Способ определения лозартана, его основного метаболита лозартан карбоновой кислоты и глибенкламида в сыворотке крови и моче человека Российский патент 2021 года по МПК A61K31/4178 A61K31/64 A61P9/12 A61P3/10 G01N30/72 G01N33/15 G01N30/06 

Изобретение относится к фармации, к фармакологии и клинической фармакологии, к исследованию биологических материалов, в частности, к способам определения лозартана, его основного метаболита лозартан карбоновой кислоты (Е-3174) и глибенкламида (ГЛБ) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) в сыворотке крови и (или) моче человека при терапевтическом лекарственном мониторинге и исследованиях фармакокинетики.

Уровень техники

Пациенты, страдающие совокупностью таких заболеваний как артериальная гипертензия и сахарный диабет 2-го типа, часто обязаны принимать лозартан и глибенкламид, совместно. При этом отсутствует простой эффективный, чувствительный, селективный, точный и воспроизводимый способ пробоподготовки для определения низких концентраций лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида в сыворотке крови и (или) моче человека.

Из уровня техники известен способ для определения лозартана в плазме крови человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) [1]. В данной работе к образцам плазмы крови или мочи (200 мкл) добавляют раствор внутреннего стандарта, аналиты экстрагируют с использованием 2 мл метил-трет-бутилового эфира (МТБЭ), затем встряхивают и центрифугируют, после замораживания водной фазы органический слой (МТБЭ) отбирают и высушивают в токе азота, сухой остаток растворяют в 200 мкл подвижной фазы. Хроматографическое разделение проводят с использованием колонки Hypersil С18, 4,6 мм × 250 мм, диаметр частиц сорбента 3,5 мкм (Thermo), элюирование осуществляют в изократическом режиме подвижной фазой состоящей из смеси ацетонитрил:0,1% муравьиная кислота (60:40, v/v).

Недостатками данного способа являются:

- невозможность определения глибенкламида совместно с лозартаном и его активным метаболитом Е-3174 в сыворотке и (или) моче;

- используется жидкостная экстракция в качестве способа пробоподготовки с дальнейшим замораживанием водной фазы (в течение 40 минут), что удлиняет время подготовки аналита к анализу;

- использование изократического режима элюирования удлиняет время анализа проб;

В другом известном способе для определения лозартана и его метаболита в плазме крови и моче человека [2] предложена схема пробоподготовки осаждение белков ацетонитрилом. Хроматографическое разделение проводится в режиме градиентного элюирования с подвижной фазой А (0,1 М ацетат аммония)/ В (ацетонитрил) на колонке CAPCELL РАК С18, длиной 15×x2 мм, диаметром частиц сорбента 5 мкм с масс-спектрометрическим детектором.

К недостаткам этого способа следует отнести:

- невозможность определения глибенкламида совместно с лозартаном и его активным метаболитом Е-3174 в сыворотке и (или) моче;

- увеличение времени пробоподготовки плазмы крови в связи с тем, что после осаждения пробы ацетонитрилом, супернатант высушивают, растворяют в 300 мкл метанола, высушивают и перерастворяют в 100 мкл метанола и фильтруют;

- предложено перед осаждением проб мочи ацетонитрилом инкубировать их (3-глюкуронидазой в ацетате натрия в течение 24 ч в водяной бане при 37°С, что приводит к увеличению времени пробоподготовки аналитов;

- длительное время хроматографического разделения (общее время анализа 13 мин).

В качестве прототипа выбран известный способ для определения глибенкламида в плазме крови человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) [3]. Пробоподготовку осуществляют путем осаждения белков в плазме крови и моче ацетонитрилом, содержащим 0,1% муравьиную кислоту, с последующим встряхиванием в течение 3 мин и центрифугированием в течение 10 мин при 14000 g, далее 500 мкл супернатанта разбавляют ультрачистой водой в соотношении 1:2 (об/об), еще раз центрифугируют в течение 10 минут. Хроматографическое разделение проводится в режиме градиентного элюирования с подвижной фазой А (0,1% раствор муравьиной кислоты в воде) / В (0,1% раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле) на колонке UPLC®HSS Суапо, 2,1 мм × 100 мм, диаметр частиц сорбента 1,8 мкм с масс-спектрометрическим детектором.

К недостаткам данного способа следует отнести:

невозможность определения глибенкламида совместно с лозартаном и его активным метаболитом Е-3174 в сыворотке и (или) моче;

разбавление проб приводит к меньшей чувствительности метода;

диапазон концентраций 125-2000 нг/мл не позволяет определять концентрации ниже 125 нг/мл;

необходимость оборудования, обеспечивающего работу при сверхвысоком давлении, из-за использования сорбента с диаметром частиц 1,8 мкм. Таким образом, существует потребность в разработке простого, эффективного, чувствительного, селективного, точного и воспроизводимого способа для определения лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида в сыворотке крови и (или) моче человека.

Сущность изобретения

Технической задачей заявленного изобретения является - разработка эффективного, простого способа пробоподготовки без применения сильных неорганических кислот, расширение аналитического диапазона, достижения высокой чувствительности, селективности, точности и воспроизводимости для определения лозартана, его активного метаболита лозартан карбоновой кислоты (Е-3174), являющийся маркером активности CYP2C9, и глибенкламида, как по отдельности, так и при их совместном присутствии в сыворотке крови человека и (или) моче; применение единого внутреннего стандарта.

Техническим решением предлагаемого изобретения является то, что заявленный способ для определения лозартана, его метаболита лозартан карбоновой кислоты (Е-3174) и глибенкламида, характеризуется эффективностью, селективностью, чувствительностью, точностью, с широким линейным диапазоном, позволяющим определять анализируемые вещества, при совместном или отдельном их присутствии в сыворотке крови и (или) моче человека в диапазоне концентраций от 1 нг/мл до 1000 нг/мл.

Кроме того, настоящее техническое решение - является эффективным для применения в области клинической фармакологии при проведении терапевтического лекарственного мониторинга путем исследования сыворотки крови и (или) мочи пациента.

Технический результат предложенного изобретения достигается благодаря тому, что:

- используют неразбавленный ацетонитрил, в качестве осадителя белков в сыворотке крови и (или) мочи, что позволяет унифицировать схему пробоподготовки образцов для всех анализируемых веществ и сделать ее единой для сыворотки крови и (или) мочи, что приводит к уменьшению времени пробоподготовки;

- применяют прометазин в качестве единого внутреннего стандарта для всех анализируемых веществ в сыворотке крови и (или) в моче;

- при проведении пробоподготовки центрифугируют пробу один раз;

- детектируют при положительной ионизации анализируемых компонентов. Описание изобретения

В заявленном способе для определения лозартана, основного метаболита лозартан карбоновой кислоты (Е-3174) и глибенкламида (ГЛБ) (Фиг. 1-3), как по отдельности, так и при их совместном присутствии в сыворотке и (или) моче человека осуществляется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС). Для количественного определения концентраций требуется приготовления набора стандартных растворов определяемых веществ, то есть, растворов с точно известной концентрацией, для дальнейшего приготовления из них калибровочных растворов, которые необходимы для построения калибровочной кривой, по которой определяются концентрации аналитов исследуемых образцов.

Калибровочные образцы готовят путем прибавления к 180 мкл интактной сыворотки крови и (или) моче 20 мкл соответственно одного из стандартных растворов лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида до получения их концентраций в диапазоне от 1 нг/мл до 1000 нг/мл.

Пробоподготовку калибровочных и анализируемых образцов сыворотки крови и (или) мочи пациента проводят методом осаждения белков следующим образом: к 200 мл биологического образца, помещенного в центрифужные микропробирки типа «эппендорф» вместимостью 2 мл, прибавляют 5 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта прометазина, взятого в концентрации 100,00 нг/мл, затем прибавляют 600 мкл неразбавленного ацетонитрила от 99,9% масс., смешивают в смесителе типа «вортекс» до полного перемешивания (однородного состояния), предпочтительнее в течение не менее 15 с; затем центрифугируют до разделения содержимого на твердую и жидкую фазы, с центробежным ускорением 15294 g в течение в течение от 10 до 20 минут, наиболее предпочтительно в течение 15 минут; затем 500 мкл надосадочной жидкости (супернатант) переносят в хроматографические виалы с дальнейшим помещением в автоматический пробоотборник хроматографа.

Неожиданно было обнаружено, что для извлечения лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида из сыворотки крои и (или) мочи человека, целесообразно использовать неразбавленный ацетонитрил, в качестве осадителя белков, который позволяет наиболее эффективно извлекать аналиты анализируемых веществ из сыворотки крови человека и (или) мочи человека.

Таким образом, использование неразбавленного ацетонитрила, в качестве осадителя белков для аналитов анализируемой группы веществ, в виде лозартана, метаболита Е-3174 и глибенкламида при совместном присутствии в сыворотке крови и (или) моче человека, приводит к более эффективному, точному и воспроизводимому анализу, характеризующемуся способностью, наиболее эффективно дифференцировать аналиты анализируемых веществ в сыворотке крови и (или) моче человека.

Также, неожиданно было обнаружено, что применение неразбавленного ацетонитрила, в качестве осадителя белка для анализируемой группы веществ, в виде лозартана, метаболита Е-3174 и глибенкламида и внутреннего стандарта представляющий собой раствор прометазина, при совместном присутствии в сыворотке крови и (или) моче человека, приводят к уменьшению времени пробоподготовки, в связи с тем, что позволяют использовать единую пробоподготку для сыворотки крови и (или) мочи, и что позволяют экономить время при проведении анализа.

Кроме того, неожиданно было обнаружено, что настоящее техническое решение с заявленным техническим результатом - является эффективным для применения в области клинической фармакологии при проведении терапевтического лекарственного мониторинга и при проведении исследования сыворотки крови и (или) мочи пациента.

Условия хроматографического разделения и детектирования

Количественное определение лозартана, его метаболита лозартан карбоновой кислоты (Е-3174) и глибенкламида (ГЛБ), проводят на высокоэффективном жидкостном хроматографе, оснащенном градиентным насосом, термостатом колонок, дегазатором, термостатируемым автоматическим пробоотборником и тандемным масс-спектрометрическим детектором (тройным квадруполем). Обработку первичных данных проводят при помощи соответствующего программного обеспечения.

Колонка (неподвижная фаза), для проведения ВЭЖХ МС/МС. Выбрана колонка размером 50×4,6 мм с привитой фазой С18 из группы XBridge и сорбентом с диаметром частиц 3,5 мкм, с универсальной предколонкой С18, 4×3,0 мм, что обеспечивает рабочее давлении в системе, не превышающее 17МПа.

Температура термостата колонок: 40°С.

Подвижная фаза:

- Элюент А: 0,1% (об.) раствор муравьиная кислота/деионизированная вода

- Элюент В: 0,1% (об.) раствор муравьиная кислота/ ацетонитрил

Градиентный режим элюирования по составу подвижной фазы представлен в таблице 1.

Градиентный режим элюирования по скорости потока подвижной фазы представлен в таблице 2.

Объем вводимой пробы: 20 мкл.

Время регистрации хроматограммы по масс-спектрометрическому детектору: 0-5,3 мин.

Время удерживания прометазина: 1,59±0,02 мин Время удерживания лозартана: 1,88±0,02 мин Время удерживания Е-3174: 2,19±0,02 мин Время удерживания глибенкламида: 2,67±0,02 мин

Параметры источника ионизации: распыляющий газ 3 л/мин, осушающий газ 20 л/мин, блок нагрева 400°С, линия десольвации 200°С, напряжение на капилляре +5 кВ.

Условия детектирования лозартана, его основного метаболита Е-3174 и прометазина (внутренний стандарт) и глибенкламида в режиме мониторинга множественных реакций представлены в Таблице 3.

Полученные калибровочные кривые имеют линейный характер в диапазоне концентраций, для анализируемых веществ от 1 нг/мл до 1000 нг/мл в сыворотке крови и (или) моче человека, с соответствующими коэффициентами корреляции (Фиг. 4-9). Правильность и прецизионность результатов рассчитывают в соответствии с требованиями Руководства по экспертизе лекарственных средств [4]. Правильность измерений (Е, %) не превышает 6,33%, а относительное стандартное отклонение, позволяющее оценить прецизионность результатов, имеет значение не более 12,32% (Таблица 4-6).

Предложенный способ позволяет:

Отказаться от использования сильных неорганических кислот при пробоподготовке и использовать в качестве осадителя белков неразбавленный ацетонитрил.

Получить аналитические диапазоны, для анализируемых веществ от 1 нг/мл до 1000 нг/мл за счет унификации пробоподготовки.

Повысить эффективность, чувствительность, селективность, точность и воспроизводимость предлагаемого способа для определения комбинации лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида, как по отдельности, так и при их совместном присутствии в сыворотке крови и (или) моче человека.

Использовать прометазин в качестве единого и доступного стандарта.

Расширить спектр аналитических методик для определения лозартана, метаболита Е-3174 и глибенкламида в сыворотке крови и (или) моче человека при хроматографическом разделении на сорбенте с диаметром частиц 3,5 мкм, при рабочем давлении в системе не более 17МПа при сохранении скорости анализа.

Количественное определение изучаемых веществ в моче человека позволяет использовать неинвазивный метод отбора проб.

Краткое описание чертежей и иных материалов (Приложения 1-15).

Фиг. 1. Структурная формула лозартана.

Фиг. 2. Структурная формула активного метаболита лозартана (Е-3174).

Фиг. 3. Структурная формула глибенкламида.

Фиг. 4. Калибровочная зависимость отношения площади пика лозартана к площади пика прометазина от отношения концентрации лозартана к концентрации прометазина в сыворотке крови.

Фиг. 5. Калибровочная зависимость отношения площади пика Е-3174 к площади пика прометазина от отношения концентрации Е-3174 к концентрации прометазина в сыворотке крови.

Фиг. 6. Калибровочная зависимость отношения площади пика глибенкламида к площади пика прометазина от отношения концентрации глибенкламида к концентрации прометазина в сыворотке крови.

Фиг. 7. Калибровочная зависимость отношения площади пика лозартана к площади пика прометазина от отношения концентрации лозартана к концентрации прометазина в моче.

Фиг. 8. Калибровочная зависимость отношения площади пика Е-3174 к площади пика прометазина от отношения концентрации Е-3174 к концентрации прометазина в моче.

Фиг. 9. Калибровочная зависимость отношения площади пика глибенкламида к площади пика прометазина от отношения концентрации глибенкламида к концентрации прометазина в моче.

Фиг. 10. Хроматограмма образца сыворотки крови пациента с содержанием лозартана 11,39 нг/мл, Е-3174 57,49 нг/мл, глибенкламида 12, 28 нг/мл и рабочего стандартного раствора прометазина в концентрации 3,33 нг/мл.

Фиг. 11. Хроматограмма образца сыворотки крови пациента с содержанием глибенкламида 21,27 нг/мл и рабочего стандартного раствора прометазина в концентрации 3,33 нг/мл.

Фиг. 12. Хроматограмма образца сыворотки крови человека, принимавшего лозартан в дозе 25 мг, с содержанием 8,68 нг/мл лозартана, Е-3174 133,66 нг/мл и рабочего стандартного раствора прометазина с концентрацией 3,33 нг/мл.

Фиг. 13. Хроматограмма образца сыворотки крови человека, принимавшего лозартан в дозе 100 мг, с содержанием 103,89 нг/мл лозартана, Е-3174 489,6 нг/мл и рабочего стандартного раствора прометазина с концентрацией 3,33 нг/мл.

Фиг. 14. Хроматограмма образца интактной сыворотки крови человека не содержащего лозартан, Е-3174, глибекламид и прометазин.

Фиг. 15. Хроматограмма образца мочи пациента с содержанием лозартана 430,51 нг/мл, Е-3174 155,59 нг/мл, глибенкламида 1,05 нг/мл и рабочего стандартного раствора прометазина в концентрации 3,33 нг/мл.

Фиг. 16. Хроматограмма образца мочи пациента, принимавшего лозартан в дозе 100 мг, с содержанием лозартана 516,7 нг/мл, Е-3174 929,23 нг/мл и рабочего стандартного раствора прометазина в концентрации 3,33 нг/мл.

Фиг. 17. Хроматограмма образца мочи пациента, принимавшего глибенкламид в дозе 7 мг, с содержанием глибенкламида 9,7 нг/мл и рабочего стандартного раствора прометазина в концентрации 3,33 нг/мл.

Фиг. 18. Хроматограмма образца интактной мочи человека не содержащего лозартан, Е-3174, глибекламид и прометазин.

Возможность осуществления заявляемого изобретения раскрыта в следующих примерах.

Пример 1. Определение содержания лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида в сыворотке крови человека.

Пациент, включенный в исследование, находился на постоянной терапии глибенкламидом (глибенкламид микронизированный 3,5 мг), а в день исследования принимал в терапевтически эффективных дозировках 50 мг лозартана. Отбор крови производили непосредственно перед приемом лозартана и глибенкламида, а также через 4 часа после приема указанных препаратов. Проведение анализа.

1. Получение сыворотки крови человека. Забор крови производят в вакуумные пробирки. Кровь, взятую у пациента, выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин. По истечении 30 минут пробирки центрифугируют не менее 15 минут при 3000 об/мин. Затем аликвоту полученной сыворотки переносят в пробирки типа Eppendorf Save Lock вместимостью 2 мл для дальнейшей пробоподготовки.

2. Калибровочные образцы готовят путем прибавления к интактной сыворотке крови и/или моче 20 мкл стандартных растворов лозартана, метаболита лозартана Е-3174 и глибенкламида до получения концентраций в диапазоне от 1 нг/мл до 1000 нг/мл.

3. Пробоподготовку калибровочных и анализируемых образцов сыворотки крови и (или) мочи человека проводят методом осаждения белков следующим образом: к 200 мкл биологического образца, помещенным в центрифужные микропробирки типа «эппендорф» вместимостью 2 мл, прибавляют 5 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта прометазина в концентрации 100 нг/мл, затем прибавляют 600 мкл неразбавленного ацетонитрила, перемешивают в смесителе типа «вортекс» до полного перемешивания в течение не менее 15 с; затем центрифугируют до разделения содержимого на твердую и жидкую фазы с центробежным ускорением 15294 g в течение от 10 мин до 20 мин, наиболее предпочтительно в течение 15 мин. Затем 500 мкл надосадочной жидкости (супернатант) переносят в хроматографические виалы и помещают в автоматический пробоотборник хроматографа.

4. Количественное определение лозартана, метаболита Е-3174 и ГЛБ проводят на высокоэффективном жидкостном хроматографе, оснащенном градиентным насосом, термостатом колонок, дегазатором, термостатируемым автоматическим пробоотборником и тандемным масс-спектрометрическим детектором (тройным квадруполем). Обработку первичных данных проводят при помощи соответствующего программного обеспечения.

Колонка (неподвижная фаза), для проведения ВЭЖХ МС/МС. Выбрана колонка размером 50×4,6 мм с привитой фазой С18 из группы XBridge и сорбентом 3,5 мкм, с универсальной предколонкой С18,4×3,0 мм.

Объем вводимой пробы: 20 мкл.

Время регистрации хроматограммы по масс-спектрометрическому детектору: 0-5,3 мин.

Время удерживания прометазина: 1,59±0,02 мин

Время удерживания лозартана: 1,88±0,02 мин

Время удерживания Е-3174: 2,19±0,02 мин Время удерживания глибенкламида: 2,67±0,02 мин

Параметры источника ионизации: распыляющий газ 3 л/мин, осушающий газ 20 л/мин, блок нагрева 400°С, линия десольвации 200°С, напряжение на капилляре +5 кВ.

Условия детектирования лозартана, его основного метаболита Е-3174, глибенкламида и внутреннего стандарта прометазина, в режиме мониторинга множественных реакций представлены в Таблице 3.

Обнаружено лозартана 11,39 нг/мл, лозартан-карбоксилат (Е-3174) 57,49 нг/мл и глибенкламида 12,28 нг/мл (Фиг. 10). От момента забора крови до предоставления результатов затрачивается не более 1 ч.

Данный пример показывает возможность определения лозартана, метаболита Е-3174 и глибенкламида при совместном присутствии в сыворотке крови человека заявленным способом.

Пример 2. Определение количественного содержания глибенкламида в сыворотке крови пациента при монотерапии глибенкламидом.

Пациент, включенный в исследование, находился на постоянной монотерапии глибенкламидом в терапевтической эффективной дозе 7,0 мг.

В пробе сыворотки крови, отобранной через 4 часа после приема препарата, обнаружено 21,27 нг/мл глибенкламида, без присутствия лозартана и его основного метаболита (Фиг. 11).

Данный пример показывает возможность количественного определения изучаемых веществ по отдельности в сыворотке крови человека заявленным способом, описанным в Примере 1.

Пример 3. Определение содержания лозартана и метаболита Е-3174 в сыворотке крови пациента принимавшего лозартан в дозе 25 мг.

В пробе сыворотки крови пациента, принимавшего лозартан в дозе 25 мг, обнаружено лозартана 8,68 нг/мл и Е-3174 133,66 нг/мл (Фиг. 12). На хроматограммах полученных образцов отсутствует пик, соответствующий глибенкламиду по времени удерживания. Отбор проб сыворотки крови, пробоподготовку и анализ аналитов осуществляли заявленным способом, описанным в Примере 1.

Данный пример показывает возможность количественного определения изучаемых веществ, как по отдельности, так и при применении меньших терапевтических доз препаратов, заявленным способом.

Пример 4. Определение содержания лозартана и метаболита лозартана Е-3174 в сыворотке крови пациента принимавшего лозартан в дозе 100 мг.

В данном исследовании пациент принимал лозартан в эффективной дозе 100 мг. Отбор проб сыворотки крови, пробоподготовку и анализ аналитов осуществляли способом, описанным в Примере 1.

В пробе сыворотки крови пациента, принимавшего лозартан в дозе 100 мг, обнаружено лозартана 103,89 нг/мл и метаболита Е-3174 489,60 нг/мл (Фиг. 13). На хроматограммах, полученных образцов отсутствует пик, соответствующий глибенкламиду по времени удерживания.

Данный пример показывает возможность количественного определения изучаемых веществ как по отдельности, так и при применении больших терапевтических доз препаратов, заявленным способом.

Пример 5. Определение содержания лозартана, метаболита лозартана Е-3174 и глибенкламида в интактной сыворотке крови.

Определение содержания лозартана, Е-3174 и глибенкламида в интактной сыворотке крови человека, достоверно не содержащей эти препараты, проводят заявленным способом, описанным в Примере 1.

На хроматограммах (Фиг. 14), полученных образцов отсутствуют пики, соответствующие лозартану, метаболиту Е-3174 и глибенкламиду по времени удерживания.

Таким образом, данный пример демонстрирует селективность заявленного способа и отсутствие риска предоставления ложноположительных результатов количественного определения лозартана, метаболита Е-3174 и глибенкламида в сыворотке крови.

Пример 6. Определение содержания лозартана, метаболита лозартана Е-3174 и глибенкламида в моче человека.

Пациент, включенный в исследование, находился на постоянной терапии глибенкламидом (3,5 мг), в день исследования принимал 50 мг лозартана. Сбор мочи проводили в течение 8 часов после приема, а концентрацию аналитов измеряли в усредненной пробе.

Определение содержания лозартана, метаболита Е-3174 и глибенкламида в моче человека проводят заявленным способом, описанным в Примере 1.

Обнаружено лозартана 430,51 нг/мл, метаболита Е-3174 155,59 нг/мл и глибенкламида 1,05 нг/мл (Фиг. 13). От момента забора крови до предоставления результатов затрачивается не более 1 ч.

Данный пример показывает возможность количественного определения лозартана, метаболита Е-3174 и глибенкламида при совместном присутствии в моче человека заявленным способом.

Пример 7. Определение содержания лозартана и метаболита лозартана Е-3174 в моче пациента принимавшего 100 мг лозартана.

Пациент, включенный в исследование, принимал лозартан в дозе 100 мг. Сбор мочи проводится как описано в Примере 6, определение содержания лозартана и Е-3174 в моче человека проводят способом, описанным в Примере 1.

В аналитах обнаружено лозартана 566,70 нг/мл и метаболита Е-3174 929,23 нг/мл (Фиг. 16). На хроматограммах полученных образцов отсутствует пик, соответствующий глибенкламиду по времени удерживания.

Данный пример показывает возможность количественного определения изучаемых веществ по отдельности в моче человека, а также возможность применения других терапевтических доз изучаемых препаратов, заявленным способом, описанным в Примере 1.

Пример 8. Определение содержания глибенкламида в моче пациента, находящегося на монотерапии глибенкламидом в дозе 7 мг.

Пациент, включенный в исследование, находился на постоянной монотерапии глибенкламидом в дозе 7,0 мг. Определение содержания глибенкламида в моче проводят способом, описанным в Примере 1.

В исследуемом образце обнаружено 9,7 нг/мл глибенкламида. На хроматограммах отсутствуют пики, соответствующие лозартану и его метаболиту (Фиг. 17).

Данный пример показывает возможность количественного определения изучаемых веществ по отдельности в моче человека, а также возможность применения других терапевтических доз изучаемых препаратов, заявленным способом, описанным в Примере 1.

Пример 9. Определение содержания лозартана, метаболита Е-3174 и глибенкламида в интактной моче человека.

Определение содержания лозартана, Е-3174 и глибенкламида в интактной моче человека, достоверно не содержащей эти препараты, проводят способом, описанным в Примере 1.

На хроматограммах (Фиг. 18) полученных образцов отсутствуют пики, соответствующие лозартану, метаболиту Е-3174 и глибенкламиду по времени удерживания.

Таким образом, данный пример демонстрирует селективность заявленного способа и отсутствие риска предоставления ложноположительных результатов количественного определения лозартана, метаболита Е-3174 и глибенкламида в сыворотке крови.

Пример 10. Определение правильности и прецизионности результатов определения лозартана, его метаболита лозартана Е-3174 и глибенкламида в сыворотке крови и моче человека. Оценку точности и прецизионности проводили в диапазоне от 1 нг/мл до 1000 нг/мл путем анализа образцов контроля качества, содержащих лозартан, его метаболит Е-3174 и глибенкламид на уровнях 1 нг/мл, 3 нг/мл, 500 нг/мл, 750 нг/мл, 1000 нг/мл. Анализ проводили в рамках 3 циклов, включавших по 5 образцов для каждого уровня концентраций. Правильность (Е,%) и прецизионность (RSD,%) определяли внутри аналитического цикла и между циклами (таблицы 4-6). Величины относительного стандартного отклонения (RSD, %) соответствовали нормам (не более 20% для нижнего предела количественного определения (НПКО) и не более 15% - для остальных уровней).

Величины правильности (Е,%) (табл. 4-6) не превышают 6,33%, что свидетельствует о высокой степени соответствия между истинным значением аналита и его значением, полученным по данной методике.

Данный пример раскрывает возможность определения лозартана, метаболита лозартана Е-3174 и глибенкламида при совместном присутствии в сыворотке крови и (или) моче человека с приемлемой эффективностью, точностью и воспроизводимостью в концентрациях диапазоне от 1 нг/мл до 1000 нг/мл, что отвечает заявленным аналитическим диапазонам.

Представленные примеры не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения и служат только для цели иллюстрации.

Промышленная применимость

Все приведенные примеры, подтверждают эффективность, чувствительность, селективность, точность и воспроизводимость заявленного способа.

Таким образом, поставленная техническая задача, а именно, разработка эффективного, чувствительного, селективного, точного и воспроизводимого заявленного способа для количественного определения лозартана, его метаболита Е-3174, глибенкламида в сыворотке крови и моче, достигнута, что подтверждается приведенными примерами.

Применение заявленного способа в клинической фармакологии при проведении терапевтического лекарственного мониторинга для исследования сыворотки крови и (или) моче пациента, является эффективным.

Список литературы:

1. Z.Li, G.Wang, L.-S.Wang et al. Effects of the CYP2C9*13 allele on the pharmacokinetics of losartan in healthy male subjects. Xenobiotica. 2009. 39(10): 788-793.

2. Shimako Tanaka, Shinya Uchida, Naoki Inui et al. Simultaneous LC-MS/MS Analysis of the Plasma Concentrations of a Cocktail of 5 Cytochrome P 450 Substrate Drugs and Their Metabolites. Biol.PHarai.Bull. 2014. 37(1): 18-25.

3. Mariana Milan Fachi, Leticia Bonancio, Leticia Paula Leonart et al. Simultaneous Quantification of Antidiabetic Agents in Human Plasma by UPLC-QToF-MS Method. PLoS ONE. 2016. 11(12): 1-10.

4. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Под ред. проф. А.Н. Миронова. Том I. М.: Гриф и К, 2013. С.201-207.

5. Руководство по валидации аналитических методик проведения испытаний лекарственных средств. Решение Коллегии Евразийского экономической комиссии от 17 июля 2018 N113.

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и может быть использовано для пробоподготовки при одновременном определении лозартана, его метаболита лозартанкарбоновой кислоты (Е-3174) и глибенкламида высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) в сыворотке крови и/или моче человека. В предварительно приготовленные калибровочные и анализируемые образцы, представляющие собой сыворотку крови и/или мочу человека, добавляют эффективное количество внутреннего стандарта, представляющего собой раствор прометазина в концентрации 100 нг/мл. Далее добавляют эффективное количество осадителя белка, представляющего собой неразбавленный ацетонитрил, затем перемешивают до однородного состояния, с последующим центрифугированием при центробежном ускорении 15294 g до разделения на твердую и жидкую фазы, с дальнейшим отбором эффективного количества супернатанта. Проводят хроматографическое разделение компонентов пробы в режиме градиентного элюирования с последующим детектированием сигнала при положительной ионизации для лозартана, его метаболита Е-3174, глибенкламида и внутреннего стандарта прометазина. Данный способ применяют для определения лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида в сыворотке крови и/или моче человека. Способ обеспечивает возможность осуществления пробоподготовки для определения лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида, позволяющего определять анализируемые вещества, при совместном или отдельном их присутствии в сыворотке крови и/или моче человека за счет использования унифицированной схемы пробоподготовки образцов для всех анализируемых веществ с применением неразбавленного ацетонитрила, центрифугирования пробы один раз, применения прометазина, в качестве единого внутреннего стандарта для всех анализируемых веществ. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 18 ил., 6 табл., 10 пр.

1. Способ пробоподготовки для одновременного определения лозартана, его метаболита лозартанкарбоновой кислоты (Е-3174) и глибенкламида высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) в сыворотке крови и/или моче человека, характеризующийся тем, что в предварительно приготовленные калибровочные и анализируемые образцы, представляющие собой сыворотку крови и/или мочу человека, добавляют эффективное количество внутреннего стандарта, представляющего собой раствор прометазина в концентрации 100 нг/мл; далее добавляют эффективное количество осадителя белка, представляющего собой неразбавленный ацетонитрил, затем перемешивают до однородного состояния, с последующим центрифугированием при центробежном ускорении 15294 g до разделения на твердую и жидкую фазы, с дальнейшим отбором эффективного количества супернатанта; с последующим хроматографическим разделением компонентов пробы в режиме градиентного элюирования, далее с последующим детектированием сигнала при положительной ионизации для лозартана, его метаболита Е-3174, глибенкламида и внутреннего стандарта прометазина.

2. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что аналитический диапазон для лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида составляет от 1 до 1000 нг/мл соответственно.

3. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что осаждают белки неразбавленным ацетонитрилом в соотношении к сыворотке крови и/или моче человека 3:1.

4. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что предварительно подготовленные сыворотка крови и/или моча человека содержат эффективное количество лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида.

5. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что используют сорбент из группы XBridge с привитой фазой С18 с диаметром частиц 3,5 мкм.

6. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что хроматографическое разделение компонентов пробы проводят при рабочем давлении не более 17 МПа с сохранением скорости анализа.

7. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что центрифугируют в течение 15 минут.

8. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что детектированный сигнал получают с помощью масс-спектрометрического детектора в режиме мониторинга множественных реакций.

9. Применение способа по п. 1 для определения лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида в сыворотке крови и/или моче человека.