 25, где активный агент представляет собой белок, выбранный по меньшей мере из одного из антитела, фермента, рекомбинантного белка, полипептида и короткоцепочечного полипептида.
30. Композиция по п. 19, где композиция представлена в форме липидной наночастицы.
31. Способ получения липидной наночастицы, включающий:
смешивание ионизируемого соединения, которое представляет собой соединение по п. 1, с PEG-липидом, структурным липидом и фосфолипидом с образованием липидной смеси; смешивание активного ингредиента с липидной смесью с образованием липидной наночастицы с помощью смесителя.
32. Соединение по любому из пп. 1-18 для использования в изготовлении липидной наночастицы.
33. Соединение по п. 32, где указанная липидная наночастица является нейтральной и незаряженной в нейтральной среде и является положительно заряженной после протонирования в кислой среде.
34. Соединение по п. 32, где указанная липидная наночастица является такой, как определено в любом из пп. 19-29.
35. Способ по п. 31, где соединение растворяют и смешивают с PEG-липидом, структурным липидом и фосфолипидом с образованием липидной смеси, затем смешивают активный ингредиент с липидной смесью при помощи смесителя с образованием липидной наночастицы.
36. Фармацевтическая композиция для введения фармацевтических средств на основе нуклеиновых кислот, таких как мРНК и миРНК, содержащая липидную наночастицу по п. 30 и фармацевтически приемлемый носитель.
37. Композиция по п. 36 для применения в изготовлении лекарственного средства.
38. Композиция по п. 37, дополнительно включающая активный ингредиент, при этом активный ингредиент выбран из по меньшей мере одного из ДНК, РНК, белка или активной фармацевтической молекулы.
39. Композиция по п. 38, где активный ингредиент представляет собой РНК, выбранную из по меньшей мере одной из мРНК, siRNA, aiRNA, miRNA, dsRNA, aRNA или lncRNA.
40. Композиция по п. 38, где активный ингредиент представляет собой белок, выбранный по меньшей мере из одного из антитела, фермента, рекомбинантного белка, полипептида и короткоцепочечного полипептида.
41. Композиция по любому из пп. 37-40, где указанное лекарственное средство может быть введено человеку путем внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, подкожной инъекции, микроигольного пластыря, перорального введения, перорального и назального спрея или смазывания.
| Автомобиль-сани, движущиеся на полозьях посредством устанавливающихся по высоте колес с шинами | 1924 |
|
SU2017A1 |
| Токарный резец | 1924 |
|
SU2016A1 |
| CN 109640962 А, 16.04.2019 | |||
| CN 106795096 А, 31.05.2017 | |||
| CN 108368028 А, 03.08.2018 | |||
| Многоступенчатая активно-реактивная турбина | 1924 |
|
SU2013A1 |
| Способ обработки целлюлозных материалов, с целью тонкого измельчения или переведения в коллоидальный раствор | 1923 |
|
SU2005A1 |
| ТРИАЛКИЛОВЫЕ КАТИОННЫЕ ЛИПИДЫ И СПОСОБЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ | 2013 |
|
RU2718053C2 |
