ИОНИЗИРУЕМЫЕ ЛИПИДЫ И ИХ КОМПОЗИЦИИ В ФОРМЕ НАНОЧАСТИЦ Российский патент 2025 года по МПК C07C323/26 C07C323/27 A61K9/16 A61K48/00 C12N15/86 C12N15/88 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

В данной заявке заявлено преимущественное право приоритета предварительной заявки на патент США №62/939326, поданной 22 ноября 2019 года, и предварительной заявки на патент США №63/026493, поданной 18 мая 2020 года, полное содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Генная терапия направлена на улучшение клинических результатов у пациентов, страдающих от генетических нарушений либо от приобретенных заболеваний, вызванных аберрантным профилем экспрессии генов. На данное время разработаны различные типы генной терапии, которые обеспечивают доставку терапевтических нуклеиновых кислот в клетки пациента в качестве лекарственного средства для лечения заболевания.

Доставка и экспрессия корригирующего гена в клетках-мишенях пациента может быть осуществлена многочисленными способами, включая использование сконструированных вирусных векторов доставки генов и потенциально плазмид, минигенов, олигонуклеотидов, миниколец или различных ДНК с замкнутыми концами. Среди многих доступных векторов вирусного происхождения (например, рекомбинантный ретровирус, рекомбинантный лентивирус, рекомбинантный аденовирус и т.п.) рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV) получает признание в качестве универсального, а также относительно надежного вектора в генной терапии. Однако вирусные векторы, такие как аденоассоциированные векторы, могут быть высокоиммуногенными и вызывать гуморальный и клеточно-опосредованный иммунный ответ, что может поставить под угрозу эффективность, особенно в отношении повторного введения.

Невирусная доставка гена позволяет обойти определенные недостатки, связанные с трансдукцией вируса, в частности те, которые связаны с гуморальным и клеточным иммунным ответом на вирусные структурные белки, образующие векторную частицу, и любой экспрессией гена вируса de novo. К числу невирусных технологий доставки генов относится использование в качестве носителя катионных липидов.

В общих чертах, ионизируемые липиды состоят из аминного фрагмента и липидного фрагмента, и катионный аминный фрагмент и полианион нуклеиновой кислоты электростатически взаимодействуют с образованием положительно заряженной структуры липосомы или липидной мембраны. Таким образом, усиливается поглощение клетками, и происходит доставка нуклеиновых кислот в клетки.

Некоторые широко используемые ионизируемые липиды представляют собой CLinDMA, DLinDMA (также известные как DODAP) и катионные липиды, такие как DOTAP. Следует отметить, что указанные липиды использовались для доставки миРНК в печень, но при более высоких дозах они страдают от неоптимальной эффективности доставки наряду с гепатотоксичностью. С учетом недостатков современных катионных липидов, в данной области техники существует потребность в создании липидных каркасов, которые не только демонстрируют повышенную эффективность наряду со сниженной токсичностью, но и обладают улучшенной фармакокинетикой и внутриклеточной кинетикой, такой как поглощение клеткой и высвобождение нуклеиновой кислоты из липидного носителя.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе предложен ионизируемый липид, представленный формулой (I):

или его фармацевтически приемлемая соль, где:

R¹ и R^1', каждый независимо, представляют собой необязательно замещенный линейный или разветвленный С_1-3 алкилен;

R² и R^2', каждый независимо, представляют собой необязательно замещенный линейный или разветвленный C_1-6 алкилен;

R³ и R^3', каждый независимо, представляют собой необязательно замещенный линейный или разветвленный C_1-6 алкил;

или альтернативно, если R² представляет собой необязательно замещенный разветвленный C_1-6 алкилен, то R² и R³ вместе с их промежуточным атомом N образуют 4-8-членный гетероциклил;

или альтернативно, если R^2' представляет собой необязательно замещенный разветвленный С_1-6 алкилен, то R^2' и R^3' вместе с их промежуточным атомом N образуют 4-8-членный гетероциклил;

R⁴ и R^4', каждый независимо, представляют собой -CR^a, -C(R^a)₂CR^a или -[C(R^a)₂]₂CR^a;

R^a для каждого случая независимо представляет собой Η или С_1-3 алкил;

или альтернативно, если R⁴ представляет собой C(R^a)₂CR^a или -[C(R^a)₂]₂CR^a, и если R^a представляет собой С_1-3 алкил, то R³ и R⁴ вместе с промежуточным атомом N образуют 4-8-членный гетероциклил;

или альтернативно, если R^4' представляет собой -C(R^a)₂CR^a или -[C(R^a)₂]₂CR^a, и если R^a представляет собой C_1-3 алкил, то R^3' и R^4' вместе с промежуточным атомом N образуют 4-8-членный гетероциклил;

R⁵ и R^5', каждый независимо, представляют собой С_1-20 алкилен или С_2-20 алкенилен;

R⁶ и R^6' для каждого случая независимо представляют собой С_1-20 алкилен, С_3-20 циклоалкилен или С_2-20 алкенилен; и

m и n, каждый независимо, представляют собой целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4 и 5.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, R² и R^2', каждый независимо, представляют собой С_1-3 алкилен.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, каждый линейный или разветвленный С_1-3 алкилен, представленный обозначением R¹ или R^1', каждый линейный или разветвленный С_1-6 алкилен, представленный обозначением R² или R^2', каждый и необязательно замещенный линейный или разветвленный С_1-6 алкил необязательно замещен одной или более галогенными и циано-группами.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, R¹ и R² вместе представляют собой С_1-3 алкилен, и R¹ и R^2' вместе представляют собой С_1-3 алкилен, например, этилен.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, R³ и R^3', каждый независимо, представляют собой необязательно замещенный С_1-3 алкил, например, метил.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, каждый R⁴ и R^4' представляет собой -СН.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, R² представляет собой необязательно замещенный разветвленный C_1-6 алкилен; и R² и R³ вместе с промежуточным атомом N образуют 5- или 6-членный гетероциклил. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, R^2' представляет собой необязательно замещенный разветвленный C_1-6 алкилен; и R^2' и R^3' вместе с промежуточным атомом N образуют 5-или 6-членный гетероциклил, такой как пирролидинил или пиперидинил.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, R⁴ представляет собой -C(R^a)₂CR^a или -[C(R^a)₂]₂CR^a, и R^a представляет собой C_1-3 алкил; и R³ и R⁴ вместе с промежуточным атомом N образуют 5- или 6-членный гетероциклил. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, R^4' представляет собой -C(R^a)₂CR^a или -[C(R^a)₂]₂CR^a, и R^a представляет собой C_1-3 алкил; и R^3' и R^4' вместе с промежуточным атомом N образуют 5- или 6-членный гетероциклил, такой как пирролидинил или пиперидинил.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, R⁵ и R^5', каждый независимо, представляют собой С_1-10 алкилен или С_2-10 алкенилен. В одном варианте реализации R⁵ и R^5', каждый независимо, представляют собой C_1-8 алкилен или C_1-6 алкилен.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, R⁶ и R^6' для каждого случая независимо представляют собой С_1-10 алкилен, С_3-10 циклоалкилен или С_2-10 алкенилен. В одном варианте реализации C_1-6 алкилен, С_3-6 циклоалкилен или С_2-6 алкенилен. В одном варианте реализации С_3-10 циклоалкилен или С_3-6 циклоалкилен представляет собой циклопропилен. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, каждый m и n равен 3.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, ионизируемый липид выбран из любых липидов в таблице 1 или их фармацевтически приемлемых солей.

Другой аспект данного изобретения относится к липидной наночастице (LNP), содержащей ионизируемый липид формулы (I), включая любые аспекты или варианты реализации, описанные в данном документе, и нуклеиновую кислоту. В одном варианте реализации нуклеиновая кислота инкапсулирована в ионизируемый липид. В конкретном варианте реализации нуклеиновая кислота представляет собой ДНК с замкнутыми концами (зкДНК).

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, LNP дополнительно содержит стерин. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, стерин может представлять собой холестерин или бета-ситостерин.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации, холестерин присутствует в молярном процентном содержании от около 20% до около 40%, например, от около 20% до около 35%, от около 20% до около 30%, от около 20% до около 25%, от около 25% до около 35%, от около 25% до около 30%, или от около 30% до около 35%, а ионизируемый липид присутствует в молярном процентном содержании от около 80% до около 60%, например, от около 80% до около 65%, от около 80% до около 70%, от около 80% до около 75%, от около 75% до около 60%, от около 75% до около 65%, от около 75% до около 70%, от около 70% до около 60% или от около 70% до около 60%. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, холестерин присутствует в молярном процентном содержании от около 20% до около 40%, например, около 20%, около 21%, около 22%, около 23%, около 24%, около 25%, около 26%, около 27%, около 28%, около 29%, около 30%, около 31%, около 32%, около 33%, около 34%, около 35%, около 36%, около 37%, около 38%, около 39% или около 40%, и при этом ионизируемый липид присутствует в молярном процентном содержании от около 80% до около 60%, например, около 80%, около 79%, около 78%, около 77%, около 76%, около 75%, около 74%, около 73%, около 72%, около 71%, около 70%, около 69%, около 68%, около 67%, около 66%, около 65%, около 64%, около 63%, около 62%, около 61%, or около 60%. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, холестерин присутствует в молярном процентном содержании около 40%, и при этом ионизируемый липид присутствует в молярном процентном содержании около 50%. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, предложенная композиция дополнительно содержит холестерин, ПЭГ или ПЭГ-липидный конъюгат и некатионный липид. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, ПЭГ или ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в количестве от около 1,5% до около 3%, например, от около 1,5% до около 2,75%, от около 1,5% до около 2,5%, от около 1,5% до около 2,25%, от около 1,5% до около 2%, от около 2% до около 3%, от около 2% до около 2,75%, от около 2% до около 2,5%, от около 2% до около 2,25%, от около 2,25% до около 3%, от около 2,25% до около 2,75% или от около 2,25% до около 2,5%. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, ПЭГ или ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в количестве около 1,5%, около 1,6%, около 1,7%, около 1,8%, около 1,9%, около 2%, около 2,1%, около 2,2%, около 2,3%, около 2,4%, около 2,5%, около 2,6%, около 2,7%, около 2,8%, около 2,9% или около 3%. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, холестерин присутствует в молярном процентном содержании от около 30% до около 50%, например, от около 30% до около 45%, от около 30% до около 40%, от около 30% до около 35%, от около 35% до около 50%, от около 35% до около 45%, от около 35% до около 40%, от около 20% до около 40%, от около 40% до около 50% или от около 45% до около 50%. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, холестерин присутствует в молярном процентном содержании около 30%, около 31%, около 32%, около 33%, около 34%, около 35%, около 36%, около 37%, около 38%, около 39%, около 40%, около 41%, около 42%, около 43%, около 44%, около 45%, около 46%, около 47%, около 48%, около 49% или около 50%.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, LNP дополнительно содержит полиэтиленгликоль (ПЭГ). В соответствии с некоторыми вариантами реализации, ПЭГ представляет собой 1-(монометокси-полиэтиленгликоль)-2,3-димиристоилглицерин (ПЭГ-DMG или DMG-ПЭГ2000).

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, LNP дополнительно содержит некатионный липид. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, некатионный липид выбран из группы, состоящей из дистеароил-sn-глицеро-фосфоэтаноламина, дистеароилфосфатидилхолина (DSPC), диолеоилфосфатидилхолина (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), диолеоилфосфатидилглицерина (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерина (DPPG), диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE), пальмитоилолеоилφосфатидилхолина (РОРС), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламина (POPE), диолеоилфосфатидилэтаноламин-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (DOPE-mal), дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламина (DMPE), дистеароилфосфатидилэтаноламина (DSPE), монометилфосфатидилэтаноламина (такого как 16-О-монометил-РЕ), диметилфосфатидилэтаноламина (такого как 16-О-диметил-РЕ), 18-1-транс-РЕ, 1-стеароил-2-олеоилфосфатидилэтаноламина (SOPE), гидрированного соевого фосфатидилхолина (HSPC), яичного фосфатидилхолина (ЕРС), диолеоилфосфатидилсерина (DOPS), сфингомиелина (SM), димиристоилфосфатидилхолина (DMPC), димиристоилфосфатидилглицерина (DMPG), дистеароилфосфатидилглицерина (DSPG), диэрукоилфосфатидилхолина (DEPC), пальмитоилолеоилфосфатидилглицерина (POPG), диэлаидоилфосфатидилэтаноламина (DEPE), 1,2-дилауроил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DLPE); 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DPHyPE); лецитина, фосфатидилэтаноламина, лизолецитина, лизофосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, сфингомиелина, яичного сфингомиелина (ESM), цефалина, кардиолипина, фосфатидной кислоты, цереброзидов, дицетилфосфата, лизофосфатидилхолина, дилинолеоилфосфатидилхолина или их смесей. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, некатионный липид выбран из группы, состоящей из из диолеоилфосфатидилхолина (DOPC), дистеароилфосфатидилхолина (DSPC) и д ио ле оилфо сф атид илэтано л амина (DOPE).

В соответствии с некоторыми вариантами реализации, ПЭГ или ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в количестве от около 1,5% до около 4%, например, от около 1,5% до около 3%, от около 2% до около 3%, от около 2,5% до около 3%, от около 1,5% до около 2,75%, от около 1,5% до около 2,5%, от около 1,5% до около 2,25%, от около 1,5% до около 2%, от около 1,5% до около 1,75%, от около 2% до около 3%, от около 2% до около 2,75%, от около 2% до около 2,5%, от около 2% до около 2,25%. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, ПЭГ или ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в количестве около 1,5%, около 1,6%, около 1,7%, около 1,8%, около 1,9%, около 2%, около 2,1%, около 2,2%, около 2,3%, около 2,4%, около 2,5%, около 2,6%, около 2,7%, около 2,8%, около 2,9% или около 3%. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, ионизируемый липид присутствует в молярном процентном содержании от около 42,5% до около 62,5%. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, ионизируемый липид присутствует в молярном процентном содержании около 42,5%, около 43%, около 43,5%, около 44%, около 44,5%, около 45%, около 45,5%, около 46%, около 46,5%, около 47%, около 47,5%, около 48%, около 48,5%, около 49%, около 49,5%, около 50%, около 50,5%, около 51%, 51,5%, около 52%, около 52,5%, около 53%, около 53,5%, около 54%, около 54,5%, около 55%, около 55,5%, около 56%, около 56,5%, около 57%, 57,5%, около 58%, около 58,5%, около 59%, около 59,5%, около 60%, около 60,5%, около 61%, около 61,5%, около 62% или около 62,5%. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, некатионный липид присутствует в молярном процентном содержании от около 2,5% до около 12,5%. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, холестерин присутствует в молярном процентном содержании около 40%, ионизируемый липид присутствует в молярном процентном содержании около 52,5%, некатионный липид присутствует в молярном процентном содержании около 7,5%, и при этом ПЭГ присутствует в количестве около 3%.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, композиция LNP дополнительно содержит пальмитат дексаметазона.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, размер LNP составляет от около 50 нм до около 110 нм в диаметре, например, от около 50 нм до около 100 нм, от около 50 нм до около 95 нм, от около 50 нм до около 90 нм, от около 50 нм до около 85 нм, от около 50 нм до около 80 нм, от около 50 нм до около 75 нм, от около 50 нм до около 70 нм, от около 50 нм до около 65 нм, от около 50 нм до около 60 нм, от около 50 нм до около 55 нм, от около 60 нм до около 110 нм, от около 60 нм до около 100 нм, от около 60 нм до около 95 нм, от около 60 нм до около 90 нм, от около 60 нм до около 85 нм, от около 60 нм до около 80 нм, от около 60 нм до около 75 нм, от около 60 нм до около 70 нм, от около 60 нм до около 65 нм, от около 70 нм до около 110 нм, от около 70 нм до около 100 нм, от около 70 нм до около 95 нм, от около 70 нм до около 90 нм, от около 70 нм до около 85 нм, от около 70 нм до около 80 нм, от около 70 нм до около 75 нм, от около 80 нм до около 110 нм, от около 80 нм до около 100 нм, от около 80 нм до около 95 нм, от около 80 нм до около 90 нм, от около 80 нм до около 85 нм, от около 90 нм до около 110 нм или от около 90 нм до около 100 нм. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, LNP имеет размер менее чем около 100 нм, например, менее чем около 105 нм, менее чем около 100 нм, менее чем около 95 нм, менее чем около 90 нм, менее чем около 85 нм, менее чем около 80 нм, менее чем около 75 нм, менее чем около 70 нм, менее чем около 65 нм, менее чем около 60 нм, менее чем около 55 нм, менее чем около 50 нм, менее чем около 45 нм, менее чем около 40 нм, менее чем около 35 нм, менее чем около 30 нм, менее чем около 25 нм, менее чем около 20 нм, менее чем около 15 нм или менее чем около 10 нм. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, размер LNP составляет менее чем около 70 нм, например, менее чем около 65 нм, менее чем около 60 нм, менее чем около 55 нм, менее чем около 50 нм, менее чем около 45 нм, менее чем около 40 нм, менее чем около 35 нм, менее чем около 30 нм, менее чем около 25 нм, менее чем около 20 нм, менее чем около 15 нм или менее чем около 10 нм. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, размер LNP составляет менее чем около 60 нм, например, менее чем около 55 нм, менее чем около 50 нм, менее чем около 45 нм, менее чем около 40 нм, менее чем около 35 нм, менее чем около 30 нм, менее чем около 25 нм, менее чем около 20 нм, менее чем около 15 нм или менее чем около 10 нм. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, композиция LNP имеет отношение общего содержания липидов к нуклеиновой кислоте около 10:1. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, композиция LNP имеет отношение общего содержания липидов к нуклеиновой кислоте около 20:1. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, предложенная композиция имеет отношение общего содержания липидов к нуклеиновой кислоте около 30:1. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, предложенная композиция имеет отношение общего содержания липидов к нуклеиновой кислоте около 40:1. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, предложенная композиция имеет отношение общего содержания липидов к нуклеиновой кислоте около 50:1.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, LNP дополнительно содержит фрагмент, нацеливающий на ткань. Фрагмент, нацеливающий на ткань, может представлять собой пептид, олигосахарид или т.п., который можно использовать для доставки LNP в одну или более конкретных тканей, таких как рак, печень, ЦНС или мышцы. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, фрагмент, нацеливающий на ткань, представляет собой лиганд к печень-специфическим рецепторам. В соответствии с одним вариантом реализации, лиганд печень-специфических рецепторов, используемый для направленной доставки в печень, представляет собой олигосахарид, такой как Ν-ацетилгалактозамин (GalNAc), который ковалентно присоединен к компоненту LNP, например, ПЭГ-липидным конъюгатам, или т.п. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, GalNAc ковалентно присоединен, например, к ПЭГ-липидному конъюгату. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, GalNAc конъюгирован с DSPE-ПЭГ2000. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, GalNAc-ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в липидной наночастице в молярном процентном содержании 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1,0%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2% или 0,1% от общего содержания липидов. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, GalNAc-ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в LNP в молярном процентном содержании 0,2% от общего содержания липидов. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, GalNAc-ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в LNP в молярном процентном содержании 0,3% от общего содержания липидов. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, GalNAc-ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в LNP в молярном процентном содержании 0,4% от общего содержания липидов. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, GalNAc-ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в LNP в молярном процентном содержании 0,5% от общего содержания липидов. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, GalNAc-ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в LNP в молярном процентном содержании 0,6% от общего содержания липидов. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, GalNAc-ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в LNP в молярном процентном содержании 0,7% от общего содержания липидов. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, GalNAc-ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в LNP в молярном процентном содержании 0,8% от общего содержания липидов. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, GalNAc-ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в LNP в молярном процентном содержании 0,9% от общего содержания липидов. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, GalNAc-ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в LNP в молярном процентном содержании 1,0% от общего содержания липидов. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, GalNAc-ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в LNP в молярном процентном содержании около 1,5% от общего содержания липидов. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, GalNAc-ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в LNP в молярном процентном содержании 2,0% от общего содержания липидов.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, композицию LNP получают в буфере, таком как яблочная кислота. В некоторых вариантах реализации композицию получают в яблочной кислоте с концентрацией от около 10 мМ до около 30 мМ, например, например, от около 10 мМ до около 25 мМ, от около 10 мМ до около 20 мМ, от около 10 мМ до около 15 мМ, от около 15 мМ до около 25 мМ, от около 15 мМ до около 20 мМ, от около 20 мМ до около 25 мМ. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, композицию получают с концентрацией около 10 мМ яблочной кислоты, около 11 мМ яблочной кислоты, около 12 мМ яблочной кислоты, около 13 мМ яблочной кислоты, около 14 мМ яблочной кислоты, около 15 мМ яблочной кислоты, около 16 мМ яблочной кислоты, около 17 мМ яблочной кислоты, около 18 мМ яблочной кислоты, около 19 мМ яблочной кислоты, около 20 мМ яблочной кислотыоколо 21 мМ яблочной кислоты, около 22 мМ яблочной кислоты, около 23 мМ яблочной кислоты, около 24 мМ яблочной кислоты, около 25 мМ яблочной кислоты, около 26 мМ яблочной кислоты, около 27 мМ яблочной кислоты, около 28 мМ яблочной кислоты, около 29 мМ яблочной кислоты или около 30 мМ яблочной кислоты. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, композиция содержит около 20 мМ яблочной кислоты.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, композицию LNP получают в растворе, содержащем от около 30 мМ до около 50 мМ NaCl, например, от около 30 мМ до около 45 мМ NaCl, от около 30 мМ до около 40 мМ NaCl, от около 30 мМ до около 35 мМ NaCl, от около 35 мМ до около 45 мМ NaCl, от около 35 мМ до около 40 мМ NaCl или от около 40 мМ до около 45 мМ NaCl. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, композицию LNP получают в растворе, содержащем около 30 мМ NaCl, около 35 мМ NaCl, около 40 мМ NaCl или около 45 мМ NaCl. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, композицию LNP получают в растворе, содержащем около 40 мМ NaCl.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации, композицию LNP получают в растворе, содержащем от около 20 мМ до около 100 мМ MgCl₂, например, от около 20 мМ до около 90 мМ MgCl₂, от около 20 мМ до около 80 мМ MgCl₂, от около 20 мМ до около 70 мМ MgCl₂, от около 20 мМ до около 60 мМ MgCl₂, от около 20 мМ до около 50 мМ MgCl₂, от около 20 мМ до около 40 мМ MgCl₂, от около 20 мМ до около 30 мМ MgCl₂, от около 320 мМ до около 90 мМ MgCl₂, от около 30 мМ до около 80 мМ MgCl₂, от около 30 мМ до около 70 мМ MgCl₂, от около 30 мМ до около 60 мМ MgCl₂, от около 30 мМ до около 50 мМ MgCl₂, от около 30 мМ до около 40 мМ MgCl₂, от около 40 мМ до около 90 мМ MgCl₂, от около 40 мМ до около 80 мМ MgCl₂, от около 40 мМ до около 70 мМ MgCl₂, от около 40 мМ до около 60 мМ MgCl₂, от около 40 мМ до около 50 мМ MgCl₂, от около 50 мМ до около 90 мМ MgCl₂, от около 50 мМ до около 80 мМ MgCl₂, от около 50 мМ до около 70 мМ MgCl₂, от около 50 мМ до около 60 мМ MgCl₂, от около 60 мМ до около 90 мМ MgCl₂, от около 60 мМ до около 80 мМ MgCl₂, от около 60 мМ до около 70 мМ MgCl₂, от около 70 мМ до около 90 мМ MgCl₂, от около 70 мМ до около 80 мМ MgCl₂ или от около 80 мМ до около 90 мМ MgCl₂.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, зкДНК представляет собой дуплексную линейную ДНК с замкнутыми концами. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, зкДНК содержит экспрессионную кассету, содержащую последовательность промотора и трансген.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации, зкДНК содержит экспрессионную кассету, содержащую последовательность полиаденилирования.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, зкДНК содержит по меньшей мере один инвертированный концевой повтор (ITR), фланкирующий либо 5'-, либо 3'-конец указанной экспрессионной кассеты. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, экспрессионная кассета фланкирована двумя ITR, причем указанные два ITR включают один 5'-ITR, и один 3'-ITR. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, экспрессионная кассета связана с ITR на 3'-конце (3'-ITR). В соответствии с некоторыми вариантами реализации, экспрессионная кассета связана с ITR на 5'-конце (5'-ITR). В соответствии с некоторыми вариантами реализации, по меньшей мере один из 5'-ITR и 3'-ITR представляет собой ITR AAV дикого типа. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, по меньшей мере один из 5'-ITR и 3'-ITR представляет собой модифицированный ITR. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, зкДНК дополнительно содержит спейсерную последовательность между 5'-ITR и экспрессионной кассетой.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации, зкДНК дополнительно содержит спейсерную последовательность между 3'-ITR и экспрессионной кассетой. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, спейсерная последовательность имеет по меньшей мере 5 пар оснований в длину. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, спейсерная последовательность имеет от 5 до 100 пар оснований в длину. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, спейсерная последовательность имеет 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 пар оснований в длину. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, спейсерная последовательность имеет от 5 до 500 пар оснований в длину. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, спейсерная последовательность имеет 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490 или 495 пар оснований в длину.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, зкДНК содержит разрыв или гэп.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации, ITR представляет собой ITR, полученный из серотипа AAV, полученный из ITR вируса гусей, полученный из ITR вируса В19, ITR дикого типа из парвовируса. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, серотип AAV выбран из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и AAV12.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации, ITR представляет собой мутантный ITR, и зкДНК необязательно содержит дополнительный ITR, который отличается от первого ITR. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, зкДНК содержит два мутантных ITR на обоих, 5'- и 3'-концах экспрессионной кассеты, при этом необязательно два мутантных ITR являются симметричными мутантами. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, зкДНК представляет собой CELiD, миникольцо на основе ДНК, MIDGE, мини-нитевую ДНК, гантелеобразную дуплексную линейную ДНК с замкнутыми концами, содержащую две шпилечные структуры ITR на 5'- и 3'-концах экспрессионной кассеты, или ДНК Doggybone™. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

В соответствии с некоторыми аспектами, в данном описании предложен способ лечения генетического расстройства у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества фармацевтической композиции согласно любому из аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, субъектом является человек. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, генетическое нарушение выбрано из группы, состоящей из серповидноклеточной анемии, меланомы, гемофилии А (дефицит фактора свертывания крови VIII (FVIII)) и гемофилии В (дефицит фактора свертывания крови IX (FIX)), кистозного фиброза (CFTR), семейной гиперхолестеринемии (дефект рецептора LDL), гепатобластомы, болезни Вильсона, фенилкетонурии (PKU), врожденной печеночной порфирии, наследственных нарушений печеночного метаболизма, синдрома Леш-Нихана, серповидноклеточной анемии, талассемии, пигментной ксеродермы, анемии Фанкони, пигментной дегенерации сетчатки, телеангиоэктатической атаксии, синдрома Блума, ретинобластомы, заболеваний накопления мукополисахаридов (например, синдром Гурлера (MPS типа I), синдром Шейе (MPS типа I S), синдром Гурлера-Шейе (MPS типа I H-S), синдром Хантера (MPS типа II), болезнь Санфилиппо типов А, В, С и D (MPS типов III А, В, С и D), болезнь Моркио типов А и В (MPS IVA и MPS IVB), синдром Марото-Лами (MPS типа VI), синдром Слая (MPS типа VII), дефицит гиалуронидазы (MPS типа IX)), болезни Ниманна-Пика типов А/В, С1 и С2, болезни Фабри, болезни Шиндлера, GM2-ганглиозидоза типа II (болезнь Сандхоффа), болезни Тея-Сакса, метахроматической лейкодистрофии, болезни Краббе, муколипидоза типа I, II/III и IV, сиалидоза типов I и II, болезни накопления гликогена типов I и II (болезнь Помпе), болезни Гоше типов I, II и III, болезни Фабри, цистиноза, болезни Баттена, аспартилглюкозаминурии, болезни Салла, болезни Данона (дефицит LAMP-2), дефицита лизосомной кислой липазы (LAL), нейронального цероидного липофусциноза (CLN1-8, INCL и LINCL), сфинголипидоза, галактосиалидоза, амиотрофического бокового склероза (ALS), болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, болезни Хантингтона, спиноцеребеллярной атаксии, спинальной мышечной атрофии, атаксии Фридриха, мышечной дистрофии Дюшенна (DMD), мышечной дистрофии Беккера (BMD), дистрофического буллезного эпидермолиза (DEB), дефицита эктонуклеотидной пирофосфатазы 1, детского генерализованного кальциноза артерий (GACI), врожденного амавроза Лебера, дегенерации желтого пятна Штаргардта (АВСА4), дефицита орнитинтранскарбамилазы (ОТС), синдрома Ушера, дефицита альфа-1-антитрипсина, прогрессирующего семейного внутрипеченочного холестаза (РИС) типа I (дефицит АТР8 В1), типа II (АВСВ11), типа III (АВСВ4) или типа IV (TJP2) и дефицита катепсина А. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, генетическое нарушение представляет собой врожденный амавроз Лебера (LCA). В соответствии с некоторыми вариантами реализации, LCA представляет собой LCA10. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, генетическое нарушение представляет собой болезнь Ниманна-Пика. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, генетическое нарушение представляет собой дегенерацию желтого пятна Штаргардта. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, генетическое нарушение представляет собой дефицит глюкоза-6-фосфатазы (G6P-азы) (болезнь накопления гликогена типа I) или болезнь Помпе (болезнь накопления гликогена типа II). В соответствии с некоторыми вариантами реализации, генетическое нарушение представляет собой гемофилию А (дефицит фактора VIII). В соответствии с некоторыми вариантами реализации, генетическое нарушение представляет собой гемофилию В (дефицит фактора IX). В соответствии с некоторыми вариантами реализации, генетическое нарушение представляет собой синдром Хантера (мукополисахаридоз II). В соответствии с некоторыми вариантами реализации, генетическое нарушение представляет собой кистозный фиброз. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, генетическое нарушение представляет собой дистрофический буллезный эпидермолиз (DEB). В соответствии с некоторыми вариантами реализации, генетическое нарушение представляет собой фенилкетонурию (PKU). В соответствии с некоторыми вариантами реализации, генетическое нарушение представляет собой прогрессирующий семейный внутрипеченочный холестаз (PFIC). В соответствии с некоторыми вариантами реализации, генетическое нарушение представляет собой болезнь Вильсона. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, генетическое нарушение представляет собой болезнь Гоше типа I, II или III.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Варианты реализации данного изобретения, кратко обобщенные выше и более подробно описанные ниже, могут быть понятны со ссылкой на иллюстративные варианты реализации данного изобретения, изображенные в сопроводительных графических материалах. Однако прилагаемые графические материалы иллюстрируют лишь типичные варианты реализации данного изобретения и, следовательно, их не следует толковать как ограничение его объема, поскольку данное изобретение может допускать другие, равноэффективные варианты реализации.

На Фиг. 1А изображена иллюстративная структура вектора зкДНК для экспресси трансгена, в соответствии с данным описанием, содержащая асимметричные ITR. В данном варианте реализации иллюстративный вектор зкДНК содержит экспрессионную кассету, содержащую промотор CAG, WPRE и BGHpA. Открытая рамка считывания (ORF), кодирующая трансген, может быть вставлена в клонирующий сайт (R3/R4) между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами (ITR) ITR AAV2 дикого типа слева (в направлении 5'-конца) и модифицированный ITR справа (в направлении 3'-конца) экспрессионной кассеты, таким образом, два ITR, фланкирующие экспрессионную кассету, являются асимметричными относительно друг друга.

На Фиг. 1В изображена иллюстративная структура вектора зкДНК для экспрессии трансгена, в соответствии с данным описанием, содержащая асимметричные ITR, с экспрессионной кассетой, содержащей промотор CAG, WPRE и BGHpA. Открытая рамка считывания (ORF), кодирующая трансген, может быть вставлена в клонирующий сайт между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами (ITR) - модифицированный ITR слева (в направлении 5'-конца) и ITR дикого типа справа (в направлении 3'-конца) экспрессионной кассеты.

На Фиг. 1С изображена иллюстративная структура вектора зкДНК для экспрессии трансгена, в соответствии с данным описанием, содержащая асимметричные ITR, с экспрессионной кассетой, содержащей энхансер/промотор, трансген, посттранскрипционный элемент (WPRE) и сигнал polyA. Открытая рамка считывания (ORF) обеспечивает возможность вставки трансгена, кодирующего требуемый белок, или терапевтической нуклеиновой кислоты в клонирующий сайт между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами (ITR), которые являются асимметричными относительно друг друга; модифицированный ITR слева (в направлении 5'-конца) и модифицированный ITR справа (в направлении 3'-конца) экспрессионной кассеты, причем и 5'-OTR, и 3'-ITR представляют собой модифицированные ITR, но имеют различные модификации (т.е. они не содержат одинаковые модификации).

На Фиг. 1D изображена иллюстративная структура вектора зкДНК для экспрессии трансгена, в соответствии с данным описанием, содержащая симметричные модифицированные ITR или по существу симметричные модифицированные ITR, описанные в данном документе, с экспрессионной кассетой, содержащей промотор CAG, WPRE и BGHpA. Открытая рамка считывания (ORF), кодирующая трансген, вставлена в клонирующий сайт между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя модифицированными инвертированными терминальными повторами (ITR), причем модифицированный 5'-ITR и модифицированный 3'-ITR являются симметричными или по существу симметричными.

На Фиг. 1Е изображена иллюстративная структура вектора зкДНК для экспрессии трансгена, в соответствии с данным описанием, содержащая симметричные модифицированные ITR или по существу симметричные модифицированные ITR, описанные в данном документе, с экспрессионной кассетой, содержащей энхансер/промотор, трансген, посттранскрипционный элемент (WPRE) и сигнал polyA. Открытая рамка считывания (ORF) обеспечивает возможность вставки трансгена в клонирующий сайт между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя модифицированными инвертированными терминальными повторами (ITR), причем модифицированный 5'-ITR и модифицированный 3'-ITR являются симметричными или по существу симметричными.

На Фиг. 1F изображена иллюстративная структура вектора зкДНК для экспрессии трансгена, в соответствии с данным описанием, содержащая симметричные ITR дикого типа (WT) или по существу симметричные ITR дикого типа, описанные в данном документе, с экспрессионной кассетой, содержащей промотор CAG, WPRE и BGHpA.

Открытая рамка считывания (ORF), кодирующая трансген, вставлена в клонирующий сайт между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными терминальными повторами дикого типа (WT-ITR), причем 5'-ITR дикого типа и 3'-ITR дикого типа являются симметричными или по существу симметричными.

На Фиг. 1G изображена иллюстративная структура вектора зкДНК для экспрессии трансгена, в соответствии с данным описанием, содержащая симметричные модифицированные ITR или по существу симметричные модифицированные ITR, описанные в данном документе, с экспрессионной кассетой, содержащей энхансер/промотор, трансген, посттранскрипционный элемент (WPRE) и сигнал polyA. Открытая рамка считывания (ORF) обеспечивает возможность вставки трансгена в клонирующий сайт между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными терминальными повторами дикого типа (WT-ITR), причем 5'-ITR дикого типа и 3'-ITR дикого типа являются симметричными или по существу симметричными.

На Фиг. 2А представлена Т-образная структура «петля на стебле» левого ITR дикого типа с указанием плеча А-А', плеча В-В', плеча С-С', двух связывающих сайтов Rep (RBE и RBE'), а также сайта концевого разрешения (trs). RBE содержит последовательность из 4 двойных тетрамеров, которые предположительно взаимодействуют с Rep 78 или Rep 68. Кроме того, RBE' также предположительно взаимодействует с комплексом Rep, собранным на ITR дикого типа или мутированном ITR в указанном конструкте. Области D и D' содержат сайты связывания фактора транскрипции и другие консервативные структуры. На Фиг. 2В представлена предполагаемая Rep-катализируемая никирующая и лигирующая активность в левом ITR дикого типа, включая Т-образную структуру «петля на стебле» данного левого ITR AAV2 дикого типа с указанием плеча А-А', плеча В-В', плеча С-С', двух связывающих сайтов Rep (RBE и RBE'), а также сайта концевого разрешения (trs), и области D и D' содержат несколько сайтов связывания фактора транскрипции и другие консервативные структуры.

На Фиг. 3А представлена первичная структура (полинуклеотидная последовательность) (слева) и вторичная структура (справа) RBE-содержащих частей плеча А-А', а также плеча С-С' и В-В' левого ITR AAV2 дикого типа. На Фиг. 3В изображена последовательность иллюстративного мутированного ITR (также упоминаемого как модифицированный ITR) для левого ITR. Показана первичная структура (слева) и прогнозируемая вторичная структура (справа) RBE-части плеча А-А', плеча С и плеча В-В' иллюстративного мутированного левого ITR (ITR-1, левый). На Фиг. 3С представлена первичная структура (слева) и вторичная структура (справа) RBE-содержащей части петли А-А', а также плеча В-В' и С-С' ITR AAV2 дикого типа. На Фиг. 3D представлен иллюстративный правый модифицированный ITR. Показана первичная структура (слева) и прогнозируемая вторичная структура (справа) RBE-содержащей части плеча А-А', плеча В-В' и плеча С иллюстративного мутантного правого ITR (ITR-1, правый). В соответствии с данным описанием, может быть использована любая комбинация левого и правого ITR (например, ITR AAV2 или другого вирусного серотипа, или синтетические ITR). На Фиг. 3A-3D полинуклеотидные последовательности относятся к последовательности, используемой в геноме плазмиды или бакмиды/бакуловируса, которую используют для получения зкДНК, описанной в данном документе. На Фиг. 3A-3D представлены также соответствующие вторичные структуры зкДНК, прогнозируемые на основании конфигураций вектора зкДНК в геноме плазмиды или бакмиды/бакуловируса, а также прогнозируемые значения свободной энергии Гиббса.

На Фиг. 4А представлено схематическое изображение процесса синтеза для получения клеток насекомых, инфицированных бакуловирусом (ВИС), которые пригодны для получения вектора зкДНК для экспрессии трансгена, описанного в данном документе, способом, схематически изображенным на Фиг. 4В. На Фиг. 4В представлена схема иллюстративного способа получения зкДНК, и на Фиг. 4С изображен биохимический способ и процесс для подтверждения получения вектора зкДНК. На Фиг. 4D и Фиг. 4Е представлены схематические иллюстрации, описавающие способ идентификации присутствия зкДНК в ДНК, собранной из клеточного осадка, полученного в процессе получения зкДНК, представленном на Фиг. 4В. На Фиг. 4D схематически изображены ожидаемые полосы для иллюстративной зкДНК, которая либо оставлена без разрезов, либо расщеплена рестрикционной эндонуклеазой, а затем подвержена электрофорезу на нативном геле или наденатурирующем геле. Самая левая схема иллюстрирует нативный гель и демонстрирует несколько полос, что позволяет предположить, что в своей дуплексной и необрезанной форме зкДНК существует в по меньшей мере мономерных и димерных состояниях, видимых как более быстро мигрирующий мономер меньшего размера и более медленно мигрирующий димер, имеющий размер в два раза больше мономера. Вторая слева схема иллюстрирует, что при разрезании зкДНК рестрикционной эндонуклеазой исчезают первоначальные полосы и появляются более быстро мигрирующие полосы (например, фрагментов меньшего размера), соответствующие ожидаемым размерам фрагментов, остающихся после расщепления. В денатурирующих условиях исходная дуплексная ДНК является одноцепочечной и мигрирует в форме частиц, которые в два раза больше, чем наблюдается в нативном геле, поскольку комплементарные нити являются ковалентно связанными. Таким образом, на второй справа схеме расщепленная зкДНК демонстрирует распределение полос, аналогичное распределению, наблюдаемому в нативном геле, но данные полосы мигрируют в форме фрагментов, вдвое превосходящих по размеру их аналоги в нативном геле. На самой правой схеме показано, что неразрезанная зкДНК в условиях денатурации мигрирует в форме одноцепочечного открытого цикла и, следовательно, наблюдаемые полосы в два раза превосходят по размеру те, которые наблюдаются в нативных условиях, в которых цикл не является открытым. На данном изображении сокращение «п.о.» использовано для указания относительного размера молекул нуклеотидов на основании, в зависимости от контекста, длины цепи нуклеотида (например, для односпиральных молекул, наблюдаемых в денатурирующих условиях) или количества пар оснований (например, для двухспиральных молекул, наблюдаемых в нативных условиях). На Фиг. 4Е показана ДНК, имеющая нецельную структуру. зкДНК может быть разрезана рестрикционной эндонуклеазой, имеющей один сайт распознавания в векторе зкДНК, и образовывать два фрагмента ДНК разного размера (1 п.о. и 2 п.о.) и в нейтральных, и в денатурирующих условиях. На Фиг. 4Е также показана зкДНК, имеющая линейную и сплошную структуру. Вектор зкДНК может быть разрезан рестрикционной эндонуклеазой и образовывать два фрагмента ДНК, которые мигрируют как фрагменты размером 1 п.о. и 2 п.о. в нейтральных условиях, но в денатурирующих условиях спирали остаются связанными и образуют одиночные цепи, которые мигрируют как фрагменты размером 2 п.о. и 4 п.о.

На Фиг. 5 показана экспрессия зкДНК, содержащей ген люциферазы (т.е. промотор зкДНК: CAG, функционально связанный с Luc) при измерении в общем потоке (фотон/с) in vivo системы визуализации (IVIS) в глазах крыс Спрага-Доули дикого типа (самцы), получивших субретинальную инъекцию (2,5 мкл 0,04 мкг/мкл композиции LNP-зкДНК) LNP39 (молярное процентное отношение липид 39: DOPC: холестерин: ОМС-ПЭГ2000: DSPE-n3T2000, 50,8: 7,2: 38,6: 2,9: 0,48).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении предложена платформа на липидной основе для доставки терапевтической нуклеиновой кислоты (ТНК), такой как вирусные или невирусные векторы (например, ДНК с замкнутыми концами), которые могут перемещаться из цитоплазмы клетки в ядро и сохранять высокий уровень экспрессии. Например, иммуногенность, связанная с генными терапиями на основе вирусных векторов, ограничивает количество пригодны для лечения пациентов вследствие уже существующей фоновой иммунной реакции, а также препятствует повторному введению дозы пациентам либо подбору эффективного уровня дозы для каждого пациента, либо сохранению эффекта в течение более продолжительного периода. Кроме того, другие тактики лечения с применением нуклеиновых кислот в значительной степени страдают от иммуногенности вследствие врожденного сенсорного механизма ДНК или РНК, который запускает каскад иммунных ответов. Благодаря отсутствию существующего иммунитета, описанные в данном документе липидные частицы ТНК (например, липидные наночастицы) обеспечивают возможность введения дополнительных доз ТНК, таких как мРНК, миРНК или зкДНК, сообразно обстоятельствам, и дополнительно расширяют выборку пациентов, включая педиатрическую группу, для которой может потребоваться введение последующей дозы в случае роста ткани. Кроме того, согласно настоящему изобретению обнаружено, что липидные частицы ТНК (например, липидные наночастицы), содержащие, в частности, липидные композиции, которые содержат одну или более третичных аминогрупп и дисульфидную связь, обеспечивают более эффективную доставку ТНК (например, зкДНК), улучшенную переносимость и улучшенный профиль безопасности. Благодаря тому, что описанные в данном документе липидные частицы ТНК (например, липидные наночастицы) не имеют ограничений по упаковке, обусловленных пространством в вирусном капсиде, теоретически единственным ограничением размера липидных частиц ТНК (например, липидных наночастиц) является эффективность экспрессии (например, репликации ДНК или трансляции РНК) клетки-хозяина.

Одним из наибольших препятствий при разработке терапевтических средств, в частности, для лечения редких заболеваний, является большое количество индивидуальных состояний. Около 350 миллионов людей во всем мире живут с редкими расстройствами, которые, по определению Национальных институтов здравоохранения, являются расстройством или патологическим состоянием, диагностированным у менее чем 200000 человек. Около 80 процентов редких расстройств имеют генетическое происхождение, и около 95 процентов из них не имеют лечения, одобренного FDA (rarediseases.info.nih.gov/diseases/pages/31/faqs-about-rare-diseases). К преимуществам липидных частиц ТНК (например, липидных наночастиц), описанных в данном документе, относится обеспечение подхода, который можно быстро адаптировать для многих заболеваний, которые можно лечить особой формой ТНК, и, в частности, для редких моногенных заболеваний, что может значительно изменить современный статус лечения многих генетических нарушений или заболеваний.

I. Определения

В данном контексте термин «алкил» относится к насыщенному одновалентному углеводородному радикалу, содержащему от 1 до 20 атомов углерода (т.е. С_1-20 алкил). «Одновалентынй» означает, что алкил имеет одну точку присоединения к остальной части молекулы. В одном варианте реализации алкил содержит от 1 до 12 атомов углерода (т.е. С_1-12 алкил) или от 1 до 10 атомов углерода (т.е. С_1-10 алкил). В одном варианте реализации алкил содержит от 1 до 8 атомов углерода (т.е. C_1-8 алкил), от 1 до 7 атомов углерода (т.е. С_1-7 алкил), от 1 до 6 атомов углерода (т.е. С_1-6 алкил), от 1 до 4 атомов углерода (т.е. С_1-4 алкил) или от 1 до 3 атомов углерода (т.е. С_1-3 алкил). Примеры включают, но не ограничиваясь ими, метил, этил, 1-пропил, 2-пропил, 1-бутил, 2-метил-1-пропил, 2-бутил, 2-метил-2-пропил, 1-пентил, 2-пентил, 3-пентил, 2-метил-2-бутил, 3-метил-2-бутил, 3-метил-1-бутил, 2-метил-1-бутил, 1-гексил, 2-гексил, 3-гексил, 2-метил-2-пентил, 3-метил-2-пентил, 4-метил-2-пентил, 3-метил-3-пентил, 2-метил-3-пентил, 2,3-диметил-2-бутил, 3,3-диметил-2-бутил, 1-гептил, 1-октил и т.п. Линейный или разветвленный алкил, такой как «линейный или разветвленный С_1-6 алкил», «линейный или разветвленный С_1-4 алкил» или «линейный или разветвленный С_1-3 алкил» означает, что насыщенный одновалентный углеводородный радикал представляет собой линейную или разветвленную цепь.

Термин «алкилен» в данном контексте относится к насыщенному двухвалентному углеводородному радикалу, содержащему от 1 до 20 атомов углерода (т.е. С_1-20 алкилен), примеры которого включают, но не ограничиваясь ими, те, которые имеют такие же центральные структуры алкильных групп, примеры которых приведены выше. «Двухвалентный» означает, что алкилен имеет две точки присоединения к остальной части молекулы. В одном варианте реализации алкилен содержит от 1 до 12 атомов углерода (т.е. С_1-12 алкилен) или от 1 до 10 атомов углерода (т.е. С_1-10 алкилен). В одном варианте реализации алкилен содержит от 1 до 8 атомов углерода (т.е. C_1-8 алкилен), от 1 до 7 атомов углерода (т.е. С_1-7 алкилен), от 1 до 6 атомов углерода (т.е. С_1-6 алкилен), от 1 до 4 атомов углерода (т.е. С_1-4 алкилен) или от 1 до 3 атомов углерода (т.е. C_1-3 алкилен), этилен или метилен. Линейный или разветвленный алкилен, такой как «линейный или разветвленный С_1-6 алкилен», «линейный или разветвленный С_1-4 алкилен» или «линейный или разветвленный С_1-3 алкилен» означает, что насыщенный двухвалентный углеводородный радикал представляет собой линейную или разветвленную цепь.

«Алкенилен» в данном контексте относится к алифатическому двухвалентному углеводородному радикалу, содержащему от 1 до 20 атомов углерода (т.е. С_2-20 алкенилен) с одной или двумя двойными углерод-углеродными связями, при этом алкениловый радикал включает радикалы, имеющие «цис» и «транс» ориентации, или, по альтернативной номенклатуре, «Ε» и «Ζ» ориентации. «Двухвалентный» означает, что алкенилен имеет две точки присоединения к остальной части молекулы. В одном варианте реализации алкенилен содержит от 2 до 12 атомов углерода (т.е. С_2-16 алкенилен), от 2 до 10 атомов углерода (т.е. С_2-10 алкенилен). В одном варианте реализации алкенилен содержит от 2 до четырех атомов углерода (С_2-4). Примеры включают, но не ограничиваясь ими, этиленилен или винилен (-СН=СН-), аллил (-СН₂СН=СН-) и т.п. Линейный или разветвленный алкенилен, такой как «линейный или разветвленный С_2-6 алкенилен», «линейный или разветвленный С_2-4 алкенилен» или «линейный или разветвленный С_2-3 алкенилен» означает, что ненасыщенный двухвалентный углеводородный радикал представляет собой линейную или разветвленную цепь.

«Циклоалкилен» в данном контексте относится к двухвалентному насыщенному карбоциклическому кольцевому радикалу, содержащем от 3 до 12 атомов углерода в форме моноциклического кольца или от 7 до 12 атомов углерода в форме бициклического кольца. «Двухвалентный» означает, что циклоалкилен имеет две точки присоединения к остальной части молекулы. В одном варианте реализации циклоалкилен является 3-7-членным моноциклическим или 3-6-членным моноциклическим. Примеры моноциклических циклоалкильных групп включают, но не ограничиваясь ими, циклопропилен, циклобутилен, циклопентилен, циклогексилен, циклогептилен, циклооктилен, циклононилен, циклодецилен, циклоундецилен, циклододецилен и т.п. В одном варианте реализации циклоалкилен представляет собой циклопропилен.

Термины «гетероцикл», «гетероциклил», «гетероциклический» и «гетероциклическое кольцо» использованы в данном контексте взаимозаменяемо и относятся к циклической группе, которая содержит по меньшей мере один атом Ν, содержит гетероатом и необязательно 1-3 дополнительных гетероатома, выбранных из N и S, и является неароматической (т.е. частично или полностью насыщенной). Она может быть моноциклической или бициклической (мостиковой или конденсированной). Примеры гетероциклических колец включают, но не ограничиваясь ими, азиридинил, диазиридинил, тиазиридинил, азетидинил, диазетидинил, триазетидинил, тиадиазетидинил, тиазетидинил, пирролидинил, пиразолидинил, имидазолинил, изотиазолидинил, тиазолидинил, пиперидинил, пиперазинил, гексагидропиримидинил, азепанил, азоканил и т.п. Гетероцикл содержит от 1 до 4 гетероатомов, которые могут быть одинаковыми или различными, выбранными из N и S. В одном варианте реализации гетероцикл содержит от 1 до 3 атомов N. В другом варианте реализации гетероцикл содержит 1 или 2 атома N. В другом варианте реализации гетероцикл содержит 1 атом N. «4-8-Членный гетероциклил» означает радикал, содержащий от 4 до 8 атомов (включая от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из N и S, или от 1 до 3 атомов Ν, или 1 или 2 атома Ν, или 1 атом Ν), расположенных в моноциклическом кольце. «5- или 6-членный гетероциклил» означает радикал, содержащий 5 или 6 атомов (включая от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из N и S, или от 1 до 3 атомов Ν, или 1 или 2 атома Ν, или 1 атом Ν), расположенных в моноциклическом кольце. Термин «гетероцикл» включает все возможные изомерные формы. Гетероциклы описаны в публикациях Paquette, Leo Α., Principles of Modern Heterocyclic Chemistry (W. A. Benjamin, Нью-Йорк, 1968), в частности, в главах 1, 3, 4, 6, 7 и 9; The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A Series of Monographs (John Wiley & Sons, Нью-Йорк, с 1950 по н.в.), в частности, в томах 13, 14, 16, 19 и 28; и J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566. Гетероциклильные группы могут быть присоединены к остальной части молекулы через атом углерода (углерод-связанные) или атом азота (азот-связанные), если такое присоединение возможно.

Если группа описана как «необязательно замещенная», то данная группа может быть либо (1) незамещенной, либо (2) замещенной. Если атом углерода какой-либо группы описан как необязательно замещенный одним или более из списка заместителей, то один или более атомов водорода у данного атома углерода (в тех случаях, когда они существуют) могут быть по отдельности и/или вместе заменены на независимо выбранный необязательный заместитель.

Подходящие заместители для алкила, алкилена, алкенилена, циклоалкилена и гетероциклила представляют собой те, которые не оказывают существенного неблагоприятного воздействия на биологическую активность бифункционального соединения. Если не указано иное, примеры заместителей для таких групп включают линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, арил, гетероарил, гетероциклил, галоген, гуанидиний [-NH(C=NH)NH₂], -OR₁₀₀, NR₁₀₁R₁₀₂, -NO₂, -NR₁₀₁COR₁₀₂, -SR₁₀₀, сульфоксид, представленный формулой -SOR₁₀₁, сульфон, представленный формулой -SO₂R₁₀₁, сульфонат -SO₃M, сульфат -OSO₃M, сульфонамид, представленный формулой -SO₂NR₁₀₁R₁₀₂, циано, азидо, -COR₁₀₁, -OCOR₁₀₁, -OCONR₁₀₁R₁₀₂ и полиэтиленгликолевое звено (-OCH₂CH₂)_nR₁₀₁, где Μ представляет собой Η или катион (такой как Na⁺ или K⁺); R₁₀₁, R₁₀₂ и R₁₀₃, каждый независимо, выбраны из Н, линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена (-OCH₂CH₂)_n-R₁₀₄, где n представляет собой целое число от 1 до 24, арила, содержащего от 6 до 10 атомов углерода, гетероциклического кольца, содержащего от 3 до 10 атомов углерода, и гетероарила, содержащего от 5 до 10 атомов углерода; и R₁₀₄ представляет собой Η или линейный или разветвленный алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, причем алкил, алкенил, алкинил, арил, гетероарил и гетероциклил в группах, представленных обозначениями R₁₀₀, R₁₀₁, R₁₀₂, R₁₀₃ и R₁₀₄, необязательно замещены одним или более (например, 2, 3, 4, 5, 6 или более) заместителями, независимо выбранными из галогена, -ОН, -CN, -NO₂ и незамещенного линейного или разветвленного алкила, содержащего от 1 до 4 атомов углерода. Предпочтительно, заместитель для необязательно замещенного алкила, алкилена, алкенилена, циклоалкилена и гетероциклил а, описанного выше, выбран из группы, состоящей из галогена, -CN, -NR₁₀₁R₁₀₂, -CF₃, -OR₁₀₀, арила, гетероарила, гетероциклила, -SR₁₀₁, -SOR₁₀₁, -SO₂R₁₀₁ и -SO₃M. Альтернативно, подходящий заместитель выбран из группы, состоящей из галогена, -ОН, -NO₂, -CN, С_1-4 алкила, -OR₁₀₀, NR₁₀₁R₁₀₂, -NR₁₀₁COR₁₀₂, -SR₁₀₀, -SO₂R₁₀₁, -SO₂NR₁₀₁R₁₀₂, -COR₁₀₁, -OCOR₁₀₁ и -OCONR₁₀₁R₁₀₂, где R₁₀₀, R₁₀₁ и R₁₀₂, каждый независимо, представляют собой -Н или С_1-4 алкил.

«Галоген» в данном контексте относится к F, Cl, Br или I. «Циано» представляет собой -CN.

«Амин» или «амино», используемые в данном контексте взаимозаменяемо, относятся к функциональной группе, которая содержит основный атом азота с неподеленной парой.

Термин «фармацевтически приемлемая соль» в данном контексте относится к фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим солям ионизируемого липида по данному изобретению. Примеры солей включают, но не ограничиваясь ими, сульфатные, цитратные, ацетатные, оксалатные, хлоридные, бромидные, иодидные, нитратные, бисульфатные, фосфатные, гидрофосфатные, изоникотинатные, лактатные, салицилатные, гидроцитратные, тартратные, олеатные, таннатные, пантотенатные, битартратные, аскорбатные, сукцинатные, малеатные, гентизинатные, фумаратные, глюконатные, глюкуронатные, сахаратные, формиатные, бензоатные, глутаматные, метансульфонатные («мезилатные»), этансульфонатные, бензолсульфонатные, п-толуолсульфонатные, памоатные (т.е. 1,1'-метилен-бис(2-гидрокси-3-нафтоатные)) соли, соли щелочных металлов (например, натрия и калия), соли щелочноземельных металлов (например, магния) и соли аммония. Фармацевтически приемлемая соль может подразумевать включение другой молекулы, такой как ацетат-ион, сукцинат-ион или другой противоион. Противоионом может быть любой органический или неорганический фрагмент, который стабилизирует заряд исходного соединения. Кроме того, фармацевтически приемлемая соль может иметь более одного заряженного атома в своей структуре. В тех случаях, когда частью фармацевтически приемлемой соли являются несколько заряженных атомов, может быть несколько противоионов. Следовательно, фармацевтически приемлемая соль может содержать один или более заряженных атомов и/или один или более противоионов.

При использовании в данном описании и прилагаемой формуле изобретения термин «около», относящийся к измеримому значению, такому как количество, продолжительность по времени и т.п., включает отклонения ±20% или ±10%, более предпочтительно ±5%, еще более предпочтительно ±1%, и еще более предпочтительно ±0,1% относительно указанного значения, поскольку такие отклонения допустимы для осуществления описанных способов.

В данном контексте «содержат», «содержащий» и содержит», а также «состоит из» являются синонимами терминам «включают», «включая», «включает» или «имеют», «имеющий», «имеет» и являются включительными или неограничивающими терминами, которые определяют присутствие того, что следует за ними, например, какого-либо компонента, и не исключают или не делают невозможным наличие дополнительных, неперечисленных компонентов, признаков, элементов, членов, стадий, известных в данной области техники или описанных в данном документе.

Термин «состоящий из» относится к композициям, способам, процессам и их соответствующим компонентам, описанным в данном документе, которые исключают любой элемент, не перечисленный в конкретном описании данного варианта реализации.

В данном контексте термин «состоящий по существу из» относится к тем элементам, которые необходимы для данного варианта реализации. Такой термин допускает присутствие дополнительных элементов, которые не оказывают существенного влияния на основные и новые или функциональные свойства данного варианта реализации изобретения.

В данном контексте термины «введение», «введенный» и их варианты относятся к введению композиции или агента (например, нуклеиновых кислот, в частности, зкДНК) субъекту и включает одновременное и последовательное введение одной или более композиций или агентов. «Введение» может относиться, например, к терапевтическим, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским, плацебо и экспериментальным способам. «Введение» также включает in vitro и ex vivo обработку. Введение композиции или агента субъекту осуществляют любым подходящим способом, включая пероральный, пульмональный, интраназальный, парентеральный (внутривенный, внутримышечный, интраперитонеальный или подкожный), ректальный, интралимфатический, внутриопухолевый или местный способ. Введение включает самостоятельное введение и введение другим лицом. Введение можно осуществлять любым подходящим способом. Подходящий способ введения обеспечивает возможность осуществление композицией или агентом его предполагаемой функции. Например, если подходящий способ является внутривенным, то композицию вводят посредством введения композиции или агента в вену субъекта.

В данном контексте выражение «иммунный ответ против терапевтической нуклеиновой кислоты», «иммунный ответ против вектора переноса» или подобные выражения относятся к любому нежелательному иммунному ответу против терапевтической нуклеиновой кислоты, вирусной или невирусной по своему происхождению. В некоторых вариантах реализации нежелательный иммунный ответ представляет собой антиген-специфический иммунный ответ против самого вирусного вектора переноса. В некоторых вариантах реализации иммунный ответ является специфическим в отношении вектора переноса, который может представлять собой двухцепочечную ДНК, одноцепочечную РНК или двухцепочечную РНК. В других вариантах реализации иммунный ответ является специфическим в отношении последовательности вектора переноса. В других вариантах реализации иммунный ответ является специфическим в отношении содержания CpG в векторе переноса.

В данном контексте термины «носитель» и «вспомогательное вещество» включают любые и все растворители, дисперсионные среды, жидкие среды, покрытия, разбавители, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты и агенты для замедления абсорбции, буферы, растворы-носители, суспензии, коллоиды и т.п. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. В композиции также могут быть включены вспомогательные активные ингредиенты. Выражение «фармацевтически приемлемые» относится к молекулярным соединениям и композициям, которые не вызывают токсическую, аллергическую или аналогичную нежелательную реакцию при введении реципиенту.

В данном контексте термин «зкДН» относится к бескапсидной линейной двухцепочечной (дц) дуплексной ДНК с замкнутыми концами для невирусного переноса гена, синтетического или иного. Подробное описание зкДНК представлено в международной заявке PCT/US 2017/020828, поданной 3 марта 2017 года, полное содержание которой в явном виде включено в данный документ посредством ссылки. Некоторые способы получения зкДНК, содержащей различные последовательности и конфигурации инвертированных концевых повторов (ITR), с использованием клеточных способов описаны в примере 1 международных заявок PCT/US 18/49996, поданной 7 сентября 2018 года, и PCT/US 2018/064242, поданной 6 декабря 2018 года, полное содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки. Некоторые способы получения синтетических векторов зкДНК, содержащих различные последовательности и конфигурации ITR, описаны, например, в международной заявке PCT/US 2019/14122, поданной 18 января 2019 года, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки. В данном контексте термины «вектор зкДНК», и «зкДН» использованы взаимозаменяемо. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, зкДНК представляет собой линейную дуплексную ДНК CELiD с замкнутыми концами (closed-ended linear duplex, CELiD). В соответствии с некоторыми вариантами реализации, зкДНК представляет собой миникольцо на основе ДНК. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, зкДНК представляет собой минималистичный иммунологически определяемый вектор экспрессии генов (MIDGE). В соответствии с некоторыми вариантами реализации, зкДНК представляет собой мини-нитевую ДНК. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, зкДНК представляет собой гантелеобразную дуплексную линейную ДНК с замкнутыми концами, содержащую две шпилечные структуры ITR на 5'- и 3'-концах экспрессионной кассеты. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, зкДНК представляет собой ДНК Doggybone™.

В данном контексте термин «зкДНК-бакмида» относится к геному инфекционного бакуловируса, содержащему геном зкДНК в качестве межмолекулярного дуплекса, который может распространять Е. coli в форме плазмиды, а также может действовать как челночный вектор для бакуловируса.

В данном контексте термин «зкДНК-бакуловирус» относится к бакуловирусу, который содержит геном зкДНК в качестве межмолекулярного дуплекса в геноме бакуловируса.

В данном контексте термины «клетка насекомого, инфицированная зкДНК-бакуловирусом» и «зкДНК-ВПС» использованы взаимозаменяемо и относятся к клетке беспозвоночного хозяина (включая, но не ограничиваясь этим, клетку насекомого (например, клетку Sf9)), инфицированную зкДНК-бакуловирусом.

В данном контексте термин «геном зкДНК» относится к экспрессионной кассете, которая дополнительно содержит по меньшей мере одну область инвертированного концевого повтора. Геном зкДНК может дополнительно содержать одну или более спейсерных областей. В некоторых вариантах реализации геном зкДНК включен в качестве межмолекулярного дуплексного полинуклеотида ДНК в геном плазмиды или вируса.

В данном контексте термины «регуляторные последовательности ДНК», «управляющие элементы» и «регулирующие элементы» использованы взаимозаменяемо и относятся к транскрипционным и трансляционным управляющим последовательностям, таким как промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, терминаторы, сигналы разрушения белков и т.п., которые обеспечивают и/или регулируют транскрипцию некодирующей последовательности (например, РНК, нацеленной на ДНК) или кодирующей последовательности (например, сайт-направленного модифицирующего полипептида или полипептида Cas9/Csn1) и/или регулируют трансляцию кодированного полипептида.

В данном контексте «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» активного агента или терапевтического агента, такого как терапевтическая нуклеиновая кислота, представляет собой количество, достаточное для обеспечения требуемого эффекта, например, ингибирования экспрессии последовательности-мишени по сравнению с уровнем экспрессии, обнаруживаемым в отсутствие терапевтической нуклеиновой кислоты. Подходящие анализы для измерения экспрессии гена-мишени или последовательности-мишени включают, например, изучение уровней белка или РНК с использованием технологий, известных специалистам в данной области техники, таких как дот-блоттинг, нозерн-блоттинг, гибридизация in situ, иммуноферментный твердофазный анализ, иммунопреципитация, функция фермента, а также фенотипические анализы, известные специалистам в данной области техники.

В данном контексте термин «экзогенный» относится к веществу, присутствующему в клетке, отличному от его природного источника. Термин «экзогенный» в данном контексте может относиться к нуклеиновой кислоте (например, к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид) или к полипептиду, который искусственно внедрен в биологическую систему, такую как клетка или организм, где он не встречается естественным образом, если необходимо внедрить данную нуклеиновую кислоту или полипептид в такую клетку или организм. Альтернативно, «экзогенный» может относиться к нуклеиновой кислоте или полипептиду, который внедрен искусственным способом в биологическую систему, такую как клетка или организм, где он встречается в относительно малом количестве, если необходимо увеличить количество такой нуклеиновой кислоты или полипептида в клетке или организме, например, для создания эктопической экспрессии или уровней. Напротив, в данном контексте термин «эндогенный» относится к веществу, которое является нативным для данной биологической системы или клетки.

В данном контексте термин «экспрессия» относится к клеточным процессам, участвующим в продуцировании РНК и белков, и, в зависимости от ситуации, в секреции белков, включая, где это уместно, но не ограничиваясь ими, например, транскрипцию, процессинг транскрипта, трансляцию и сворачивание, модификацию и процессинг белка. В данном контексте выражение «продукты экспрессии» включает РНК, транскрибированную из гена (например, трансген), и полипептиды, полученные в результате трансляции мРНК, транскрибированной из гена.

В данном контексте термин «вектор экспрессии» относится к вектору, который направляет экспрессию РНК или полипептида из последовательностей, связанных с транскрипционными регуляторными последовательностями в данном векторе. Экспрессированные последовательности часто, но не обязательно, являются гетерологичными для клетки-хозяина. Вектор экспрессии может содержать дополнительные элементы, например, вектор экспрессии может содержать две репликационные системы, что обеспечивает возможность его сохранения в двух организмах, например, в клетках человека для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Вектор экспрессии может быть рекомбинантным вектором.

В данном контексте термины «экспрессионная кассета» и «экспрессионное звено» использованы взаимозаменяемо и относятся к последовательности гетерологичной ДНК, которая функционально связана с промотором или другой регуляторной последовательностью ДНК, достаточной для обеспечения направленной транскрипции трансгена вектора ДНК, например, синтетического вектора AAV. Подходящие промоторы включают, например, тканеспецифические промоторы. Промоторы также могут иметь происхождение от AAV.

В данном контексте «фланкирующая» относится к относительному положению одной последовательности нуклеиновой кислоты относительно другой последовательности нуклеиновой кислоты. Обычно в последовательности ABC фрагмент В фланкирован фрагментами А и С. Это относится и к расположению АхВхС. Таким образом, фланкирующая последовательность предшествует или следует за фланкированной последовательностью, но не обязательно должна быть непрерывной или непосредственно смежной с фланкированной последовательностью. В одном варианте реализации термин «фланкирующая» относится к концевым повторам на каждом конце линейного одноцепочечного синтетического вектора AAV.

В данном контексте термины «гэп» и «ник» использованы взаимозаменяемо и относятся к прерывающейся части синтетического вектора ДНК по данному изобретению, образующей растяжение части одноцепочечной ДНК, которая в остальном представляет собой двухцепочечную зкДНК. Гэп может иметь длину от 1 пары оснований до 100 пар оснований в одной цепи дуплексной ДНК. Типичные гэпы, сконструированные и созданные способами, описанными в данном документе, а также синтетические векторы, полученные предложенными способами, могут иметь, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60 п.о. в длину. Примеры гэпов по данному изобретению могут быть от 1 п.о. до 10 п.о. в длину, от 1 до 20 п.о. в длину, от 1 до 30 п.о. в длину.

В данном контексте термин «ген» использован в широком смысле для обозначения любого сегмента нуклеиновой кислоты, связанного с экспрессией данной РНК или белка, in vitro или in vivo. Таким образом, гены включают области, кодирующие экспрессированные РНК (которые обычно содержат последовательности, кодирующие полипептид), и часто регуляторные последовательности, необходимые для их экспрессии. Гены могут быть получены из различных источников, включая клонирование из источника, представляющего собой интерес, или синтез на основании известной или спрогнозированной информации о последовательности, и могут включать последовательности, сконструированные для обеспечения особых требуемых параметров.

В данном контексте выражение «генетическое заболевание» или «генетическое нарушение» относится к заболеванию, частично или полностью, прямо или косвенно обусловленному одной или более патологиями в геноме, включая, в частности, патологическое состояние, которое присутствует с рождения. Патология может представлять собой мутацию, вставку или делецию в гене. Патология может влиять на кодирующую последовательность гена или его регуляторную последовательность.

В данном контексте термин «гетерологичная» относится к последовательности нуклеотида или полипептида, которая не встречается в нативной нуклеиновой кислоте или белке, соответственно. Гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты может быть связана с последовательностью природной нуклеиновой кислоты (или ее вариантом) (например, с помощью генной инженерии) с образованием гибридной последовательности нуклеотида, кодирующей гибридный полипептид. Гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты может быть связана с полипептидным вариантом (например, с помощью генной инженерии) с образованием нуклеотидной последовательности, кодирующей слитый полипептидный вариант.

В данном контексте термин «клетка хозяина» относится к клетке любого типа, которая подвержена трансформации, трансфекции, трансдукции и т.п. с применением терапевтических средств на основе нуклеиновых кислот по данному изобретению. В качестве неограничивающих примеров, клетка хозяина может представлять собой выделенную первичную клетку, плюрипотентные стволовые клетки, клетки CD34⁺, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки или любые из множества иммортализованных клеточных линий (например, клетки HepG2). Альтернативно, клетка хозяина может представлять собой in situ или in vivo клетку в ткани, органе или организме. Кроме того, клетка хозяина может представлять собой клетку-мишень, например, млекопитающего субъекта (например, пациента-человека, нуждающегося в генной терапии).

В данном контексте «индуцируемый промотор» относится к промотору, который характеризуется инициацией или усилением транскрипционной активности в присутствии, под действием или при приведении в контакт индуктора или индуцирующего агента. «Индуктор» или «индуцирующий агент» в данном контексте может быть эндогенным или обычно экзогенным соединением или белком, который вводят таким образом, что он является активным для индукции транскрипционной активности индуцируемого промотора. В некоторых вариантах реализации индуктор или индуцирующий агент, т.е. химическое вещество, соединение или белок, сам может быть результатом транскрипции или экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты (т.е. индуктор может представлять собой белок-индуктор, экспрессированный другим компонентом или модулем), который сам может находиться под управлением индуцируемого промотора. В некоторых вариантах реализации индуцируемый промотор индуцируется в отсутствие определенных агентов, таких как репрессор. Примеры индуцируемый промоторов включают, но не ограничиваясь ими, тетрациклин, металлотионин, экдизон, вирусы млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; а также длинный концевой повтор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV-LTR)) и другие стероид-чувствительные промоторы, рапамицин-чувствительные промоторы и т.п.

В данном контексте термин «in vitro» относится к анализам и способам, которые не требуют присутствия клетки с интактной мембраной, таким как клеточные экстракты, и могут относиться к внедрению программируемой синтетической биологической схемы в неклеточную систему, такую как среда, не содержащая клетки или клеточные системы, такая как клеточные экстракты.

В данном контексте термин «in vivo» относится к анализам или способам, которые осуществляют в организме или внутри организма, такого как многоклеточное животное. В некоторых аспектах, описанных в данном документе, способ или применение может быть описано как осуществляемое «in νiνo», если использован одноклеточный организм, такой как бактерия. Термин «in vivo» относится к способам и применению, которое осуществляют с использованием живой клетки с интактной мембраной, которая находится вне организма многоклеточного животного или растения, например, эксплантаты, выращенные клетки, включая первичные клетки и клеточные линии, трансформированные клеточные линии и экстрагированные ткани или клетки, включая, среди прочих, кровяные клетки.

В данном контексте термин «липид» относится к группе органических соединений, которые включают, но не ограничиваясь ими, сложные эфиры жирных кислот и характеризуются нерастворимостью в воде, но растворимостью во многих органических растворителях. Обычно их делят на по меньшей мере три класса: (1) «простые липиды», которые включают жиры и масла, а также воски; (2) «сложные липиды», которые включают фосфолипиды и гликолипиды; и (3) «производные липиды», такие как стероиды.

Иллюстративные примеры фосфолипидов включают, но не ограничиваясь ими, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит, фосфатидную кислоту, пальмитоилолеоилфосфатидилхолин, лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилэтаноламин, дипальмитоилфосфатидилхолин, диолеоилфосфатидилхолин, дистеароилфосфатидилхолин и дилинолеоилфосфатидилхолин. Другие соединения, не имеющие фосфора, такие как сфинголипид, гликосфинголипидные семейства, диацилглицерины и β-ацилоксикислоты, также входят в группу, называемую амфипатическими липидами. Кроме того, амфипатические липиды, описанные выше, могут быть смешаны с другими липидами, включая триглицериды и стерины.

В одном варианте реализации липидные композиции содержат одну или более третичных аминогрупп, одну или более фенильных сложноэфирных связей и дисульфидную связь.

В данном контексте термин «липидный конъюгат» относится к конъюгированному липиду, который ингибирует агрегацию липидных частиц (например, липидных наночастиц). Такие липидные конъюгаты включают, но не ограничиваясь ими, ПЭГ-липидные конъюгаты, такие как, например, ПЭГ, связанные с диалкилоксипропилами (например, конъюгаты ПЭГ-DAA); ПЭГ, связанные с диацилглицеринами (например, конъюгаты ПЭГ-DAG); ПЭГ, связанные с холестерином; ПЭГ, связанные с фосфатидилэтаноламинами; и ПЭГ, конъюгированные с церамидами (см., например, патент США №5885613), ионизируемые ПЭГ-липиды, полиоксазолин (POZ)-липидные конъюгаты (например, конъюгаты POZ-DAA; см., например, предварительную заявку на патент США №61/294828, поданную 13 января 2010 года, и предварительную заявку на патент США №61/295140, поданную 14 января 2010 года), полиамидные олигомеры (например, АТТА-липидные конъюгаты) и их смеси. Дополнительные примеры ΡΟΖ-липидных конъюгатов описаны в публикации РСТ № WO 2010/006282. ПЭГ или ΡΟΖ могут быть конъюгированы напрямую с липидом или могут быть связаны с липидом через линкерный фрагмент. Можно использовать любой линкерный фрагмент, пригодный для связывания ПЭГ или ΡΟΖ с липидом, включая, например, линкерные фрагменты, не содержащие сложный эфир, и линкерные фрагменты, содержание сложные эфир. В некоторых предпочтительных вариантах реализации используют линкерные фрагменты, не содержащие сложный эфир, такие как амиды или карбаматы. Полное описание каждого из вышеуказанных патентных документов включено в данный документ посредством ссылки во всех отношениях.

В данном контексте термин «инкапсулированный в липид» относится к липидной частице, которая обеспечивает активный агент или терапевтический агент, такой как нуклеиновая кислота (например, ASO, мРНК, миРНК, зкДНК, вирусный вектор) при полной инкапсуляции, частичной инкапсуляции или в обоих случаях. В предпочтительном варианте реализации нуклеиновая кислота полностью инкапсулирована в липидную частицу (например, с образованием липидной частицы, содержащей нуклеиновую кислоту).

В данном контексте термины «липидная частица» или «липидная наночастица» относятся к липидной композиции, которая может быть использована для доставки терапевтического агента, такого как терапевтическая нуклеиновая кислота (ТНК) в требуемый сайт-мишень (например, в клетку, ткань, орган и т.п.) (упоминается как «липидная частица ТНК», «липидная наночастица ТНК» или «LNP ТНК»). В одном варианте реализации липидная частица по данному изобретению представляет собой липидную частицу, содержащую терапевтическую нуклеиновую кислоту, которая обычно получена из ионизируемого липида, некатионного липида и необязательно конъюгированного липида, который препятствует агрегации частицы. В других предпочтительных вариантах реализации терапевтический агент, такой как терапевтическая нуклеиновая кислота, может быть инкапсулирован в липидную часть данной частицы, защищая ее от ферментативного расщепления. В одном варианте реализации липидная частица содержит нуклеиновую кислоту (например, зкДНК) и липид, содержащий одну или более третичных аминогрупп, одну или более фенильных сложноэфирных связей и дисульфидную связь.

Липидные частицы по данному изобретению обычно имеют средний диаметр от около 20 нм до около 120 нм, от около 30 нм до около 150 нм, от около 40 нм до около 150 нм, от около 50 нм до около 150 нм, от около 60 нм до около 130 нм, от около 70 нм до около 110 нм, от около 70 нм до около 100 нм, от около 80 нм до около 100 нм, от около 90 нм до около 100 нм, от около 70 до около 90 нм, от около 80 нм до около 90 нм, от около 70 нм до около 80 нм, или около 30 нм, около 35 нм, около 40 нм, около 45 нм, около 50 нм, около 55 нм, около 60 нм, около 65 нм, около 70 нм, около 75 нм, около 80 нм, около 85 нм, около 90 нм, около 95 нм, около 100 нм, около 105 нм, около 110 нм, около 115 нм, около 120 нм, около 125 нм, около 130 нм, около 135 нм, около 140 нм, около 145 нм или около 150 нм.

В данном контексте термин «гидрофобный липид» относится к соединению, содержащему аполярные группы, которые включают, но не ограничиваясь ими, длинноцепочечные насыщенные и ненасыщенные алифатические углеводородные группы, и такие группы необязательно замещены одной или более ароматическими, циклоалифатическими или гетероциклическими группами. Подходящие примеры включают, но не ограничиваясь ими, диацилглицерин, диалкилглицерин, Ν,Ν-диалкиламино, 1,2-диацилокси-3-аминопропан и 1,2-диалкил-3-аминопропан.

В данном контексте термин «ионизируемый липид» относится к липиду, например, катионному липиду, содержащему по меньшей мере одну протонируемую или депротонируемую группу, так что данный липид является положительно заряженным при рН, равном или ниже физиологического рН (например, рН 7,4), является нейтральным при втором рН, который предпочтительно равен или выше физиологического рН. Специалистам в данной области техники понятно, что присоединение или отщепление протонов в зависимости от рН представляет собой равновесный процесс, и что упоминание заряженного или нейтрального липида относится к природе преобладающих частиц и не подразумевает требование, чтобы весь липид присутствовал в заряженной или нейтральной форме. Обычно ионизируемые липиды имеют pKa протонируемой группы в диапазоне от около 4 до около 7. В некоторых вариантах реализации ионизируемый липид может включать «расщепляемый липид» или «SS-расщепляемый липид».

В данном контексте термин «нейтральный липид» относится к любому количеству липидных частиц, которые существуют либо в незаряженной, либо в нейтральной цвиттер-ионной форме при выбранном рН. При физиологическом рН такие липиды включают, например, диацилфосфатидилхолин, диацилфосфатидилэтаноламин, церамид, сфингомиелин, цефалин, холестерин, цереброзиды и диацилглицерины.

В данном контексте термин «анионный липид» относится к любому липиду, который отрицательно заряжен при физиологическом рН. Такие липиды включают, но не ограничиваясь ими, фосфатидилглицерины, кардиолипины, диацилфосфатидилсерины, диацилфосфатидные кислоты, Ν-додеканоилфосфатидилэтаноламины, Ν-сукцинилфосфатидилэтаноламины, Ν-глутарилфосфатидилэтаноламины, лизилфосфатидилглицерины, пальмитоилолеоилфосфатидилглицерин (POPG) и другие анионные модифицирующие группы, связанные с нейтральными липидами.

В данном контексте термин «некатионный липид» относится к любому амфипатическому липиду, а также к любому другому нейтральному липиду или анионному липиду.

В данном контексте термин «расщепляемый липид» или «SS-расщепляемый липид» относится к липиду, содержащему расщепляемое звено, дисульфидную связь. В одном варианте реализации расщепляемые липиды содержат третичный амин, который реагирует на кислотный компартмент, например, эндосому или лизосому, что приводит к дестабилизации мембраны, и дисульфидную связь, которая может расщепляться в восстановительной среде, такой как цитоплазма. В одном варианте реализации расщепляемый липид представляет собой ионизируемый липид. В одном варианте реализации расщепляемый липид представляет собой катионный липид. В одном варианте реализации расщепляемый липид представляет собой ионизируемый катионный липид. Расщепляемые липиды более подробно описаны в данном документе.

В данном контексте термин «органический раствор липида» относится к композиции, содержащей, в целом или отчасти, органический растворитель, содержащий липид.

В данном контексте термин «липосома» относится к липидным молекулам, собранным в сферическую конфигурацию, инкапсулирующую внутренний водный объем, который сегрегирован от внешней водной среды. Липосомы представляют собой везикулы, которые содержат по меньшей мере один липидный двойной слой. Липосомы обычно используют в качестве носителей для доставки лекарственного/терапевтического средства в контексте фармацевтической разработки. Они действуют посредством слияния с клеточной мембраной и изменения положения их липидной структуры для доставки лекарственного средства или активного фармацевтического ингредиента. Липосомные композиции для такой доставки обычно состоят из фосфолипидов, особенно соединений, содержащих фосфатидилхолиновую группу, однако такие композиции могут содержать также другие липиды.

В данном контексте термин «локальная доставка» относится к доставке активного агента, такого как интерферирующая РНК (например, миРНК), непосредственно к сайту-мишени внутри организма. Например, агент может быть локально доставлен путем непосредственной инъекции в очаг заболевания, такой как опухоль, или в другой сайт-мишень, такой как очаг воспаления, или орган-мишень, такой как печень, сердце, поджелудочная железа, почка и т.п.

В данном контексте термин «нзкДНК» или «никированная (содержащая разрыв) зкДНК» относится к ДНК с замкнутыми концами, содержащей разрыв или гэп размером 1-100 пар оснований в стволовой области или в спейсерной области слева, в направлении 5' от открытой рамки считывания (например, экспрессируемого промотора и трансгена).

В данном контексте термин «нуклеиновая кислота» относится к полимеру, содержащему по меньшей мере два нуклеотида (т.е. дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды) в одно- или двухцепочечной форме, и включает ДНК, РНК и их гибриды. ДНК может быть в форме, например, антисмысловых молекул, плазмидной ДНК, дуплексов ДНК-ДНК, предварительно конденсированной ДНК, продуктов ПЦР, векторов (Р1, РАС, ВАС, YAC, искусственных хромосом), экспрессионных кассет, гибридных последовательностей, хромосомной ДНК или производных и комбинаций указанных групп. ДНК может быть в форме миникольца, плазмиды, бакмиды, минигена, мини-нитевой ДНК (вектор линейной ковалентно замкнутой ДНК), линейной дуплексной ДНК с замкнутыми концами (CELiD или зкДНК), ДНК Doggybone™, гантелеобразной ДНК, минималистичного иммунологически определяемого вектора экспрессии генов (MIDGE), вирусного вектора или невирусных векторов. РНК может быть в форме малой интерферирующей РНК (миРНК), дцРНК субстрата Дайсера, малой шпилечной РНК (мшРНК), асимметричной интерферирующей РНК (аиРНК), микроРНК (микроРНК), мРНК, рРНК, тРНК, вирусной РНК (вРНК) и их комбинаций. Нуклеиновые кислоты включают нуклеиновые кислоты, содержащие известные нуклеотидные аналоги или модифицированные скелетные остатки или связи, которые являются синтетическими, природными и неприродными и которые имеют связывающие свойства, подобные эталонной нуклеиновой кислоте. Примеры таких аналогов и/или модифицированных остатков включают, без ограничения, тиофосфаты, фосфордиамидат-морфолиновый олигомер (морфолино), фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2'-O-метилрибонуклеотиды, закрытую нуклеиновую кислоту (LNA™) и пептидные нуклеиновые кислоты (PNA). При отсутствии специального ограничения, данный термин включает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые имеют связывающие свойства, подобные эталонной нуклеиновой кислоте. Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также в явном виде включает ее консервативно модифицированные варианты (например, замещения вырожденного кодона), аллели, ортологи, SNP и комплементарные последовательности, а также последовательности, указанные в явном виде.

В данном контексте выражения «терапевтическое средство на основе нуклеиновой кислоты», «терапевтическая нуклеиновая кислота» и «ТНК» использованы взаимозаменяемо и относятся к любому способу лечения с применением нуклеиновых кислот в качестве активного компонента терапевтического агента для лечения заболевания или расстройства. В данном контексте указанные выражения относятся к терапевтическим средствам на основе РНК и к терапевтическим средствам на основе ДНК. Неограничивающие примеры терапевтических средств на основе РНК включают мРНК, антисмысловые РНК и олигонуклеотиды, рибозимы, аптамеры, интерферирующие РНК (РНКи), дцРНК субстрата Дайсера, малую шпилечную РНК (мшРНК), асимметричную интерферирующую РНК (аиРНК) и микроРНК (микроРНК). Неограничивающие примеры терапевтических средств на основе ДНК включают миникольцевую ДНК, миниген, вирусные векторы ДНК (например, геном лентивируса или AAV) или невирусные векторы ДНК, линейную дуплексную ДНК с замкнутыми концами (зкДНК/CELiD), плазмиды, бакмиды, векторы ДНК Doggybone™, минималистичный иммунологически определяемый вектор экспрессии генов (MIDGE), невирусный вектор мини-нитевой ДНК (вектор линейной ковалентно замкнутой ДНК) и минимальный вектор гантелеобразной ДНК («гантелеобразной ДНК»). В данном контексте термин «LNP ТНК» относится к липидной частице, содержащей по меньшей мере одну из ТНК, описанных выше.

В данном контексте «нуклеотиды» содержат сахарную дезоксирибозу (ДНК) или рибозу (РНК), основание и фосфатную группу. Нуклеотиды связаны друг с другом фосфатными группами.

В данном контексте «функционально связанный» относится к непосредственному присоединению, при котором компоненты, описанные данным термином, находятся во взаимосвязи, обеспечивающей возможность их функционирования предполагаемым образом. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор влияет на ее транскрипцию или экспрессию. Может быть сказано, что промотор управляет экспрессией или управляет транскрипцией последовательности нуклеиновой кислоты, которую он регулирует. Выражения «функционально связанный», «функционально расположенный», «функционально соединенный», «под управлением» и «под транскрипционным управлением» означают, что промотор находится в правильном функциональном положении и/или ориентации относительно последовательности нуклеиновой кислоты, которую он регулирует, для обеспечения контроля инициации транскрипции и/или экспрессии данной последовательности. «Инвертированный промотор» в данном контексте относится к промотору, в котором последовательность нуклеиновой кислоты находится в инвертированной ориентации, как если бы кодирующая цепь стала теперь некодирующей цепью, и наоборот. Последовательности инвертированных промоторов можно использовать в различных вариантах реализации для регуляции состояния переключения. Кроме того, в различных вариантах реализации промотор может быть использован вместе с энхансером.

В данном контексте термин «промотор» относится к любой последовательности нуклеиновой кислоты, которая регулирует экспрессию другой последовательности нуклеиновой кислоты посредством управления транскрипцией последовательности нуклеиновой кислоты, которая может быть гетерологичным геном-мишенью, кодирующим белок или РНК. Промоторы могут быть конститутивными, индуцибельными, репрессируемыми, тканеспецифическими или любыми их комбинациями. Промотор представляет собой контрольную область последовательности нуклеиновой кислоты, в которой контролируется инициация и скорость транскрипции остальной части последовательности нуклеиновой кислоты. Промотор также может содержать генетические элементы, на которых могут связываться регуляторные белки и молекулы, такие как РНК-полимераза и другие факторы транскрипции. В последовательности промотора находится сайт инициации транскрипции, а также белок-связывающие домены, отвечающие за связывание РНК-полимеразы. Эукариотические промоторы часто, но не всегда содержат боксы «ТАТА» и боксы «САТ». Различные промоторы, включая индуцибельные промоторы, могут быть использованы для управления экспрессией трансгенов в синтетических векторах AAV, описанных в данном документе. Последовательность промотора может быть связана на ее 3'-конце через сайт инициации транскрипции и продолжаться влево (в 5'-направлении), включая минимальное количество оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровне, пригодном для обнаружения, выше фонового значения.

Промотор может представлять собой промотор, который естественным образом ассоциирован с геном или последовательностью, что может быть достигнуто посредством выделения 5'-некодирующих последовательностей, расположенных слева от кодирующего сегмента и/или экзона данного гена или последовательности. Такой промотор может быть упомянут как «эндогенный». Таким же образом, в некоторых вариантах реализации энхансер может быть естественным образом ассоциирован с последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной после или до указанной последовательности. В некоторых вариантах реализации сегмент кодирующей нуклеиновой кислоты находится под управлением «рекомбинантного промотора» или «гетерологичного промотора», каждый из которых относится к промотору, который обычно не ассоциирован с кодируемой последовательностью нуклеиновой кислоты, с которой он функционально связан в естественном окружении. Таким же образом, «рекомбинантный или гетерологичный энхансер» относится к энхансеру, который обычно не ассоциирован с данной последовательностью нуклеиновой кислоты в естественном окружении. Такие промоторы или энхансеры могут включать промоторы или энхансеры других генов; промоторы или энхансеры, выделенные из любой другой прокариотической, вирусной или эукариотической клетки; и синтетические промоторы или энхансеры, которые не являются «природными», т.е. содержат другие элементы или другие области регуляции транскрипции, и/или мутации, которые изменяют экспрессию в способах генной инженерии, известных в данной области техники. Помимо получения последовательностей нуклеиновых кислот промоторов и энхансеров синтетическими способами, последовательности промоторов могут быть получены с помощью технологии рекомбинантного клонирования и/или амплификации нуклеиновой кислоты, включая ПЦР, в сочетании с синтетическими биологическими схемами и модулями, описанными в данном документе (см., например, патент США №4683202, патент США №5928906, полное описание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки). Кроме того, предусмотрено, что могут быть использованы также контрольные последовательности, которые управляют транскрипцией и/или экспрессией последовательностей в неядерных органеллах, таких как митохондрии, хлоропласты и т.п.

В данном контексте термины «связывающий сайт Rep» («RBS») и «связывающий элемент Rep» («RBE») использованы взаимозаменяемо и относятся к связывающему сайту для белка Rep (например, Rep 78 AAV или Rep 68 AAV), который при связывании с белком Rep обеспечивает возможность осуществления белком Rep его сайт-специфической эндонуклеазоной активности в отношении последовательности, включающей RBS. Последовательность RBS и ее обратный комплемент вместе образуют один RBS. Последовательности RBS хорошо известны в данной области техники и включают, например, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3', последовательность RBS, идентифицированную в AAV2.

В данном контексте выражение «рекомбинантный вектор» относится к вектору, который содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты или «трансген», который способен к экспрессии in vivo. Следует понимать, что векторы, описанные в данном документе, в некоторых вариантах реализации можно комбинировать с другими пригодными композициями и терапевтическими средствами. В некоторых вариантах реализации вектор является эписомным. Использование подходящего эписомного вектора обеспечивает способ сохранения у субъекта интересующего нуклеотида во внехромосомной ДНК с высоким количеством копий, исключая возможный эффект хромосомной интеграции.

В данном контексте термин «репортер» относится к белку, который можно использовать для обеспечения считывания, пригодного для обнаружения. Репортер обычно создает пригодный для измерения сигнал, такой как флуоресценция, цвет или люминесценция. Последовательности, кодирующие репортерный белок, кодируют белки, присутствие которых можно без труда наблюдать в клетке или организме.

В данном контексте термины «смысловая» и «антисмысловая» относятся к ориентации структурного элемента в полинуклеотиде. Смысловые и антисмысловые версии элемента являются обратными комплементами друг друга.

В данном контексте термин «идентичность последовательностей» относится к родству между двумя нуклеотидными последовательностями. В контексте данного описания степень идентичности последовательностей между двумя дезоксирибонуклеотидными последовательностями определяют с помощью алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, выше), реализованного в программе Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al, 2000, выше), предпочтительно версии 3.0.0 или более поздней версии. Необязательные используемые параметры представляют собой штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрицу замен EDNAFULL (EMBOSS версии NCBI NUC4.4). Результат работы Needle, обозначенный как «наиболее длинная идентичность» (полученная с применением опции -nobrief), используют в качестве процентной идентичности и рассчитывают следующим образом: (идентичные дезоксирибонуклеотиды*100)/(длина выравнивания - общее количество гэпов в выравнивании). Длина выравнивания предпочтительно составляет по меньшей мере 10 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 25 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 50 нуклеотидов и наиболее предпочтительно по меньшей мере 100 нуклеотидов.

В данном контексте термин «спейсерная область» относится к промежуточной последовательности, которая разделяет функциональные элементы в векторе или геноме. В некоторых вариантах реализации спейсерные области AAV удерживают два функциональных элемента на требуемом расстоянии для обеспечения оптимальной функциональности. В некоторых вариантах реализации спейсерные области обеспечивают или увеличивают генетическую стабильность вектора или генома. В некоторых вариантах реализации спейсерные области облегчают доступные генетические манипуляции с геномом посредством обеспечения удобного положения для клонирующих сайтов и гэпа с заданным количеством пар оснований. Например, в некоторых вариантах реализации олигонуклеотидный «полилинкер» или «полисайт клонирования», содержащий несколько сайтов рестрикционной эндонуклеазы, или последовательность неоткрытой рамки считывания, разработанную так, чтобы она не содержала известных сайтов связывания белка (например, факторов транскрипции), может быть расположен в вкеторе или геноме так, чтобы разделять цис-действующие факторы, например, посредством вставки 6-мера, 12-мера, 18-мера, 24-мера, 48-мера, 86-мера, 176-мера и т.д.

В данном контексте термин «субъект» относится к человеку или животному, в отношении которого осуществляют лечение, включая профилактическое лечение, с применением терапевтической нуклеиновой кислоты по данному изобретению. Обычно животное представляет собой позвоночное животное, такое как, но не ограничиваясь ими, примат, грызун, домашнее животное или промысловое животное. Приматы включают, но не ограничиваясь ими, шимпанзе, яванских макак, паукообразных обезьян и макак, например, резус. Грызуны включают мышей, крыс, сурков, хорьков, кроликов и хомяков. Домашние и промысловые животные включают, но не ограничиваясь ими, коров, лошадей, свиней, оленей, бизонов, буйволов, животных семейства кошачьих, например, домашних кошек, животных семейства псовых, например, собак, лисиц, волков, животных семейства птиц, например, кур, эму, страусов, а также рыб, например, форель, сомов и семгу. В некоторых вариантах реализации аспектов, описанных в данном документе, субъектом является млекопитающее, например, примат или человек. Субъект может быть мужского или женского пола. Кроме того, субъектом может быть младенец или ребенок. В некоторых вариантах реализации субъект может быть новорожденным или нерожденным субъектом, например, субъект находится in utero. Предпочтительно, субъектом является млекопитающее. Млекопитающим может быть человек, низший примат, мышь, крыса, собака, кошка, лошадь или корова, но не ограничиваясь приведенными примерами. Млекопитающие, отличные от людей, могут быть преимущественно использованы в качестве субъектов, которые являются животными моделями заболеваний и расстройств. Кроме того, способы и композиции, описанные в данном документе, могут быть использованы для одомашненных животных и/или домашних питомцев. Субъект-человек может быть любого возраста, пола, расы или этнической группы, например, европеоидной расы (белый), азиат, африканец, черный, афроамериканец, афроевропеец, латиноамериканец, представитель Ближнего Востока и т.д. В некоторых вариантах реализации субъект может быть пациентом или другим субъектом в условиях клиники. В некоторых вариантах реализации субъект уже проходит лечение. В некоторых вариантах реализации субъектом является эмбрион, плод, новорожденный, младенец, ребенок, подросток или взрослая особь. В некоторых вариантах реализации субъектом является плод человека, новорожденный человек, младенец человека, ребенок человека, подросток человека или взрослый человек. В некоторых вариантах реализации субъектом является эмбрион животного или нечеловеческий эмбрион, или эмбрион примата, не являющегося человеком. В некоторых вариантах реализации субъектом является эмбрион человека.

В данном контексте выражение «нуждающийся субъект» относится к субъекту, которому (i) будет введена липидная частица ТНК (или фармацевтическая композиция, содержащая липидную частицу ТНК) по данному изобретению, (ii) который принимает липидную частицу ТНК (или фармацевтическую композицию, содержащую липидную частицу ТНК) по данному изобретению; или (iii) который принимал липидную частицу ТНК (или фармацевтическую композицию, содержащую липидную частицу ТНК) по данному изобретению, если из контекста или применения данного выражения не следует иное.

В данном контексте термин «подавляет», «снижает», «препятствует», «ингибирует» и/или «уменьшает» (и подобные термины) обычно относится к акту прямого или косвенного снижения концентрации, уровня, функции, активности или свойства относительно естественного, ожидаемого или среднего значения, или относительно контрольного состояния.

В данном контексте термины «синтетический вектор AAV» и «синтетическое получение вектора AAV» относятся к вектору AAV и к синтетическим способам его получения в полностью бесклеточных условиях.

В данном контексте термин «системная доставка» относится к доставке липидных частиц, которая приводит к широкому биораспределению активного агента, такого как интерферирующая РНК (например, миРНК), в организме. Некоторые технологии введения могут приводить к системной доставке некоторых агентов, но не других агентов. Системная доставка означает, что подходящее, предпочтительно терапевтическое количество агента воздействует на большинство частей тела. Для достижения широкого биораспределения обычно необходим определенный период существования в кровотоке, чтобы данный агент не подвергается быстрому разрушению или клиренсу (например, в органах пресистемного метаболизма (печени, легких и т.д.) или под действием быстрого, неспецифического клеточного связывания) до достижения очага заболевания, удаленного от места введения. Системная доставка липидных частиц (например, липидных наночастиц) может быть осуществлена любыми способами, известными в данной области техники, включая, например, внутривенное, подкожное и интраперитонеальное введение. В предпочтительном варианте реализации системную доставку липидных частиц (например, липидных наночастиц) обеспечивают посредством внутривенной доставки.

В данном контексте термины «сайт концевого разрешения» и «TRS» использованы взаимозаменяемо и относятся к области, в которой Rep образует тирозин-фосфодиэфирную связь с 5'-тимидином с образованием 3'-ОН, который служит в качестве субстрата для продления ДНК с помощью клеточной ДНК-полимеразы, например, ДНК-полимеразы дельта или ДНК-полимеразы эпсилон. Альтернативно, Rep-тимидиновый комплекс может участвовать в реакции координационного лигирования.

В данном контексте термины «терапевтическое количество», «терапевтически эффективное количество», «эффективное количество» или «фармацевтически эффективное количество» активного агента (например, липидной частицы ТНК, описанной в данном документе) использованы взаимозаменяемо для обозначения количества, которое является достаточным для обеспечения предполагаемой пользы лечения. Однако уровни доз зависят от различных факторов, включая тип повреждения, возраст, массу, пол, медицинское состояние пацента, тяжесть патологического состояния, способ введения и конкретный используемый активный агент. Таким образом, схема введения доз может широко варьироваться, но обычно может быть определена врачом с применением стандартных способов. Кроме того, термины «терапевтическое количество», «терапевтически эффективное количество» и «фармацевтически эффективное количество» включают профилактическое или превентивное количество композиций по данному изобретению. Для профилактического или превентивного применения по данному изобретению фармацевтические композиции или лекарственные средства вводят пациенту, восприимчивому или имеющему иной риск возникновения заболевания, расстройства или патологического состояния, в количестве, достаточном для устранения или снижения риска, ослабления тяжести или отсрочки возникновения заболевания, расстройства или патологического состояния, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, расстройства или патологического состояния, его осложнений и промежуточных патологических фенотипов, присутствующих во время развития заболевания, расстройства или патологического состояния. Обычно предпочтительно использовать максимальную дозу, то есть наибольшую безопасную дозу, в соответствии с определенным медицинским заключением. Термины «доза» и «дозировка» использованы в данном контексте взаимозаменяемо.

В данном контексте термин «терапевтический эффект» относится к следствию лечения, результаты которого считаются желательными и благотворными. Терапевтический эффект может включать, прямо или косвенно, прекращение, уменьшение или устранение проявления заболевания. Терапевтический эффект также может включать, прямо или косвенно, прекращение, уменьшение или устранение прогрессирования проявления заболевания.

Для любого терапевтического агента, описанного в данном документе, терапевтически эффективное количество может быть первоначально определено на основании предварительных in vitro исследований и/или животных моделей. Терапевтически эффективная доза также может быть определена на основании данных, полученных для человека. Используемая доза может быть скорректирована на основании относительной биодоступности и эффективности введенного соединения. Изменение дозы для достижения максимальной эффективности на основании способов, описанных выше, и других общеизвестных способов, входит в объем возможностей специалиста в данной области техники. Общие принципы определения терапевтической эффективности, которые можно найти в главе 1 книги Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10е издание, McGraw-Hill (Нью-Йорк) (2001), включенной в данный документ посредством ссылки, обобщены ниже.

Фармакокинетические принципы обеспечивают основу для изменения схемы введения доз для достижения требуемой степени терапевтической эффективности с минимумом неприемлемых неблагоприятных явлений. В тех ситуациях, в которых концентрация лекарственного соединения в плазме может быть измерена и соотнесена с терапевтическим окном, можно получить дополнительные рекомендации по модификации дозы.

В данном контексте термины «лечит», «лечить» и/или «лечение» включают устранение, существенное ингибирование, замедление или реверсирование прогрессирования патологического состояния, существенное улучшение клинических симптомов патологического состояния или существенное предотвращение возникновения клинических симптомов патологического состояния, получение благоприятных или требуемых клинических результатов. Лечение дополнительно относится к осуществлению одного или более из следующего: (а) уменьшение тяжести нарушения; (b) ограничение развития симптомов, характерных для нарушения(й), подлежащего лечению; (с) ограничения усугубления симптомов, характерных для нарушения(й), подлежащего лечению; (d) ограничения рецидива нарушения(й) у пациентов, которые ранее имели данное нарушение(я); и (е) ограничение рецидива симптомов у пациентов, которые ранее имели данное нарушение(я) без симптомов.

Благоприятные или требуемые клинические результаты, такие как фармакологические и/или физиологические эффекты, включают, но не ограничиваясь ими, предупреждение возникновения заболевания, расстройства или патологического состояния у субъекта, который может быть предрасположен к данному заболеванию, расстройству или патологическому состоянию, но еще не испытывает или не проявляет симптомы данного заболевания (профилактическое лечение), облегчение симптомов заболевания, расстройства или патологического состояния, уменьшение степени заболевания, расстройства или патологического состояния, стабилизацию (т.е. не ухудшение) заболевания, расстройства или патологического состояния, предотвращение распространения заболевания, расстройства или патологического состояния, отсрочку или замедление прогрессирования заболевания, расстройства или патологического состояния, улучшение или облегчение заболевания, расстройства или патологического состояния, и их комбинации, а также увеличение продолжительности жизни по сравнению с ожидаемой выживаемостью в отсутствие лечения.

В данном контексте термины «вектор» или «вектор экспрессии» относятся к репликону, такому как плазмида, бакмида, фаг, вирус, вирион или космида, к которому может присоединяться другой сегмент ДНК, т.е. «вставка», «трансген» или «кассета экспрессии», чтобы обеспечить возможность экспрессии или репликации присоединенного сегмента («кассеты экспрессии») в клетке. Вектором может быть конструкт нуклеиновой кислоты, разработанный для доставки в клетку хозяина или для переноса между различными клетками хозяина. В данном контексте вектор может быть вирусным или невирусным по своему происхождению в конечной форме. Однако в контексте данного изобретения «вектор» обычно относится к синтетическому вектору AAV или к вектору никированной зкДНК. Соответственно, термин «вектор» включает любой генетический элемент, который способен к репликации при ассоциации с соответствующими управляющими элементами и который может переносить последовательности генов в клетки. В некоторых вариантах реализации вектор может представлять собой рекомбинантный вектор или вектор экспрессии.

Группы альтернативных элементов или вариантов реализации данного изобретения, описанные в данном документе, не следует толковать как ограничения. Каждый член группы может быть упомянут и заявлен в отдельности или в любой комбинации с другими членами этой группы или с другими элементами, встречающимися в данном документе. Один или более членов группы могут быть включены или исключены из группы по соображениям удобства и/или патентоспособности. Если происходит такое включение или исключение, то описание, представленное в данном документе, считается содержащим данную группу в модифицированной форме, соответствуя письменному описанию всех групп Маркуша, используемому в прилагаемой формуле изобретения.

В некоторых вариантах реализации любых аспектов, изобретение, описанное в данном документе, не касается способа клонирования человеческих особей, способов модификации генетической идентичности зародышевой линии человеческих особей, использования человеческих эмбрионов в промышленных или коммерческих целях или способов модификации генетической идентификации животных, которые могут причинить им страдания без какой-либо существенной медицинской пользы для человека или животного, а также животных, полученных в результате осуществления таких способов.

Определение других терминов представлено в данном описании в различных аспектах данного изобретения.

Все патенты и другие публикации, включая литературные ссылки, выданные патенты, опубликованные патентные заявки и одновременно рассматриваемые патентные заявки, цитированные в данной заявке, в явном виде включены в данный документ посредством ссылки в целях описания и раскрытия, например, методик, описанных в таких публикациях, которые могут быть использованы в связи с технологией, описанной в данном документе. Такие публикации представлены исключительно в отношении их описания до даты подачи данной заявки. В этой связи ничто не должно быть истолковано как признание того, что авторы данного изобретения не имеют права датировать задним числом такое описание на основании предшествующего изобретения или по любой другой причине. Все заявления в отношении даты или утверждения в отношении содержания указанных документов основаны на информации, которой располагают заявители, и не представляют собой какое-либо допущение в отношении правильности дат или содержания указанных документов.

Описание вариантов реализации данного изобретения не предназначено быть исчерпывающим или для ограничения объема данного изобретения до конкретной описанной формы. Несмотря на то, что в данном документе в иллюстративных целях описаны конкретные варианты реализации и примеры, возможны различные эквивалентные модификации в пределах объема данного изобретения, которые понятны специалистам в релевантной области техники. Например, несмотря на то, что стадии или функции способа представлены в определенном порядке, в альтернативных вариантах реализации можно осуществлять указанные функции в другом порядке, или функции могут быть осуществлены по существу одновременно. Описание данного изобретения, представленное в данном документе, можно применять к другим процессам или способам, сообразно обстоятельствам. Различные варианты реализации, описанные в данном документе, можно комбинировать с получением дополнительных вариантов реализации. Аспекты данного изобретения можно при необходимости модифицировать для использования композиций, функций и концепций из приведенных выше ссылок и заявок с получением дополнительных вариантов реализации данного изобретения. Кроме того, по соображениям биологической функциональной эквивалентности, могут быть сделаны некоторые качественные или количественные изменения в структуре белка без ухудшения биологического или химического действия. Эти и другие изменения могут быть сделаны в отношении данного изобретения с учетом изложенного подробного описания. Все такие модификации считаются включенными в объем прилагаемой формулы изобретения.

Конкретные элементы любых вышеописанных вариантов реализации можно комбинировать или заменять элементами из других вариантов реализации. Кроме того, несмотря на то, что в контексте предложенных вариантов реализации описаны преимущества, связанные с некоторыми вариантами реализации данного изобретения, другие варианты реализации также могут демонстрировать такие преимущества, и не все варианты реализации обязательно должны демонстрировать такие же преимущества, чтобы входить в объем данного изобретения.

Технология, описанная в данном документе, дополнительно проиллюстрирована следующими примерами, которые никоим образом не следует толковать как дополнительное ограничение. Следует понимать, что данное изобретение никоим образом не ограничено конкретной методикой, протоколами и реагентами и т.д., описанными в данном документе, и, следовательно, они могут варьироваться. Используемая в данном документе терминология предназначена лишь для целей описания конкретных вариантов реализации и не предназначена для ограничения объема данного изобретения, который определяется исключительно формулой изобретения.

II. Ионизируемые липиды

В данном документе предложены ионизируемые липиды, представленные формулой (I):

или их фармацевтически приемлемые соли, где:

R¹ и R^1', каждый независимо, представляют собой С_1-3 алкилен;

R² и R^2', каждый независимо, представляют собой линейный или разветвленный С_1-6 алкилен или С_3-6 циклоалкилен;

R³ и R^3', каждый независимо, представляют собой необязательно замещенный С_1-6 алкил или необязательно замещенный С_3-6 циклоалкил;

или альтернативно, если R² представляет собой разветвленный C_1-6 алкилен, и если R³ представляет собой C_1-6 алкил, то R² и R³ вместе с их промежуточным атомом N образуют 4-8-членный гетероциклил;

или альтернативно, если R^2' представляет собой разветвленный C_1-6 алкилен, и если R^3' представляет собой C_1-6 алкил, то R^2' и R^3' вместе с их промежуточным атомом N образуют 4-8-членный гетероциклил;

R⁴ и R^4', каждый независимо, представляют собой -СН, -СН₂СН или -(СН₂)₂СН;

R⁵ и R^5', каждый независимо, представляют собой С_1-20 алкилен или С_2-20 алкенилен;

R⁶ и R^6' для каждого случая независимо представляют собой С_1-20 алкилен, С_3-20 циклоалкилен или С_2-20 алкенилен; и

m и n, каждый независимо, представляют собой целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4 и 5.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, R² и R^2', каждый независимо, представляют собой С_1-3 алкилен.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, каждый линейный или разветвленный С_1-3 алкилен, представленный обозначением R¹ или R^1', каждый линейный или разветвленный C_1-6 алкилен, представленный обозначением R² или R^2', каждый и необязательно замещенный линейный или разветвленный C_1-6 алкил необязательно замещен одной или более галогенными и циано-группами.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, R¹ и R² вместе представляют собой С_1-3 алкилен, и R^1' и R^2' вместе представляют собой С_1-3 алкилен, например, этилен.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, R³ и R^3', каждый независимо, представляют собой необязательно замещенный С_1-3 алкил, например, метил.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, каждый R⁴ и R^4' представляет собой -СН.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, R² представляет собой необязательно замещенный разветвленный C_1-6 алкилен; и R² и R³ вместе с промежуточным атомом N образуют 5- или 6-членный гетероциклил. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, R^2' представляет собой необязательно замещенный разветвленный C_1-6 алкилен; и R^2' и R^3' вместе с промежуточным атомом N образуют 5-или 6-членный гетероциклил, такой как пирролидинил или пиперидинил.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, R⁴ представляет собой -C(R^a)₂CR^a или -[C(R^a)₂]₂CR^a, и R^a представляет собой С_1-3 алкил; и R³ и R⁴ вместе с промежуточным атомом N образуют 5- или 6-членный гетероциклил. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, R^4' представляет собой -C(R^a)₂CR^a или -[C(R^a)₂]₂CR^a, и R^a представляет собой С_1-3 алкил; и R^3' и R^4' вместе с промежуточным атомом N образуют 5- или 6-членный гетероциклил, такой как пирролидинил или пиперидинил.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, R⁵ и R^5', каждый независимо, представляют собой С_1-10 алкилен или С_2-10 алкенилен. В одном варианте реализации R⁵ и R^5', каждый независимо, представляют собой C_1-8 алкилен или C_1-6 алкилен.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, R⁶ и R^6' для каждого случая независимо представляют собой С_1-10 алкилен, С_3-10 циклоалкилен или С_2-10 алкенилен. В одном варианте реализации С_1-6 алкилен, С_3-6 циклоалкилен или С_2-6 алкенилен. В одном варианте реализации С_3-10 циклоалкилен или С_3-6 циклоалкилен представляет собой циклопропилен. В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, каждый тип равен 3.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации любых аспектов или вариантов реализации, описанных в данном документе, ионизируемый липид выбран из любых липидов в таблице 1 или их фармацевтически приемлемых солей.

Частицы липид-нуклеиновая кислота (LNP) или их фармацевтические композиции, содержащие ионизируемый липид формулы (I) и бескапсидный невирусный вектор (например, зкДНК), могут быть использованы для доставки бескапсидного невирусного вектора ДНК в требуемый сайт-мишень (например, в клетку, ткань, орган и т.п.).

Ионизируемые липиды формулы (I) содержат третичный амин, который реагирует на кислотный компартмент (например, эндосому или лизосому), что приводит к дестабилизации мембраны, и дисульфидную связь, которая может расщепляться в восстановительной среде (например, в цитоплазме).

Однако в отличие от SS-ращепляемых липидов, описанных в публикации международной патентной заявки №WO 2019188867, ионизируемые липиды формулы (I) не содержат или по существу не содержат сложноэфирную связь, амидную связь, карбаматную связь, простую эфирную связь или карбамидную связь. В частности, фенильные сложные эфиры в SS-расщепляемых липидах, описанных в вышеуказанной опубликованной патентной заявке, усиливают способность к разложению (самопроизвольному разложению) структуры липидов. В целом, ионизируемые липиды по данному изобретению, представленные формулой (I), описанной в данном документе, не содержат или по существу не содержат никаких атомов кислорода.

Кроме того, ионизируемые липиды по данному изобретению, представленные формулой (I), описанной в данном документе, не содержат или по существу не содержат никаких ароматических или гетероароматических групп или фрагментов, значение которых определено в данном документе.

В одном варианте реализации композиция липидной частицы (например, липидной наночастицы) получена и заряжена ТНК (например, зкДНК), полученной способом, описанным в международной заявке PCT/US 2018/050042, поданной 7 сентября 2018 года, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки. Это может быть достигнуто посредством высокоэнергетического смешивания этанольных липидов с водной ТНК, такой как зкДНК, при низком рН, который обеспечивает протонирование липида и благоприятные энергетические условия для ассоциации зкДНК/липида и образования зародышей частиц. Частицы можно дополнительно стабилизировать посредством разбавления водой и удаления органического растворителя. Частицы можно концентрировать до требуемой степени.

Обычно липидные частицы (например, липидные наночастицы) получают с отношением общего содержания липида к нуклеиновой кислоте (по массе или весу) от около 10:1 до 60:1. В некоторых вариантах реализации отношение липида к нуклеиновой кислоте (отношение массы к массе; отношение мас./мас.) может составлять от около 1:1 до около 60:1, от около 1:1 до около 55:1, от около 1:1 до около 50:1, от около 1:1 до около 45:1, от около 1:1 до около 40:1, от около 1:1 до около 35:1, от около 1:1 до около 30:1, от около 1:1 до около 25:1, от около 10:1 до около 14:1, от около 3:1 до около 15:1, от около 4:1 до около 10:1, от около 5:1 до около 9:1, от около 6:1 до около 9:1; от около 30:1 до около 60:1. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, липидные частицы (например, липидные наночастицы) получают с отношением нуклеиновой кислоты (по массе или весу) к общему содержанию липида около 60:1. В соответствии с некоторыми вариантами реализации, липидные частицы (например, наночастицы) получают с отношением нуклеиновой кислоты (по массе или весу) к общему содержанию липида около 30:1. Количество липидов и нуклеиновой кислоты можно изменять для получения требуемого соотношения N/P, например, соотношения N/P 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более. Обычно общее содержание липида в композиции липидных частиц может составлять от около 5 мг/мл до около 30 мг/мл.

В некоторых вариантах реализации липидная наночастица содержит агент для конденсации и/или инкапсулирования карго-нуклеиновой кислоты, такой как зкДНК. Такой агент также упоминается в данном документе как конденсирующий или инкапсулирующий агент.Без ограничения, можно использовать любое соединение, известное в данной области техники для конденсации и/или инкапсуляции нуклеиновых кислот, при условии, что оно не является фузогенным (вызывающим слияние). Другими словами, агент, способный конденсировать и/или инкапсулировать карго-нуклеиновую кислоту, такую как зкДНК, но обладающий слабой или не обладающий фузогенной активностью. Не ограничиваясь теорией, конденсирующий агент может обладать некоторой фузогенной активностью, когда он не конденсирует/не инкапсулирует нуклеиновую кислоту, такую как зкДНК, но липидная наночастица, инкапсулирующая нуклеиновую кислоту, полученная с указанным конденсирующим агентом, может не быть фузогенной.

В целом, ионизируемый липид или катионный липид обычно используют для конденсации карго-нуклеиновой кислоты, например, зкДНК, при низком рН и для управления ассоциацией и фузогенностью мембраны. Обычно катионные липиды представляют собой липиды, содержащие по меньшей мере одну аминогруппу, которая заряжена положительно или становится протонированной в кислотных условиях, например, при рН 6,5 или ниже. Катионные липиды также могут быть ионизируемыми липидами, например, ионизируемыми катионными липидами. «Нефузогенный ионизируемый липид» означает ионизируемый липид, который может конденсировать и/или инкапсулировать карго-нуклеиновую кислоту, такую как зкДНК, но не обладает или обладает очень слабой фузогенной активностью.

В одном варианте реализации ионизируемый липид может составлять 20-90% (мол.) от общего содержания липидов в липидных частицах (например, в липидных наночастицах). Например, молярное содержание ионизируемого липида может составлять 20-70% (мол.), 30-60% (мол.), 40-60% (мол.), 40-55% (мол.) или 45-55% (мол.) от общего содержания липидов, присутствующих в липидной частице (например, в липидных наночастицах). В некоторых вариантах реализации ионизируемый липид составляет от около 50% мол. до около 90% мол. от общего содержания липидов в липидных частицах (например, в липидных наночастицах).

В одном варианте реализации липидные частицы (например, липидные наночастицы) могут дополнительно содержать некатионный липид. Некатионный липид может служить для увеличения фузогенности, а также для повышения стабильности LNP при получении. Некатионные липиды включают амфипатические липиды, нейтральные липиды и анионные липиды. Соответственно, некатионный липид может быть нейтральным незаряженным, цвиттер-ионным или анионным липидом. Некатионные липиды обычно используют для усиления фузогенности.

Примеры некатионных липидов включают, но не ограничиваясь ими, дистеароил-sn-глицеро-фосфоэтаноламин, дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (РОРС), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламин (POPE), диолеоилфосфатидилэтаноламин-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1 - карбоксилат (DOPE-mal), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламин (DMPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), монометилфосфатидилэтаноламин (такой как 16-О-монометил-РЕ), диметилфосфатидилэтаноламин (такой как 16-О-диметил-РЕ), 18-1-транс-РЕ, 1-стеароил-2-олеоилфосфатидилэтаноламин (SOPE), гидрированный соевый фосфатидилхолин (HSPC), яичный фосфатидилхолин (ЕРС), диолеоилфосфатидилсерин (DOPS), сфингомиелин (SM), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG), дистеароилфосфатидилглицерин (DSPG), диэрукоилфосфатидилхолин (DEPC), пальмитоилолеоилфосфатидилглицерин (POPG), диэлаидоилфосфатидилэтаноламин (DEPE), 1,2-дилауроил-sn-глицеро- 3-фосфоэтаноламин (DLPE); 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DPHyPE); лецитин, фосфатидилэтаноламин, лизолецитин, лизофосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатид ил инозит, сфингомиелин, яичный сфингомиелин (ESM), цефалин, кардиолипин, фосфатидную кислоту, цереброзиды, дицетилфосфат, лизофосфатидилхолин, дилинолеоилфосфатидилхолин или их смеси. Следует понимать, что можно использовать также другие диацилфосфатидилхолиновые и диацилфосфатидилэтаноламинные фосфолипиды. Ацильные группы в указанных липидах предпочтительно представляют собой ацильные группы, полученные из жирных кислот, имеющих С₁₀-С₂₄ углеродные цепи, например, лауроил, миристоил, пальмитоил, стеароил или олеоил.

Другие примеры некатионных липидов, пригодных для применения в липидных частицах (например, в липидных наночастицах), включают не содержащие фосфор липиды, такие как, например, стеариламин, додециламин, гексадециламин, ацетилпальмитат, глицерилрицинолеат, гексадецилстеарат, изопропилмиристат, амфотерные акриловые полимеры, триэтаноламинлаурилсульфат, алкил-арилсульфаты, полиэтилоксилированные амиды жирных кислот, бромид диоктадецилдиметиламмония, церамид, сфингомиелин и т.п.

В одном варианте реализации некатионный липид представляет собой фосфолипид. В одном варианте реализации некатионный липид выбран из группы, состоящей из DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, РОРС, DOPE и SM. В некоторых вариантах реализации некатионный липид представляет собой DSPC. В других вариантах реализации некатионный липид представляет собой DOPC. В других вариантах реализации некатионный липид представляет собой DOPE.

В некоторых вариантах реализации некатионный липид может составлять 0-20% (мол.) от общего содержания липидов в липидной наночастице. В некоторых вариантах реализации содержание некатионного липида составляет 0,5-15% (мол.) от общего содержания липидов, присутствующих в липидной частице (например, в липидной наночастице). В некоторых вариантах реализации содержание некатионного липида составляет 5-12% (мол.) от общего содержания липидов, присутствующих в липидной частице (например, в липидной наночастице). В некоторых вариантах реализации содержание некатионного липида составляет 5-10% (мол.) от общего содержания липидов, присутствующих в липидной частице (например, в липидной наночастице). В одном варианте реализации содержание некатионного липида составляет около 6% (мол.) от общего содержания липидов, присутствующих в липидной частице (например, в липидной наночастице). В одном варианте реализации содержание некатионного липида составляет около 7,0% (мол.) от общего содержания липидов, присутствующих в липидной частице (например, в липидной наночастице). В одном варианте реализации содержание некатионного липида составляет около 7,5% (мол.) от общего содержания липидов, присутствующих в липидной частице (например, в липидной наночастице). В одном варианте реализации содержание некатионного липида составляет около 8,0% (мол.) от общего содержания липидов, присутствующих в липидной частице (например, в липидной наночастице). В одном варианте реализации содержание некатионного липида составляет около 9,0% (мол.) от общего содержания липидов, присутствующих в липидной частице (например, в липидной наночастице). В некоторых вариантах реализации содержание некатионного липида составляет около 10% (мол.) от общего содержания липидов, присутствующих в липидной частице (например, в липидной наночастице). В одном варианте реализации содержание некатионного липида составляет около 11% (мол.) от общего содержания липидов, присутствующих в липидной частице (например, в липидной наночастице).

Примеры некатионных липидов описаны в публикации РСТ WO 2017/099823 и в публикации патента США US 2018/0028664, полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки.

В одном варианте реализации липидные частицы (например, липидные наночастицы) могут дополнительно содержать компонент, такой как стерин, для обеспечения целостности и стабильности мембраны липидной частицы. В одном варианте реализации примером стерина, который можно использовать в липидной частице, является холестерин или его производное. Неограничивающие примеры производных холестерина включают полярные аналоги, такие как 5α-холестанол, 5β-копростанол, холестерил-(2’-гидрокси)этиловый эфир, холестерил-(4’-гидрокси)бутиловый эфир и 6-кетохолестанол; неполярные аналоги, такие как 5α-холестан, холестенон, 5α-холестанон, 5β-холестанон и холестерилдеканоат; а также их смеси. В некоторых вариантах реализации производное холестерина представляет собой полярный аналог, такой как холестерил-(4’-гидрокси)бутиловый эфир. В некоторых вариантах реализации производное холестерина представляет собой холестерилгемисукцинат (CHEMS).

Примеры производных холестерина описаны в публикации РСТ WO 2009/127060 и в публикации патента США US 2010/0130588, полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки.

В одном варианте реализации компонент, обеспечивающий целостность мембраны, такой как стерин, может составлять 0-50% (мол.) от общего содержания липидов в липидной частице (например, в липидной наночастице). В некоторых вариантах реализации такой компонент составляет 20-50% (мол.) от общего содержания липидов в липидной частице (например, в липидной наночастице). В некоторых вариантах реализации такой компонент составляет 30-40% (мол.) от общего содержания липидов в липидной частице (например, в липидной наночастице). В некоторых вариантах реализации такой компонент составляет 35-45% (мол.) от общего содержания липидов в липидной частице (например, в липидной наночастице). В некоторых вариантах реализации такой компонент составляет 38-42% (мол.) от общего содержания липидов в липидной частице (например, в липидной наночастице).

В одном варианте реализации липидная частица (например, липидная наночастица) может дополнительно содержать полиэтиленгликоль (ПЭГ) или конъюгированную молекулу липида. Обычно их используют для ингибирования агрегации липидной частицы (например, липидной наночастицы) и/или для обеспечения пространственной стабилизации. Примеры конъюгированных липидов включают, но не ограничиваясь ими, ПЭГ-липидные конъюгаты, полиоксазолин (POZ)-липидные конъюгаты, полиамид липидные конъюгаты (такие как АТТА-липидные конъюгаты), конъюгаты катионного полимера и липида (CPL) и их смеси. В некоторых вариантах реализации конъюгированная липидная молекула представляет собой ПЭГ-липидный конъюгат, например, липид, конъюгированный с метоксиполиэтиленгликолем. В некоторых других вариантах реализации конъюгированная липидная молекула представляет собой ПЭГ-липидный конъюгат, например, ПЭГ₂₀₀₀-DMG (димиристоилглицерин).

Примеры ПЭГ-липидных конъюгатов включают, но не ограничиваясь ими, ПЭГ-диацилглицерин (DAG) (такой как 1-(монометоксиполиэтиленгликоль)-2,3-димиристоилглицерин (ПЭГ-DMG)), ПЭГ-диалкилоксипропил (DAA), ПЭГ-фосфолипид, ПЭГ-церамид (Cer), пэгилированный фосфатидилэтаноламин (ПЭГ-РЕ), ПЭГ-сукцинат-диацилглицерин (ПЭГ-S-DAG) (такой как 4-0-(2^’,3’-ди(тетрадеканоилокси)пропил-1-0-(w-метокси(полиэтокси)этил)бутандиоат (ПЭГ-S-DMG)), ПЭГ-диалкоксипропилкарбам, натриевая соль М-(карбонил-метоксиполиэтиленгликоль 2000)-1,2-дистеароил-8п-глицеро-3-фосфоэтаноламина или их смеси. Дополнительные примеры ПЭГ-липидных конъюгатов описаны, например, в US 5885613, US 6287591, US 2003/0077829, US 2003/0077829, US 2005/0175682, US 2008/0020058, US 2011/0117125, US 2010/0130588, US 2016/0376224 и US 2017/0119904, полное содержание которых включено в данный документ посредством ссылки.

В одном варианте реализации конъюгат ПЭГ-DAA может представлять собой, например, ПЭГ-дилаурилоксипропил, ПЭГ-димиристилоксипропил, ПЭГ-дипальмитилоксипропил или ПЭГ-дистеарилоксипропил. ПЭГ-липид может представлять собой один или более из ПЭГ-DMG, ПЭГ-дилаурилглицерина, ПЭГ-дипальмитоилглицерина, ПЭГ-дистеарилглицерина, ПЭГ-дилаурилгликамида, ПЭГ-димиристилгликамида, ПЭГ-дипальмитоилгликамида, ПЭГ-дистеарилгликамида, ПЭГ-холестерина (1-[8’-(холест-5-ен-3[бета]окси)карбоксамидо-3’,6’-диоксаоктанил]карбамоил-[омега]метил-поли(этиленгликоль), ПЭГ-DMB (3,4-дитетрадецоксилбензил-[омега]метил-поли(этиленгликолевый) эфир) и 1,2-димиристоил-8п-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000]. В одном варианте реализации ПЭГ-липид может быть выбран из группы, состоящей из ПЭГ-DMG, 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоля)-2000].

В одном варианте реализации липиды, конъюгированные с молекулой, отличной от ПЭГ, также могут быть использованы вместо ПЭГ-липида. Например, могут быть использованы полиоксазолин (POZ)-липидные конъюгаты, полиамид-липидные конъюгаты (такие как АТТ А-липидные конъюгаты) и конъюгаты катионного полимера и липида (CPL) вместо ПЭГ-липида или вместе с ним. Примеры конъюгированных липидов, т.е. ПЭГ-липидов, (POZ)-липидных конъюгатов, АТТА-липидных конъюгатов и конъюгатов катионных полимеров с липидами описаны в публикациях патентных заявок РСТ WO 1996/010392, WO 1998/051278, WO 2002/087541, WO 2005/026372, WO 2008/147438, WO 2009/086558, WO 2012/000104, WO 2017/117528, WO 2017/099823, WO 2015/199952, WO 2017/004143, WO 2015/095346, WO 2012/000104, WO 2012/000104 и WO 2010/006282, в публикациях патентных заявок США US 2003/0077829, US 2005/0175682, US 2008/0020058, US 2011/0117125, US 2013/0303587, US 2018/0028664, US 2015/0376115, US 2016/0376224, US 2016/0317458, US 2013/0303587, US 2013/0303587 и US 20110123453, а также в патентах CUIAUS 5885613, US 6287591, US 6320017 и US 6586559, полное содержание которых включено в данный документ посредством ссылки.

В некоторых вариантах реализации ПЭГ или конъюгированный липид может составлять 0-20% (мол.) от общего содержания липидов в липидной наночастице. В некоторых вариантах реализации содержание ПЭГ или конъюгированного липида составляет 0,5-10% (мол.) от общего содержания липидов, присутствующих в липидной частице (например, в липидной наночастице). В некоторых вариантах реализации содержание ПЭГ или конъюгированного липида составляет 1-5% (мол.) от общего содержания липидов, присутствующих в липидной частице (например, в липидной наночастице). В некоторых вариантах реализации содержание ПЭГ или конъюгированного липида составляет 1-3% (мол.) от общего содержания липидов, присутствующих в липидной частице (например, в липидной наночастице). В одном варианте реализации содержание ПЭГ или конъюгированного липида составляет около 1,5% (мол.) от общего содержания липидов, присутствующих в липидной частице (например, в липидной наночастице). В некоторых вариантах реализации содержание ПЭГ или конъюгированного липида составляет около 3% (мол.) от общего содержания липидов, присутствующих в липидной частице (например, в липидной наночастице).

Следует понимать, что молярные отношения ионизируемого липида формулы (I) к некатионному липиду, стерину и/или ПЭГ/конъюгированному липиду могут при необходимости варьироваться. Например, липидная частица (например, липидная наночастица) может содержать 30-70% ионизируемого липида по количеству моль или по общей массе композиции, 0-60% холестерина по количеству моль или по общей массе композиции, 0-30% некатионного липида по количеству моль или по общей массе композиции и 1-10% ПЭГ или конъюгированного липида по количеству моль или по общей массе композиции. В одном варианте реализации композиция содержит 40-60% ионизируемого липида по количеству моль или по общей массе композиции, 30-50% холестерина по количеству моль или по общей массе композиции, 5-15% некатионного липида по количеству моль или по общей массе композиции и 1-5% ПЭГ или конъюгированного липида по количеству моль или по общей массе композиции. В одном варианте реализации композиция содержит 40-60% ионизируемого липида по количеству моль или по общей массе композиции, 30-40% холестерина по количеству моль или по общей массе композиции и 5-10% некатионного липида по количеству моль или по общей массе композиции, и 1-5% ПЭГ или конъюгированного липида по количеству моль или по общей массе композиции. Композиция может содержать 60-70% ионизируемого липида по количеству моль или по общей массе композиции, 25-35% холестерина по количеству моль или по общей массе композиции, 5-10% некатионного липида по количеству моль или по общей массе композиции и 0-5% ПЭГ или конъюгированного липида по количеству моль или по общей массе композиции. Композиция также может содержать до 45-55% ионизируемого липида по количеству моль или по общей массе композиции, 35-45% холестерина по количеству моль или по общей массе композиции, от 2 до 15% некатионного липида по количеству моль или по общей массе композиции и 1-5% ПЭГ или конъюгированного липида по количеству моль или по общей массе композиции. Композиция также может представлять собой композицию липидных наночастиц, например, содержащую 8-30% ионизируемого липида по количеству моль или по общей массе композиции, 5-15% некатионного липида по количеству моль или по общей массе композиции и 0-40% холестерина по количеству моль или по общей массе композиции; 4-25% ионизируемого липида по количеству моль или по общей массе композиции, 4-25% некатионного липида по количеству моль или по общей массе композиции, от 2 до 25% холестерина по количеству моль или по общей массе композиции, от 10 до 35% конъюгированного липида по количеству моль или по общей массе композиции и 5% холестерина по количеству моль или по общей массе композиции; или 2-30% ионизируемого липида по количеству моль или по общей массе композиции, 2-30% некатионного липида по количеству моль или по общей массе композиции, от 1 до 15% холестерина по количеству моль или по общей массе композиции, от 2 до 35% ПЭГ или конъюгированного липида по количеству моль или по общей массе композиции и 1-20% холестерина по количеству моль или по общей массе композиции; или даже до 90% ионизируемого липида по количеству моль или по общей массе композиции и 2-10% некатионных липидов по количеству моль или по общей массе композиции, или даже 100% ионизируемого липида по количеству моль или по общей массе композиции. В некоторых вариантах реализации композиция липидных частиц содержит ионизируемый липид, некатионный фосфолипид, холестерин и ПЭГилированный липид (конъюгированный липид) в молярном соотношении около 50:10:38,5:1,5.

В одном варианте реализации композиция липидных частиц (например, липидных наночастиц) содержит ионизируемый липид, некатионный фосфолипид, холестерин и ПЭГилированный липид (конъюгированный липид) в молярном соотношении около 50:7:40:3.

В одном варианте реализации липидная частица (например, липидная наночастица) содержит ионизируемый липид, некатионынй липид (например, фосфолипид), стерин (например, холестерин) и ПЭГилированный липид (конъюгированный липид), причем молярное содержание липидов варьируется от 20 до 70 молярных процентов для ионизируемого липида, с целевым значением 30-60, молярный процент некатионного липида варьируется от 0 до 30, с целевым значением от 0 до 15, молярный процент стерина варьируется от 20 до 70, с целевым значением от 30 до 50, и молярный процент ПЭГилированного липида (конъюгированного липида) варьируется от 1 до 6, с целевым значением от 2 до 5.

Липидные наночастицы (LNP), содержащие зкДНК, описаны в международной заявке PCT/US 2018/050042, поданной 7 сентября 2018 года, полное содержание которой включено в данный документ и предусмотрено для применения в способах и композициях, описанных в данном документе.

Размер липидной частицы (например, липидной наночастицы) может быть определен методом квазиупругого светорассеяния на приборе Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, Великобритания) и составляет приблизительно 50-150 нм в диаметре, приблизительно 55-95 нм в диаметре или приблизительно 70-90 нм в диаметре.

Значение pKa составленных в композицию ионизируемых липидов может коррелировать с эффективностью LNP для доставки нуклеиновых кислот (см. Jayaraman et al, Angewandte Chemie, международное издание (2012), 51(34), 8529-8533; Semple etal., Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010), полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки). В одном варианте реализации pKa каждого ионизируемого липида определяют в липидных наночастицах с помощью анализа, основанного на флуоресценции 2-(п-толуидино)-6-нафталинсульфоновой кислоты (TNS). Липидные наночастицы, содержащие ионизируемый липид/П)8РС/холестерин/ПЭГ-липид (50/10/38,5/1,5% мол.) в PBS с общей концентрацией липидов 0,4 мМ, могут быть получены с использованием поточного способа, описанного в данном документе и в других местах. TNS может быть получена в форме 100 мМ исходного раствора в дистиллированной воде. Везикулы могут быть разбавлены до 24 мМ липида в 2 мл буферных растворов, содержащих 10 мМ HEPES, 10 мМ MES, 10 мМ ацетата аммония, 130 мМ NaCl, причем рН варьируется от 2,5 до 11. Можно добавлять аликвоту раствора TNS с получением конечной концентрации 1 мМ, с последующим перемешиванием на вортексе и измерением интенсивности флуоресценции при комнатной температуре на люминесцентном спектрофотометре SLM Aminco серии 2, с использованием длины волн возбуждения и испускания 321 нм и 445 нм. Для данных флуоресценции можно применять анализ наилучшего совпадения с сигмоидальной функцией, а рКа измеряют как рН, обеспечивающий полумаксимальную интенсивность флуоресценции.

В одном варианте реализации относительная активность может быть определена посредством измерения экспрессии люциферазы в печени через 4 часа после введения посредством инъекции в хвостовую вену. Сравнивают активность в дозе 0,3 и 1,0 мг зкДНК/кг и выражают в нг люциферазы/г печени, при измерении через 4 часа после введения.

Без ограничений, липидная частица (например, липидная наночастица) по данному изобретению включает липидную композицию, которая может быть использована для доставки бескапсидного невирусного вектора ДНК в требуемый сайт-мишень (например, в клетку, ткань, орган и т.п.). Обычно липидная частица (например, липидная наночастица) содержит бескапсидный невирусный вектор ДНК и ионизируемый липид или его соль.

В одном варианте реализации липидная частица (например, липидная наночастица) содержит ионизируемый липид/некатионный липид/стерин/конъюгированный липид в молярном соотношении 50:10:38,5:1,5. В одном варианте реализации липидная частица (например, липидная наночастица) содержит ионизируемый липид/некатионный липид/стерин/конъюгированный липид в молярном соотношении около 51:7:38,5:3,5. В одном варианте реализации липидная частица (например, липидная наночастица) содержит ионизируемый липид/некатионный липид/стерин/конъюгированный липид в молярном соотношении около 51:7:39:3. В одном варианте реализации липидная частица (например, липидная наночастица) содержит ионизируемый липид/некатионный липид/стерин/конъюгированный липид в молярном соотношении около 51,5:7:39:2,5. В некоторых вариантах реализации конъюгированный липид представляет собой ПЭГ-липид, например, ПЭГ-DMG и/или ПЭГ-DSPE.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена композиция липидной частицы (например, липидной наночастицы), содержащая фосфолипиды, лецитин, фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин.

III. Терапевтическая нуклеиновая кислота (ТНК)

В данном изобретении предложена платформа на липидной основе для доставки терапевтической нуклеиновой кислоты (ТНК). В данном контексте выражения «терапевтическое средство на основе нуклеиновой кислоты», «терапевтическая нуклеиновая кислота» и «ТНК» использованы взаимозаменяемо и относятся к любому способу лечения с применением нуклеиновых кислот в качестве активного компонента терапевтического агента для лечения заболевания или расстройства. ТНК относится к терапевтическому средству на основе РНК или к терапевтическому средству на основе ДНК. Неограничивающие примеры терапевтических средств на основе РНК включают мРНК, антисмысловые РНК и олигонуклеотиды, рибозимы, аптамеры, интерферирующие РНК (РНКи), дцРНК субстрата Дайсера, малую шпилечную РНК (мшРНК), асимметричную интерферирующую РНК (аиРНК) и микроРНК (микроРНК). Неограничивающие примеры терапевтических средств на основе ДНК включают миникольцевую ДНК, миниген, вирусные векторы ДНК (например, геном лентивируса или AAV) или невирусные векторы ДНК, линейную дуплексную ДНК с замкнутыми концами (зкДНК/CELiD), плазмиды, бакмиды, векторы ДНК Doggybone™, минималистичный иммунологически определяемый вектор экспрессии генов (MIDGE), невирусный вектор мини-нитевой ДНК (вектор линейной ковалентно замкнутой ДНК) или минимальный вектор гантелеобразной ДНК («гантелеобразной ДНК»). Таким образом, в аспектах данного изобретения, в целом, предложены частицы ионизируемых липидов (например, липидные наночастицы), содержащие ТНК.

Терапевтические нуклеиновые кислоты

Примеры терапевтических нуклеиновых кислот по данному изобретению могут включать, но не ограничиваясь ими, минигены, плазмиды, миникольца, малую интерферирующую РНК (мирНК), микроРНК (микроРНК), антисмысловые олигонуклеотиды (ASO), рибозимы, двухцепочечную ДНК с замкнутыми концами (например, зкДНК, CELiD, линейная ковалентно замкнутая ДНК («мини-нитевая»), Doggybone™, ДНК протеломера с замкнутыми концами или гантелевидная линейная ДНК), дцРНК субстрата Дайсера, малую шпилечную РНК (мшРНК), асимметричную интерферирующую РНК (аиРНК), микроРНК (микроРНК), мРНК, тРНК, рРНК и векторы вирусных ДНК, векторы вирусных РНК и любые их комбинации.

киРНК или миРНК, которые могут отрицательно регулировать внутриклеточные уровни специфических белков способом, называемым РНК-интерференция (РНКи), также предусмотрены данным изобретением как терапевтические средства на основе нуклеиновых кислот.После внедрения киРНК или миРНК в цитоплазму клетки хозяина указанные двухцепочечные конструкты РНК могут связываться с белком, называемым RISC. Смысловая спираль киРНК или миРНК удаляется комплексом RISC. Комплекс RISC, при объединении с комплементарной мРНК, расщепляет мРНК и высвобождает разрезанные спирали. РНКи происходит в результате индукции специфического разрушения мРНК, что приводит к отрицательной регуляции соответствующего белка.

Терапевтическими средствами на основе нуклеиновых кислот могут быть антисмысловые олигонуклеотиды (ASO) и рибозимы, которые ингибируют трансляцию мРНК в белок. Для антисмысловых конструктов указанные одноцепочечные дезоксинуклеиновые кислоты имеют последовательность, комплементарную с последовательностью мРНК белка-мишени, и способны связываться с мРНК посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику. Такое связывание препятствует трансляции целевой мРНК и/или инициирует расщепление РНазы-Н транскрипта мРНК. В результате антисмысловый олигонуклеотид имеет повышенную специфичность действия (т.е. отрицательной регуляции специфического белка, связанного с заболеванием).

В любых способах и композициях, предложенных в данном документе, терапевтическая нуклеиновая кислота (ТНК) может представлять собой терапевтическую РНК. Указанная терапевтическая РНК может быть ингибитором трансляции мРНК, агентом РНК-интерференции (РНКи), каталитически активной молекулой РНК (рибозим), транспортной РНК (тРНК) или РНК, которая связывает транскрипт мРНК (ASO), белок или другой молекулярный лиганд (аптамер). В любых способах, предложенных в данном документе, агент РНКи может представлять собой двухцепочечную РНК, одноцепочечную РНК, микроРНК, короткую интерферирующую РНК, короткую шпилечную РНК или олигонуклеотид, образующий триплекс.

В любых способах и композициях, предложенных в данном документе, терапевтическая нуклеиновая кислота (ТНК) может представлять собой терапевтическую ДНК, такую как двухцепочечная ДНК с замкнутыми концами (например, зкДНК, CELiD, линейная ковалентно замкнутая ДНК («мини-нитевая»), Doggybone™, ДНК протеломера с замкнутыми концами, гантелевидная линейная ДНК, плазмида, миникольцо или т.п.). Некоторые варианты реализации данного изобретения основаны на способах и композициях, содержащих линейную дуплексную ДНК с замкнутыми концами (зкДНК), которая может экспрессировать трансген (например, терапевтическую нуклеиновую кислоту). Векторы зкДНК, описанные в данном документе, могут не иметь ограничений по упаковке, обусловленных ограниченным пространством в вирусном капсиде. Векторы зкДНК представляют собой заслуживающую внимания альтернативу, получаемую из эукариот, вместо векторов плазмидной ДНК, получаемых из прокариот.

Векторы зкДНК предпочтительно имеют линейную и непрерывную структуру, а не прерывистую структуру. Линейная и непрерывная структура предположительно является более стабильной в отношении атаки клеточных эндонуклеаз, а также менее вероятно подвергается рекомбинированию и вызывает мутагенез. Таким образом, вектор зкДНК в линейной и непрерывной структуре является предпочтительным вариантом реализации. Непрерывный, линейный, одно цепочечный внутримолекулярный вектор дуплексной зкДНК может иметь ковалентно связанные терминальные концы, без последовательностей, кодирующих капсидные белки AAV. Такие векторы зкДНК структурно отличаются от плазмид (включая плазмиды зкДНК, описанные в данном документе), которые представляют собой кольцевые молекулы дуплексной нуклеиновой кислоты бактериального происхождения. Комплементарные цепи плазмид могут быть разделены после денатурации с образованием двух молекул нуклеиновых кислот, и в отличие от них векторы зкДНК, хотя и имеют комплементарные цепи, представляют собой одиночные молекулы ДНК и, следовательно, даже при денатурации остаются единой молекулой. В некоторых вариантах реализации векторы зкДНК могут быть получены без метилирования оснований ДНК прокариотического типа, в отличие от плазмид. Таким образом, векторы зкДНК и зкДНК-плазмиды отличаются как по структуре (в частности, линейная против кольцевой), так и с точки зрения способов, используемых для получения и очистки указанных различных объектов, а также с точки зрения метилирования их ДНК, которое для зкДНК-плазмид является метилированием прокариотического типа, а для вектора зкДНК является метилированием эукариотического типа.

В данном документе предложены невирусные бескапсидные молекулы зкДНК с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК). Указанные невирусные бескапсидные молекулы зкДНК могут быть получены в пермиссивных клетках хозяина из экспрессионного конструкта (например, зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды, зкДНК-бакуловируса или интегрированной клеточной линии), содержащего гетерологичный ген (например, трансген, в частности, терапевтический трансген), расположенный между двумя различными последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR), причем указанные ITR являются различными относительно друг друга. В некоторых вариантах реализации один из ITR модифицирован посредством делеции, вставки и/или замены по сравнению с последовательностью ITR дикого типа (например, ITR AAV); и по меньшей мере один из ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения (trs) и сайт связывания Rep.Вектор зкДНК предпочтительно представляет собой дуплекс, например, является самокомплементарным на протяжении по меньшей мере части молекулы, такой как экспрессионная кассета (например, зкДНК не является двухцепочечной кольцевой молекулой). Вектор зкДНК имеет ковалентно замкнутые концы и, следовательно, устойчив к расщеплению под действием экзонуклеазы (например, экзонуклеазы I или экзонуклеазы III), например, в течение часа при 37°С.

В одном аспекте вектор зкДНК содержит, направлении от 5’ к 3’: первый инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV), рассматриваемую нуклеотидную последовательность (например, экспрессионную кассету, описанную в данном документе) и второй ITR AAV. В одном варианте реализации первый ITR (5’ ITR) и второй ITR (3’ ITR) являются асимметричными относительно друг друга, то еть они имеют различную 3D-пространственную конфигурацию относительно друг друга. В качестве иллюстративного варианта реализации, первый ITR может представлять собой ITR дикого типа, а второй ITR может представлять собой мутированный или модифицированный ITR, или наоборот, если первый ITR может представлять собой мутированный или модифицированный ITR, а второй ITR - ITR дикого типа. В одном варианте реализации и первый ITR, и второй ITR являются модифицированными, но имеют разные последовательности или имеют разные модификации, или не являются идентичными модифицированными ITR, и имеют различные 3D-пространственные конфигурации. Иначе говоря, вектор зкДНК с асимметричными ITR содержит ITR, в которых любые изменения в одном ITR относительно ITR дикого типа не отражаются на другом ITR; или альтернативно, если асимметричные ITR включают модифицированные асимметричные ITR, то указанная пара может иметь различные последовательности и различную трехмерную форму относительно друг друга.

В одном варианте реализации вектор зкДНК содержит, направлении от 5’ к 3’: первый инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV), рассматриваемую нуклеотидную последовательность (например, экспрессионную кассету, описанную в данном документе) и второй ITR AAV, причем первый ITR (5’ ITR) и второй ITR (3’ ITR) являются симметричными или по существу симметричными относительно друг друга, то есть вектор зкДНК может содержать последовательности ITR, которые имеют симметричную трехмерную пространственную организацию, так что их структура имеет одинаковую форму в геометрическом пространстве, или имеют одинаковые петли А, С-С и В-В’ в 3D пространстве. В таком варианте реализации пара симметричных ITR или пара по существу симметричных ITR может представлять собой модифицированные ITR (например, mod-ITR), которые не являются ITR дикого типа. Пара mod-ITR может иметь одну и ту же последовательность, которая содержит одну или более модификаций относительно ITR дикого типа, и они являются обратными (инвертированными) комплементами друг друга. В одном варианте реализации пара модифицированных ITR является по существу симметричной, как описано в данном документе, то есть пара модифицированных ITR может иметь разные последовательности, но иметь соответствующую или одинаковую симметричную трехмерную форму. В некоторых вариантах реализации симметричные ITR или по существу симметричные ITR могут быть дикого типа (WT-ITR), как описано в данном документе. То есть оба ITR имеют последовательность дикого типа, но не обязательно должны быть WT-ITR из одного серотипа AAV. В одном варианте реализации один WT-ITR может быть из одного серотипа AAV, а другой WT-ITR может быть из другого серотипа AAV. В таком варианте реализации пара WT-ITR является по существу симметричной, как описано в данном документе, то есть они могут иметь одну или более консервативных модификаций нуклеотида при сохранении симметричной трехмерной пространственной организации.

Последовательности ITR дикого типа или мутированных, или иным образом модифицированных ITR, предложенные в данном документе, представляют собой последовательности ДНК, включенные в экспрессионный конструкт (например, зкДНК-плазмида, зкДНК-бакмида, зкДНК-бакуловирус), для продуцирования вектора зкДНК. Таким образом, последовательности ITR, фактически содержащиеся в векторе зкДНК, полученном из зкДНК-плазмиды или другого экспрессионного конструкта, могут быть или не быть идентичны последовательностям ITR, предложенным в данном документе, в результате естественных изменений, происходящих во время процесса продуцирования (например, ошибки репликации).

В одном варианте реализации вектор зкДНК, описанный в данном документе, который содержит экспрессионную кассету с трансгеном, который представляет собой последовательность терапевтической нуклеиновой кислоты, может быть функционально связан с одной или более регуляторными последовательностями, которые обеспечивают возможность экспрессии или регулируют экспрессию трансгена. В одном варианте реализации полинуклеотид содержит последовательность первого ITR и последовательность второго ITR, причем рассматриваемая нуклеотидная последовательность фланкирована последовательностями первого и второго ITR, и последовательности первого и второго ITR являются асимметричными относительно друг друга или симметричными относительно друг друга.

В одном варианте реализации экспрессионная кассета расположена между двумя ITR, находящихся в следующем порядке с одним или более из: промотора, функционально связанного с трансгеном, посттранскрипционного регуляторного элемента и сигнала полиаденилирования и терминации. В одном варианте реализации промотор является регулируемым-индуцибельным или репрессируемым. Промотор может представлять собой любую последовательность, которая облегчает транскрипцию трансгена. В одном варианте реализации промотор представляет собой промотор CAG или его вариант.Посттрансляционный регуляторный элемент представляет собой последовательность, которая модулирует экспрессию трансгена, в качестве неограничивающего примера любую последовательность, которая создает третичную структуру, усиливающую экспрессию трансгена, который представляет собой последовательность терапевтической нуклеиновой кислоты.

В одном варианте реализации посттрансляционный регуляторный элемент содержит WPRE. В одном варианте реализации сигнал полиаденилирования и терминации содержит BGHpolyA. Дополнительно можно использовать любой цис-регуляторный элемент, известный в данной области техники, или их комбинацию, например, последовательность энхансера 3’-5’-дирекционного типа (USE) позднего сигнала polyA SV40, или другие посттранскрипционные процессинговые элементы, включая, но не ограничиваясь ими, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса или вируса гепатита В (HBV). В одном варианте реализации длина экспрессионной кассеты в направлении от 5’ к 3’ больше, чем максимальная длина, известная для инкапсулирования в вирион AAV. В одном варианте реализации ее длина составляет более 4,6 тыс.о. или более 5 тыс.о., или более 6 тыс.о., или более 7 тыс.о. В данном документе приведены примеры различных экспрессионных кассет.

В одном варианте реализации экспрессионная кассета может содержать более 4000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 10000 нуклеотидов или 20000 нуклеотидов, или 30000 нуклеотидов, или 40000 нуклеотидов, или 50000 нуклеотидов, или любой диапазон в пределах около 4000-10000 нуклеотидов или 10000-50000 нуклеотидов, или более 50000 нуклеотидов.

В одном варианте реализации экспрессионная кассета также может содержать внутренний участок посадки рибосомы (IRES) и/или элемент 2А. Цис-регуляторные элементы включают, но не ограничиваясь ими, промотор, рибо-переключатель, инсулятор, mir-индуцибельный элемент, посттранскрипционный регуляторный элемент, тканеспецифический и клеточноспецифический промотор и энхансер. В некоторых вариантах реализации ITR может действовать как промотор для трансгена. В некоторых вариантах реализации вектор зкДНК содержит дополнительные компоненты для регуляции экспрессии трансгена, например, регуляторный переключатель, для контролирования и регулирования экспрессии трансгена и может содержать, при необходимости, регуляторный переключатель, который представляет собой блокирующий выключатель для обеспечения возможности контролируемой гибели клетки, содержащей вектор зкДНК.

В одном варианте реализации векторы зкДНк являются бескапсидными и могут быть получены из кодирующей плазмиды, в указанном порядке: первый ITR, кассета экспрессируемого трансгена и второй ITR, причем по меньшей мере одна из последовательностей первого и/или второго ITR является мутированной относительно соответствующей последовательности ITR AAV2 дикого типа.

В одном варианте реализации векторы зкДНК, описанные в данном документе, используют в терапевтических целях (например, для применения в медицине, для диагностики или в ветеринарии) или иммуногенных полипептидов.

Экспрессионная кассета может содержать любой трансген, который представляет собой последовательность терапевтической нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации вектор зкДНК содержит любой ген, представляющий собой интерес у данного субъекта, который содержит один или более полипептидов, пептидов, рибозимов, пептидных нуклеиновых кислот, миРНК, РНКи, антисмысловых олигонуклеотидов, антисмысловых полинуклеотидов, антител, антигенсвязывающих фрагментов или любой их комбинации.

В одном варианте реализации последовательности, которые находятся в экспрессионной кассете, экспрессионном конструкте или донороной последовательности вектора зкДНК, описанные в данном документе, могут быть кодон-оптимизированными для клетки хозяина. В данном контексте термин «кодон-оптимизированный» или «оптимизация кодонов» относится к процессу модификации последовательности нуклеиновой кислоты для усиленной экспрессии в клетках рассматриваемого позвоночного животного, например, мыши или человека, посредством замены по меньшей мере одного, более чем одного или существенного количества кодонов нативной последовательности (например, прокариотической последовательности) на кодоны, которые более часто или чаще всего используются в генах данного позвоночного животного. Различные биологические виды демонстрируют особую склонность к некоторым кодонам конкретной аминокислоты.

Обычно оптимизация кодонов не изменяет аминокислотную последовательность исходного транслированного белка. Оптимизированные кодоны могут быть определены с помощью платформы оптимизации кодонов и синтеза выборочных генов Gene Forge® компании Aptagen (Aptagen, Inc., 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Херндон, штат Вирджиния, 20171) или другой общедоступной базы данных.

Многие организмы проявляют склонность к использованию определенных кодонов для кодирования вставки конкретной аминокислоты в растущую пептидную цепь. Неслучайное использование кодонов или предпочтение кодонов, неодинаковое использование кодонов различными организмами, обеспечивается дегенерацией генетического кода и научно доказано для многих организмов. Предпочтение кодонов часто коррелирует с эффективностью трансляции матричной РНК (мРНК), которая, в свою очередь, предположительно зависит, среди прочего, от свойств транслируемых кодонов и доступности конкретных молекул транспортной РНК (тРНК). Преобладание выборочных тРНК в клетке обычно отражает кодоны, которые чаще всего используются для синтеза пептидов. Соответственно, на основании оптимизации кодонов можно адаптировать гены для оптимальной экспрессии генов в данном организме.

С учетом большого количества генных последовательностей, доступных для многочисленных видов животных, растений и микробов, можно рассчитать относительную частоту использования кодонов (Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)).

Инвертированные концевые повторы (ITR)

Как описано в данном документе, векторы зкДНК представляют собой молекулы бескапсидной, линейной дуплексной ДНК, образованные из непрерывной цепи комплементарной ДНК с ковалентно замкнутыми концами (линейная, непрерывная и не инкапсидированная структура), которые содержат 5’-последовательность инвертированного концевого повтора (ITR) и 3’-последовательность ITR, которые являются различными или асимметричными относительно друг друга. По меньшей мере один из ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения и сайт связывания белка репликации (RPS) (иногда упоминаемый как репликативный сайт связывания белка), например, сайт связывания Rep.Обычно вектор зкДНК содержит по меньшей мере одну модифицированную последовательность инвертированного концевого повтора (ITR) AAV, т.е. делецию, вставку и/или замену относительно другого ITR, и экспрессируемый трансген.

В одном варианте реализации по меньшей мере один из ITR представляет собой ITR AAV, например, ITR AAV дикого типа. В одном варианте реализации по меньшей мере один из ITR является модифицированным ITR относительного другого ITR, т.е. зкДНК содержит ITR, которые являются асимметричными относительно друг друга. В одном варианте реализации по меньшей мере один из ITR представляет собой нефункциональный ITR.

В одном варианте реализации вектор зкДНК содержит: (1) экспрессионную кассету, содержащую цис-регуляторный элемент, промотор и по меньшей мере один трансген; или (2) промотор, функционально связанный с по меньшей мере одним трансгеном, и (3) две самокомплементарные последовательности, например, ITR, фланкирующие указанную экспрессионную кассету, причем вектор зкДНК не ассоциирован с капсидным белком. В некоторых вариантах реализации вектор зкДНК содержит две самокомплементарные последовательности, встречающиеся в геноме AAV, где по меньшей мере одна содержит функциональный Rep-связывающий элемент (RBE) и сайт концевого разрешения (trs) AAV или функциональный вариант RBE, и один или более цис-регуляторных элементов, функционально связанных с трансгеном. В некоторых вариантах реализации вектор зкДНК содержит дополнительные компоненты для регуляции экспрессии трансгена, например, регуляторные переключатели, для контролирования и регулирования экспрессии трансгена, и может содержать регуляторный переключатель, который представляет собой блокирующий выключатель для обеспечения возможности контролируемой гибели клетки, содержащей вектор зкДНК.

В одном варианте реализации две самокомплементарные последовательности могут представлять собой последовательности ITR из любого известного парвовируса, например, депендовируса, такого как AAV (например, AAV1-AAV12). Может быть использовано любой серотип AAV, включая, но не ограничиваясь ими, модифицированную последовательность ITR AAV2, которая сохраняет Rep-связывающий сайт (RBS), такой как 5’-GCGCGCTCGCTCGCTC-3’, и сайт концевого разрешения (trs), в дополнение к переменной палиндромной последовательности, обеспечивающей возможность образования вторичной шпилечной структуры. В некоторых вариантах реализации ITR может быть синтетическим. В одном варианте реализации синтетический ITR основан на последовательностях ITR из более чем одного серотипа AAV. В другом варианте реализации синтетический ITR не содержит последовательность на основе AAV. В другом варианте реализации синтетический ITR сохраняет структуру ITR, описанную выше, несмотря на то, что содержит лишь часть или не содержит последовательность из AAV. В некоторых аспектах синтетический ITR может предпочтительно взаимодействовать с Rep дикого типа или Rep определенного серотипа, или в некоторых случаях не распознается Rep дикого типа и распознается только мутированным Rep.В некоторых вариантах реализации ITR представляет собой синтетическую последовательность ITR, которая сохраняет функциональный Rep-связывающий сайт (RBS), такой как 5’-GCGCGCTCGCTCGCTC-3’, и сайт концевого разрешения (TRS), в дополнение к переменной палиндромной последовательности, обеспечивающей возможность образования вторичной шпилечной структуры. В некоторых примерах модифицированная последовательность ITR сохраняет последовательность RBS, trs и структуру и положение Rep-связывающего элемента, образуя концевую часть петли вторичной шпилечной структуры ITR из соответствующей последовательности ITR AAV2 дикого типа. Иллюстративные последовательности ITR для применения в векторах зкДНК описаны в таблицах 2-9, 10А и 10 В, SEQ ID NO: 2, 52, 101-449 и 545-547, а частичные последовательности ITR представлены на Фиг. 26А-26 В в заявке РСТ №PCT/US 18/49996, поданной 7 сентября 2018 года. В некоторых вариантах реализации вектор зкДНК может содержать ITR с модификацией в ITR, соответствующей любым модификациям в последовательностях ITR или в частичных последовательностях ITR, представленным в одной или более таблицах 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10А и 10В в заявке РСТ №PCT/US 18/49996, поданной 7 сентября 2018 года.

В одном варианте реализации векторы зкДНК могут быть получены из экспрессионных конструктов и дополнительно содержат специфическую комбинацию цис-регуляторных элементов. 1|мс-регуляторные элементы включают, но не ограничиваясь ими, промотор, рибо-переключатель, инсулятор, mir-индуцибельный элемент, посттранскрипционный регуляторный элемент, тканеспецифический и клеточноспецифический промотор и энхансер. В некоторых вариантах реализации ITR может действовать как промотор для трансгена. В некоторых вариантах реализации вектор зкДНК содержит дополнительные компоненты для регуляции экспрессии трансгена, например, регуляторные переключатели, описанные в заявке РСТ №PCT/US 18/49996, поданной 7 сентября 2018 года, для регуляции экспрессии трансгена, или блокирующий выключатель, который может уничтожать клетку, содержащую вектор зкДНК.

В одном варианте реализации экспрессионные кассеты также могут содержать посттранскрипционный элемент для повышения экспрессии трансгена. В одном варианте реализации для повышения экспрессии трансгена используют посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (WHP) (WPRE). Могут быть использованы другие посттранскрипционные процессинговые элементы, такие как посттранскрипционный элемент из гена тимидинкиназы вируса простого герпеса или вируса гепатита В (HBV). С трансгенами могут быть связаны секреторные последовательности, например, последовательности VH-02 и VK-A26. Экспрессионные кассеты могут включать последовательность полиаденилирования, известную в данной области техники, или ее вариант, такой как природная последовлательность, выделенная из бычьего BGHpA или вирусного SV40pA, или синтетическая последовательность. Некоторые экспрессионные кассеты также могут включать последовательность энхансера 3’-5’-дирекционного типа (US E) позднего сигнала polyA SV40. USE можно использовать в комбинации с SV40pA или гетерологичным сигналом polyA.

На Фиг. 1А-1С международной заявки №PCT/US 2018/050042, поданной 7 сентября 2018 года и полностью включенной в данный документ посредством ссылки, представлено схематическое изображение неограничивающих, иллюстративных векторов зкДНК или соответствующей последовательности плазмид зкДНК. Векторы зкДНК являются бескапсидными и могут быть получены из кодирующей плазмиды в указанном порядке: первый ITR, кассета экспрессируемого трансгена и второй ITR, причем по меньшей мере одна из последовательностей первого и/или второго ITR является мутированной относительно соответствующей последовательности ITR AAV2 дикого типа. Экспрессируемая трансгенная кассета предпочтительно содержит один или более из следующих, в указанном порядке: энхансер/промотор, репортер ORF (трансген), посттранскрипционный регуляторный элемент (например, WPRE) и сигнал полиаденилирования и терминации (например, polyA BGH).

Промоторы

Пригодные промоторы, включая те, которые описаны выше, могут быть получены из вирусов и, следовательно, могут быть упомянуты как вирусные промоторы, или они могут быть получены из любого организма, включая прокариотические или эукариотические организмы. Пригодные промоторы могут быть использованы для управления экспрессией под действием любой РНК-полимеразы (например, pol I, pol II, pol III). Иллюстративные промоторы включают, но не ограничиваясь ими, ранний промотор SV40, промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса опухоли молочной железы мышей; главный поздний промотор аденовируса (Ad MLP); промотор вируса простого герпеса (HSV), промотор цитомегаловируса (CMV), такой как область немедленно-раннего промотора CMV (CMVTE), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), малый ядерный промотор U6 человека (U6, например, (Miyagishi el al., Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)), усовершенствованный промотор U6 {e.g., Xia et al., Nucleic Acids Res. 1 сент.2003; 31(17)), промотор HI человека (HI), промотор CAG, промотор человеческого альфа-1-антитрипсина (НААТ) (например, и т.п.). В одном варианте реализации указанные промоторы изменены в правой части, содержащей интрон, и содержат один или более сайтов расщепления нуклеазы. В одном варианте реализации ДНК, содержащая сайт(ы) расщепления нуклеазы, является чужеродной для ДНК промотора.

В одном варианте реализации промотор может содержать одну или более специфических транскрипционных регуляторных последовательностей для дополнительного усиления экспрессии и/или для изменения пространственной экспрессии, и/или для временной экспрессии таковых. Промотор может также содержать удаленные энхансерные или репрессорные элементы, которые могут быть расположены за несколько тысяч пар оснований от сайта начала транскрипции. Промотор может быть получен из различных источников, включая вирусы, бактерии, грибы, растения, насекомых и животных. Промотор может регулировать экспрессию генного компонента конститутивно или дифференциально относительно клетки, ткани или органа, в котором происходит экспрессия, или относительно стадии развития, на которой происходит экспрессия, или в ответ на внешние раздражители, такие как физиологические стрессы, патогены, ионы металлов или индуцирующие агенты. Иллюстративные примеры промоторов включают промотор Т7 бактериофагов, промотор Т3 бактериофагов, промотор SP6, промотор-оператор lac, промотор tac, поздний промотор SV40, ранний промотор SV40, промотор RSV-LTR, промотор CMV IE, ранний промотор SV40 или поздний промотор SV40 и промотор CMV IE, а также промоторы, перечисленные ниже. Такие промоторы и/или энхансеры могут быть использованы для экспрессии любого интересующего гена, например, терапевтических белков. Например, вектор может содержать промотор, который функционально связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей терапевтический белок. В одном варианте реализации промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью терапевтического белка, может представлять собой промотор из вируса обезьян 40 (SV40), промотор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), промотор вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), такой как промотор длинного концевого повтора (LTR) бычьего вирус иммунодефицита (BIV), промотор вируса Молони, промотор вируса лейкоза птиц (ALV), промотор цитомегаловируса (CMV), такой как немедленно-ранний промотор CMV, промотор вируса Эпштейна-Барра (EBV) или промотор вируса саркомы Рауса (RSV). В одном варианте реализации промотор также может представлять собой промтор из гена человека, такого как убиквитин С человека (hUbC), актин человека, миозин человека, гемоглобин человека, мышечный креатинин человека или металлотионеин человека. Промотор также может представлять собой тканеспецифический промотор, такой как печеночно-специфический промотор, такой как альфа-1-антитрипсин человека (НААТ), природный или синтетический. В одном варианте реализации доставка в печень может быть осуществлена с помощью направленной доставки, специфической для эндогенного АроЕ, композиции, содержащей вектор зкДНК, в гепатоциты через рецептор липопротеина низкой плотности (LDL), присутствующий на поверхности гепатоцита.

В одном варианте реализации используемый промотор представляет собой нативный промотор гена, кодирующего терапевтический белок. Промоторы и другие регуляторные последовательности для соответствующих генов, кодирующих терапевтические белки, известны и описаны ранее. Используемая область промотора может дополнительно содержать одну или более дополнительных регуляторных последовательностей (например, нативных), например, энхансеры.

Неограничивающие примеры подходящих промоторов для применения по данному изобретению включают промотор CAG, например, промотор НААТ, промотор EFl-a человека или фрагмент промотора the EF1-α и промотора EFl-α крыс.

Последовательности полиаденилирования

Последовательность, кодирующая последовательность полиаденилирования, может быть включена в вектор зкДНК для стабилизации мРНК, экспрессированной из вектора зкДНК, и для облегчения выхода из ядра и трансляции. В одном варианте реализации вектор зкДНК не содержит последовательность полиаденилирования. В других вариантах реализации указанный вектор содержит по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50 или более адениновых динуклеотидов. В некоторых вариантах реализации последовательность полиаденилирования содержит около 43 нуклеотидов, около 40-50 нуклеотидов, около 40-55 нуклеотидов, около 45-50 нуклеотидов, около 35-50 нуклеотидов или количество в любом диапазоне между указанными значениями.

В одном варианте реализации зкДНК может быть получена из полинуклеотида вектора, который кодирует гетерологичную нуклеиновую кислоту, функционально расположенную между двумя различными последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR) (например, ITR AAV), причем по меньшей мере один из ITR содержит сайт концевого разрешения и репликативный сайт связывания белка (RPS), например, Rep-связывающий сайт (например, ITR AAV дикого типа), и один из ITR содержит делецию, вставку и/или замену относительного другого ITR, например, функционального ITR.

В одном варианте реализации клетки хозяина не экспрессируют белки вирусного капсида, и матрица полинуклеотидного вектора не содержит последовательности, кодирующие вирусный капсид. В одном варианте реализации матрица полинуклетоидного вектора не содержит гены капсида AAV, а также гены капсида других вирусов. В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты также не содержит последовательности, кодирующие белок Rep AAV. Соответственно, в некоторых вариантах реализации молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению не содержит функциональные гены cap AAV и rep AAV.

В одном варианте реализации вектор зкДНК не содержит модифицированные ITR.

В одном варианте реализации вектор зкДНК содержит регуляторный переключатель, описанный в данном документе (или в заявке РСТ №PCT/US 18/49996, поданной 7 сентября 2018 года).

IV. Получение вектора зкДНК

Способы получения вектора зкДНК, описанного в данном документе, который содержит пару асимметричных ITR или пару симметричных ITR, как описано в данном документе, описаны в разделе IV заявки PCT/US 18/49996, поданной 7 сентября 2018 года, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки. Как описано в данном документе, вектор зкДНК может быть получен, например, способом, включающим стадии: а) инкубация популяции клеток хозяина (например, клеток насекомого), несущих матрицу конструкта экспрессии полинуклеотида (например, зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус), которая не содержит последовательности, кодирующие вирусный капсид, в присутствии белка Rep в эффективных условиях и в течение времени, достаточного для инициации продуцирования вектора зкДНК в клетках хозяина, и при этом клетки хозяина не содержат последовательности, кодирующие вирусный капсид; и Ь) сбор и выделение вектора зкДНК из клеток хозяина. Присутствие белка Rep индуцирует репликацию векторного полинуклеотида с модифицированным ITR с образованием вектора зкДНК в клетке хозяина.

Однако не экспрессируются вирусные частицы (например, вирионы AAV). Таким образом, не существует ограничений по размеру, которые обычно характерны для векторов на основе AAV или других вирусных векторов.

Присутствие вектора зкДНК, выделенного из клеток хозяина, может быть подтверждено посредством расщепления ДНК, выделенной из клетки хозяина, рестрикционным ферментом, имеющим один сайт распознавания в векторе зкДНК, и анализа материала расщепленной ДНК на неденатурирующем геле для подтверждения наличия характеристических полос линейной и непрерывной ДНК, по сравнению с линейной и прерывистой ДНК.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено применение клеточных линий хозяина, которые содержат матрицу экспрессии полинуклеотида вектора ДНК (матрицу зкДНК), стабильно интегрированную в их собственный геном, для получения невирусного вектора ДНК, например, как описано в публикации Lee, L. et at. (2013) Plos One 8(8): e69879. Предпочтительно, Rep добавляют в клетки хозяина при значении MOI (множественность трансфекции) около 3. Если клеточная линия хозяина представляет собой клеточную линию млекопитающего, например, клетки НЕК293, то клеточные линии могут содержать стабильно интегрированную матрицу полинуклеотидного вектора, а второй вектор, такой как вирус герпеса, можно использовать для внедрения белка Rep в клетки, что обеспечивает возможность удаления и амплификации зкДНК в присутствии Rep и вируса-хелпера.

В одном варианте реализации клетки хозяина, используемые для получения векторов зкДНК, описанных в данном документе, представляют собой клетки насекомых, и использован бакуловирус для доставки полинуклеотида, кодирующего белок Rep, и матрицы конструкта экспрессии полинуклеотида невирусного вектора ДНК для зкДНК. В некоторых вариантах реализации клетка хозяина сконструирована для экспрессии белка Rep.

Затем собирают вектор зкДНК и выделяют из клеток хозяина. Время для сбора и получения векторов зкДНК, описанных в данном документе, из клеток может быть выбрано и оптимизировано для достижения высокой производительности получения векторов зкДНК. Например, время сбора может быть выбрано с учетом жизнеспособности клеток, морфологии клеток, роста клеток и т.д. В одном варианте реализации клетки выращивают в достаточных условиях и собирают спустя достаточное время после инфицирования бакуловирусом для получения векторов зкДНК, но до того, как большинство клеток начнут погибать вследствие бакуловирусной токсичности. Векторы ДНК могут быть выделены с помощью наборов для очистки плазмид, таких как наборы Qiagen Endo-Free Plasmid. Для векторов ДНК также могут быть адаптированые другие способы, разработанные для выделения плазмид. В целом, можно адаптировать любые способы очистки нуклеиновых кислот.

Векторы ДНК могут быть очищены любыми способами, известными специалистам в данной области техники для очистки ДНК. В одном варианте реализации векторы зкДНК очищают с получением молекул ДНК. В одном варианте реализации векторы зкДНК очищают с получением экзосом или микрочастиц. Присутствие вектора зкДНК может быть подтверждено посредством расщепления вектора ДНК, выделенного из клеток, рестрикционным ферментом, имеющим один сайт распознавания в векторе ДНК, и анализа материала расщепленной и нерасщепленной ДНК с использованием гель-электрофореза для подтверждения наличия характеристических полос линейной и непрерывной ДНК, по сравнению с линейной и прерывистой ДНК.

V. Получение липидных частиц

Липидные частицы (например, липидные наночастицы) могут самопроизвольно образовываться при смешивании ТНК (например, зкДНК) и липида(ов). В зависимости от требуемого распределения частиц по размеру, полученную смесь наночастиц можно экструдировать через мембрану (например, с отсечением по размеру 100 нм), например, с использованием экструдера типа Thermobarrel, такого как Lipex Extruder (Northern Lipids, Inc). В некоторых случаях стадия экструзии может быть пропущена. Удаление этанола и одновременную замену буфера можно осуществлять, например, посредством диализа или тангенциальной поточной фильтрации.

В целом, липидные частицы (например, липидные наночастицы) могут быть получены любым способом, известным в данной области техники. Например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) могут быть получены способами, описанными, например, в US 2013/0037977, US 2010/0015218, US 2013/0156845, US 2013/0164400, US 2012/0225129 и US 2010/0130588, полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации липидные частицы (например, липидные наночастицы) могут быть получены способом непрерывного смешивания, способом непосредственного разбавления или способом прямоточного разбавления. Способы и устройство оборудования для получения липидных наночастиц с использованием непосредственного разбавления или прямоточного разбавления описаны в US 2007/0042031, полное содержание которого включено в данный документ посредством ссылки. Способы и оборудование для получения липидных наночастиц с использованием поэтапного разбавления описаны в US 2004/0142025, полное содержание которого включено в данный документ посредством ссылки.

В одном варианте реализации липидные частицы (например, липидные наночастицы) могут быть получены способом ударяющей струи. В целом, частицы получают посредством смешивания липидов, растворенных в спирте (например, в этаноле), с зкДНК, растворенной в буфере, например, в цитратном буфере, в натрий-ацетатном буфере, в натрий-ацетатном и магний-хлоридном буфере, в буфере на основе яблочной кислоты, в буфере на основе яблочной кислоты и хлорида натрия, или в буфере на основе цитрата натрия и хлорида натрия. Отношение смешивания липидов к зкДНК может составлять около 45-55% липида и около 65-45% зкДНК.

Раствор липидов может содержать ионизируемый липид формулы (I), некатионный липид (например, фосфолипид, такой как DSPC, DOPE и DOPC), ПЭГ или ПЭГ-конъюгированную молекулу (например, ПЭГ-липид) и стерин (например, холестерин) в общей концентрации липидов 5-30 мг/мл, более предпочтительно 5-15 мг/мл, наиболее предпочтительно 9-12 мг/мл в спирте, например, в этаноле. В растворе липидов молярное содержание липидов может варьироваться в диапазоне около 25-98% для катионного липида, предпочтительно около 35-65%; около 0-15% для неионогенного липида, предпочтительно около 0-12%, около 0-15% для ПЭГ или ПЭГ-конъюгированной липидной молекулы, предпочтительно около 1-6% и около 0-75% для холестерина, предпочтительно около 30-50%.

Раствор зкДНК может содержать зкДНК в диапазоне концентрации от 0,3 до 1,0 мг/мл, предпочтительно 0,3-0,9 мг/мл в буферном растворе с рН в диапазоне 3,5-5.

В одном иллюстративном, но не ограничивающем варианте реализации указанные две жидкости нагревают до температуры в диапазоне около 15-40°С, предпочтительно около 30-40°С, и затем смешивают, например, в смесителе с ударяющими струями, сразу получая LNP. Скорость потока смешивания может варьироваться от 10 до 600 мл/мин. Внутренний диаметр трубки может составлять от 0,25 до 1,00 мл, а общая скорость потока от 10 до 600 мл/мин. Комбинация скорости потока и внутреннего диаметра трубок может влиять на регулирование размера частиц LNP от 30 до 200 нм. Затем можно смешивать полученный раствор с буферным раствором с более высоким рН в соотношении смешивания от 1:1 до 1:3 об.:об., предпочтительно около 1:2 об.:об. При необходимости указанный буферный раствор может иметь температуру в диапазоне 15-40°С или 30-40°С.Затем смешанные LNP можно подвергать стадии фильтрования через анионообменник. Перед анионообменом смешанные LNP можно инкубировать в течение некоторого периода времени, например, от 30 минут до 2 часов. Температура во время инкубации может быть в диапазоне 15-40°С или 30-40°С. После инкубации раствор фильтруют через фильтр, такой как 0,8 мкм фильтр, включая стадию разделения на анионообменнике. В указанном процессе можно использовать трубки с внутренним диаметром (ID) от 1 мм ID до 5 мм ID и скорость потока от 10 до 2000 мл/мин.

После их получения LNP можно концентрировать и подвергать диафильтрации способом ультрафильтрации, в результате чего осуществляют удаление спирта и замену буфера на конечный буферный раствор, например, фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) с pH около 7, например, с рН около 6,9, с рН около 7,0, с рН около 7,1, с рН около 7,2, с рН около 7,3 или с рН около 7,4.

Для процесса ультрафильтрации можно использовать формат тангенциальной поточной фильтрации (TFF) с использованием мембраны с номинальным отсечением по молекулярной массе от 30 до 500 кДа. Формат мембраны представляет собой половолоконный или плоский листовой картридж. Процессы TFF с правильным отсечением по молекулярной массе могут обеспечивать удерживание LNP в ретентате, а фильтрат или пермеат содержит спирт; остатки цитратного буфера и конечного буфера. Процесс TFF представляет собой многостадийный процесс с переходом от исходной концентрации до концентрации зкДНК 1-3 мг/мл. После концентрирования раствор LNP подвергают диафильтрации против конечного буфера в количестве 10-20 объемов для удаления спирта и осуществления замены буфера. Затем полученный материал можно дополнительно концентрировать в 1-3 раза. Концентрированный раствор LNP можно подвергать фильтрации через стерилизующий фильтр.

VI. Фармацевтические композиции и лекарственные формы

В данном документе предложена также фармацевтическая композиция, содержащая липидную частицу ТНК и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество.

В одном варианте реализации липидные частицы ТНК (например, липидные наночастицы) обеспечены с полной инкапсуляцией, частичной инкапсуляцией терапевтической нуклеиновой кислоты. В одном варианте реализации терапевтические средства на основе нуклеиновой кислоты полностью инкапсулированы в липидные частицы (например, липидные наночастицы) с образованием липидной частицы, содержащей нуклеиновую кислоту. В одном варианте реализации нуклеиновая кислота может быть инкапсулирована в липидную часть частицы, что защищает ее от ферментативного расщепления.

В одном варианте реализации липидная частица имеет средний диаметр от около 20 нм до около 100 нм, от 30 нм до около 150 нм, от около 40 нм до около 150 нм, от около 50 нм до около 150 нм, от около 60 нм до около 130 нм, от около 70 нм до около 110 нм, от около 70 нм до около 100 нм, от около 80 нм до около 100 нм, от около 90 нм до около 100 нм, от около 70 до около 90 нм, от около 80 нм до около 90 нм, от около 70 нм до около 80 нм или около 30 нм, 35 нм, 40 нм, 45 нм, 50 нм, 55 нм, 60 нм, 65 нм, 70 нм, 75 нм, 80 нм, 85 нм, 90 нм, 95 нм, 100 нм, 105 нм, 110 нм, 115 нм, 120 нм, 125 нм, 130 нм, 135 нм, 140 нм, 145 нм или 150 нм для обеспечения эффективной доставки.

Липидные частицы, содержащие нуклеиновую кислоту (например, липидные наночастицы), и способы их получения описаны, например, в PCT/US 18/50042, в публикациях патентов США №20040142025 и 20070042031, полное описание которых во всех отношениях включено в данный документ посредством ссылки. В одном варианте реализации размер липидной частицы (например, липидной наночастицы) можно определять методом квазиупругого светорассеяния с использованием, например, системы Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, Великобритания).

Обычно липидные частицы (например, липидные наночастицы) по данному изобретению имеют средний диаметр, выбранный для обеспечения предполагаемого терапевтического эффекта.

В зависимости от предполагаемого применения липидных частиц (например, липидных наночастиц), доли компонентов могут варьироваться, а эффективность доставки конкретной композиции можно измерять, например, с помощью анализа параметра эндосомального высвобождения (ERP).

В одном варианте реализации липидные частицы (например, липидные наночастицы) могут быть конъюгированы с другими фрагментами для предотвращения агрегации. Такие липидные конъюгаты включают, но не ограничиваясь ими, ПЭГ-липидные конъюгаты, такие как, например, ПЭГ, связанные с диалкилоксипропилами (например, конъюгаты ПЭГ-DAA); ПЭГ, связанные с диацилглицеринами (например, конъюгаты ПЭГ-DAG); ПЭГ, связанные с холестерином; ПЭГ, связанные с фосфатидилэтаноламинами; и ПЭГ, конъюгированные с церамидами (см., например, патент США№5885613), катионные ПЭГ-липиды, полиоксазолин (POZ)-липидные конъюгаты (например, конъюгаты POZ-DAA; см., например, предварительную заявку на патент США №61/294828, поданную 13 января 2010 года, и предварительную заявку на патент США№61/295140, поданную 14 января 2010 года), полиамидные олигомеры (например, АТТА-липидные конъюгаты) и их смеси. Дополнительные примеры POZ-липидных конъюгатов описаны в публикации РСТ№WO 2010/006282. ПЭГ или POZ могут быть конъюгированы напрямую с липидом или могут быть связаны с липидом через линкерный фрагмент. Можно использовать любой линкерный фрагмент, пригодный для связывания ПЭГ или POZ с липидом, включая, например, линкерные фрагменты, не содержащие сложный эфир, и линкерные фрагменты, содержание сложные эфир. В некоторых предпочтительных вариантах реализации используют линкерные фрагменты, не содержащие сложный эфир, такие как амиды или карбаматы. Полное описание каждого из вышеуказанных патентных документов включено в данный документ посредством ссылки во всех отношениях.

В одном варианте реализации зкДНК может быть связана в комплекс с липидной частью указанной частицы или инкапсулирована в липидном положении липидной частицы (например, липидной наночастицы). В одном варианте реализации зкДНК может быть полностью инкапсулирована в липидном положении липидной частицы (например, липидной наночастицы), что защищает ее от расщепления нуклеазой, например, в водном растворе. В одном варианте реализации зкДНК в липидной частице (например, в липидной наночастице) не подвергается существенному расщеплению при воздействии на липидную частицу (например, липидную наночастицу) нуклеазы при 37°С в течение по меньшей мере около 20, 30, 45 или 60 минут.В некоторых вариантах реализации зкДНК в липидной частице (например, в липидной наночастице) не подвергается существенному расщеплению после инкубации частицы в сыворотке при 37°С в течение по меньшей мере 30, 45 или 60 минут или по меньшей мере около 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 или 36 часов.

В одном варианте реализации липидные частицы (например, липидные наночастицы) являются по существу нетоксичными для субъекта, например, млекопитающего, такого как человек.

В одном варианте реализации фармацевтическая композиция, содержащая терапевтическую нуклеиновую кислоту по данному изобретению, может быть составлена в форме липидных частиц (например, липидных наночастиц). В некоторых вариантах реализации липидная частица, содержащая терапевтическую нуклеиновую кислоту, может быть получена из ионизируемого липида формулы (I). В некоторых других вариантах реализации липидная частица, содержащая терапевтическую нуклеиновую кислоту, может быть получена из некатионного липида. В предпочтительном варианте реализации липидная частица по данному изобретению представляет собой липидную частицу, содержащую нуклеиновую кислоту, причем указанная липидная частица получена из ионизируемого липида формулы (I) и содержит терапевтическую нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из мРНК, антисмысловой РНК и олигонуклеотида, рибозимов, аптамера, интерферирующих РНК (РНКи), дцРНК субстрата Дайсера, малой шпилечной РНК (мшРНК), асимметричной интерферирующей РНК (аиРНК), микроРНК (микроРНК), миникольцевой ДНК, минигена, синтетических векторов ДНК вирусной ДНК (например, генома лентивируса или AAV) или невирусных векторов ДНК, линейной дуплексной ДНК с замкнутыми концами (зкДНК/CELiD), плазмид, бакмид, векторов ДНК Doggybone™, минималистичного иммунологически определяемого вектора экспрессии генов (MIDGE), невирусного вектора мини-нитевой ДНК (вектора линейной ковалентно замкнутой ДНК) или минимального вектора гантелеобразной ДНК («гантелеобразной ДНК»).

В другом предпочтительном варианте реализации липидная частица по данному изобретению представляет собой липидную частицу, содержащую нуклеиновую кислоту, которая получена из некатионного липида и необязательно конъюгированного липида, который препятствует агрегации частицы.

В одном варианте реализации композиция липидных частиц предсталяет собой водный раствор. В одном варианте реализации композиция липидных частиц (например, липидных наночастиц) представляет собой лиофилизированный порошок.

В соответствии с некоторыми аспектами, в данном описании предложена композиция липидных частиц, дополнительно содержащая одно или более фармацевтических вспомогательных веществ. В одном варианте реализации композиция липидных частиц (например, липидных наночастиц) дополнительно содержит сахарозу, Tris, трегалозу и/или глицин.

В одном варианте реализации липидные частицы (например, липидные наночастицы), описанные в данном документе, могут быть включены в фармацевтические композиции, подходящие для введения субъекту для in vivo доставки в клетки, ткани или органы субъекта. Как правило, фармацевтическая композиция содержит липидные частицы ТНК (например, липидные наночастицы), описанные в данном документе и фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте реализации липидные частицы ТНК (например, липидные наночастицы) по данному изобретению могут быть включены в фармацевтическую композицию, подходящую для требуемого способа терапевтического введения (например, для парентерального введения). Предусмотрен также пассивный перенос в ткань посредством внутривенной или внутриартериальной инфузии при высоком давлении, а также при внутриклеточной инъекции, такой как внутриядерная микроинъекция или интрацитоплазматическая инъекция. Фармацевтические композиции терапевтического назначения могут быть составлены в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосом или другой упорядоченной структуры, пригодной для высокой концентрации вектора зкДНК. Стерильные растворы для инъекций могут быть получены посредством включения соединения вектора зкДНК в требуемом количестве в подходящий буфер, при необходимости с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, с последующей фильтрацией через стерилизующий фильтр.

Липидная частица, описанная в данном документе, может быть включена в фармацевтическую композицию, подходящую для местного, системного, интраамниотического, интратекального, внутричерепного, внутриартериального, внутривенного, интралимфатического, интраперитонеального, подкожного, трахеального, внутритканевого (например, внутримышечного, интракардиального, внутрипеченочного, внутрипочечного, интрацеребрального), интратекального, интравезикального, конъюнктивального (например, экстраорбитального, интраорбитального, ретроорбитального, интраретинального, субретинального, хороидального, субхороидального, интрастромального, интракамерального и интравитреального), интракохлеарного и мукозального (например, перорального, ректального, назального) введения. Предусмотрен также пассивный перенос в ткань посредством внутривенной или внутриартериальной инфузии при высоком давлении, а также при внутриклеточной инъекции, такой как внутриядерная микроинъекция или интрацитоплазматическая инъекция.

Фармацевтически активные композиции, содержащие липидные частицы ТНК (например, липидные наночастица), могут быть составлены для доставки трансгена в нуклеиновой кислоте в требуемые клетки реципиента, что приводит к терапевтической экспрессии в них трансгена. Композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтические композиции терапевтического назначения обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть составлена в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосом или другой упорядоченной структуры, пригодной для высокой концентрации вектора зкДНК. Стерильные растворы для инъекций могут быть получены посредством включения соединения вектора зкДНК в требуемом количестве в подходящий буфер, при необходимости с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, с последующей фильтрацией через стерилизующий фильтр.

В одном варианте реализации липидные частицы (например, липидные наночастицы) представляют собой частицы с твердым ядром, которые имеют по меньшей мере один липидный двойной слой. В одном варианте реализации липидные частицы (например, липидные наночастицы) имеют структуру, которая не является двухслойной, т.е. имеют неслоистую (т.е. не двухслойную) морфологию. Без ограничений, не двухслойная морфология может включать, например, трехмерные трубки, стержни, структуры кубической симметрии и т.д. Неслоистая морфология (т.е. не двухслойная структура) липидных частиц (например, липидных наночастиц) может быть определена аналитическими технологиями, известными специалистам в данной области техники. Такие технологии включают, но не ограничиваясь ими, просвечивающую электронную крио-микроскопию («Cryo-ТЕМ»), дифференциальную сканирующую калориметрию («ДСК»), рентгеновскую дифракцию и т.п.Например, морфология липидных частиц (слоистая или неслоистая) может быть без труда определена и охарактеризована с применением, например, анализа Cryo-ТЕМ, описанного в US 2010/0130588, полное содержание которого включено в данный документ посредством ссылки.

В одном варианте реализации липидные частицы (например, липидные наночастицы), имеющие неслоистую морфологию, являются электроноплотными.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена липидная частица (например, липидная наночастица), которая является либо однослойной, либо многослойной по своей структуре. В некоторых аспектах данного изобретения предложена композиция липидных частиц (например, липидных наночастиц), которая содержит мультивезикулярные частицы и/или частицы на пенистой основе. Посредством регулирования состава и концентрации липидных компонентов, можно регулировать скорость, с которой происходит переход липидного конъюгата из липидной частицы и, в свою очередь, скорость, с которой липидная частица (например, липидная наночастица) становится фузогенной. Кроме того, можно использовать другие переменные, включая, например, рН, температуру или ионную силу, для изменения и/или регулирования скорости, с которой липидная частица (например, липидная наночастица) становится фузогенной. Другие способы, которые можно использовать для регулирования скорости, с которой липидная частица (например, липидная наночастица) становится фузогенной, станут понятны специалистам в данной области техники на основании данного описания. Также понятно, что посредством изменения состава и концентрации липидного конъюгата можно регулировать размер липидных частиц.

В одном варианте реализации значение рКа составленных в композицию ионизируемых липидов может коррелировать с эффективностью LNP для доставки нуклеиновых кислот (см. Jayaraman et al, Angewandte Chemie, международндое издание (2012), 51(34), 8529-8533; Semple etal, Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010), полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки). В одном варианте реализации предпочтительный диапазон рКа оставляет от ~5 до ~8. В одном варианте реализации предпочтительный диапазон рКа составляет ~6 to ~ 7. В одном варианте реализации предпочтительный pKa составляет -6,5. В одном варианте реализации pKa ионизируемого липида может быть определен в липидных частицах (например, в липидных наночастицах) с помощью анализа, основанного на флуоресценции 2-(п-толуидино)-6-нафталинсульфоновой кислоты (TNS).

В одном варианте реализации инкапсуляция зкДНК в липидные частицы (напрмер, в липидные наночастицы) может быть определена посредством выполнения анализа исключения непроницаемого для мембраны флуоресцентного красителя, в котором используют краситель, обладающий повышенной флуоресценцией при ассоциации с нуклеиновой кислотой, например, анализа Oligreen® или анализа PicoGreen®. Обычно инкапсуляцию определяют посредством добавления красителя в композицию липидных частиц, измерения результирующей флуоресценции и ее сравнения с флуоресценцией, наблюдаемой при добавлении небольшого количества неионогенного детергента. Опосредованное детергентом разрушение липидного двойного слоя приводит к высвобождению инкапсулированной зкДНК, что обеспечивает возможность ее взаимодействия с непроницаемым для мембраны красителем. Инкапсуляцию зкДНК можно рассчитать по уравнению Е=(Io-I)/Io, где I и Io относятся к интенсивности флуоресценции до и после добавления детергента.

Единичная лекарственная форма

В одном варианте реализации фармацевтические композиции могут быть представлены в форме единичной лекарственной формы. Единичная лекарственная форма обычно адаптирована для одного или более конкретных способов введения фармацевтической композиции. В некоторых вариантах реализации форма единичной дозы адаптирована для введения посредством ингаляции. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения с помощью испарителя. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения с помощью небулайзера. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения с помощью распылителя. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для преорального введения, для трансбуккального введения или для сублингвального введения. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для внутривенного, внутримышечного или подкожного введения. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для интратекального или интрацеребровентрикулярного введения. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция составлена для местного введения. Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалом носителя с получением единичной лекарственной формы, обычно является таким количеством соединения, которое обеспечивает терапевтический эффект.

VII. Способы лечения

Композиции ионизируемых липидов и способы (например, липидные частицы ТНК (например, липидные наночастицы), описанные в данном документе), описанные в данном документе, можно использовать для введения последовательности нуклеиновой кислоты (например, последовательности терапевтической нуклеиновой кислоты) в клетку хозяина. В одном варианте реализации введение последовательности нуклеиновой кислоты в клетку хозяина с использованием LNP ТНК (например, липидных частиц (например, липидных наночастиц) вектора зкДНК, описанных в данном документе) можно отслеживать с помощью соответствующих биомаркеров, полученных от пациентов, прошедших лечение, для оценки экспрессии генов.

Композиции LNP, предложенные в данном документе, можно использовать для доставки трансгена (последовательности нуклеиновой кислоты) для различных целей. В одном варианте реализации векторы зкДНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) можно использовать различными способами, включая, например, ex situ, in vitro и in vivo применение, методики, диагностические процедуры и/или схемы генной терапии.

В данном документе предложены способы лечения у субъекта заболевания или расстройства, включающие введение в клетку-мишень, нуждающуюся в этом (например, в клетку печени, в мышечную клетку, в клетку почки, в нейронную клетку или в пораженную клетку другого типа), данного субъекта терапевтически эффективного количества LNP ТНК (например, липидных частиц (например, липидных наночастиц) вектора зкДНК, описанных в данном документе), необязательно с фармацевтически приемлемым носителем. Внедренная LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) содержит интересующую нуклеотидную последовательность, пригодную для лечения данного заболевания. В частности, ТНК может содержать требуемую последовательность экзогенной ДНК, функционально связанную с управляющими элементами, способными управлять транскрипцией требуемого полипептида, белка или олигонуклеотида, кодируемого последовательностью экзогенной ДНК, при введении субъекту. LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) можно вводить любым подходящим способом, описанным в данном документе и известным в данной области техники. В одном варианте реализации клетки-мишени находятся у субъекта-человека.

В данном документе предложены способы обеспечения субъекта, нуждающегося в этом, диагностически или терапевтически эффективным количеством LNP ТНК (например, липидных частиц (например, липидных наночастиц) вектора зкДНК, описанных в данном документе), включающие обеспечение в клетке, ткани или органе субъекта, нуждающегося в этом, определенного количества LNP ТНК (например, липидных частиц (например, липидных наночастиц) вектора зкДНК, описанных в данном документе); и в течение времени, эффективного для обеспечения возможности экспрессии трансгена из LNP ТНК, что обеспечивает у субъекта диагностически или терапевтически эффективное количество белка, пептида, нуклеиновой кислоты, экспрессируемой LNP ТНК (например, липидными частицами (например, липидными наночастицами) вектора зкДНК, описанными в данном документе). В одном варианте реализации субъектом является человек.

В данном документе предложены способы диагностики, предупреждения, лечения или облегчения по меньшей мере одного или более симптомов заболевания, расстройства, дисфункции, повреждения, патологического состояния или травмы у субъекта. В целом, предложенный способ включает по меньшей мере стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, LNP ТНК (например, липидных частиц (например, липидных наночастиц) вектора зкДНК, описанных в данном документе) в количестве и в течение времени, достаточных для постановки диагноза, предупреждения, лечения или облегчения одного или более симптомов заболевания, расстройства, дисфункции, повреждения, патологического состояния или травмы у субъекта. В одном варианте реализации субъектом является человек.

В данном документе предложены способы, включающие применение LNP ТНК в качестве инструмента для лечения или ослабления одного или более симптомов заболевания или болезненных состояний. Существует множество наследственных заболеваний, для которых известны дефектные гены, и обычно их делят на два класса: состояния недостаточности, обычно ферментов, которые обычно являются наследственными по рецессивному типу, и несбалансированные состояния, которые могут затрагивать регуляторные или структурные белки и которые обычно, но не всегда, являются наследственными по доминантному типу. Для заболеваний, характеризующихся состоянием недостаточности, можно использовать LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) для доставки трансгенов для переноса нормальных генов в пораженные ткани в качестве заместительной терапии, а также, в некоторых вариантах реализации, для создания животных моделей данного заболевания с использованием антисмысловых мутаций. Для заболеваний, характеризующихся несбалансированным состоянием, можно использовать LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы), описанные в данном документе) для создания модельной системы болезненного состояния, которую можно затем использовать для разработки средств борьбы с данным болезненным состоянием. Таким образом, LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) и способы, описанные в данном документе, обеспечивают возможность лечения генетических заболеваний. В данном контексте болезненное состояние лечат посредством частичного или полного восстановления недостаточности или несбалансированности, которая вызывает данное заболевание или усугубляет его.

В целом, LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) можно использовать для доставки любого трансгена в соответствии с приведенным выше описанием для лечения, предупреждения или облегчения симптомов, связанных с любым расстройством, которое связано с экспрессией генов. Примеры болезненных состояний включают, но не ограничиваются ими: кистозный фиброз (и другие заболевания легких), гемофилию А, гемофилию В, талассемию, анемию и другие нарушения со стороны крови, СПИД, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, амиотрофический боковой склероз, эпилепсию и другие неврологические расстройства, рак, сахарный диабет, мышечную дистрофию (например, Дюшенна, Беккера), болезнь Гурлера, дефицит аденозиндезаминазы, метаболические нарушения, дегенеративные заболевания сетчатки (и другие заболевания глаз), митохондриопатии (например, наследственную нейропатию зрительного нерва Лебера (LHON), синдром Лея и подострую склерозирующую энцефалопатию), миопатии (например, фациоскапулохумеральную миопатию (FSHD) и кардиомиопатию), заболевания центральных органов (например, головного мозга, печени, почек, сердца) и т.п.В некоторых вариантах реализации векторы зкДНК, описанные в данном документе, могут быть преимущественно использованы для лечения индивидуумов с метаболическими расстройствами (например, с дефицитом орнитин-транскарбамилазы).

В одном варианте реализации LNP ТНК, описанные в данном документе, могут быть использованы для лечения, облегчения и/или предупреждения заболевания или расстройства, вызванного мутацией гена или генного продукта. Примеры заболеваний или расстройств, который можно лечить с применением LNP ТНК (например, липидных частиц (например, липидных наночастиц) вектора зкДНК, описанных в данном документе), включают, но не ограничиваясь ими, метаболические заболевания или расстройства (например, болезнь Фабри, болезнь Гоше, фенилкетонурию (PKU), болезнь накопления гликогена); болезни или расстройства цикла синтеза мочевины (например, дефицит орнитин-транскарбамилазы (ОТС); заболевания или расстройства лизосомного накопления (например, метахроматическую лейкодистрофию (MLD), мукополисахаридоз типа II (MPSII; синдром Хантера)); заболевания или расстройства печени (например, прогрессирующий семейный внутрипеченочный холестаз (PFIC); заболевания или расстройства со стороны крови (например, гемофилию (А и В), талассемию и анемию); раковые заболевания и опухоли, а также генетические заболевания или расстройства (например, кистозный фиброз).

В одном варианте реализации LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) могут быть использованы для доставки гетерологичной нуклеотидной последовательности в тех случаях, когда это необходимо для регуляции уровня экспрессии трансгена (например, трансгенов, кодирующих гормоны или факторы роста, как описано в данном документе).

В одном варианте реализации LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) могут быть использованы для коррекции патологического уровня и/или функции генного продукта (например, отсутствие или дефект белка), который вызывает данное заболевание или расстройство. Предложенные LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) могут продуцировать функциональный белок и/или модифицировать уровни белка для облегчения или ослабления симптомов, обусловленных конкретным заболеванием или расстройством, или для благотворного влияния на конкретное заболевание или расстройство, вызванное отсутствием или дефектом данного белка. Например, лечение дефицита ОТС может быть достигнуто посредством продуцирования функционального фермента ОТС; лечение гемофилии А и В может быть достигнуто посредством модификации уровней фактора VIII, фактора IX и фактора X; лечение PKU может быть достигнуто посредством модификации уровней фермента фенилаланингидроксилазы; лечение болезни Фабри или Гоше может быть достигнуто посредством продуцирования функциональной альфа-галактозидазы или бета-глюкоцереброзидазы, соответственно; лечение MFD или MPSII может быть достигнуто посредством продуцирования функциональной арилсульфатазы А или идуронат-2-сульфатазы, соответственно; лечение кистозного фиброза может быть достигнуто посредством продуцирования функционального регулятора трансмембранной проводимости при кистозном фиброзе; лечение болезни накопления гликогена может быть достигнуто посредством восстановления функции функционального фермента G6P-азы; и лечение PFIC может быть достигнуто посредством продуцирования функциональных генов АТР8 В1, АВСВ11, АВСВ4 или TJP2.

В одном варианте реализации LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе), могут быть использованы для обеспечения терапевтического средства на основе РНК в клетке in vitro или in vivo. Примеры терапевтических средств на основе РНК включают, но не ограничиваясь ими, мРНК, антисмысловые РНК и олигонуклеотиды, рибозимы, аптамеры, интерферирующие РНК (РНКи), дцРНК субстрата Дайсера, малую шпилечную РНК (мшРНК), асимметричную интерферирующую РНК (аиРНК), микроРНК (микроРНК). Например, LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе), могут быть использованы для обеспечения антисмысловой нуклеиновой кислоты в клетке in vitro или in vivo. Например, если трансген представляет собой молекулу РНКи, то экспрессия антисмысловой нуклеиновой кислоты или РНКи в клетке-мишени снижает экспрессию конкретного белка данной клеткой. Соответственно, трансгены, которые представляют собой молекулы РНКи или антисмысловые нуклеиновые кислоты, можно вводить для снижения экспрессии определенного белка у субъекта, нуждающегося в этом. Антисмысловые нуклеиновые кислоты также можно вводить в клетки in vitro для регуляции клеточной физиологии, например, для оптимизации систем клеточных или тканевых культур.

В одном варианте реализации LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе), могут быть использованы для обеспечения терапевтического средства на основе ДНК в клетке in vitro или in vivo. Примеры терапевтических средств на основе ДНК включают, но не ограничиваясь ими, миникольцевую ДНК, миниген, вирусные векторы ДНК (например, геном лентивируса или AAV) или невирусные синтетические векторы ДНК, линейную дуплексную ДНК с замкнутыми концами (зкДНК/CELiD), плазмиды, бакмиды, векторы ДНК Doggybone™, минималистичный иммунологически определяемый вектор экспрессии генов (MIDGE), невирусный вектор мини-нитевой ДНК (вектор линейной ковалентно замкнутой ДНК) или минимальный вектор гантелеобразной ДНК («гантелеобразной ДНК»). Например, в одном варианте реализации векторы зкДНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) могут быть использованы для обеспечения миникольцевой ДНК в клетке in vitro или in vivo. Например, если трансген представляет собой миникольцевую ДНК, то экспрессия миникольцевой ДНК в клетке-мишени снижает экспрессию конкретного белка данной клеткой. Соответственно, трансгены, которые представляют собой миникольцевые ДНК, можно вводить для снижения экспрессии определенного белка у субъекта, нуждающегося в этом. Миникольцевые ДНК также можно вводить в клетки in vitro для регуляции клеточной физиологии, например, для оптимизации систем клеточных или тканевых культур.

В одном варианте реализации примеры трансгенов, кодируемых вектором ТНК, содержащим экспрессионную кассету, включают, но не ограничиваются ими: X, лизосомные ферменты (например, гексозаминидаза А, ассоциированная с болезнью Тея-Сакса, или идуронатсульфатаза, ассоциированная с синдромом Хантера/MPS II), эритропоэтин, ангиостатин, эндостатин, супероксиддисумтаза, глобин, лептин, каталаза, тирозингидроксилаза, а также цитокины (например, интерферон, β-интерферон, интерферон-γ, интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин 12, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, лимфотоксин и т.п.), факторы роста пептидов и гормоны (например, соматотропин, инсулин, инсулиноподобные факторы роста 1 и 2, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста нервов (NGF), нейротропный фактор-3 и 4, нейтротропный фактор головного мозга (BDNF), глиальный фактор роста (GDNF), трансформирующий фактор роста-а и -b, и т.п.), рецепторы (например, рецептор фактора некроза опухоли). В некоторых иллюстративных вариантах реализации трансген кодирует моноклональное антитело, специфическое к одной или более требуемым мишенями. В некоторых иллюстративных вариантах реализации вектор зкДНК кодирует более одного транс гена. В некоторых иллюстративных вариантах реализации трансген кодирует белок слияния, содержащий два разных полипептида, представляющих собой интерес. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует антитело, включая полноразмерное антитело или фрагмент антитела, как описано в данном документе. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой антигенсвязывающий домент или последовательность вариабельного домена иммуноглобулина, как описано в данном документе. Другие иллюстративные трансгенные последовательности кодируют продукты «суицидального» гена (типидинкиназу, цитозиндезаминазу, токсин дифтерии, цитохром Р450, дезоксицитидинкиназу и фактор некроза опухоли), белки, обусловливающие резистентность к лекарствам, используемым в терапии рака, а также продукты гена-супрессора опухоли.

Введение

В одном варианте реализации LNP ТНК (например, липидные частицы вектора зкДНК, описанные в данном документе) можно вводить в организм для трансдукции клеток in vivo. В одном варианте реализации LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) можно вводить в организм для трансдукции клеток ex vivo.

Как правило, введение осуществляют любым способом, обычно используемым для введения молекулы в непосредственный контакт с клетками крови или ткани. Подходящие способы введения таких нуклеиновых кислот являются доступными и известными для специалистов в данной области техники, и, несмотря на то, что для введения конкретной композиции можно использовать более одного способа, какой-либо конкретный способ может обеспечивать более быструю и более эффективную реакцию, чем другой способ. Примеры способов введения LNP ТНК (например, липидных частиц (например, липидных наночастиц) вектора зкДНК, описанных в данном документе) включают пероральный, ректальный, трансмукозальный, интраназальный, ингаляцию (например, в форме аэрозоля), трансбуккальный (например, сублингвальный), вагинальный, интратекальный, интраокулярный, трансдермальный, интраэндотелиальный, in utero (или in ovd), парентеральный (например, внутривенный, подкожный, внутрикожный, внутричерепной, внутримышечный [включая введение в мышцы скелета, диафрагмы и/или сердца], интраплевральный, интрацеребральный и внутрисуставный), местный (например, на поверхности кожи и слизистых оболочке, включая поверхности дыхательных путей, а также трансдермальное введение), интралимфатический и т.п., а также непосредственную инъекцию в ткань или орган (например, в печень, глаз, скелетную мышцу, сердечную мышцу, в мышцу диафрагмы или в головной мозг).

Введение вектора зкДНК (например, липидной частицы вектора зкДНК, описанной в данном документе) можно осуществлять в любую область организма субъекта, включая, без ограничения, область, выбранную из группы, состоящей из головного мозга, скелетной мышцы, гладкой мышцы, сердца, диафрагмы, эпителия дыхательных путей, печени, почек, селезенки, поджелудочной железы, кожи и глаз. В одном варианте реализации введение векторов зкДНК (например, липидных частиц (например, липидных наночастиц) вектора зкДНК, описанных в данном документе) также можно осуществлять в опухоль (например, в саму опухоль или вблизи опухоли или лимфатического узла). Наиболее подходящий способ для любого данного случая зависит от природы и тяжести патологического состояния, подлежащего лечению, облегчению и/или предотвращению, а также от природы конкретных используемых векторов зкДНК (например, липидных частиц (например, липидных наночастиц) вектора зкДНК, описанных в данном документе). Кроме того, зкДНК обеспечивает возможность введения более чем одного трансгена в одном векторе или в нескольких векторах зкДНК (например, в виде коктейля зкДНК).

В одном варианте реализации введение векторов зкДНК (например, липидных частиц (например, липидных наночастиц) вектора зкДНК, описанных в данном документе) в скелетную мышцу включает, но не ограничиваясь этим, введение в скелетную мышцу в конечность (например, в верхнюю часть руки, в нижнюю часть руки, в верхнюю часть ноги и/или в нижнюю часть ноги), в спину, шею, голову (например, язык), в грудную клетку, в живот, в чашевидную полость/промежность и/или в пальцы. Векторы зкДНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) можно доставлять в скелетную мышцу посредством внутривенного введения, внутриартериального введения, интраперитонеального введения, перфузии конечности (необязательно перфузии изолированной конечности, ноги и/или руки; см., например, Arruda et at, (2005) Blood 105: 3458-3464), и/или прямой внутримышечной инъекции. В конкретных вариантах реализации вектор зкДНК (например, липидную частицу вектора зкДНК, описанную в данном документе) вводят в конечность (руку и/или ногу) субъекта (например, субъекта с мышечной дистрофией, такой как DMD) посредством перфузии конечности, необязательно перфузии изолированной конечности (например, посредством внутривенного или внутрисуставного введения). В одном варианте реализации вектор зкДНК (например, липидную частицу вектора зкДНК, описанную в данном документе) можно вводить без использования «гидродинамических» технологий.

Введение LNP ТНК (например, липидных частиц (например, липидных наночастиц) вектора зкДНК, описанных в данном документе) в сердечную мышцу включает введение в левое предсердие, правое предсердие, левый желудочек, правый желудочек и/или в перегородку. LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) можно доставлять в сердечную мышцу посредством внутривенного введения, внутриартериального введения, такого как интрааортальное введение, прямой инъекцией в сердце (например, в левое предсердие, правое предсердие, левый желудочек, правый желудочек) и/или посредством перфузии коронарной артерии. Введение в мышцу диафрагмы можно осуществлять любым пригодным способом, включая внутривенное введение, внутриартериальное введение и/или интраперитонеальное введение. Введение в гладкую мышцу можно осуществлять любым пригодным способом, включая внутривенное введение, внутриартериальное введение и/или интраперитонеальное введение. В одном варианте реализации введение можно осуществлять в эндотелиальные клетки, присутствующие в гладкой мышце, вблизи нее и/или на ней.

В одном варианте реализации LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) вводят в скелетную мышцу, в мышцу диафрагмы и/или в сердечную мышцу (например, для лечения, облегчения и/или предупреждения мышечной дистрофии или заболевания сердца (например, PAD или застойной сердечной недостаточности).

LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) можно вводить в ЦНС (например, в головной мозг или в глаза). LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) можно вводить в спинной мозг, ствол головного мозга (продолговатый мозг, варолиев мост), средний мозг (гипоталамус, таламус, эпиталамус, гипофиз, черное вещество, эпифиз), в мозжечок, концевой мозг (полосатое тело, большой мозг, включая затылочные, височные, теменные и лобные доли, в кору головного мозга, базальные ядра, гиппокамп и мендалевидную железу), в лимбическую систему, новую кору, полосатое тело, большой мозг и нижний холмик четверохолмия. LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) можно также вводить в различные части глаза, такие как сетчатка, роговица и/или зрительный нерв. LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) можно доставлять в спинномозговую жидкость (например, посредством люмбарной пункции). LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) можно дополнительно вводить интраваскулярно в ЦНС в тех ситуациях, когда нарушен гематоэнцефалический барьер (например, при опухоли головного мозга или церебральном инфаркте).

В одном варианте реализации LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) можно вводить в требуемую область(и) ЦНС любым способом, известным в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, интратекальную, интраокулярную, интрацеребральную, интравентрикулярную, внутривенную (например, в присутствии сахара, такого как маннит), интраназальную, интраауральную, интраокулярную (например, интравитреальную, субретинальную, в переднюю камеру) и периокулярную (например, в субтеноново пространство) доставку, а также внутримышечную доставку с ретроградной доставкой в двигательные нейроны.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации, LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) вводят в виде жидкой композиции путем прямой инъекции (например, стереотактической инъекции) в требуемую область или отдел ЦНС. В соответствии с другими вариантами реализации, LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) можно доставлять посредством местного нанесения на требуемую область или посредством интраназального введения аэрозольной композиции. Введение в глаза может представлять собой местное применение жидких капель. В качестве дополнительной альтернативы, вектор зкДНК можно вводить в форме твердой композиции с медленным высвобождением (см., например, патент США№7201898, полное содержание которого включено в данный документ посредством ссылки). В одном варианте реализации LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) можно использовать для ретроградного переноса для лечения, облегчения и/или предупреждения заболеваний и расстройств, затрагивающих двигательные нейроны (например, амиотрофического бокового склероза (ALS); спинальной мышечной атрофии (SMA) и т.д.). Например, LNP ТНК (например, липидные частицы (например, липидные наночастицы) вектора зкДНК, описанные в данном документе) можно доставлять в мышечную ткань, из которой они могут мигрировать в нейроны.

В одном варианте реализации можно осуществлять многократное введение терапевтического продукта до достижения приемлемого уровня экспрессии. Так, в одном варианте реализации терапевтическую нуклеиновую кислоту можно вводить и повторно вводить множество раз. Например, терапевтическую нуклеиновую кислоту можно вводить на 0 день. После первоначального лечения на 0 день можно осуществлять введение второй дозы (повторное введение) по истечении около 1 недели, около 2 недель, около 3 недель, около 4 недель, около 5 недель, около 6 недель, около 7 недель, около 8 недель или около 3 месяцев, около 4 месяцев, около 5 месяцев, около 6 месяцев, около 7 месяцев, около 8 месяцев, около 9 месяцев, около 10 месяцев, около 11 или около 1 года, около 2 лет, около 3 лет, около 4 лет, около 5 лет, около 6 лет, около 7 лет, около 8 лет, около 9 лет, около 10 лет, около 11 лет, около 12 лет, около 13 лет, около 14 лет, около 15 лет, около 16 лет, около 17 лет, около 18 лет, около 19 лет, около 20 лет, около 21 лет, около 22 лет, около 23 лет, около 24 лет, около 25 лет, около 26 лет, около 27 лет, около 28 лет, около 29 лет, около 30 лет, около 31 года, около 32 лет, около 33 лет, около 34 лет, около 35 лет, около 36 лет, около 37 лет, около 38 лет, около 39 лет, около 40 лет, около 41 года, около 42 лет, около 43 лет, около 44 лет, около 45 лет, около 46 лет, около 47 лет, около 48 лет, около 49 лет или около 50 лет после первоначального лечения терапевтической нуклеиновой кислотой.

В одном варианте реализации можно включать также одно или более дополнительных соединений. Такие соединения можно вводить отдельно, или дополнительные соединения могут быть включены в липидные частицы (например, липидные наночастицы) по данному изобретению. Другими словами, липидные частицы (например, липидные наночастицы) могут содержать другие соединения, помимо ТНК, или по меньшей мере вторую ТНК, отличную от первой. Без ограничений, другие дополнительные соединения могут быть выбраны из группы, состоящей из низкомолекулярных или крупных органических или неорганических молекул, моносахаридов, дисахаридов, трисахаридов, олигосахаридов, полисахаридов, пептидов, белков, аналогов пептидов и их производных, пептидомиметиков, нуклеиновых кислот, аналогов и производных нуклеиновых кислот, экстракта, полученного из биологических материалов, или любых их комбинаций.

В одном варианте реализации одно или более дополнительных соединений могут представлять собой терапевтический агент. Терапевтический агент может быть выбран из любого класса, пригодного для терапевтических целей. Соответственно, терапевтический агент может быть выбран из любого класса, пригодного для терапевтических целей. Терапевтический агент может быть выбран в соответствии с целью лечения и требуемым биологическим действием. Например, в одном варианте реализации, если ТНК в LNP является пригодной для лечения рака, то дополнительное соединение может представлять собой противораковый агент (например, химиотерапевтический агент, агент прицельной противораковой терапии (включая, но не ограничиваясь ими, низкомолекулярные соединения, антитела или конъюгаты антитела и лекарственного агента). В одном варианте реализации, если LNP, содержащая ТНК, пригодна для лечения инфекции, то дополнительное соединение может представлять собой противомикробный агент (например, антибиотик или противовирусное соединение). В одном варианте реализации, если LNP, содержащая ТНК, пригодна для лечения иммунного заболевания или расстройства, то дополнительное соединение может представлять собой соединение, которое модулирует иммунный ответ (например, иммунодепрессант, иммуностимулирующее соединение или соединение, модулирующее один или более специфических иммунных путей). В одном варианте реализации в композициях и способах по данному изобретению можно использовать различные коктейли различных липидных частиц, содержащих различные соединения, такие как ТНК, кодирующая различные белки, или различные соединения, такие как терапевтические агенты. В одном варианте реализации дополнительное соединение представляет собой иммуномодулирующий агент. Например, дополнительное соединение представляет собой иммунодепрессант. В некоторых вариантах реализации дополнительное соединение представляет собой иммуностимулятор.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры представлены в качестве иллюстрации, но не ограничения. Специалистам в данной области техники понятно, что ионизируемые липиды могут быть разработаны и синтезированы с применением общих способов синтеза, описанных ниже. Несмотря на то, что предложенные способы описаны на примере ионизируемых липидов, их можно применять для синтеза расщепляемых пептидов, предусмотренных формулой (I).

Пример 1

Общий синтез (например, R⁴=-С)

Синтез ионизируемых липидов, описанных в данном документе, можно начинать с липидной кислоты (а). Связывание с N,O-диметилгидроксиламиномприводитк получению амида Вайнреба (b). Присоединение Гриньяр а приводит к образованию кетона (с). Опосредованное титаном восстановительное аминирование приводит к получению продуктов типа (d), которые приводят во взаимодействие с дисульфидом общей структуры (е), где оба концевых спирта имеют уходящие группы, т.е. метансульфонильные группы, с образованием конечных продуктов общей структуры (f).

Синтез липида 1 (схема)

Отдельные стадии синтеза с быстрыми приемами

К раствору олеиновой кислоты (I) в дихлорметане (ДХМ), охлажденному до 0°С, добавляли CDI. Нагревали реакционную смесь до комнатной температуры в течение 30 минут, затем охлаждали до 0°С и обрабатывали сначала триэтиламином, а затем гидрохлоридом диметилгидроксиламина. Через 1 час реакционную смесь разделяли между водой и гептаном. Органический слой сушили над сульфатом магния, фильтровали и выпаривали в вакууме с получением неочищенного амида Вайнреба (II), который напрямую использовали для следующей реакции.

Охлаждали 1 М раствор диэтилцинкав дихлорметане до -1°С и обрабатывали ТФК, добавляя ее по каплям. Через 30 минут добавляли дииодметан и оставляли созревать в течение 30 минут на ледяной бане. К полученному раствору добавляли амид Вайнреба (II). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Реакцию гасили раствором хлорида аммония и отделяли органический слой, промывали 10% раствором тиосульфата натрия, сушили над сульфатом магния, фильтровали и выпаривали в вакууме. Очищали флэш-хроматографией с получением соединения (III).

Соединение (III) растворяли в сухом ТГФ, затем добавляли 1 М нонилмагнийбромид в атмосфере азота при комнатной температуре. Через 10 минут реакционную смесь медленно гасили избытком насыщенного водного раствора NH4CI. Реакционную смесь промывали гексаном и водой в делительной воронке, встряхивали, отбрасывали нижний водный слой, верхний слой сушили сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали с получением неочищенного кетона К полученному выше неочищенному кетону (IV) добавляли диметиламин (2 M в ТГФ), затем Ti(О-i-Pr)₄ и оставляли перемешиваться в течение ночи. На следующий день добавляли этанол, затем NaBP₄. Через 5 минут перемешивания всю реакционную смесь напрямую вводили в колонку с диоксидом кремния для очистки, с получением соединения (IV).

Дисульфид (е) и 4 молярных эквивалента амина (V) растворяли в ацетонитриле и нагревали в течение около 48 часов в присутствии Cs₂CO₃. Неочищенную реакционную смесь загружали на диоксид кремния для флэш-хроматографии с получением конечного требуемого соединения (1).

Синтез липида 3

Экспериментальная часть:

Синтез N-метокси-N-метилолеамнда (2). К раствору олеиновой кислоты (1 г, 3,5 ммоль)в дихлорметане (500 мл) добавляли CDI (0,63 г, 3,9 ммоль). Перемешивали реакционную смесь в течение 10 минут при комнатной температуре, затем добавляли триэтиламин (0,39 г, 3,9 ммоль) и 1а (0,38 г, 3,9 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 1 часа разделяли реакционную смесь между водой и гексаном. Органический слой сушили над MgSO₄ и выпаривали. Неочищенный продукт напрямую использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Синтез N-метокси-N-метил-8-(2-октилциклопропил)октанамида (3). Охлаждали раствор диэтилцинка (7,03 мл 1 М раствора, 7,03 ммоль) до 0°С и обрабатывали ТФК (0,8 г, 7,03 ммоль). Через 30 минут добавляли дииодметан (1,88 г, 7,03 ммоль) и оставляли смесь для созревания на 30 минут на ледяной бане. К полученному раствору добавляли соединение 2 (0,76 г, 2,34 ммоль). Нагревали реакционную смесь до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Гасили реакцию раствором хлорида аммония (10 мл) и отделяли органический слой, промывали 10% раствором тиосульфата натрия, сушили над MgSO₄ и выпаривали. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией, используя 0-20% этилацетатав гексане в качестве элюента, с получением 3 (0,7 г, 88%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 3,67 (с, 3 Н), 3,17 (с, 3 Н), 2,40 (т, 2 Н), 1,57 (м, 3 Н), 1,32-1,35 (м, 22 Н), 1,26 (м, 2 Н), 0,89 (м, 3 Н), 0,50-0,70 (м, 3 Н), -0,35 (м, 1 Н).

Синтез 1-(2-октилцнклопропил)гептадекан-8-она (4). В 25 мл безводного эфира растворяли соединение 3 (2,03 г, 5,8 ммоль). К полученному раствору по каплям добавляли 1 М раствор нонилмагнийбромида(12 мл, 12 ммоль) при 0°С. Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, гасили насыщенным раствором хлорида аммония и экстрагировали гексаном. Сушили органический слой над MgSO₄, затем очищали колоночной хроматографией, используя 0-20% этилацетата в гексане в качестве элюента, с получением 4 (2,1 г, 87%) в виде белого твердого вещества.

¹Н-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 2,35-2,40 (т, 4 Н), 1,55 (с, 6 Н), 1,26-1,36 (м, 32 Н), 1,00-1,20 (м, 2 Н), 0,89 (м, 6 Н), 0,50-0,70 (м, 3 Н), -0,35 (м, 1 Н).

Синтез 1-(2-октнлциклопропил)гептадекан-8-амина (5). К 33% раствору метиламина в этаноле (3 мл) добавляли раствор соединения 4 (800 мг, 2 ммоль) в 5 мл этанола. Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 8 часов. К полученному выше раствору добавляли NaBH₄ (200 мг, 5 ммоль) при 0°С. Перемешивали полученную смесь при комнатной температуре в течение ночи, затем гасили водой. Из реакционной смеси выпаривали растворитель, и очищали остаток колоночной хроматографией, используя метиламин в этилацетаге в качестве элюента, с получением 5 (560 мг, 68%) в виде светло-желтого маслянистого вещества ¹Н-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 2,37 (с, 3 Н), 1,10-1,40 (м, 44 Н), 1,00-1,20 (м, 2 Н), 0,89 (м, 6 Н), 0,50-0,70 (м, 3 Н), -0,35 (м, 1 Н).

Синтез N,N'-(дисульфандиилбис(этан-2,1-диил))бис(1-(2-октилциклопропил)гептадекан-8-амина) (липид 3). К 5 мл ACN добавляли соединение 5 (110 мг, 0,26 ммоль), соединение 6 (20 мг, 0,06 ммоль) и CsCO₃ (124 мг, 0,38 ммоль). Перемешивали полученную смесь при 150°С в закрытой пробирке в течение 12 часов. Охлаждали неочищенную реакционную смесь до комнатной температуры, фильтровали для удаления твердого веществ а и очищали колоночной хроматографией, используя 3-5% метанола в дихлорметане в качестве злюента, с получением липнда 3 (30 мг, 48%) в виде светло-желтого маслянистого вещества. ¹Н-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 2,6-2,9 (м, 8 Н), 2,3-2,4 (м, 2 Н), 2,20 (с, 6 Н), 1,10-1,50 (м, 88 Н), 0,85-0,89 (т, 12 Н), 0,65 (м, 4 Н), 0,5-0,6 (м, 2Н), -0,35 (к, 2Н).

Синтез липида 30

Экспериментальная часть:

Синтез этил-(E)-3-(7-(2-октнлциклопропил)гептил)додец-2-еноата (9). К суспензии NaH (1,6 г, 40,3 ммоль) в 60 мл безводного ТГФ по каплям добавляли соединение 8 (9,2 мл, 46 ммоль) при 0°С.Перемешивали полученную смесь при 0°С в течение 30 минут с получением прозрачного раствора К полученному раствору добавляли соединение 4 (2,25 г, 5,75 ммоль), затем перемешивали при кипении с обратным холодильником в течение 2 дней. Охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры, гасили водой и экстрагировали эфиром. Объединенный органический слой очищали колоночной хроматографией, используя 1% этилацетат в гексане, с получением 9 (2.3 г, 88%) в виде бесцветного маслянистого вещества. ¹H-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 5,6 (с, 1 Н), 4,15 (к, 2 Н), 2,58 (т, 3 Н), 2,12 (м, 3 Н), 1,26-1,50 (м, 40 Н), 0,89 (м, 6 Н), 0,50-0,70 (м, 3 Н), -0,35 (м, 1 Н).

Синтез этил-3-(7-(2-октилциклопропил)гептил)додеканоата (10). К раствору соединения 9 (2,0 г, 4 ммоль) в ТГФ добавляли Ni Ренея (2,0 г). Полученную смесь гидрировали при атмосферном давлении в течение ночи. Удаляли катализатор посредством фильтрования и выпаривали фильтрат с получением 10 (2,1 г, 100%) в виде бесцветного маслянистого вещества. ¹H-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 4,13 (к, 2 Н), 2,20 (м, 3 Н), 1,26-1,50 (м, 44 Н), 0,89 (м, 6 Н), 0,50-0,70 (м, 3 Н), -0,35 (м, 1 Н).

Синтез 3-(7-(2-октилциклопропил)гептил)додекановой кислоты (11). К

раствору соединения 10 (1,9 г, 4 ммоль) в 20 мл ТГФ добавляли 20 мл 1 н. NaOH. Перемешивали полученную смесь при кипении с обратным холодильником в течение 3 дней, затем охлаждали до комнатной температуры и нейтрализовали 1 н. раствором HCl. Реакционную смесь экстрагировали дихлорметаном. Объединенный органический слой выпаривали и очищали колоночной хроматографией, используя 0-20% этилацетата в гексане в качестве элюента, с получением 11 (1,0 г, 83%). ¹H-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 2,28 (м, 3 Н), 1,26-1,50 (м, 44 Н), 0,89 (м, 6 Н), 0,50-0,70 (м, 3 Н), -0,35 (м, 1Н).

Синтез N-метил-3-(7-(2-октилциклопропил)гептил)додеканамида (12). К

раствору 30 мл дихлорметана добавляли соединение 11 (1,5 г, 3,3 ммоль), 2 М раствор метиламина в ТГФ (3,5 мл, 7 ммоль), HATU (1,33 г, 3,4 ммоль) и DIPEA (0,85 г, 6,6 ммоль). Перемешивали полученную смесь при комнатной температуре в течение ночи, промывали 1 н. раствором HCl, насыщенным раствором NaHCO₃ и водой. Очищали органический слой колоночной хроматографией, используя 5-25% этилацетата в гексане в качестве элюента, с получением 12 (1,45 г, 94%). ¹H-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 5,2 (ш, 1 Н), 2,80 (с, 3 Н), 2,28 (м, 3 Н), 1,26-1,50 (м, 44 Н), 0,89 (м, 6 Н), 0,50-0,70 (м, 3 Н), -0,35 (м, 1 Н).

Синтез N-метил-3-(7-(2-октилциклопропил)гептил)додекан-1-амина (13). К раствору соединения 12 (750 мг, 1,6 ммоль) в 15 мл безводного ТГФ добавляли 2 М LiAlH₄ (1,5 мл, 3 ммоль). Перемешивали полученную смесь при кипении с обратным холодильником в течение 2 часов, гасили с помощью Na₂SO₄⋅10H₂O, и фильтровали. Выпаривали фильтрат с получением 13 (577 мг, 70%) в виде бесцветного маслянистого вещества. ¹Н-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 2,54 (м, 3 Н), 1,0-1,6 (м, 44 Н), 0,87 (м, 6 Н), 0,50-0,70 (м, 3 Н), -0,35 (м, 1 Н).

Синтез N,N'-(дисульфандиилбис(этан-2,1-диил))бис(N-метил-3-(7-(2-октилциклопропил)гептил)додекан-1-амина)(липид 30). Смесь соединения 13 (300 мг, 0,66 ммоль) и соединения 6 (80 мг, 1,2 ммоль) в 3 мл бензола перемешивали при 110°С в течение 8 часов в микроволновом реакторе. Охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи на воздухе, затем выпаривали досуха. Очищали остаток колоночной хроматографией, используя 5% метанола в дихлорметане в качестве элюента, с получением липида 30 (110 мг, 32%). ¹Н-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 2,80-2,90 (м, 4 Н), 2,6-2,7 (м, 4 Н), 2,3-2,4 (м, 4 Н), 2,26 (с, 6 Н), 1,0-1,5 (м, 96 Н), 0,86-0,90 (м, 12 Н), 0,50-0,70 (м, 6 Н), -0,35 (м, 2 Н).

Синтез липида 31

N-Метилолеамид (1)

К перемешанному раствору олеиновой кислоты (5,0 г, 17,7 ммоль) в CH₂Cl₂ (150 мл) добавляли DMAP (2,16 г, 17,7 ммоль), затем EDCI (4,75 г, 24,7 ммоль). Затем добавляли метиламин (13,28 мл, 26,5 ммоль) и перемешивали полученную смесь при комнатной температуре в течение ночи. Затем разбавляли реакционную смесь, используя 300 мл CH₂Cl₂, и промывали органический слой водой и насыщенным солевым раствором. Органический слой сушили над безводным Na₂SO₄, выпаривали досуха и очищали хроматографией на системе ISCO, используя 5-50% EtOAc в гексане в качестве элюента Фракции, содержащие требуемое соединение, объединяли и выпаривали с получением 1 (4,2 г, 80,3%).

(Z)-N-метилоктадец-9-ен-1-амин (2)

Соединение 1 (4,2 г, 14,21 ммоль) растворяли в ТГФ (100 мл) и охлаждали до 0°С. Затем по частям добавляли LiAlH₄ (1,62 г, 42,64 ммоль). После добавления оставляли реакционную смесь взаимодействовать при комнатной температуре и нагревали при 50°С в течение ночи. Затем охлаждали реакционную смесь до 0°С и по каплям добавляли воду до полного погашения LiAlH₄. Фильтровали реакционную смесь через целит и выпаривали с получением требуемого продукта, соединения 2 (3,92 г, 98%).

Дисульфандиилбис(этан-2,1-диил)диметансульфонат (2').

Доступный в продаже 2,2'-дисульфандиилбис(этан-1-ол) 1' (15 г, 97,2 ммоль) растворяли в ацетонитриле (143 мл), затем добавляли NEt₃ (33,3 г, 328 ммоль). К реакционной смеси по каплям добавляли MsCl (34,5 г, 300 ммоль) при 0°С. Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. К реакционной смеси добавляли EtOH (39 мл), чтобы погасить реакцию, и удаляли нерастворимые вещества посредством фильтрации. Разделяли фильтрат между дихлорметаном (150 мл) и 10% водным раствором бикарбоната натрия (150 мл). Органический слой четыре раза промывали, используя по 100 мл воды, сушили над MgSO₄ и выпаривали с получением 2' в виде коричневого маслянистого вещества (25 г, 81%), которое затвердевало при стоянии.

(9Z,9'Z)-N,N'-(дисульфандиилбис(этан-2,1-диил))бис(N-метилоктадец-9-ен-1-амин) (липид 31)

Соединение 2 (0,2 г, 0,64 ммоль) растворяли в CH₃CN (3 мл) и добавляли Cs₂CO₃ (0,32 г, 1,28 ммоль). Затем в реакционную смесь по каплям добавляли раствор соединения 2' (0,725 г, 2,56 ммоль) в CH₃CN и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Затем выпаривали растворитель и очищали соединение хроматографией на системе ISCO (0-10% МеОН (3% NH) в CH₂Cl₂) с получением продукта, липида 31 (0,13 г, 31%). ¹Н ЯМР (300 МГц, d-хлороформ) δ 5,34 (т, J=4,8 Гц, 4Н), 2,80 (дд, J=9,0, 5,4 Гц, 4Н), 2,67 (дд, J=9,1, 5,5 Гц, 4Н), 2,44-2,30 (м, 4Н), 2,24 (с, 4Н), 2,06-1,93 (м, 8Н), 1,44 (д, J=6,1 Гц, 4Н), 1,27 (д, J=4,9 Гц, 46Н), 0,87 (т, J=6,5 Гц, 6Н). МС, обнаружено 681,6 [М+Н]⁺, расч. 680,61 для [C₄₂H₈₄N₂S₂].

Схема синтеза лнпида 35

(Z)-N-метилнонадец-10-ен-1-амин (2a-1)

Олеилметансульфонат (5,0 г, 14,4 ммоль) взвешивали в закрытой пробирке и добавляли 50 мл метиламина (2 M в ТГФ). Перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем выпаривали растворитель и напрямую использовали наследующей стадии.

(Z)-2-(метил(нонадец-10-ен-1-ил)амино)этан-1-тиол (2а-2)

Соединение 2а-2 растворяли в толуоле в закрытой пробирке и продували N₂ в течение 5 минут. Затем добавляли этиленсульфид (1,28 мл, 21,6 ммоль) и нагревали реакционную смесь при 50°С в течение 24 часов. Затем концентрировали реакционную смесь в вакууме и сразу использовали наследующей стадии.

(Z)-N-метил-N-(2-(фенилдисульфанил)этил)нонадец-10-ен-1-амин (2а-3)

Соединение 2а-2 растворяли в 50 мл CHCl₃ и добавляли 2,2'-дипиридилдисульфид (4,0 г, 18,2 ммоль), и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем концентрировали реакционную смесь в вакууме и очищали хроматографией на системе ISCO (гексан:EtOAc 0-15%).

N-метокси-N-метилолеамид (1а-1)

К раствору олеиновой кислоты (5,0 г, 17,7 ммоль) в дихлорметане (50 мл) добавляли DIPEA (9,2 мл, 53,1 ммоль) и HATU (10,1 г, 26,5 ммоль) и перемешивали реакционную смесь в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем добавляли гидрохлорид N,O-диметилгидроксиламина(4,89 г, 53,1 ммоль) и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Затем разбавляли реакционную смесь EtOAc и промывали водой, насыщенным солевым раствором, и сушили над безводным Na₂SO₄. Выпаривали растворитель под вакуумом и очищали остаток хроматографией на системе ISCO (гексан:EtOAc 0-30%). Фракции, содержащие требуемое соединение, выпаривали с получением 1а-1 (4,2 г, 73%).

N-метокси-N-метил-8-(2-октилциклопропил)октанамид (1а-2)

Раствор диэтилцинка (54 ммоль, 54 мл 1 М раствора), растворенный в дихлорметане (100 мл), охлаждали до 0°С. Затем обрабатывали указанный раствор, по каплям добавляя ТФК (4,12 мл, 54 ммоль). Через 30 минут добавляли дииодметан (4,34 мл, 54 ммоль) и оставляли смесь созревать на 30 минут на ледяной бане. К полученному раствору добавляли амид Вайнреба (1а-1) (5,8 г, 17,8 ммоль). Нагревали реакционную смесь до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Гасили реакцию раствором хлорида аммония и отделяли органический слой, промывали 105 раствором тиосульфата натрия, сушили над безводным Na₂SO₄. Затем выпаривали растворитель под вакуумом и очищали остаток хроматографией на системе ISCO (гексан:EtOAc 0-20%). Фракции, содержащие требуемое соединение, выпаривали с получением соединения 1а-2 (5,8 г, 78%).

1-(2-Октилциклопропил)гептадекан-8-он (1а-3)

Соединение 1а-2 (1,0 г, 2,95 ммоль) растворяли в ТГФ (6 мл) и затем по каплям добавляли нонилмагнийбромид (5,9 мл, 5,9 ммоль, 1 M в Et₂O) при комнатной температуре в атмосфере азота. После перемешивания в течение 1 часа гасили реакцию, добавляя раствор NH₄Cl. Продукт экстрагировали гексаном и промывали органический слой водой, и сушили органический слой над безводным Na₂SO₄. Затем выпаривали растворитель под вакуумом и очищали остаток хроматографией на системе ISCO (гексан:EtOAc 0-5%). Фракции, содержащие требуемое соединение, выпаривали с получением 1а-3 (0,85 г, 72%).

N-метил-1-(2-октилциклопропил)гептадекан-8-амин (1а-4)

Соединение 1а-3 (0,85 г, 2,1 ммоль) растворяли в 10 мл ТГФ в закрытой пробирке и охлаждали до 0°С, и добавляли метиламин (2,6 мл, 5,22 ммоль). Закрытую реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем охлаждали реакционную смесь до 0°С и добавляли NaBH₄ (0,214 г, 5,67 ммоль), и перемешивали в течение ночи. Затем гасили реакцию водой и экстрагировали продукт EtOAc, и сушили органический слой над безводным Na₂SO₄. Затем выпаривали растворитель под вакуумом и очищали остаток хроматографией на системе ISCO (CH₂Cl₂:МеОН 0-10%).

2-(Метил(1-(2-октилциклопропил)гептадекан-8-ил)амино)этан-1-тиол (1a-5)

Соединение 1a-4 (0,4 г, 0,94 ммоль) растворяли в толуоле (5 мл) в закрытой пробирке и продували N₂ в течение 5 минут.Затем добавляли этиленсульфид (0,09 мл, 1,41 ммоль) и нагревали смесь при 50°С в течение 24 часов. Затем концентрировали реакционную смесь в вакууме и использовали на следующей стадии без очистки.

(Z)-N-метил-N-(2-((2-(метил(1-(2-октилциклопропил)гептадекан-8-ил)амино)этил)дисульфанил)этил)октадец-9-ен-1-амин (липид 35)

Соединения 1а-5 и 2а-4 растворяли в 10 мл CHCl₃ и перемешивали при комнатной температуре. После завершения выпаривали растворитель под вакуумом и очищали хроматографией на системе ISCO (CH₂Cl₂:10% МеОН 0-50%). ¹Н ЯМР (300 МГц, d-хлороформ) δ 5,35 (т, J=4,9 Гц, 2Н), 2,85-2,75 (м, 4Н), 2,74-2,59 (м, 4Н), 2,41-2,29 (м, 4Н), 2,23 (д, J=13,3 Гц, 6Н), 2,01 (д, J=5,5 Гц, 4Н), 1,31 (д, J=25,3 Гц, 69Н), 0,97-0,81 (м, 9Н), 0,64 (с, 2Н), 0,57 (дд, J=7,1, 3,9 Гц, 1H), -0,28 - -0,42 (м, 1H). МС, обнаружено 821,7 [М+Н]⁺, расч. 820,76 для [C₅₂H₁₀₄N₂S₂].

Схема синтеза липида 36

Синтез этил-(2Е,11Z)-3-нониликоза-2,11-диеноата (1b-1)

К суспензии NaH (1,6 г, 40,3 ммоль) в 60 мл безводного ТГФ по каплям добавляли этил-2-(диэтоксифосфорил)ацетат (9,2 мл, 46 ммоль) при 0°С. Перемешивали полученную смесь при 0°С в течение 30 минут с получением прозрачного раствора. К полученному раствору добавляли соединение 1а-3 (2,25 г, 5,75 ммоль), затем перемешивали при кипении с обратным холодильником в течение 2 дней. Охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры, гасили водой и экстрагировали эфиром. Объединенный органический слой очищали колоночной хроматографией, используя 1% этилацетатав гексане, с получением 1b-1 (2,4 г, 91%)в виде бесцветного маслянистого вещества. ¹Н-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 5,6 (с, 1 Н), 5,30-5,40 (м, 2Н), 4,15 (к, 2 Н), 2,58 (т, 3 Н), 2,12 (м, 3 Н), 1,26-1,50 (м, 40 Н), 0,89 (м, 6 Н).

Этил-3-(7-(2-октилциклопропил)гептил)додеканоат (1b-2)

К раствору соединения 1b-1 (2,0 г, 4 ммоль) в ТГФ добавляли Ni Ренея (2,0 г). Полученную смесь гидрировали при атмосферном давлении в течение ночи. Катализатор удаляли посредством фильтрации и выпаривали фильтрат с получением 1b-2 (2,1 г, 100%) в виде бесцветного маслянистого вещества. ¹H-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 4,13 (к, 2 Н), 2,20 (м, 3 Н), 1,26-1,50 (м, 44 Н), 0,89 (м, 6 Н), 0,50-0,70 (м, 3 Н), -0,35 (м, 1 Н).

3-(7-(2-октилциклопропил)гептил)додекановая кислота (1b-3)

К раствору соединения 1b-2 (1,9 г, 4 ммоль) в 20 мл ТГФ добавляли 20 мл 1 н. раствора NaOH. Перемешивали полученную смесь при кипении с обратным холодильником в течение 3 дней, затем охлаждали до комнатной температуры и нейтрализовали 1 н. раствором HCl. Экстрагировали реакционную смесь дихлорметаном. Объединенный органический слой выпаривали и очищали колоночной хроматографией, используя 0-20% этилацетатав гексане в качестве элюента, с получением 1b-3 (1,0 г, 83%). ¹-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 2,28 (м, 3 Н), 1,26-1,50 (м, 44 Н), 0,89 (м, 6 Н), 0,50-0,70 (м, 3 Н), -0,35 (м, 1 Н).

N-метил-3-(7-(2-октилциклопропил)гептил)додеканамид (1b-4).

К раствору 30 мл дихлорметана добавляли 1b-3 (1,5 г, 3,3 ммоль), 2 М раствор метиламина в ТГФ (3,5 мл, 7 ммоль), HATU (1,33 г, 3,4 ммоль) и DIPEA (0,85 г, 6,6 ммоль). Перемешивали полученную смесь при комнатной температуре в течение ночи, промывали 1 н. раствором HCl, насыщенным раствором NaHCO₃ и водой. Органический слой очищали колоночной хроматографией, используя 5-25% этилацетата в гексане в качестве элюента, с получением 1b-4 (1,45 г, 94%). ¹H-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 5,2 (ш, 1 Н), 2,80 (с, 3 Н), 2,28 (м, 3 Н), 1,26-1,50 (м, 44 Н), 0,89 (м, 6 Н), 0,50-0,70 (м, 3 Н), -0,35 (м, 1 Н).

N-метил-3-(7-(2-октилциклопропил)гептил)додекан-1-амин (1B-5)

К раствору соединения 1B-4 (750 мг, 1,6 ммоль) в 15 мл безводного ТГФ добавляли 2 М раствор LiAlH₄ (1,5 мл, 3 ммоль). Перемешивали полученную смесь при кипении с обратным холодильником в течение 2 часов, гасили с помощью Na₂SO₄⋅10H₂O и фильтровали. Выпаривали фильтрат с получением 1b-5 (577 мг, 70%) в виде бесцветного маслянистого вещества. ¹H-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 2,54 (м, 3 Н), 1,0-1,6 (м, 44 Н), 0,87 (м, 6 Н), 0,50-0,70 (м, 3 Н), -0,35 (м, 1 Н).

2-(метил(3-(7-(2-октилциклопропил)гептил)додецил)амино)этан-1-тиол (1а-6)

Соединение 1а-5 (0,5 г, 1,14 ммоль) растворяли в толуоле (5 мл) в закрытой пробирке и продували N₂ в течение 5 минут. Затем добавляли этиленсульфид (0,08 мл, 1,26 ммоль) и нагревали смесь при 50°С в течение 24 часов. Затем концентрировали реакционную смесь в вакууме и использовали на следующей стадии без очистки.

(Z)-N-метил-N-(2-((2-(метил(3-(7-(2-октилциклопропил)гептил)додецил)амино)этил)дисульфанил)этил)октадец-9-ен-1-амин (липид 36)

Соединения 1b-6 (0,3 г, 0,39 ммоль) и 2а-4 (0,2 г, 0,43 ммоль) растворяли в 10 мл CHCl₃ и перемешивали при комнатной температуре. После завершения выпаривали растворитель в вакууме и очищали хроматографией на системе ISCO (CH₂Cl₂:10% МеОН 0-50%). ¹Н ЯМР (300 МГц, d-хлороформ) δ 5,34 (т, J=4,9 Гц, 2Н), 2,81 (т, J=5,1 Гц, 4Н), 2,67 (дд, J=9,0, 5,5 Гц, 4Н), 2,41-2,31 (м, 4Н), 2,24 (с, 6Н), 2,06-1,94 (м, 4Н), 1,25 (с, 71Н), 0,87 (т, J=6,6 Гц, 9Н), 0,64 (д, J=5,2 Гц, 2Н), 0,59-0,50 (м, 1H), -0,34 (к, J=5,0 Гц, 1H). МС, обнаружено 849,7 [М+Н]⁺, расч. 848,80 для [C₅₄H₁₀₈N₂S₂].

Схема синтеза липида 37

(2)-гептакоз-18-ен-10-он (1с-1)

В 15 мл безводного эфира растворяли соединение 1а-1 (1,53 г, 4,7 ммоль). К полученному раствору по каплям добавляли 1 М раствор нонилмагнийбромида(9,4 мл, 12 ммоль) при 0°С. Перемешивали полученную смесь при комнатной температуре в течение 2 часов, гасили насыщенным раствором хлорида аммония и экстрагировали гексаном. Органический слой сушили над MgSO₄, затем очищали колоночной хроматографией, используя 0-20% этилацетатав гексане в качестве элюента, с получением 1 с-1 (1,14 г, 62%) в виде белого твердого вещества ¹H-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 5,32-5,36 (м, 2 Н), 2,35-2,40 (т, 4 Н), 1,99-2,12 (м, 4 Н), 1,53-1,54 (м, 4 Н), 1,10-1,40 (м, 32 Н), 0,83-0,89 (т, 6 Н).

(Z)-N- метилгептакоз-18-ен-10-амин(1 с-2)

Соединение 1 с-1 (2,5 г, 6,4 ммоль) растворяли в 10 мл EtOH в закрытой пробирке и добавляли 10 мл 30% раствора метиламина в EtOH (2,6 мл, 5,22 ммоль) при комнатной температуре. Закрытую реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 часов. Затем охлаждали реакционную смесь до 0°С и добавляли NaBH₄ (0,73 г, 19,2 ммоль), и перемешивали в течение ночи. Затем гасили реакцию водой и экстрагировали продукт EtOAc, и сушили органический слой над безводным Na₂SO₄. Затем выпаривали растворитель под вакуумом и очищали остаток хроматографией на системе ISCO (CH₂Cl₂:МеОН 0-10%).

(Z)-2-(гептакоз-18-ен-10-ил(метил)амино)этан-1-тиол (1с-3)

Соединение 1 с-2 (0,5 г, 1,22 ммоль) растворяли в толуоле (5 мл) в закрытой пробирке и продували N₂ в течение 5 минут. Затем добавляли этиленсульфид (0,11 мл, 1,83 ммоль) и нагревали смесь при 50°С в течение 24 часов. Затем концентрировали реакционную смесь в вакууме и использовали на следующей стадии без очистки.

(Z)-N-метил-N-(2-((2-(метил((Z)-октадец-9-ен-1-ил)амино)этил)дисульфанил)этил)гептакоз-18-ен-10-амин (липид 37)

Соединения 1b-4 (0,4 г, 0,85 ммоль) и 2а-4 (0,43 г, 0,93 ммоль) растворяли в 10 мл CHCl₃ и перемешивали при комнатной температуре. После завершения выпаривали растворитель в вакууме и очищали хроматографией на системе ISCO (CH₂Cl₂:10% МеОН 0-50%). ¹Н ЯМР (301 МГц, d-хлороформ) δ 5,34 (т, J=4,9 Гц, 4Н), 2,84-2,74 (м, 4Н), 2,74-2,59 (м, 4Н), 2,43-2,31 (м, 3Н), 2,23 (д, J=13,7 Гц, 6Н), 2,09-1,91 (м, 8Н), 1,26 (с, 64Н), 0,88 (т, J=6,5 Гц, 9Н). МС, обнаружено 807,7 [М+Н]⁺, расч. 806,75 для [C₅₁H₁₀₂N₂S₂].

Схема синтеза липида 38

Этил-(E)-3-(7-(2-октилциклопропил)гептил)додец-2-еноат (1d-1)

К суспензии NaH (1,6 г, 40,3 ммоль) в 60 мл безводного ТГФ по каплям добавляли соединение 8 (9,2 мл, 46 ммоль) при 0°С. Перемешивали полученную смесь при 0°С в течение 30 минут с получением прозрачного раствора. К полученному раствору добавляли соединение 4 (2,25 г, 5,75 ммоль), затем перемешивали при кипении с обратным холодильником в течение 2 дней. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, гасили водой и экстрагировали эфиром. Объединенный органический слой очищали колоночной хроматографией, используя 1% этилацетат в гексане, с получением 1d-1 (2,3 г, 88%) в виде бесцветного маслянистого вещества. ¹Н-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 5,6 (с, 1 Н), 4,15 (к, 2 Н), 2,58 (т, 3 Н), 2,12 (м, 3 Н), 1,26-1,50 (м, 40 Н), 0,89 (м, 6 Н), 0,50-0,70 (м, 3 Н), -0,35 (м, 1 Н).

Этил-3-(7-(2-октилциклопропил)гептил)додеканоат (1d-2)

К раствору соединения 1d-1 (2,0 г, 4 ммоль) в ТГФ добавляли Ni Ренея (2,0 г). Полученную смесь гидрировали при атмосферном давлении в течение ночи. Удаляли катализатор посредством фильтрации и выпаривали фильтрат с получением 1d-2 (2,1 г, 100%) в виде бесцветного маслянистого вещества. ¹Н-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 4,13 (к, 2 Н), 2,20 (м, 3 Н), 1,26-1,50 (м, 44 Н), 0,89 (м, 6 Н), 0,50-0,70 (м, 3 Н), -0,35 (м, 1Н).

(Z)-3-нониликоз-11-еновая кислота (1d-3)

К раствору соединения 1d-2 (3,0 г, 6,45 ммоль) в воде (100 мл) и ТГФ (30 мл), добавляли 10 экв. раствора NaOH и кипятили с обратным холодильником в течение 72 часов. Затем нейтрализовали реакционную смесь, добавляя 1 н. раствор HCl. Продукт дважды экстрагировали EtOAc и промывали насыщенным солевым раствором, и сушили над безводным NS₂SO₄. Объединенный органический слой очищали хроматографией на системе ISCO (гексан:EtOAc 40-100%) с получением 2,1 г 1d-3 (75%).

(Z)-N-метил-3-нониликоз-11-енамид (1d-4)

К перемешанному раствору соединения 1d-3 (2,1 г, 4,8 ммоль) в CH₂Cl₂ (50 мл) добавляли DMAP (0,58 г, 4,8 ммоль), затем EDCI (1,29 г, 6,72 ммоль). Затем добавляли метиламин (3,7 мл, 7,2 ммоль) и перемешивали полученную смесь при комнатной температуре в течение ночи. Затем разбавляли реакционную смесь 300 мл CH₂Cl₂ и промывали органический слой водой и насыщенным солевым раствором. Органический слой сушили над безводным Na₂SO₄, выпаривали досуха и очищали хроматографией на системе ISCO, используя 5-50% EtOAc в гексане в качестве элюента. Фракции, содержащие требуемое соединение, объединяли и выпаривали с получением 1d-4 (1,5 г, 80,3%).

(Z)-N-метил-3-нониликоз-11-ен-1-амин (1d-5)

Соединение 1d-4 (1,5 г, 3,44 ммоль) растворяли в в ТГФ (100 мл) и охлаждали до 0°С.Затем по частям добавляли LiAlH₄ (0,4 г, 10,32 ммоль). После добавления оставляли смесь достигать комнатной температуры и нагревали при 50°С в течение ночи. Затем охлаждали реакционную смесь до 0°С и по каплям добавляли воду до полного погашения LiAlH₄. Затем фильтровали реакционную смесь через целит и выпаривали растворитель досуха, и очищали хроматографией на системе ISCO (CH₂Cl₂:МеОН (2% NH₃) 0-100%) с получением требуемого продукта, 1d-5 (0,93 г, 62%).

(Z)-2-(метил(3-нониликоз-11-ен-1-ил)амино)этан-1-тиол (1d-6)

Соединение 1d-6 (0,5 г, 1,14 ммоль) растворяли в толуоле (5 мл) в закрытой пробирке и продували N₂ в течение 5 минут. Затем добавляли этиленсульфид (0,11 мл, 1,2 ммоль) и нагревали смесь при 50°С в течение 24 часов. Затем концентрировали реакционную смесь в вакууме и использовали наследующей стадии без очистки.

(Z)-N-метил-N-(2-((2-(метил((Z)-октадец-9-ен-1-ил)амино)этил)дисульфанил)этил)-3-нониликоз-11-ен-1-амин (липид 38)

Соединения 1d-6 (0,2 г, 0,40 ммоль) и 2а-4 (0,28 г, 0,6 ммоль) растворяли в 20 мл CHCl₃ и перемешивали при комнатной температуре. После завершения выпаривали растворитель в вакууме и очищали хроматографией на системе ISCO (CH₂Cl₂:10% МеОН 0-50%). ¹Н ЯМР (300 МГц, d-хлороформ) δ 5,34 (т, J=4,8 Гц, 4Н), 2,84-2,72 (м, 4Н), 2,72-2,59 (м, 4Н), 2,40-2,29 (м, 4Н), 2,23 (д, J=7,6 Гц, 6Н), 2,04-1,91 (м, 8Н), 1,26 (с, 69Н), 0,87 (т, J=6,6 Гц, 9Н). МС, обнаружено 835,8 [М+Н]⁺, расч. 834,78 для [C₅₃H₁₀₆N₂S₂].

Схема синтеза липида 39

Синтез (2,)-пентакоз-16-ен-8-она (1е-1)

В 60 мл безводного эфира растворяли соединение 1а-1 (5 г, 14,7 ммоль). К полученному раствору по каплям добавляли 1 М раствор гептилмагнийбромида (30 мл, 30 ммоль) при 0°С. Перемешивали полученную смесь при комнатной температуре в течение 2 часов, гасили насыщенным раствором хлорида аммония и экстрагировали гексаном. Органический слой сушили над MgSO₄, затем очищали колоночной хроматографией, используя 0-20% этилацетата в гексане в качестве элюента, с получением 1е-1 (4 г, 75%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 5,32-5,36 (м, 2 Н), 2,40 (т, 4 Н), 1,99-2,02 (м, 4 Н), 1,53-1,58 (м, 4 Н), 1,10-1,40 (м, 28 Н), 0,83-0,89 (т, 6 Н).

Синтез (Z)-пентакоз-16-ен-8-амина (1е-2)

К 33% раствору метиламина в этаноле (4,5 мл) добавляли раствор соединения 1е-1 (1 г, 2,7 ммоль) в 5 мл этанола. Перемешивали полученную смесь при комнатной температуре в течение 8 часов. К полученному выше раствору добавляли NaBH₄ (300 мг, 7,5 ммоль) при 0°С. Перемешивали полученную смесь при комнатной температуре в течение ночи, затем гасили водой. Из реакционной смеси выпаривали растворитель и очищали остаток колоночной хроматографией, используя метиламин в этилацетате в качестве элюента, с получением 1е-2 (510 мг, 49%) в виде светло-желтого маслянистого вещества. ¹Н-ЯМР (300 МГц, d-хлороформ): δ 5,33-5,34 (м, 2 Н), 2,39 (м, 4 Н), 1,97-2,01 (м, 4 Н), 1,10-1,50 (м, 42 Н), 0,85-0,87 (т, 6 Н).

(Z)-2-(метил(пентакоз-16-ен-8-ил)амино)этан-1-тиол (1е-3)

Соединение 1е-2 (0,5 г, 1,30 ммоль) растворяли в толуоле (5 мл) в закрытой пробирке и продували N₂ в течение 5 минут. Затем добавляли этиленсульфид (0,08 мл, 1,36 ммоль) и нагревали смесь при 50°С в течение 24 часов. Затем концентрировали реакционную смесь в вакууме и использовали на следующей стадии без очистки.

(Z)-N-метил-N-(2-((2-(метил((Z)-октадец-9-ен-1-ил)амино)этил)дисульфанил)этил)пентакоз-16-ен-8-амин (липид 39)

Соединения 1е-3 (0,27 г, 0,61 ммоль) и 2а-4 (0,30 г, 0,64 ммоль) растворяли в 5 мл CHCl₃ и перемешивали при комнатной температуре. После завершения выпаривали растворитель под вакуумом и очищали хроматографией на системе ISCO (CH₂Cl₂:10% МеОН 0-50%). ¹Н ЯМР (300 МГц, d-хлороформ) δ 5,35 (т, J=4,8 Гц, 4Н), 2,78 (дд, J=7,9, 4,0 Гц, 4Н), 2,75-2,62 (м, 4Н), 2,42-2,31 (m,3Н), 2,23 (д,J=13,6 Гц, 6Н), 2,07-1,94 (м, 8Н), 1,27 (д, J=4,1 Гц, 61Н), 0,88 (т, J=6,6 Гц, 9Н). МС, обнаружено 779,7 [М+Н]⁺, расч. 778,72 для [C₄₉H₉₈N₂S₂].

Схема синтеза лнпида 40

2-(метил(октадецил)амнио)этан-1-тиол (2b-1)

N-Метилоктадециламин (1,5 г, 5,30 ммоль) растворяли в толуоле (10 мл) в закрытой пробирке и продували N₂ в течение 5 минут.Затем добавляли этиленсульфид (0,32 мл, 5,83 ммоль) и нагревали смесь при 50°С в течение 24 часов. Затем концентрировали реакционную смесь в вакууме и использовали наследующей стадии без очистки.

N-метил-N-(2-(пиридин-2-илдисульфанил)этил)октадекан-1-амин (2b-2)

Соединение 2b-1 растворяли в 50 мл CHCl₃ и добавляли 2,2'-дипиридилдисульфид (1,4 г, 6,36 ммоль), и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Концентрировали реакционную смесь в вакууме и очищали хроматографией на системе ISCO (гексан:EtOAc 0-15%).

N-метил-N-(2-((2-(метил(3-(7-(2-октилциклопропил)гептил)додецил)амино)этил)дисульфанил)этил)октадекан-1-амин (липид 40)

Соединения 1а-5 и 2b-2 растворяли в 5 мл CHCl₃ и перемешивали при комнатной температуре. После завершения выпаривали растворитель в вакууме и очищали хроматографией на системе ISCO (CH₂Cl₂:10% МеОН 0-50%). ¹Н ЯМР (300 МГц, d-хлороформ) δ 2,93-2,75 (м, 4Н), 2,68 (дд, J=9,1, 5,9 Гц, 4Н), 2,42-2,31 (м, 4Н), 2,25 (д, J=2,2 Гц, 6Н), 1,26 (с, 80Н), 0,88 (дд, J=6,7, 4,7 Гц, 9Н), 0,65 (с, 2Н), 0,58 (дд, J=7,0, 4,3 Гц, 1H), -0,32 (т, J=4,4 Гц, 1H). МС, обнаружено 851,8 [М+Н]⁺, расч. 850,81 для [C₅₄H₁₁₀N₂S₂].

Схема синтеза лнпида 41

(9Z,12Z)-N-метилоктадека-9,12-диен-1-амин (2 с-1)

Взвешивали линолеилметансульфонат (5,0 г, 14,5 ммоль) в закрытой пробирке и добавляли 58 мл метиламина (2 M в ТГФ). Перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем концентрировали реакционную смесь в вакууме и очищали хроматографией на системе ISCO (CH₂Cl₂:MeOH 0-10%). Фракцию, содержащую требуемое соединение, выпаривали с получением 2 с-1 (2,5 г, 62%).

2-(Метил((9Z,12Z)-октадека-9,12-диен-1-ил)амино)этан-1-тиол (2 с-2)

Соединение 2 с-1 (2,5 г, 8,90 ммоль) растворяли в толуоле (10 мл) в закрытой пробирке и продували N₂ в течение 5 минут.Затем добавляли этиленсульфид (0,54 мл, 9 ммоль) и нагревали смесь при 50°С в течение 24 часов. Затем концентрировали реакционную смесь в вакууме и использовали на следующей стадии без очистки.

(9Z,12Z)-N-метил-N-(2-(пиридин-2-илдисульфанил)этил)октадека-9,12-диен-1-амин (2 с-3)

Соединение 2 с-2 растворяли в 50 мл CHCl₃ и добавляли 2,2'-дипиридилдисульфид (5,5 г, 25 ммоль), и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем концентрировали реакционную смесь в вакууме и очищали хроматографией на системе ISCO (гексан:EtOAc 0-30%) с получением продукта 2 с-3 (2,3 г, 58%).

(9Z,12Z)-N-метил-N-(2-((2-(метил(3-(7-(2-октилциклопропил)гептил)додецил)амино)этил)дисульфанил)этил)октадека-9,12-диен-1-амин (липид 41)

Соединения 1а-5 и 2 с-2 растворяли в 5 мл CHCl₃ и перемешивали при комнатной температуре. После завершения выпаривали растворитель в вакууме и очищали хроматографией на системе ISCO (CH₂Cl₂:10% МеОН 0-50%). ¹Н ЯМР (300 МГц, d-хлороформ) δ 5,42-5,26 (м, 4Н), 2,79 (дт, J=10,4, 5,8 Гц, 4Н), 2,67 (дд, J=8,9, 5,4 Гц, 4Н), 2,40-2,31 (м, 4Н), 2,25 (д, J=3,7 Гц, 6Н), 2,04 (к, J=6,5 Гц, 4Н), 1,35-1,18 (м, 65Н), 0,88 (тд, J=6,7, 2,6 Гц, 9Н), 0,69-0,61 (м, 2Н), 0,56 (дд, J=7,2, 3,9 Гц, 1H), -0,33 (т, J=4,4 Гц, 1Н). МС, обнаружено 847,8 [М+Н]⁺, расч. 846,78 для [C₅₄H₁₁₀N₂S₂].

Синтез липидов 46, 47 и 49-51 Общая схема:

Синтез соединений 2, 12

Мезилат углеродной цепи (R₁ / R₃ / R₅) взвешивали в закрытой пробирке и добавляли метиламин (2 M в ТГФ). Затем перемешивали смесь в течение 16 часов при комнатной температуре. Затем разбавляли реакционную смесь EtOAc и промывали органический слой 2 н. раствором NaOH и насыщенным солевым раствором, сушили над безводным Na₂SO₄ и фильтровали. Концентрировали фильтрат в вакууме. Полученный продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Синтез соединения 9

Взвешивали бромнонан (R₄) в закрытой пробирке и добавляли метиламин (2 M в ТГФ) (20 экв.). Затем перемешивали смесь в течение 16 часов при комнатной температуре Затем удаляли ТГФ в вакууме и разбавляли реакционную смесь CHCl₃, и промывали органический слой водой и насыщенным солевым раствором, и сушили над Na₂SO₄, и фильтровали. Концентрировали фильтрат в вакууме. Полученный продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Синтез соединений 3, 6, 10 и 13

Промежуточные соединения из предыдущей стадии (2, 12 и 9) растворяли в толуоле в закрытой пробирке и продували N₂ в течение 5 минут. Затем добавляли этиленсульфид (1,5 экв.) и нагревали смесь при 50°С в течение 24 часов. Затем концентрировали реакционную смесь в вакууме и сразу использовали на следующей стадии.

Синтез соединений 4 и 7

Полученный на предыдущей стадии тиол (3/6) растворяли в CHCl₃ и добавляли 2,2'-дипиридилдисульфид (1,5 экв.), и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем концентрировали реакционную смесь в вакууме и очищали хроматографией на системе ISCO (нексан:EtOAc 0-10%).

Синтез соединения 16

Соединение 14 (swR (спин-волновой резнонанс) (300 МГц, d-хлороформ) δ 5,34 (т, J=4,9 Гц, 2Н), 2,81 (дд, J=9,4, 5,6 Гц, 4Н), 2,67 (дд, J=8,9, 5,3 Гц, 4Н), 2,41-2,30 (м, 4Н), 2,25 (с, 6Н), 2,01 (д, J=5,6 Гц, 4Н), 1,45 (с, 4Н), 1,26 (с, 38Н), 0,87 (т, J=6,7 Гц, 6Н). МС, обнаружено 585,4 [М+Н]⁺, расч. 584,51 для [C₃₅H₇₂N₂S₂].

Т-метил-Т-(2-((2-(метил(ундецил)амино)этил)дисульфанил)этил)октадекан-1-амин (липид 47). Выход: 0,082 г (30%). ¹Н ЯМР (300 МГц, d-хлороформ) δ 2,80 (дд, J=9,2, 5,6 Гц, 4Н), 2,67 (дд, J=9,0, 5,3 Гц, 4Н), 2,42-2,29 (м, 4Н), 2,24 (с, 6Н), 1,52-1,38 (м, 6Н), 1,24 (с, 46Н), 0,87 (т, J=6,6 Гц, 6Н). МС, обнаружено 587,7 [М+Н]⁺, расч. 586,53 для [C₃₅H₇₄N₂S₂].

(Z)-N-метил-N-(2-((2(метил(нонил)амино)этил)дисульфанил)этил)октадец-9-ен-1-амин (липид 49). Выход: 0,252 г (42%). ¹H ЯМР (300 МГц, d-хлороформ) δ 5,34 (т, J=4,9 Гц, 2Н), 2,81 (дд, J=9,3, 5,6 Гц, 4Н), 2,67 (дд, J=8,5, 5,8 Гц, 4Н), 2,42-2,30 (м, 4Н), 2,24 (с, 6Н), 2,08-1,94 (м, 6Н), 1,68 (д, J=4,4 Гц, 2Н), 1,45 (с, 4Н), 1,26 (с, 32Н), 0,87 (т, J=6,6 Гц, 6Н). МС, обнаружено 557,4 [М+Н]⁺, расч. 556,48 для [C₃₃H₆₈N₂S₂].

N-метил-N-(2-((2-(метил(нонил)амино)этил)дисульфанил)этил)октадекан-1-амин (липид 50). Выход: 0,114 г (21%). ¹H ЯМР (300 МГц, d-хлороформ) δ 2,88-2,76 (м, 4Н), 2,72-2,59 (м, 4Н), 2,35 (дд, J=9,8, 5,3 Гц, 4Н), 2,24 (с, 6Н), 1,51-1,37 (м, 4Н), 1,25 (д, J=4,0 Гц, 42Н), 0,87 (т, J=6,7 Гц, 6Н). МС, обнаружено 559,4 [М+Н]⁺, расч. 558,50 для [C₃₃H₆₈N₂S₂].

(9Z,12Z)-N-метил-N-(2-((2(метил(нонил)амино)этил)дисульфанил)этил)октадека-9,12-диен-1-амин (липид 51). Выход: 0,074 г (26%). ¹H ЯМР (301 МГц, d-хлороформ) δ 5,42-5,28 (м, 4Н), 2,87-2,80 (м, 4Н), 2,77-2,72 (м, 4Н), 2,50-2,38 (м, 4Н), 2,30 (с, 6Н), 2,04 (к, J=6,6 Гц, 4Н), 1,54-1,42 (м, 4Н), 1,28 (с, J=5,6 Гц, 30Н), 0,93-0,81 (м, 6Н). МС, обнаружено 555,4 [М+Н]⁺, расч. 554,47 для [C₃₃H₆₆N₂S₂].

Пример 2

Оценка безопасности и экспрессии трансгена терапевтической нуклеиновой кислоты, составленной в композицию LNP, содержащую липид 39, после субретиналъной инъекции у крыс

Для оценки экспрессии трансгена терапевтической нуклеиновой кислоты (например, векторов зкДНК), составленной композицию липидных наночастиц (LNP), содержащую липид 39 («LNP 39») в качестве ионизируемого липида, инкапсулировали зкДНК, содержащую промотор CAG, функционально связанный с геном люциферазы («CAG-Luc-зкДНК»), в LNP (молярное отношение липид LIPID 39: DOPC: холестерин: DMG-n3r2000: DSPE-ПЭГ2000, 50,8: 7,2: 38,6: 2,9: 0,48) и вводили посредством инъекции крысам Спрага-Доули (самцам). Средний диаметр LNP составлял 72,4 нм с эффективностью инкапсуляции приблизительно 40%. Как отмечено выше, все экспериментальные препараты представляли собой зкДНК, составленные в композиции LNP: «CAG-люцифераз-зкДНК», содержащие липид 39 в качестве ионизируемого липида. Как отмечено выше, липид 39 представляет собой ионизируемый липид, имеющий название (Z)-N-метил-N-(2-((2-(метил((Z)-октадец-9-ен-1-ил)амино)этил)дисульфанил)этил)пентакоз-16-ен-8-амин.

Животным субретинально (SR) вводили дозу экспериментальных препаратов, как подробно описано ниже. Всем животным ежедневно вводили 0,5 мг/кг метилпреднизолона (подкожно, SC), начиная с -1 дня и заканчивая на 14 день.

Здоровье и акклиматизация животных:

Животных акклиматизировали к условиям исследования на протяжении не менее 3 дней до анестезии. По окончании периода акклиматизации для каждого животного проводили медицинский осмотр для определения пригодности для участия в исследовании. Осмотр включал изучение состояния кожи и ушных раковин, глаз, брюшной полости, неврологического, поведенческого и общего состояния организма. Животные, признанные здоровыми, были допущены к исследованию.

Исследования: Ежедневно проводили оценку смертности и заболеваемости.

Хирургические операции:

В день хирургической операции крысам вводили бупренорфин, 0,01-0,05 мг/кг SQ. Животным также местно вводили коктейль из тропикамида (1,0%) и фенилэфрина (2,5%) для расширения и проптоза глаз. Затем животных транквилизировали коктейлем из кетамина/ксилазина для проведения хирургической операции, и в оба глаза вводили по одной капле 0,5% пропаракаин.HCl. Подготавливали глаза для асептических хирургических операций. Альтернативно, крыс транквилизировали ингаляцией изофлурана. Поддерживали роговицу в увлажненном состоянии посредством местного промывания глаз, а температуру тела при необходимости поддерживали горячими подушечками.

Субретинальные инъекции: Для обнажения склеры делали разрез конъюнктивы и теноновой капсулы длиной 2 мм. В задней части склеры делали небольшое пробное отверстие с помощью кончика иглы 30 калибра для субретинальной инъекции с помощью иглы 33 калибра и шприца Гамильтона. После каждой процедуры инъекции на поверхность глаза местно наносили 1 каплю офтальмологического раствора офлоксацина и смазывали глаз, а животных оставляли восстанавливаться после операции. Крысам вводили атипамезол для устранения действия ксилазина (0,1-1,0 мг/кг).

Исследование глаза:

Исследование глаза проводили с помощью биомикроскопа с щелевой лампой для оценки морфологии поверхности глаза в моменты времени, указанные выше в таблице. Для оценки воспаления переднего сегмента использовали таблицу баллов, представленную ниже.

Визуализация с помощью IVIS:

На 14 день всех животных подвергали процедуре визуализации глаз с помощью IVIS для количественного измерения и определения экспрессии люциферазы. Вводили интраперитонеальную инъекцию люциферина на субстрате (0,15 мг/г) и визуализировали крыс приблизительно через 5-10 минут после инъекции. Записывали значения общего потока (фотон/с) и среднего излучения (фотон/с/см/ср) для элипсоидной ROI (обследуемой области) вокруг каждого глаза.

Оптическая когерентная томография (ОСТ)

Всех животных подвергали процедуре визуализации заднего сегмента глаз с помощью ОСТ для определения успешности субретинальной инъекции и изменений с течением времени. Глаза расширяли с помощью коктейля из 1% тропикамид.HCl и 2,5% гидрохлорида фенилэфрина для проведения ОСТ за 15 минут до исследования. Измеряли толщину внешнего ядерного слоя (ONL) в трех положения (слева, справа и в центре) на основании двух сканов ОСТ.

Результаты

Как показано на Фиг. 5, крысы Спрага-Доули, которым вводили субретинальную (SR) инъекцию 2,5 мкл композиции LNP (0,04 мкг/мкл) («LNP39»), содержащей LNP с молярным процентным соотношением липид 39: DOPC: холестерин: ОМО-ПЭГ2000: DSPE-ПЭГ2000, 50,8: 7,2: 38,6: 2,9: 0,48, инкапсулирующей «CAG-Luc-зкДНК», демонстрировали заметную экспрессию люциферазы в глазах на 14 день. Животные, которым вводили носитель, а также животные без лечения демонстрировали лишь фоновые уровни. Все животные, которым вводили LNP39, хорошо переносили дозу без существенной потери массы тела.

ССЫЛКИ

Все публикации и ссылки, включая, но не ограничиваясь ими, патенты и патентные заявки, цитированные в данном описании и в приведенных примерах, в полном объеме включены посредством ссылки, как если бы каждая отдельная публикация или ссылка была специально и в отдельности указана как включенная в данный документ посредством ссылки в полном изложении. Любая патентная заявка, в отношении которой заявлен приоритет согласно данной заявке, также включена в данный документ посредством ссылки способом, описанным выше для публикаций и ссылок.

Изобретение относится к ионизируемым липидам, представленным формулой (I)

или их фармацевтически приемлемым солям, где R¹ и R^1’, каждый независимо, представляют собой линейный или разветвленный С_1-3 алкилен; R² и R^2’, каждый независимо, представляют собой линейный или разветвленный С_1-6 алкилен; R³ и R^3’, каждый независимо, представляют собой линейный или разветвленный С_1-6 алкил; или альтернативно, если R² представляет собой разветвленный С_1-6 алкилен, то R² и R³ вместе с их промежуточным атомом N образуют 4-8-членный гетероциклил; или альтернативно, если R^2’ представляет собой разветвленный С_1-6 алкилен, то R^2’ и R^3’ вместе с их промежуточным атомом N образуют 4-8-членный гетероциклил; R⁴ и R^4’, каждый независимо, представляют собой -CR^a, -C(R^a)₂CR^a или -[C(R^a)₂]₂CR^a; R^a для каждого случая независимо представляет собой Н или С_1-3 алкил; или альтернативно, если R⁴ представляет собой C(R^a)₂CR^a или [C(R^a)₂]₂CR^a и если R^a представляет собой С_1-3 алкил, то R³ и R⁴ вместе с промежуточным атомом N образуют 4-8-членный гетероциклил; или альтернативно, если R⁴’ представляет собой -C(R^a)₂CR^a или -[C(R^a)₂]₂CR^a и если R^a представляет собой С_1-3 алкил, то R^3’ и R^4’ вместе с промежуточным атомом N образуют 4-8-членный гетероциклил; R⁵ и R^5’, каждый независимо, представляют собой С_4-20 алкил; R⁶ и R^6’ для каждого случая независимо представляют собой С_1-20 алкилен, С_3-20 циклоалкилен или С_2-20 алкенилен; и m и n, каждый независимо, представляют собой целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4 и 5, а также к ионизируемым липидам, выбранным из группы и их фармацевтически приемлемым солям, липидной наночастице (LNP) для доставки терапевтической нуклеиновой кислоты, фармацевтической композиции для доставки трансгена в нуклеиновой кислоте в требуемые клетки реципиента и применению липидной наночастицы или фармацевтической композиции для производства лекарственного средства для лечения генетического нарушения у субъекта. Технический результат: получены липидные каркасы, которые не только демонстрируют повышенную эффективность наряду со сниженной токсичностью, но и обладают улучшенной фармакокинетикой и внутриклеточной кинетикой, такой как поглощение клеткой и высвобождение нуклеиновой кислоты из липидного носителя. 6 н. и 93 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр., 19 ил.

1. Ионизируемый липид, представленный формулой (I)

или его фармацевтически приемлемая соль, где:

R¹ и R^1’, каждый независимо, представляют собой линейный или разветвленный С_1-3 алкилен;

R² и R^2’, каждый независимо, представляют собой линейный или разветвленный С_1-6 алкилен;

R³ и R^3’, каждый независимо, представляют собой линейный или разветвленный С_1-6 алкил;

или альтернативно, если R² представляет собой разветвленный С_1-6 алкилен, то R² и R³ вместе с их промежуточным атомом N образуют 4-8-членный гетероциклил;

или альтернативно, если R^2’ представляет собой разветвленный С_1-6 алкилен, то R^2’ и R^3’ вместе с их промежуточным атомом N образуют 4-8-членный гетероциклил;

R⁴ и R^4’, каждый независимо, представляют собой -CR^a, -C(R^a)₂CR^a или -[C(R^a)₂]₂CR^a;

R^a для каждого случая независимо представляет собой Н или С_1-3 алкил;

или альтернативно, если R⁴ представляет собой C(R^a)₂CR^a или [C(R^a)₂]₂CR^a и если R^a представляет собой С_1-3 алкил, то R³ и R⁴ вместе с промежуточным атомом N образуют 4-8-членный гетероциклил;

или альтернативно, если R^4’ представляет собой -C(R^a)₂CR^a или -[C(R^a)₂]₂CR^a и если R^a представляет собой С_1-3 алкил, то R^3’ и R^4’ вместе с промежуточным атомом N образуют 4-8-членный гетероциклил;

R⁵ и R^5’, каждый независимо, представляют собой С_4-20 алкил;

R⁶ и R^6’ для каждого случая независимо представляют собой С_1-20 алкилен, С_3-20 циклоалкилен или С_2-20 алкенилен; и

m и n, каждый независимо, представляют собой целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4 и 5.

2. Ионизируемый липид по п. 1, отличающийся тем, что каждый R² и R^2’ независимо представляет собой С_1-3 алкилен.

3. Ионизируемый липид по п. 2, отличающийся тем, что R¹ и R² вместе представляют собой С_1-3 алкилен и R^1’ и R^2’ вместе представляют собой С_1-3 алкилен.

4. Ионизируемый липид по п. 3, отличающийся тем, что R¹ и R² вместе представляют собой этилен и R^1’ и R^2’ вместе представляют собой этилен.

5. Ионизируемый липид по п. 1, отличающийся тем, что каждый R³ и R^3’ независимо представляет собой С_1-3 алкил.

6. Ионизируемый липид по п. 5, отличающийся тем, что каждый R³ и R³’ представляет собой метил.

7. Ионизируемый липид по п. 1, отличающийся тем, что каждый R⁴ и R^4’ представляет собой -CH.

8. Ионизируемый липид по п. 1, отличающийся тем, что R² представляет собой разветвленный С_1-6 алкилен и R² и R³ вместе с промежуточным атомом N образуют 5- или 6-членный гетероциклил.

9. Ионизируемый липид по п. 1, отличающийся тем, что R^2’ представляет собой разветвленный С_1-6 алкилен и R^2’ и R^3’ вместе с промежуточным атомом N образуют 5- или 6-членный гетероциклил.

10. Ионизируемый липид по п. 1, отличающийся тем, что R⁴ представляет собой C(R^a)₂CR^a или [C(R^a)₂]₂CR^a, R^a представляет собой С_1-3 алкил и R³ и R⁴ вместе с промежуточным атомом N образуют 5- или 6-членный гетероциклил.

11. Ионизируемый липид по п. 1, отличающийся тем, что R^4’ представляет собой -C(R^a)₂CR^a или -[C(R^a)₂]₂CR^a, R^a представляет собой С_1-3 алкил и R^3’ и R^4’ вместе с промежуточным атомом N образуют 5- или 6-членный гетероциклил.

12. Ионизируемый липид по любому из пп. 8-11, отличающийся тем, что 5- или 6-членный гетероциклил представляет собой пирролидинил или пиперидинил.

13. Ионизируемый липид по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что каждый R⁵ и R^5’ независимо представляют собой С_4-9 алкил.

14. Ионизируемый липид по любому из пп. 1-13, отличающийся тем, что R⁶ и R^6’ для каждого случая независимо представляют собой С_1-10 алкилен, С_3-10 циклоалкилен или С_2-10 алкенилен.

15. Ионизируемый липид по п. 14, отличающийся тем, что С_3-10 циклоалкилен представляет собой циклопропилен.

16. Ионизируемый липид по п. 14 или 15, отличающийся тем, что каждый m и n равен 3.

17. Ионизируемый липид, выбранный из группы, состоящей из:

и фармацевтически приемлемой соли любого из вышеуказанных соединений.

18. Ионизируемый липид, выбранный из группы, состоящей из:

и фармацевтически приемлемой соли любого из вышеуказанных соединений.

19. Липидная наночастица (LNP) для доставки терапевтической нуклеиновой кислоты, содержащая ионизируемый липид по любому из пп. 1-18 и нуклеиновую кислоту.

20. Липидная наночастица по п. 19, отличающаяся тем, что нуклеиновая кислота инкапсулирована в ионизируемый липид.

21. Липидная наночастица по п. 19 или 20, отличающаяся тем, что нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из минигенов, плазмид, миниколец, малой интерферирующей РНК (миРНК), микроРНК (микроРНК), антисмысловых олигонуклеотидов (ASO), рибозимов, зкДНК, мини-нити, Doggybone™, ДНК протеломера с замкнутыми концами или гантелевидной линейной ДНК, дцРНК субстрата Дайсера, малой шпилечной РНК (мшРНК), асимметричной интерферирующей РНК (аиРНК), микроРНК (микроРНК), мРНК, тРНК, рРНК, векторов вирусных ДНК, векторов вирусных РНК, невирусных векторов и любых их комбинаций.

22. Липидная наночастица по п. 21, отличающаяся тем, что нуклеиновая кислота представляет собой ДНК с замкнутыми концами (зкДНК).

23. Липидная наночастица по любому из пп. 19-22, дополнительно содержащая стерин.

24. Липидная наночастица по п. 23, отличающаяся тем, что стерин представляет собой холестерин.

25. Липидная наночастица по любому из пп. 19-24, дополнительно содержащая полиэтиленгликоль (ПЭГ) или ПЭГ-липидный конъюгат.

26. Липидная наночастица по п. 25, отличающаяся тем, что ПЭГ-липидный конъюгат представляет собой 1-(монометоксиполиэтиленгликоль)-2,3-димиристоилглицерин (ПЭГ-DMG).

27. Липидная наночастица по любому из пп. 19-26, дополнительно содержащая некатионный липид.

28. Липидная наночастица по п. 27, отличающаяся тем, что некатионный липид выбран из группы, состоящей из дистеароил-sn-глицеро-фосфоэтаноламина, дистеароилфосфатидилхолина (DSPC), диолеоилфосфатидилхолина (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), диолеоилфосфатидилглицерина (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерина (DPPG), диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE), пальмитоилолеоилфосфатидилхолина (РОРС), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламина (POPE), диолеоилфосфатидилэтаноламин-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (DOPE-mal), дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламина (DMPE), дистеароилфосфатидилэтаноламина (DSPE), монометилфосфатидилэтаноламина (такого как 16-О-монометил-РЕ), диметилфосфатидилэтаноламина (такого как 16-О-диметил-РЕ), 18-1-транс-РЕ, 1-стеароил-2-олеоилфосфатидилэтаноламина (SOPE), гидрированного соевого фосфатидилхолина (HSPC), яичного фосфатидилхолина (ЕРС), диолеоилфосфатидилсерина (DOPS), сфингомиелина (SM), димиристоилфосфатидилхолина (DMPC), димиристоилфосфатидилглицерина (DMPG), дистеароилфосфатидилглицерина (DSPG), диэрукоилфосфатидилхолина (DEPC), пальмитоилолеоилфосфатидилглицерина (POPG), диэлаидоилфосфатидилэтаноламина (DEPE), 1,2-дилауроил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DLPE); 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DPHyPE); лецитина, фосфатидилэтаноламина, лизолецитина, лизофосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, сфингомиелина, яичного сфингомиелина (ESM), цефалина, кардиолипина, фосфатидной кислоты, цереброзидов, дицетилфосфата, лизофосфатидилхолина, дилинолеоилфосфатидилхолина или их смесей.

29. Липидная наночастица по п. 28, отличающаяся тем, что некатионный липид выбран из группы, состоящей из из диолеоилфосфатидилхолина (DOPC), дистеароилфосфатидилхолина (DSPC) и диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE).

30. Липидная наночастица по п. 29, отличающаяся тем, что ПЭГ или ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в молярном процентном содержании от около 2 до около 4%.

31. Липидная наночастица по п. 30, отличающаяся тем, что ПЭГ или ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в молярном процентном содержании от около 2 до около 3,5%.

32. Липидная наночастица по п. 31, отличающаяся тем, что ПЭГ или ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в молярном процентном содержании от около 2,5 до около 3%.

33. Липидная наночастица по п. 32, отличающаяся тем, что ПЭГ или ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в молярном процентном содержании около 3%.

34. Липидная наночастица по любому из пп. 28-33, отличающаяся тем, что холестерин присутствует в молярном процентном содержании от около 20 до около 40%, и при этом ионизируемый липид присутствует в молярном процентном содержании от около 80 до около 60%.

35. Липидная наночастица по п. 34, отличающаяся тем, что холестерин присутствует в молярном процентном содержании около 40%, и при этом ионизируемый липид присутствует в молярном процентном содержании около 50%.

36. Липидная наночастица по любому из пп. 19-22, дополнительно содержащая холестерин, ПЭГ или ПЭГ-липидный конъюгат и некатионный липид.

37. Липидная наночастица по п. 36, отличающаяся тем, что ПЭГ или ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в молярном процентном содержании от около 2 до около 4%.

38. Липидная наночастица по п. 37, отличающаяся тем, что ПЭГ или ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в молярном процентном содержании от около 2 до около 3,5%.

39. Липидная наночастица по п. 38, отличающаяся тем, что ПЭГ или ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в молярном процентном содержании от около 2,5 до около 3%.

40. Липидная наночастица по п. 39, отличающаяся тем, что ПЭГ или ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в молярном процентном содержании около 3%.

41. Липидная наночастица по любому из пп. 35-40, отличающаяся тем, что холестерин присутствует в молярном процентном содержании от около 30 до около 50%.

42. Липидная наночастица по любому из пп. 35-40, отличающаяся тем, что ионизируемый липид присутствует в молярном процентном содержании от около 42,5 до около 62,5%.

43. Липидная наночастица по любому из пп. 35-40, отличающаяся тем, что некатионный липид присутствует в молярном процентном содержании от около 2,5 до около 12,5%.

44. Липидная наночастица по любому из пп. 35-40, отличающаяся тем, что холестерин присутствует в молярном процентном содержании около 40%, ионизируемый липид присутствует в молярном процентном содержании около 52,5%, некатионный липид присутствует в молярном процентном содержании около 7,5%, и при этом ПЭГ или ПЭГ-липидный конъюгат присутствует в молярном процентном содержании около 3%.

45. Липидная наночастица по любому из пп. 19-44, дополнительно содержащая пальмитат дексаметазона.

46. Липидная наночастица по любому из пп. 19-44, отличающаяся тем, что диаметр наночастицы составляет от около 50 до около 110 нм.

47. Липидная наночастица по любому из пп. 19-44, отличающаяся тем, что размер наночастицы составляет менее чем около 100 нм.

48. Липидная наночастица по п. 47, отличающаяся тем, что размер частицы составляет менее чем около 70 нм.

49. Липидная наночастица по п. 48, отличающаяся тем, что размер частицы составляет менее чем около 60 нм.

50. Липидная наночастица по п. 22, отличающаяся тем, что указанная частица имеет отношение общего содержания липидов к зкДНК около 10:1 мас./мас.

51. Липидная наночастица по п. 22, отличающаяся тем, что указанная частица имеет отношение общего содержания липидов к зкДНК около 20:1 мас./мас.

52. Липидная наночастица по п. 22, отличающаяся тем, что указанная частица имеет отношение общего содержания липидов к зкДНК около 30:1 мас./мас.

53. Липидная наночастица по п. 22, отличающаяся тем, что указанная частица имеет отношение общего содержания липидов к зкДНК около 40:1 мас/мас.

54. Липидная наночастица по любому из пп. 19-53, дополнительно содержащая тканеспецифический нацеливающий фрагмент.

55. Липидная наночастица по п. 54, отличающаяся тем, что тканеспецифический нацеливающий агент представляет собой фрагмент, содержащий N-ацетилгалактозамин (GalNAc) (например, GalNAC-ПЭГ-липидный конъюгат), и присутствует в указанной частице в молярном процентном содержании около 1,5%, около 1,4%, около 1,3%, около 1,2%, около 1,1%, около 1,0%, около 0,9%, около 0,8%, около 0,7%, около 0,6%, около 0,5%, около 0,4%, около 0,3%, около 0,2% или около 0,1% от общего содержания липидов.

56. Липидная наночастица по п. 55, отличающаяся тем, что фрагмент, содержащий GalNAc, присутствует в указанной частице в молярном процентном содержании около 0,5% от общего содержания липидов.

57. Липидная наночастица по любому из пп. 19-56, дополнительно содержащая от около 10 до около 30 мМ яблочной кислоты.

58. Липидная наночастица по п. 57, содержащая около 20 мМ яблочной кислоты.

59. Липидная наночастица по любому из пп. 19-58, дополнительно содержащая от около 30 до около 50 мМ NaCl.

60. Липидная наночастица по п. 59, дополнительно содержащая около 40 мМ NaCl.

61. Липидная наночастица по любому из пп. 19-60, дополнительно содержащая от около 20 до около 100 мМ MgCl₂.

62. Липидная наночастица по п. 22, отличающаяся тем, что зкДНК представляет собой линейную дуплексную ДНК с замкнутыми концами.

63. Липидная наночастица по п. 22, отличающаяся тем, что зкДНК содержит экспрессионную кассету, и при этом экспрессионная кассета содержит последовательность промотора и трансген.

64. Липидная наночастица по п. 63, отличающаяся тем, что экспрессионная кассета содержит последовательность полиаденилирования.

65. Липидная наночастица по любому из пп. 62-64, отличающаяся тем, что зкДНК содержит по меньшей мере один инвертированный концевой повтор (ITR), фланкирующий либо 5’-, либо 3’-конец указанной экспрессионной кассеты.

66. Липидная наночастица по п. 65, отличающаяся тем, что экспрессионная кассета фланкирована двумя ITR, причем указанные два ITR включают один 5’-ITR и один 3’-ITR.

67. Липидная наночастица по п. 65, отличающаяся тем, что экспрессионная кассета связана с ITR на 3’-конце (3’-ITR).

68. Липидная наночастица по п. 65, отличающаяся тем, что экспрессионная кассета связана с ITR на 5’-конце (5’-ITR).

69. Липидная наночастица по п. 65, отличающаяся тем, что по меньшей мере один из 5’-ITR и 3’-ITR представляет собой ITR AAV дикого типа.

70. Липидная наночастица по п. 65, отличающаяся тем, что по меньшей мере один из 5’-ITR и 3’-ITR представляет собой модифицированный ITR.

71. Липидная наночастица по п. 65, отличающаяся тем, что зкДНК дополнительно содержит спейсерную последовательность между 5’-ITR и экспрессионной кассетой.

72. Липидная наночастица по п. 65, отличающаяся тем, что зкДНК дополнительно содержит спейсерную последовательность между 3’-ITR и экспрессионной кассетой.

73. Липидная наночастица по п. 71 или 72, отличающаяся тем, что спейсерная последовательность имеет по меньшей мере 5 пар оснований в длину.

74. Липидная наночастица по п. 73, отличающаяся тем, что спейсерная последовательность имеет от 5 до 100 пар оснований в длину.

75. Липидная наночастица по п. 73, отличающаяся тем, что спейсерная последовательность имеет от 5 до 500 пар оснований в длину.

76. Липидная наночастица по любому из пп. 19-75, отличающаяся тем, что зкДНК содержит разрыв или гэп.

77. Липидная наночастица по п. 65, отличающаяся тем, что ITR представляет собой ITR, полученный из серотипа AAV, полученный из ITR вируса гусей, полученный из ITR вируса В19, ITR дикого типа из парвовируса.

78. Липидная наночастица по п. 77, отличающаяся тем, что серотип AAV выбран из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и AAV12.

79. Липидная наночастица по п. 65, отличающаяся тем, что ITR представляет собой мутантный ITR и зкДНК необязательно содержит дополнительный ITR, который отличается от первого ITR.

80. Липидная наночастица по п. 65, отличающаяся тем, что зкДНК содержит два мутантных ITR на обоих 5’- и 3’-концах экспрессионной кассеты, при этом необязательно два мутантных ITR являются симметричными мутантами.

81. Липидная наночастица по п. 22, отличающаяся тем, что зкДНК представляет собой CELiD, миникольцо на основе ДНК, MIDGE, вспомогательную ДНК, гантелеобразную дуплексную линейную ДНК с замкнутыми концами, содержащую две шпилечные структуры ITR на 5’ - и 3’-концах экспрессионной кассеты, или ДНК Doggybone™.

82. Фармацевтическая композиция для доставки трансгена в нуклеиновой кислоте в требуемые клетки реципиента, содержащая липидную наночастицу по любому из пп. 19-81 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

83. Применение липидной наночастицы по любому из пп. 19-81 или фармацевтической композиции по п. 82 для производства лекарственного средства для лечения генетического нарушения у субъекта.

84. Применение по п. 83, отличающееся тем, что субъект представляет собой человека.

85. Применение по любому из пп. 83 или 84, отличающееся тем, что генетическое нарушение выбрано из группы, состоящей из серповидноклеточной анемии, меланомы, гемофилии А (дефицит фактора свертывания крови VIII (FVIII)) и гемофилии В (дефицит фактора свертывания крови IX (FIX)), кистозного фиброза (CFTR), семейной гиперхолестеринемии (дефект рецептора LDL), гепатобластомы, болезни Вильсона, фенилкетонурии (PKU), врожденной печеночной порфирии, наследственных нарушений печеночного метаболизма, синдрома Леш-Нихана, серповидноклеточной анемии, талассемии, пигментной ксеродермы, анемии Фанкони, пигментной дегенерации сетчатки, телеангиоэктатической атаксии, синдрома Блума, ретинобластомы, заболеваний накопления мукополисахаридов (например, синдром Гурлера (MPS типа I), синдром Шейе (MPS типа I S), синдром Гурлера-Шейе (MPS типа I H-S), синдром Хантера (MPS типа II), болезнь Санфилиппо типов А, В, С и D (MPS типов III А, В, С и D), болезнь Моркио типов А и В (MPS IVA и MPS IVB), синдром Марото-Лами (MPS типа VI), синдром Слая (MPS типа VII), дефицит гиалуронидазы (MPS типа IX)), болезни Ниманна-Пика типов А/В, С1 и С2, болезни Фабри, болезни Шиндлера, GM2-ганглиозидоза типа II (болезнь Сандхоффа), болезни Тея-Сакса, метахроматической лейкодистрофии, болезни Краббе, муколипидоза типа I, II/III и IV, сиалидоза типов I и II, болезни накопления гликогена типов I и II (болезнь Помпе), болезни Гоше типов I, II и III, болезни Фабри, цистиноза, болезни Баттена, аспартилглюкозаминурии, болезни Салла, болезни Данона (дефицит LAMP-2), дефицита лизосомной кислой липазы (LAL), нейронального цероидного липофусциноза (CLN1-8, INCL и LINCL), сфинголипидоза, галактосиалидоза, амиотрофического бокового склероза (ALS), болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, болезни Хантингтона, спиноцеребеллярной атаксии, спинальной мышечной атрофии, атаксии Фридриха, мышечной дистрофии Дюшенна (DMD), мышечной дистрофии Беккера (BMD), дистрофического буллезного эпидермолиза (DEB), дефицита эктонуклеотидной пирофосфатазы 1, детского генерализованного кальциноза артерий (GACI), врожденного амавроза Лебера, дегенерации желтого пятна Штаргардта (АВСА4), дефицита орнитинтранскарбамилазы (ОТС), синдрома Ушера, дефицита альфа-1-антитрипсина, прогрессирующего семейного внутрипеченочного холестаза (PFIC) типа I (дефицит АТР8В1), типа II (АВСВ11), типа III (АВСВ4) или типа IV (TJP2) и дефицита катепсина А.

86. Применение по п. 85, отличающееся тем, что генетическое нарушение представляет собой врожденный амавроз Лебера (LCA).

87. Применение по п. 86, отличающееся тем, что LCA представляет собой LCA10.

88. Применение по п. 85, отличающееся тем, что генетическое нарушение представляет собой болезнь Ниманна-Пика.

89. Применение по п. 85, отличающееся тем, что генетическое нарушение представляет собой дегенерацию желтого пятна Штаргардта.

90. Применение по п. 85, отличающееся тем, что генетическое нарушение представляет собой дефицит глюкоза-6-фосфатазы (G6P-азы) (болезнь накопления гликогена типа I) или болезнь Помпе (болезнь накопления гликогена типа II).

91. Применение по п. 85, отличающееся тем, что генетическое нарушение представляет собой гемофилию А (дефицит фактора VIII).

92. Применение по п. 85, отличающееся тем, что генетическое нарушение представляет собой гемофилию В (дефицит фактора IX).

93. Применение по п. 85, отличающееся тем, что генетическое нарушение представляет собой синдром Хантера (мукополисахаридоз II).

94. Применение по п. 85, отличающееся тем, что генетическое нарушение представляет собой кистозный фиброз.

95. Применение по п. 85, отличающееся тем, что генетическое нарушение представляет собой дистрофический буллезный эпидермолиз (DEB).

96. Применение по п. 85, отличающееся тем, что генетическое нарушение представляет собой фенилкетонурию (PKU).

97. Применение по п. 85, отличающееся тем, что генетическое нарушение представляет собой прогрессирующий семейный внутрипеченочный холестаз (PFIC).

98. Применение по п. 85, отличающееся тем, что генетическое нарушение представляет собой болезнь Вильсона.

99. Применение по п. 85, отличающееся тем, что генетическое нарушение представляет собой болезнь Гоше типа I, II или III.