Применение оснований Манниха на основе фузидовой кислоты в качестве соединений с противоопухолевой активностью Российский патент 2024 года по МПК C07C215/50 A61K31/575 A61K31/58 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицинской химии, а именно к гетероциклическим производным фузидовой кислоты - основаниям Манниха - формулы (1) - (4), представляющим собой: 4-морфолинобут-2-ин-1-ил-(Z)-2-((3S,4S,8S,10S,11R,14S,16S)-16-ацетокси-3,11-дигидрокси-4,8,10,14-тетраметилгексадекагидро-17H-циклопента[a]фенантрен-17-илиден)-6-метилгепт-5-еноат (1), 4-(пирролидин-1-ил)бут-2-ин-1-ил-(Z)-2-((3S,4S,8S,10S,11R,14S,16S)-16-ацетокси-3,11-дигидрокси-4,8,10,14-тетраметил-гексадекагидро-17H-циклопента[a]фенантрен-17-илиден)-6-метилгепт-5-еноат (2), 4-(4-метилпиперазин-1-ил)бут-2-ин-1-ил-(Z)-2-((3S,4S,8S,10S,11R,14S,16S)-16-ацетокси-3,11-дигидрокси-4,8,10,14-тетраметилгексадекагидро-17H-цикло-пента[a]фенантрен-17-илиден)-6-метилгепт-5-еноат (3) и 4-(пиперидин-1-ил)бут-2-ин-1-ил-(Z)-2-((3S,4S,8S,10S,11R,14S,16S)-16-ацетокси-3,11-дигидрокси-4,8,10,14-тетраметилгексадекагидро-17H-циклопента[a]фенантрен-17-илиден)-6-метилгепт-5-еноат (4), проявляющим высокую противоопухолевую активность in vitro в отношении раковых клеточных линий человека HepG2, HCT-116, SH-SY5Y, MCF-7 и A-549.

Известны основания Манниха абиетановых дитерпеноидов, содержащие в своей структуре фрагменты морфолина (5), диэтиламина (6) или пирролидина (7) (схема 1). Изучение противоопухолевой активности полученных соединений в отношении 60 клеточных линий девяти различных типов рака человека (легкие, толстая кишка, центральная нервная система, яичники, почки, предстательная железа, опухоли молочной железы, лейкемия и меланома) показало, что данные производные не проявляют цитотоксического действия в отношении протестированных линий раковых клеток [Tret’yakova E.V., Salimova E.V., Parfenova L.V. Nat. Prod. Res. 2022, 36, 79-86].

Схема 1.

Известны основания Манниха 2,3-индолтритерпеновых кислот, содержащие N-метилпиперазиновый (20-22) или морфолиновый (23-25) фрагменты в молекуле (схема 2). Изучение цитотоксичности полученных соединений в отношении 60 клеточных линий девяти различных типов опухолей человека показало, что производные (20-22) были активны в отношении лейкемии, рака толстой кишки, немелкоклеточного рака легкого и клеток меланомы с процентом роста от -25,3% до 29,8% [Khusnutdinova E.F., Petrova A.V., Kukovinets O.S., Kazakova O.B. Nat. Prod. Commun. 2018, 13, 665-668].

Схема 2.

Известны основания Манниха природных стероидов - эстрона (Е), 17β-аминопроизводного эстрона (NHBn-E) и эстрадиола (Е2), содержащие в качестве заместителей аминометиленовые фрагменты с линейными и циклическими аминами (схема 3). Изучение противоопухолевого действия полученных соединений в отношении клеточных линий карциномы шейки матки, рака яичников и молочной железы показало, что производные NHBn-E (27, 30, 33, 36, 39, 42 и 45) проявляли высокую антипролиферативную активность в отношении всех исследованных линий раковых клеток (IC₅₀ 5,27-5,94 мкМ). Аналоги Е2 (28, 31, 37 и 46) ингибировали пролиферацию клеток карциномы шейки матки (IC₅₀ = 5.09 - 5.34 мкМ), в то время как производные эстрона (26, 29, 32, 35 и 44) проявляли антипролиферативное действие (IC₅₀ 4,49-4,98 мкМ) в отношении клеточных линий рака шейки матки и яичников [Molnar B., Kinyua N.I., Motyan G., Leits P., Zupko I., Minorics R., Balogh G.T., Frank E. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2022, 219, 106064-106076].

Схема 3.

Известны гетероциклические производные фузидовой кислоты (ФК) (47, 48), содержащие в качестве заместителя радикал ТЕМПО (2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-ил)оксил) в линейной части молекулы (схема 4). Изучение цитотоксического действия синтезированных соединений на клеточные линии рака предстательной железы и рака толстой кишки показало, что производные (47, 48) проявляют высокую противоопухолевую активность в отношении обеих протестированных клеточных линий с IC₅₀ 6.00 мкМ и 6.98 мкМ, соответственно [Sultani H.N., Morgan I., Hussain H., Roos A.H., Haeri H.H., Kaluderovic' G.N., Hinderberger D., Westermann B. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7125-7142].

Схема 4.

Таким образом, противоопухолевая активность гетероциклических производных фузидовой кислоты - оснований Манниха (1) - (4) в литературе не описана.

Задачей предлагаемого изобретения является изучение противоопухолевой активности in vitro 4-морфолинобут-2-ин-1-ил-(Z)-2-((3S,4S,8S,10S,11R,14S,16S)-16-ацетокси-3,11-дигидрокси-4,8,10,14-тетраметилгексадекагидро-17H-циклопента[a]фенантрен-17-илиден)-6-метилгепт-5-еноата (1), 4-(пирролидин-1-ил)бут-2-ин-1-ил-(Z)-2-((3S,4S,8S,10S,11R,14S,16S)-16-ацетокси-3,11-дигидрокси-4,8,10,14-тетраметил-гексадекагидро-17H-циклопента[a]фенантрен-17-илиден)-6-метилгепт-5-еноата (2), 4-(4-метилпиперазин-1-ил)бут-2-ин-1-ил-(Z)-2-((3S,4S,8S,10S,11R,14S,16S)-16-ацетокси-3,11-дигидрокси-4,8,10,14-тетраметилгексадекагидро-17H-цикло-пента[a]фенантрен-17-илиден)-6-метилгепт-5-еноата (3) и 4-(пиперидин-1-ил)бут-2-ин-1-ил-(Z)-2-((3S,4S,8S,10S,11R,14S,16S)-16-ацетокси-3,11-дигидрокси-4,8,10,14-тетраметилгексадекагидро-17H-циклопента[a]фенантрен-17-илиден)-6-метилгепт-5-еноата (4) в отношении пяти линий раковых клеток человека: гепатоцеллюлярная карцинома (HepG2), рак толстой кишки (HCT-116), нейробластома (SH-SY5Y), аденокарцинома молочной железы (MCF-7) и карцинома легких (A549).

Синтез указанных соединений осуществляли по реакции аминометилирования, описанной в [Tret’yakova E.V., Salimova E.V., Parfenova L.V. Nat. Prod. Res. 2022, 36, 79-86]. Алкин (49) вовлекали во взаимодействие с вторичными аминами (морфолином, пирролидином, N-метилпиперазином, пиперидином) и формальдегидом в среде диоксана, в присутствии CuCl в качестве катализатора. В результате аминометилирования были выделены основания Манниха (1) - (4) с выходами 75-85% (схема 5). Структуры полученных соединений установлены с помощью 1D и 2D спектроскопии ЯМР ¹Н и ¹³С и масс-спектрометрии. Анализ спектров NOESY показал, что в условиях реакции конфигурация атома С3 кольца А изменяется с α на β.

Схема 5.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1. Смесь 1.0 ммоль (0.03 г) параформальдегида и 1.0 ммоль вторичного амина в 3 мл сухого 1,4-диоксана перемешивали 2 ч при 75°С. Затем добавляли 0.54 ммоль (0.3 г) соединения (49) и 0,1 ммоль (0,009 г) хлорида меди (I) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. После завершения реакции (по данным ТСХ) к реакционной смеси добавляли хлороформ, а затем водный раствор аммиака. Смесь переносили в делительную воронку, разделяли, органический слой промывали водой до нейтральной реакции, сушили CaCl₂. Растворитель удаляли в вакууме, остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, используя в качестве элюента смесь растворителей, хлороформ: метанол (40:1).

4-Морфолинобут-2-ин-1-ил(Z)-2-((3S,4S,8S,10S,11R,14S,16S)-16-ацетокси-3,11-дигидрокси-4,8,10,14-тетраметилгексадекагидро-17H-циклопента [a]фенантрен-17-илиден)-6-метилгепт-5-еноат (1). Белый порошок, выход 0.28 г (78%); т.пл. 85-87°C; [α]_D²⁰ -1.5° (c 0.53, CHCl₃). Спектр ЯМР ¹H (500.17 MHz, CDCl₃): 0.83 (с, 3H, CH₃, Н-18), 0.84 (д, 3H, CH₃, J 7.1 Hz, Н-28), 0.90 (с, 3H, CH₃, Н-19), 0.92-1.07 (м, 1H, CH₂, Н-6), 0.94-1.08 (м, 1H, CH₂, Н-7), 1.20 (д, 1H, CH₂, J 14.2 Hz, Н-15), 1.31 (с, 3H, CH₃, Н-30), 1.38-1.46 (м, 1H, CH₂, Н-1), 1.40-1.51 (м, 1H, CH, Н-5), 1.45-1.54 (м, 1H, CH, Н-9), 1.49-1.63 (м, 1H, CH₂, Н-6), 1.53 (с, 3H, CH₃, Н-27), 1.56-1.71 (м, 1H, CH₂, Н-7), 1.58-1.80 (м, 2H, CH₂, Н-2), 1.61 (с, 3H, CH₃, Н-26), 1.69-1.79 (м, 1H, CH₂, Н-12), 1.71-1.80 (м, 1H, CH₂, Н-1), 1.89 (с, 3H, OC(O)CH₃), 1.95-2.19 (м, 3H, CH₂, CH, Н-23, Н-4), 2.03-2.16 (м, 1H, CH₂, Н-15), 2.23 (д, 1H, CH₂, J 10.5 Hz, Н-12), 2.31-2.56 (м, 2H, CH₂, Н-22), 2.45-2.56 (м, 4H, CH₂, Н-5', Н-8'), 2.99 (д, 1H, CH, J 11.0 Hz, Н-13), 3.22-3.28 (м, 2H, CH₂, Н-4'), 3.55-3.69 (м, 4H, CH₂, Н-6', Н-7'), 3.58-3.68 (м, 1H, CH, Н-3), 4.20-4.30 (м, 1H, CH, Н-11), 4.56 (д, 1H, CH₂, J 15.0 Hz, Н-1'), 4.65 (д, 1H, CH₂, J 15.0 Hz, Н-1'), 5.02 (т, 1H, CH, J 6.5 Hz, Н-24), 5.74 (д, 1H, CH, J 7.0 Hz, Н-16). Спектр ЯМР ¹³C (125.78 MHz, СDCl₃): 16.00 (C-28), 17.53 (C-18), 17.71 (C-27), 20.92 (OC(O)CH₃), 21.10 (C-6), 23.32 (C-30), 23.57 (C-19), 25.70 (C-26), 28.37 (C-23), 28.89 (C-22), 29.82 (C-1, C-2), 31.39 (C-7), 35.27 (C-4), 35.54 (C-12), 36.53 (C-10), 36.82 (C-5), 38.89 (C-15), 39.41 (C-8), 44.12 (C-13), 47.37 (C-4'), 48.56 (C-14), 49.40 (C-9), 52.04 (C-1'), 52.22 (C-5', C-8'), 66.68 (C-6', C-7'), 67.90 (C-11), 71.27 (C-3), 74.38 (C-16), 79.29 (C-2'), 81.51 (C-3'), 123.04 (C-24), 129.38 (C-20), 132.44 (C-25), 149.55 (C-17), 169.18 (C-21), 170.21 (OC(O)CH₃). Масс-спектр: m/z (I_rel, %): 654.440 [M+H]⁺ (100); 676.422 [M+Na]⁺ (55); 692.396 [M+K]⁺ (47).

4-(Пирролидин-1-ил)бут-2-ин-1-ил(Z)-2-((3S,4S,8S,10S,11R,14S,16S)-16-ацетокси-3,11-дигидрокси-4,8,10,14-тетраметилгексадекагидро-17H-цтклопента[a]фенантрен-17-илиден)-6-метилгепт-5-еноат (2). Светло-желтый порошок, выход 0.28 г (80%); т.пл. 93-95°C; [α]_D²⁰ -2.1° (c 1.12, CHCl₃). Спектр ЯМР ¹H (500.17 MHz, CDCl₃): 0.85 (д, 3H, CH₃, J 6.5 Hz, Н-28), 0.86 (с, 3H, CH₃, Н-18), 0.93 (с, 3H, CH₃, Н-19), 0.95-1.05 (м, 1H, CH₂, Н-6), 1.00-1.09 (м, 1H, CH₂, Н-7), 1.23 (д, 1H, CH₂, J 14.0 Hz, Н-15), 1.34 (с, 3H, CH₃, Н-30), 1.39-1.47 (м, 1H, CH₂, Н-1), 1.43-1.52 (м, 1H, CH, Н-5), 1.46-1.54 (м, 1H, CH, Н-9), 1.50-1.59 (м, 1H, CH₂, Н-6), 1.56 (с, 3H, CH₃, Н-27), 1.58-1.67 (м, 1H, CH₂, Н-7), 1.60-1.71 (м, 1H, CH₂, Н-2), 1.63 (с, 3H, CH₃, Н-26), 1.70-1.79 (м, 1H, CH₂, Н-12), 1.71-1.86 (м, 4H, CH₂, Н-6', Н-7'), 1.73-1.80 (м, 1H, CH₂, Н-2), 1.92 (с, 3H, OC(O)CH₃), 1.97-2.05 (м, 1H, CH₂, Н-23), 1.99-2.12 (м, 1H, CH, Н-4), 2.05-2.17 (м, 1H, CH₂, Н-15), 2.06-2.15 (м, 1H, CH₂, Н-1), 2.07-2.18 (м, 1H, CH₂, Н-23), 2.26 (д, 1H, CH₂, J 10.5 Hz, Н-12), 2.33-2.51 (м, 2H, CH₂, Н-22), 2.51-2.63 (м, 4H, CH₂, Н-5', Н-8'), 3.01 (д, 1H, CH, J 11.0 Hz, Н-13), 3.37-3.44 (м, 2H, CH₂, Н-4'), 3.58-3.69 (м, 1H, CH, Н-3), 4.20-4.32 (м, 1H, CH, Н-11), 4.57 (д, 1H, CH₂, J 15.3 Hz, Н-1'), 4.69 (д, 1H, CH₂, J 15.3 Hz, Н-1'), 5.04 (т, 1H, CH, J 6.5 Hz, Н-24), 5.78 (д, 1H, CH, J 6.5 Hz, Н-16). Спектр ЯМР ¹³C (125.78 MHz, СDCl₃): 15.99 (C-28), 17.57 (C-18), 17.71 (C-27), 20.91 (OC(O)CH₃), 21.07 (C-6), 23.41 (C-30), 23.48 (C-19), 23.72 (C-6', 7'), 25.70 (C-26), 28.38 (C-23), 28.90 (C-22), 29.87 (C-1, C-2), 31.51 (C-7), 35.37 (C-4), 35.55 (C-12), 36.59 (C-10), 36.77 (C-5), 38.91 (C-15), 39.42 (C-8), 43.10 (C-4'), 44.10 (C-13), 48.58 (C-14), 49.39 (C-9), 52.14 (C-1'), 52.43 (C-5', 8'), 67.94 (C-11), 71.28 (C-3), 74.38 (C-16), 78.25 (C-2'), 82.52 (C-3'), 123.06 (C-24), 129.49 (C-20), 132.45 (C-25), 149.44 (C-17), 169.21 (C-21), 170.22 (OC(O)CH₃). Масс-спектр: m/z (I_rel, %): 638.445 [M+H]⁺ (100); 660.427 [M+Na]⁺ (27); 676.402 [M+K]⁺ (27).

4-(4-Метилпиперазин-1-ил)бут-2-ин-1-ил(Z)-2-((3S,4S,8S,10S,11R,14S,16S)-16-ацетокси-3,11-дигидрокси-4,8,10,14-тетраметилгексадекагидро-17H-циклопента[a]фенантрен-17-илиден)-6-метилгепт-5-еноат (3). Светло-желтый порошок, выход 0.31 г (85%); т.пл. 108-110°C; [α]_D²⁰ -1.8° (c 0.95, CHCl₃). Спектр ЯМР ¹H (500.17 MHz, CDCl₃): 0.86 (т, 3H, CH₃, J 7.3 Hz, Н-28), 0.86 (с, 3H, CH₃, Н-18), 0.93 (с, 3H, CH₃, Н-19), 0.94-1.09 (м, 1H, CH₂, Н-6), 1.02-1.10 (м, 1H, CH₂, Н-7), 1.23 (д, 1H, CH₂, J 14.0 Hz, Н-15), 1.33 (с, 3H, CH₃, Н-30), 1.35-1.48 (м, 1H, CH₂, Н-1), 1.43-1.52 (м, 1H, CH, Н-5), 1.46-1.53 (м, 1H, CH, Н-9), 1.48-1.64 (м, 1H, CH₂, Н-6), 1.56 (с, 3H, CH₃, Н-27), 1.58-1.71 (м, 1H, CH₂, Н-2), 1.60-1.72 (м, 1H, CH₂, Н-7), 1.63 (с, 3H, CH₃, Н-26), 1.71-1.81 (м, 1H, CH₂, Н-12), 1.72-1.83 (м, 1H, CH₂, Н-1), 1.73-1.83 (м, 1H, CH₂, Н-2), 1.92 (с, 3H, OC(O)CH₃), 1.95-2.20 (м, 2H, CH₂, Н-23), 2.01-2.11 (м, 1H, CH, Н-4), 2.07-2.17 (м, 1H, CH₂, Н-15), 2.19-2.29 (м, 1H, CH₂, Н-12), 2.26 (с, 3H, CH₃, Н-9'), 2.31-2.58 (м, 2H, CH₂, Н-22), 2.33-2.49 (м, 4H, CH₂, Н-6', Н-7'), 2.46-2.72 (м, 4H, CH₂, Н-5', Н-8'), 3.01 (д, 1H, CH, J 10.5 Hz, Н-13), 3.24-3.35 (м, 2H, CH₂, Н-4'), 3.61-3.69 (м, 1H, CH, Н-3), 4.20-4.31 (м, 1H, CH, Н-11), 4.57 (д, 1H, CH₂, J 14.3 Hz, Н-1'), 4.67 (д, 1H, CH₂, J 14.3 Hz, Н-1'), 5.05 (т, 1H, CH, J 6.5 Hz, Н-24), 5.78 (д, 1H, CH, J 8.5 Hz, Н-16). Спектр ЯМР ¹³C (125.78 MHz, СDCl₃): 15.99 (C-28), 17.66 (C-18), 17.74 (C-27), 20.94 (OC(O)CH₃), 20.97 (C-6), 23.28 (C-19), 23.63 (C-30), 25.71 (C-26), 28.35 (C-23), 28.90 (C-22), 29.90 (C-2), 29.98 (C-1), 31.77 (C-7), 35.56 (C-12), 35.61 (C-4), 36.61 (C-5), 36.72 (C-10), 38.92 (C-15), 39.42 (C-8), 44.09 (C-13), 45.86 (C-9'), 47.02 (C-4'), 48.60 (C-14), 49.33 (C-9), 51.79 (C-5', 8'), 52.13 (C-1'), 54.83 (C-6', 7'), 68.01 (C-11), 71.25 (C-3), 74.38 (C-16), 79.01 (C-2'), 81.92 (C-3'), 123.07 (C-24), 129.53 (C-20), 132.47 (C-25), 149.44 (C-17), 169.19 (C-21), 170.23 (OC(O)CH₃). Масс-спектр: m/z (I_rel, %): 667.472 [M+H]⁺ (100); 689.454 [M+Na]⁺ (11); 705.429 [M+K]⁺ (18).

4-(Пиперидин-1-ил)бут2-ин-1-ил(Z)-2-((3S,4S,8S,10S,11R,14S,16S)-16-ацетокси-3,11-дигидрокси-4,8,10,14-тетраметилгексадекагидро-17H-циклопента[a]фенантрен-17-илиден)-6-метилгепт-5-еноат (4). Светло-желтый порошок, выход 0.26 г (75%); т.пл. 97-99°C; [α]_D²⁰ -2.5° (c 1.21, CHCl₃). Спектр ЯМР ¹H (500.17 MHz, CDCl₃): 0.85 (т, 3H, CH₃, J 6.5 Hz, Н-28), 0.85 (с, 3H, CH₃, Н-18), 0.92 (с, 3H, CH₃, Н-19), 0.99-1.09 (м, 1H, CH₂, Н-6), 1.02-1.11 (м, 1H, CH₂, Н-7), 1.18-1.26 (м, 1H, CH₂, Н-15), 1.32 (с, 3H, CH₃, Н-30), 1.35-1.40 (м, 2H, CH₂, Н-7'), 1.39-1.47 (м, 1H, CH₂, Н-1), 1.42-1.52 (м, 1H, CH, Н-5), 1.50-1.55 (м, 1H, CH, Н-9), 1.52-1.61 (м, 1H, CH₂, Н-6), 1.53-1.59 (м, 4H, CH₂, Н-6', Н-8'), 1.55 (с, 3H, CH₃, Н-27), 1.59-1.69 (м, 1H, CH₂, Н-7), 1.62 (с, 3H, CH₃, Н-26), 1.63-1.82 (м, 2H, CH₂, Н-2), 1.71-1.82 (м, 1H, CH₂, Н-1), 1.76 (т, 1H, CH₂, J 12.4 Hz, Н-12), 1.91 (с, 3H, OC(O)CH₃), 1.93-2.16 (м, 2H, CH₂, Н-23), 2.01-2.12 (м, 1H, CH, Н-4), 2.07-2.17 (м, 1H, CH₂, Н-15), 2.25 (д, 1H, CH₂, J 12.4 Hz, Н-12), 2.32-2.47 (м, 2H, CH₂, Н-22), 2.40-2.48 (м, 4H, CH₂, Н-5', Н-9'), 3.00 (д, 1H, CH, J 11.6 Hz, Н-13), 3.21-3.28 (м, 2H, CH₂, Н-4'), 3.63-3.68 (м, 1H, CH, Н-3), 4.26-4.31 (м, 1H, CH, Н-11), 4.57 (д, 1H, CH₂, J 15.2 Hz, Н-1'), 4.68 (д, 1H, CH₂, J 15.2 Hz, Н-1'), 5.04 (т, 1H, CH, J 6.4 Hz, Н-24), 5.77 (д, 1H, CH, J 8.1 Hz, Н-16). Спектр ЯМР ¹³C (125.78 MHz, СDCl₃): 16.00 (C-28), 17.57 (C-18), 17.72 (C-27), 20.93 (OC(O)CH₃), 21.06 (C-6), 23.46 (C-19), 23.47 (C-30), 23.68 (C-7'), 25.70 (C-26), 25.72 (C-6', 8'), 28.38 (C-23), 28.90 (C-22), 29.84 (C-1, C-2), 31.52 (C-7), 35.39 (C-4), 35.53 (C-12), 36.60 (C-10), 36.75 (C-5), 38.90 (C-15), 39.42 (C-8), 44.10 (C-13), 47.75 (C-4'), 48.58 (C-14), 49.38 (C-9), 52.16 (C-1'), 53.17 (C-5', 9'), 67.97 (C-11), 71.30 (C-3), 74.37 (C-16), 78.92 (C-2'), 82.09 (C-3'), 123.05 (C-24), 129.50 (C-20), 132.47 (C-25), 149.45 (C-17), 169.22 (C-21), 170.24 (OC(O)CH₃). Масс-спектр: m/z (I_rel, %): 652.461 [M+H]⁺ (100); 674.443 [M+Na]⁺ (22); 690.418 [M+K]⁺ (32).

Контроль реакции осуществляли методом ТСХ на пластинах Sorbfil (Сорбполимер, Краснодар, Россия), проявляли 10% раствором серной кислоты. Для колоночной хроматографии использовали силикагель L (50-160 мкм) марки КСКГ. Температура плавления определена на приборе РНМК 80/2617. Спектры ЯМР 1D (¹Н, ¹³С) и 2D (COSY, NOESY, HSQC, HMBC) сняты на спектрометре Bruker Avance 500 (125.78 МГц для ¹³С и 500.17 МГц для ¹Н) с использованием стандартных импульсных последовательностей фирмы Bruker, внутренний стандарт Me₄Si, растворитель - СDCl₃. Оптические углы измерены на поляриметре Perkin-Elmer 341. Масс-спектры получены на спектрометре Bruker Autoflex TM III Smartbeam с использованием матрицы 3-(4-гидрокси-3,5-диметоксифенил)проп-2-еновой кислоты (синапиновая кислота).

Пример 2. Изучение противоопухолевой активности. Клеточные линии A549 (карцинома легкого человека), MCF-7 (аденокарцинома молочной железы человека), SH-SY5Y (нейробластома человека), HepG2 (гепатоцеллюлярная карцинома человека) и HCT116 (рак толстой кишки человека) были приобретены в Российской коллекции клеточных культур в Институте цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия). Клетки A-549, MCF-7, HepG2, HCT116 и SH-SY5Y культивировали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM) (Invitrogen, США) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Sigma-Aldrich, Великобритания), 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS; Invitrogen, США), 50 мкг/мл сульфата гентамицина (Invitrogen, США) при 37°С в 5% СО₂ и 95% влажности. Соединения растворяли в 100% ДМСО (Sigma-Aldrich, Великобритания), получая рабочие растворы тестируемых веществ одинаковой концентрации - 100 мМ, которые разбавляли в заполненных DMEM планшетах непосредственно перед анализом. ДМСО поддерживали в конечной концентрации 0.1%.

Для анализа жизнеспособности клеток их культивировали при соответствующей плотности в 96-луночных планшетах (1.2×10⁴ клеток/лунку для A-549; 1.2×10⁴ клеток/лунку для MCF-7; 3×10⁴ клеток/лунку для SH-SY5Y; 1.5×10⁴ клеток/лунку для HepG2; 1×10⁴ клеток/лунку для HCT116) и оставляли для роста на 24 часа. После этого клетки обрабатывали соединениями (1) - (4) в конечных концентрациях 1, 10, 100 мкМ в течение 48 ч и определяли жизнеспособность клеток с помощью стандартного МТТ-анализа по инструкции производителя (Thermo Fisher Scientific) измерением поглощения при 590 нм с использованием микропланшетного ридера «2300 EnSpire® Multimode Plate Reader» (Perkin-Elmer). Концентрацию соединений, подавляющих на 50% жизнеспособность клеток (значение IC₅₀), рассчитывали с помощью нелинейного регрессионного анализа (GraphPad Prism v.5.02; GraphPad Software Inc.). Жизнеспособность контрольной группы (клетки, обработанные 0.1% ДМСО) принимали за 100%, а жизнеспособность обработанных групп определяли путем сравнения ее оптической плотности с контролем. Данные были выражены как среднее ± S.E.M., рассчитанное на основе двух независимых экспериментов, проведенных в трех повторах. В аналогичных условиях обрабатывали клетки фторурацила в качестве положительного контроля для анализа МТТ. Результаты исследований приведены в табл. 1.

Таблица 1. Цитотоксическая активность соединений (1)-(4) и фузидовой кислоты. Comp. IC₅₀, мкM HepG2 SH-SY5Y MCF-7 A549 HCT-116 1 12.66±0.34 19.01±0.69 16.08±0.41 12.97±0.75 9.98±0.49 2 4.27±0.72 11.62±0.25 12.32±0.04 4.47±0.25 6.74±0.07 3 5.85±0.53 11.46±0.01 8.85±0.24 8.44±0.07 6.35±0.30 4 11.28±0.29 13.33±0.19 15.28±0.58 9.40±1.29 9.47±0.08 Fusidic acid >100 >100 >100 >100 >100 Fluorouracil 4.31±0.3 2.56±0.46 3.32±0.28 2.29±0.08 3.48±0.76

Анализ результатов противоопухолевого скрининга показал, что производные фузидовой кислоты (1) - (4) обладали выраженной цитотоксической активностью в отношении тестируемых клеточных линий со значениями IC₅₀ в пределах 4,2 - 19 мкМ, в то время как у самой ФК такая активность отсутствовала. Как следует из табл. 1, соединения по способности ингибировать выживание клеток можно расположить в следующем порядке: (2) × (3) × (4) × (1). Среди синтезированных производных аналог ФК с пирролидинметиленовым заместителем (2) проявлял выраженную цитотоксичность по отношению к клеткам HepG2, HCT-116 и A549 со средними значениями IC₅₀ ниже 7 мкМ и близкими к значениям эталонного соединения фторурацила. Основания Манниха с фрагментами морфолина (1), N-метилпиперазина (3) и пиперидина (4) были менее эффективны, хотя все еще активны, со значениями IC₅₀ в диапазоне 5.8-19 мкМ, в зависимости от клеточной линии.

Таким образом, основания Манниха (1) - (4) продемонстрировали высокую противоопухолевую активность in vitro в отношении пяти линий раковых клеток человека: HepG2, HCT-116, SH-SY5Y, MCF-7 и A549.

Изобретение относится к области медицины, и раскрывает применение оснований Манниха на основе фузидовой кислоты формулы (1) - (4) в качестве соединений, проявляющих высокую противоопухолевую активность in vitro в отношении пяти линий раковых клеток человека HepG2, HCT-116, SH-SY5Y, MCF-7 и A549. Техническим результатом изобретения является обеспечение высокой противоопухолевой активности in vitro в отношении пяти линий раковых клеток человека: HepG2, HCT-116, SH-SY5Y, MCF-7 и A549. 1 табл., 2 пр.

Применение оснований Манниха на основе фузидовой кислоты формулы (1) - (4) в качестве соединений, проявляющих высокую противоопухолевую активность in vitro в отношении пяти линий раковых клеток человека HepG2, HCT-116, SH-SY5Y, MCF-7 и A549.