Способ количественного определения ионов алюминия атомно-абсорбционной спектрометрией с электротермической атомизацией Российский патент 2023 года по МПК G01N21/74 

Изобретение относится к области медицины, фармации, биотехнологии, а именно к количественному определению ионов алюминия в иммунобиологических лекарственных препаратах (далее - ИЛП), содержащих гель гидроксида алюминия в качестве адъюванта.

Уровень техники

Гель гидроксида алюминия входит в состав большого количества ИЛП: препараты анатоксинов, вакцины против гепатита В, вакцины против клещевого энцефалита, вакцина против гепатита А, пневмококковые вакцины, вакцины комбинированные, вакцины последнего поколения против коронавирусной инфекции на основе синтетических пептидов. Несмотря на постоянный поиск и внедрение в практику новых веществ, повышающих иммуногенность иммунобиологических препаратов, гель гидроксида алюминия остается самым популярным адъювантом, имеющим многолетний опыт применения и доказавшим свою иммунологическую эффективность.

Помимо повышения иммуногенности, наличие в составе препарата геля гидроксида алюминия может вызывать нежелательные местные реакции, такие как покраснение в месте введения, уплотнения, а также возможность развития воспалительного синдрома, ассоциированного с адъювантами [1-3].

Содержание геля гидроксида алюминия в соответствии с требованиями ВОЗ нормируется по содержанию алюминия и ограничено требованием не более 1,25 мг алюминия на дозу. Допустимое содержание геля гидроксида алюминия может варьировать от 0,2 мг/мл до 1,7 мг/мл в зависимости от препарата, при этом для каждого препарата должна быть определена индивидуальная норма, подтвержденная материалами о фармацевтической разработке [4].

Из уровня техники известен способ определения ионов алюминия методом комплексонометрического титрования. В данном способе раскрыты условия перевода геля гидроксида алюминия в растворенное состояние с помощью нагревания в 10%-ом растворе серной кислоте, реакции комплексообразования с трилоном Б и титрования с визуальным определением точки эквивалентности в присутствии индикатора дитизона. К недостаткам данного способа можно отнести низкую чувствительность, ограниченную возможность автоматизации анализа, визуальное детектирование точки эквивалентности [5].

Из уровня техники известен другой способ определения ионов алюминия методом атомно-абсорбционной спектроскопии с пламенной атомизацией. В данном способе также раскрыты условия перевода геля гидроксида алюминия в растворенное состояние с помощью нагревания в концентрированной серной кислоте, условия атомизации в пламени газовой смеси ацетилен-закись азота и детектирования ионов алюминия (аналитическая длина волны, объем пробы). К недостаткам данного способа можно отнести невысокую чувствительность, использование воспламеняемых газов для атомизации, проблему проскока частиц сквозь просвечиваемую зону [6].

Прототипом заявляемого изобретения является известный из уровня техники способ определения ионов алюминия методом атомно-абсорбционной спектроскопии с электротермической атомизацией. В данном способе раскрыты условия перевода геля гидроксида алюминия в растворенное состояние с помощью нагревания в концентрированной серной или азотной кислоте, электротермической атомизации раствора и детектирования ионов (схема термического нагревания образца, аналитическая длина волны, объем пробы). Данный способ обладает высокой чувствительностью, не требует использования горючих газов в смеси с окислителями, благодаря одновременной атомизации всей пробы свободные атомы остаются в оптическом пути длительное время. К недостатку данного способа можно отнести необходимость использования концентрированных кислот [7].

Авторами было выявлено, что в настоящее время определение алюминия методом атомно-абсорбционной спектроскопии с электротермической атомизацией с получением раствора алюминия в условиях нагревания в присутствии щелочных растворов отсутствует. Потребность в использовании щелочных растворов заключается в оптимизации процедуры пробоподготовки.

Описание сущности и осуществления заявленного способа

Технической задачей является разработка способа количественного определения геля гидроксида алюминия в иммунобиологических лекарственных препаратах.

Техническим результатом является количественное определение ионов алюминия в иммунобиологических лекарственных препаратах заявленным способом, обладающим селективностью, прецезионностью и правильностью.

Достижение технического результата обеспечивается благодаря:

- использованию атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией;

- проведению процедуры пробоподготовки не менее чем в две стадии;

- условиям разведения, обеспечивающим получение раствора с концентрацией, приемлемой для чувствительности атомно-абсорбционного спектрометра;

- использование стандартного образца.

Используемые термины и понятия

«Эффект матрицы» - это изменение интенсивности определяемого элемента под влиянием других присутствующих в пробе элементов [9].

Стандартный образец - это образец с установленными значениями величин, характеризующих содержание определенных компонентов в веществе: химических элементов, их изотопов, соединений химических элементов, структурных составляющих и т.п. По уровню утверждения стандартные образцы подразделяют на следующие категории: государственный стандартный образец (ГСО), фармакопейный стандартный образец (ФСО), международный стандартный образец (МСО) и др.[10].

Иммунобиологические лекарственные препараты (далее - ИЛП) - это лекарственные препараты биологического происхождения, предназначенные для иммунологической диагностики, профилактики и лечения различных заболеваний [11].

Метод калибровочного графика - метод определения содержания определяемого элемента путем сравнения аналитического сигнала испытуемого образца с аналитическими сигналами серии стандартных растворов с известными концентрациями определяемого элемента. [8]

Осуществление заявленного способа

Способ количественного определения ионов алюминия, содержащихся в адъюванте для иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП), отличающийся тем, что используют атомно-абсорбционную спектрометрию с электротермической атомизацией, где пробоподготовку проводят не менее чем в две стадии, где на первой стадии к ИЛП и к стандартному образцу содержания ионов алюминия прибавляют раствор натрия гидроксида и далее нагревают на кипящей водяной бане 5 минут до получения прозрачного раствора смеси, охлаждают, добавляют концентрированную азотную кислоту, взятую в избытке относительно количества натрия гидроксида, и где на последней стадии разводят раствором 0,1% трилона Х-100 разведенного в 0,5% азотной кислоте до концентрации калибровочного графика, далее проводят количественный анализ ионов алюминия в полученной смеси, если проводят более двух стадий пробоподготовки, то между первой стадией и последней стадией используют воду.

Способ, отличающийся тем, что количественный анализ проводят при аналитической волне 309,3 нм.

Способ, отличающийся тем, что проводят количественный анализ при температуре атомизации ионов алюминия.

Способ отличающийся тем, что концентрация диапазона калибровочного графика от 10 мкг/л до 50 мкг/л.

Способ, отличающийся тем, что раствор натрия гидроксида с концентрацией не менее 2 моль/л.

Способ, отличающийся тем, что иммунологические препараты выбраны из вакцин, анатоксинов.

Способ, отличающийся тем, что иммунологические препараты содержат адъювант в виде геля гидроксида алюминия.

Известно, что гель гидроксида алюминия представляет собой коллоидную систему с частицами разного размера. Для электротермической атомизации необходим перевод алюминия в растворенное состояние. Поскольку алюминия гидроксид является амфотерным соединением, образование устойчивого раствора возможно как в кислой, так и в щелочной среде.

В ходе исследований было установлено, что для получения достоверных и воспроизводимых результатов требуется соблюдение следующих условий:

- концентрация ионов алюминия в образце после проведения всех этапов пробоподготовки находиться в диапазоне от 5 мкг/л до 60 мкг/л, так как данный диапазон является наилучшим для его определения;

- в ходе пробоподготовки для достижения указанного выше диапазона необходимо не менее двух стадий, первая из которых включает растворение геля гидроксида алюминия, вторая (и последующие, при их наличии) - разведение полученного раствора до концентраций диапазона калибровочного графика. При этом растворение необходимо произвести на первой стадии, для снижения «эффекта матрицы»;

- для растворения геля гидроксида алюминия нагревают суспензию геля на кипящей водяной бане в течение 5 минут в присутствии раствора натрия гидроксида концентрацией не менее 2 моль/л до получения визуально прозрачного раствора;

- использование щелочных растворов может вызывать неисправность атомно-абсорбционного спектрометра, поэтому полученный раствор нейтрализуют азотной кислотой взятой в избытке относительно используемого количества щелочи. Допускается использование раствора азотной кислоты любой концентрации, при условии соблюдения избытка кислоты;

- получаемый аналитический сигнал далее обрабатывается с использованием метода калибровочного графика. Для приготовления серии растворов с известной концентрацией используют стандартный образец.

Для осуществления заявленного способа была разработана процедура пробоподготовки состоящая не менее чем из двух стадий: где на первой стадии, к водной суспензии ИЛП, содержащей адъювант в виде геля гидроксида алюминия, прибавляют раствор натрия гидроксида с концентрацией не менее 2 моль/л, далее нагревают на кипящей водяной бане 5 минут до визуального растворения геля гидроксида алюминия, смесь охлаждают, прибавляют концентрированную азотную кислоту, взятую в избытке относительно количества натрия гидроксида; и где на второй стадии смесь разводят водным раствором 0,1% тритон Х-100 в 0,5% азотной кислоте до концентрации, соответствующей диапазону калибровочного графика от 10 мкг/л до 50 мкг/л.

Если пробоподготовку проводят более, чем в две стадии, то водный раствор 0,1% тритон Х-100 в 0,5% азотной кислоте используется только на последней стадии, а на промежуточных стадиях используют воду очищенную.

Аналогичную процедуру пробоподготовки проводят для стандартного образца содержания ионов алюминия.

Процедуру пробоподготовки проводят не менее чем для 5 растворов для построения калибровочного графика с использованием стандартного образца содержания ионов алюминия.

Далее полученный раствор (смесь) анализируют на приборе при аналитической длине волны 309,3 нм, объем аликвоты - от 10 мкл до 20 мкл, при температурном режиме атомизации (см. таблицу 1).

Таблица 1. Температурный режим атомизации раствора (смеси) Этап Температура, °C Время, с Назначение 1 105 13,0 Удаление воды из раствора (смеси) 2 120 7,0 3 200 10,0 4 650 3,0 Сжигание органических веществ, находящихся в составе смеси 5 650 10,0 6 1300 5,0 Атомизация иных элементов, входящих в состав смеси 7 1300 15,0 8 1300 2,0 9 2575 0,6 Атомизация алюминия в смеси 10 2575 2,5 11 2650 3,0 Очистка измерительной ячейки

В результате электротермической атомизации раствора алюминия, получают атомный пар. Детекция результатов заключается в измерении интенсивности резонансной линии, меняющейся в зависимости от интенсивности поглощения атомами определяемого элемента излучения, соответствующего определяемому элементу. Интенсивность поглощения зависит от концентрации аналита, которая находится в диапазоне от 5 мкг/л до 60 мкг/л. Объем образца, поступающий в прибор, может варьировать от 10 мкл до 20 мкл в зависимости от технических характеристик прибора, аналитическая длина волны - 309,3 нм.

Концентрация алюминия в испытуемом растворе рассчитывалась и затем пересчитывалась с учетом разведения, способами и методами известными специалисту из уровня техники методами.

Краткое описание чертежей и иных материалов (Приложение 1)

Фиг. 1 Калибровочная прямая, характеризующая зависимость оптической плотности атомного пара (А) при длине волны 309,3 нм от концентрации ионов алюминия (С) в растворе.

Возможность осуществления заявляемого изобретения раскрыта в следующих примерах.

Пример 1. Приготовление растворов для построения калибровочного графика

К стандартному образцу содержания ионов алюминия прибавляют раствор натрия гидроксида с концентрацией не менее 2 моль/л, далее нагревают на кипящей водяной бане 5 минут до визуального растворения геля гидроксида алюминия; смесь охлаждают, прибавляют концентрированную азотную кислоту, взятую в избытке относительно количества натрия гидроксида; далее смесь разводят водным раствором 0,1% тритон Х-100 в 0,5% азотной кислоте получая серию растворов с концентрациями 10-20-30-40-50 мкг/л. Анализируют растворы на приборе при температуре атомизации и аналитической длине волны 309,3 нм, фиксируя оптическую плотность атомного пара.

Выводы. Полученная линейная зависимость оптической плотности от концентрации ионов алюминия (фиг.1), может быть использована в качестве калибровочной при анализе проб с неизвестной концентрацией ионов алюминия.

Пример 2. Определение количественного содержания ионов алюминия в препарате «Вакцина на основе пептидных антигенов для профилактики COVID-19» заявленным способом.

К образцу препарата прибавляют раствор натрия гидроксида с концентрацией не менее 2 моль/л, далее нагревают на кипящей водяной бане 5 минут до визуального растворения геля гидроксида алюминия; смесь охлаждают, прибавляют концентрированную азотную кислоту, взятую в избытке относительно количества натрия гидроксида; далее смесь разводят водным раствором 0,1% тритон Х-100 в 0,5% азотной кислоте до получения концентрации, лежащей в диапазоне калибровочного графика.

Анализируют растворы на приборе при температуре атомизации и аналитической длине волны 309,3 нм, фиксируя оптическую плотность атомного пара.

Полученное на приборе значение оптической плотности пересчитывают по калибровочному графику с учетом степени разведения.

Выводы. Полученное значение, 0,686 мг/0,5 мл, находится в диапазоне, определенном нормативной документацией на препарат - 0,5 - 0,7 мг/0,5 мл.

Пример 3. Определение количественного содержания ионов алюминия в препарате, содержащем комбинацию Анатоксин ботулинический и Анатоксин столбнячный очищенный адсорбированный заявленным способом.

Пробоподготовку и анализ полученных данных проводили аналогично примеру 2.

Выводы. Полученное значение, 0,97 мг/мл, находится в диапазоне, определенном нормативной документацией на препарат - не более 1,2 мг/мл.

Пример 4. Определение количественного содержания ионов алюминия в препарате «Вакцина для профилактики дифтерии столбняка, коклюша (бесклеточная), полиомиелита (инактивированная), гепатита В комбинированная адсорбированная» заявленным способом.

Пробоподготовку и анализ полученных данных проводили аналогично примеру 2.

Выводы. Полученное значение, 1,309 мг/мл, находится в диапазоне, определенном нормативной документацией на препарат - 1,1-1,7 мг/мл.

Пример 5. Определение количественного содержания ионов алюминия в ФСО заявленным способом.

Пробоподготовку и анализ полученных данных проводили аналогично примеру 2.

Выводы. Полученное значение 0,81 мг/мл находится в диапазоне, указанном в паспорте производителя ФСО, что подтверждает специфичность выбранной методики.

Пример 6. Прецизионность заявленного способа оценивали, известной специалисту из уровня техники, методикой оценивания [12] на уровне повторяемости (сходимости) результатов и на уровне внутрилабораторной прецизионность: обе оценки повторяемости методики проводили с использованием фармакопейного стандартного образца.

Выводы. Заявленный способ обладает прецезионностью, соответствующей требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации (таблица 3).

Пример 7. Для оценки правильности методики проводили анализ коммерчески доступных стандартных образцов с различными концентрациями от 80 до 120% от номинальной концентрации в диапазоне аналитической области методики (таблица 2,3).

Выводы. Заявленный способ обладает правильностью, соответствующей требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации.

Таблица 2. Оценка правильности методики определения алюминия методом атомно-абсобрционной спектроскопии с электротермической атомизацией Образец Номинальная концентрация, мг/л Разведение, % от номинального Теоретическая концентрация, мкг/л Фактическая концентрация, мкг/л Фактическая концентрация с учетом разведения, мг/л Правильность, % Правильность усредненная, % ГСО 1000 80 25,6 28,7 1122,8 112,3 111,7 100 32,0 36,4 1138,4 113,8 120 38,4 41,9 1090,7 109,1 МСО 1000 80 25,6 28,6 1116,9 111,7 109,8 100 32,0 35,8 1118,7 111,9 120 38,4 40,7 1059,2 105,9 ФСО 810 80 20,7 22,5 877,5 108,3 109,4 100 25,9 28,2 882,3 108,9 120 31,1 34,5 898,3 110,9

Оценку полученных данных по валидации проводили в соответствии с рекомендациями Государственной фармакопея Российской Федерации [13].

Таблица 3 . Валидационные параметры методики определения алюминия методом атомно-абсорбционной спектроскопии Параметр Мера Критерий приемлемости Результат Линейность Визуальная оценка графика Линейная регрессия Коэффициент корреляции R≥0,985 Аналитическая область - - 5-60 мкг/л Повторяемость
(n=5) Относительное стандартное отклонение ≤ 5,0 % 3,14 % Внутрилабораторная прецизионность
(n=10) Относительное стандартное отклонение ≤ 5,0 % 4,74 % Правильность
(n=6) Среднее значение выявления 85-115 % 105,9- 113,8 %

Выше изложенное техническое решение описано довольно подробно, с целью ясности понимания, и не должно рассматриваться, как ограничивающее объем притязаний.

Представленные примеры не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения и служат только для цели иллюстрации и раскрытия заявленного способа.

Промышленная применимость

Все представленные примеры подтверждают возможность применения в фармации, биотехнологии, биологии, химии, медицине заявленного способа определения содержания ионов алюминия атомно-абсорбционной спектрометрией с электротермической атомизации в иммунологических лекарственных средствах и препаратах.

Таким образом, поставленная техническая задача, а именно, разработка способа количественного определения ионов алюминия в адъюванте, в виде геля гидроксида алюминия, содержащегося в иммунобиологических лекарственных средствах и препаратах достигнута, что подтверждается приведенными примерами.

Список литературы

1. С.Г. Раденска-Лоповок, П. Волкова, Архив патологии, № 5, 56-62 (2018)

2. H. HogenEsch, Vaccine., №20, 34-39 (2002)

3. R.K.Gheradi, F.J.Authier, Lupus, № 2, 184-189 (2012)

4. Guideline on adjuvants in vaccines for human use [Электронный ресурс] URL: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-adjuvants-vaccines-human-use-see-also-explanatory-note_en.pdf (дата обращения 27.04.2022 г.)

5. Государственная фармакопея РФ, Определение ионов алюминия в сорбированных иммунобиологических лекарственных препаратах ОФС 1.7.2.0016.15 [Электронный ресурс] URL: https: // docs.rucml.ru / feml / pharma / v14 / vol2 / 1103 / (дата обращения 27.04.2022 г.)

6. The aluminum content of biological products containing aluminum adjuvants: determination by atomic absorption spectrometry, J. C. May, J. J. Progar, R. Chin, Journal of Biological Standardization, 12, 1984, P. 175-183

7. The measurement and full statistical analysis including Bayesian methods of the aluminium content of infant vaccines, E.Shardlowa, C. Linharta, S. Connor, Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 66, 2021,P. 1-7

8. Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 11.08.2020 N 100

"О Фармакопее Евразийского экономического союза"// СПС КонсультантПлюс.

9. Государственная фармакопея РФ, Атомно-эмиссионная спектрометрия ОФС.1.2.1.1.0004.15 [Электронный ресурс] URL: https: // docs.rucml.ru / feml / pharma / v14 / vol1 / 759 / (дата обращения 27.04.2022 г.)

10. ГОСТ 8.315-2019. Стандартные образцы состава и свойств веществ и материалов

11. Государственная фармакопея РФ, Иммунобиологические лекарственные препараты ОФС.1.7.1.0018.18 [Электронный ресурс] URL: https: // docs.rucml.ru / feml / pharma / v14 / vol2 / 2717 /(дата обращения 27.04.2022 г.)

12. Государственная фармакопея РФ, Статистическая обработка результатов химического эксперимента ОФС.1.1.0013.15 [Электронный ресурс] URL: https: // docs.rucml.ru / feml / pharma / v14 / vol1 / 289 /(дата обращения 27.04.2022 г.)

13. Государственная фармакопея РФ, Валидация аналитических методик ОФС.1.1.0012.15 [Электронный ресурс] URL: https: // docs.rucml.ru / feml / pharma / v14 / vol1 / 275 / (дата обращения 27.04.2022 г.).

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано в медицине, фармации, биотехнологии. Способ количественного определения ионов алюминия, содержащихся в адъюванте для иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП), включает использование атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией, где пробоподготовку проводят не менее чем в две стадии, где на первой стадии к ИЛП и к стандартному образцу содержания ионов алюминия прибавляют раствор натрия гидроксида и далее нагревают на кипящей водяной бане до получения прозрачного раствора смеси, охлаждают, добавляют концентрированную азотную кислоту, взятую в избытке относительно количества натрия гидроксида, и где на последней стадии разводят раствором 0,1% трилона Х-100, разведенного в 0,5% азотной кислоте до концентрации калибровочного графика, далее проводят количественный анализ ионов алюминия в полученной смеси, если проводят более двух стадий пробоподготовки, то между первой стадией и последней стадией используют воду. Техническим результатом является разработка способа количественного определения ионов алюминия в иммунобиологических лекарственных препаратах, обладающего селективностью, прецизионностью и правильностью. 7 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.

1. Способ количественного определения ионов алюминия, содержащихся в адъюванте для иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП), отличающийся тем, что используют атомно-абсорбционную спектрометрию с электротермической атомизацией, где пробоподготовку проводят не менее чем в две стадии, где на первой стадии к ИЛП и к стандартному образцу содержания ионов алюминия прибавляют раствор натрия гидроксида и далее нагревают на кипящей водяной бане до получения прозрачного раствора смеси, охлаждают, добавляют концентрированную азотную кислоту, взятую в избытке относительно количества натрия гидроксида, и где на последней стадии разводят раствором 0,1% трилона Х-100, разведенного в 0,5% азотной кислоте до концентрации калибровочного графика, далее проводят количественный анализ ионов алюминия в полученной смеси, если проводят более двух стадий пробоподготовки, то между первой стадией и последней стадией используют воду.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что иммунобиологические препараты выбраны из вакцин, анатоксинов.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что иммунобиологические препараты, содержат адъювант в виде геля гидроксида алюминия.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что количественный анализ проводят при аналитической волне 309,3 нм.

5. Способ по п. 1 или 4, отличающийся тем, что проводят количественный анализ при температуре атомизации ионов алюминия.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрация диапазона калибровочного графика от 10 до 50 мкг/л.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что раствор натрия гидроксида с концентрацией не менее 2 моль/л.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что смесь нагревают до получения прозрачного раствора на кипящей водяной бане 5 мин.