СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДЕРМАТОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2023 года по МПК A61K38/18 A61P17/02 

Описание патента на изобретение RU2799211C2

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение предоставляет средство, подходящее для лечения и профилактики дерматологических нарушений, включая, без ограничения таковыми, язвенные нарушения кожи.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Кожные заболевания, включая хронические раны, такие как язвы, включают язвы на поверхности кожи или слизистой оболочке, часто сопровождающиеся распадом ткани. Как правило, такие кожные заболевания могут привести к потере эпидермиса, а часто и отдельных участков дермы и даже подкожного жира. Такие кожные заболевания могут быть вызваны множеством факторов, например, без ограничения таковым, нарушением кровообращения. Кожные язвы часто встречаются у людей, в том числе у пациентов с диабетом (Ndip et al., 2012, Int. J. Gen. Med., Том 5, стр. 129-134). Такие кожные заболевания представляют собой серьезную медицинскую и социальную проблему.

В настоящее время не существует подходящего лечебного лечения дерматологических заболеваний этого типа. Согласно текущим данным, пациенты должны лечиться месяцами, а иногда и годами, что приводит к значительным экономическим затратам и высокой нагрузки для пациентов и общества (Buchberger et al., 2010, GMS Health Technol. Assess., vol. 1(6), doc. 12). В некоторых случаях альтернативные меры, такие как снижение давления за счет использования разгрузочных механических устройств, являются основным вариантом лечения таких заболеваний (Ndip et al., 2012, Int. J. Gen. Med., Vol. 5, p. 129-134), но такие альтернативные меры вообще не обеспечивают лечения.

Кожные заболевания часто возникают у пациентов с диабетом: диабет часто встречается в современном обществе, и есть статистические данные, что у каждого четвертого пациента с диабетом в течение жизни разовьется кожное заболевание, в частности язва стопы (Ndip et al., 2012, Int. J. Gen. Med., vol. 5, p. 129-134). Такое расстройство часто требует длительного пребывания в больнице, реабилитации, ухода на дому и социальных услуг. Таким образом, язвы, возникшие в результате диабета, представляют собой серьезную проблему, оказывающую огромное влияние на общее глобальное бремя болезней ввиду растущей распространеннности диабета и отсутствия вариантов лечения, в настоящее время являющихся достаточными как для субъектов, так и для общества.

В поисках лечебной обработки в прошлом предлагалось использрвание некоторых факторов роста человека для терапии и потенциального лечения кожных заболеваний, но сейчас принято считать, что существуют только ограниченные доказательства, подтверждающие эффективность использования факторов роста человека при лечении кожных язв (Ndip et al., 2012, Int. J. Gen. Med., vol. 5, p. 129-134). Одним из примеров фактора роста, который в прошлом предлагался для лечения кожных заболеваний, является фактор роста, полученный из тромбоцитов (беклапермин, торговая марка Regranex), но было обнаружено, что его введение связано с серьезными побочными эффектами, включая злокачественные новообразования (Buchberger et al., 2010, GMS Health Technol. Assess., vol. 1(6), doc. 12; https://www.rxlist.com/regranex-side-effects-drug-center.htm#professional). Другим протестированным вариантом является гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), но было обнаружено, что G-CSF существенно не влияет на вероятность разрешения инфекции или заживления ран (Cruciani et al., 2005, Diabetes Care, vol. 28, p. 454-460). Еще одним примером, предложенным в ходе исследований, является фактор эпидермального роста (EGF), который, по предположению, первоначально оказывает неожиданное положительное лечебное действие (например, WO/2003/075949 A1), но лечение на основе EGF по факту оказалось коммерчески недоступным, что позволяет предположить, что первоначальные надежды, возлагаемые на этого агента, не оправдались. В качестве альтернативы, человеческий фактор роста нервов (hNGF), который, как предполагалось, обладает проангиогенными свойствами и облегчает заживление ран (Graiani et al., 2004, Diabetologia, vol. 47, p. 1047-1054), был предложен для лечения определенных нейрофатических клинических состояний, но клинические испытания дали притиворечивые результаты (Apfel et al., 2000, J. Amer. Med. Assoc., vol. 284, p. 2215-2221), и, как следствие, основанное на NGF лекарственное средство не было разработано (см., например, https://www.gene.com/media/press-releases/4875/1999-04-08/phase-iii-trial-with-nerve-growth-factor). Например, хотя Graiani et al. конкретно не обсуждает аллогенный эффект NGF, общеизвестно, что человеческий NGF вызывает болевые ощущения (Dyck et al. 1997, Neurology, vol. 48, p. 501-505; Svensson et al., 2003, Pain, vol. 104, с. 241-247). В результате человеческий NGF не был одобрен как подходящее терапевтическое средство для лечения кожных язв; среди прочего, из-за его боль-продуцирующей активности и/или недостаточной эффективности в переносимых дозах. Следовательно, учитывая, что лечение, основанное на факторах роста, имело ограниченный успех, недостаточно доказательств излечения, и, помимо прочего, из-за нежелательных побочных эффектов, медицинское сообщество продолжало поиск других потенциальных лекарств. На основании вышеизложенного в последнее время для лечения некоторых кожных язв были предложены интерлейкины и другие молекулы, не являющиеся факторами роста. Например, Genentech предложил производные интерлейкинов, в частности r-интерлейкин 22, который, как предполагается, играет роль в модуляции иммунной системы, и, возможно, является подходящим для лечения или профилактики кожных язв, включая диабетические кожные язвы (см., например, https://www.gene.com/stories/mechanisms-of-healing), но такое лекарство недоступно для пациентов, и в настоящее время неизвестно, может ли это со временем измениться.

Таким образом, все еще существует потребность в эффективном лечении кожных заболеваний, при отсутствии побочных эффектов, например, полностью непереносимых или иным образом нежелательных побочных эффектов, вызываемых терапевтическим средством, подходящем для этих целей и доступном для практикующих врачей, обладающем надежной и приемлемой чистотой для введения млекопитающим, включая человека.

Проблема, подлежащая решению

Основной целью изобретения является предоставление лечения или профилактики дерматологических расстройств, включая язвы, не вызывающих нежелательных или болезненных побочных эффектов у диабетических и недиабетических субъектов. Также желательно предоставить терапевтически активный агент с достаточным выходом и чистотой, чтобы такое лечение стало возможным. Таким образом, цель настоящего изобретения включает устранение проблем, определенных на данном уровнем техники. Конкретные цели включают обеспечение надежного способа лечения субъекта с дерматологическим заболеванием без нежелательных побочных эффектов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к полипептиду для применения при лечении и/или профилактике дерматологического заболевания у млекопитающего, где полипептид выбран из полипептида SEQ ID NO: 3 и полипептида SEQ ID NO: 4. Эти полипептиды характеризуются мутацией аминокислотной последовательности человеческого NGF (SEQ ID NO: 2), при этом указанная мутация связана со сниженной ноцицептивной активностью. В частности, аргинин в положении 100 hNGF замещен глутаминовой кислотой.

Особенно предпочтительным полипептидом является полипептид SEQ ID NO: 4. Указанный полипептид характеризуется, по меньшей мере, отсутствием пролина в положении 61, а более предпочтительно, заменой пролина в положении 61 другой аминокислотой. В SEQ ID NO: 4 пролин в положении 61 SEQ ID NO: 3 заменен серином.

Предпочтительно, чтобы субъектом-млекопитающим являлся человек.

Предпочтительно дерматологическое заболевание характеризуется поврежденной поверхностью по меньшей мере части тела субъекта. Предпочтительно, дерматологическое заболевание характеризуется поврежденной поверхностью. Более предпочтительно, дерматологическое заболевание представляет собой поражение кожи, предпочтительно характеризующееся по меньшей мере частичным разрушением дермы, хотя это и необязательно.

Предпочтительно, дерматологическое заболевание состоит из, по меньшей мере, одной язвы, предпочтительно выбранной из группы, состоящей из диабетических язв, травматических язв, хирургических язв, пролежней, хронических язв и комбинаций любых из этих язв. В альтернативных, но не взаимоисключающих вариантах дерматологическое заболевание также включает ожог или механическое повреждение.

Предпочтительно млекопитающее, предпочтительно человек, страдает сахарным диабетом или имеет предрасположенность к сахарному диабету. В типичных вариантах осуществления сахарный диабет выбирается из сахарного диабета 1 типа и сахарного диабета 2 типа.

В одном варианте осуществления полипептид вводят однократно.

В альтернативном и более предпочтительном варианте полипептид вводят несколько раз. В особенно предпочтительном варианте полипептид вводят повторно от одного до пяти раз в день, предпочтительно два раза в день.

В одном варианте полипептид вводят повторно до заживления поврежденной поверхности тела. Альтернативно, полипептид вводят повторно в течение периода от трех до 30 дней, предпочтительно от семи до 14 дней. Необязательно, введение прекращают после завершения указанного интервала.

В одном варианте осуществления полипептид вводят субъекту с диабетической нейропатической язвой стопы (DFU), предпочтительно расположенной ниже лодыжки.

Предпочтительно, полипептид предназначен для местного применения. Более предпочтительно, полипептид наносят на поверхность поврежденной части тела.

Предпочтительно, доза вводимого полипептида определяется из расчета площади поврежденной поверхности тела, подлежащей лечению. Предпочтительно такое определение проводят в начале лечения. В одном варианте осуществления дозировка корректируется для более позднего введения в зависимости от поверхности поврежденной поверхности тела на момент времени такого более позднего введения. В альтернативном варианте осуществления дозировка не корректируется для более позднего введения, так что доза введения зависит исключительно от поверхности поврежденной поверхности тела, подлежащей лечению в начале лечения (первая дозировка), и последующие дозировки соответствуют первой дозе.

В одном варианте осуществления доза/каждая доза имеет количество от 0,3 до 6 мкг полипептида на мм2 обрабатываемой поврежденной поверхности тела (от 0,3 до 6 мкг/мм2).

В одном осуществлении, полипептид содержится в водной среде, и в водной среде вводится млекопитающему.

Предпочтительно, чтобы лечение и/или профилактика не вызывали гипералгезии у млекопитающего.

В одном варианте осуществления полипептид SEQ ID NO: 3 или полипептид SEQ ID NO: 4 можно получить из биологического источника. Это может включать очистку, то есть отделение такового от других молекул, включая другие белки, такие как белки клетки-хозяина. Необязательно, полипептид SEQ ID NO: 3 или полипептид SEQ ID NO: 4 может быть получен в процессе, который включает (ре)фолдинг и/или хроматографическую очистку, и/или расщепление протеазой, возможно, доведение до конечной концентрации белка и/приготовление желаемого препарата. В одном варианте осуществления полипептид можно получить путем рекомбинантной экспрессии и очистки, где очистка включает очистку в смешанной стационарной фазе.

Таким образом, настоящее изобретение также предоставляет полипептид SEQ ID NO: 3 и полипептид SEQ ID NO: 4 из рекомбинантного источника: очищенный, как описано здесь, для использования в способе лечения поверхностей тела человека или животного с помощью терапии, как описано здесь.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Это описание в целом, вместе с формулой изобретения и чертежами, раскрывает конкретные и/или предпочтительные варианты осуществления и варианты индивидуальных свойств изобретения. Настоящее изобретение также рассматривает в качестве особенно предпочтительных вариантов осуществления те варианты осуществления, которые создаются путем объединения двух или более конкретных и/или предпочтительных вариантов осуществления и вариантов, описанных в данном документе для настоящего изобретения. Таким образом, настоящее раскрытие также включает все объекты, соединения, признаки, этапы, способы или композиции, упомянутые или указанные в данном описании, индивидуально или в сочетании, и любые или все комбинации таковых, или любые два или более из указанных объектов, соединений, признаков, этапов, способов или композиций. Таким образом, если в данном документе специально не указано иное или контекст не требует иного, ссылка на один объект, соединение, признак, этап, способ или композицию должна охватывать как один, так и множество (то есть более одного, например, два или более, три или более или все) этих объектов, соединений, признаков, этапов, способов или композиций. Если специально не указано иное или контекст не требует иного, каждый вариант осуществления, аспект и пример, раскрытые в данном документе, следует рассматривать как применимый к любому другому варианту осуществления, аспекту или примеру, раскрытому в данном документе, или осуществимый в комбинации с таковым.

Специалист в данной области техники поймет, что описанное здесь изобретение допускает изменения и модификации, отличные от конкретно описанных. Таким образом, настоящее раскрытие не ограничено в объеме конкретными вариантами осуществления, описанными в данном документе, а также представленными в данном документе в целях иллюстрации и пояснения. Функционально или иным образом все эквивалентные объекты, соединения, особенности, стадии, способы или композиции включены в объем настоящего раскрытия. Для специалиста в данной области техники будет очевидно, что настоящее раскрытие включает все варианты и модификации сущностей, соединений, признаков, этапов, способов или композиций, описанных здесь.

Каждая из приведенных здесь ссылок (включая все патенты, заявки на патенты, научные публикации, спецификации производителя, инструкции, презентации и т.д., приведенных в тексте), полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. Ничто в данном документе не должно толковаться как признание того, что настоящее изобретение не имеет права предшествовать определенному учению, и/или как признание того, что конкретная ссылка, кроме общеизвестных, не содержит информации, достаточно ясной и полной, чтобы ей не мог воспользоваться специалист в данной области техники.

Как правило, если специально не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области (например, в медицине, дерматологии, неврологии, генетике, молекулярной биологии, экспрессии генов, клеточной биологии, культурах клеток, иммунологии, нейробиологии, хроматографии, химии белков и биохимии). Опубликованные учебники и обзорные статьи, например, на английском языке, обычно определяют значение, обычно понимаемое специалистом в данной области техники.

Выражение «и/или», например, «X и/или Y» должно пониматься как означающее «X и Y» или «X или Y» и должно рассматриваться как обеспечивающее явное раскрытие «и», «или», а также обоих значений одновременно (и «и» и «или»).

В контексте настоящего описания, если не указано иное, термины «примерно», «приблизительно». и «по существу» все означают «приблизительно» или «почти», а в контексте числового значения или диапазона, изложенного в данном документе, предпочтительно обозначают +/- 10%, более предпочтительно +/- 5% от числового значения или диапазона, указанного или заявленного.

Если прямо не указано иное, слово «содержать», или варианты такового, такие как «содержит» или «содержащий», используются в контексте настоящего документа для указания, что дополнительные элементы могут необязательно присутствовать в дополнение к элементам списка, введенным словом «содержащий». Однако в качестве конкретного варианта осуществления настоящего изобретения предполагается, что термин «содержащий» охватывает возможность отсутствия дополнительных элементов, т.е. для целей конкретного варианта осуществления термин «содержащий» следует понимать как имеющий значение «состоящий из».

Если специально не указано иное, все указания относительных количеств в отношении настоящего изобретения сделаны на основе вес/вес. Указания относительных количеств компонента, характеризующегося общим термином, предназначены для обозначения общего количества всех конкретных вариантов или элементов, охватываемых указанным общим термином. Если определенный компонент, определенный общим термином, указан как присутствующий в определенном относительном количестве, и если этот компонент дополнительно охарактеризован как конкретный вариант или элемент, охватываемый общим термином, то это означает, что никаких других вариантов или элементов, охватываемых общим термином, не присутствует дополнительно таким образом, чтобы общее относительное количество компонентов, охватываемых общим термином, превышало указанное относительное количество; более предпочтительно, чтобы другие варианты или элементы, охватываемые общим термином, вообще не присутствовали.

Все описанные здесь способы и процессы могут выполняться в любом подходящем порядке, если в данном документе не указано иное или если контекст явно не диктует иное.

Используемый здесь термин «агент», если не указано иное, обычно относится к соединению или композиции, предпочтительно к соединению. Агент способен оказывать действие на живой организм и/или на клетку живого организма или происходить из живого организма, например, как воздействующий на клетку и/или на ткань тела, или на окружающую среду. Физическое состояние агента конкретно не ограничивается и, если не указано иное, таковой может находиться в газообразном, жидком и/или в твердом состоянии. Тип агента особо не ограничивается, если не указано иное, и, таким образом, агент может быть химическим веществом и/или биомолекулой, такой как белок или нуклеиновая кислота. Определенные здесь агенты используются в настоящем изобретении.

«Неблагоприятный эффект», как используется здесь, представляет собой нежелательный негативный эффект, возникающий в результате введения агента (лекарственного средства) субъекту. Побочные эффекты включают, без ограничения, увеличение поражения, смертность, гипералгезический синдром, боль, изменение массы тела, уровней ферментов, потерю функции или любое патологическое изменение, обнаруживаемое на микроскопическом, макроскопическом или физиологическом уровне. Неблагоприятные эффекты могут вызвать обратимые или необратимые изменения, включающие повышение или снижение восприимчивости человека к другим химическим веществам, продуктам питания или процессам, таким как лекарственные взаимодействия.

Используемые здесь термины «хроматография», «хроматографический» и т.п. обычно относятся к методике, подходящей для разделения смеси, при которой смесь добавляют к нежидкому материалу, называемому «стационарная фаза», с целью разделения, по меньшей мере, частично, одного или нескольких компонентов смеси. С этой целью стационарная фаза может подвергаться воздействию жидкости и/или смесь может быть растворена в жидкости; указанная жидкость, контактирующая со стационарной (неподвижной) фазой, также может называться «подвижной фазой». В общем, любая стадия, которая «выполняется с помощью хроматографии», как описано в данном документе, может быть синонимично обозначена как «хроматографическая стадия».

Используемый здесь термин «подвижная фаза» имеет значение, обычно используемое в данной области, и может относиться ко всем жидкостям, приведенным в контакт со стационарной (неподвижной) фазой во время хроматографии, то есть к промывочным жидкостям, а также к жидкостям (смесям), содержащим белки, представляющие интерес, такие как один или несколько белков, описанных в данном документе. В настоящем изобретении смесь, подвергнутая хроматографии, как определено в данном документе, обычно включает один или несколько белков, таких как, в частности, белки, описанные в настоящем документе, такие как полипептиды SEQ ID NO: 3 или 4, предшественники любого из них, протеазы и/или белки клетки-хозяина (HCP).

«Стационарная фаза» обычно включает основную матрицу, которая представляет собой нерастворимый в воде материал, обычно находящийся в форме частиц или геля, такого как смола. Во многих случаях, включая варианты осуществления, описанные в данном документе, стационарная фаза включает основную матрицу и фрагменты, которые могут связываться по меньшей мере с одним компонентом, входящим в смесь, подлежащую хроматографии. Основная матрица обычно представляет собой нерастворимый в воде материал, обычно в форме частиц или геля. Неограничивающими примерами основных матриц являются сефароза и агароза, например, очень жесткая агароза.

«Хроматографическая стадия» в контексте настоящего описания относится к действию добавления к хроматографическому материалу (предпочтительно стационарной (неподвижной) фазе) жидкости, содержащей по меньшей мере одно соединение, подлежащее анализу и/или очистке, которое предпочтительно является белком (и в контексте настоящего изобретения указанный белок наиболее предпочтительно представляет собой полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4); возможно промывание хроматографического материала одним или несколькими промывочными растворами и элюирование, по меньшей мере, одного указанного соединения. В этом контексте процесс, характеризующийся двумя хроматографическими стадиями, предоставленный для иллюстрации, отличается тем, что жидкость, содержащая, по меньшей мере, одно такое соединение, подлежащее анализу и/или очистке, добавляется к первому хроматографическому материалу, как описано выше, и, после элюирования, жидкость, содержащую по меньшей мере одно такое соединение, добавляют ко второму хроматографическому материалу, из которого оно также элюируется, как описано выше. Цель любой «хроматографической стадии» состоит в том, чтобы по крайней мере один компонент, содержащийся в смеси, нанесенной на стационарную (неподвижную) фазу, предпочтительно используемой в хроматографии, связался со стационарной (неподвижной) фазой. Такое соединение может быть одним или несколькими белками, описанными здесь. Соединение может быть извлечено из стационарной фазы, например заменой подвижной фазы и/или продолжающимся воздействием подвижной фазы с течением времени.

Термин «связывает», когда он используется по отношению к хроматографии, например для описания связывающей способности стационарной (неподвижной) фазы, особо не ограничивается, но обычно относится к нековалентному связыванию. Таким образом, обычно, по меньшей мере, один компонент, содержащийся в смеси, такой как, по меньшей мере, один белок, нековалентно связывается с неподвижной фазой. Хроматографическая стадия необязательно, но предпочтительно включает промывку неподвижной фазы, с которой связан по меньшей мере один компонент. По меньшей мере, один компонент может представлять собой, по меньшей мере, один белок, такой как один белок, описанный здесь.

Используемый здесь термин «гетерологичный» описывает нечто, состоящее из множества различных элементов.

Термины «дисульфид» и «дисульфидная связь» используются в контексте настоящего изобретения в значениях, обычно используемых в данной области техники. В общем и целом, «дисульфид» относится к функциональной группе со структурой R-S-S-R'. Связь также называется «SS-связью» и обычно образуется путем сочетания двух тиоловых групп. Дисульфидные связи в белках образуются между тиоловыми группами остатков цистеина в процессе окислительного свертывания; такая специфическая дисульфидная связь между тиоловыми группами двух остатков цистеина также может называться «дисульфидным мостиком». Не полагаясь на какую-либо конкретную теорию, в данной области обычно понимают, что в эукариотических клетках дисульфидные мостики образуются в просвете эндоплазматического ретикулума (и митохондриальном межмембранном пространстве), но не в цитозоле, а в случае прокариот дисульфидные мостики образуются в периплазме (соответствующих организмов, в частности грамотрицательных бактерий); дисульфидные мостики также могут быть обнаружены в белках внеклеточной среды как эукариотических, так и прокариотических клеток.

Термины «экспрессировать», «экспрессия», «экспрессированный», «экспрессия гена» и т.п., используемые в данном документе, относятся к преобразованию информации гена в функциональный продукт гена в ходе синтеза. Экспрессия гена включает, по меньшей мере, транскрипцию и, необязательно, включает одну или более дополнительных функций, необязательно выбранных из списка, включающего трансляцию и посттрансляционную модификацию, без ограничения таковыми. В контексте рекомбинантной экспрессии белка в клетке-хозяине этот термин обычно означает, что белок продуцируется клеткой-хозяином (в любом компартменте клетки и/или секретируется, и/или включается в тельца включения), если только контекст не диктует иное.

Используемый здесь термин «гетерологичный» описывает нечто, состоящее из множества различных элементов или полученное из дугих источников. Например, в нечеловеческой клетке-хозяине, содержащей человеческий ген (или ген, кодирующий неприродный полипептид, такой как полипептид по изобретению), указанный ген является «гетерологичным» по отношению к клетке, и клетка может быть способна к «гетерологичной» экспрессии соответствующего гена. Гетерологичная экспрессия гена также может называться «рекомбинантной».

Термин «тельца включения» имеет значение, обычно используемое в данной области, и предназначен для обозначения агрегатов или частиц, обнаруженных в цитозоле или в периплазме клетки-хозяина; тельца включения обычно содержат белок, такой как, в частности, белок, рекомбинантно экспрессируемый в клетке-хозяине. Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, следует понимать, что в области рекомбинантной экспрессии тельца включения обычно содержат рекомбинантно экспрессируемый белок, а также относительно небольшие количества белков клетки-хозяина (HCP), рибосомных компонентов или фрагментов ДНК/РНК. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, следует понимать, что тельца включения обычно содержат, по меньшей мере частично, белок, который неправильно свернут (неправильно свернутый белок), в частности неправильно свернутый рекомбинантно экспрессируемый белок. Понятно, что тельца включения обычно содержат белок в неправильно свернутой форме, то есть в контексте настоящего изобретения они обычно включают полипептид в соответствии с настоящим изобретением и/или его предшественник в неправильно свернутой форме. Термин «неправильно свернутый» обычно описывает биомолекулу, такую как нуклеиновая кислота или полипептид, которая не находится в нативной конформации, то есть находится в неправильно свернутой форме.

Под «изолированным» подразумевается материал, который по существу или практически не содержит компонентов, обычно сопровождающих таковой в нативном состоянии. Например, «изолированный пептид» или «изолированный белок» в контексте настоящего описания относится, соответственно, к пептиду или белку, очищенному от клеточной и внеклеточной среды, такой как ткань, окружающей таковой в нативной среде, т.е. к пептиду или белку, выделеннному, например, из клетки, в которой он был экспрессирован, например, из клетки-хозяина. Альтернативно, «выделенный пептид» или «выделенный белок» и т.п. в контексте настоящего описания относятся к выделению in vitro и/или очистке пептида или белка, соответственно, из его нативного клеточного окружения и изолированного от ассоциации с другими компонентами среды, в которой обычно находится пептид или белок. В другом примере «изолированная клетка» в контексте настоящего описания относится к клетке, которая была очищена от клеточной и внеклеточной среды, такой как ткань или клеточные колонии, окружающие таковую в ее естественном состоянии, например, к клетке-хозяину, удаленной из окружающей среды, обычно прилегающей к клетке. В соответствии с приведенным выше определением термина «изолированный», «изолировать», как используется в данном документе, является термином, описывающим деятельность по получению «изолированного» материала, такого как, например, изолированная клетка или изолированный пептид или белок.

Термины «мульти» и «несколько» в контексте настоящего описания означают множество, то есть любое количество, состоящее из двух или более.

Используемый здесь термин «мутация» относится к изменению нуклеотидной последовательности генома организма, вируса, внехромосомной ДНК или других генетических элементов. Термин также распространяется на мутации аминокислотной последовательности, в частности, аминокислотной последовательности гена, несущего, по крайней мере, одну мутацию, не являющуюся сайленс-мутацией. Если не указано иное, мутация нуклеотидной последовательности является постоянным изменением. Мутации, присутствующие в зародышевой линии, обычно наследуются. В общем и целом, мутация нуклеотидной последовательности может привести к множеству различных типов изменений последовательностей: мутации в генах могут либо не иметь эффекта, либо изменять продукт гена, либо препятствовать правильному или полному функционированию гена. Мутации также могут присутствовать в негенных областях. Если не указано иное, последовательность дикого типа используется в качестве эталонной последовательности для описания мутации. Таким образом, например, если говорится, что данный мутант характеризуется мутацией в положении 100 полипептидной последовательности, то это указывает на то, что в положении 100 мутант не имеет того же аминокислотного остатка, как полипептид дикого типа. Конкретные типы мутаций нуклеотидной последовательности и/или аминокислотной последовательности включают изменения, такие как делеции, замены, добавления, инсерции и варианты сплайсинга. «Делеция» в отношении нуклеотидной последовательности относится к отсутствию одного или нескольких нуклеотидов в нуклеотидной последовательности. «Делеция» в отношении аминокислотной последовательности относится к отсутствию одного или нескольких аминокислотных остатков в полипептиде. «Добавление» в отношении нуклеотидной последовательности относится к наличию одного или нескольких дополнительных нуклеотидов в нуклеотидной последовательности. «Добавление» в отношении аминокислотной последовательности относится к наличию одного или нескольких дополнительных аминокислотных остатков в соответствующем полипептиде. «Замена» в отношении нуклеотидной последовательности относится к замене одного или нескольких нуклеотидов на другой(ие) нуклеотид(ы) в нуклеотидной последовательности. «Замена» в отношении аминокислотной последовательности относится к замене одного или нескольких аминокислотных остатков на другие аминокислотные остатки в полипептиде. Добавления, делеции и замены нуклеотидной последовательности, например в открытой рамке считывания, могут находиться на 5’-конце, 3’-конце и/или внутри гена. Добавления, делеции и замены полипептида могут находиться на аминоконце, карбокси-конце и/или внутри полипептида. «Инсерция» в отношении нуклеотидной последовательности и/или полипептидной последовательности представляет собой добавление одного или нескольких нуклеотидов или одного или нескольких аминокислотных остатков соответственно, именно внутрь соответствующей последовательности. Термин «вариант сплайсинга» используется для описания того варианта, когда РНК, кодирующая полипептидную последовательность, сплайсируется иначе, чем соответствующая РНК дикого типа, обычно в результате мутации на уровне нуклеиновой кислоты, обычно приводящей к продукту трансляции полипептида, который отличается от полипептида дикого типа. Термин «вариант сплайсинга» можно использовать не только в отношении соответствующей РНК, но также в отношении соответствующей последовательности матричной ДНК (обычно геномной ДНК) и в отношении последовательности полипептида, кодируемого такой РНК. Термин «мутантный» обычно предназначен для обозначения последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, отличающихся от последовательности дикого типа. Таким образом, мутантная последовательность нуклеиновой кислоты или мутантная аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере одну мутацию по отношению к соответствующей последовательности дикого типа. В случаях, когда существуют полиморфизмы в последовательности нуклеиновой кислоты, которые, тем не менее, не отражаются на уровне соответствующего кодируемого полипептида (молчащие (сайленс) мутации, вырожденность генетического кода), термин «мутант» на уровне нуклеиновой кислоты конкретно относится только к тем вариантам нуклеиновой кислоты, которые кодируют мутантный полипептид. Мутанты могут содержать различные комбинации мутаций, по отдельности или в комбинации, включающей более одной мутации и/или разные типы мутаций.

Термин «фактор роста нервов», сокращенно «NGF» или «бета-NGF» обозначает нейротрофический фактор и нейропептид, участвующие в регуляции роста, поддержания, пролиферации и выживания определенных нейронов и других клеток в соответствии с общепринятыми значениями терминов в данной области техники (см., например, Levi-Montalcini, 2004, Progress in Brain Research, vol. 146, p. 525-527). Если контекст не диктует иное, термин «фактор роста нервов» обозначает только NGF дикого типа и не включает полипептиды SEQ ID NO: 3 или 4 NGF дикого типа, представляет собой 2,5S, 26-кДа бета-субъединицу, образующуюся из предшественника NGF, которая является биологически активной: NGF дикого типа связывается по меньшей мере с двумя классами рецепторов: киназой A тропомиозинового рецептора (TrkA) и рецептором NGF с низким сродством (LNGFR/p75NTR). Термин «NGF», если не указано иное, относится к NGF любых видов, предпочтительно видов млекопитающих; однако наиболее предпочтительным является человеческий NGF. «hNGF», как используется здесь, означает человеческий NGF. Если контекст не диктует иное, термины «NGF» и «hNGF» относятся к NGF дикого типа, т.е. hNGF означает NGF дикого типа. Аминокислотная последовательность человеческого NGF дикого типа соответствует положениям 121-239 SEQ ID NO: 1 (серый цвет на Фиг. 24). Последовательности нечеловеческого NGF доступны, например, в научной литературе с помощью алгоритма поиска последовательностей, такого как BLAST, при использовании положений 121-239 SEQ ID NO: 1 в качестве точки ввода, а также в общедоступных базах данных белков, таких как Swissprot.

Термины «мутеин NGF» и «мутеин NGF» или, со ссылкой на NGF «мутеин такового», используются здесь взаимозаменяемо для обозначения полипептида, который характеризуется по меньшей мере одной мутацией по сравнению с NGF дикого типа, как далее подробно описано здесь. Полипептиды SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 являются мутеинами NGF. Предпочтительно, мутеин NGF имеет от 80 до 99,5% идентичности последовательности с NGF, особенно с человеческим NGF, более предпочтительно, мутеин имеет от 90 до 99% идентичности последовательности с NGF, особенно с человеческим NGF.

Термины «зрелая часть», «зрелый фрагмент» по отношению к NGF используются взаимозаменяемо с термином «бета-NGF» и относятся к полипептиду NGF, который отличается тем, что не содержит пропептид (и, следовательно, не содержит пре-пропептид) NGF. По аналогии, термин «зрелая часть» также используется для обозначения полипептидов SEQ ID NO: 3 или 4, поскольку эти полипептиды также не содержат пропептид (и, следовательно, не содержат пре-пропептида). Предпочтительно, зрелая часть также не содержит расщепляемого на С-конце пептида, кодируемого открытой рамкой считывания NGF дикого типа; такой C-концевой расщепляемый пептид, в случае человеческого NGF, состоит из двух аминокислотных остатков «RA» (240 и 241 в SEQ ID NO: 1). Более конкретно, зрелую часть можно получить расщеплением про-NGF протеазой фурин Furin (и другими протеазами, способными точно расщеплять непосредственно N-конец первого аминокислотного остатка NGF или полипептидов SEQ ID NO: 3 или 4, соответственно, без ограничения такими методами. Например, хорошо известно, что сайт расщепления фурином человеческого NGF и многих ортологов состоит из последовательности R1S2K3R4 (однобуквенный аминокислотный код; последовательности пронумерованы от N до C-конца; и заключены в рамку на Фиг.25)). В зрелом NGF обычно не присутствует ни сайт расщепления фурином, ни какая-либо аминокислота на N-конце сайта расщепления фурина. Для иллюстрации зрелая часть человеческого NGF состоит из полипептида, представленного положениями аминокислот 122-239 в SEQ ID NO: 1. Зрелая часть нечеловеческого NGF может быть идентифицирована, например, при поиске последовательностей и/или анализе последовательностей, где указанную зрелую часть человеческого NGF используют для выравнивания последовательностей.

Термин «предшественник», используемый в данном документе по отношению к NGF, относится к любой пептидной последовательности, из которой NGF может быть получен посредством протеолитического расщепления. Представленные для иллюстративных целей как про-NGF, так и пре-про-NGF, а также варианты таковых, являются типичными примерами предшественников NGF. Термин «предшественник», используемый в данном документе, может относиться к предшественникам, у которых наиболее C-концевой аминокислотный остаток является крайним C-концевым остатком NGF, а также к предшественникам, чей C-конец выходит за пределы самого крайнего C-концевого остатка NGF, при условии, что NGF может быть получен из такового протеолитическим расщеплением: хотя встречающийся в природе предшественник про-NGF человека дикого типа (SEQ ID NO: 1) содержит C-концевой дипептид (аминокислотные остатки 240 и 241 в SEQ ID NO: 1 выделены жирным шрифтом на Фиг. 1), предпочтительно, в настоящем изобретении предшественник не содержит расщепляемого на С-конце пептида, кодируемого открытой рамкой считывания NGF дикого типа; такой C-концевой отщепляемый пептид в случае человеческого NGF состоит из двух аминокислотных остатков «RA» (240 и 241 в SEQ ID NO: 1).

Используемые здесь термины «препептид» или «препоследовательность» обычно взаимозаменяемо относятся к полипептидной последовательности, кодируемой частью открытой рамки считывания NGF, N-концом непосредственно примыкающей к пропептиду. Для иллюстративных целей препептид представляет собой NGF, состоящий из последовательности, содержащей непрерывную последовательность в диапазоне от остатка 1 SEQ ID NO: 1 до остатка 18 SEQ ID NO: 1. Последовательности соответствующих препептидов предшественников нечеловеческого NGF доступны, например, в научной литературе, при использовании алгоритма поиска последовательностей, такого как BLAST, с использованием положений 1-18 SEQ ID NO: 1 в качестве вводных данных, а также в общедоступных базах данных белков, таких как Swissprot. Полипептид или белок, состоящий из препептида и про-NGF, где С-конец пре-пептида непосредственно примыкает к N-концу про-NGF, может быть обозначен здесь как «пре-про-NGF».

Термины «пропептид» или «пропоследовательность», используемые в данном документе, обычно взаимозаменяемо относятся к полипептидной последовательности, кодируемой в природе частью открытой рамки считывания NGF, на N-конце непосредственно примыкающей к последовательности зрелого NGF, полипептидная последовательность которого не включает препептид. Для иллюстрации: пропептид содержится в предшественнике NGF дикого типа. Пропептид предшественника NGF состоит из последовательности, содержащей непрерывную последовательность от остатка 19 SEQ ID NO: 1 до остатка 121 SEQ ID NO: 1. Последовательности соответствующих пропептидов нечеловеческого происхождения, или pro-NGF, доступны, например, в научной литературе при использовании алгоритма поиска последовательностей, такого как BLAST, с использованием положений 19-121 SEQ ID NO: 1 в качестве вводных данных, а также в общедоступных базах данных белков, таких как Swissprot.

«Про-NGF» в контексте настоящего описания относится к пептидной последовательности, содержащей как зрелую часть NGF, так и соответствующий про-пептид, но не включающей соответствующий пре-пептид. Про-NGF человека состоит из последовательности, содержащей непрерывную последовательность в диапазоне от остатка 19 SEQ ID NO: 1 до, по меньшей мере, остатка 239 SEQ ID NO: 1. Хотя про-NGF человека дикого типа включает С-концевой дипептид (амино кислотные остатки 240 и 241 в SEQ ID NO: 1, выделеные жирным шрифтом на Фиг.25), предпочтительно, чтобы про-NGF, получаемый и используемый в настоящем изобретении, не содержал C-концевого отсщепляемого пептида, кодируемого открытой рамкой чтения NGF дикого типа, такого как C-концевой отсщепляемый пептид, в случае человеческого NGF, состоящего из двух аминокислотных остатков «RA» (240 и 241 в SEQ ID NO: 1). Последовательности нечеловеческого про-NGF доступны, например, в научной литературе при использовании алгоритма поиска последовательностей, такого как BLAST, с использованием положений 19-121 SEQ ID NO: 1 в качестве вводных данных, а также в общедоступных базах данных белков, таких как Swissprot.

Термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» используются здесь взаимозаменяемо и относятся как к РНК, так и к ДНК, включая кДНК, геномную ДНК, синтетическую ДНК и эквиваленты ДНК/РНК, содержащие аналоги нуклеотидов, аналоги фосфата и/или аналоги сахаров. Нуклеиновая кислота может быть двухцепочечной или одноцепочечной (т.е. смысловой цепью или антисмысловой цепью). Неограничивающие примеры полинуклеотидов включают гены, открытые рамки считывания, фрагменты генов, экзоны, интроны, информационную РНК (мРНК), транспортную РНК, рибосомную РНК, миРНК, микро-РНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, изолированные нуклеиновые кислоты любого типа, последовательности зондов нуклеиновых кислот и праймеры, а также аналоги нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты могут иметь трехмерную структуру любого типа.

Термин «пептид» согласно изобретению включает олиго- и полипептиды и относится к веществам, включающим две или более, предпочтительно 3 или более, предпочтительно 4 или более, предпочтительно 6 или более, предпочтительно 8 или более, предпочтительно 10 или более, предпочтительно 13 или более, предпочтительно более 16, предпочтительно 21 или более и предпочтительно до 8, 10, 20, 30, 40 или 50, в частности до 100 аминокислот, ковалентно связанных в цепь пептидными связями.

Термин «белок» предпочтительно относится к большим пептидам, предпочтительно к пептидам с более чем 100 аминокислотными остатками, но в целом термины «пептид», «полипептид» и «белок» являются синонимами и используются здесь взаимозаменяемо, если контекст не диктует иное. Таким образом, термины «полипептид SEQ ID NO: 4 и « белок SEQ ID NO: 4» имеют идентичное значение.

Термин «фармацевтически приемлемый» обычно описывает, что определенное вещество можно вводить субъекту, необязательно и предпочтительно в комбинации с агентом, без агента, вызывающего непереносимые побочные эффекты, в используемой дозировке.

Термины «фармацевтически приемлемый носитель» и «фармацевтически приемлемый эксципиент» используются для обозначения одного или нескольких из растворителей, дисперсионных сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых агентов, изотонических агентов и агентов, замедляющих всасывание, и т.п., которые являются физиологически совместимыми и пригодными для введения субъекту, как описано в данном документе, или иным образом не мешают такому введению. Примеры таких фармацевтически приемлемых носителей включают, без ограничения, один или несколько из списка, состоящего из воды, физиологического раствора, забуференного фосфатом физиологического раствора, декстрозы, глицерина, этанола и т.п., а также комбинации таковых. В частности, в случае жидких фармацевтических композиций может оказаться предпочтительным включение в композицию изотонических агентов, например сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит, сорбит или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно включать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, увеличивающие срок хранения или эффективность агента. Фармацевтически приемлемый носитель обычно входит в композицию согласно настоящему изобретению.

Термин «фармацевтически активный агент (средство)» относится к агенту, который можно использовать при введении субъекту таким образом, что агент способен принести пользу, например, вызвать облегчение симптомов заболевания или расстройства. Кроме того, «фармацевтически активный агент» может оказывать положительное или благоприятное воздействие на состояние или течение болезни субъекта при введении субъекту в терапевтически эффективном количестве. Предпочтительно, фармацевтически активный агент обладает лечебными свойствами и может вводиться для облегчения, уменьшения, купирования, регрессии, отсрочки начала заболевания или уменьшения тяжести одного или нескольких симптомов заболевания или расстройства. Фармацевтически активный агент может обладать профилактическими свойствами и использоваться для отсрочки начала заболевания или для уменьшения тяжести такого заболевания или патологического состояния. Например, заявленный агент по изобретению рассматривается здесь как фармацевтически активный ингредиент для лечения кистозного фиброза. В другом примере, фармацевтически активный белок может быть использован для лечения клетки или индивидума, которые в норме не экспрессирует белок вообще или на желаемых уровнях, или которые неправильно экспрессирует белок, например, фармацевтически активный белок может компенсировать мутации, приводящие к отсутствию достаточно высокой экспрессии, путем поставки желаемого белка. Термин «фармацевтически активный пептид или белок» включает целые белки или полипептиды, а также может относиться к их фармацевтически активным фрагментам. Он также может включать фармацевтически активные аналоги пептида или белка.

«Открытая рамка считывания» или «ORF» представляет собой непрерывный участок кодонов, начинающийся стартовым кодоном и заканчивающийся стоп-кодоном.

Термины «субъект» и «пациент» в контексте настоящего описания относятся к млекопитающему. Например, млекопитающие в контексте настоящего изобретения представляет собой человека, приматов, одомашненных животных, включая, без ограничения таковыми, собак, кошек, овец, крупный рогатый скот, коз, свиней, лошадей и т.д., лабораторных животных, а также мышей, крыс, кроликов и др., а также животных в неволе, например животных, содержащихся в зоопарках. Термины «субъект» и «пациент», используемые здесь, в частности, включают человека. Субъект (человек или животное) имеет два набора хромосом; то есть является диплоидным. Термин «пациент» относится к субъекту, который страдает от состояния, находится в группе риска и подвержен болезненному состоянию, страдает от состояния или, по прогнозам, может страдать от состояния, и который может быть подвергнут терапии, например, при введении агента. Состояние пациента может быть хроническим и/или острым. Таким образом, «пациент» также может быть описан как субъект, подвергаемый терапии и/или нуждающийся в таковой.

Термин «терапия» следует понимать в широком смысле, таковой относится к применению к субъекту с целью предотвращения или к лечению состояния у субъекта. В предпочтительных вариантах осуществления терапия, в частности, включает введение агента субъекту.

Используемый здесь термин «трипсин» обычно относится к протеолитическому ферменту, классифицированному как EC 3.4.21.4). Трипсин расщепляет пептидные цепи в основном на карбоксильном конце по аминокислотам лизину или аргинину, обычно за исключением случаев, когда за таковыми следует пролин. Не ограничиваясь теорией, следует понимать, что трипсин является сериновой протеазой и что трипсин естественным образом содержится в пищеварительной системе многих позвоночных, где он гидролизует белки. В настоящем изобретении предпочтительным является трипсин из рекомбинантных источников. Хотя in vivo трипсин образуется вместе с пропептидом (называемым «трипсиногеном»), используемый здесь термин «трипсин» предпочтительно относится к зрелому трипсину, лишенному какого-либо пропептида. Использование трипсина для протеолитического расщепления также может называться «трипсиновым протеолизом» или «трипсинизацией», а белки, возникающие в результате расщепления трипсином, называются «трипсинизированные».

«Вариант» предшественника NGF или полипептида SEQ ID NO: 3 или 4 относится к полипептиду или белку, аминокислотная последовательность которого не соответствует части зрелого NGF (бета-NGF) или не соответствует части SEQ ID NO: 3 или 4 соответственно; характеризуется по меньшей мере одной мутацией по сравнению с предшественником NGF дикого типа, таким как про-NGF дикого типа или пре-про-NGF дикого типа; где указанная, по меньшей мере, одна мутация предпочтительно обнаруживается на N-конце аминокислотной последовательности зрелого NGF (бета-NGF). Таким образом, в контексте настоящего описания «вариант» предшественника NGF или подобного белка относится к пептиду или белку, в котором препептид и/или пропептид характеризуется, по меньшей, мере одной мутацией по отношению к аминокислотной последовательности препептида и/или пропептида, без ограничения таковым, например, представляет собой те варианты, которые описаны в WO 2013/092776 A1 и в US 2018/0086805 A1. Для иллюстративных целей в WO 2013/092776 A1 описаны «варианты» про-NGF, в которых сайт расщепления фурина (дикого типа) отсутствует из-за одной или нескольких специфических мутаций.

Термин «вектор» или «вектор клонирования» обычно относится к нуклеиновой кислоте, которая может быть введена в клетку-хозяина. Примеры векторов включают, без ограничения таковыми, плазмиды, фаги и все другие типы нуклеиновых кислот, которые могут быть введены в клетку-хозяина. Термин «вектор» следует понимать широко, как включающий векторы, кодирующие пептид или белок для гетерологичной экспрессии (такие векторы могут служить в качестве матриц для генерации транскриптов), и векторы, которые такого не осуществляют. Векторы первого типа будут содержать открытую рамку считывания, кодирующую белок или пептид, который будет экспрессироваться, если вектор присутствует в клетке-хозяине. Хотя тип вектора, который выберет специалист в данной области техники, будет зависеть от типа клетки-хозяина, выбранной специалистом, в конкретном случае векторы клонирования для всех обычных клеток-хозяев, включая E.coli, коммерчески доступны, и, таким образом, специалист в данной области техники может выбрять конкретный вектор с полным учетом характеристик выбранной клетки-хозяина.

Термин «дикий тип» используется здесь для обозначения гена или белка, обычно встречающегося в природе, предпочтительно у здорового субъекта. Ген или белок, который не является «диким типом», упоминается здесь как «мутант» или «мутировавший» или тому подобное. Для иллюстративных целей SEQ ID NO: 1 показывает аминокислотную последовательность предшественника человеческого NGF дикого типа; SEQ ID NO: 2 показывает аминокислотную последовательность человеческого NGF дикого типа.

Настоящее изобретение основано на нескольких взаимосвязвнных открытиях, которые, вместе взятые, привели изобретателей к различным аспектам изобретения, описанных ниже индивидуально.

Агент по настоящему изобретению

Настоящее изобретение относится к агенту для лечения и/или предотвращения дерматологического заболевания у млекопитающего. Агент может быть использован для введения субъекту при необходимости, например, для облегчения симптомов заболевания или расстройства. В частности, агент, предлагаемый по настоящему изобретению, представляет собой полипептид с SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Таким образом, настоящее изобретение, в частности, предоставляет полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 для использования в терапии. Терапия обычно включает введение указанного полипептида в организм человека или животного, как описано ниже.

Согласно настоящему изобретению полипептиды SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 представлены в качестве фармацевтически активных агентов. В соответствии с настоящим изобретением полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 предназначен для медицинского применения, в частности, для лечения и/или предотвращения дерматологического заболевания у млекопитающего. Необязательно, полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 происходит из рекомбинантного источника. Таким образом, настоящее изобретение также предоставляет рекомбинантный полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 для медицинского применения, как описано в данном документе.

Агент по настоящему изобретению, также называемый здесь «полипептид SEQ ID NO: 3» или «полипептид SEQ ID NO: 4», теперь будет описан более подробно. Термин «полипептид SEQ ID NO: 3» и аналогичные термины обозначают здесь полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3, и/или агент с эквивалентной биологической активностью. Термин «полипептид SEQ ID NO: 4» и подобные термины обозначают здесь полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4, и/или агент с эквивалентной биологической активностью. Таким образом, эти термины также включают функционально эквивалентные части или аналоги таких полипептидов. Одним из примеров биологически эквивалентной части полипептида может быть домен или субпоследовательность полипептида SEQ ID NO: 3 или полипептида SEQ ID NO: 4, который(ая) включает сайт связывания, позволяющий домену или подпоследовательности проявлять по существу такую же биологическая активность, каковой обладает полноразмерный полипептид SEQ ID NO: 3 или полноразмерный полипептид SEQ ID NO: 4, или, альтернативно, ген, кодирующий такой полипептид. Термин «практически такая же биологическая активность» относится к эквивалентной части или аналогам полипептида, имеющим не менее 50%, предпочтительно не менее 60%, более предпочтительно не менее 70%, более предпочтительно не менее 75%, более предпочтительно не менее 80%, более предпочтительно не менее 85%, более предпочтительно не менее 90%, более предпочтительно не менее 95% и наиболее предпочтительно не менее 97%, не менее 98% или не менее 99% активности полипептида SEQ ID NO: 3 или полипептида SEQ ID NO: 4; в анализах, описанных в Примерах 3 и 4 примером биологически эквивалентного аналога полипептида может быть слитый белок, который включает, по меньшей мере, часть аминокислотной последовательности полипептида SEQ ID NO: 3 или полипептида SEQ ID NO: 4, а также гомологичный аналог полипептида. Кроме того, полностью синтетические молекулы, имитирующие специфическую биологическую активность полипептида SEQ ID NO: 3 или полипептида SEQ ID NO: 4, также будут являться «биологически эквивалентными аналогами».

Более предпочтительно, термин «полипептид SEQ ID NO: 3» и подобные термины обозначают здесь полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3; такие агенты необязательно представляют собой слитые белки, содержащие, среди прочего, аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3. Наиболее предпочтительно, термин «полипептид SEQ ID NO: 3» и подобные термины обозначают здесь полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 3; в этом варианте осуществления агент состоит из полипептида, состоящего из 118 аминокислотных остатков в последовательном порядке, как указано в SEQ ID NO: 3. В этом и других вариантах осуществления полипептид необязательно несет одну, две или три внутренних цистеиновых связи, таким образом, что остатки цистеина (Cys, C) ковалентно связаны друг с другом с образованием внутримолекулярных дисульфидных мостиков. Цистеиновые связи предпочтительно эквивалентны связям в NGF дикого типа человека.

В равной степени более предпочтительно термин «полипептид SEQ ID NO: 4» и подобные термины обозначают здесь полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4; такие агенты необязательно представляют собой слитые белки, которые содержат, среди прочего, аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4. Наиболее предпочтительно, термин «полипептид SEQ ID NO: 4» и аналогичные термины обозначают здесь полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 4; в этом варианте осуществления агент состоит из полипептида, состоящего из 118 аминокислотных остатков в последовательном порядке как указано в SEQ ID NO: 4. В этом и других вариантах осуществления полипептид необязательно несет одну, две или три внутренних цистеиновых связи, таким образом, что остатки цистеина (Cys, C) ковалентно связаны друг с другом с образованием внутримолекулярных дисульфидных мостиков. Цистеиновые связи полипептида предпочтительно эквивалентны связям в NGF человека дикого типа.

Полипептид по настоящему изобретению необязательно может быть охарактеризован дополнительными посттрансляционными модификациями. Такие посттрансляционные модификации необязательно включают гликозилирование и/или фосфорилирование. Однако, предпочтительно, полипептид по настоящему изобретению не подвергается гликозилированию и/или фосфорилированию. Действительно, с учетом того, что приведенные здесь экспериментальные примеры демонстрируют положительный эффект на заживление кожных заболеваний и допустимое соотношение положительных и отрицательных эффектов, и при понимании, что используемый полипептид был получен путем цитозольной рекомбинантной экспрессии в бактериях, обычно не приводящей к гликозилированию и/или фосфорилированию, существует вероятность того, что положительный эффект продукта по настоящему изобретению не зависит от такого типа посттрансляционной модификации. Следовательно, в предпочтительных вариантах осуществления полипептид согласно настоящему изобретению не подвергается гликозилированию и/или фосфорилированию.

Как правило, полипептид по настоящему изобретению представляет собой неприродный полипептид, который не вырабатывается в норме субъектом, которому вводят полипептид. Это не только дает преимущества при обнаружении агента у субъекта после введения, но также свидетельствует о том, что введение субъекту (из внешнего источника, такого как, например, композиции, приготовленные в соответствии с настоящим описанием) может являться необходимым для достижения успеха в лечении или профилактике расстройства.

Предпочтительно, полипептид согласно настоящему изобретению представляет собой отдельный (изолированный) полипептид. Более предпочтительно, если полипептид согласно настоящему изобретению по существу не содержит белков клетки-хозяина, продуктов деградации (таких как вариант des-nona, например) и протеаз (например, трипсина). Если полипептид согласно настоящему изобретению практически не содержит белков клетки-хозяина, продуктов деградации (такие, как des-nona вариант, например) и протеаз (например, трипсина), то такой полипептид также может называться «чистым полипептидом». Предпочтительно, полипептид согласно настоящему изобретению вводят в форме чистого полипептида. Более предпочтительно, чистый полипептид, состоящий из SEQ ID NO: 3, и/или чистый полипептид, состоящий из SEQ ID NO: 4, имеет весовой процент 90% или более, предпочтительно 92% или более, более предпочтительно 93% или более, более предпочтительно 94% или более, более предпочтительно 96% или более, более предпочтительно 97% или более, более предпочтительно 98% или более, более предпочтительно 99% или более, более предпочтительно 99,2% или более, более предпочтительно 99,4% или более, более предпочтительно 99,6% или более, более предпочтительно 99,8% или более, более предпочтительно 99,9% или более по отношению к общему белку в композиции. Такой чистый полипептид доступен в соответствии с раскрытием в данном документе, включающим Примеры 1 и 2. Наиболее предпочтительно, чистый полипептид согласно настоящему изобретению имеет степень чистоты, совместимую с надлежащей производственной практикой (GMP, Good manufacturing practices).

Как продемонстрировано в экспериментах в данном документе, в частности в Примерах 3 и 4, введение агента по настоящему изобретению не вызывает гипералгезического синдрома (боли), несмотря на тот факт, что агент находился в прямом контакте с полностью обнаженными ноцицептивными волокнами (нервами); таковые считаются полностью открытыми из-за отсутствия кожи и гиперактивированными в результате поражения кожи. Отсутствие боли в этих экстремальных условиях особенно примечательно, поскольку средство вводили местно и многократно на поврежденную кожу, в том числе при хронических заболеваниях (подробности показаны в примерах). Это является особенно примечательным с учетом обескураживающих данных более ранних исследований с человеческим NGF, введенным в контакт с иннервируемой областью, то есть областью, характеризующейся обнаженными ноцицепторами (Svensson et al., 2003, Pain, vol. 104, p. 241-247). Вышеупомянутые неожиданные результаты не могут быть объяснены исключительно тем фактом, что агент по настоящему изобретению был ранее описан как «безболезненный», поскольку его способность вызывать боль в иннервируемой области, т.е. в области обнаженных ноцицепторов, не говоря уже о гиперактивированных нервах, как в случае поражения кожи, никогда не исследовалась экспериментально. Кроме того, даже несмотря на то, что введение агента согласно настоящему изобретению является причиной реиннервации ткани (см., например, Пример 3), само введение не связано с болью. В дополнение к этому, положительный эффект агента по настоящему изобретению на ангиогенез (см. Экспериментальные Примеры) является неожиданным и не был предсказан, основываясь на данных уровня техники. Подразумевается, что ангиогенез имеет особое значение для образования ткани и закрытия ран. Таким образом, сочетание этих выгодных эффектов является весьма неожиданным в свете современного уровня техники.

Необязательно, согласно настоящему изобретению полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 вводят в эффективном количестве субъекту, нуждающемуся в этом. Подробности введения, эффективное количество и качества субъекта, нуждающегося в этом, описаны ниже.

Полипептиды, состоящие из SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно, отличаются в одном или двух положениях от аминокислотной последовательности фактора роста нервов человека (NGF, также называемый NGF дикого типа, см. SEQ ID NO: 2). Именно отличие полипептида согласно настоящему изобретению от полипептида SEQ ID NO: 2 обуславливает заметное влияние на лечение или профилактику кожных заболеваний и отсутствие побочных эффектов, как подробно раскрыто в настоящем документе и подтверждено экспериментальными данными в приведенных примерах.

Фактор роста нервов (NGF) - это нейротрофин, необходимый для развития и выживания определенных популяций нейронов. NGF представляет собой гомодимерный пептид, который естественным образом запускает пролиферацию и гомеостаз нейронов. В организме NGF связывается по крайней мере с двумя типами рецепторов: киназой A рецептора тропомиозина (TrkA) и рецептором нейротрофина p75 с низким сродством к NGF (LNGFR/p75NTR/p75). Оба связаны с определенными расстройствами у людей и животных, хотя соответствующие механизмы действия, вероятно, различны. Было предложено несколько терапевтических применений для NGF, но лишь немногие из них были коммерчески освоены.

Тем не менее, хотя многие терапевтические применения NGF предполагались в прошлом, они не были доработаны до коммерчески продаваемых терапевтических продуктов NGF, и причиной этого может быть то, что NGF, помимо желаемого эффекта на пролиферацию и гомеостаз нейронов, связан с болью: он способоен вызывать гипералгезию при местном или системном введении. (Lewin et al., 1994, Eur. J. Neurosci., том 6, стр. 1903-1912; Della Seta et al., 1994, Pharmacol. Biochem. Behav., vol. 49, p. 701; Dyck et al, 1997, Neurology, vol. 48, 501-505; McArthur, et al., 2000, Neurology, vol. 54, p. 1080-1088; Svensson et al., 2003, Pain, vol. 104, p. 241-247; Ruiz et al., 2004, Brain Res., Vol. 1011, p. 1-6). В качестве решения были разработаны мутантные версии NGF («мутеины»), которые связаны со сниженной ноцицептивной активностью («безболезненный NG»), и которые характеризуются по меньшей мере одной мутацией в домене NGF, взаимодействующим с рецептором TrkA (WO 2008/006893 A1, Malerba et al. PLOS One, 2015, vol. 10, e0136425). Однако такие полипептиды до сих пор недоступны для продажи населению с фармацевтически приемлемой чистотой и не были предложены или разработаны для лечения или профилактики дерматологических заболеваний кожи, возможно, из-за предубеждения и общего отрицательного опыта исследований факторов роста в этой терапевтической области в целом.

Согласно настоящему изобретению стабильность и, таким образом, долговременное сохранение чистоты полипептида с SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 могут быть достигнуты и/или улучшены на основе аспектов и вариантов осуществления, описанных в данном документе. Таким образом, настоящее изобретение не только делает доступным новое лечение или профилактику дерматологических расстройств, но также предоставляет агент, подходящий для такого лечения или профилактики, со степенью чистоты, подходящей для терапевтического применения, включая введение млекопитающему. Агент настоящего изобретения ранее не был доступен широкой публике с такой эффективной степенью чистоты.

Полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 не встречается в природе и также может называться неприродным полипептидом. Таким образом, агент по настоящему изобретению не является NGF дикого типа и, в частности, не является NGF дикого типа человека.

Предпочтительно неприродный полипептид по настоящему изобретению имеет высокую чистоту. Полипептид, необязательно, содержит внутренние дисульфидные мостики. Полипептид, необязательно, правильно свернут. Полипептид, необязательно, растворим в водной среде.

Настоящее изобретение частично основано на экспериментах с двумя животными моделями кожных язв. В этих моделях кожные язвы индуцируются у мышей с диабетом с помощью круговой биопсии или циклов нагружения давлением, и полипептид по настоящему изобретению применяется местно. Полипептид вызывает значительное и дозозависимое улучшение времени заживления язв по сравнению с животными, получавшими плацебо. Это улучшение было очевидным при дозах, лишенных побочных эффектов, связанных с болью, и, таким образом, демонстрирует потенциальное преимущество по сравнению с существующим уровнем техники.

В частности, данные, полученные на моделях диабетических кожных язв in vivo, продемонстрировали, что полипептид по настоящему изобретению безболезнен, но сохраняет активность, направленную на рецепторную систему NGF, и тем самым является терапевтическим средством для лечения или профилактики дерматологических заболеваний. Действительно, полипептид по изобретению сохраняет трофические свойства NGF дикого типа в отношении ангиогенеза и реиннервации, что способствует заживлению язв, не вызывая про-ноцицептивных эффектов NGF дикого типа в месте местного применения и на системном уровне.

В настоящем изобретении предложен полипептид для применения в лечении и/или профилактике дерматологических заболеваний у млекопитающего, при этом полипептид выбран из полипептида с SEQ ID NO: 3 и полипептида с SEQ ID NO: 4. Таким образом, настоящее изобретение также относится к полипептиду SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 для использования в способе лечения человека или животного посредством терапии, как описано в данном документе.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к конкретному терапевтическому применению полипептида SEQ ID NO: 3 и полипептида SEQ ID NO: 4, где конкретное терапевтическое применение представляет собой лечение и/или профилактику дерматологического заболевания у субъектов млекопитающих. Таким образом, настоящее изобретение также предоставляет полипептид SEQ ID NO: 3 и полипептид SEQ ID NO: 4 для использования в способе лечения человека или животного посредством терапии, где терапия включает лечение и/или предотвращение дерматологического расстройства у млекопитающего. Субъект-млекопитающее обычно является субъектом, которому требуется такое лечение.

Полипептид SEQ ID NO: 3, а также полипептид SEQ ID NO: 4 характеризуются мутацией аминокислотной последовательности человеческого NGF (hNGF, SEQ ID NO: 2), при этом указанная мутация связана со снижением интенсивности ноцицептивного действия. В частности, аргинин в положении 100 hNGF замещен глутаминовой кислотой. Настоящее изобретение частично основано на неожиданном открытии того, что терапевтический эффект может быть достигнут без побочных эффектов, известных из предшествующего уровня техники.

Без ограничения какой-либо конкретной теорией, предпочтительно, чтобы полипептид согласно настоящему изобретению содержал один или несколько дисульфидных мостиков, наиболее предпочтительно, три дисульфидных мостика. Зрелый и правильно свернутый человеческий NGF характеризуется тремя дисульфидными мостиками (при связывании в позициях 136 ↔ 201, 179 ↔ 229, 189↔ 231, где нумерация позиций относятся к SEQ ID NO: 1; см. Wiesmann et al., 1999, Nature, vol. 401, с. 184-188). Без ограничения какой-либо конкретной теорией, предпочтительно, чтобы полипептид в соответствии с настоящим изобретением включал эквивалентные дисульфидные мостики (где номера позиций для связывания понятны квалифицированному специалисту при выравнивании полипептида согласно настоящему изобретению с полипептидом SEQ ID NO: 1 и Wiesmann et al., см. выше.)

Описание наличия и отсутствия побочных эффектов

Предпочтительно, чтобы лечение и/или профилактика не вызывали побочных или нежелательных эффектов у субъекта, которому вводят или вводили полипептид. Один из побочных эффектов или побочный эффект, который предпочтительно отсутствует в данном контексте, - это гипералгезия или боль. Таким образом, предпочтительно, введение агента по настоящему изобретению не вызывает гипералгезического синдрома (боли).

Важно отметить, что отсутствие боли не просто предоставляет более приятное (или менее неприятное) лечение, чем введение эталонного соединения, связанного с болью (например, NGF дикого типа), а, по крайней мере, частично является причиной успеха лечения или профилактики кожных заболеваний как таковых: учитывая, что полипептид согласно настоящему изобретению предпочтительно вводят местно, более предпочтительно вводят местно на участок, пораженный кожным заболеванием (например, при язвах), отсутствие боли позволяет субъекту, проходящему лечение, принимать введение полипептида на поверхность тела без побочных реакций, таких как соскабливание, смывание или удаление его иным способом, чтобы снять боль, в результате чего полипептид будет продолжать воздействие на пораженную поверхность тела, оказывая терапевтически положительный эффект, например, при лечении или профилактике кожного заболевания. Таким образом, отсутствие боли, связанной с полипептидом по настоящему изобретению, будет подходящим условием для преодоления сопротивления потребителей и опасений регулирующих органов. Другими словами, отсутствие боли связано со значительным увеличением соотношения польза/риск по сравнению с агентами, ассоциирующимися с болью.

В частности, предпочтительно, чтобы лечение и/или профилактика не вызывали гипералгезии у млекопитающего. В одном варианте осуществления субъект, которому вводят полипептид по изобретению, не страдает механической аллодинией. Точнее, механическая аллодиния не индуцируется у субъекта, которому вводят полипептид по изобретению, так что субъект, которому вводят полипептид, не страдает механической аллодинией.

В одном варианте осуществления субъект, которому вводят полипептид по изобретению, не страдает термальной аллодинией. Более точно, термальная аллодиния не индуцируется у субъекта, которому вводят полипептид по изобретению, так что субъект, которому вводят полипептид, не страдает термальной аллодинией.

Другой побочный эффект или нежелательный эффект, который предпочтительно отсутствует в данном контексте, представляет собой злокачественное новообразование или рак. В частности, введение полипептида по настоящему изобретению субъекту предпочтительно не связано с аномальным ростом клеток и даже, что более предпочтительно, не связано не только с аномальным ростом клеток, но и с возможностью проникновения или распростпоражения клеток на другие части тела. Особенно предпочтительно, что введение полипептида по настоящему изобретению субъекту предпочтительно никак не связано с раком кожи, в частности дермы или эпидермиса. В этом отношении лечение или введение согласно настоящему изобретению связано со значительными преимуществами по сравнению с уровнем техники, например, по сравнению с коммерческим лечением фактором роста, полученным из тромбоцитов (беклапермин, торговая марка Regranex). Таким образом, ожидается, что отсутствие злокачественных новообразований, связанных с полипептидом по настоящему изобретению, поможет преодолеть сопротивление потребителей и опасения регулирующих органов. Другими словами, отсутствие злокачественного новообразования связано со значительным увеличением соотношения польза/риск по сравнению с таковым агентов, связаных с риском злокачественных новообразований.

Таким образом, предпочтительно, что введение полипептида по настоящему изобретению субъекту не сопровождается побочными эффектами, такими как злокачественные новообразования и/или боль.

Обычно введение агента согласно настоящему изобретению хорошо переносится субъектом. В частности, предпочтительно, введение полипептида по настоящему изобретению не связано с образованием у субъекта антител против лекарств. Действительно, поскольку аминокислотная последовательность полипептида согласно настоящему изобретению отличается только по одной или двум аминокислотным позициям от человеческого NGF дикого типа, то вероятно, что иммунологическая переносимость у людей является особенно привлекательным фактором, и вероятно, что введение полипептида по настоящему изобретению не вызывает образования антител против лекарств у человека.

Предпочтительно, введение согласно настоящему изобретению положительно влияет на одно или несколько из следующих: воспаление, отложение внеклеточного матрикса, иннервацию и ангиогенез.

Обнаруживаемость полипептида

Предпочтительно, полипептид для использования согласно настоящему изобретению может селективно распознаваться реагентом, специфичным в отношении эндогенного (например, человеческого) NGF. Термины «селективно распознаваемый» и «обнаруживаемый» используются здесь взаимозаменяемо и обычно относятся к специфичной идентификации, предпочтительно молекулярными средствами, белка в биологическом образце.

В этом отношении полипептид согласно настоящему изобретению предпочтительно обнаруживается антителом или другой иммунореактивной молекулой.

Белок, обнаруживаемый антителом или другой иммунореактивной молекулой, также может называться антигеном. В некоторых вариантах осуществления биологический образец может характеризоваться презентации - или отсутствием презентации одного или нескольких специфических антигенов. В контексте настоящего изобретения полипептид, вводимый субъекту, предпочтительно обнаруживается в биологическом образце, полученном от субъекта после введения полипептида. Одним из неограничивающих способов демонстрации присутствия белка является вестерн-блоттинг, но другие иммунологические методы в равной степени включаются в контекст настоящего изобретения. Антитело или другая иммунореактивная молекула либо сама помечена (например, флуорофором), либо распознается меченым вторичным антителом или другой иммунореактивной молекулой, которая добавляется для этой цели. Таким образом, в некоторых случаях вторичная молекула, способствующая обнаружению, например, необязательно, меченое вторичное антител, также добавляется для облегчения обнаружения.

Согласно изобретению антиген считается присутствующим в биологическом образце, если его уровень выше предела обнаружения и/или если уровень достаточно высок, чтобы позволить связывание антигенспецифическими антителами, добавленными к образцу. Согласно изобретению антиген считается неэкспрессируемым в клетке, если уровень экспрессии ниже предела обнаружения и/или если уровень экспрессии слишком низок, чтобы позволить связывание антигенспецифическими антителами, добавленными к образцу.

Антитело или другая иммунореактивная молекула может распознавать эпитоп на клеточной поверхности. Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте молекулы, такой как антиген, т.е. к части или фрагменту молекулы, которая распознается, то есть связывается иммунной системой, например, которая распознается антителом или другой иммунореактивной молекулой. Обнаружение эпитопа, специфичного для любого конкретного антигена, обычно позволяет сделать вывод о том, что этот конкретный антиген присутствует в анализируемой клетке.

В одном варианте осуществления образец, полученный от субъекта, в частности субъекта, которому вводили полипептид согласно настоящему изобретению, можно охарактеризовать с помощью иммунофенотипирования. «Иммунофенотипирование» обычно означает, что клетка или образец могут быть охарактеризованы антиген-специфическими молекулами, такими как антитела или другие иммунореактивные молекулы, которые добавляются к образцу для определения наличия антигена. Иммунофенотипирование включает сортировку клеток с использованием различных методов, включая проточную цитометрию, а также методы анализа лизированных клеток и лизированных образцов, такие как вестерн-блоттинг.

В настоящем изобретении особенно предпочтительным является полипептид, который может быть специфически обнаружен даже в присутствии NGF дикого типа, например человеческого NGF дикого типа. Хотя любая мутация аминокислотной последовательности, такая как, например, любая точечная мутация, может сделать полипептид специфически детектируемым даже в присутствии соответствующего немутантного полипептида дикого типа, то, следовательно, каждый полипептид SEQ ID NO: 3 и каждый полипептид SEQ ID NO: 4 могут быть, prima facie, специфически обнаружены даже в присутствии человеческого NGF дикого типа, в частности полипептид SEQ ID NO: 4, для которого уже доступно антитело, способное отличать указанный полипептид от NGF человека дикого типа (WO 2008/006893 A1).

Таким образом, предпочтительно, полипептид характеризуется, по меньшей мере, отсутствием пролина в положении 61 (который присутствует в положении 61 эталонной SEQ ID NO: 2), более предпочтительно заменой пролина в положении 61 другой аминокислотой. В особенно предпочтительном варианте осуществления пролин в положении 61 заменен серином. В этом предпочтительном варианте осуществления полипептид для использования согласно настоящему изобретению представляет собой полипептид SEQ ID NO: 4. Этот полипептид характеризуется по меньшей мере отсутствием пролина в положении 61, более предпочтительно заменой пролина в положении 61 на другую аминокислоту. В SEQ ID NO: 4 пролин в положении 61 из SEQ ID NO: 3 заменен серином.

Пораженная поверхность тела

В соответствии с настоящим изобретением на пораженную поверхность тела вводят полипептид по изобретению.

Пораженные поверхности тела включают, без ограничения таковыми, язвы (венозные язвы, артериальные язвы, пролежни, диабетические язвы), послеоперационные раны, пролежни, ожоги, разрывы, разрезы, синяки, ссадины, колотые раны) и т.п. Субъекты, имеющие такие ​поражения поверхности тела, будут описаны ниже, и следующее описание пораженной поверхности тела применимо ко всем таким субъектам, если контекст явно не диктует иное.

В одном варианте осуществления агент согласно настоящему изобретению предоставляется для лечения и профилактики кожного заболевания, при этом кожное заболевание выбрано из язв, послеоперационных ран, пролежней, ожогов, разрывов, разрезов, синяков, ссадин и колотых ран.

В одном варианте осуществления предоставляется средство согласно настоящему изобретению в данном документе для лечения и профилактики язв, при этом язва выбрана из венозных язв, артериальных язв, пролежней и диабетических язв.

В некоторых вариантах осуществления поверхность пораженного тела имеет диаметр 1 мм или более. В общем, когда в настоящем документе делается ссылка на «диаметр» пораженной поверхности тела, для некруглых пораженных поверхностей тела термин «диаметр» относится к наибольшему диаметру пораженной поверхности тела, измеренному от одной границы пораженной поверхности тела поперек пораженной поверхности до противоположной границы пораженной поверхности тела. Для округлых пораженных поверхностей тела диаметр, конечно, одинаков в любом направлении измерения от одной границы пораженной поверхности через пораженную поверхность до противоположной границы пораженной поверхности тела. Диаметр можно определить с помощью линейки или другого подходящего инструмента на внешней поверхности пораженной поверхности тела.

В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр от 1 мм до 50 см. В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр от 2 мм до 20 см. Пораженные поверхности тела диаметром 0,5 см или более, предпочтительно 1 см или более, также могут называться здесь «большими» пораженными поверхностями тела. Настоящее изобретение также подходит для лечения больших пораженных поверхностей тела, таких как большие язвы (см., например, пример 4). В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр от 3 мм до 10 см. В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр от 4 мм до 5 см. В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр от 5 мм до 4 см. В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр от 6 мм до 3 см. В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр от 7 мм до 1 см. В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр от 8 мм до 1 см. В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр около 6 мм. В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр около 12 мм.

Субъекты, для которых агент по настоящему изобретению является особенно подходящим

Согласно настоящему изобретению полипептид с SEQ ID NO: 3 или с SEQ ID NO: 4 можно вводить субъекту, нуждающемуся в таком введении. Субъект, нуждающийся в таком введении, может быть субъектом, диагностированным описанным здесь расстройством, субъектом с риском заболевания таким расстройством или иным образом страдающим таким расстройством. Агент вводится субъекту в терапевтически эффективном количестве. Терапевтически эффективное количество может быть определено врачом с учетом настоящего описания.

В частности, полипептид согласно изобретению вводят млекопитающему. Субъекта также можно называть «пациентом». Наиболее предпочтительно, чтобы субъектом-млекопитающим являлся человек.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения пациента, страдающего дерматологическим заболеванием, где способ включает введение пациенту эффективного количества полипептида SEQ ID NO: 3 или полипептида SEQ ID NO: 4. Термины «пациент» и «субъект» используются здесь взаимозаменяемо, в частности, применительно к пациенту/субъекту, характеризующемуся дерматологическим заболеванием, как описано в данном документе.

Предпочтительно, дерматологическое заболевание характеризуется поврежденной поверхностью, по меньшей мере, на части тела субъекта. Предпочтительно, дерматологическое заболевание характеризуется пораженной поверхностью (пораженной поверхностью тела). Пораженные поверхности тела были описаны, например, выше, и последующее описание применимо ко всем таким пораженниям поверхности тела субъектов, если контекст не диктует иное.

Более предпочтительно дерматологическое заболевание представляет собой или включает поражение кожи, предпочтительно поражение кожи, характеризующееся, по меньшей мере, частичной абляцией дермы и необязательно дермы. В одном из вариантов осуществления пораженная поверхность тела представляет собой или содержит повреждение, в частности, повреждение кожи.

Хотя такие термины, как «дерматологическое заболевание», «рана», «поврежденная поверхность тела», «хроническое поражение», «язва» и другие термины используются здесь в единственном числе, настоящее изобретение также применимо к субъектам, страдающим множественными дерматологическими расстройствами, ранами, или имеющим пораженнные поверхности тела, хронические раны, язвы и другие подобные заболевания.

Предпочтительно, чтобы пораженная поверхность тела содержала по меньшей мере одно хроническое поражение. Таким образом, введение агента по настоящему изобретению подходит для лечения или профилактики по меньшей мере одного хронического поражения. В контексте настоящего изобретения термин «хроническое поражение» следует понимать в широком смысле и он включает, без ограничений, язвы всех типов, независимо от того, упоминаются ли они явно в этом раскрытии или нет, пролежни, ожоги и механические абляции кожи. В частности, в этот термин входят раны, которые не заживают в течение временных периодов, типичных для заживления у здоровых субъектов соответствующего вида. В дополнение к этому, все раны на поверхности тела субъекта, которые не зажили и/или не закрылись в течение семи или более дней, например, 14 дней или более, 21 день или более, 1 месяц или более, или один год или более, классифицируются как «хроническое поражение». Агент по настоящему изобретению можно вводить для всех таких типов хронических поражений для лечения или предотвращения таких хронических поражений.

В контексте настоящего изобретения термин «предотвращать» следует понимать в широком смысле, где он включает не только предотвращение начала расстройства, но и предотвращение прогрессирования расстройства. В частности, в контексте пораженной поверхности тела, такой как хроническая рана, например, при язве, термин «предотвращать» также включает предотвращение дальнейшего увеличения площади пораженной поверхности тела, например, дальнейшее углубление раневой поверхности тела и/или увеличение диаметра пораженной поверхности тела.

В контексте настоящего изобретения термин «лечить» следует понимать широко. Термин включает, без ограничения, уменьшение симптомов расстройства. В самом деле, предпочтительно, чтобы достижение улучшения дерматологического расстройства, такого как, например, в случае (частичного) закрытия раны, что продемонстрировано экспериментальными примерами, являлось предпочтительной неотъемлемой частью заявленного здесь изобретения. Действительно, достижение заявленного терапевтического эффекта является функциональной технической особенностью настоящего изобретения. Приведенные здесь примеры свидетельствуют в пользу того, что указанная функциональная техническая характеристика достижима как прямой результат введения полипептида по настоящему изобретению. Другими словами, авторы настоящего изобретения установили, что полипептид по настоящему изобретению является причиной улучшения состояния у субъекта, страдающего дерматологическим заболеванием. Дерматологическое заболевание предпочтительно характеризуется поврежденной поверхностью тела.

Настоящее изобретение особенно подходит для подгрупп субъектов, страдающих дерматологическим заболеванием. Такие подгруппы описаны здесь. Также возможно, что конкретный субъект попадает в одну или несколько подгрупп, описанных в данном документе; и введение полипептида согласно настоящему изобретению субъектам, попадающим в одну из подгрупп, описанных в данном документе, в равной степени входит в настоящее изобретение, как «введение полипептида согласно настоящему изобретению субъектам, попадающим в более чем одну из подгрупп, описанных в данном документе».

Изобретение не ограничивается конкретными причинами повреждения поверхности тела. Например, в изобретение включены диабетические причины, а также недиабетические причины.

Поверхность поражения может находиться на одной или нескольких частях тела. Предпочтительными являются пораженные поверхности тела на конечностях, таких как руки (включая пальцы) и ноги (включая ступни), но пораженные поверхности тела на туловище или голове или других частях тела также могут быть подвергнуты введению полипептида по изобретению. В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела находится на ноге или ступне, а более предпочтительно на ступне. В таких вариантах осуществления часто встречаются пациенты с диабетом, но введение на такую конкретную пораженную поверхность тела не ограничивается пациентами с диабетом.

В некоторых вариантах осуществления полипептид согласно настоящему изобретению предназначен для введения субъекту, перенесшему операцию. Соответственно, полипептид по настоящему изобретению подходит для лечения или предотвращения одного или нескольких послеоперационных осложнений, таких как пролежни, и/или для лечения хирургических ран.

Предпочтительно, чтобы пораженная поверхность тела содержала, по меньшей мере, одну язву. Согласно настоящему изобретению полипептид можно вводить (наносить), по меньшей мере, на часть пораженной поверхности тела. Термин «по меньшей мере, одна часть», как используется здесь, включает любое соотношение от 0 до 100%, например, от 10 до 90%, от 20 до 80%, от 30 до 70%, от 40 до 60% и примерно 50%; таким образом, полипептид можно вводить на всю поверхность поражения или на любую его часть. Необязательно, введение также включает участок кожи, прилегающий к пораженной поверхности тела.

Предпочтительно дерматологическое заболевание включает по меньшей мере одну язву. Согласно настоящему изобретению полипептид можно вводить по меньшей мере в часть одной язвы. «По меньшей мере, одна часть», как используется здесь, включает любое соотношение от 0 до 100%, например, от 10 до 90%, от 20 до 80%, от 30 до 70%, от 40 до 60% и примерно 50%; таким образом, полипептид можно вводить на всю поверхность язвы или в любую ее часть. Необязательно, введение также включает участок кожи, прилегающий к язве.

Сахарный диабет - распространенное и изнурительное заболевание, поражающее множество органов, включая кожу. В настоящее время подсчитано, что от тридцати до семидесяти процентов пациентов с сахарным диабетом, как типа 1, так и типа 2, в какой-то момент в течение жизни будут иметь кожные осложнения сахарного диабета. Независимо от таких теоретических соображений, которые никоим образом не ограничивают настоящее изобретение, способы обнаружения диабета хорошо известны в данной области. Способы выявления диабета, в одном варианте осуществления, не являются частью настоящего изобретения, но они помогают в определении подгруппы субъектов, подверженых риску дерматологических заболеванией, таким как описанные в данном документе, и может это помочь в лечении или профилактике такого дерматологического расстройства в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления средство согласно настоящему изобретению предназначено для введения пациентам с диабетом, страдающим нейропатией, такой как, в частности, периферическая нейропатия. Способы выявления нейропатии и прогнозирования развития язвы стопы у людей с такими заболеваниями, как сахарный диабет, известны (например, описаны в WO/2010/128519 A1 без ограничения таковыми).

Полипептид по изобретению можно вводить на пораженную кожу диабетического субъекта, предпочтительно на кожные поражения, характеризующиеся, по меньшей мере, частичным абляцией дермы и, необязательно (только) дермы у такого субъекта. В одном из вариантов осуществления пораженная поверхность тела представляет собой или включает поражение, в частности поражение кожи такого субъекта. Предпочтительно введение включает введение в/на язву, в частности язву стопы, у пациента с диабетом.

Диабетические язвы, в частности язвы диабетической стопы, являются серьезным осложнением сахарного диабета. В контексте настоящего изобретения термин «диабетическая язва» конкретно не ограничивается, за исключением того, что язва является язвой у диабетического субъекта. По некоторым оценкам, пациенты с диабетом могут иметь высокий риск нетравматической ампутации по сравнению с лицами, не страдающими диабетом, в пять-пятнадцать раз больше (например, WO/2003/075949 A1). При отсутствии лечения или без успешного лечения, язвы диабетической стопы могут быть трудно излечимыми у некоторых субъектов и даже могут потребовать ампутации, особенно если они сопровождаются другими осложнениями или нарушениями, такими как инфекция. Действительно, сахарный диабет может поражать несколько систем органов. Дерматологические проявления сахарного диабета имеют различные последствия для здоровья, начиная от тех, которые касаются эстетики, до тех, которые при отсутствии лечения могут стать опасными для жизни. Дерматологические последствия сахарного диабета описаны, например, в Rosen et al., 2000, Endotext, De Groot et al., Eds, South Dartmouth (MA, USA), MDText.com, Inc. Настоящее изобретение предоставляет лечение и/или профилактику таких дерматологических последствий диабета.

В некоторых вариантах осуществления полипептид по настоящему изобретению предназначен для введения пациенту с диабетом, перенесшему операцию. Соответственно, полипептид по настоящему изобретению подходит для лечения или предотвращения одного или нескольких послеоперационных осложнений, таких как пролежни, у пациента с диабетом и/или для лечения хирургических ран.

В целом, раны, помимо диабетической язвы, особенно диабетической язвы стопы, а также пролежней и обширных/глубоких хирургических ран, могут быть трудно заживаемыми даже при приеме лекарств, вероятно, из-за большого размера пораженных участков. Если вовремя не лечить такие раны, они ухудшатся и впоследствии могут стать неизлечимыми и опасными для жизни. Настоящее изобретение предоставляет лечение и/или профилактику таких дерматологических проявлений диабета. Действительно, согласно настоящему изобретению эффективное медицинское лечение может не только помочь пациентам избавиться от этих кожных осложнений, но также может обеспечить им лучшее качество жизни, сокращение расходов на медицинское обслуживание или даже увеличение продолжительности жизни.

Настоящее изобретение также подходит для лечения пораженных поверхностей тела, в частности язв большого размера, у диабетиков и недиабетиков. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение подходит для лечения больших пораженных поверхностей тела диаметром 5 мм или более, например 1 см или более. Дополнительные детали пораженной поверхности тела, включая определенные варианты диаметра пораженной поверхности тела, описаны выше.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает преимущество перед современными методами лечения, которые часто не могут обеспечить эффективный способ лечения ран большой площади. Настоящее изобретение обеспечивает лечение и/или профилактику таких дерматологических проявлений, включая раны большой площади, у субъектов с диабетом и субъектов, не страдающих диабетом.

Согласно настоящему изобретению полипептид подходит для лечения или профилактики пролежней, включая хронические пролежни. В частности, пролежни (травмы давлением) включают пролежни на разных стадиях и пролежни разных типов.

В предпочтительных вариантах осуществления средство согласно настоящему изобретению предназначено для лечения или профилактики язвы и с этой целью вводится в(на) язву. Согласно настоящему изобретению язва, в которую вводят полипептид, предпочтительно выбирается из группы, состоящей из диабетических язв, травматических язв, хирургических язв, пролежней, хронических язв и комбинаций любых из вышеперечисленных. В конкретных вариантах осуществления изобретения язвы выбраны из язв диабетической травмы, диабетических хирургических язв, диабетических пролежней, диабетических хронических язв, травматических диабетических язв, травматических хирургических язв, травматических пролежней, травматических хронических язв, хронических хирургических язв, хронических пролежней и других язв. В некоторых вариантах осуществления изобретения язвы выбраны из травматических язв, хирургических язв, пролежней и хронических язв субъектов с диабетом. В некоторых вариантах осуществления изобретения язвы выбраны из травматических язв, хирургических язв, пролежней и хронических язв субъектов, не страдающих диабетом.

Настоящее изобретение не ограничено лечением субъектов с одной язвой или субъектов с множественными язвами. Среди субъектов, страдающих множественными язвами, настоящее изобретение не ограничено ни лечением только одной из этих язв, ни лечением определенного количества этих язв, ни лечением всех этих язв. Таким образом, термины «язва» и «язвы», независимо от их использования в единственном или множественном числе в настоящем раскрытии, явно включают все эти варианты осуществления и не ограничиваются каким-либо конкретным количеством язв у субъекта или каким-либо конкретным количеством язв, подлежащих лечению.

Было установлено, что язва стопы при диабете может быть связана либо с нейропатией (нейропатическая язва), либо с заболеванием периферических сосудов (ишемическая язва), либо с обоими (нейроишемическая язва), хотя окончательный этиопатогенетический путь может включать сочетание этих основных факторов риска и других причинных факторов, таких как травма. Таким образом, в одном варианте осуществления полипептид по изобретению предназначен для профилактики и/или лечения ишемических язв, включая ишемические язвы стопы. В альтернативном варианте осуществления полипептид по изобретению предназначен для профилактики и/или лечения нейропатических язв, включая нейропатические язвы стопы. Наконец, полипептид по изобретению может использоваться для профилактики и/или лечения нейроишемических язв, включая нейроишемические язвы стопы. Все вышеупомянутые язвы необязательно являются диабетическими язвами, хотя это не является обязательным требованием.

В некоторых вариантах осуществления полипептид по настоящему изобретению вводят субъекту, страдающему ишемией. Ишемия может быть локальной или системной. В некоторых вариантах осуществления введение согласно настоящему изобретению может уменьшить ишемию у субъекта. Уменьшение ишемии может быть местным или системным.

В некоторых вариантах осуществления полипептид по настоящему изобретению вводят субъекту, страдающему нейропатией. В предпочтительных вариантах осуществления средство согласно настоящему изобретению предназначено для введения субъекту, страдающему нейропатией, такой как, в частности, периферическая нейропатия. Такие субъекты могут быть диабетиками или недиабетиками. Действительно, сообщалось, что у большинства пациентов с диабетической язвой имеется основная нейропатия (Ndip et al., 2012, Int. J. Gen. Med., Vol. 5, p. 129-134). Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления полипептид согласно настоящему изобретению вводят субъекту с диабетом, страдающему нейропатией. Нейропатия может быть местной или системной. В некоторых вариантах осуществления введение согласно настоящему изобретению может уменьшить нейропатию у субъекта. Уменьшение нейропатии может быть местным и/или системным. В одном варианте осуществления уменьшение нейропатии включает уменьшение нейропатии в области, в которую введен полипептид по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления уменьшение нейропатии включает уменьшение нейропатии в органе, в который вводят полипептид по изобретению.

Лечение или профилактика в соответствии с настоящим изобретением может осуществляться путем введения, предпочтительно местного введения, полипептида по изобретению. В некоторых вариантах осуществления введение осуществляется в стационаре (лечебном учереждении). В некоторых вариантах лечение не осуществляется в стационаре.

Необязательно, но без взаимоисключения, дерматологическое заболевание включает по меньшей мере ожог или механическое повреждение. Таким образом, настоящее изобретение также включает лечение или профилактику ожогов и механических повреждений, при этом лечение таких повреждений практически более значимо, чем профилактика.

Предпочтительно млекопитающее, которому вводят полипептид по изобретению, предпочтительно человек, страдает сахарным диабетом или имеет предрасположенность к сахарному диабету; соответствующий субъект упоминается здесь как «субъект-диабетик». В типичных вариантах осуществления сахарный диабет выбирается из сахарного диабета 1 типа и сахарного диабета 2 типа.

Язвы стопы и другие дерматологические заболевания часто встречаются у пациентов с диабетом. Другие дерматологические нарушения также можно лечить и/или предотвращать на основании настоящего изобретения. Одной из основных причин язв стопы у пациентов с диабетом является нейропатия (повреждение нервов), из-за которой человеку сложно идентифицировать такие повреждения стопы, как порезы, синяки и сдавливание.

Таким образом, в одном варианте осуществления полипептид вводят субъекту с язвой стопы. В одном варианте осуществления полипептид вводят субъекту с диабетической язвой стопы (DFU). Действительно, язвы стопы и сопутствующие им осложнения часто встречаются у пациентов с диабетом, у большинства из которых имеется основная нейропатия (Ndip et al., 2012, Int. J. Gen. Med., Vol. 5, p. 129-134). Такие язвы также называются диабетической нейропатической язвой стопы. Таким образом, предпочтительно, полипептид вводят субъекту с диабетической нейропатической язвой стопы.

Необязательно, введение полипептида согласно настоящему изобретению также включает аспект улучшения эстетического внешнего вида субъекта, в частности поверхности тела субъекта. В некоторых вариантах осуществления закрытие раны достигается в результате введения в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления образование рубцов минимально. Таким образом, введение в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает также косметическое преимущество субъекту на излечении по сравнению с необработанными субъектами. Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу косметического лечения субъекта, где способ включает введение полипептида с SEQ ID NO: 3 или 4.

В другом варианте осуществления средство согласно настоящему изобретению предназначено для лечения или профилактики рака кожи, например, гемангиомы, и/или кожных заболеваний, связанных с такими видами рака без ограничения таковыми.

В дополнительном воплощении средство по настоящему изобретению предназначено для лечения или профилактики дерматологического нарушения, которое возникает в результате генетического нарушения у субъекта или на которое влияет генетическое нарушение у субъекта.

Введение агента

Настоящее изобретение предоставляет гетерологичный полипептид для введения субъекту.

Предпочтительно, полипептид предназначен для местного применения. Таким образом, предпочтительно, полипептид по изобретению вводят в(на) кожу или, если кожа повреждена или отсутствует, на поверхность тела в том месте, где кожа могла бы присутствовать, если бы она не была пораженна или отсутствовала. В некоторых вариантах осуществления полипептид вводят в эпидермис. В некоторых вариантах осуществления полипептид вводят на дерму. В некоторых вариантах осуществления полипептид вводят в ткань, которая обычно находится под эпидермисом, например, в подкожную область, без ограничения таковой.

Более предпочтительно, полипептид вводят на пораженную поверхность тела. Другими словами, полипептид согласно настоящему изобретению предпочтительно вводят местно, более предпочтительно вводят местно на участок кожного заболевания (например, язвы).

Введение согласно настоящему изобретению обычно не связано с хирургическим вмешательством. В одном варианте осуществления введение полипептида по изобретению не является хирургическим вмешательством и не включает инвазивный этап, представляющий собой существенное физическое вмешательство в организм, которое требует профессиональных медицинских знаний и которое влечет за собой существенный риск для здоровья, даже при проведении такового с требуемым профессионализмом и опытом. Напротив, в более типичных вариантах осуществления введение полипептида по изобретению, в частности местное введение, обычно считается безопасным для субъекта, и поэтому полипептид может вводиться самим субъектом, особенно в случае субъекта-человека.

Необязательно, язва закрывается повязкой до и/или во время и/или после введения. Огромное разнообразие доступных типов перевязочных материалов не ограничивается настоящим изобретением. Таким образом, можно использовать любую повязку, если она явно не является технически неподходящей. В некоторых вариантах осуществления полипептид согласно изобретению вводят одновременно с наложением повязки на рану; необязательно, повязка на рану содержит полипептид по изобретению, необязательно в форме водной среды, наносимой на повязку перед введением.

Предпочтительно полипептид вводят (наносят) субъекту с язвой стопы на ступню указанного субъекта ниже лодыжки.

В одном из вариантов реализации полипептид вводят однократно.

В альтернативном и более предпочтительном варианте полипептид вводят повторно. В особенно предпочтительном варианте полипептид вводят повторно от одного до пяти раз в день. В одном варианте полипептид вводят один раз в день (см. также Пример 3). В одном варианте полипептид вводят два раза в день (см. также Пример 5). В одном варианте полипептид вводят три раза в день. В одном варианте полипептид вводят четыре раза в день. В одном варианте полипептид вводят пять раз в день. Особенно предпочтительно, чтобы полипептид вводился человеку два раза в день. Все вышеупомянутые введения предпочтительно повторяют в течение нескольких дней, как описано в данном документе. Например, полипептид можно вводить повторно в течение периода от трех до 30 дней, предпочтительно от семи до 14 дней и предпочтительно от одного до пяти раз в каждый из этих дней.

В одном варианте полипептид вводят повторно до закрытия пораженной поверхности тела. Альтернативно, полипептид вводят однократно, и введение прекращают после этого однократного введения. Альтернативно полипептид вводят повторно в течение периода от трех до 30 дней, предпочтительно от семи до 14 дней. Необязательно, введение прекращают после завершения указанного интервала.

В некоторых вариантах осуществления агент вводят таким образом, чтобы он вступал в прямой контакт с ноцицептивными волокнами (нервами). В некоторых вариантах осуществления агент вводится таким образом, что он находится в прямом контакте с полностью обнаженными ноцицептивными волокнами (нервами); ноцицептивные волокна (нервы) считаются полностью обнаженными в случае отсутствия кожи, что типично для пораженной поверхности тела. В некоторых вариантах осуществления агент вводят таким образом, чтобы он вступал в прямой контакт с гиперактивированными ноцицептивными волокнами (нервами); ноцицептивные волокна (нервы) считаются гиперактивированными в результате поражения кожи. В некоторых вариантах осуществления агент вводят таким образом, чтобы он вступал в прямой контакт с гиперактивированными ноцицептивными волокнами (нервами). Предпочтительно, в частности, в таких вариантах осуществления агент не вызывает гипералгезический синдром (боль). Ранее в распоряжение медицинского сообщества не предоставлялся агент с такими свойствами. По этой и другим причинам настоящее изобретение обладает существенным преимуществом.

Доза

Описанные здесь агенты и композиции вводятся в эффективных количествах. В соответствии с настоящим изобретением «эффективное количество» представляет собой такое количество или дозу, при которых достигается желаемая реакция или желаемый эффект либо после однократной дозы, либо в сочетании с дополнительными дозами. В случае лечения конкретного расстройства желаемая реакция предпочтительно связана с торможением течения заболевания. Это включает замедление развития болезни и, предпочтительно, прерывание или регрессию болезни. Желаемая реакция при лечении заболевания или состояния может также включать отсрочку начала заболевания или предотвращение указанного заболевания или указанного состояния. В некоторых вариантах осуществления желаемая реакция включает полное исцеление симптомов расстройства локально и/или системно.

Эффективное количество агента или композиции, описанных в данном документе, будет зависеть от состояния или расстройства, подлежащего лечению, тяжести расстройства, индивидуальных параметров субъекта, которому вводят агент, таких как возраст, физиологическое состояние, сопутствующее состояние (при наличии), рост и вес, продолжительность лечения, тип сопутствующей терапии (при наличии), конкретный способ введения и другие параметры. Соответственно, вводимые дозы агентов, описанных в данном документе, могут зависеть от различных таких параметров. В случае, если реакция пациента на начальную дозу недостаточна, можно использовать более высокие дозы (или, по сути, более высокие дозы, достигаемые при другом, более локализованном пути введения).

Согласно настоящему изобретению подходящие и практически эффективные дозировки для введения терапевтического агента субъекту-человеку для лечения и/или предотвращения кожного заболевания, такого как хроническая кожная язва и ожоговые раны, могут быть определены на основании экспериментально определенных подходящих и терапевтически эффективных доз для введения терапевтического агента субъекту-грызуну, в частности, мыши, для лечения и/или предотвращения кожного заболевания, такого как хроническая кожная язва и ожоговые раны. Руководство доступно в «Руководстве для промышленных хронических кожных язв и ожоговых ран - Разработка продуктов для лечения», опубликованном Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, 2006 г. (Guidance for Industry Chronic Cutaneous Ulcer and Burn Wounds - Developing Products for Treatment”, published by U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration, 2006).

Животные модели кожных поражений (ран) (Примеры 3 и 4) помогут установить фармакологические реакции, а также оценить потенциальную токсичность продуктов при обработке ран. В некоторых вариантах осуществления доза, которую следует вводить субъекту, представляет собой дозу, описанную в Примере 3, или в Примере 4, или в Примере 5.

Предпочтительно доза вводимого полипептида определяется на основе поверхности пораженной поверхности тела, подлежащей лечению. Предпочтительно определение проводят в начале лечения. В одном варианте осуществления дозирование корректируется для более позднего введения(й) в зависимости от размера поверхности пораженной части тела в момент времени такого более позднего введения(й). В альтернативном варианте осуществления дозирование не корректируется для более позднего введения(й), так что доза введения зависит исключительно от размера поверхности пораженной поверхности тела, подлежащей лечению в начале введения (первое дозирование), и последующие дозы соответствуют первой дозе.

В одном варианте осуществления доза/каждая доза составляет от 0,3 до 6 мкг полипептида на мм2 обрабатываемой поверхности пораженного тела (от 0,3 до 6 мкг/мм2).

Необязательно, во всех вариантах осуществления согласно настоящему изобретению доза рассчитывается на основе фактического размера пораженной поверхности тела (например, язвы) на момент лечения. Другими словами, доза может быть подвергнута расчету (пересчету) в каждый момент времени введения на основе фактического размера пораженной поверхности тела (например, язвы) в этот момент времени.

Процесс получения полипептида

В одном варианте осуществления полипептид SEQ ID NO: 3 и полипептид SEQ ID NO: 4 можно получить из биологического источника. Необязательно, полипептид SEQ ID NO: 3 и полипептид SEQ ID NO: 4 можно получить путем рекомбинантной экспрессии. Для этой цели открытую рамку считывания, кодирующую соответствующий полипептид, вводят в продуцент рекомбинантных белков, например клетку-хозяин или бесклеточную систему белковой экспрессии. Действительно, учитывая, что человеческий NGF продуцируется in vivo только в незначительных количествах, мышиный NGF обычно продуцируется как гетерогенная смесь различных белков (см. WO 2000/022119 A1), а полипептиды по настоящему изобретению являются неприродными и, следовательно, не продуцируются in vivo вообще, наиболее значимую возможность получения полипептида по настоящему изобретению предоставляет рекомбинантная экспрессия в соответствии с эквивалентными подходами для NGF дикого типа уровня техники (WO 2000/022119 A1, WO 2008/006893 A1; Rattenholl et al., Eur. J. Biochem, 2001, том 268, стр. 3296-3303, US 2018/0086805 A1). Однако получение таких полипептидов со степенью чистоты, достаточной для введения млекопитающему, представляло собой постоянную проблему. Эта проблема была преодолена авторами настоящего изобретения, как подробно раскрыто в данном документе (см. также Примеры 1 и 2).

Предпочтительно, полипептид согласно настоящему изобретению может быть получен путем рекомбинантной экспрессии в бактериях. Более предпочтительно, полипептид согласно настоящему изобретению может быть получен путем цитозольной рекомбинантной экспрессии в бактериях. В целом бактериальные клетки, в частности E. coli, способны к рекомбинантной продуции значительного количества рекомбинантных белков, но, как и в случае многих других рекомбинантно экспрессируемых генов, продуцирование рекомбинантного NGF и подобных полипептидов в бактериях приводит к биологически неактивному продукту трансляции, который затем накапливается в клетке (цитозоле) в форме агрегатов (так называемых телец включения (IB)) (WO 2000/022119 A1; US2018/0086805 A1). В отличие от NGF, про-NGF известен как довольно нестабильный белок и требует значительных усилий для повторной укладки и очистки при низкой скорости восстановления, что делает процесс производства NGF через про-NGF в бактериях относительно сложным и дорогостоящим. Таким образом, основные трудности, связанные с продуцируемым бактериями NGF и сходными полипептидами, продуцируемых бактериями, через соответствующие проформы, касаются фолдинга (укладки), обработки и очистки рекомбинантного белка. Эти трудности теперь решены (см. Примеры 1 и 2). В результате полипептиды SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 становятся доступными со степенью чистоты, подходящей для введения млекопитающему, включая человека.

Предпочтительно, полипептид по настоящему изобретению экспрессируется вместе с пропоследовательностью. Без ограничения таковой, подходящей пропоследовательностью является пропоследовательность человеческого NGF дикого типа (позиции аминокислот с 18 по 121 SEQ ID NO: 1), обычно слитая с N-концом полипептида SEQ ID NO: 3. или 4. Для NGF дикого типа, хотя пропоследовательность не является частью зрелого NGF и, следовательно, не требуется для биологической функции NGF, присутствие ковалентно присоединенной пропоследовательности, как было показано, способствует повторному сворачиванию рекомбинантного NGF из телец включения, с сопутствующим образованием дисульфидной связи в зрелой части (бета-NGF). Таким образом, наличие ковалентно присоединенной пропоследовательности положительно влияет на выход и скорость повторного сворачивания по сравнению с повторным сворачиванием in vitro зрелого NGF из телец включения (Rattenholl et al., Eur. J. Biochem, 2001, т. 268, с. 3296-3303). Без связи с какой-либо конкретной теорией, то же самое является правдоподобным и постулируется здесь для полипептидов с SEQ ID NO: 3 и 4.

Таким образом, когда полипептид согласно настоящему изобретению продуцируется в тельцах включения, требуется правильная укладка, и это обычно достигается посттрансляционно, как и отщепление ковалентно присоединенной пропоследовательности; сложные методы фолдинга, расщепления и очистки были предложены в прошлом, в частности, для человеческого NGF дикого типа. Примечательно, что в большинстве опубликованных исследований NGF применяется общий режим рефолдинга, который ранее был установлен Rattenholl et al. (2001, Eur. J. Biochem, т. 268, стр. 3296-3303). В рамках этого оригинального исследования были подробно исследованы несколько параметров рефолдинга белка (например, температура, временной период рефолдинга, pH реакции рефолдинга, и концентрация белка, аргинина и глутатиона) и оценено их влияние на эффективность рефолдинга. Протокол Rattenholl et al. основан на ре-натурации проформы, которая имеет очень плохую растворимость, может быть получена из телец включения после рекомбинантного продуцирования в прокариотах, вследствии которой про-NGF солюбилизируется в растворе денатурирующего агента в денатурирующей концентрации, переносится в раствор, который не является денатурирующим в принципе или незначительно денатурирует, так что растворимость сохраняется, и таким образом растворенный денатурированный про-NGF может принимать биологически активную конформацию, включая образование дисульфидных связей, как в нативном NGF, после чего NGF очищается, а пропоследовательность удаляется протеолитически (WO 2000/022119 A1; Rattenholl et al., Eur. J. Biochem, 2001, т. 268, стр. 3296-3303). Примечательно, что в рамках этого исследования было обнаружено, что низкая концентрация белка приводит к более высокому удельному выходу правильно сложенного продукта по сравнению с более высокой концентрацией белка. Примерные концентрации белка около 50 мг на литр реакции рефолдинга привели к удельному выходу примерно 25% правильно свернутого про-NGF, в то время как эта фракция снижалась до 10% при концентрациях белка 500 мг на литр. На основании этого Rattenholl et al. предполагают, что концентрация белка в растворе рефолдинга должна быть очень низкой: согласно Rattenholl et al., ожидается выход 15-20 мг правильно свернутого белка на литр реакции рефолдинга. Однако необходимо масштабирование процесса (например, за пределы лабораторных масштабов) для очистки даже нескольких сотен мг рекомбинантного белка.

Хотя человеческий про-NGF содержит нативный сайт расщепления для протеазы Furin (Arg1-Ser2-Lys3-Arg4; R1S2K3R4), и фурин (Furin) расщепляет про-NGF в этом сайте in vivo, фурин недоступен коммерчески в значимой степени очистки или количестве. Согласно настоящему изобретению полипептид согласно настоящему изобретению при экспрессии вместе с пропоследовательностью, например в E. coli, предпочтительно расщепляется протеазой трипсином (EC 3.4.21.4), которая имеется в продаже. Действительно, для NGF дикого типа сообщалось, что трипсин дает удовлетворительный биологически активный зрелый NGF, который в конечном итоге может быть очищен (Rattenholl et al., Eur. J. Biochem, 2001, vol. 268, p. 3296-3303), а протеолиз рекомбинантно экспрессируемого про-NGF с помощью трипсина тем временем получил поддержку других исследователей (например, D'Onofrio et al., 2011, PLoS One, vol. 6, e20839). Однако позже было показано, что расщепление про-NGF дикого типа с помощью трипсина с образованием бета-NGF связано с несколькими недостатками, так как низкие количества трипсина могут привести к неэффективному расщеплению, тогда как высокие количества трипсина еще больше снижают селективность расщепления, поскольку трипсин способен расщеплять С-конец любого остатка по аргинину и лизину (остатки R и K), так что при расщеплении трипсином содержащего R1S2K3R4 про-NGF можно получить несколько альтернативных продуктов расщепления; таким образом, использование трипсина в качестве фермента расщепления привело бы к очень низким выходам правильно расщепленного NGF, а также к проблемам с очисткой и выходом, поскольку эти различные продукты расщепления при учете экономических затрат нерентабельно разделять в стандартных условиях. В качестве одного решения предлагалось экспрессировать вариант про-NGF, где R1S2K3R4 сайт расщепления протеазой в пропептиде содержит замены другими аминокислотами, по меньшей мере, в позициях R1 и K3, соответствующих позициям 101 и 103 последовательности про-NGF дикого типа человека (SEQ ID NO: 1) (WO 2013/092776 A1). В одном примере R1 и K3, соответственно, заменены валином (V) и аланином (A), трансформируя исходный сайт расщепления фурином R1S2K3R4 в V1S2A3R4, где трипсин способен специфически расщеплять только C-концевой R4; Опосредованное трипсином расщепление соответствующего про-NGF также может называться «методом VSAR». Хотя WO 2013/092776 A1 ничего не говорит о полипептидах SEQ ID NO: 3 или 4 согласно настоящему изобретению, метод VSAR изначально предлагался для применения к определенным вариантам про-NGF мутеинов, хотя сообщалось, что условия протеолиза необходимо балансировать с осторожностью (US 2018/0086805 A1). В ходе разработки настоящего изобретения авторы настоящего изобретения обнаружили, что технология VSAR, вопреки ранее высказанным предположениям, не решает удовлетворительным образом проблемы очистки, связанные с получением рекомбинантного полипептида по настоящему изобретению удовлетворительной степени чистоты. Действительно, очистка рекомбинантно экспрессируемого бета-NGF или мутеинов такового не только от белков клетки-хозяина (HCP), но также от трипсина (или другой протеазы, используемой для расщепления) все еще является проблемой; разумеется, требуется, чтобы протеолитический фермент (такой как трипсин) отсутствовал в конечном препарате фармацевтического белка, чтобы избежать протеолиза во время хранения полипептида, чтобы полипептид сохранялся по существу чистым и без деградации до момент введения такового субъекту согласно настоящему изобретению. Авторы настоящего изобретения решили эту задачу, как изложено в описании. Таким образом, настоящее изобретение делает полипептид согласно SEQ ID NO: 3 или 4 доступным с высокой чистотой и, таким образом, по существу свободным от трипсина и/или продуктов деградации полипептида. Хотя определенные способы получения NGF (например, WO2013092776 A1) и полипептида SEQ ID NO: 4 (например, Malerba et al., 2015, PLOS One, vol.10, e0136425) были описаны ранее, авторы настоящего изобретения, к своему удивлению, обнаружили, что ранее опубликованные способы недостаточны для получения соответствующего полипептида высокой чистоты. В качестве решения этого недостатка авторы настоящего изобретения предложили новый процесс и связанные с ним аспекты, как подробно описано в данном документе.

Способ получения полипептида SEQ ID NO: 3 и полипептида SEQ ID NO: 4 путем рекомбинантной экспрессии, например, в клетке-хозяине согласно настоящему изобретению может включать очистку. Очистка в самом широком смысле означает, что полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 должен быть отделен от других молекул, включая другие белки, такие как белки клетки-хозяина. Таким образом, очистка может включать отделение полипептида от одной или нескольких других молекул, включая другие белки, такие как белки клетки-хозяина, протеазы (например, трипсин) и/или продукты разложения полипептида согласно изобретению.

Способ получения полипептида SEQ ID NO: 3 и полипептида SEQ ID NO: 4 согласно настоящему изобретению предпочтительно включает следующие стадии:

(а) получение предшественника полипептида SEQ ID NO: 3 или полипептида SEQ ID NO: 4,

(d) очистка,

где очистка на стадии (d) обычно включает очистку на стационарной фазе в смешанном режиме стационарной фазы. Таким образом, в одном варианте осуществления полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 может быть получен путем рекомбинантной экспрессии и очистки, где очистка включает очистку в смешанном режиме стационарной фазы. Термин «в смешанном режиме стационарной фазы» следует понимать в широком смысле, где он означает, что смесь, содержащая полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 или предшественник любого из них, вместе с другими видами молекул, подвергается воздействию в стационарной фазе в смешанном режиме, например на стадии хроматографии или другой подходящей технологической стадии. Действительно, предпочтительно смесь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 или предшественник любого из них, вместе с другими видами молекулярных соединений, подвергают хроматографии, таким образом, что очистка на стадии (d) включает очистку путем смешанной хроматографии. Предпочтительно, хроматография в смешанном режиме включает использование неподвижной фазы, имеющей заряженную группу, предпочтительно отрицательно заряженную группу, ароматическую группу и/или гидрофобную группу.

Очистка в самом широком смысле в соответствии с настоящим изобретением означает, что полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 по изобретению, по меньшей мере, частично отделяется от других видов молекулярных соединений, включая другие белки, такие как белки клетки-хозяина, предшественники и/или продукты разложения. В результате можно получить полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, который по меньшей мере частично очищен. В то время как другие молекулярные частицы могут быть необязательно удалены или сохранены, полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 предпочтительно извлекается и сохраняется очищенным.

Предпочтительно, хроматография в смешанном режиме включает использование стационарной (неподвижной) фазы, имеющей заряженную группу, предпочтительно отрицательно заряженную группу, ароматическую группу и/или гидрофобную группу.

Каждый из этих этапов сам по себе может включать в себя несколько действий, которые для простоты также могут называться стадиями. Для иллюстративных целей и как подробно описано ниже, стадия (d) может включать более одной стадии очистки, например, на более чем одной стационарной фазе.

Любые буква или цифры, используемые здесь для обозначения одного или нескольких этапов процесса, например, (a), (b), (c), (d), (d1), (d2) не должны быть поняты как ограничение, а, скорее, как предоставленные для справки. Не следует понимать, что последовательность событий в процессе или использовании согласно настоящему изобретению может быть ограничена алфавитной последовательностью (буквами) или числовой последовательностью (числами). Несмотря на вышесказанное, настоятельно рекомендуется, чтобы последовательность событий в процессе или использовании согласно настоящему изобретению была последовательностью, описанной здесь.

Дополнительные аспекты хроматографии в смешанном режиме и наиболее подходящие стационарные фазы будут описаны более подробно ниже, но эти аспекты в целом применимы к настоящему изобретению. Таким образом, в частности, все те стационарные фазы, включая все их варианты осуществления, описаные ниже как наиболее подходящие для хроматографии в смешанном режиме на стадии (d2), обычно пригодны для очистки полипептида SEQ ID NO: 3 и/или полипептида SEQ ID NO: 4 согласно настоящему изобретению, и могут быть использованы во всех типах вариантов осуществлений, например, в сочетании со стадией (d1) улавливающей хроматографии или без нее. Действительно, в Примере 2B описывается, что некоторые преимущества могут быть достигнуты при использовании хроматографии в смешанном режиме в варианте протокола в соответствии с уровнем техники.

Необязательно, полипептид SEQ ID NO: 3 или полипептид SEQ ID NO: 4 можно получить в процессе, который включает (ре)фолдинг и/или хроматографическую очистку и/или расщепление протеазой, и, возможно, доведение белка до конечной концентрации и/приготовление желаемого препарата.

Таким образом, введение полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 нуждающемуся в этом субъекту, как раскрыто в настоящем документе, также возможно благодаря промышленно значимой степени очистки и выходу полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID. NO: 4, осуществление которых на основании раскрытия в данном документе становится возможным для специалиста. Таким образом, настоящее раскрытие также описывает процесс получения полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4.

Способ получения полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 согласно настоящему изобретению предпочтительно включает следующие стадии:

(а) получение предшественника полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, например, путем рекомбинантной экспрессии,

(d) очистка, где очистка включает очистку на стационарной фазе в смешанном режиме.

В настоящем изобретении также предпочтительно, чтобы предшественник полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 подвергался стадии

(c) воздействие протеазы.

Указанное воздействие обычно проводят перед этапом (d).

Способ настоящего изобретения предпочтительно также отличается тем, что перед воздействием протеазы не проводят хроматографическую очистку. Действительно, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что расщепление протеазой работает хорошо и эффективно также в неочищенной фракции, полученной из клетки-хозяина, т.е. когда перед воздействием протеазы не проводится хроматографическая очистка.

Предпочтительно, стадия получения (а) включает экспрессию предшественника полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, предпочтительно рекомбинантную экспрессию. Более предпочтительно рекомбинантная экспрессия осуществляется в клетке-хозяине. По завершении культивирования клеток-хозяев полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 получают во фракции клеточной культуры. Фракция может состоять из клеток-хозяев, т.е. в случае, когда белок по существу не секретируется из клеток-хозяев. Это действительно так, например, когда полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 продуцируется в тельцах включения и/или иным образом оказываются во внутриклеточном компартменте, включая цитозоль. Подходящие клетки-хозяева могут быть выбраны из прокариотических и эукариотических клеток-хозяев, хотя в типичных вариантах осуществления предпочтительны прокариотические клетки-хозяева. Предпочтительные прокариотические клетки-хозяева включают Escherichia coli (E. coli), предпочтительно E. coli Rosetta (DE3). В одном варианте осуществления полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 получают в конформации, отличной от нативной конформации, и/или в агрегатах, наиболее предпочтительно в тельцах включения. Затем, предпочтительно, способ настоящего изобретения включает стадию (b) (ре)фолдинга полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Предпочтительно, чтобы стадия (c) выполнялась после стадии (b).

Предпочтительно, на стадии (c) протеаза представляет собой протеазу, способную расщеплять полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 таким образом, что освобождается (зрелый) полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. В конкретном варианте осуществления указанной протеазой является трипсин, предпочтительно трипсин свиньи, необязательно экспрессируемый рекомбинантно.

Предпочтительно стадия очистки (d) включает следующие стадии, предпочтительно в последовательном порядке:

(d1) улавливание,

(d2) полировка.

Предпочтительно, стадию улавливания (d1) проводят посредством хроматографии, предпочтительно колоночной хроматографии. Более предпочтительно, указанная стадия улавливания (d1) осуществляется с использованием стационарной фазы катионообменной хроматографии или стационарной фазы хроматографии в смешанном режиме. Наиболее предпочтительно, указанную стадию улавливания (d1) проводят с использованием стационарной фазы хроматографии в смешанном режиме, которой предпочтительно является Capto MMC.

Предпочтительно стадию полировки (d2) проводят посредством хроматографии, предпочтительно колоночной хроматографии. Более предпочтительно, указанную стадию полировки проводят с использованием стационарной фазы катионообменной хроматографии. В еще более предпочтительном варианте, указанную стадию улавливания (d1) проводят с использованием SP-сефарозы, предпочтительно SP-сефарозы с малым размером частиц. SP является аббревиатурой названия сульфопропила.

Необязательно, способ согласно настоящему изобретению включает дополнительную стадию доведения белка до конечной концентрации и приготовления желаемого препарата. В результате получается композиция согласно изобретению.

Другими словами, настоящее изобретение предоставляет способ проведения хроматографии в смешанном режиме для получения полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Хроматография в смешанном режиме полезна при получении полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ. ID NO: 4. В предпочтительных вариантах осуществления предшественник полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 подвергается действию протеазы с целью расщепления, и хроматография в смешанном режиме используется на стадии, следующей за воздействием протеазы. В предпочтительных вариантах осуществления не проводят хроматографическую очистку полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 перед указанным воздействием протеазы.

Чистота полипептида

Полипептид по изобретению в большей степени или по существу не содержит компонентов, которые обычно сопровождают его в нативном состоянии. Полипептид по изобретению выделяют перед введением. В одном варианте осуществления «изолированный полипептид» относится к полипептиду, который был очищен от клеточной и внеклеточной среды, такой как ткань, которая окружает его в естественном состоянии, например, выделен из клетки, в которой он был экспрессирован, например, из клетки-хозяина. В другом варианте осуществления «изолированный полипептид» относится к полипептиду, выделенному и/или очищенному in vitro, соответственно, и к выделению такового из его естественного клеточного окружения, а также к очистке от ассоциации с другими компонентами окружающей среды, в которой полипептид обычно находится.

Предпочтительно полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 для использования согласно настоящему изобретению по существу не содержит примесей. Такой преимущественно чистый полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 можно получить, как описано в данном документе.

Полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, описанный здесь, рассматривается как фармацевтически активный пептид или белок.

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид согласно настоящему изобретению получают, по существу, свободным от продуктов деградации указанного полипептида. В частности, авторы настоящего изобретения наблюдали, что, в отличие от сообщений о человеческом NGF дикого типа на данном уровне техники, воздействие трипсина на предшественник SEQ ID NO: 4 характерным образом приводит к частичному расщеплению указанного предшественника на С-конце по аргининовому (Arg, R) остатку 9 SEQ ID NO: 4 либо до, либо после очистки, в случае если очистка не приводит к полному удалению трипсина (вариант des-nona, данные не показаны). С помощью специального метода очистки, предусмотренного в настоящем изобретении, полипептид в соответствии с настоящим изобретением может быть получен, по существу, свободным от трипсина и/или от варианта des-nona.

Предпочтительно полипептид, получаемый, как описано выше, по существу не содержит продуктов деградации. В частности, настоящее описание делает полипептид по изобретению доступным с новой, улучшенной степенью очистки, и предпочтительно, чтобы полипептид вводился при той же степени чистоты. Предпочтительно полипептид по изобретению для применения согласно изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 90%. Более предпочтительно, полипептид по изобретению для применения согласно изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 91%. Более предпочтительно, полипептид по изобретению для применения согласно изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 92%. Более предпочтительно, полипептид по изобретению для использования по изобретению характеризуется степенью чистоты не менее 93%. Более предпочтительно полипептид по изобретению для применения согласно изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 94%. Более предпочтительно, полипептид по изобретению для применения по изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 95%. Более предпочтительно, полипептид по изобретению для применения по изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 96%. Более предпочтительно, полипептид по изобретению для применения по изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 97%. Более предпочтительно, полипептид по изобретению для применения согласно изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 98%. Еще более предпочтительно, полипептид по изобретению для применения согласно изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 99%.

Наиболее предпочтительно, полипептид по изобретению для применения согласно изобретению характеризуется степенью очистки по меньшей мере 99,0%, например степенью чистоты более 99,1%, более 99,2%, более 99,3%, более 99,4%. %%, более 99,5%, более 99,6%, более 99,7%, более 99,8%, более 99,9%.

Здесь «степень чистоты» обычно относится к процентному содержанию (мас.) полипептида по настоящему изобретению по отношению к массе (мас.) биологического материала, отличного от полипептида согласно настоящему изобретению. Для иллюстрации, как правило, при степени чистоты 99,0% полипептид по настоящему изобретению присутствует в относительном количестве (весе) 99,0 единиц (например, 1,0 мг), а сумма весов всех биологических материалов, кроме полипептида по настоящему изобретению, составляет 1,0 единицы (например, 1,0 мг). Такой биологический материал, отличный от полипептида по настоящему изобретению, включает, без ограничения, белки клетки-хозяина, нуклеиновые кислоты, протеазы, такие как, например, трипсин, инактивированный или нет, продукты деградации полипептида по изобретению и другие макромолекулы биологического происхождения. В конкретном варианте осуществления степень «чистоты» относится к чистоте по сравнению с полипептидами, отличными от полипептидов по изобретению. Для иллюстрации, в этом варианте осуществления при степени чистоты 99,0% полипептид настоящего изобретения присутствует в относительном количестве (весе) 99,0 единиц (например, 1,0 мг), а сумма веса всех полипептидов, неидентичных полипептиду по настоящему изобретению составляет 1,0 единицы (например, 1,0 мг). Продукты деградации полипептида по настоящему изобретению, во избежание сомнений, включены в «полипептиды, неидентичные полипептиду по настоящему изобретению». Конкретным продуктом разложения является вариант des-nona (см. Примеры 1 и 2).

В частности, по существу не содержат des-nona вариант полипептида. Вариант des-nona представляет собой ранее не охарактеризованный продукт деградации полипептида по настоящему изобретению, который ассоциирован с продуцированием определенных вариантов NGF, включая полипептид по настоящему изобретению, за исключением случаев, когда полипептид продуцируется новым способом, описанным в настоящем документе (см., например, Примеры 1 и 2). «Практически не содержит» в данном контексте означает, что полипептид по изобретению для использования в соответствии с изобретением характеризуется степенью очистки по сравнению с вариантом des-nona, составляющей более 99,0%, например степенью очистки более 99,1%, более 99,2%, более 99,3%, более 99,4%, более 99,5%, более 99,6%, более 99,7%, более 99,8%, более 99,9%, по отношению к варианту des-nona. В наиболее предпочтительном варианте осуществления вариант des-nona не определяется и/или отсутствует.

Также предпочтительно, чтобы полипептид понастоящему изобретению практически не содержал протеаз (например, трипсина). «Практически свободный» в данном контексте означает, что полипептид по изобретению для использования в соответствии с изобретением характеризуется степенью чистоты по отношению к сумме весов всех протеаз (включая трипсин) более 99,0%, например, степенью чистоты более 99,1%, более 99,2%, более 99,3%, более 99,4%, более 99,5%, более 99,6%, более 99,7%, более 99,8%, более 99,9% по отношению к сумме весов всех протеаз (включая трипсин). В наиболее предпочтительном варианте осуществления трипсин не определяется и/или отсутствует.

Такая высокая степень чистоты в описанных выше вариантах осуществления делает препарат более приемлемым для регулирующих органов и квалифицирует полипептид по настоящему изобретению как лекарственное средство для применения на млекопитающих, включая человека в частности. Таким образом, степень чистоты согласно настоящему изобретению позволяет впервые использовать этот полипептид для введения/нанесения на пораженную поверхность тела, включая пораженную поверхность тела человека и, в частности, язвы, безопасным и надежным способом. Марка высокой степени чистоты в отношении протеазы (трипсин), в частности, позволяет хранить полипептид также в незамороженной форме.

Композиции

В некоторых вариантах осуществления полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, описанный в данном документе, содержится в композиции, содержащей дополнительно один или несколько носителей и/или один или несколько наполнителей. Используемый здесь термин «носитель» относится к органическому или неорганическому компоненту природного или синтетического характера, который комбинируется вместе с активным ингредиентом, чтобы сделать возможным, улучшить или облегчить применение активного ингредиента. Используемый здесь термин «наполнитель» предназначен для обозначения всех веществ, которые могут присутствовать в фармацевтической композиции по настоящему изобретению и которые не являются активными ингредиентами.

Предпочтительно, композиция согласно настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, воду в качестве наполнителя. В некоторых вариантах осуществления композиция согласно настоящему изобретению содержит водную среду, и, более предпочтительно, композиция по настоящему изобретению находится в форме водного раствора. В одном варианте осуществления полипептид содержится в водной среде, и в водной среде вводится млекопитающему. Водная среда может быть представлена, например, водным раствором. Водные растворы ингредиентов и другие соответствующие композиции в некоторых вариантах осуществления могут быть приготовлены непосредственно после очистки NGF в водной среде. Например, когда агент по настоящему изобретению получают очисткой из биологического источника, соответствующие водные композиции могут быть получены непосредственно с последней стадии очистки, например при элюировании с последней хроматографической колонки (обычно на стадии полировки) и/или фильтрацией. Альтернативно, соответствующие композиции доступны через дополнительную стадию корректировки конечной концентрации белка и/приготовления желаемого препарата. Такая дополнительная стадия может включать, например, стадию осветления или фильтрации, как описано в данном документе, и/или добавление одного или нескольких наполнителей и/или одного или нескольких носителей. Примеры композиций, применимых в настоящем изобретении, без ограничения таковыми, описаны в настоящем документе.

Таким образом, полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, описанный в данном документе, может присутствовать в композиции, например в фармацевтическом составе. Описанные здесь композиции предпочтительно являются стерильными и предпочтительно содержат полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 в качестве фармацевтически активного пептида или белка и, возможно, другие агенты, упомянутые или не упомянутые в данном документе. Композиции могут находится в любом состоянии, например, быть жидкими, замороженными, лиофилизированными и др.

Описанные здесь композиции могут включать соли, буферные соединения, консерванты, носители, разбавители и/или наполнители, все из которых предпочтительно являются фармацевтически приемлемыми. Термин «фармацевтически приемлемый» описывает нечто нетоксичное и/или не нарушающее действие активного ингредиента фармацевтической композиции.

Подходящие буферные соединения для использования по изобретению включают соли уксусной кислоты, соли лимонной кислоты, соли борной кислоты и соли фосфорной кислоты. Например, предпочтительно, чтобы полипептид по изобретению, в результате различных аспектов настоящего изобретения, мог быть получен в буфере, имеющем pH от 4,5 до 6,5, предпочтительно от 5,0 до 6,0. В одном марианте осуществления ацетатный буфер является подходящим буфером для таких целей и поэтому является особенно предпочтительным. Таким образом, в одном варианте осуществления полипептид по изобретению получают в ацетатном буфере, имеющем pH от 4,5 до 6,5, предпочтительно от 5,0 до 6,0.

Подходящие консерванты для использования в композициях согласно настоящему изобретению включают консерванты, известные в данной области, среди которых для иллюстративных целей и без ограничения таковыми, находится бензиловый спирт, бензалконий и соли такового, М-крезол, фенол, хлорбутанол, парабен и тимеросал.

Таким образом, настоящее изобретение предоставляет полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 для терапевтического применения, то есть для применения в способе лечения организма человека или животного посредством терапии. Терапия может включать профилактику и/или лечение состояния. Принимая во внимание возможность терапевтического использования, указанный полипептид можно также называть фармацевтически активным белком или пептидом.

Необязательно, введение согласно настоящему изобретению сопровождается введением по меньшей мере одного противомикробного агента, такого как антибиотик. Противомикробный агент может быть частью композиции, содержащей полипептид согласно настоящему изобретению, или, альтернативно, может вводиться субъекту отдельно, в то же или другое место, тем же или другим путем введения.

Промышленная применимость

Полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, описанный в данном документе, подходит для различных целей, например, для применения в терапии, как описано здесь.

Следующие ниже примеры и чертежи предназначены для иллюстрации некоторых предпочтительных вариантов осуществления изобретение и не должны интерпретироваться как ограничивающие объем изобретения, который определяется формулой изобретения.

ПРИМЕРЫ

Материалы и методы, используемые для более чем одного примера

Если не указано иное, следующие экспериментальные примеры конкретно относятся к полипептиду SEQ ID NO: 4, охарактеризованному по отношению к человеческому NGF дикого типа заменами P61S R100E (обозначаемого «NGF P61S R100E», Malerba et al. PLOS One, 2015 , vol.10, e0136425, SEQ ID NO: 4), а также проформы такового и т.д. Полипептид SEQ ID NO: 4 может также называться «мутеин NGF», но следует иметь в виду, что терапевтическая пригодность, специфичная для этого белка, в соответствии с данным изобретением и как продемонстрировано в экспериментальных примерах, особенно в Примерах 3 и 4, заметно отличается от пригодности человеческого NGF дикого типа. Аналогичным образом, как описано в Примере 2, очистка полипептида SEQ ID NO 4 отличается от опубликованных протоколов очистки для NGF дикого типа, и конкретный способ получения указанного полипептида согласно настоящему изобретению подходит для достижения высокой степени чистоты, при отсутствии варианта des-nona и трипсина, в частности.

Полипептид SEQ ID NO: 4 рекомбинантно экспрессировали в виде предшественника. С этой целью SEQ ID NO: 4 был слит с пропептидом человеческого NGF дикого типа (позиции 1-121 SEQ ID NO: 1). Другими словами, предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 состоял из предшественника человеческого NGF дикого типа (SEQ ID NO: 1), за исключением замен P61S R100E в зрелой части человеческого NGF дикого типа (кроме того, для точности, отсутствуют две самые C-концевые аминокислоты из SEQ ID NO: 1, не формирующие часть полипептидной последовательности человеческого NGF дикого типа). Экспрессию проводили в E.coli Rosetta (DE3) (штамм: E.coli Rosetta (DE3)/pET11a-hpro NGF P61S R100E) с образованием нерастворимых телец включения.

Оборудование

Устройство Инвентарный номер устройства Серийный номер Поставщик Биореакторы объемом 1 л (включая датчики и насосы) E023, E024 07462/09, 07463/09 Sartorius Stedim Биореактор 10 л E082 - Sartorius Stedim Источник питания 300 В E018; E019 - VWR Äkta Explorer100a E011 001054 GE Healthcare Äkta Explorer100a E054 18111241 GE Healthcare Автоклав Systec VX-120 E050 2512 Systec GmbH Центрифуга Galaxy 14D E016 904090 VWR Центрифуга Sorvall Evolution RC F683 - Sorvall Чистый стол E006 40970929 Thermo Scientific Камера для электрофореза Novex Mini Cell - - Invitrogen Гомогенизатор высокого давления APV 2000 F688 5-07.791 APV HPLC, 1100 Series E053 - Agilent Магнитная мешалка MR Hei-Mix S E013 30948231 Heidolph Магнитная мешалка PC-620D 686 - Corning pH-метр лабараторный pH720 E017 9080718 WTW Фотометр Genesys 10uv E051 2L9Q013008 Thermo Spectronics Пипетки Pipetus ® - - Hirschmann Laborgeräte Насос VL 1000 F606 0208004 Verder Весы F651 - Sartorius Весы E030 W092934 Kern Весы E009 - Mettler Шейкер IKA KS 4000ic E049 - IKA Встряхиватель Vortexer E012 40934086 VWR

Таблица 1. Список используемого оборудования

Белковые параметры белков и пептидов описанных в настоящем документе

Теоретические значения белковых параметров соответствующих белков были рассчитаны с помощью программы ExPASy's ProtParam-Tool, доступной по адресу http://web.expasy.org/protparam. Они показаны в Таблице 2, ниже:

Предшественник
SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 4 Трипсин свиньи
MW,
мономер
24.8 кДа 13.23 кДа 24.4 кДа
pI 9.7 8.2 7.0 ε 25168 л/моль/см 19668 л/моль/см 34295 л/моль/см

Таблица 2: Теоретически выведенные свойства соответствующих белков/полипептидов

Аналитические методы

SDS-PAGE и вестерн-блоттинг

SDS-PAGE и вестерн-блоттинг проводили с использованием стандартных процедур. Для этого SDS-PAGE гели 12% Bis-TRIS NuPAGE (Article No. NP0342BOX, Thermo Fisher) помещали в восстанавливающие условия при постоянном напряжении (175 В) в рабочем буфере NuPAGE MES (Article No. NP0002, Thermo Fisher). Первичные антитела для вестерн-блоттинга были приобретены в Santa Cruz Biotechnology (NGF (H-20) sc-548). Примеры результатов, показаны, например, на Фиг. 9A и Фиг. 10.

Аналитическая хроматография CEX-HPLC

CEX-HPLC выполняли с использованием ProPac SCX-10 от Dionex. Колонка работала с 50 мМ цитратным буфером, pH 5,5, при 1 мл/мин. Для элюирования добавляли 1 M NaCl (B) и элюировали в линейным градиенте от 0 до 100% (B) в течение 50 минут. Пример результатов показан на Фиг. 9В.

SE-HPLC

SE-HPLC выполняли с использованием Superdex 200 Increase 10/300 GL от GE Healthcare. Колонка работала в PBS. Продукт обнаруживался при 280 нм.

Эндотоксин, ДНК и HCP

Эндотоксин, ДНК и белки клетки-хозяина (HCP) определяли согласно стандартным протоколам.

Пример 1: Экспрессия полипептида SEQ ID NO: 4 в форме белка-предшественника

Производственный штамм

Ген, кодирующий про-NGF, клонировали в экспрессионную плазмиду pET11a. Ген происходит от H. sapiens, и две точечные мутации (а именно P61S и R100E) были введены в открытую рамку считывания. Впоследствии химически индуцированные компетентные клетки Rosetta (DE3) трансформировали экспрессионной плазмидой и отбирали одну колонию (полученный штамм был назван E5901 STRAIN (= E.coli Rosetta (DE3)/pET11a-pro NGF P61S R100E

NGF RCB C-151101)). Аликвоты хранили при температуре <-60 ° C в 1,0 мл.

В Примере 1 описано начальное развитие ферментации на основе штамма E5901 STRAIN.

Оборудование

Устройство Инвентарный номер устройства Серийный номер Поставщик Автоклав Systec VX-120 E050 2512 Systec GmbH Центрифуга Galaxy 14D E016 904090 VWR Центрифуга Sorvall Evolution RC F683 - Sorvall Чистый стол E006 40970929 Thermo Scientific Магнитная мешалка MR Hei-Mix S E013 30948231 Heidolph Магнитная мешалка PC-620D 686 - Corning pH- метр лабораторный pH720 E017 9080718 WTW Фотометр Genesys 10uv E051 2L9Q013008 Thermo Spectronics Пипетки Pipetus - - Hirschmann Laborgeräte Шейкер IKA KS 4000ic E049 - IKA Весы Kern 572 E030 W092934 Kern Весы Mettler AE160 E009 - Mettler Биореакторы объемом 1 л (включая датчики и насосы) E023, E024 07462/09, 07463/09 Sartorius Stedim

Культуральная среда

Комплексная среда для брожения

Сложная среда, используемая для ферментации, состояла из: 49,3 г/л дрожжевого экстракта, 0,61 г/л MgSO4*7H2O, 0.5 г/л NH4Cl, 14.2 г/л K2HPO4*3H2O и 10 г/л глюкозы. Питательное вещество, используемое для этого брожения, состояло из 263 г/л дрожжевого экстракта и 133 г/л глюкозы.

Минимальная среда (MM, Minimal Media) для ферментации

Составляющие MM I - Конечная конц. [мМ] MM II - Конечная конц. [мМ] Хлорид алюминия, гексагидрат нет 0,000063 Сульфат аммония 39,4 нет Борная кислота 0,005 0,000125 Кальция хлорид, дигидрат 2 0,000875 Лимонная кислота, моногидрат 25,2 10 Хлорид кобальта (II), гексагидрат нет 0,00075 Сульфат кобальта (II), гептагидрат 0,014 нет Сульфат меди (II), пентагидрат 0,032 0,00425 Диаммонийфосфат нет 35 Фосфат калия нет 45 Гидрофосфат натрия 7,5 нет Хлорид железа, гексагидрат 0,37 0,17 Kanamycin 0,103 0,103 Сульфат магния, гептагидрат 4 3 Сульфат марганца (II), моногидрат 0,142 0,00375 Полипропиленгликоль 2000 нет нет Хлорид калия 53,6 нет Натрия хлорид 8,5 40 Натрия дигидрофосфат, моногидрат 31,9 нет Молибдат натрия, дигидрат 0,001 0,00005 Сульфат цинка, гептагидрат 0,073 0,000375

На этапе культивирования клеток в обе основные среды добавляли 30 г/л глюкозы. Если не указано иное, питательное вещество имело тот же состав, что и соответствующая среда данной серии, но содержало 300 г/л соответствующего источника углерода.

Чашки с LB-агаром с ампициллином и хлорамфениколом

Чашки были залиты свежей средой на основе LB-агара. Среда состояла из 10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl и 15 г/л агара. После автоклавирования в среду добавляли 100 мкг/мл ампициллина и 30 мкг/мл хлорамфеникола.

Ферментация

Если не указано иное, ферментацию в данном Примере 1 проводили в стеклянных биореакторах объемом 1 л с мешалкой, контролируемых устройством Biostat B от Sartorius. Обычно pO2 контролировали на уровне 30%, температуру культивирования поддерживали на 37°C, а pH доводили до 7, используя 2М фосфорную кислоту и 25% гидроксид аммония. Если не указано иное, за этапом культивирования клеток следовала экспоненциальная подача питания с F0=6 г/л/ч и μ = 0,25/ч. По практическим соображениям все экспоненциальные подачи были аппроксимированы двумя линейными подачами. Обычно индукцию экспрессии продукта проводили путем добавления 1 мМ IPTG, а после индукции применяли постоянную скорость подачи питания 10 г/л/ч. Биомассу клеток собирали центрифугированием с использованием Sorvall Evolution RC от Thermo Scientific. Центрифуга была оснащена ротором SLC-6000, и культуру центрифугировали при 8500 об/мин и 4°C в течение 30 мин.

Определение относительного количества продукта в образцах биомассы

В заданные моменты времени образцы культур разбавляли до OD600, равного 10, и осаждали биомассу из аликвот 100 мкл этого разведения. Осадки ресуспендировали в 150 мкл (невосстанавливающего) буфера Лэммли и образцы кипятили в течение 5 мин. при 95°С. 10 мкл каждого образца анализировали на 10% геле Bis-Tris от Novex. Электрофоретическое разделение проводили в течение 90 мин при 125 В и гели окрашивали красителем Кумасси. Обесцвеченные гели сканировали, и численность полосы, соответствующей предшественнику полипептида SEQ ID NO: 4, количественно определяли с помощью денситометрии. Для дополнительной корректировки вариабельности используемой биомассы интенсивность полосы, соответствующей предшественнику полипептида SEQ ID NO: 4, была нормализована к интенсивности полосы белка домашнего хозяйства.

Относительное накопление продукта рассчитывали по увеличению полосы, соответствующей предшественнику полипептида SEQ ID NO: 4, до и после индукции. Примечательно, что измеренное значение представляет собой конкретный выход (т.е. нормализованный до OD600=10). Для получения значения абсолютного выхода при данной ферментации необходимо учитывать фактическую плотность клеток (см. ниже).

Количественное определение абсолютного выхода продукта в образцах биомассы

Стандарт предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 был получен из Европейского института исследований мозга (EBRI, Рим, Италия). Стандарт разбавляли до концентрации 65 мкг/мл в буфере Лэммли. Заявленная концентрация белка была определена по протоколу EBRI. Стандартная кривая была построена для 260, 520, 780, 1040 и 1300 нг стандарта для предшественника полипептида SEQ ID NO: 4. Образцы анализировали на том же геле, что и пробы для стандартной кривой, и учитывали фактор разведения образца для расчета абсолютного выхода продукта в конкретный момент времени.

Краткое описание и выводы Примера 1

На основании вышеизложенного делается вывод, что штамм-продуцент (E5901 STRAIN, см. выше) был успешно использован для ферментации в масштабе 1 л. Хотя различные композиции сред были оценены на предмет их способности стимулировать рост бактерий и экспрессию продукта, минимальная среда MM I с добавлением 5 г/л дрожжевого экстракта оказалась благоприятной с точки зрения достижения экспрессии и получения желаемой плотности клеток. Что касается образования продукта, то мы не наблюдали значительных различий, когда основное культивирование проводили с антибиотиками или без таковых (ампициллин и хлорамфеникол, данные не показаны).

Пример 1 может быть масштабирован для получения полипептида в промышленном масштабе.

Пример 2: Очистка в лабораторных условиях, создание Capto MMC

Предшественник SEQ ID NO: 4, использованный в этом примере, был получен в тельцах включения, как описано в Примере 1.

Исходная точка для оптимизации с учетом уровня техники

Вначале авторы настоящего изобретения пришли к выводу, что разработка процесса может, при отсутствии указаний на обратное, следовать основным концепциям очистки NGF, ранее описанным в литературе. Однако было также принято во внимание, что для эффективного производства в больших масштабах необходимо учитывать возможность адаптации, подходящей для более позднего масштабирования. Таким образом, мы пришли к выводу, основываясь на Rattenholl et al. (см. выше), WO2013092776 A1 и других публикациях, что полипептид SEQ ID NO: 4 аналогичным образом может быть получен, по меньшей мере, в лабораторных условиях, путем неспецифического расщепления его предшественника трипсином и последующей очистки. Было высказано предположение, что таким образом можно получить зрелый полипептид SEQ ID NO: 4 с высокой степенью чистоты. Однако только благодаря специфическим адаптациям и модификациям, описанным в этом примере, был получен зрелый полипептид SEQ ID NO: 4 с высокой степенью чистоты. Следовательно, введение полипептида SEQ ID NO: 4 нуждающемуся в этом субъекту возможно, в частности, ввиду высокой чистоты полипептида SEQ ID NO: 4, как описано в данном документе.

Оборудование для производства полипептида SEQ ID NO: 4

Устройство Инвентарный номер устройства Серийный номер Поставщик Биореакторы объемом 1 л (включая датчики и насосы) E023, E024 07462/09, 07463/09 Sartorius Stedim Источник питания 300 В E018; E019 - VWR Äkta Explorer100a E011 001054 GE Healthcare Äkta Explorer100a E054 18111241 GE Healthcare Автоклав Systec VX-120 E050 2512 Systec GmbH Центрифуга Galaxy 14D E016 904090 VWR Центрифуга Sorvall Evolution RC F683 - Sorvall Чистый стол E006 40970929 Thermo Scientific Камера для электрофореза Novex Mini Cell - - Invitrogen Гомогенизатор высокого давления APV 2000 F688 5-07.791 APV ВЭЖХ ( HPLC), 1100 Series E053 - Agilent Магнитная мешалка MR Hei-Mix S E013 30948231 Heidolph Магнитная мешалка PC-620D 686 - Corning pH-метр лабораторный pH720 E017 9080718 WTW Фотометр Genesys 10uv E051 2L9Q013008 Thermo Spectronics Пипетки Pipetus - - Hirschmann Laborgeräte Насос VL 1000 F606 0208004 Verder Весы F651 - Sartorius Весы E030 W092934 Kern Весы E009 - Mettler Шейкер IKA KS 4000ic E049 - IKA Встряхиватель Vortexer E012 40934086 VWR

Список оборудования, использованного в Примере 2.

Подробности производственного процесса в соответствии с этим примером, включая улучшения, описанные в примере 2B, приведены в обзоре процесса на Фиг. 1.

Если не указано иное, аналитические методы были такими, как описано в разделе «Аналитические методы» выше.

Пример 2A: очистка в соответствии с ранее описанными протоколами

Клетки E. coli, экспрессирующие предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 («биомасса»), получали, как описано в Примере 1, и лизировали добавлением лизоцима с последующей обработкой ультразвуком на ледяной бане. Тельца включения («IB») были (1) экстрагированы из клеток-хозяев и промыты раствором 6% Triton X100 (в 1,5 M NaCl, 60 мМ EDTA) и (2) солюбилизированы в 6 M гуанидиния HCl («gHCl»), 0,1 М трис-HCl pH 8,0, 1 мМ EDTA, 100 мМ (свежий) DTT. IB солюбилизировали в течение 2 ч при комнатной температуре. После этого pH понижали до 3-4, добавляя 37% HCl. Полученный таким образом раствор, содержащий солюбилизированный предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 («солюбилизат» (solubilizate)), подвергали диализу против 6 M gHCl (pH 3-4).

Рефолдинг предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 проводили в 0,1 М трис-HCl, 1 М L-аргинине, 5 мМ ЭДТА, 0,61 г/л окисленного глутатиона и 1,53 г/л восстановленного глутатиона, pH 9,5 при +4°С. Для этого каждый час добавляли белок в количестве 50 мкг белка на мл буфера для рефолдинга. После проведения рефолдинга реакционную смесь диализовали против 50 мМ фосфата натрия, pH 7,0. При замене буфера происходило образование значительного осадка.

Предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 очищали с использованием последовательных этапов катионообменной хроматографии (SP Sepharose HP, установлена с 50 мМ фосфатом натрия, pH 7,0 и элюирована градиентом NaCl) и последующей хроматографии гидрофобного взаимодействия (Phenyl Sepharose HP, установлена с 50 мМ фосфатом натрия, 1 M сульфатом аммония, pH 7,0). После этого использовали другой диализ для замены буфера образца на буфер 50 мМ фосфата натрия, pH 7,0 (обратите внимание, что такой второй диализ, однако, можно было не проводить в процессе, описанном в Примере 5). Снова наблюдалось преципитация значительные количества продукта в ходе снижения буферной проводимости.

Полученный таким образом предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 подвергали ограниченному протеолизу путем добавления 1 мг трипсина на 250 мг про-NGF. Воздействие протеазы на предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 происходило в течение 14 часов при 2-8°C.

Зрелый NGF был окончательно очищен («отполирован») на катионообменнике (SP Sepharose XL, уравновешена 50 мМ фосфатом натрия, pH 7,0 и элюирована градиентом NaCl). Наконец, продукт концентрировали до 0,5-1 мг/мл и замораживали при температуре <65°C.

Пример 2B: Инновации

Далее описываются несколько оптимизации по сравнению с примером 2A, которые были протестированы и реализованы авторами настоящего изобретения в ходе создания настоящего изобретения. Если контекст не диктует иное, все те детали, которые не явно указаны, были такими же, как описано выше для Примера 2A.

Оптимизация IB-солюбилизации

Хотя ранее сообщалось, что небольшие количества IB (например, полученные из культур во встряхиваемых колбах) легко растворяются в буфере для солюбилизации (6M gHCl, 0,1 M трис-HCL pH 8,0, 1 мМ EDTA, 100 мМ (свежий) DTT), оказалось, что IB, полученные в результате ферментации с высокой плотностью клеток, не могут быть полностью растворены. Авторы настоящего изобретения смогли решить эту проблему путем добавления 2М мочевины к указанному буферу для солюбилизации, что, как оказалось, значительно улучшает выход солюбилизации (данные не показаны). Во избежание сомнений: 2 M мочевина присутствовала в дополнение к 6 M gHCl и другим ингредиентам.

Оптимизация рефолдинга

Было принято решение, изначально основанное на Rattenholl et al. (2001, Eur. J. Biochem, vol. 268, p. 3296-3303; Rattenholl, 2001, Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.), Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg (Germany)), но, при этом с учетом возможной более поздней масштабируемости, провести рефолдинг предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 в количестве от 200 до 500 мг на литр реакции рефолдинга, предпочтительно в количестве от 200 до 300 мг предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 на литр реакции рефолдинга. Это приводит к относительно хорошему выходу солюбилизированного предшественника полипептида SEQ ID NO: 4. В частности, важно учитывать, что вследствие увеличенного количества NGF по сравнению с объемом реакции рефолдинга и с учетом того, что реакция рефолдинга включает относительно дорогие ингредиенты как глутатион и аргинин, относительно большее количество предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 на объем реакции рефолдинга, может быть подвергнуто рефолдингу, что должно сделать рефолдинг экономически целесообразным, также в производственных масштабах.

Очистка предшественника полипептида SEQ ID NO: 4

Очистку предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 после рефолдинга проводили с помощью подхода, в котором используется довольно высокая изоэлектрическая точка про-NGF, а для очистки используется катионообменная стационарная фаза (а именно SP-сефароза). Для проведения этого типа хроматографии по техническим причинам буфер рефолдинга надо было заменять на буфер с низкой проводимостью. При этом наблюдалась преципитация значительного количества предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 (данные не показаны). Это наблюдение можно объяснить снижением концентрации аргинина в буфере.

Поэтому были предприняты некоторые попытки заменить колонку улавливания колонкой другого типа (колонкой с другой селективностью), которая была бы более толерантной к присутствию аргинина в реакции рефолдинга. При первой попытке осуществления была оценена эффективность нескольких стационарных фаз, но ни один из подходов не дал удовлетворительных результатов (см. Таблицу 6). Таким образом, стационарная фаза, используемая для улавливающей колонки, была сохранена, как это было описано в предыдущем процессе. Однако из-за высокой изоэлектрической точки (pI) предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 увеличение проводимости рабочего буфера (путем добавления 250 мМ L-аргинина) без влияния на производительность стало возможным. Посредством этого подвергнутый рефолдингу предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 мог быть стабилизирован до определенной степени, и количество осаждаемого предшественника уменьшилось (данные не показаны).

Возможный Этап улавливания Краткое описание Оценка Хроматография гидрофобного взаимодействия Хроматография гидрофобного взаимодействия не зависит от проводимости и солевого состава загруженного образца. Если сульфат аммония или хлорид натрия добавляли к продукту, присутствующему в буфере рефолдинга, то происходила значительная преципитация белка. Даже добавление небольшого количества сульфата аммония (до концентрации 0,25 М) приводило к выпадению осадка. Также невозможно было добавить хлорид натрия, не провоцируя осаждение продукта. Следовательно, этап захвата на основе фенил- или бутил-сефарозы не подходит. Хроматография в смешанном режиме Capto MMC представляет собой стационарную фазу в смешанном режиме, сочетающую гидрофобные свойства со свойствами неподвижной фазы для обмена катионов. Поскольку связывание опосредуется не только ионными взаимодействиями, эта стационарная фаза более солеустойчива, чем классическая катионообменная стационарная фаза. В начальной установке фосфатный буфер с pH 5,5 был дополнен 0,25 M L-аргинином, и элюция была проведена градиентом NaCl. Однако при таком подходе не было извлечено никаких значительных количеств продукта (предшественника). Эксклюзионная хроматография Эксклюзионная хроматография обеспечивает хорошее разрешение и не зависит от буфера для образца. Типичное узкое место этого типа хроматографии (т.е. его ограниченная производительность) можно не учитывать, поскольку требуются относительно небольшие количества продукта. Хотя препаративная хроматограмма выглядела многообещающей, отделения предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 от примесей добиться не удалось. Это может быть вызвано существованием данного специфического предшественника в виде полидисперсной смеси в исследуемых условиях.

Таблица выше: альтернативные возможности, протестированные для улавливания предшественника полипептида SEQ ID NO: 4, и их оценка.

Что касается хроматографии в смешанном режиме, авторы изобретения, без привязки к конкретной теории, понимают, что при хроматографии в смешанном режиме предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 не элюируется эффективно, тогда как зрелый полипептид SEQ ID NO: 4 эффективно элюируется.

Расщепление протеазой для получения зрелого NGF

Для производства полипептида SEQ ID NO: 4 существенно важна протеаза (трипсин), и поэтому было высказано предположение, что в идеале конкретный выбранный трипсин должен соответствовать следующим критериям:

1. Получен из рекомбинантного источника. Сертификация сырья, не содержащего животного материала, имеет решающее значение для обеспечения соответствия процесса требованиям GMP.

2. Обладает низкой побочной активностью. Примечательно, что трипсин может подвергаться автолизу. Этот процесс может привести к так называемому псевдотрипсину, который имеет расширенный спектр субстратов и обладает химотрипсин-подобной активностью. Ca2+ (например, 1 мМ CaCl2) может быть добавлен для уменьшения автолиза. Однако в настоящее время обычно для каждого протокола применяется «модифицированный трипсин», требующий высокой специфичности последовательности (например, для пептидного фингерпринтинга). Этот модифицированный трипсин обычно получают ацилированием трипсиновых экспонированных ε-аминогрупп остатков лизина.

3. Низкая вариабельность от партии к партии, что обеспечивает воспроизведение производственного процесса. С другой стороны, выбранный фермент должен обладать сертификатом, в котором указывается удельная активность соответствующей партии. Требуемое количество фермента может зависеть от активности, а не от массы.

Несмотря на интенсивный поиск, трипсин, удовлетворяющий критериям 1 и 2, на коммерческом рынке не обнаружен. Было высказано мнение, что критерий 1 важнее всех остальных. Для уменьшения автолиза может быть достаточно добавления CaCl2. В результате в качестве сырья для процесса был выбран рекомбинантный трипсин «GMP grade» от Roche (Roche 06369880103, лот: 11534700). Последовательность этого фермента, который экспрессируется в Pichia pastoris, была получена из Sus scrofa. Согласно сертификату, партия использованного трипсина имеет удельную активность 4997 Ед/мг (определена в соответствии с USP).

Пропуск второй стадии очистки перед трипсинизацией

В рамках начального скрининга для поиска оптимальных соотношений фермент/субстрат для предполагаемой трипсинизации использовали предшественник полипептида SEQ ID NO: 4, полученный на улавливающей колонке (см. выше). В отличие от ранее установленного процесса (Европейский институт исследований мозга (EBRI), подробности не опубликованы, процесс на основе Rattenholl et al., supra) авторы настоящего изобретения решили не использовать стадию дополнительной хроматографии гидрофобного взаимодействия перед трипсинизацией. Решение об исключении такой второй стадии очистки на колонке перед трипсинизацией было принято, исходя из двух соображений: с одной стороны, продукт, полученный после улавливания колонкой, уже был практически чистым согласно SDS-PAGE. С другой стороны, сама трипсинизация как таковая могла бы способствовать улучшению профиля примесей за счет переваривания оставшихся белков клетки-хозяина (HCP).

В Таблице 7 представлены основные условия, проверенных в первом раунде. Были исследованы результаты трипсинизации в 12% SDS-PAGE (данные не показаны). Результаты (данные не показаны) показывают, что трипсинизация воспроизводимо дает стабильный полипептид SEQ ID NO: 4 в довольно широком диапазоне соотношений фермент/субстрат (т.е. от 1 до 5 мкг трипсина на 375 мкг предшественника полипептида SEQ ID NO: 4). Сроки переваривания не имеют большого значения. Следовательно, остановка реакции и время, необходимое для загрузки объема реакции в колонну для очистки («полировки»), очевидно, не являются ограничивающими. Это открытие имеет особое значение, поскольку реакцию невозможно остановить подходящим или экономичным способом в препаративных масштабах.

Некоторые дополнительные эксперименты были проведены для уточнения оптимального соотношения фермент/субстрат для предполагаемой трипсинизации, и было обнаружено, что при соотношении фермент/субстрат от 1/100 до 1/200 (вес белка/вес белка) хороший выход полипептида SEQ ID NO: 4, с одной стороны, и небольшие количества усеченных продуктов, с другой стороны, могут быть получены воспроизводимо. Следует указать, что в используемых условиях (т.е. нахождение в фосфатно-аргининовом буфере (pH 7,0) при 2-8°C и инкубации (для обработки протеазой) в течение двух-шести часов) качество переваривания не сильно зависело от соотношения фермент/субстрат. Это открытие имеет особое значение, поскольку базовое ферментативное расщепление зависимо от незначительных изменений в экспериментальной установке (например, изменение активности трипсина из-за изменчивости такового от партии к партии или хранения фермента; от времени и температуры стадии инкубации (воздействие протеазы); от ошибки в определении концентрации белка). Более того, это также является причиной, по которой расширенная точная настройка в мелком масштабе для дальнейшего уменьшения количества потенциальных усеченных продуктов кажется нецелесообразной. Если «оптимальное» условие будет идентифицировано мелкомасштабно, то еще есть хороший шанс слегка измененить схему получения продукта в следующий раз, когда фактически то же переваривание (дайджест) будет повторено в более крупном масштабе.

«Полировка» хроматографией с целью получения чистого полипептида после трипсинизации

В отличие от ранее установленного процесса (Европейский институт исследований мозга (EBRI), подробности не опубликованы, процесс основан на Rattenholl et al., выше), в котором использовалась стационарная фаза SP-сефарозы для полировки зрелого полипептида (примечание: SP-сефароза является катионообменной стационарной фазой), авторами был проведен поиск более подходящей стационарной фазы, исходя из следующих соображений: для эффективной загрузки в колонку с SP-сефарозой снижение проводимости раствора, содержащего предшественник полипептида SEQ ID NO: 4, например, путем замены буфера, не требуется. Однако известно (например, Пример 2А), что снижение ионной силы раствора действительно приводит к осаждению целевой молекулы, и поэтому следует избегать замены буфера на буфер с низкой проводимостью. Более того, катионообменная стационарная фаза уже использовалась для улавливания (захвата) предшественника полипептида SEQ ID NO: 4, и ортогональная селективность является предпочтительной для достижения лучшего разделения оставшихся примесей. Третий и последний аргумент против использования неподвижной фазы SP для очистки реакции трипсинизации заключается в том, что потенциально оставшийся предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 будет связываться с этой колонкой и может быть отделен от зрелого полипептида SEQ ID NO: 4 просто по селективности элюирования, а не по селективности связывания.

Для создания такой полировочной колонки с ортогональной селективностью для очистки зрелого полипептида SEQ ID NO: 4, в первую очередь предлагалось использовать колонку с гидрофобным взаимодействием (HIC). Эта стационарная фаза была выбрана не только потому, что она обладает ортогональной селективностью, но также потому, что замена буфера на буфер с низкой проводимостью не требуется. Несмотря на тестирование нескольких стационарных фаз и условий HIC (например, фенил- и бутил-сефарозы, работающих с 1 M (NH4) 2SO4 и 0,5 M (NH4) 2SO4, соответственно), авторы заключили, что удовлетворительная стадия полировки на основе HIC не может быть реализована (данные не показаны ).

Однако в следующей экспериментальной установке для этапа полировки была протестирована стационарная фаза смешанного режима Capto MMC, и она могла бы быть успешно реализована. Было обнаружено, что в оптимизированных условиях стационарная фаза обратимо связывается с полипептидом SEQ ID NO: 4, и продукт можно элюировать путем увеличения pH (данные не показаны). Напротив, предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 необратимо связывается со стационарной фазой и может быть элюирован только при использовании 1 М NaOH в качестве подвижной фазы (данные не показаны). Кроме того, можно продемонстрировать, что трипсин вообще не связывается с колонкой, работающей в таких условиях (данные не показаны). Эти результаты обеспечивают четкое доказательство того, что стационарная фаза Capto MMC способна эффективно отделять зрелый полипептид SEQ ID NO: 4 от трипсина и от оставшегося предшественника полипептида SEQ ID NO: 4.

Установка дополнительной мембранной хроматографии

Для более эффективного истощения примесей эндотоксинов и ДНК, в процессе была задействована дополнительная анионообменная мембрана. Обычно, как известно, мембранная хроматография отличается тем, что раствор, содержащий компонент, подлежащий анализу или очистке (в данном случае полипептид SEQ ID NO: 4), пропускается через мембрану, в норме заряженую. Для этой цели в данном случае STIC-мембрана (Sartorius, Goettingen, Germany) была включена в систему в положениях, указанных на Фиг. 1. Было определено, что полипептид SEQ ID NO: 4 не связывается с мембраной, и, таким образом, предоставлено доказательство концепции, что мембранная хроматография подходит для очистки полипептида SEQ ID NO: 4. Для иллюстрации всего процесса, включая мембранную хроматографию, см. Фиг. 1.

Воспроизводимость процесса, описаного в Примере 2

Чтобы проверить надежность процесса, процесс был проведен пять раз, и полученные фракции были проанализированы на предмет их выхода и чистоты. На протяжении этих циклов проводилась неуклонная оптимизация деталей процесса и состава буфера, градиенты и т.д. тестировались до тех пор, пока не были установлены окончательные, оптимизированные детали осуществления процесса (см. Фиг. 1). Результаты показывают, что в лабораторном масштабе из одного последовательного производственного цикла можно получить приблизительно от 50 до 100 мг полипептида SEQ ID NO: 4. Примечательно, что с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в SDS с последующим окрашиванием Кумасси или серебром полученный продукт неизменно обнаруживался относительно чистым (присутствует менее пяти процентов загрязняющих белков клетки-хозяина и следовое количество усеченного NGF, данные не показаны).

Для предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 не удалось установить удовлетворительный метод SE-HPLC. Напротив, анализ SE-HPLC для зрелого полипептида SEQ ID NO: 4 был простым и привел к пику гомогенного продукта приблизительно в области 16 кДа, что соответствует мономерной форме полипептида SEQ ID NO: 4 n (данные не показаны).

Краткое описание и выводы

В этом процессе подвергшийся рефолдингу предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 был захвачен с использованием SP-сефарозы FF («FF» означает «Fast Flow», т.е. стационарная фаза с относительно большими частицами) и впоследствии обработан трипсином для получения зрелого NGF. С этой целью концентрация аргинина в реакции рефолдинга была уменьшена с 1 М (как рекомендовано предшествующим уровнем техники) до 350 мМ.

Контроль протеолитического расщепления предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 с получением зрелого полипептида SEQ ID NO: 4 рассматривается как наиболее важный параметр процесса. Здесь были определены условия, которые воспроизводимо облегчают расщепление с высокой эффективностью, с одной стороны, и предотвращают образование продуктов деградации NGF, с другой стороны. Экспериментальные данные, представленные здесь, показали, что достаточно устойчивый производственный процесс может быть установлен в довольно широком диапазоне соотношений фермент/субстрат. Что касается трипсинизации, то выходы на данной стадии, очевидно, хорошие, и на данной стадии процесса не ожидается значительных потерь. Полученный образец продукта, по-видимому, не сильно зависит от используемых условий реакции (с точки зрения соотношения фермент/субстрат и времени инкубации (времени воздействия протеазы)). Примечательно, что даже при достаточно хорошем выходе для стадии полировки ферментом, необходимо обработать по меньшей мере 2*x грамма полипептида SEQ ID NO: 4, чтобы получить x грамм зрелого полипептида SEQ ID NO: 4.

Очистка в соответствии с этим примером представляет собой экономичный процесс, состоящий всего из двух стадий хроматографической очистки. Существующий процесс очистки был дополнительно оптимизирован, и несколько аспектов процесса были модифицированы для увеличения масштаба (см. Фиг. 1). Примеры ранее использованных методов разрушения клеток были заменены гомогенизацией под высоким давлением, и все стадии диализа можно было заменить тангенциальной поточной фильтрацией. Установленный таким образом процесс позволяет производить полипептид SEQ ID NO: 4 с высокой чистотой.

Несмотря на обозначенные проблемы, похоже, что в целом процесс позволяет получить продукт приемлемого качества.

Полный процесс, включающий оптимизации согласно Примеру 2, включая мембранную хроматографию, схематически изображен на Фиг.1.

Пример 2 может быть масштабирован для получения полипептида в промышленном масштабе.

Пример 3: Подтверждение концепции in vitro и на млекопитающих, кроме человека.

Настоящее изобретение частично основано на экспериментах с двумя животными моделями кожных язв. В этих моделях кожные язвы индуцируются у мышей с диабетом с помощью круговой биопсии или циклов нагружения давлением, и полипептид по настоящему изобретению применяется местно.

В настоящем документе сообщается об исследовании введения полипептида SEQ ID NO: 4 животным, не являющимся человеком. Полипептид SEQ ID NO: 4 можно получить с высокой чистотой путем экспрессии, как описано в Примере 1, и очистки, как описано в Примере 2.

Целью этого примера является исследование эффективности местного применения полипептида SEQ ID NO: 4 в контексте заживления ран у мышей с диабетом, соответствующих гистопатологии, болевому порогу и уровню человеческого NGF (hNGF) в плазме. Стандартные соединения (человеческий NGF (SEQ ID NO: 2) и мышиный NGF, аминокислотная последовательность, доступная в общедоступных ресурсах) также были использованы в исследовании.

Животные, которым вводили полипептид SEQ ID NO: 4, характеризовались кожным заболеванием, как описано в данном документе. Животные представляли собой животную модель человека, страдающего сахарным диабетом или имеющего предрасположенность к сахарному диабету, например, сахарному диабету 1 типа или сахарному диабету 2 типа.

Полипептид SEQ ID NO: 4 может быть введен в однократной дозе или в многократных дозах. Полипептид SEQ ID NO: 4 может быть введен субъектам с диабетическими язвами и животным в модели диабетических нейропатических язв стопы (DFU).

Этот пример включает следующие разделы:

Пример 3А: тест на удлинение нейритов РС12 in vitro. Целью этого эксперимента было установить эффективность полипептида SEQ ID NO: 4. Для этой цели использовали обычный тест на удлинение нейритов in vitro в NGF-чувствительных клетках (PC12).

Пример 3В: исследование эффективности in vivo. Целью этого раздела было определить, улучшает ли местное применение полипептида SEQ ID NO: 4 заживление ран (хирургическое поражение) у мышей с диабетом.

Были включены следующие группы:

- db/db, интактные (неповрежденные) N=8, каждый момент времени

- db/db, рана+носитель N=8, каждый момент времени

- db/db, рана+полипептид SEQ ID NO: 4, 1 мкг/день; N=8, каждый момент времени

- db/db, рана+полипептид SEQ ID NO: 4, 10 мкг/день; N=8, каждый момент времени

- db/db, рана+полипептид SEQ ID NO: 4, 30 мкг/день; N=8, каждый момент времени

- db/db, рана+hNGF, 10 мкг/день N=8, каждый момент времени

- db/db, рана+mNGF, 10 мкг/день N=8, каждый момент времени

(доза в мкг относится к соответствующим дозам, вводимым на рану (каждое животное имеет одну рану)

В этом эксперименте исследования животных умерщвляли через 7 и 30 дней после индукции раны с определением следующих конечных точек: время до закрытия; гистология (N=4) и иммуногистохимия поражений (N=4).

Пример 3C: механизм: поисковое исследование. Целью этого раздела было изучить молекулярные механизмы, поддерживающие положительный эффект полипептида SEQ ID NO: 4 на заживление ран у мышей с диабетом, уделяя особое внимание воспалению, отложению внеклеточного матрикса, иннервации и ангиогенезу.

Были включены следующие группы:

- db/db, интактные (неповрежденные) N=6

- db/db, рана+транспортное средство N=6

- db/db, рана+полипептид SEQ ID NO: 4, 1 мкг/день N=6

- db/db, рана+полипептид SEQ ID NO: 4, 10 мкг/день N=6

- db/db, рана+полипептид SEQ ID NO: 4, 30 мкг/день N=6

- db/db, рана+чНГФ, 10 мкг/день N=6

- db/db, рана+mNGF, 10 мкг/день N=6

(доза в мкг относится к соответствующим дозам, вводимым на рану (каждое животное имеет одну рану)

В этом разделе исследования животных умерщвляли через 14 дней после индукции раны, что соответствует 50% заживлению раны, с определением следующей конечной точки: изучение возможных механизмов, ответственных за терапевтический эффект полипептида SEQ ID NO: 4, с учетом экспрессии и регуляции мРНК (N=252), кодирующей белки, участвующие в процессах биологии внеклеточного матрикса (N=84), ангиогенезе (N=84), факторов роста и биологии нейротрофинов (N=84).

Материалы и методы в этом Примере

Животные и мониторинг

Мышей, гомозиготных по спонтанной мутации диабета (Leprdb) (генетически C57BL/6J), и мышей, соответствующих гетерозиготным контролям из той же колонии использовали в возрасте 8-12 недель (Charles River Laboratories - Calco - Lecco, T/BKS.CG- M +/+ LEPR DB/J и S/BKS.CG-M DB/+). см. «Введение для получения информации о составлении группы и умервщлении животных».

Животных содержали в одиночных клетках с гранулированным кормом и водой ad libitum и с 12-часовым циклом темноты. Все описанные здесь протоколы для животных были выполнены в соответствии с Директивами Совета Европейского сообщества (European Community Council Directives 2010/63/EU), одобрены Министерством здравоохранения (№ 350/2015-PB) и соответствуют рекомендациям, опубликованным в Руководстве NIH по уходу и использованию лабораторных животных (NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals).

Уровень гликемии в крови измеряли до лечения, на следующий день после последнего лечения и перед умерщвлением (Contour XT, Bayer, Базель, Швейцария).

График эксперимента для 8-дневной когорты:

График эксперимента для 30-дневной когорты:

Первая неделя: также, как для 8-дневной когорты

Далее: фото два раза в неделю до умервщления.

Уровень гликемии на 28 день

Умервщление на 29 день

В этом примере эксперименты обозначены как когорты «8 дней» и «30 дней», для которых указаны дни тестирований или умервщления, как указано в графике экспериментов.

Поражение, лекарства и наблюдение.

Круглая рана ровной толщины диаметром 6 мм была создана путем пункционной дермальной биопсии на средней части спины мыши. Вкратце, животных анестезировали изофлуораном (+2 л/мин O2). Кожа спины была освобождена от шерсти с помощью восковой эпиляции и продезинфицирована с помощью Clorexidina 4% ("Clorexyderm" I.C.F. srl Industria Chimica Fine - CR-Italy) or Iodopovidone 10% ("Poviderm" Nuova Farmec srl - VR - Italy). Стерильный инструмент для пункционной биопсии диаметром 6 мм использовался для создания открытой раны определенной толщины на спине. Область раны немедленно покрывали полуокклюзионным препаратом Тегадерм ((Tegaderm Roll -3M Health Care, St.Paul, MN, USA), и одевали полосу защиты толщиной 1,5 см вокруг грудной клетки, чтобы мыши не могли снять раневую повязку. Игла 26 калибра использовалась для введения 50 мкл лекарства через тегадерм в ложе раны в дни после пораженния с 0 по 6. Примечательно, что повязка с тегадермом полностью предотвращала утечку раствора из очага поражения.

Круглая рана на полную толщину диаметром 6 мм имела площадь 28,26 мм2.

Исходя из этого, животным вводили следующие дозы:

Доза 1 мкг: 0,0035 мкг/мм2

Доза 10 мкг: 0,35 мкг/мм2

Доза 30 мкг: 1,05 мкг/мм2

За животными ежедневно наблюдали, проверяя целостность повязки и отсутствие инфекций. Тегадерм меняли еженедельно у всех животных до полного заживления ран.

Делали фотографии раны, включая имерительную линейку, и измеряли площадь поражения с помощью компьютерного анализа изображений (NIS Elements, Nikon) трижды в течение первой недели, а затем дважды в неделю до конца эксперимента.

Введение полипептида SEQ ID NO: 4.

Полипептид SEQ ID NO: 4 разводили в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) и делили на ежедневные аликвоты. Все процедуры выполнялись на ледяной бане, а конечные аликвоты хранились при - 80°C.

Человеческий NGF (hNGF, Recombinant, E. Coli Cat N°: N-245, Alomone, Jerusalem, Israe) и рекомбинантный мышиный NGF (mNGF, Cat N°: 1156-NG, R&D System) использовали в качестве контрольных NGF.

Тестируемые соединения вводили ежедневно в течение 7 дней, начиная со дня образования раны. 50 мкл раствора тестируемых соединений при каждой концентрации вводили под повязку Tegaderm на область раны с помощью иглы 26-го размера. Эластичность тегадерма позволяет герметизировать отверстие иглы после вытягивания иглы, при этом утечки жидкого раствора не наблюдается.

Мониторинг болевого порога

гипералгезию оценивали у свободно движущихся животных методом Харгрива с использованием прибора для термического подошвенного тестирования (Ugo Basile - Comerio, Varese). Животным давали акклиматизироваться в боксе прибора из оргстекла в течение 15 мин. Источник лучистого тепла постоянной интенсивности (диаметр луча 0,5 см и интенсивность 25 I.R.) помещали под заднюю лапу, и время отдергивания (секунды) регистрировали как время от начала приложения лучистого тепла до отдергивания лапы. Для статистического анализа использовалось среднее четырех показателей. Животных тестировали с помощью подошвенного теста на -3 день (перед операцией) и в День 7 (через 24 часа после последнего применения тестируемых соединений).

Сбор и обработка тканей

В день умерщвления мышей подвергали глубокой анестезии (изофлуран+2 л/мин O2) и забирали образцы кожи (1 см × 1 см) из области раны. Для Исследования B в каждой группе было собрано 4 образца для иммуногистохимии и 4 образца для гистологии. Для Исследования C с помощью эксцизионного пробойника брали 6 мм участка кожи (в области раны), забирали кольцо 8 мм вокруг этого (по периметр раны) и участок неповрежденной кожи размером 6 мм.

Образцы, собранные для гистологии, заливали парафином, делали срезы и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E); образцы, собранные для иммуногистохимии, подвергали постфиксации, промывали сахарозным PBS, подвергали криосекции и подготавливали для непрямой иммунофлуоресценции.

Иммуногистохимия и количественный анализ

Кожу погружали в 4% параформальдегид (мас./об.) и насыщенный водный раствор пикриновой кислоты в 0,1 М буфере Соренсена, pH 7, на 24 часа, затем промывали в течение не менее 48 часов 5% сахарозой в 0,1 М фосфатном буфере. После замораживания в CO2 срезы (толщиной 14 мкм) вырезали с помощью криостата (HM550 Microm, Bio-Optica). Срезы собирали на покрытых желатином предметных стеклах, сначала инкубированных в 0,1 M PBS при комнатной температуре в течение 20 мин, с последующей инкубацией в течение ночи при 4°C во влажной атмосфере с первичными антителами, разведенными в 0,3% PBS-Triton X-100, об./об. В этом исследовании использовались следующие антисыворотки: ламинин (Rabbit, Sigma, 1: 1000); продукт гена белка 9,5 (PGP-9,5) (Rabbit, Boheringer, 1:2000). После ополаскивания в PBS в течение 20 минут (2×10 мин) срезы инкубировали при 37°C в течение 30 минут во влажной атмосфере со вторичной антисывороткой, конъюгированной с Rhodamine Red™-X-conjugated - affinity-pure Donkey anti-Rabbit IgG (Jackson Immunoresearch) разводили в тритоне PBS 0,3%. Затем срезы промывали PBS (как указано выше) и помещали в глицерин, содержащий 1,4-фенилендиамин (0,1 г/л).

Иммуногистологические изображения получали с помощью микроскопа Nikon Eclipse E600, оснащенного цифровой камерой CCD Q Imaging Retiga-2000RV (Q Imaging, Surrey, BC, Canada). Анализ проводился с использованием программы Nis-Elements AR 3.2. Иммунореактивная площадь ламинина и PGP9.5 рассчитывалась как доля (процент) в слое эпидермиса через 7 дней и 30 дней после индукции поражения кожи. Индекс прорастания оценивался по количеству участков, в которых PGP9,5 IR приближался к границе язвы. Для всего морфологического анализа было проанализировано пять изображений для каждого животного и на двух уровнях /на животное. Все анализы проводились слепым методом. Среднее значение на животное использовали для статистического анализа.

Количественное определение hNGF

Кровь собирали в пробирки Vacuntainer с EDTA-K2 и в течение 30 мин центрифугировали при 3000×g в течение 10 мин при 4°C. Плазму собирали, разделяли на аликвоты в полипропиленовые пробирки и хранили при -80°C до использования.

Набор Human Adipokine Magnetic Bead Panel 2 (HADK2MAG-61K, EMD Millipore Coorporation, Billerica, MA, USA) использовали для количественного определения hNGF в образцах плазмы с использованием технологии xMAP и платформы MAGPIX Luminex. Эта технология основана на использовании различных популяций гранул с цветовой кодировкой, конъюгированных с моноклональными антителами, специфичными к конкретному белку, что позволяет одновременно улавливать и обнаруживать специфические аналиты с высокой чувствительностью из небольшого объема образца. Мы использовали простую версию набора, включающую только одну популяцию шариков, конъюгированных с человеческим моноклональным антителом NGF-β. Анализ был выполнен в соответствии с техническими требованиями производителя с небольшими изменениями.

Вкратце, после инкубации популяции гранул, конъюгированных с конкретным человеческим моноклональным антителом NGF-β, с образцами плазмы (25 мкл) в течение ночи при комнатной температуре, гранулы промывали и инкубировали сначала с раствором детектирующих антител в течение 1 часа при комнатной температуре, затем с раствором стрептавидин-фикоэритрин конъюгата в течение 30 мин при комнатной температуре. После промывки гранулы ресуспендировали в 100 мкл жидкости Drive и считывали на приборе MAGPIX. Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения xPONENT 4.2 ®, и результаты были выражены в пг/мл. Мы получили значения в динамическом диапазоне стандартной кривой (от 10000 до 0,128 пг/мл) для всех образцов. Стандартные кривые имели значение коэффициента корреляции (R2)> 0,98. Точность полученных результатов была дополнительно проверена с помощью значений, полученных для растворов контроля качества, включенных в набор (QC1 и QC2), которые находились в пределах диапазона, указанного производителем набора. Предел обнаружения человеческого NGF-β составлял 0,3-0,7 пг/мл.

Этот анализ был выбран из-за высокой чувствительности и специфичности для hNGF по сравнению с другими методами ELISA.

Культура PC12 и обработка (лечение) таковой

Клетки поддерживали в стандартных условиях культивирования в культуральной среде (DMEM, 10% лошадиной сыворотки, 5% FBS и pen/strep 1x) в колбах T25 см2 (NUNC). После проведения, по меньшей мере, двух пассажей клетки высевали (1000 клеток/лунку) на 96-луночные планшеты с плоским дном (NUNC) для клеточных культур. Через 1 день in vitro (DIV) культуральную среду удаляли и клетки поддерживали в среде депривации (DMEM, 1% лошадиной сыворотки, 0,5% FBS и pen/strep 1x). Клетки обрабатывали тремя различными концентрациями всех тестируемых соединений (50, 100 и 200 нМ) через 24 часа после лишения сыворотки. После обновления среды 2 DIV и при 7 DIV клетки фиксировали и окрашивали на антиген бета-III-тубулина с использованием непрямой иммунофлуоресценции (Фиг. 1).

Иммуноцитохимия

При 7 DIV клетки фиксировали холодным 4% параформальдегидом в течение 20 минут. После обработки в течение 1 часа блокирующим раствором (PBS, тритон X-100 0,3%, BSA 1% и нормальная сыворотка осла 1%), клетки инкубировали с первичной антисывороткой (Mouse Anti-beta-III-tubulin, 1: 1000; R&D) в течение ночи при 4°C. Затем клетки инкубировали со вторичными антителами против мыши (Donkey Anti-mouse Alexa-488 conjugated; 1:500; Jackson) при 37°C в течение 30 минут. Наконец, клетки инкубировали с красителем ядер Hoechst33258 при комнатной температуре в течение 20 минут.

Скрининговый анализ при высоком содержании клеток (высокопропускной скрининг)

Анализ удлинения нейритов выполняли с помощью Cell Insight™ CX5 High Content Screening (HCS; Thermo Scientific), с использованием приложения Neuronal Profiling BioApplication. Программное обеспечение способно распознавать каждую клетку в каждой лунке по флуоресценции ядерного красителя. Каждое ядро идентифицируется как объект, и каждый объект соответствует отдельной клетке. Система распознает зеленую флуоресценцию (иммунореактивность бета-III-тубулина) вокруг ядра, идентифицируя тело клетки. Это устройство нейронного профилирования способно распознавать и отслеживать все нейриты, возникающие в каждом теле клетки. Это позволяет подсчитывать и измерять нейриты в каждой клетке. Агрегаты клеток не распознавались как объект единичной клетки и были исключены из анализа.

Было проанализировано отдельные клетки в количестве 2000-4000 на лунку и 6 лунок/ на каждую обработку.

ОТ-ПЦР (RT-PCR)

Поисковое исследование возможных механизмов, на которых основан положительный эффект полипептида SEQ ID NO: 4 на заживление ран у мышей с диабетом, было выполнено с использованием исследовательской стратегии (анализ экспрессии генов с фокусом на каскады сопряженных реакций, с использованием ПЦР-массивов RT2 Profiler), с упором на основные молекулярные каскады реакций, участвующие в заживлении ран в 50% процесса заживления, например, включающие ангиогенез, внеклеточный матрикс и адгезионные белки, факторы роста. Образцы собирали из центра поражения (диаметр 6 мм), и РНК экстрагировали у всех животных (6 животных в группе), определяли количественно (спектрофотометр Nanodrop 2000) и объединяли (100 нг на животное). Таким образом, для обратной транскрипции использовали 600 нг РНК на группу.

Для каждой группы выполняли одну ПЦР-матрицу (single PCR array) с использованием прибора для ПЦР в реальном времени CFX96 (BioRad). Для всех планшетов использовали одно и то же пороговое значение, и относительную экспрессию гена рассчитывали сравнительным методом 2-ΔΔCq. Матрицы ПЦР Rt2 Profiler™ (QIAGEN) для ангиогенеза, внеклеточного матрикса и белков адгезии (ЕСМ), а также факторов роста (GF) мыши были использованы для профилирования экспрессии 250 ключевых генов, участвующих в ангиогенезе, ЕСМ и GF (по 84 гена каждый) и синтезирована кДНК с использованием набора RT2 First Strand (QIAGEN) в соответствии с инструкциями производителя.

Полученные результаты

Результаты представлены в следующем порядке:

- Анализ PC12 in vitro

- Эффективность, 8 дней

- Эффективность, 30 дней

- Механизм, 14 дней

Пример 3А : Тест на удлинение нейритов РС12 in vitro.

Эффективность полипептида SEQ ID NO: 4 тестировали in vitro на клетках PC12 (см. Схему эксперимента на Фиг. 1), измеряя удлинение нейритов посредством высокопропускного клеточного скрининга, используя следующие параметры:

- Средняя длина нейрита: представляет собой среднюю длину нейрита на клетку;

- Средняя общая длина нейрита: представляет собой общую длину нейрита на клетку;

- % клеток с максимальной длиной нейрита (% High Neurite): представляет процент клеток, у которых длина нейрита равна длине тела клетки или превышает ее.

Во-первых, все дозы тестируемых соединений анализировали и сравнивали с контролем (носитель) (данные не показаны). В этом отчете показаны только результаты для наиболее эффективной дозы каждого тестируемого соединения (Фиг. 1). Клетки, подвергшиеся воздействию эффективных доз всех тестируемых соединений, показали увеличение среднестатистической средней длины нейритов (A; mNGF, P=0,0394; hNGF, P=0,0196; полипептид SEQ ID NO: 4, P=0,0033) и средней общей длины нейритов (B; mNGF, P=0,0338; hNGF, P=0,0006; полипептид SEQ ID NO: 4, P=0,0211; Aloe, P <0,0001) по сравнению с клетками, обработанными носителем. Только полипептид SEQ ID NO: 4 (P=0,0367) был способен увеличивать процент клеток, демонстрирующих удлиненный нейрит.

Пример 3B: Исследование эффективности, 8-дневная когорта.

Мониторинг животных

В период до образования раны у животных наблюдали за уровнем глюкозы в крови. Результаты представлены на Фиг. 3. Гликемия была выше у мышей с диабетом, чем у контрольных животных, по данным пилотного исследования. Между животными, отнесенными к разным экспериментальным группам, различий не наблюдалось.

Прибавка массы тела между днем 0 и днем 7 после поражения представлена на Фиг. 4. Никаких различий не наблюдалось ни по времени (день 0 против дня 7), ни по лечению.

Гипералгезия

Термальную гипералгезию оценивали у свободно движущихся животных по методу Харгрива с использованием прибора для термического подошвенного тестирования на День -3 (до поражения кожи) и на следующий день после последнего нанесения тестируемого соединения (день 7). Результаты проиллюстрированы на Фиг. 5. Никаких различий между группами не наблюдалось в день 0. При сравнении средней латентности отдергивания лапы, измеряемой в одной и то же группе лечения, в День 0 и День 7, у животных, получавших hNGF, на 7 день наблюдалось значительное снижение. В остальных группах гипералгезии к тепловым раздражителям не наблюдалось. Примечательно, что более высокое пороговое значение наблюдался у мышей, обработанных полипептидом SEQ ID NO: 4, на 7 день, что указывает на более высокое пороговое значение боли в этой группе.

Время до заживления раны

Оценка заживления ран проводилась путем макроскопического наблюдения по фотографиям, которые делались, начиная с дня 0 (день операции), каждые два дня в течение первой недели. «Время до заживления» было измерено на этих изображениях ран с использованием элементов NIS (Nikon). Результаты представлены на Фиг. 6, где показаны графики как внешних, так и внутренних областей. Двусторонний дисперсионный анализ показывает временной эффект (F (4 203) = 41,25, p <0,0001) и групповой эффект (F (5 203) = 2,565, P=0,0282).

Время до заживления на 7 день показано на Фиг. 7. Никаких различий между группами не наблюдается, несмотря на то, что в группах, обработанных полипептидом SEQ ID NO: 4, наблюдается дозозависимая тенденция к ускорению заживления ран.

Уровни NGF в плазме

Кровь собирали при умерщвлении, то есть через 48 часов после последнего применения тестируемых соединений. Уровни NGF в плазме определяли с помощью анализа на основе антител с использованием антител, способных обнаруживать человеческий NGF, мышиный NGF, а также полипептид, указанный в SEQ ID NO: 4. В данном документе определенные таким образом уровни NGF в плазме упоминаются как «общий уровень NGF в плазме». Результаты представлены на Фиг. 8. У обработанных мышей наблюдали дозозависимое увеличение общих уровней NGF в плазме, достигающее значений более 350 пг/мл. Более того, увеличение также наблюдалось в группе, получавшей mNGF. Это неудивительно, поскольку рекомбинантный мышиный NGF-β, используемый для лечения, представляет собой гомодимер двух аминокислотных полипептидов, имеющих примерно 90% идентичности на уровне аминокислотной последовательности с человеческим NGF и распознается тем же антителом.

Пример 3C : исследование эффективности, 30-дневная когорта.

Мониторинг животных

У животных отслеживали уровни глюкозы в крови до образования раны, после окончания введения тестируемых соединений и при умерщвлении. Результаты представлены на Фиг. 9. Мы наблюдали постепенное увеличение уровня глюкозы в крови в течение 28 дней наблюдения во всех экспериментальных группах. Никаких различий между группами лечения в разное время не наблюдалось.

Прибавка массы тела между 0-м и 28-м днями после индукции поражения кожи представлена на Фиг. 10. Никаких различий не наблюдалось ни по времени, ни в зависимости от лечения.

Гипералгезия

Термальную гипералгезию оценивали у свободно движущихся животных по методу Харгрива с использованием прибора для термических подошвенных тестов на День -3 (до поражения кожи) и на День 7, через 24 часа после последнего применения NGF. Результаты проиллюстрированы на Фиг. 11. Никаких различий между группами не наблюдалось в день 0. При сравнении латентности в День 0 и День 7 в одной и той же группе лечения, наблюдалась незначительная тенденция к снижению латентности отдергивания лапы в День 7 у животных, получавших hNGF. Однако при объединении данных по 8-дневным и 30-дневным когортам у животных, получавших hNGF, наблюдалось значительное снижение болевого порога, что позволяет предположить, что именно этот состав hNGF вызывает гипералгезию. В остальных группах различий не наблюдалось. Результаты представлены на Фиг. 12.

Время до заживления

Оценку заживления ран проводили путем макроскопического наблюдения, фотографируя раны каждые два дня в течение первой недели, начиная с дня -3 (день операции), затем дважды в неделю до умерщвления. «Время до заживления» было измерено на этих изображениях ран с использованием элементов NIS (Nikon).

Индивидуальные данные для оценки «времени до заживления» представлены в табличной форме (Фиг. 13). Последовательные измерения площади внешней раны отложены в зависимости от времени на Фиг. 14. Двусторонний дисперсионный анализ показывает временной эффект (F (50 434) = 417,3, p <0,0001), эффект лечения (F (5 434) = 21,45, p <0,0001) и корреляцию между эффектами лечения и времени (F (50 434) = 1,638, p=0,0055).

У мышей, получавших полипептид SEQ ID NO: 4, скорость заживления ран была значительно ускорена по сравнению с животными, получавшими носитель, причем дозозависимым образом.

Время до заживления на 8-й день показано на Фиг. 15, где объединены данные как для 8-дневных, так и для 30-дневных когорт. Значительное уменьшение времени заживления ран уже в это время наблюдается в группе, получавшей полипептид SEQ ID NO: 4 в дозе 30 мкг/день, по сравнению с группой, получавшей носитель.

Уровни NGF в плазме

Кровь собирали при умерщвлении. Уровни NGF в плазме определяли с помощью анализа на основе антител с использованием антител, способного обнаруживать человеческий NGF, мышиный NGF, а также полипептид с SEQ ID NO: 4. В данном документе определенные таким образом уровни NGF в плазме упоминаются как «общий уровень NGF в плазме». Результаты представлены на Фиг. 16. Общие уровни NGF в плазме очень низки (по сравнению с Фиг. 8), не превышают 10 пг/мл и одинаковы во всех группах.

Гистология (через 8 и 30 дней) (см. также отчет пилотного исследования)

Образцы кожи, содержащие область язвы, включающий край неповрежденной кожи 5 мм, вырезали, заливали парафином и делали серийные срезы в соответствии со схемой, представленной на Фиг. 17B. Затем срезы окрашивали (H&E), и репрезентативные изображения на разных уровнях глубины раны с низким увеличением представлены на Фиг. 17A. Микрофотографии с большим увеличением иллюстрируют процесс реэпителизации на границе раны (Фиг. 17D), где виден «мигрирующий эпидермальный язык» (migrating epidermal tongue (MET)), обширная грануляционная ткань в дерме ниже слоя эпидермиса, характеризующаяся воспалением, пролиферацией клеток, отложением матрикса (Фиг. 17E) и ангиогенезом (Фиг. 17F). Реэпителизацию оценивали путем измерения толщины слоя эпидермиса. Репрезентативные изображения по группам интактных животных, носителя, полипептида SEQ ID NO: 4, мышей, получавших 1 мкг/день, и мышей, получавших 30 мкг/день полипептида SEQ ID NO: 4, представлены на Фиг. 18. Полипептид SEQ ID NO: 4 вызывает дозозависимое утолщение слоя эпидермиса, которое оказывается намного выше, чем в неповрежденной коже. Базальный слой эпидермиса характеризуется гиперцеллюлярностью базального и остистого слоев, что, возможно, отражает повышенную пролиферацию клеток. Кроме того, дерма также утолщена и сильно окрашена, что свидетельствует о более высоком отложении внеклеточного матрикса, и обогащена кожными структурами (железами и волосяными фолликулами) также в зависимости от дозы. Толщина эпидермиса во всех группах представлена на графике. Полипептид SEQ ID NO: 4 вызывает дозозависимое утолщение эпидермального слоя, который становится намного толще, чем в группе носителя. Также mNGF и hNGF вызывают такой же эффект, сравнимый с группой, обработанной сходной дозой полипептида SEQ ID NO: 4.

Иммуногистохимия (через 8 и 30 дней)

Реиннервацию кожи анализировали с помощью иммуноокрашивания на белок PGP9.5, высокочувствительный нейроэктодермальный маркер, который широко используется для визуализации кожной иннервации. Анатомия кожной иннервации представлена на Фиг. 19, где визуализируются волокна PGP9.5 -IR в неповрежденной коже мыши. В частности, визуализируются подкожные, глубокие кожные и субэпидермальные сплетения; субэпидермальное сплетение обеспечивает эпидермис свободными эпидермальными нервными окончаниями.

Эффект местного применения полипептида SEQ ID NO: 4 на повторный рост нервов в восстанавливающейся коже был проанализирован с использованием «индекса разрастания» на границе поражения на 8-й день после поражения и PGP9.5-IR в зоне поражения в эпидермисе и дерме восстанавливаемого участка кожи. Типичные изображения представлены на Фиг. 20. Панели A, B и C показывают графики PGP9.5-IR через 30 дней у интактных животных при обработке мышей носителем и полипептидом SEQ ID NO: 4 в количестве 30 мкг/день, соответственно. Результаты морфометрического анализа представлены на Фиг. 21. Обработка полипептидом SEQ ID NO: 4 в количестве 30 мкг/день вызывает значительное увеличение прорастания через 8 дней, такого же, как при hNGF. Через 30 дней, в то время как у животных, которым вводили носитель, иннервация еще не восстановилась, и не наблюдалось различий между интактными и обработанными (NGF) животными, которым вводили полипептид SEQ ID NO: 4 (все дозы) и mNGF. Напротив, при использовании hNGF наблюдается гиперинервация.

Эффект местного применения полипептида SEQ ID NO: 4 на ангиогенез оценивали методом с использованием ламинина в качестве маркера. Ламинин является маркером базальной мембраны, маркирующим, таким образом, несколько структур кожи, включая эндотелиальные клетки. Другие эндотелиальные маркеры, такие как PECAM (также известный как CD31), фактор фон Виллебранда, коллаген, обеспечивали окрашивание, неподходящее для количественной оценки в условиях фиксации, примененных в этом исследовании. Репрезентативные изображения представлены на Фиг. 22. Панели A иллюстрируют эпидермальный слой, визуализированный с помощью традиционной гистологии (H&E). Стрелками обозначен базальный слой. Панель B иллюстрирует базальную мембрану, лежащую под эпидермисом (стрелки); Панель C иллюстрирует сенсорную иннервацию эпидермиса, происходящую из субэпендимального сплетения; Панель D иллюстрирует границу раны и связанную с ней иннервацию через 8 дней (E) и после восстановления кожи (F). Панели G-I иллюстрируют ангиогенез через 8 дней (G, EE; H, ламинин-IR) и через 30 дней (I).

Результаты морфометрического анализа представлены на Фиг. 23. Применение полипептида SEQ ID NO: 4 в дозе 30 мкг/день вызывает значительное увеличение ламинина-IR через 8 дней, такого как при hNGF, которое все еще наблюдается через 30 дней, что, возможно, отражает ангиогенез.

Механизм: Поисковое исследование

Регуляция экспрессии генов

Целью исследования было изучение молекулярных механизмов, поддерживающих положительный эффект полипептида SEQ ID NO: 4 на заживление ран у мышей с диабетом, при этом обращалось особое внимание на воспаление, отложение внеклеточного матрикса, иннервацию, ангиогенез. Исследовательская стратегия (анализ экспрессии генов, ориентированный на каскады реакций с использованием ПЦР-матриц RT2 Profiler был использован для определения основного молекулярного пути (каскада реакций) в ране в точке времени, соответствующей 50% заживления. Ангиогенез мыши, внеклеточный матрикс и белок адгезии (ЕСМ), и факторы роста (GF), проанализированные с помощью Rt2 Profiler™ использовали для профилирования экспрессии 252 ключевых генов, участвующих в ангиогенезе, ECM и GF (по 84 гена каждый).

Анализ экспрессии для каждой панели (ангиогенез, ЕСМ, фактор роста) включает следуещее:

- список генов;

- тепловую карту, обеспечивающую графическое представление данных регуляции сворачивания между двумя группами, наложенных на схему планшета с ПЦР-матрицей;

- диаграмму разброса (скатерограмму), сравнивающую нормализованную экспрессию каждого гена в ПЦР-матрице между двумя группами путем их сопоставления друг с другом для быстрой визуализизации значительных изменений экспрессии генов, и список генов, изменения в экспрессии которых больше выбранного порогового значения (≥ 3).

Диаграммы разброса показывает сравнение следующих групп:

- db/db по сравнению с мышами WT (WT в качестве контрольной группы)

- носитель db/db по сравнению с db/db интактными мышами (db/db интактные мыши использовались в качестве контрольной группы)

- db/db NGF (полипептид SEQ ID NO:, mNGF, hNGF) по сравнению с db/db носителем (группа «db/db носитель» использовалась в качестве контрольной группы)

- db/db NGF (полипептид SEQ ID NO:, mNGF, hNGF) по сравнению с db/db интактными мышами (db/db интактные мыши использовались в качестве контрольной группы)

Результаты анализировались с учетом внеклеточного матрикса и молекул адгезии, факторов роста и нейротрофинов (чертежи не показаны).

Основные результаты и выводы настоящего анализа следующие:

Эффект генотипа:

- Сравнение между интактными db/db и неповрежденными мышами WT показывает, что многочисленные гены ангиогенеза и ECM по-разному регулируются в соответствии с генотипом, в то время как очень немногие гены GF по-разному экспрессируются, что позволяет предположить, что ECM и ангиогенез являются процессами, на которые в контексте заживления ран в основном влияет диабетическое состояние.

- Эффект поражения в db/db:

- Поражение индуцировало подавление многочисленных генов ангиогенеза и ECM и повышение активации регуляции нескольких генов GF, в результате чего можно предположить, что ECM и ангиогенез являются основными процессами, управляющими заживлением ран у мышей с диабетом.

- Эффект полипептида SEQ ID NO: 4 в db/db (по сравнению с носителем):

- полипептид SEQ ID NO: 4 подавляет несколько генов, включая: гены ангиогенеза: akt, Ccl2 (хемокин (мотив C-C) лиганд 2), Ctgf (фактор роста соединительной ткани), Hif1a, MMP14, thbs2 (тромбоспондин 2);

- полипептид SEQ ID NO: 4 активирует несколько генов, и только некоторые из них также регулируются hNGF и mNGF

- полипептид SEQ ID NO: 4 не регулирует гены GF, и только некоторые из них регулируются hNGF и mNGF

Также был проведен анализ STRING (данные не показаны). STRING представляет собой биологическую базу данных и веб-ресурс известных и прогнозируемых белок-белковых взаимодействий, который широко используется для поиска взаимосвязей взаимодействий между дифференциально экспрессируемыми генами. «Кластерный» анализ с помощью программного обеспечения STRING базируется на всех генах, которые регулируются в различных матрицах.

ВЫВОДЫ

Основные выводы из этого примера следующие:

1. Клетки PC12, в сочетании с HCS как методом аналитического подхода, представляет собой подходящий инструмент для оценки эффективности полипептида SEQ ID NO: 4 in vitro;

2. полипептид SEQ ID NO: 4 улучшает заживление дозозависимым образом.

3. Полипептид SEQ ID NO: 4 значительно увеличивает восстановление эпидермального слоя и вызывает сильное увеличение его толщины; полипептид SEQ ID NO: 4 также положительно влияет на реиннервацию и ангиогенез (по оценке с использованием ламинина-IR). Все эти параметры у мышей, обработанных полипептидом SEQ ID NO: 4, выше, чем у контрольных интактных мышей, что позволяет предположить, что фаза реконфигурации раны при заживлении должна быть оценена в дальнейшем исследовании.

4. Предварительное исследование предполагает, что каскад реакций AKT-mTOR может быть подвержен действию полипептида SEQ ID NO: 4. Так как Akt и mTOR считаются промоторами выживания и клеточного роста, было высказано предположение, что кратковременная фармакологическая активация PI3K-Akt-mTOR сигнального каскада может представлять собой новую стратегию клинического вмешательства для ускорения заживления. Примечательно, что нарушенный каскад AKT-mTOR был указан как возможная причина нарушения заживления ран у мышей с диабетом, и было продемонстрировано, что каскад AKT-mTOR участвует в улучшенном заживлении посредством нескольких молекул, таких как нотогинсенозид Ft1 у диабетических мышей; ацеманнан; SR-0379; семейство микроРНК-99.

Таким образом, полипептид SEQ ID NO: 4 представляет собой рекомбинантный белок с полипептидной последовательностью, подобной фактору роста нервов человека, но имеющий, по меньшей мере, одну мутацию, которая делает его безболезненным (hNGFp) и терапевтически эффективным.

Таблица выше: экспериментальный дизайн теста удлинения нейритов in vitro в клетках PC12. См. Методы для получения дополнительной информации

Пример 4: Подтверждение концепции: модель пролежней у мышей

В настоящем документе сообщается об исследовании введения полипептида SEQ ID NO: 4 животным, не являющимся человеком. Полипептид SEQ ID NO: 4 можно получить с высокой чистотой путем экспрессии, как описано в Примере 1, и очистки, как описано в Примере 2.

Методы

В эксперимент были включены контрольные (C57BL6, альбиносы) и генетически диабетические мыши C57BL/KsJ-m +/+ Leprdb (db/db), Jackson laboratories, возрастом 8-10 недель. Под газовой анестезией животным выбривали спину и тщательно очищали выбритую область для предотвращения раздражения кожи. Кожная складка была приподнята, и два магнитных керамических диска диаметром 12 мм и толщиной 5,0 мм, со средним весом 2,4 г и силой магнитного поля 1000 G (Magnetic Fountain, Castle Rock, CO), были приложены к коже, оставив «мост» из кожи толщиной примерно 5,0 мм между двумя магнитами. Этот процесс создает давление сжатия 50 мм рт.ст. между двумя пластинами, что, как это было документально подтверждено, необходимо для локальной ишемии тканей (Peirce et al., 2000, Wound Repair Regen., Vol. 8, p. 68-76). Было проведено три цикла ишемии-реперфузии (I/R), чтобы вызвать образование 2 язв однородной степени тяжести. Единичный цикл I/R состоит из 12-часового периода наложения магнитов, начинающегося в 8:00 утра, с последующим периодом отдыха продолжительностью 12 часов без магнитов. Обработку носителем и тестируемыми соединениями начинали через 3 дня после окончания циклов I/R, чтобы сделать возможным хирургическое выскабливание язв, включающее удаление экссудата фибрина и некротической ткани.

Некоторых мышей подвергали тестируемому лечению полипептидом SEQ ID NO: 4, который также может называться безболезненным рекомбинантным мутантным фактором роста нервов человека (hNGFp). Подробно исследованы следующие экспериментальные группы:

- db/db, носитель

- db/db, полипептид SEQ ID NO: 4, 1 мкг/см2/день

- db/db, полипептид SEQ ID NO: 4, 10 мкг/см2/день

- db/db, полипептид SEQ ID NO: 4, 100 мкг/см2/день.

Лечение(обработку) продолжали ежедневно в течение 14 дней подряд, а затем дважды в неделю до заживления в той же дозировке (дозировка рассчитывалась в зависимости от размера язвы на момент лечения). Пролежни контролировали визуальным осмотром для установления дня закрытия. Кроме того, были сделаны снимки пролежней, включающие измерительную линейку, и измерена площадь поражения с помощью компьютерного анализа изображений, в течение периода, когда пролежни обрабатывались лекарствами два раза в неделю. Оценка пролежней проводилась по стандартной шкале и путем измерения площади пролежней с помощью компьютерного анализа изображений.

Влияние соединения на болевой порог оценивали у свободно движущихся животных в месте травмы с помощью электронного прибора фон Фрея Bioseb, который позволяет определять порог механической болевой чувствительности у грызунов.

Гистология поражения, иннервация и ангиогенез были проанализированы с помощью гистологии и иммуногистохимии, а также компьютерного анализа изображений.

Полученные результаты

Размещение магнитов на кожной складке на спине мышей с диабетом вызывало необратимое повреждение всей дермоэпидермальной ткани под местом сдавливания. Как визуальный осмотр (наличие некротической и геморрагической области), так и гистологический анализ подтвердили, что 3 цикла I/R были способны вызвать поражения, сходные с пролежнями.

Во всех группах, получавших полипептид SEQ ID NO: 4, скорость заживления ран была увеличена по сравнению с животными, получавшими носитель. Закрытие пролежней у животных, получавших полипептид SEQ ID NO: 4, было очевидным, начиная с 17 и 21 дня, тогда как животные, получавшие носитель, излечивались, начиная с 23 дня.

На 28 день, в последний день наблюдения, у более чем 80% животных, получавших полипептид SEQ ID NO: 4, кожные пролежни полностью закрылись; как показано на Фиг. 25; по сравнению с животными, которым вводили носитель, эффект был статистически значимым при всех дозах полипептида SEQ ID NO: 4, тогда как вероятность заживления в первой группе составляла менее 60%. Эти данные согласуются с литературными данными, показывающими, что в животных моделях диабета скорость заживления ран нарушена, и вместе с данными, полученными на модели хирургической язвы (Пример 3), они предполагают, что полипептид SEQ ID NO: 4 может нормализовывать замедленный процесс заживления у мышей с диабетом.

Помимо положительного воздействия на заживление ран, гистологические и иммуногистохимические данные предоставляют дополнительные доказательства того, что полипептид SEQ ID NO: 4 обладает биологической способностью улучшать степень заживления ран у мышей с диабетом с нарушенным заживлением. На гистологическом уровне в восстановленной области наблюдалась полная реэпителизация и восстановление нормальной анатомии кожи после обработки полипептидом SEQ ID NO: 4. Иммуногистохимия показала, что полипептид SEQ ID NO: 4 также положительно влияет на реиннервацию (как измерено иммунореактивностью PGP 9.5 в эпидермисе) и неоангиогенез (как измерено иммунореактивностью PECAM в дерме) (Фиг. 26 A и B).

Поскольку сообщалось, что NGF дикого типа увеличивает болевую чувствительность в месте введения, порог механической боли оценивали через 14 дней подряд лечения полипептидом SEQ ID NO: 4 путем наложения механического стимула на границе пролежней. Никаких изменений болевого механического порога не наблюдалось по сравнению с диабетическими мышами, получавшими носитель, что позволяет предположить, что полипептид SEQ ID NO: 4 после хронического местного лечения может оказывать положительное трофическое действие на кожу в большом интервале доз, не вызывая сенсибилизации ноцицепторов ( Фиг.27).

Пример 5: Рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование для изучения безопасности, переносимости, фармакокинетических и фармакодинамических профилей полипептида SEQ ID NO: 4 после однократного и многократного увеличения доз у субъектов с диабетическими нейропатическими язвами стопы (DFU)

В настоящем документе сообщается об исследовании введения полипептида SEQ ID NO: 4 в однократных и многократных возрастающих дозах участникам с диабетическими нейропатическими язвами стопы (DFU). Участниками были люди.

Исследование, описанное в этом примере, было этически одобрено соответствующими органами.

Полипептид SEQ ID NO: 4 можно также называть рекомбинантным мутантным человеческим безболезненным фактором роста нервов (hNGFp). Полипептид SEQ ID NO: 4 альтернативно называют «РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР РОСТА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО НЕРВА (RHNGF)» или «SUB77552», а полная молекулярная формула такового представляет собой C580H895N163O176S8. Полипептид SEQ ID NO: 4 может быть биологического/биотехнологического происхождения (кроме Advanced Therapy IMP (ATIMP). Это рекомбинантный лекарственный продукт (см. также Пример 1). В частности, полипептид SEQ ID NO: 4 можно получить экспрессией такового, как описано в Примере 1, и очисткой, как описано в Примере 2. В частности, высокая чистота такового, которую можно достигнуть, как описано в Примере 2, предпочтительно в соответствии со стандартами GMP, позволяет использовать полипептид SEQ ID NO: 4 в качестве лекарственного средства.

В данном примере полипептид SEQ ID NO: 4 представляет собой исследуемый лекарственный препарат (Investigational Medicinal Product (IMP)). Согласно Директиве 2001/20/EC, «IMP» - это «фармацевтическая форма активного вещества или плацебо, тестируемая или используемая в качестве эталона в клинических исследованиях, включая продукты, уже имеющие разрешение на продажу, но используемые или собранные (сформулированные или упакованые) способом, отличным от авторизованной формы, или при использовании для неавторизованного применения, или если используется для получения дополнительной информации о авторизованной форме». В данном случае полипептид SEQ ID NO: 4 представляет собой IMP для использования в первом клиническом испытании на людях. Таким образом, этот пример описывает первое клиническое испытание на людях. Факторов риска в соответствии с руководством по «первому применению на людях» выявлено не было.

IMP, используемый в этом примере, представляет собой прозрачный бесцветный раствор hNGFp, приготовленный с концентрацией 1 мг/мл полипептида SEQ ID NO: 4. Полипептид SEQ ID NO: 4 доводят до желаемой концентрации и заполняют таковым стеклянный флакон. Концентрация раствора - 1 мг/мл.

Полипептид SEQ ID NO: 4 вводят людям, нуждающимся в этом. Указанный полипептид SEQ ID NO: 4 вводят в виде кожного раствора. Таковой не является специальным педиатрическим составом.

Люди, нуждающиеся в введении полипептида SEQ ID NO: 4, являются субъектами с диабетическими нейропатическими язвами стопы (DFU). Факторов риска согласно руководству о «первом применении на человеке» не выявлено.

Полипептид SEQ ID NO: 4 вводят местно (наружно). Таким образом, полипептид SEQ ID NO: 4 предназначен для местного применения (не в настоящее время).

Полипептид SEQ ID NO: 4 вводят в общей дозе от 0,3 до 6 мкг/мм2. «мм2» относится к области язвы. Указанное количество (в мкг) относится к количеству полипептида, которое вводится в день.

Полипептид SEQ ID NO: 4 вводят два раза в день в течение 14 дней подряд. После этого прием прекращают.

В этом исследовании присутствует плацебо. Плацебо обозначается как PL1. Плацебо является кожным раствором. Плацебо предназначено для местного применения (не в настоящее время). Плацебо представляет собой плацебо по полипептиду SEQ ID NO: 4 (PR1). В остальном плацебо идентично IMP (PR1). Плацебо вводят идентично полипептиду SEQ ID NO: 4.

PR1 и плацебо 1 подготовлены для исследования в Klifo A/S, Smedeland 36, 2600 Glostrup, Denmark.

В данном исследовании нет другого (сравнительного) лекарственного средства.

Субъекты, участвующие в этом исследовании, страдают, поражены или предрасположены к заболеванию, которое представляет собой заболевание кожи и соединительной ткани. В частности, в этом исследовании участвуют субъекты, страдающие диабетической нейропатической язвой стопы (DFU). Язва диабетической стопы - серьезное осложнение сахарного диабета, незаживающая или плохо заживающая полнослойная рана, поражающая дерму ниже лодыжки у человека с диабетом.

Версия MedDRA, класс системного органа, уровень, термин и классификационный код (веб-сайт EMEA EudraCT (http://eudract.ema.europa.eu/)): Версия Система Орган Класс Классификационный код Термин Уровень 20.0 100000004858 10012664 Diabetic foot ulcer LLT

Для данного исследования был образован независимый комитет по мониторингу данных.

Первоначальная оценка продолжительности испытания - 2 года 1 месяц.

Планируемое количество субъектов - 92 (из них 60 в возрастном диапазоне 18-64 года; 32 из которых в возрастном диапазоне 65 лет и старше). Группа испытуемых состоит из пациентов и не включает здоровых добровольцев. Включены конкретные уязвимые группы населения.

Лечение или уход после того, как субъект завершил свое участие в исследовании, представляет собой стандартное лечение.

Получено одобрение властей по вопросам этики. Выдано положительное заключение.

Цель исследования:

Основная цель: оценить безопасность и переносимость полипептида SEQ ID NO: 4 у субъектов с DFU при одно- и многодневном местном дозировании.

Вторичные цели:

(a) Оценить фармакокинетический профиль системно доступного лекарственного средства после одно- и многодневного местного введения полипептида SEQ ID NO: 4 у субъектов с DFU;

(b) Оценить фармакодинамические эффекты многодневного местного дозирования полипептида SEQ ID NO: 4 на заживление DFU в течение 12-недельного периода.

Дополнительных исследований не проводилось.

Основные критерии включения:

Часть 1 SD и Часть 2 MD:

Субъекты должны соответствовать всем следующим критериям для получения права на участие в исследовании:

1. Письменное информированное согласие субъекта, полученное до любой процедуры, связанной с исследованием;

2. Субъект мужского или женского пола в возрасте от 18 до 80 лет (включительно) с диагнозом сахарный диабет I или II типа с гликозилированным гемоглобином (HbA1c) ≤10%.

3. Субъекты женского пола, не способные к деторождению (WONCBP): -женщины должны сообщить о хирургической стерилизации (проведенной не менее чем за 6 месяцев до скрининга) или - менопаузе (не должно быть регулярных менструальных кровотечений в течение как минимум одного года до скрининга, возраст ≥45 лет и уровень ФСГ при скрининге ≥40 мМЕ/мл).

4. Субъекты женского пола с детородным потенциалом (WOCBP): женщины должны использовать один или несколько из следующих надежных методов контрацепции в течение периода исследования и, по крайней мере, в течение 90 дней после последнего введения исследуемого препарата, таких как: a) установка внутриматочной спирали (ВМС) или внутриматочная система (ВМС); b) гормональная контрацепция (имплантируемая, пластырь, оральная); c) барьерные методы контрацепции: презерватив или закрывающий колпачок (диафрагма или шейные своды/колпачки) со спермицидной пеной/гелем/пленкой/кремом/суппозиторием; d) стерилизация партнера-мужчины (с соответствующей документацией после вазектомии об отсутствии сперматозоидов в эякуляте).

5. Субъекты мужского пола должны использовать два эффективных метода контрацепции в течение всего периода исследования и не сдавать сперму в течение 90 дней после последнего введения исследуемого препарата.

6. Наличие хотя бы одной язвы диабетической стопы, отвечающей следующим критериям:

а) Установлен диагноз полнослойной нейропатической DFU, расположенной на лодыжке или дистальнее от нее (за исключением язв между пальцами ног, но включая язвы на пятке).

b) SD: язва присутствует от 6 недель до 12 месяцев и имеет площадь 3-5 см2 после иссечения язвы, подтверждается при скрининге.

MD: язва присутствует от 6 недель до 12 месяцев и имеет площадь 3-5 см2 после иссечения язвы, подтверждается при скрининге после 2-недельного подготовительного периода.

c) Минимальное расстояние в 2 см между язвой, подходящей для исследования, и любыми другими язвами на указанной стопе.

d) Глубина ≥5 мм и степень 1А в соответствии с «Системой стадирования язв диабетической стопы Техасского университета» (22) ("The University of Texas Staging System for Diabetic Foot Ulcers" (22)), без обнаженных капсул, сухожилий или костей, а также без туннелей, подрывов или пазух, обнаруживаемых после первоначального иссечения язвы.

7. Субъект должен иметь возможность удерживать целевую язву в таком положении и ориентации, чтобы исследуемое лекарство можно было применять без значительной потери вещества из-за стекания, пока не будет наложена повязка.

8. Адекватная перфузия сосудов пораженной конечности, продемонстрированная в течение 30 дней до скрининга, что определяется по крайней мере одним из следующих критериев:

a) Лодыжечно-плечевой индекс (ЛПИ)≥0,9 и ≤1,2, подтвержденный путем чрескожного парциального давления кислорода (TcPO2)> 50 мм рт.

b) Давление на пальцах ног (плетизмография)> 50 мм рт.

c) Допплеровское ультразвуковое исследование (двухфазные или трехфазные волны) не менее двух сосудов на лодыжке, где результат соответствует адекватному кровотоку к пораженной конечности, как определено SoC.

Основные критерии исключения:

Часть 1 SD и Часть 2 MD:

Субъекты не должны соответствовать ни одному из следующих критериев для получения права участия в эксперименте:

1. Только для субъектов женского пола: беременность, подтвержденная положительным результатом сывороточного теста на беременность при скрининге и анализом мочи, проведенным в День-1 или кормление грудью.

2. У субъекта имеется:

a) Язва(ы), сопровождающаяся инфицированным целлюлитом, остеомиелитом или клиническими признаками или симптомами инфекции в соответствии с рекомендациями Общества по инфекционным заболеваниям Америки (IDSA) (19) (Infectious Diseases Society of the America's Guidelines (IDSA) (19).

b) Гангрена или некроз любой части пораженной конечности.

c) Активная или хроническая стопа Шарко на исследуемой конечности.

d) Запланированная сосудистая хирургия, ангиопластика, тромболизис или процедура реваскуляризации, выполненная в течение 1 месяца до включения в исследование.

e) Язвы с обнажением сухожилия, кости или суставной капсулы (допустимо наличие язв, распространяющихся через дерму и подкожную ткань с наличием грануляционной ткани).

f) Язва(ы) недиабетической этиологии.

g) Предыдущие обширные ампутации той же целевой стопы.

h) Фактическая или недавняя (3 недели) терапия антибиотиками по любой причине.

i) а также прикованные к постели субъекты или субъекты с ожидаемой продолжительностью жизни менее одного года.

3. Использование любой другой терапии факторами роста в течение 6 месяцев до скрининга.

4. Злокачественные новообразования в анамнезе за 5 лет до скрининга или лица с выраженным семейным анамнезом рака (например, семейные раковые заболевания), за исключением плоскоклеточного или базально-клеточного рака кожи, который был успешно излечен.

5. Клинически значимое сердечно-сосудистое, легочное, почечное, эндокринное, печеночное, неврологическое, психиатрическое, иммунологическое, желудочно-кишечное, гематологическое или метаболическое заболевание, которое, по мнению исследователя, не может быть стабилизировано или может иным образом повлиять на безопасность субъекта или результаты исследования (в случае сомнений следует проконсультироваться с врачом по клиническим исследованиям, назначаемым спонсором).

6. Субъект, находящийся на гемодиализе или перитонеальном диализе, или с хронической почечной недостаточностью (креатинин плазмы > 2 мг/дл).

7. Субъект со значительно отклоняющимися от нормы ключевыми лабораторными параметрами, влияющими на безопасность пациента в соответствии с оценкой PI.

Объем исследований/части исследования:

Исследование состоит из двух частей:

- Часть 1 SD - однократная возрастающая доза

- Часть 2 МД - многократная возрастающая доза

Дозировки:

SD: 0,3, 1, 3 и 6 мкг/мм2

MD: 1 и 3 мкг/мм2

Конечные точки эксперимента:

Первичная конечная точка:

Часть 1 SD:

Безопасность:

Нежелательные явления (AE) и нежелательные реакции на лекарства (ADR)

Показатели жизнедеятельности: систолическое (SBP) и диастолическое (DBP) артериальное давление.

Параметры ЭКГ в 12 отведениях, полученные по Холтеру (HR, PR, QRS, QTcF, QT)

Клинические лабораторные исследования (химия, гематологию и анализ мочи).

Часть 2 МД:

Безопасность:

AE и ADR;

Показатели жизнедеятельности: SBP, DBP; температура;

Трехкратная ЭКГ в 12 отведениях;

(В случае если какие-либо данные ЭКГ/сердечно-сосудистой системы проявятся в Части 1 исследования, SAC может также применить мониторинг по Холтеру для части или всей Части 2, как указано);

Параметры ЭКГ в 12 отведениях, полученные по Холтеру (ЧСС, PR, QRS, QTcF, QT);

Отклонения от нормы на 24-часовой холтеровской ЭКГ (общие паузы > 2,5 секунд, фибрилляция предсердий и трепетание предсердий, желудочковые запуски, преждевременные сокращения предсердий (PAC), преждевременные сокращения желудочков (PVC), аберрантная морфология); частота сердечных сокращений 0-24 часа (по 24-часовой холтеровской ЭКГ) и среднечасовая ЧСС;

Клинические лабораторные исследования (химия, гематология и анализ мочи).

Временные точки(ы) времени для характеристики этой конечной точки эксперимента: указаны выше.

Вторичная конечная точка:

Часть 1 SD:

Фармакокинетические (PK) переменные:

Следующие параметры PK будут получены на основе сывороточных концентраций полипептида SEQ ID NO: 4:

AUC 0-12 ч, AUC00-24ч, AUC0-t, AUC0-∞, Cmax, tmax, t½, CL/F, Vd/F;

AUC 0-12h DN, AUC00-24h DN, AUC0-t DN, AUC0-∞ DN, Cmax DN.

Переменные параметры иммуногенности: ADA Ct

Часть 2 МД:

Фармакокинетические (PK) переменные:

Следующие параметры PK будут получены из сывороточных концентраций полипептида SEQ ID NO: 4:

В день 1: AUC 0-12 ч, Cmax и tmax;

Со 2 по 13 день: Ctrough

В последний день приема препарата (День 14): AUC 0-12 ч, AUC0-t, AUC0-∞, Ctrough, Cmax , Cmin, tmax, tmin, Cav и Rac, t½, CL/F, и Vd/F.

Переменные параметры иммуногенности:

Концентрации антилекарственных антител (ADA) в сыворотке крови будут оцениваться в День 1 до введения первой дозы, в День 15 перед выпиской, в День 24 (4-я неделя), в День 52-й (8-я неделя) и 80-й день (12-я неделя).

Ct

Переменные фармакодинамики/эффективности:

Среднее уменьшение площади и объема целевой язвы от исходного уровня до D14, D21, D28, D56 и D84;

Время до заживления целевой области и объема язвы. Излечение будет определяться как «полное выздоровление». Также будут применяться различные определения «излечения» (частичная редукция: 50%, 66%, 75%).

Временные точки оценки данной конечной точки эксперимента: указаны выше.

Разовая возрастающая доза (SAD) осуществляется в следующих дозировках: Когорта A: 0,3 мкг/мм2; Когорта B: 1 мкг/мм2; Когорта СА: 3 мкг/мм2; Когорта D: 6 мкг/мм2. Каждая когорта состоит из субъектов с нативной последовательностью SEQ ID NO: 4, чтобы избежать возможности переноса эффектов между когортами. Это особенно важно в отношении гипералгезии, известной для человеческого NGF дикого типа. При необходимости уровни доз корректируются, и при необходимости для достижения целей исследования могут быть включены периоды вымывания.

При однократной возрастающей дозе (single ascending dose, SAD) стандарт лечения (Standard of Care, SOC) применялся при скрининге и при каждом последующем посещении до конца периода наблюдения, если не произошла полная реэпителизация/заживление, сохраняющаяся в течение 2 последовательных посещений. В этом случае SoC можно было бы прекратить, а ногу субъекта лечить в соответствии с оценкой/решением исследователя. SoC состоял из следующих процедур:

обработка целевой язвы (любое возможное кровотечение, вызванное обработкой раны, контролировалось только путем сжатия и подъема ноги),

перевязка поражения парафиновой марлей и наложение защитной повязки из стерильных марлевых салфеток,

использование разгрузочных съемных ходунков (не снимаемых в течение периода наблюдения) после перевязки.

В случае инфицирования очага во время исследования, из очага должен был быть взят образец для микробиологического посева, и субъекту была назначена системная эмпирическая антибактериальная терапия в соответствии с решением исследователя, который должен скорректировать терапию в соответствии с результатом исследования культуры. Каждая инфекция, особенно тяжелая, должна быть оценена на предмет серьезности в соответствии с ее интенсивностью.

При множественной возрастающей дозе (multiple ascending dose, MAD), исследование проводится последовательно в двух когортах, каждая с нативными субъектами. Целевые уровни суточной дозы составляют 1 мкг/мм2 и 3 мкг/мм2 для полипептида SEQ ID NO: 4 (20) или плацебо (10). После скрининга подходящие субъекты проходят лечение в соответствии со стандартом лечения (SOC; вводный период); регистрация подтверждается после измерения размера язвы. Если в течение этого подготовительного периода площадь язвы уменьшится на 50% или более, пациенты не будут включены в исследование.

Объем исследования:

Определение безопасности, фармакокинетики, фармакодинамики и других (переносимости) IMP у человека.

Результаты

Однократная возрастающая доза (SOC)

Однократная возрастающая доза (SAD) применялась в четырех последовательных когортах в следующих дозировках: Когорта A: 0,3 мкг/мм2; Когорта B: 1 мкг/мм2; Когорта СА: 3 мкг/мм2; Когорта D: 6 мкг/мм2, сверх стандартного лечения. Во всех этих когортах количественно определяемые уровни полипептида SEQ ID NO: 4 обнаруживались в системном кровотоке соответствующих субъектов. Таким образом, введенный полипептид присутствует в организме субъектов после введения.

Субъектов наблюдали на предмет нежелательных явлений в течение 28 дней после введения препарата в разовой дозе. Никаких нежелательных явлений, связанных с введением полипептида SEQ ID NO: 4 не наблюдалось. Таким образом, введение полипептида SEQ ID NO: 4 не было связано с какой-либо наблюдаемой нежелательной реакцией на лекарство. В результате отсутствия побочных реакций на лекарства можно сделать вывод, что полипептид SEQ ID NO: 4 безопасен и хорошо переносится человеком.

Перспективы

Биологическая активность полипептида SEQ ID NO: 4 проистекает из его способности стимулировать рост, а также обеспечивать поддержание, пролиферацию и выживание клеток, особенно нервных клеток.

В результате этого примера исследуются и подтверждаются профили безопасности, переносимости, фармакокинетики и фармакодинамики полипептида SEQ ID NO: 4 после введения однократных и многократных доз человеку.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Схема процесса согласно Примеру 2, включающая модиикации (оптимизации), описанные в Примере 2B.

Фиг. 2. ТЕСТ НА УДЛИНЕНИЕ НЕЙРИТА IN VITRO PC12.

Иллюстрация средней длины нейрита (A; средняя длина в лунке), общей длины нейрита (B; средняя общая длина на клетку) и процента клеток, у которых длина нейрита превышает длину тела клетки (C).

Столбики представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Статистический анализ: однофакторный дисперсионный анализ ANOVA с последующим апостериорным методом Тьюки по сравнению с группой, обработанной носителем (* P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001)

CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4

Фиг. 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 8-ДНЕВНАЯ КОГОРТА

Уровни глюкозы в крови у мышей db/db, измеренные во время взятия биопсии кожи. Никаких различий между животными, отнесенными к разным экспериментальным группам, не наблюдалось.

CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4

Фиг. 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 8-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.

Увеличение массы тела за время эксперимента (День 0 и День 7 после поражения кожи).

CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4

Фиг. 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 8-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.

Термальное пороговое значение. Задержка отдергивания лапы при подошвенном тесте, проведенном в Дни-3 и 7 после биопсии кожи и введения NGF. Данные представлены как среднее+SEM. Статистический анализ выполнен по критерию Стьюдента, *p <0,05.

CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4

Фиг. 6. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 8-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.

«Время до заживления» измеряется как внешняя и внутренняя площадь язвы (подробности см. в отчете пилотного исследования) до 8 дня после биопсии кожи. Результаты выражаются в процентах от пораженной области в День 0; данные представлены как среднее значение+SEM. См. текст для двустороннего статистического анализа ANOVA.

CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4

Фиг. 7. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 8-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.

Время до заживления язвы (наружная область) на 8-й День, выраженное как процент закрытия язвы по сравнению с Днем 0. Данные представлены как среднее значение+SEM.

CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4

Фиг. 8. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 8-ДНЕВНАЯ КОГОРТА

Уровни NGF в плазме при умерщвлении. Данные представляют собой среднее значение+SEM; Статистический анализ: односторонний дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом Даннета. * р <0,05, ** р <0,01.

CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4

Фиг. 9. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТА

Концентрацию глюкозы в крови измеряли при взятии биопсии кожи (d-1), после окончания лечения полипептидом SEQ ID NO: 4 (d-8) и при умерщвлении (d28). Подробности см. в тексте.

CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4

Фиг. 10. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТА

Увеличение массы тела за экспериментальное время. Никаких различий между экспериментальными группами не наблюдалось.

CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4

Фиг. 11. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТА

Результаты подошвенного теста через 0 и 7 дней после взятия биопсии кожи и введения полипептида SEQ ID NO: 4 (N=8 в каждой группе). Данные, полученные в 30-дневной когорте, представлены как среднее значение+SEM; статистический анализ выполнен по критерию Стьюдента.

CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4

Фиг. 12. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТА

Термальная гипералгезия, измеренная в 0-й и 7-й День после пункционной биопсии. На этом графике объединены данные, полученные как в 8-дневных, так и 30-дневных экспериментах (N=16 в каждой группе); данные представляют собой средние значения+SEM. Статистический анализ: t-критерий Стьюдента, * p <0,05.

CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4

Фиг. 13. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.

В таблице указан день заживления за время наблюдения, полученный из клинических наблюдений. «Нет» означает, что заживления не наблюдалось.

CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4

Фиг. 14. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.

Динамика процесса заживления, измеренная как внешняя область язвы, до 29 дня после биопсии кожи. Результаты выражаются в процентах от площади поражения в День 0; данные представляют собой средние значения+SEM. См. текст для статистического анализа.

CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4

Фиг. 15. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, когорты 8+30 дней

Время-до-заживления язвы (внешней области) на 8-й День. Данные, представленные на графике, были получены путем объединения значений как для 8-дневных, так и для 30-дневных экспериментов; N=16. Данные представлены как среднее значение+SEM. Статистический анализ: односторонний дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом множественных сравнений Даннета: F (5, 77) = 3,007, P=0,0156.

CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4

Фиг. 16. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.

Уровни NGF в плазме измеряли на 30 день. Данные представлены как среднее значение+SEM; статистический анализ: односторонний дисперсионный анализ и апостериорный тест Даннета.

CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4

Фиг. 17. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.

A. Микрофотографии, иллюстрирующие гистологию раны (окрашивание H&E) через 7 дней, взятые в соответствии со схемой, представленной в B.

D-F. Микрофотографии границы раны, иллюстрирующие MET (migrating epidermal tongue, мигрирующий эпидермальный язык) (D, E) и ангиогенез (F).

Фиг. 18. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.

Типичные микрофотографии процесса реэпителизации мышей, обработанных носителем, SEQ ID NO: 4 (1, 10 и 30 мкг/день). Для сравнения приводится микрофотография неповрежденной кожи. Толщина эпидермального слоя в разных группах представлена на графике. Данные представлены как среднее значение+SEM; статистический анализ: однофакторный дисперсионный анализ с последующим апостериорным критерием Тьюки, ** p <0,01; ****p <0,0001.

CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4

Фиг. 19. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.

Анатомия иннервации кожи спины мыши, визуализированная с помощью иммуноокрашивания PGP-9.5.

Фиг. 20. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, КОГОРТЫ 8+30 ДНЕЙ.

PGP9.5-IR в коже интактных животных (A), мышей, обработанных носителем (B) и SEQ ID NO: 4 (30 мкг/день) (C), через 30 дней после индукции поражения. D, E: ROI (интересующая область, D) и настройка порогового значения (E) для компьютерной процедуры анализа изображений, используемой для оценки иннервации кожи через 30 дней.

Фиг. 21. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, КОГОРТЫ 8+30 ДНЕЙ.

Морфометрический анализ PGP9.5-IR в коже через 8 (A) и 30 (B) дней после индукции язвы. Данные выражены как среднее значение+SEM; статистический анализ: однофакторный дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом Даннета; * р <0,05; ** р <0,01.

CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4

Фиг. 22. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, КОГОРТЫ 8+30 ДНЕЙ.

Гистологический (окрашивание H&E) и иммуногистохимический анализ заживленной (восстановленной) кожи в группе, обработанной SEQ ID NO: 4 (30 мкг/день). A-B: восстановленные слои кожи на базальной мембране, на что указывает окрашивание ламинином (B, стрелки); реиннервация исходит из субэпидермального сплетения и проецируется вверх через базальную мембрану (C). MET (D) значительно иннервирован как через 8 дней (E), так и через 30 (F) дней после поражения; ангиогенез наблюдается в MET, что визуализируется окрашиванием H&E (G), ламинином-IR при низком (H) и высоком (I) увеличениях.

Сокращения: ep - эпидермальный слой; MET- мигрирующий эпидермальный язык

Фиг. 23. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, КОГОРТЫ 8+30 ДНЕЙ.

Морфометрический анализ Laminin-IR в коже через 8 дней (A) и 30 дней (B) после индукции язвы. Серая горизонтальная полоса на графике B представляет ламинин-IR в неповрежденной коже. Данные выражены как среднее значение+SEM; статистический анализ: однофакторный дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом Даннета; *р <0,05; ***p <0,001; ****p <0,0001.

ФИГ. 24. ПОЛИПЕПТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ. ЗВЕЗДОЧКА (*) = ПОЛОЖЕНИЕ 61 В ЗРЕЛОМ ЧЕЛОВЕЧЕСКОМ NGF; КРЕСТ (+): ПОЛОЖЕНИЕ 100 В ЗРЕЛОМ ЧЕЛОВЕЧЕСКОМ NGF.

A: SEQ ID NO: 1: последовательность пре-про-человеческого NGF, кодируемая соответствующей открытой рамкой считывания гена человека.

Препептид: положения аминокислот 1-18; пропептид: положения аминокислот 19-121; зрелый NGF: положения аминокислот 122-239; С-концевой дипептид: положения аминокислот 240-241.

Дисульфидные связи (в правильно сложенной зрелой части): связывающие положения аминокислот 136 ↔201, 179 ↔ 229, 189 ↔ 231.

Сайт расщепления фурином (RSKR): положения аминокислот 118-121.

B: схематический обзор препептида, пропептида и зрелого NGF.

C: SEQ ID NO: 2: последовательность зрелого человеческого NGF.

D: SEQ ID NO: 3

E: SEQ ID NO: 4

Фиг. 25. Скорость заживления ран после обработки носителем или полипептидом SEQ ID NO: 4 (1-10-100 мкг/см2/день) у диабетических мышей представлена как «Доля мышей с незажившей поверхностью» в течение всего курса исследования. Статистический анализ: оценка кривой выживаемости Каплана-Мейера.

CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4

Фиг. 26. Морфометрический анализ PGP9.5-IR (A) и PECAM1-IR (A) в восстановленной коже через 28 дней после индукции язвы. Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n=15-18). Статистический анализ: однофакторный дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом Даннета; *р <0,05; **р <0,01.

CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4

Фиг. 27. Эффект полипептида SEQ ID NO: 4 на механический болевой порог в области, окружающей границу язвы, оценивали через 14 дней хронического местного лечения с помощью электронного аппарата фон Фрея Bioseb. Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n=15-18). Статистический анализ: односторонний дисперсионный анализ.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Киези Фармачукичи С.п.А (S.p.A.)

<120> Средство для лечения дерматологических заболеваний

<130> D411P2

<140>

<141>

<150> EP18194930.6

<151> 2018-09-17

<150> EP18203665.7

<151> 2018-10-31

<160> 4

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 241

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Последовательность человеческого пре-про-NGF,

кодируемая соответствующей открытой рамкой считывания человека.

<400> 1

Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile

1 5 10 15

Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile

20 25 30

Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu

35 40 45

Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala

50 55 60

Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg

65 70 75 80

Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu

85 90 95

Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro

100 105 110

Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe

115 120 125

His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly

130 135 140

Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu

145 150 155 160

Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu

165 170 175

Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile

180 185 190

Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val

195 200 205

Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg

210 215 220

Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg

225 230 235 240

Ala

<210> 2

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> SEQ ID NO: 2: Последовательность зрелого NGF человека

<400> 2

Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp

1 5 10 15

Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys

20 25 30

Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val

35 40 45

Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val

50 55 60

Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys

65 70 75 80

Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln

85 90 95

Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu

100 105 110

Ser Arg Lys Ala Val Arg

115

<210> 3

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO: 3

<400> 3

Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp

1 5 10 15

Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys

20 25 30

Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val

35 40 45

Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val

50 55 60

Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys

65 70 75 80

Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln

85 90 95

Ala Ala Trp Glu Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu

100 105 110

Ser Arg Lys Ala Val Arg

115

<210> 4

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO: 4

<400> 4

Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp

1 5 10 15

Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys

20 25 30

Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val

35 40 45

Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Ser Asn Pro Val

50 55 60

Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys

65 70 75 80

Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln

85 90 95

Ala Ala Trp Glu Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu

100 105 110

Ser Arg Lys Ala Val Arg

115

<---

Похожие патенты RU2799211C2

название год авторы номер документа
АГЕНТ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКЕ ОФТАЛЬМОЛОГИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ 2020
  • Имбимбо, Бруно, Пьетро
  • Виллетти, Джино
RU2812055C1
ХЛОРИД-ИНДУЦИРУЕМАЯ ПРОКАРИОТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ЭКСПРЕССИИ 2019
  • Вирт, Томас
  • Ирьянхейкки, Юха
  • Самаранаяке, Харита
  • Кярккяйнен, Ханна-Риикка
  • Куркипуро, Ере
  • Мирау, Игор
  • Смит, Уэсли
RU2812766C2
НОВЫЕ ВИДЫ ЛЕЧЕНИЯ 2015
  • Кларсунд Матс Петер
  • Блом Ульф Томас
RU2732378C2
ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ И КОСМЕТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ НЕЙРОТОКСИНА БОТУЛИНА СЕРОТИПА E 2019
  • Пон, Лоран
RU2800604C2
Модифицированная РНК, кодирующая полипептиды VEGF-A, составы, содержащие ее, и пути их применения 2017
  • Париндер Лиф Карлссон
  • Фритше Даниельсон Регина Десирэ
  • Ханссон Кенни Микаэль
  • Гань Ли Мин
  • Кларк Джонатан
  • Эгнелль Энн-Шарлотт Эва
  • Чейн Кеннет Рэндалл
RU2756313C2
КОМБИНАЦИИ АНТИТЕЛ К STAPHYLOCOCCUS AUREUS 2019
  • Ткачик, Кристин
  • Селлман, Брет
  • Ду, Цюнь
  • Дамшродер, Мелисса
  • Коэн, Тэйлор
RU2804815C2
НОВЫЙ БЕЛКОВЫЙ КОНЪЮГАТ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ НЕАЛКОГОЛЬНОГО СТЕАТОГЕПАТИТА, ОЖИРЕНИЯ И ДИАБЕТА 2021
  • Ким, Юнки
  • Ким, Минсун
  • Ким, Риуриун
  • Чои, Джаеянг
  • Йим, Йесеал
  • Шим, Мюнгбо
  • Хан, Дайе
  • Им, Даесеонг
  • Парк, Сунгджин
RU2822001C1
ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПОСРЕДСТВОМ ЭКСПРЕССИИ ФЕРМЕНТА, ОБЛАДАЮЩЕГО ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕАЗНОЙ (ДНКазной) АКТИВНОСТЬЮ, В ПЕЧЕНИ 2019
  • Генкин, Дмитрий Дмитриевич
  • Тец, Георгий Викторович
  • Тец, Виктор Вениаминович
RU2773691C2
Антитела к CD38 и фармацевтические композиции на их основе для лечения аутоиммунного заболевания, опосредованного аутоантителами 2020
  • Клункер Даниел
  • Боксхаммер Райнер
  • Хертле Штефан
  • Штайдль Штефан
  • Ярутат Тиантом
RU2809565C2
АНТИТЕЛА К CD40 ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЛЕЧЕНИИ СИНДРОМА ШЕГРЕНА 2018
  • Эспи, Паскаль
  • Гергели, Петер
  • Раш, Джеймс
RU2790558C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 799 211 C2

Реферат патента 2023 года СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДЕРМАТОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу лечения кожных язв у субъекта-млекопитающего. Способ лечения кожных язв у субъекта-млекопитающего, включающий введение полипептида SEQ ID NO: 4, где полипептид вводят местно и наносят на поверхность поврежденной части тела и, при этом, доза/каждая доза имеет количество от 0,3 до 6 мкг полипептида на мм2 обрабатываемой поврежденной поверхности тела, что составляет от 0,3 до 6 мкг/мм2. Вышеуказанное изобретение позволяет лечить кожные язвы у млекопитающих. 11 з.п. ф-лы, 27 ил., 9 табл., 5 пр.

Формула изобретения RU 2 799 211 C2

1. Способ лечения кожных язв у субъекта-млекопитающего, включающий введение полипептида SEQ ID NO: 4, где полипептид вводят местно и наносят на поверхность поврежденной части тела и, при этом, доза/каждая доза имеет количество от 0,3 до 6 мкг полипептида на мм2 обрабатываемой поврежденной поверхности тела, что составляет от 0,3 до 6 мкг/мм2.

2. Способ по п.1, где субъектом-млекопитающим является человек.

3. Способ по любому из предшествующих пунктов, где млекопитающее, предпочтительно человек, страдает сахарным диабетом или имеет предрасположенность к сахарному диабету.

4. Способ по п.3, где сахарный диабет выбран из сахарного диабета 1 типа и сахарного диабета 2 типа.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где полипептид вводят однократно.

6. Способ по любому из пп.1-4, где полипептид вводят многократно от одного до пяти раз в день.

7. Способ по п.6, где полипептид вводят два раза в день.

8. Способ по п.6 или 7, где полипептид вводят многократно в течение периода от трех до 30 дней, предпочтительно от семи до 14 дней, или, альтернативно, до заживления пораженной поверхности тела.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где полипептид вводят субъектам с диабетическими язвами стопы (DFU), предпочтительно субъектам с нейропатическими диабетическими язвами стопы (DFU).

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где лечение и/или профилактика не вызывают гипералгезии у млекопитающего.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где полипептид содержится в водной среде, а водная среда вводится млекопитающему.

12. Способ по любому из предшествующих пунктов, где полипептид может быть получен путем рекомбинантной экспрессии и очистки, при этом очистка включает очистку путем смешанного режима стационарной фазы.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2023 года RU2799211C2

Станок для изготовления деревянных ниточных катушек из цилиндрических, снабженных осевым отверстием, заготовок 1923
  • Григорьев П.Н.
SU2008A1
ПИЛЬЩИКОВА В.В
и др
Профилактика заболеваний: учебное пособие для студентов лечебного и педиатрического факультетов
- Краснодар, ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России, 2016
КУНГУРОВ Н.В
Болезни кожи: монография [атлас], Екатеринбург: УрНИИДВиИ, 2014
Приспособление для удаления таянием снега с железнодорожных путей 1920
  • Строганов Н.С.
SU176A1

RU 2 799 211 C2

Авторы

Виллетти, Джино

Имбимбо, Бруно Пьетро

Кальца, Лаура

Даты

2023-07-04Публикация

2019-09-17Подача