Показать метаданные Скрыть метаданные

(19)

(11)

2 832 574

(13)

(51)

МПК

C07K14/82(2006-01-01)

C12N15/52(2006-01-01)

A61K35/15(2015-01-01)

(21) (22)

Заявка

2022100158, 2020-06-10

(24)

Дата начала отсчета патента

2020-06-10

(22)

дата подачи заявки

2020-06-10

(45)

опубликовано

2024-12-25

(72)

авторы

Джунеджа, ВикрамДонг, ЧжэнсиньИзерт, Робин ДжессикаКхейрабад, Махбубех

(73)

патентообладатели

Байонтек Юэс Инк.

(56)

Документы, цитированные в отчете о поиске

WO 2018208856 A1, 15.11.2018YARCHOAN Met al., Targeting neoantigens to augment antitumour immunity, Nat Rev Cancer, 2017, vБАРЫШНИКОВА М.Аи др., Неоантигены в иммунотерапии опухолей, Российский биотерапевтический журнал, 2018, т

НЕОАНТИГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C07K14/82 C12N15/52 A61K35/15

Описание патента на изобретение RU2832574C2

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки США № 62/860,493, поданной 12 июня 2019 г., которая полностью включена в настоящее описание посредством ссылки. Эта заявка относится к международной заявке № PCT/US2020/031898, поданной 7 мая 2020 г., которая полностью включена в настоящее описание посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Иммунотерапией рака является использование иммунной системы для лечения рака. Иммунотерапии используют тот факт, что раковые клетки часто имеют на своей поверхности молекулы, которые могут быть обнаружены иммунной системой, известные как опухолевые антигены, которые часто являются белками или другими макромолекулами (например, углеводами). Активная иммунотерапия направляет иммунную систему атаковать опухолевые клетки путем воздействия на опухолевые антигены. Пассивная иммунотерапия усиливает существующие противоопухолевые ответы и включает использование моноклональных антител, лимфоцитов и цитокинов. Опухолевые вакцины обычно состоят из опухолевых антигенов и иммуностимулирующих молекул (например, адъювантов, цитокинов или лигандов Toll-подобных рецепторов (TLR)), которые работают вместе, чтобы индуцировать антигенспецифические цитотоксические Т-клетки (CTL), которые распознают и лизируют опухолевые клетки. Опухолевые неоантигены, которые возникают в результате генетических изменений (например, инверсий, транслокаций, делеций, миссенс-мутаций, мутаций сайтов сплайсинга и т.д.) в злокачественных клетках, представляют собой наиболее опухолеспецифичный класс антигенов, и могут быть пациент-специфичными или и то и другое. Опухолевые неоантигены уникальны для опухолевой клетки, поскольку мутация и соответствующий ей белок присутствуют только в опухоли. Они также избегают центральной толерантности и, следовательно, с большей вероятностью являются иммуногенными. Таким образом, опухолевые неоантигены являются превосходной мишенью для иммунного распознавания, в том числе и гуморальным и клеточным иммунитетом.

Чтобы вызвать Т-клеточный ответ на вакцинацию, антигенпрезентирующие клетки (АРС) должны процессировать эпитопсодержащий пептид и презентировать эпитопы на главном комплексе гистосовместимости (МНС) I или МНС II. Одним из критических препятствий для разработки лечебной и опухолеспецифической иммунотерапии является недостаточный процессинг и высвобождение минимальных эпитопов для презентации антигена для создания адекватных иммунных ответов. Соответственно, существует потребность в разработке дополнительных противораковых терапевтических вакцин для обеспечения эффективного и достаточного процессинга и презентации эпитопов.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

Все публикации, патенты и заявки на патенты, упомянутые в настоящем описании, включены сюда посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент была специально и индивидуально указана как включенная посредством ссылки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В некоторых аспектах изобретение относится к полипептиду, содержащему эпитоп, презентируемый МНС класса I или МНС класса II антигенпрезентирующей клетки (АРС), полипептид, имеющий структуру Формулы (I):

Y_n-B_t-A_r-X_m-A_s-C_u-Z_p

Формула (I),

или его фармацевтически приемлемая соль,

(i) где X_m является эпитопом, где каждый X независимо является аминокислотой из непрерывной аминокислотной последовательности, кодированной последовательностью нуклеиновой кислоты в геноме субъекта,

и где,

(a) MHC является MHC класса I, и m является целым числом от 8 до 12, или

(b) MHC является MHC класса II, и m является целым числом от 9 до 25;

(ii) где каждый Y независимо является аминокислотой, ее аналогом или производным, и где:

(А) если переменная r из A_r в Формуле (I) равна 0, Y_n не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует B_t-A_r-X_m,

(В) если переменная r из A_rв Формуле (I) равна 1, и переменная t из B_tв Формуле (I) равна 0, Y_n не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m, или

(С) если переменная r из A_r в Формуле (I) равна 1 и переменная t из B_t в Формуле (I) равна 1 или более, Y_n не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует B_t; и

где n является целым числом от 0 до 1000;

(iii) где каждый Z независимо является аминокислотой, аналогом или производным, и где:

(А) если переменная s из A_s в Формуле (I) равна 0, Z_p не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m-A_s-C_u,

(В) если переменная s из A_sв формуле (I) равна 1, и переменная u из C_u в формуле (I) равна 0, Z_p не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m, или

(С) когда переменная s из A_s в формуле (I) равна 1, и переменная u из C_u в формуле (I) равна 1 или более, Z_p не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует C_u; и

где р является целым числом от 0 до 1000;

и, кроме того, где

если n равно 0, p является целым числом от 1 до 1000; и

если p равно 0, n является целым числом от 1 до 1000;

(iv) где A_rявляется линкером, и r равно 0 или 1;

(v) где A_sявляется линкером и s равно 0 или 1;

(vi) где каждый B независимо является аминокислотой, кодированной последовательностью нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая находится непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m,

и где t является целым числом от 0 до 1000; и

(vii) где каждый C независимо является аминокислотой, кодированной последовательностью нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая находится непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m,

и где u является целым числом от 0 до 1000;

и, кроме того, где

(а) полипептид не состоит из четырех разных эпитопов, презентированных MHC класса I;

(b) полипептид содержит по меньшей мере две различные полипептидные молекулы;

(d) Y_nи/или Z_pотщепляются от эпитопа, когда полипептид процессируется APC.

В некоторых вариантах осуществления, эпитоп презентируется MHC класса II. В некоторых вариантах осуществления, m является целым числом от 9 до 25. В некоторых вариантах осуществления, t равно 1, 2, 3, 4 или 5 или более и r равно 0. В некоторых вариантах осуществления, u равно 1, 2, 3, 4, или 5 или более и s равно 0. В некоторых вариантах осуществления, t равно 1 или более, r равно 0 и n равно от 1 до 1000. В некоторых вариантах осуществления, u равно 1 или более, s равно 0 и p равно от 1 до 1000. В некоторых вариантах осуществления, t равно 0. В некоторых вариантах осуществления, u равно 0. В некоторых вариантах осуществления, t равно по меньшей мере 1, и B_t содержит лизин. В некоторых вариантах осуществления, u равно по меньшей мере 1, и C_u содержит лизин. В некоторых вариантах осуществления, B_t отщепляется от эпитопа, если полипептид процессируется APC. В некоторых вариантах осуществления, C_u отщепляется от эпитопа, если полипептид процессируется APC. В некоторых вариантах осуществления, n является целым числом от 1 до 5 или от 7 до 1000. В некоторых вариантах осуществления, p является целым числом от 1 до 4 или от 6 до 1000.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид не состоит из четырех различных эпитопов, презентированных МНС класса I. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не содержит четыре различных эпитопа, презентированных MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит по меньшей мере две разные полипептидные молекулы. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп содержит по меньшей мере одну мутантную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна мутантная аминокислота кодируется вставкой, делецией, сдвигом рамки считывания, неоORF или точечной мутацией в последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта. В некоторых вариантах осуществления Y_n и/или Z_p отщепляются от эпитопа, если полипептид процессируется APC. В некоторых вариантах осуществления m из X_m равно по меньшей мере 8, и X_m является AA₁AA₂AA₃AA₄AA₅AA₆AA₇AA₈AA₉AA₁₀AA₁₁AA₁₂AA₁₃AA₁₄AA₁₅AA₁₆AA₁₇AA₁₈AA₁₉AA₂₀AA₂₁AA₂₂AA₂₃AA₂₄AA₂₅, где каждая АА является аминокислотой, и где одна или несколько из AA₉, AA₁₀, AA₁₁, AA₁₂, AA₁₃, AA₁₄,AA₁₅, AA₁₆, AA₁₇, AA₁₈, AA₁₉, AA₂₀, AA₂₁, AA₂₂, AA₂₃, AA₂₄ и AA₂₅ необязательно присутствуют, и, кроме того, где по меньшей мере одна AA является мутантной аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления, r равно 1. В некоторых вариантах осуществления, s равно 1. В некоторых вариантах осуществления, r равно 1 и s равно 1. В некоторых вариантах осуществления, r равно 0. В некоторых вариантах осуществления, s равно 0. В некоторых вариантах осуществления, r равно 0 и s равно 0.

В некоторых вариантах осуществления, A_r и/или A_s являются не полипептидным линкером. В некоторых вариантах осуществления, A_r и/или A_s являются химическим линкером. В некоторых вариантах осуществления, A_r и/или A_s содержат не природную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления, A_r и/или A_s не содержат аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления, A_r и/или A_s не содержат природную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления, A_r и/или A_s содержат связь, отличную от пептидной связи. В некоторых вариантах осуществления, A_r и/или A_s содержат дисульфидную связь. В некоторых вариантах осуществления, A_r и/или A_s являются разными. В некоторых вариантах осуществления, A_r и/или A_s являются одинаковыми.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит гидрофильный хвост. В некоторых вариантах осуществления, Y_n-B_t-A_r и/или A_s-C_u-Z_p повышает растворимость полипептида по сравнению с соответствующим пептидом, который не содержит Y_n-B_t-A_r и/или A_s-Z_p. В некоторых вариантах осуществления, каждый X из X_m является природной аминокислотой.

В некоторых вариантах осуществления, эпитоп высвобождается из Y_n-B_t-A_r и/или A_s-C_u-Z_p, если полипептид процессируется APC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется на A_r и/или A_s. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется с более высокой скоростью, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида той же длины, который содержит X_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m; и/или полипептид расщепляется с более высокой скоростью, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида той же длины, который содержит X_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется с более высокой скоростью, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида такой же длины, который содержит B_t-X_m, где t равно по меньшей мере единице, и r из переменной A_r в Формуле (I) равно 0; и/или где полипептид расщепляется с более высокой скоростью, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида такой же длины, который содержит X_m-C_u, где u равно по меньшей мере одному и s из переменной A_s в Формуле (I) равно 0.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется на A_r с более высокой скоростью, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида такой же длины, который содержит X_mи по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m; и/или полипептид расщепляется на A_s с более высокой скоростью, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида такой же длины, который содержит X_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m.

В некоторых вариантах осуществления презентация эпитопа с помощью APC усиливается, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с презентацией эпитопа соответствующего полипептида той же длины, который содержит X_mи по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m; и/или презентация эпитопа с помощью APC усиливается, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с презентацией эпитопа соответствующего полипептида той же длины, который содержит X_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m.

В некоторых вариантах осуществления, презентация эпитопа с помощью APC усиливается, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с презентацией эпитопа соответствующего полипептида той же длины, который содержит B_t-X_m, где t равно по меньшей мере единице, и r из переменной A_r в формуле (I) равен 0; и/или где презентация эпитопа с помощью APC усиливается, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с презентацией эпитопа соответствующего полипептида той же длины, который содержит X_m-C_u, где u равен по меньшей мере единице и s из переменной A_sв формуле (I) равен 0.

В некоторых вариантах осуществления, APC презентирует эпитоп к иммунной клетке. В некоторых вариантах осуществления, APC презентирует эпитоп к фагоцитарной клетке. В некоторых вариантах осуществления, APC презентирует эпитоп к дендритной клетке, макрофагу, тучной клетке, нейтрофилу или моноциту. В некоторых вариантах осуществления, APC презентирует эпитоп, предпочтительно или конкретно, к иммунной клетке, фагоцитарной клетке, дендритной клетке, макрофагу, тучной клетке, нейтрофилу или моноциту.

В некоторых вариантах осуществления, иммуногенность повышается, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с иммуногенностью соответствующего полипептида той же длины, который содержит X_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m; и/или иммуногенность повышается, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с иммуногенностью соответствующего полипептида той же длины, который содержит X_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m.

В некоторых вариантах осуществления, иммуногенность увеличивается, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с иммуногенностью соответствующего полипептида такой же длины, который содержит B_t-X_m, где t равно по меньшей мере единице и r из переменной A_rв Формуле (I) равно 0; и/или где иммуногенность увеличивается, если p является целым числом от 1 до 1000 по сравнению с иммуногенностью соответствующего полипептида такой же длины, который содержит X_m-C_u, где u равно по меньшей мере единице, и s из переменной A_sв Формуле (I) равно 0.

В некоторых вариантах осуществления, противоопухолевая активность увеличивается, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с противоопухолевой активностью соответствующего полипептида такой же длины, который содержит X_mи по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты. непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m; и/или противоопухолевая активность увеличивается, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с противоопухолевой активностью соответствующего полипептида такой же длины, который содержит X_mи по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую непосредственно последовательностью нуклеиновой кислоты ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m.

В некоторых вариантах осуществления, противоопухолевая активность увеличивается, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с противоопухолевой активностью соответствующего полипептида такой же длины, который содержит B_t-X_m, где t равно по меньшей мере единице, и r из переменной A_r в формуле (I) равно 0; и/или где противоопухолевая активность увеличивается, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с противоопухолевой активностью соответствующего полипептида такой же длины, который содержит X_m-C_u, где u равно по меньшей мере единице, и s из переменной A_s в формуле (I) равно 0.

В некоторых вариантах осуществления Y_nи/или Z_pсодержат последовательность, выбранную из группы, состоящей из поли-Lys (полиK) и поли-Arg (полиR). В некоторых вариантах осуществления, Y_nи/или Z_pсодержат последовательность, выбранную из группы, состоящей из полиK-AA-AA и полиR-AA-AA, где каждая AA является аминокислотой, ее аналогом или производным. В некоторых вариантах осуществления, полиK содержит поли-L-Lys. В некоторых вариантах осуществления, полиR содержит поли-L-Arg. В некоторых вариантах осуществления, полиK или полиR содержит по меньшей мере три или четыре непрерывных лизиновых (SEQ ID NO: 1) или аргининовых (SEQ ID NO: 2) остатка, соответственно. В некоторых вариантах осуществления, A_rи/или A_sвыбирают из группы, состоящей из дисульфида; п-аминобензилоксикарбонила (РАВС); и AA-AA-PABC, где каждая AA является аминокислотой, ее аналогом или производным. В некоторых вариантах осуществления, AA-AA-PABC выбран из группы, состоящей из Ala-Lys-PABC, Val-Cit-PABC и Phe-Lys-PABC.

В некоторых вариантах осуществления, A_rи/или A_sявляется

Формула (II).

В некоторых вариантах осуществления, A_rи/или A_sявляются

Формула (III), или

Формула (IV),

где,

R¹ и R² независимо являются H или (C₁-C₆) алкилом; j равно 1 или 2; G¹является H или COOH; и i равно 1, 2, 3, 4 или 5.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован перед расщеплением. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован по лизиновому остатку. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не расщепляется перед процессингом APC перед интернализацией APC у субъекта. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не расщепляется в крови у субъекта перед процессингом APC или перед интернализацией APC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не расщепляется протеазой в крови. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не расщепляется плазмином, калликреином плазмы, тканевым калликреином, тромбином или фактором свертывания крови. В некоторых вариантах осуществления, полипептид стабилен в плазме человека. В некоторых вариантах осуществления, полипептид имеет период полужизни в плазме человека от 1 часа до 5 дней. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется в лизосоме, эндолизосоме, эндосоме или эндоплазматическом ретикулуме (ER). В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется аминопептидазой. В некоторых вариантах осуществления, аминопептидазой является лейцил-цистинил-аминопептидаза (IRAP) или аминопептидаза эндоплазматического ретикулума (ERAP). В некоторых вариантах осуществления, полипептид процессируется трипсиноподобным доменом протеасомы и/или иммунопротеасомы. В некоторых вариантах осуществления, трипсиноподобный домен содержит трипсиноподобную активность, химотрипсинопободную активность, или активность пептидилглутамилпептидгидролазы (PGPH). В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется протеазой. В некоторых вариантах осуществления, протеазой является трипсиноподобная протеаза, химотрипсиноподобная протеаза или пептидилглутамилпептидгидролаза (PGPH). В некоторых вариантах осуществления, протеаза выбрана из группы, состоящей из аспарагинпептидлиазы, аспарагиновой протеазы, цистеинпротеазы, глутаминовой протеазы, металлопротеазы, серинпротеазы и треонинпротеазы. В некоторых вариантах осуществления, протеазой является цистеинпротеаза, выбранная из группы, состоящей из кальпаина, каспазы, катепсина B, катепсина C, катепсина F, катепсина H, катепсина K, катепсина L1, катепсина L2, катепсина O, катепсина S, катепсина W и катепсина Z.

В некоторых вариантах осуществления, субъектом является млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления, субъектом является человек.

В некоторых вариантах осуществления, эпитоп связывается с HLA MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп связывается с HLA MHC класса I со стабильностью от 10 минут до 24 часов. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп связывается с HLA MHC класса I с аффинностью от 0,1 до 2000 нМ. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп связывается с HLA MHC класса II. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп связывается с HLA MHC класса II со стабильностью от 10 минут до 24 часов. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп связывается с HLA MHC класса II с аффинностью от 0,1 нМ до 2000 нМ, от 1 нМ до 1000 нМ, от 10 нМ до 500 нМ или менее 1000 нМ. В некоторых вариантах осуществления, n является целым числом от 1 до 20 или от 5 до 12. В некоторых вариантах осуществления, p является целым числом от 1 до 20 или от 5 до 12. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп содержит опухолеспецифический эпитоп.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит по меньшей мере два полипептида, где два или более из по меньшей мере двух полипептидов имеют одинаковую формулу Y_n-B_t-A_r-X_m-A_s-C_u-Z_p. В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит по меньшей мере две полипептидных молекулы. В некоторых вариантах осуществления, X_m двух или более из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления, Y_nдвух или более из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления, Z_p двух или более из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления, A_r и/или A_s двух или более из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул являются разными. В некоторых вариантах осуществления, r=0 для первого из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул, и r=1 для второго из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул. В некоторых вариантах осуществления, s=0 для первого из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул, и s=1 для второго из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул. В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более полипептидов или полипептидных молекул.

В некоторых вариантах осуществления, эпитоп связывается с белком, кодируемым аллелем HLA с аффинностью менее 10 мкМ, менее 1 мкМ, менее 500 нМ, менее 400 нМ, менее 300 нМ, менее 250 нМ, менее более 200 нМ, менее 150 нМ, менее 100 нМ или менее 50 нМ. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, со стабильностью более 24 часов, более 12 часов, более 9 часов, более 6 часов, более 5 часов, более 4 часов, более 3 часов, более 2 часов, более 1 часа, более 45 минут, более 30 минут, более 15 минут или более 10 минут. В некоторых вариантах осуществления, аллель HLA выбран из группы, состоящей из аллеля HLA-A02:01, аллеля HLA-A03:01, аллеля HLA-A11:01, аллеля HLA-A03:02, аллеля HLA-A30:01, аллеля HLA-A31:01, аллеля HLA-A33:01, аллеля HLA-A33:03, аллеля HLA-A68:01, аллеля HLA-A74:01 и/или HLA-C08:02 аллеля и любой их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления, эпитоп содержит аминокислотную последовательность GADGVGKSAL (SEQ ID NO: 4), GACGVGKSAL (SEQ ID NO: 5), GAVGVGKSAL (SEQ ID NO: 6), GADGVGKSA (SEQ ID NO: 7), GACGVGKSA (SEQ ID NO: 8), GAVGVGKSA (SEQ ID NO: 9), KLVVVGACGV (SEQ ID NO: 10), FLVVVGACGL (SEQ ID NO: 11), FMVVVGACGI (SEQ ID NO: 12), FLVVVGACGI (SEQ ID NO: 13), FMVVVGACGV (SEQ ID NO: 14), FLVVVGACGV (SEQ ID NO: 15), MLVVVGACGV (SEQ ID NO: 16), FMVVVGACGL (SEQ ID NO: 17), YLVVVGACGV (SEQ ID NO: 18), KMVVVGACGV (SEQ ID NO: 19), YMVVVGACGV (SEQ ID NO: 20), MMVVVGACGV (SEQ ID NO: 21), DTAGHEEY (SEQ ID NO: 22), TAGHEEYSAM (SEQ ID NO: 23), DILDTAGHE (SEQ ID NO: 24), DILDTAGH (SEQ ID NO: 25), ILDTAGHEE (SEQ ID NO: 26), ILDTAGHE (SEQ ID NO: 27), DILDTAGHEEY (SEQ ID NO: 28), DTAGHEEYS (SEQ ID NO: 29), LLDILDTAGH (SEQ ID NO: 30), DILDTAGRE (SEQ ID NO: 31), DILDTAGR (SEQ ID NO: 32), ILDTAGREE (SEQ ID NO: 33), ILDTAGRE (SEQ ID NO: 34), CLLDILDTAGR (SEQ ID NO: 35), TAGREEYSAM (SEQ ID NO: 36), REEYSAMRD (SEQ ID NO: 37), DTAGKEEYSAM (SEQ ID NO: 38), CLLDILDTAGK (SEQ ID NO: 39), DTAGKEEY (SEQ ID NO: 40), LLDILDTAGK (SEQ ID NO: 41), ILDTAGKE (SEQ ID NO: 42), ILDTAGKEE (SEQ ID NO: 43), DTAGLEEY (SEQ ID NO: 44), ILDTAGLE (SEQ ID NO: 45), DILDTAGL (SEQ ID NO: 46), ILDTAGLEE (SEQ ID NO: 47), GLEEYSAMRDQY (SEQ ID NO: 48), LLDILDTAGLE (SEQ ID NO: 49), LDILDTAGL (SEQ ID NO: 50), DILDTAGLE (SEQ ID NO: 51), DILDTAGLEEY (SEQ ID NO: 52), AGVGKSAL (SEQ ID NO: 53), GAAGVGKSAL (SEQ ID NO: 54), AAGVGKSAL (SEQ ID NO: 55), CGVGKSAL (SEQ ID NO: 56), ACGVGKSAL (SEQ ID NO: 57), DGVGKSAL (SEQ ID NO: 58), ADGVGKSAL (SEQ ID NO: 59), DGVGKSALTI (SEQ ID NO: 60), GARGVGKSA (SEQ ID NO: 62), KLVVVGARGV (SEQ ID NO: 62), VVVGARGV (SEQ ID NO: 63), SGVGKSAL (SEQ ID NO: 64), VVVGASGVGK (SEQ ID NO: 65), GASGVGKSAL (SEQ ID NO: 66), VGVGKSAL (SEQ ID NO: 67), VVVGAGCVGK (SEQ ID NO: 68), KLVVVGAGC (SEQ ID NO: 69), GDVGKSAL (SEQ ID NO: 70), DVGKSALTI (SEQ ID NO: 71), VVVGAGDVGK (SEQ ID NO: 72), TAGKEEYSAM (SEQ ID NO: 73), DTAGHEEYSAM (SEQ ID NO: 74), TAGHEEYSA (SEQ ID NO: 75), DTAGREEYSAM (SEQ ID NO: 76), TAGKEEYSA (SEQ ID NO: 77), AAGVGKSA (SEQ ID NO: 78), AGCVGKSAL (SEQ ID NO: 79), AGDVGKSAL (SEQ ID NO: 80), AGKEEYSAMR (SEQ ID NO: 81), AGVGKSALTI (SEQ ID NO: 82), ARGVGKSAL (SEQ ID NO: 83), ASGVGKSA (SEQ ID NO: 84), ASGVGKSAL (SEQ ID NO: 85), AVGVGKSA (SEQ ID NO: 86), CVGKSALTI (SEQ ID NO: 87), DILDTAGK (SEQ ID NO: 88), DILDTAGREEY (SEQ ID NO: 89), DTAGHEEYSAMR (SEQ ID NO: 90), DTAGKEEYS (SEQ ID NO: 91), DTAGKEEYSAMR (SEQ ID NO: 92), DTAGLEEYS (SEQ ID NO: 93), DTAGLEEYSA (SEQ ID NO: 94), DTAGLEEYSAMR (SEQ ID NO: 95), DTAGREEYS (SEQ ID NO: 96), DTAGREEYSAMR (SEQ ID NO: 97), GAAGVGKSA (SEQ ID NO: 98), GACGVGKSA (SEQ ID NO: 8), GACGVGKSAL (SEQ ID NO: 5), GADGVGKS (SEQ ID NO: 99), GAGDVGKSA (SEQ ID NO: 100), GAGDVGKSAL (SEQ ID NO: 101), GASGVGKSA (SEQ ID NO: 102), GCVGKSAL (SEQ ID NO: 103), GCVGKSALTI (SEQ ID NO: 104), GHEEYSAM (SEQ ID NO: 105), GKEEYSAM (SEQ ID NO: 106), GLEEYSAMR (SEQ ID NO: 107), GREEYSAM (SEQ ID NO: 108), GREEYSAMR (SEQ ID NO: 109), HEEYSAMRD (SEQ ID NO: 110), KEEYSAMRD (SEQ ID NO: 111), KLVVVGASG (SEQ ID NO: 112), LDILDTAGR (SEQ ID NO: 113), LEEYSAMRD (SEQ ID NO: 114), LVVVGARGV (SEQ ID NO: 115), LVVVGASGV (SEQ ID NO: 116), REEYSAMRDQY (SEQ ID NO: 117), RGVGKSAL (SEQ ID NO: 118), TAGLEEYSA (SEQ ID NO: 119), TEYKLVVVGAA (SEQ ID NO: 120), VGAAGVGKSA (SEQ ID NO: 121), VGADGVGK (SEQ ID NO: 122), VGASGVGKSA (SEQ ID NO: 123), VGVGKSALTI (SEQ ID NO: 124), VVVGAAGV (SEQ ID NO: 125), VVVGAVGV (SEQ ID NO: 126), YKLVVVGAC (SEQ ID NO: 127), YKLVVVGAD (SEQ ID NO: 128), YKLVVVGAR (SEQ ID NO: 129) или DILDTAGKE (SEQ ID NO: 130).

В некоторых вариантах осуществления, Y_nсодержит аминокислотную последовательность IDIIMKIRNA (SEQ ID NO: 131), FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFIIFFIFFWMC (SEQ ID NO: 132), FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFAAFWFW (SEQ ID NO: 133), IFFIFFIIFFFFFFFFFFFFIIIIIIIWEC (SEQ ID NO: 134), FIFFFIIFFFFFIFFFFFIFIIIIIIFWEC (SEQ ID NO: 135), TEY, TEYKLV (SEQ ID NO: 136), WQAGILAR (SEQ ID NO: 137), HSYTTAE (SEQ ID NO: 138), PLTEEKIK (SEQ ID NO: 139), GALHFKPGSR (SEQ ID NO: 140), RRANKDATAE (SEQ ID NO: 141), KAFISHEEKR (SEQ ID NO: 142), TDLSSRFSKS (SEQ ID NO: 143), FDLGGGTFDV (SEQ ID NO: 144), CLLLHYSVSK (SEQ ID NO: 145), KKKKIIMKIRNA (SEQ ID NO: 146) или MTEYKLVVV (SEQ ID NO: 147). В некоторых вариантах осуществления, Z_рсодержит аминокислотную последовательность KKNKKDDI (SEQ ID NO: 148), KKNKKDDIKD (SEQ ID NO: 149), AGNDDDDDDDDDDDDDDDDDKKDKDDDDDD (SEQ ID NO: 150), AGNKKKKKKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 151), AGRDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD (SEQ ID NO: 152), SALTI (SEQ ID NO: 153), SALTIQL (SEQ ID NO: 154), GKSALTIQL (SEQ ID NO: 155), GKSALTI (SEQ ID NO: 156), QGQNLKYQ (SEQ ID NO: 157), ILGVLLLI (SEQ ID NO: 158), EKEGKISK (SEQ ID NO: 159), AASDFIFLVT (SEQ ID NO: 160), KELKQVASPF (SEQ ID NO: 161), KKKLINEKKE (SEQ ID NO: 162), KKCDISLQFF (SEQ ID NO: 163), KSTAGDTHLG (SEQ ID NO: 164), ATFYVAVTVP (SEQ ID NO: 165), LTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDG (SEQ ID NO: 166) или TIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGE (SEQ ID NO: 167).

В некоторых вариантах осуществления эпитопом не является эпитоп RAS. В некоторых вариантах осуществления, полипептидом не является KKKKKPKRDGYMFLKAESKIMFAT (SEQ ID NO: 168), KKKKYMFLKAESKIMFATLQRSS (SEQ ID NO: 169), KKKKKAESKIMFATLQRSSLWCL (SEQ ID NO: 170), KKKKKIMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 171) или KKKKMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 172).

В некоторых вариантах осуществления, эпитопом является эпитоп GATA3. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп GATA3 содержит аминокислотную последовательность MLTGPPARV (SEQ ID NO: 173), SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 174), VLPEPHLAL (SEQ ID NO: 175), KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 176), KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 177), ESKIMFATL (SEQ ID NO: 178), KRDGYMFL (SEQ ID NO: 179), PAVPFDLHF (SEQ ID NO: 180), AESKIMFATL (SEQ ID NO: 181), FATLQRSSL (SEQ ID NO: 182), ARVPAVPFD (SEQ ID NO: 183), IMKPKRDGY (SEQ ID NO: 184), DGYMFLKA (SEQ ID NO: 185), MFLKAESKIMF (SEQ ID NO: 186), LTGPPARV (SEQ ID NO: 187), ARVPAVPF (SEQ ID NO: 188), SMLTGPPAR (SEQ ID NO: 189), RVPAVPFDL (SEQ ID NO: 190) или LTGPPARVP (SEQ ID NO: 191).

В некоторых аспектах, изобретение относится кизобретение относится к клетка, содержащая описанный в настоящем изобретении полипептид. В некоторых вариантах осуществления, клеткой является антигенпрезентирующая клетка. В некоторых вариантах осуществления, клеткой является дендритная клетка. В некоторых вариантах осуществления, клеткой является зрелая антигенпрезентирующая клетка.

В некоторых аспектах, изобретение относится к способу расщепления полипептида, включающему контакт описанного в настоящем изобретении полипептида с антигенпрезентирующей клеткой (APC). В некоторых вариантах осуществления, способ выполняют in vivo. В некоторых вариантах осуществления, способ выполняют ex vivo.

В некоторых аспектах, изобретение относится к способу получения полипептида, включающему связывание Y_n-A_r и/или A_s-Z_p с последовательностью, содержащей последовательность эпитопа, где последовательность эпитопа презентирована MHC класса I или МНС класса II антигенпрезентирующей клетки (APC); где (i) каждый Y независимо является аминокислотой, ее аналогом или производным, и где Y_n не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, и n является целым числом от 0 до 1000; (ii) каждый Z независимо является аминокислотой, ее аналогом или производным, и где Z_p не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, и p является целым числом от 0 до 1000; и (iii) A_r является линкером и A_s является линкером, где по меньшей мере один из r и s равен 1; и где (а) полипептид не состоит из четырех различных эпитопов, презентированных МНС класса I; (b) полипептид содержит по меньшей мере две разные полипептидные молекулы; (c) эпитоп содержит по меньшей мере одну мутантную аминокислоту; и/или (d) Y_n и/или Z_p отщепляются от эпитопа, если полипептид процессируется APC.

В некоторых аспектах, изобретение относится к способу получения полипептида, включающему связывание Y_n с B_t-X_m и/или Z_pс X_m -C_u, где X_m является последовательностью эпитопа, презентированной MHC класса I или MHC класса II антигенпрезентирующей клетки (APC); и где (i) каждый B независимо является аминокислотой, кодированной последовательностью нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая находится непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m, и где t является целым числом от 0 до 1000; (ii) где каждый C независимо является аминокислотой, кодированной последовательностью нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая находится непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m, и где u является целым числом от 0 до 1000; (iii) каждый Y независимо является аминокислотой, ее аналогом или производным, и где Y_n не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует B_t-X_m, и где n является целым числом от 0 до 1000; и (iv) каждый Z независимо является аминокислотой, ее аналогом или производным, и где Z_p не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно после последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m-C_u, и где p является целым числом от 0 до 1000; и дополнительно, где (а) полипептид не состоит из четырех разных эпитопов, презентированных MHC класса I; (b) полипептид содержит по меньшей мере две разные полипептидные молекулы; (c) эпитоп содержит по меньшей мере одну мутантную аминокислоту; и/или (d) Y_n-B_t и/или C_u-Z_p отщепляются от эпитопа, если полипептид процессируется APC.

В некоторых вариантах осуществления, если n равно 0, p является целым числом от 1 до 1000, а если p равно 0, n является целым числом от 1 до 1000. В некоторых вариантах осуществления, каждый X независимо является аминокислотой в пептидной последовательности, содержащей любую непрерывную аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, и где (а) MHC является MHC класса I и m является целым числом от 8 до 12, или (b) MHC является MHC класса II и m является целым числом от 9 до 25.

В некоторых аспектах, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид, описанный в настоящем изобретении, и фармацевтически приемлемый эксципиент. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция дополнительно содержит иммуномодулирующий агент или адъювант. В некоторых вариантах осуществления, иммуномодулирующий агент или адъювант выбраны из группы, состоящей из поли-ICLC, 1018 ISS, солей алюминия, ампливакса, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, ARNAX, агонистов STING, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Имиквимода, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, монофосфориллипида A, Монтанида IMS 1312, Монтанида ISA 206, Монтанида ISA 50V, Монтанида ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel®, векторной системы, микрочастиц PLGA, резиквимода, SRL172, виросом и других вирусоподобных частиц, YF-17D, ловушки VEGF, R848, бета-глюкана, Pam2Cys, Pam3Cys, Pam3CSK4 и стимулона Aquila QS21. В некоторых вариантах осуществления, иммуномодулирующий агент или адъювант содержит поли-ICLC. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтической композицией является вакцинная композиция. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция является водной или жидкой.

В некоторых вариантах осуществления, эпитоп присутствует в фармацевтической композиции в количестве от 1 нг до 10 мг или от 5 мкг до 1,5 мг. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДМСО. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтически приемлемый эксципиент содержит воду. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция содержит pH модификатор, присутствующий в концентрации менее 1 мМ или более 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, pH модификатором является дикарбоксилат или трикарбоксилат. В некоторых вариантах осуществления, pH модификатором является дикарбоксилат янтарной кислоты или дисукцинат. В некоторых вариантах осуществления, pH модификатором является трикарбоксилат лимонной кислоты или трицитрат. В некоторых вариантах осуществления, pH модификатором является сукцинат динатрия. В некоторых вариантах осуществления, дикарбоксилат янтарной кислоты или дисукцинат присутствует в фармацевтической композиции в концентрации 0,1 мМ - 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, дикарбоксилат янтарной кислоты или дисукцинат присутствует в фармацевтической композиции в концентрации 1 мМ - 5 мМ. В некоторых вариантах осуществления, иммунный ответ на эпитоп усиливается при введении субъекту.

В некоторых аспектах, изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, включающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, описанной в настоящем изобретении, субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления, заболеванием или состоянием является рак. В некоторых вариантах осуществления, рак выбран из группы, состоящей из рака легких, немелкоклеточного рака легких, рака поджелудочной железы, колоректального рака, рака матки и рака печени. В некоторых вариантах осуществления, введение включает внутрикожную инъекцию, интраназальное применение спрея, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, внутривенную инъекцию, пероральное введение или подкожную инъекцию.

В некоторых аспектах, изобретение относится к способу профилактики субъекта, включающему контакт клетки субъекта с полипептидом, клеткой или фармацевтической композицией, описанными в настоящем изобретении.

В некоторых аспектах, изобретение относится к способу, включающему идентификацию эпитопа, экспрессируемого опухолевыми клетками субъекта, и получение полипептида, содержащего эпитоп, где полипептид имеет структуру формулы (I),

Y_n-B_t-A_r-X_m-A_s-C_u-Z_p

Формула (I),

или его фармацевтически приемлемую соль,

и где

(а) MHC является MHC класса I и m является целым числом от 8 до 12, или

(b) MHC является MHC класса II и m является целым числом от 9 до 25;

(ii) где каждый Y независимо является аминокислотой, ее аналогом или производным, и где:

(В) если переменная r из A_r в Формуле (I) равна 1, и переменная t из B_t в Формуле (I) равна 0, Y_n не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта. которая кодирует X_m, или

где n является целым числом от 0 до 1000;

(iii) где каждый Z независимо является аминокислотой, ее аналогом или производным, и где:

(В) если переменная s из A_s в формуле (I) равна 1, и переменная u из C_u в формуле (I) равна 0, Z_p не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта. которая кодирует X_m, или

(С) если переменная s из A_s в формуле (I) равна 1, и переменная u из C_u в формуле (I) равна 1 или более, Z_p не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует C_u; и

где р является целым числом от 0 до 1000;

и, кроме того,

если n равно 0, p является целым числом от 1 до 1000; и

если p равно 0, n является целым числом от 1 до 1000;

(iv) где A_r является линкером, и r равен 0 или 1;

(v) где A_s является линкером и s равно 0 или 1;

и где t является целым числом от 0 до 1000; и

и где u является целым числом от 0 до 1000;

и, кроме того,

(а) полипептид не состоит из четырех разных эпитопов, презентированных MHC класса I;

(b) полипептид содержит по меньшей мере две разные полипептидные молекулы;

(d) Y_n и/или Z_p отщепляются от эпитопа, если полипептид процессируется APC.

В некоторых вариантах осуществления, идентификация включает выбор множества последовательностей нуклеиновых кислот из пула последовательностей нуклеиновых кислот, секвенированных из опухолевых клеток субъекта, которые кодируют множество кандидатных пептидных последовательностей, содержащих одну или несколько различных мутаций, не присутствующих в пуле секвенированных последовательностей нуклеиновых кислот из не опухолевых клеток субъекта, где пул последовательностей нуклеиновых кислот, секвенированных из опухолевых клеток субъекта, и пул последовательностей нуклеиновых кислот, секвенированных из не опухолевых клеток субъекта, секвенированы путем полногеномного секвенирования или полноэкзомного секвенирования. В некоторых вариантах осуществления, идентификация дополнительно включает прогнозирование или измерение того, какие кандидатные пептидные последовательности из множества кандидатных пептидных последовательностей образуют комплекс с белком, кодируемым аллелем HLA того же субъекта, с помощью анализа связывания пептида HLA. В некоторых вариантах осуществления, идентификация дополнительно включает выбор множества выбранных опухолеспецифических пептидов или одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих множество выбранных опухолеспецифических пептидов, из возможных пептидных последовательностей на основе анализа связывания HLA пептида.

В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает введение полипептида субъекту. В некоторых вариантах осуществления, введение включает внутрикожную инъекцию, интраназальное применение спрея, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, внутривенную инъекцию, пероральное введение или подкожную инъекцию. В некоторых вариантах осуществления, у субъекта вызывают иммунный ответ. В некоторых вариантах осуществления, эпитопом, экспрессируемым опухолевыми клетками субъекта, является неоантиген, опухолеассоциированный антиген, мутированный опухолеассоциированный антиген, и/или где экспрессия эпитопа выше в опухолевых клетках субъекта по сравнению с экспрессией эпитопа в нормальных клетках субъекта.

Изобретение относится к полипептиду, содержащему эпитоп, презентируемый MHC класса I или MHC класса II антигенпрезентирующей клетки (APC), где полипептид имеет структуру формулы (I):

Y_n-B_t-A_r-X_m-A_s-C_u-Z_p

Формула (I),

или его фармацевтически приемлемой соли, где X_m является эпитопом, где каждый X независимо является аминокислотой из непрерывной аминокислотной последовательности, кодированной последовательностью нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, и где (а) MHC является MHC класса I и m является целым числом от 8 до 12, или (b) MHC является MHC класса II и m является целым числом от 9 до 25; где каждый Y независимо является аминокислотой, ее аналогом или производным, и где: если переменная r из A_rв Формуле (I) равна 0, Y_n не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геном субъекта, которая кодирует B_t-A_r-X_m, если переменная r из A_r в Формуле (I) равна 1, и переменная t из B_tв Формуле (I) равна 0, Y_n не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m, или если переменная r из A_r в Формуле (I) равна 1, и переменная t из B_t в Формуле (I) равна 1 или более, Y_n не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует B_t; и дополнительно где n является целым числом от 0 до 1000; где каждый Z независимо является аминокислотой, аналогом или производным, и где: если переменная s из A_s в Формуле (I) равна 0, Z_p не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m-A_s-C_u, если переменная s из A_s в Формуле (I) равна 1, и переменная u из C_u в Формуле (I) равна 0, Z_p не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно после последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m, или если переменная s из A_s в формуле (I) равна 1, и переменная u из C_uв формуле (I) равна 1 или более, Z_p не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует C_u; и, кроме того, p является целым числом от 0 до 1000; и, кроме того, если n равно 0, p является целым числом от 1 до 1000; и если p равно 0, n является целым числом от 1 до 1000; где A_r является линкером, и r равно 0 или 1; где A_s является линкером, и s равно 0 или 1; где каждый B независимо является аминокислотой, кодированной последовательностью нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая находится непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m, и где t является целым числом от 0 до 1000; и где каждый C независимо является аминокислотой, кодированной последовательностью нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая находится непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m, и где u является целым числом от 0 до 1000; и, кроме того, где полипептид не состоит из четырех разных эпитопов, презентированных MHC класса I; полипептид содержит по меньшей мере две разные полипептидных молекулы; эпитоп содержит по меньшей мере одну мутантную аминокислоту; и/или Y_n и/или Z_p отщепляются от эпитопа, если полипептид процессируется APC.

В некоторых вариантах осуществления, эпитоп представлен MHC класса II, и m является целым числом от 9 до 25.

В некоторых вариантах осуществления Y_n-B_t-A_r и/или A_s-C_u-Z_p повышает растворимость полипептида по сравнению с соответствующим пептидом, который не содержит Y_n-B_t-A_r и/или A_s-C_u-Z_p. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп выделяют из Y_n-B_t-A_r и/или A_s-C_u-Z_p, если полипептид процессируется APC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется с более высокой скоростью, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида той же длины, который содержит X_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m; и/или где полипептид расщепляется с более высокой скоростью, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида той же длины, который содержит X_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m. В некоторых вариантах осуществления, презентация эпитопа APC усиливается, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с презентацией эпитопа соответствующего полипептида той же длины, который содержит X_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m; и/или где презентация эпитопа с помощью APC усиливается, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с презентацией эпитопа соответствующего полипептида той же длины, который содержит X_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m. В некоторых вариантах осуществления, APC презентирует эпитоп к иммунной клетке.

В некоторых вариантах осуществления, иммуногенность повышается, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с иммуногенностью соответствующего полипептида той же длины, который содержит X_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m; и/или где иммуногенность повышается, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с иммуногенностью соответствующего полипептида той же длины, который содержит X_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m.

В некоторых вариантах осуществления, противоопухолевая активность увеличивается, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с противоопухолевой активностью соответствующего полипептида такой же длины, который содержит X_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты. непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m; и/или где противоопухолевая активность увеличивается, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с противоопухолевой активностью соответствующего полипептида такой же длины, который содержит Х_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты. непосредственно после последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m.

В некоторых вариантах осуществления, Y_n и/или Z_p содержат последовательность, выбранную из группы, состоящей из лизина (Lys), поли-Lys (полиK) и поли-Arg (полиR). В некоторых вариантах осуществления, полиK содержит поли-L-Lys. В некоторых вариантах осуществления, полиR содержит поли-L-Arg. В некоторых вариантах осуществления, полиK или полиR содержит по меньшей мере два, три или четыре непрерывных лизиновых (SEQ ID NO: 1) или аргининовых (SEQ ID NO: 2) остатка, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления, эпитоп связывается с HLA MHC класса II. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп связывается с HLA MHC класса II со стабильностью от 10 минут до 24 часов. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп связывается с HLA MHC класса II с аффинностью от 0,1 до 2000 нМ, от 1 до 1000 нМ, от 10 до 500 нМ или менее 1000 нМ.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид не расщепляется перед процессингом APC или перед интернализацией APC у субъекта. В некоторых вариантах осуществления, полипептид стабилен в плазме человека. В некоторых вариантах осуществления, полипептид имеет период полувыведения от 1 часа до 5 дней в плазме человека. В некоторых вариантах осуществления, субъектом является человек.

В некоторых вариантах осуществления, эпитоп связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, с аффинностью менее 10 мкМ, менее 1 мкМ, менее 500 нМ, менее 400 нМ, менее 300 нМ, менее 250 нМ, менее более 200 нМ, менее 150 нМ, менее 100 нМ или менее 50 нМ. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, со стабильностью более 24 часов, более 12 часов, более 9 часов, более 6 часов, более 5 часов, более 4 часов, более 3 часов, более 2 часов, более 1 часа, более 45 минут, более 30 минут, более 15 минут или более 10 минут. В некоторых вариантах осуществления, аллель HLA выбран из группы, состоящей из аллеля HLA-A02:01, аллеля HLA-A03:01, аллеля HLA-A11:01, аллеля HLA-A03:02, аллеля HLA-A30:01, аллеля HLA-A31:01, аллеля HLA-A33:01, аллеля HLA-A33:03, аллеля HLA-A68:01, аллеля HLA-A74:01 и/или аллеля HLA-C08:02 и любых их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп содержит опухолеспецифический эпитоп. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп содержит по меньшей мере одну мутантную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна мутантная аминокислота кодируется вставкой, делецией, сдвигом рамки считывания, неоORF или точечной мутацией в последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта.

В некоторых вариантах осуществления, эпитопом является эпитоп RAS. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп содержит мутантную пептидную последовательность RAS, которая содержит по меньшей мере 8 непрерывных аминокислот мутантного белка RAS, содержащего мутацию G12, G13 или Q61 и мутацию G12, G13 или Q61. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере 8 непрерывных аминокислот мутантного белка RAS, содержащего мутацию в G12, G13 или Q61, содержат мутацию G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K или Q61R. В некоторых вариантах осуществления, мутация G12, G13 или Q61 содержит мутацию G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K или Q61R. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп РАН содержит аминокислотную последовательность VVVGAAGVGK (SEQ ID NO: 192), VVVGAAGVG (SEQ ID NO: 193), VVVGAAGV (SEQ ID NO: 125), VVGAAGVGK (SEQ ID NO: 194), VVGAAGVG (SEQ ID NO: 195), VGAAGVGK (SEQ ID NO: 196), VVVGACGVGK (SEQ ID NO: 197), VVVGACGVG (SEQ ID NO: 198), VVVGACGV (SEQ ID NO: 199), VVGACGVGK (SEQ ID NO: 200), VVGACGVG (SEQ ID NO: 201), VGACGVGK (SEQ ID NO: 202), VVVGADGVGK (SEQ ID NO: 203), VVVGADGVG (SEQ ID NO: 204), VVVGADGV (SEQ ID NO: 205), VVGADGVGK (SEQ ID NO: 206), VVGADGVG (SEQ ID NO: 207), VGADGVGK (SEQ ID NO: 122), VVVGARGVGK (SEQ ID NO: 208), VVVGARGVG (SEQ ID NO: 209), VVVGARGV (SEQ ID NO: 63), VVGARGVGK (SEQ ID NO: 210), VVGARGVG (SEQ ID NO: 211), VGARGVGK (SEQ ID NO: 212), VVVGASGVGK (SEQ ID NO: 65), VVVGASGVG (SEQ ID NO: 213), VVVGASGV (SEQ ID NO: 214), VVGASGVGK (SEQ ID NO: 215), VVGASGVG (SEQ ID NO: 216), VGASGVGK (SEQ ID NO: 217), VVVGAVGVGK (SEQ ID NO: 218), VVVGAVGVG (SEQ ID NO: 219), VVVGAVGV (SEQ ID NO: 126), VVGAVGVGK (SEQ ID NO: 220), VVGAVGVG (SEQ ID NO: 221) или VGAVGVGK (SEQ ID NO: 222). В некоторых вариантах осуществления, Y_nсодержит аминокислотную последовательность KKKK (SEQ ID NO: 1), KKKKK (SEQ ID NO: 3), KKKKKKK (SEQ ID NO: 223), KKKKKKKK (SEQ ID NO: 224), KTEY (SEQ ID NO: 225), KTEYK (SEQ ID NO: 226), KTEYKL (SEQ ID NO: 227), KTEYKLV (SEQ ID NO: 228), KTEYKLVV (SEQ ID NO: 229), KTEYKLVVV (SEQ ID NO: 230), KKTEY (SEQ ID NO: 231), KKTEYK (SEQ ID NO: 232), KKTEYKL (SEQ ID NO: 233), KKTEYKLV (SEQ ID NO: 234), KKTEYKLVV (SEQ ID NO: 235), KKTEYKLVVV (SEQ ID NO: 236), KKKTEY (SEQ ID NO: 237), KKKTEYK (SEQ ID NO: 238), KKKTEYKL (SEQ ID NO: 239), KKKTEYKLV (SEQ ID NO: 240), KKKTEYKLVV (SEQ ID NO: 241), KKKTEYKLVVV (SEQ ID NO: 242), KKKKTEY (SEQ ID NO: 243), KKKKTEYK (SEQ ID NO: 244), KKKKTEYKL (SEQ ID NO: 245), KKKKTEYKLV (SEQ ID NO: 246), KKKKTEYKLVV (SEQ ID NO: 247), KKKKTEYKLVVV (SEQ ID NO: 248), IDIIMKIRNA (SEQ ID NO: 131), FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFIIFFIFFWMC (SEQ ID NO: 132), FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFAAFWFW (SEQ ID NO: 133), IFFIFFIIFFFFFFFFFFFFIIIIIIIWEC (SEQ ID NO: 134), FIFFFIIFFFFFIFFFFFIFIIIIIIFWEC (SEQ ID NO: 135), TEY, TEYK (SEQ ID NO: 249), TEYKL (SEQ ID NO: 250), TEYKLV (SEQ ID NO: 136), TEYKLVV (SEQ ID NO: 251), TEYKLVVV (SEQ ID NO: 252), WQAGILAR (SEQ ID NO: 137), HSYTTAE (SEQ ID NO: 138), PLTEEKIK (SEQ ID NO: 139), GALHFKPGSR (SEQ ID NO: 140), RRANKDATAE (SEQ ID NO: 141), KAFISHEEKR (SEQ ID NO: 142), TDLSSRFSKS (SEQ ID NO: 143), FDLGGGTFDV (SEQ ID NO: 144), CLLLHYSVSK (SEQ ID NO: 145), KKKKIIMKIRNA (SEQ ID NO: 146) или MTEYKLVVV (SEQ ID NO: 147). В некоторых вариантах осуществления, Z_рсодержит аминокислотную последовательность K, KK, KKK, KKKK (SEQ ID NO: 1), KKKKK (SEQ ID NO: 3), KKKKKKK (SEQ ID NO: 223), KKKKKKKK (SEQ ID NO: 224), KKNKKDDI (SEQ ID NO: 148), KKNKKDDIKD (SEQ ID NO: 149), AGNDDDDDDDDDDDDDDDDDKKDKDDDDDD (SEQ ID NO: 150), AGNKKKKKKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 151), AGRDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD (SEQ ID NO: 152), SALTI (SEQ ID NO: 153), SALTIQL (SEQ ID NO: 154), GKSALTIQL (SEQ ID NO: 155), GKSALTI (SEQ ID NO: 156), SALTIK (SEQ ID NO: 253), SALTIQLK (SEQ ID NO: 254), GKSALTIQLK (SEQ ID NO: 255), GKSALTIK (SEQ ID NO: 256), SALTIKK (SEQ ID NO: 257), SALTIQLKK (SEQ ID NO: 258), GKSALTIQLKK (SEQ ID NO: 259), GKSALTIKK (SEQ ID NO: 260), SALTIKKK (SEQ ID NO: 261), SALTIQLKKK (SEQ ID NO: 262), GKSALTIQLKKK (SEQ ID NO: 263), GKSALTIKKK (SEQ ID NO: 264), SALTIKKKK (SEQ ID NO: 265), SALTIQLKKKK (SEQ ID NO: 266), GKSALTIQLKKKK (SEQ ID NO: 267), GKSALTI (SEQ ID NO: 156),KKKK (SEQ ID NO: 1), QGQNLKYQ (SEQ ID NO: 157), ILGVLLLI (SEQ ID NO: 158), EKEGKISK (SEQ ID NO: 159), AASDFIFLVT (SEQ ID NO: 160), KELKQVASPF (SEQ ID NO: 161), KKKLINEKKE (SEQ ID NO: 162), KKCDISLQFF (SEQ ID NO: 163), KSTAGDTHLG (SEQ ID NO: 164), ATFYVAVTVP (SEQ ID NO: 165), LTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDG (SEQ ID NO: 166) или TIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGE (SEQ ID NO: 167). В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит аминокислотную последовательность KTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 268), KTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 269), KTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 270), KTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 271), KKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 272), KKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 273), KKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 274), KKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 275), KKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 276), KKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 277), KKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 278), KKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 279), KKKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 280), KKKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 281), KKKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 282), KKKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 283), KKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKK (SEQ ID NO: 284), KKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKK (SEQ ID NO: 285), KKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKK (SEQ ID NO: 286), KKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKK (SEQ ID NO: 287), TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLK (SEQ ID NO: 288), TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLK (SEQ ID NO: 289), TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLK (SEQ ID NO: 290), TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLK (SEQ ID NO: 291), TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKK (SEQ ID NO: 292), TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKK (SEQ ID NO: 293), TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKK (SEQ ID NO: 294), TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKK (SEQ ID NO: 295), TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKKK (SEQ ID NO: 296), TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKKK (SEQ ID NO: 297), TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKKK (SEQ ID NO: 298), TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKKK (SEQ ID NO: 299), TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKKKK (SEQ ID NO: 300), TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKKKK (SEQ ID NO: 301), TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKKKK (SEQ ID NO: 302) или TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKKKK (SEQ ID NO: 303). В некоторых вариантах осуществления, эпитоп не является эпитопом RAS. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не является KKKKKPKRDGYMFLKAESKIMFAT (SEQ ID NO: 168), KKKKYMFLKAESKIMFATLQRSS (SEQ ID NO: 169), KKKKKAESKIMFATLQRSSLWCL (SEQ ID NO: 170), KKKKKIMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 171) или KKKKMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 172).

В некоторых вариантах осуществления Y_n и/или Z_p содержат аминокислотную последовательность белка, отличного от белка, из которого происходит эпитоп. В некоторых вариантах осуществления, Y_n и/или Z_p содержат аминокислотную последовательность белка CMV, такого как pp65, HIV или MART-1. В некоторых вариантах осуществления, n равно 11, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или целому числу больше, чем 20. В некоторых вариантах осуществления, p равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или целому числу. больше 20.

Также изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность, кодирующую полипептид, описанный в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотидом является мРНК.

Также изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид, описанный в настоящем изобретении, или полинуклеотид, описанный в настоящем изобретении; и фармацевтически приемлемый эксципиент.

Изобретение также относится к способу лечения заболевания или состояния, включающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, описанной в настоящем изобретении, субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления, заболеванием или состоянием является рак, выбранный из группы, состоящей из рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака поджелудочной железы, колоректального рака, рака матки, рака предстательной железы , рака печени, злокачественного новообразования желчных путей, рака эндометрия, рака шейки матки, рака мочевого пузыря, рака печени, миелоидного лейкоза и рака молочной железы. В некоторых вариантах осуществления, введение включает внутрикожную инъекцию, интраназальное нанесение спрея, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, внутривенную инъекцию, пероральное введение или подкожную инъекцию.

Изобретение также относится к способу получения антигенспецифических Т-клеток, включающему стимуляцию Т-клеток антигенпрезентирующими клетками, содержащими полипептид, описанный в настоящем изобретении, или полинуклеотид, кодирующий полипептид, описанный в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, способ выполняется ex vivo.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Особенности настоящего описания подробно изложены в прилагаемой формуле изобретения. Лучшее понимание особенностей и преимуществ настоящего будет получено при обращении к нижеследующему подробному описанию, в котором излагаются иллюстративные варианты осуществления, в которых используются принципы описания, и прилагаемые чертежи, в которых:

На ФИГ. 1 изображен упрощенный примерный процессинг эпитопа и презентация эпитопа Х на аллеле ХHLA антигенпрезентирующими клетками (APC). В природном контексте, пептид содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая естественным образом фланкирует последовательность эпитопа. В рациональном контексте, пептид содержит на N- и/или C-конце последовательности эпитопа аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не кодируется геномом, кодирующим последовательность эпитопа, и/или линкер.

На ФИГ. 2 показано приблизительное расщепление катепсином B полипептида, содержащего линкер, расщепляемый катепсином B.

На ФИГ. 3 представлена схема экспериментального дизайна для скрининга полипептидов in vitro на процессинг и презентацию эпитопов с использованием клеток, трансдуцированных Т-клеточным рецептором (TCR) (результаты показаны на ФИГ. 4 и 5).

На ФИГ. 4 представлен график, демонстрирующий уровень IL-2 (пг/мл), секретируемый KRAS-специфическими клетками Jurkat после 48-часового совместного культивирования с равным количеством мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), нагруженных либо пептидом, содержащим только KRAS-G12V эпитоп, либо пептидом, содержащим эпитоп KRAS-G12V и дополнительные аминокислотные последовательности, естественно фланкирующие эпитоп KRAS-G12V на N- и C-конце. На фигуре описаны SEQ ID NOS 220 и 387, соответственно, в порядке появления.

На ФИГ. 5 представлен график, демонстрирующий уровень IL-2 (пг/мл), секретируемый KRAS-специфическими клетками Jurkat после 48-часового совместного культивирования с равным количеством мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), нагруженных либо пептидом, содержащим только KRAS-G12V эпитоп, либо пептидом, содержащим эпитоп KRAS-G12V и дополнительные аминокислотные последовательности, естественным образом фланкирующие эпитоп KRAS-G12V на N- и C-конце, либо пептидом, содержащим эпитоп KRAS-G12V и дополнительные аминокислотные последовательности, рационально сконструированные не природно фланкирующим эпитопом KRAS-G12V (рациональный контекст) на N- и/или C-конце. На фигуре описаны SEQ ID NOS 220 и 387-393, соответственно, в порядке появления.

На ФИГ. 6 представлена диаграмма экспериментального дизайна исследования иммуногенности. Мышей иммунизируют в дни 0, 7 и 14 различными дизайнами полипептида, и собирают кровь в дни 7, 14 и 21, чтобы оценить ответы антигенспецифических CD8+Т-клеток (результаты показаны на ФИГ. 7-9).

На ФИГ. 7 представлены графики, демонстрирующие общие иммунные ответы (7A: H-2K^b, 7B: H-2D^b, 7C: всего). На сноске к фигуре описаны «К4» как SEQ ID NO: 1 и «K4-Val-Cit» как SEQ ID NO: 384.

На ФИГ. 8 представлены графики, демонстрирующие, что иммунизация К4-эпитопов («К4» описан как SEQ ID NO: 1) усиливает иммунные ответы на H-2K^b-презентированные эпитопы (8A: Alg8, 8B: Lama4). На сноске к фигуре описаны «К4» как SEQ ID NO: 1 и «K4-Val-Cit» как SEQ ID NO: 384.

На ФИГ. 9 представлены графики, демонстрирующие, что иммунизация К4-эпитопами («К4» описан как SEQ ID NO: 1) увеличивает иммунные ответы на H-2D^b-презентированные эпитопы (9A: Reps1, 9B: Adpgk, 9C: Irgq, 9D: Obsl1). На сноске к фигуре описаны «К4» как SEQ ID NO: 1 и «K4-Val-Cit» как SEQ ID NO: 384.

На ФИГ. 10 представлен график, демонстрирующий, что уровень IL-2 (пг/мл), секретируемый клетками Jurkat после 24-часового совместного культивирования с клетками 293T (соотношение Jurkats к клеткам 293T 5:1), нагруженным пептидом, содержащим только эпитоп TMPRSS2::ERG или трансдуцированный плазмидой, которая кодирует пептид, содержащий эпитоп TMPRSS2::ERG в природном контексте (т.е. пептид дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая естественным образом фланкирует последовательность эпитопа на N- и/или или С-конце), плазмидой, которая кодирует пептид, содержащий эпитоп TMPRSS2::ERG в не природном контексте (т.е. пептид дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая в природе не фланкирует последовательность эпитопа), или плазмидой, которая кодирует нерелевантный эпитоп в не природном контексте (в качестве контроля).

На ФИГ. 11 представлен график зависимости концентрации IL-2 (пг/мл) от концентрации пептида (нМ) в FLT3L-обработанных PBMC, контактировавших с возрастающими количествами указанных мутантных пептидов RAS-G12V после совместного культивирования с клетками Jurkat, трансдуцированными TCR, который связывается с подчеркнутым эпитопом RAS-G12V, связанным с MHC, кодируемым аллелем HLA-A11:01. На фигуре описаны SEQ ID NOS 220, 390 и 387, соответственно, в порядке появления.

На ФИГ. 12 представлены данные, иллюстрирующие иммуногенность указанных мутантных пептидов RAS-G12V из ФИГ. 11 как in vitro, с использованием PBMC от здоровых доноров (вверху), так и in vivo, с использованием HLA-A11:01 трансгенных мышей, иммунизированных пептидами (внизу).

На ФИГ. 13А изображены иллюстративные схемы конструкций мРНК с использованием шортмеров (9-10 аминокислот, вверху) и лонгмеров (25 аминокислот, внизу), используемых для экспрессии в клетках. На фигуре описаны линкерные последовательности как SEQ ID NOS 394, 386, 385, 395, 386 и 385, соответственно, в порядке появления.

На ФИГ. 13В изображен типовой график мультимер-специфичных CD8+ клеток в долях от общего количества CD8+ клеток. Показаны антигены, использованные для мультимерного анализа.

На ФИГ. 13C изображены типовые анализы проточной цитометрией обнаружения мультимер-положительных CD8+ Т-клеток, сравнивающие короткие (9-10 аминокислот) и длинные (25 аминокислот) APC, стимулированных пептидом, и APC, содержащих РНК, кодирующие те же короткие (9-10 аминокислот) и длинные (25 аминокислот) пептиды.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В настоящем изобретении описаны новые иммунотерапевтические композиции, содержащие опухолеспецифический антиген или неоэпитоп индивидуума, и их применение, основанное на открытии способов усиления процессинга и презентации эпитопа для стимуляции иммунного ответа. Соответственно, настоящее раскрытие, представленное в настоящем изобретении, относится к пептидам, которые можно использовать, например, для стимуляции иммунного ответа на опухолеассоциированный антиген или неоэпитоп, для создания иммуногенной композиции или противораковой вакцины для применения при лечении рака, заболевания или состояния.

Следующее описание и примеры подробно иллюстрируют варианты осуществления настоящего описания. Следует понимать, что настоящее описание не ограничивается конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем изобретении, и поэтому может варьировать. Специалистам в данной области техники будет понятно, что существуют многочисленные вариации и модификации настоящего описания, которые входят в его объем.

Все термины следует понимать так, как их понимает специалист в данной области техники. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем изобретении, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится описание.

Заголовки разделов, используемые в настоящем изобретении, предназначены только для организационных целей и не должны рассматриваться как ограничение описываемого объекта.

Хотя различные признаки настоящего описания могут быть описаны в контексте одного варианта осуществления, эти признаки также могут быть предоставлены отдельно или в любой подходящей комбинации. И наоборот, хотя настоящее описание может быть описано в настоящем изобретении в контексте отдельных вариантов осуществления для ясности, настоящее описание также может быть реализовано в одном варианте осуществления.

Следующие ниже определения дополняют определения в данной области техники и относятся к текущей заявке и не должны относиться к какому-либо связанному или не связанному случаю, например, к какому-либо совместному патенту или заявке. Хотя любые методы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем изобретении, могут быть использованы на практике для тестирования настоящего описания, в настоящем изобретении описаны предпочтительные материалы и методы. Соответственно, используемая в настоящем изобретении терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления, и не предназначена для ограничения.

1. Определения

Используемая в настоящем изобретении терминология предназначена только для описания конкретных случаев и не предназначена для ограничения. В этой заявке, использование единственного числа включает множественное число, если специально не указано иное. Используемые в настоящем изобретении формы единственного числа также включают формы множественного числа, если в контексте явно не указано иное.

В этой заявке, использование «или» означает «и/или», если не указано иное. Термины «и/или» и «любая их комбинация» и их грамматические эквиваленты, используемые в настоящем изобретении, могут использоваться взаимозаменяемо. Эти термины могут означать, что конкретно рассматривается любая комбинация. Исключительно в иллюстративных целях, следующие фразы «А, В и/или С» или «А, В, С или любая их комбинация» могут означать «А индивидуально; В индивидуально; С индивидуально; А и В; В и С; А и С; и А, В и С». Термин «или» может использоваться вместе или раздельно, если только контекст конкретно не указывает на раздельное использование.

Термин «примерно» или «приблизительно» может означать, в пределах приемлемого диапазона ошибок для конкретного значения, определение обычным специалистом в данной области техники, которое будет зависеть отчасти от того, как измеряется или определена величина, т.е., ограничений системы измерения. Например, «приблизительно» может означать величину в пределах 1 или более чем 1 стандартного отклонения в соответствии с практикой в данной области техники. Альтернативно, «приблизительно» может означать диапазон до 20%, до 10%, до 5% или до 1% от заданного значения. Альтернативно, особенно в отношении биологических систем или процессов, термин может означать в пределах порядка, в пределах 5-кратного, а более предпочтительно в пределах 2-кратного значения. Если конкретные значения описаны в заявке и формуле изобретения, если не указано иное, следует использовать термин «приблизительно», означающий в пределах допустимого диапазона ошибок для конкретного значения.

В настоящем описании и формуле изобретения слова «содержащий» (и любая форма включения, такая как «содержать» и «содержит»), «имеющий» (и любая форма наличия, например «иметь» и «имеет»), «включающий» (и любая форма включения, такая как «включать» и «включает») или «содержащий» (и любая форма включения, такая как «содержит» и «содержать») являются включающими или открытыми и не исключают дополнительные, не перечисленные элементы или стадии способа. Предполагается, что любой вариант осуществления, обсуждаемый в этом описании, может быть реализован по отношению к любому способу или составу настоящего описания, и наоборот. Кроме того, композиции настоящего описания можно использовать для достижения способов настоящего описания.

Ссылка в описании на «некоторые варианты осуществления», «вариант осуществления» «один вариант осуществления» или «другие варианты осуществления» означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описанные в связи с вариантами осуществления, включены, по меньшей мере в некоторые варианты осуществления, но не обязательно все варианты осуществления настоящего описания. Для облегчения понимания настоящего описания ниже определен ряд терминов и фраз.

Номенклатура, используемая для описания пептидов или белков, соответствует общепринятой практике, согласно которой аминогруппа представлена слева (амино- или N-конец), и карбоксильная группа представлена справа (карбокси- или С-конец) каждого аминокислотного остатка. Если положения аминокислотных остатков упоминаются в пептидном эпитопе, они нумеруются в направлении от амино к карбокси, причем первым положением является остаток, расположенный на амино-конце эпитопа, или пептида или белка, частью которого он может быть. В формуле, представляющей выбранные конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, амино- и карбокси-концевые группы, хотя конкретно не показаны, находятся в форме, которую они принимают при физиологических значениях pH, если не указано иное. В структурной формуле аминокислоты, каждый остаток обычно представлен стандартными трехбуквенными или однобуквенными обозначениями. L-форма аминокислотного остатка представлена заглавной одиночной буквой или заглавной первой буквой трехбуквенного символа, и D-форма для аминокислотных остатков, имеющих D-формы, представлена строчной одиночной буквой или трехбуквенным символом в нижнем регистре. Однако, если трехбуквенные символы или полные названия используют без заглавных букв, они могут относиться к L-аминокислотным остаткам. Глицин не имеет асимметричного атома углерода и называется просто «Gly» или «G». Аминокислотные последовательности пептидов, указанные в настоящем изобретении, обычно обозначаются с использованием стандартного однобуквенного символа. (A, аланин, C, цистеин, D, аспарагиновая кислота, E, глутаминовая кислота, F, фенилаланин, G, глицин, H, гистидин, I, изолейцин, K, лизин, L, лейцин, M, метионин, N, аспарагин; P, пролин; Q, глутамин; R, аргинин; S, серин; T, треонин; V, валин; W, триптофан и Y, тирозин).

Термин «остаток» относится к аминокислотному остатку или миметику аминокислотного остатка, включенному в пептид или белок посредством амидной связи или миметика амидной связи, или нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), которая кодирует аминокислоту или миметик аминокислоты.

«Полипептид», «пептид» и их грамматические эквиваленты в контексте настоящего описания относятся к полимеру аминокислотных остатков. «Зрелым белком» является белок, который является полноразмерным, и который, необязательно, содержит гликозилирование или другие модификации, типовые для белка в данной клеточной среде. Раскрытые в настоящем изобретении полипептиды и белки (включая их функциональные части и функциональные варианты) могут содержать синтетические аминокислоты вместо одной или нескольких встречающихся в природе аминокислот. Такие синтетические аминокислоты известны в данной области техники и включают, например, аминоциклогексанкарбоновую кислоту, норлейцин, α-амино н-декановую кислоту, гомосерин, S-ацетиламинометилцистеин, транс-3- и транс-4-гидроксипролин, 4-аминофенилаланин, 4-нитрофенилаланин, 4-хлорфенилаланин, 4-карбоксифенилаланин, β -фенилсерин, β-гидроксифенилаланин, фенилглицин, α-нафтилаланин, циклогексилаланин, циклогексилглицин, индолин-2-карбоновую кислоту, 1,2,3,4-тетрагидроизохинодин-3-карбоновую кислоту, аминомалоновую кислоту, моноамид аминомалоновой кислоты, N'-бензил-N'-метиллизин, N',N'-дибензиллизин, 6-гидроксилизин, орнитин, α-аминоциклопентанкарбоновую кислоту, α-аминоциклогексанкарбоновую кислоту, α-аминоциклогептанкарбоновую кислоту, α-(2-амино-2-норборнан)-карбоновую кислоту, α,γ-диаминомасляную кислоту, α,β -диаминопропионовую кислоту, гомофенилаланин и α-трет-бутилглицин. Настоящее описание дополнительно предполагает, что экспрессия описанных в настоящем изобретении полипептидов в сконструированной клетке может быть ассоциирована с пост-трансляционными модификациями одной или нескольких аминокислот полипептидных конструкций. Неограничивающие примеры пост-трансляционных модификаций включают фосфорилирование, ацилирование, включая ацетилирование и формилирование, гликозилирование (включая N-связанное и O-связанное), амидирование, гидроксилирование, алкилирование, включая метилирование и этилирование, убиквитинирование, добавление пирролидонкарбоновой кислоты, образование дисульфидных мостиков, сульфирование, миристоилирование, пальмитоилирование, изопренилирование, фарнезилирование, геранилирование, глипиирование, липоилирование и йодирование.

Термин «пептид» относится к ряду аминокислотных остатков, соединенных друг с другом, обычно пептидными связями между α-амино и карбоксильными группами соседних аминокислотных остатков.

«Синтетический пептид» относится к пептиду, полученному из не природного источника, например, искусственному. Такие пептиды можно получить с использованием таких способов, как химический синтез или технология рекомбинантной ДНК. «Синтетические пептиды» включают «слитые белки».

«Эпитоп» представляет собой совокупность характеристик молекулы, таких как первичная, вторичная и третичная пептидная структура и заряд, которые вместе образуют сайт, распознаваемый, например, иммуноглобулином, Т-клеточным рецептором, молекулой HLA или химерным антигенным рецептором. Альтернативно, эпитоп можно определить как набор аминокислотных остатков, которые участвуют в распознавании конкретным иммуноглобулином, или в контексте Т-клеток, таких остатков, которые необходимы для распознавания белками Т-клеточных рецепторов, химерными антигенными рецепторами и/или рецепторами главного комплекса гистосовместимости (MHC). Под «Т-клеточным эпитопом» следует понимать пептидную последовательность, которая может быть связана с молекулами MHC класса I или II в форме пептид-презентирующей молекулы MHC или комплекса MHC, и затем, в этой форме, быть распознаваемой и связываться Т-клетками, такими как Т-лимфоциты или Т-хелперные клетки. Эпитопы можно получить путем выделения из природного источника, или их можно синтезировать в соответствии со стандартными протоколами в данной области техники. Синтетические эпитопы могут содержать искусственные аминокислотные остатки, «аминокислотные миметики», такие как D-изомеры встречающихся в природе L-аминокислотных остатков или не встречающихся в природе аминокислотных остатков, таких как циклогексилаланин. В настоящем описании, эпитопы в некоторых случаях могут называться пептидами или пептидными эпитопами. Следует принимать во внимание, что белки или пептиды, которые содержат эпитоп или аналог, описанные в настоящем изобретении, а также дополнительные аминокислоты, все еще находятся в рамках настоящего описания. В некоторых вариантах осуществления, пептид содержит фрагмент антигена. В некоторых вариантах осуществления, существует ограничение на длину пептида по настоящему раскрытию. Вариант осуществления, ограниченный по длине, имеет место, если белок или пептид, содержащий описанный в настоящем изобретении эпитоп, содержит область (т.е. непрерывную серию аминокислотных остатков), имеющую 100% идентичность с нативной последовательностью. Чтобы избежать определения эпитопа при считывании, например, для целых природных молекул, существует ограничение на длину любой области, которая имеет 100% идентичность с нативной пептидной последовательностью. Таким образом, для пептида, содержащего описанный в настоящем изобретении эпитоп и область со 100% идентичностью с нативной пептидной последовательностью, область со 100% идентичностью с нативной последовательностью обычно имеет длину: меньше или равно 600 аминокислотным остаткам, меньше или равно 500 аминокислотным остаткам, меньше или равно 400 аминокислотным остаткам, меньше или равно 250 аминокислотным остаткам, меньше или равно 100 аминокислотным остаткам, меньше или равно 85 аминокислотным остаткам, меньше или равно 75 аминокислотным остаткам, меньше или равно 65 аминокислотным остаткам или меньше или равно 50 аминокислотным остаткам. В некоторых вариантах осуществления, «эпитоп», описанный в настоящем изобретении, состоит из пептида, имеющего область с менее чем 51 аминокислотными остатками, которая имеет 100% идентичность с нативной пептидной последовательностью в любом приращении до 5 аминокислотных остатков; например 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотный остаток.

Термин «производный» и его грамматические эквиваленты при использовании для обсуждения эпитопа являются синонимом термина «полученный» и его грамматических эквивалентов. Производный эпитоп можно выделить из природного источника или его можно синтезировать в соответствии со стандартными протоколами в данной области техники. Синтетические эпитопы могут содержать искусственные аминокислотные остатки «миметики аминокислот», такие как D-изомеры встречающихся в природе L-аминокислотных остатков или не природных аминокислотных остатков, таких как циклогексилаланин. Производный или полученный эпитоп может быть аналогом нативного эпитопа.

«Иммуногенным» пептидом или «иммуногенным» эпитопом или «пептидным эпитопом» является пептид, который содержит аллель-специфический мотив, такой, что пептид будет связываться с молекулой HLA и индуцировать клеточно-опосредованный или гуморальный ответ, например, ответ цитотоксического T-лимфоцита (CTL (например, CD8⁺)), хелперного Т-лимфоцита (Th (например, CD4⁺)) и/или В-лимфоцита. Таким образом, иммуногенные пептиды, описанные в настоящем изобретении, способны связываться с соответствующей молекулой HLA и после этого индуцировать ответ CTL (цитотоксический) или ответ HTL (и гуморальный) на пептид.

«Неоантиген» означает класс опухолевых антигенов, которые возникают в результате опухолеспецифических изменений белков. Неоантигены включают, но не ограничиваются ими, опухолевые антигены, которые возникают, например, в результате замены в последовательности белка, мутации сдвига рамки, полипептида слияния, делеции внутри рамки считывания, вставки, экспрессии эндогенных ретровирусных полипептидов и опухолеспецифической сверхэкспрессии полипептидов.

Термины «мутантный пептид», «опухолеспецифический пептид», «пептид неоантигена» и «неоантигенный пептид», используемые взаимозаменяемо с «пептидом» в настоящем описании, относятся к ряду остатков, обычно L-аминокислот, связанных друг с другом, как правило, за счет пептидных связей между α-амино- и карбоксильными группами соседних аминокислот. Точно так же, термин «полипептид» используется взаимозаменяемо с «мутантным полипептидом», «полипептидом неоантигена» и «неоантигенным полипептидом» в настоящем описании для обозначения ряда остатков, например, L-аминокислот, связанных друг с другом, обычно за счет пептидных связей между α-амино- и карбоксильными группами соседних аминокислот. Полипептиды или пептиды могут иметь различную длину либо в их нейтральной (незаряженной) форме, либо в форме солей, и либо быть без модификаций, таких как гликозилирование, окисление боковой цепи или фосфорилирование, либо содержать эти модификации, при условии чтобы модификация не разрушит биологическую активность полипептидов, как описано в настоящем изобретении. Используемый в настоящем изобретении пептид или полипептид содержит по меньшей мере одну фланкирующую последовательность. Термин «фланкирующая последовательность», используемый в настоящем изобретении, относится к фрагменту или области пептида неоантигена, который не является частью неоэпитопа.

«Неоэпитоп», «опухолеспецифический неоэпитоп», «опухолеспецифический эпитоп» или «опухолевой антиген» относится к эпитопу или области антигенной детерминанты, которая не присутствует в эталоне, такой как не больная клетка, например, не раковая клетка или клетка зародышевой линии, но обнаруживается в больной клетке, например, раковой клетке. Это включает ситуации, где соответствующий эпитоп обнаружен в нормальной здоровой клетке или клетке зародышевой линии, но из-за одной или нескольких мутаций в больной клетке, например, раковой клетке, последовательность эпитопа изменена таким образом, что получается неоэпитоп. Термин «неоэпитоп», используемый в настоящем изобретении, относится к области антигенной детерминанты внутри пептида или неоантигенного пептида. Неоэпитоп может содержать, по меньшей мере один «якорный остаток» и по меньшей мере одну «фланкирующую область якорного остатка». Неоэпитоп может дополнительно содержать «область разделения». Термин «якорный остаток» относится к аминокислотному остатку, который связывается со специфическими карманами на HLA, что приводит к специфичности взаимодействий с HLA. В некоторых случаях, якорный остаток может находиться в каноническом якорном положении. В других случаях, якорный остаток может находиться в не каноническом якорном положении. Неоэпитопы могут связываться с молекулами HLA через первичные и вторичные якорные остатки, выступающие в карманы в пептид-связывающих канавок. В пептид-связывающих канавках, специфические аминокислоты составляют карманы, вмещающие соответствующие боковые цепи якорных остатков презентированных неоэпитопов. Предпочтения пептидного связывания существуют среди различных аллелей обеих молекул HLA I и HLA II. Молекулы HLA класса I связывают короткие неоэпитопы, N- и С-концы которых заякорены в карманах, расположенных на концах неоэпитоп-связывающей канавки. В то время как большинство неоэпитопов, связывающих HLA класса I, состоят приблизительно из 9 аминокислот, более длинные неоэпитопы могут быть размещены за счет выпуклости их центральной части, что приводит к связыванию неоэпитопов приблизительно из 8-12 аминокислот. Неоэпитопы, связывающиеся с белками HLA класса II, не ограничены по размеру и могут содержать приблизительно от 16 до 25 аминокислот. Неоэпитоп-связывающая канавка в молекулах HLA класса II открыта с обоих концов, что позволяет связывать пептиды относительно большей длины. Хотя коровый сегмент длиной 9 аминокислотных остатков вносит наибольший вклад в распознавание неоэпитопа, фланкирующие области якорного остатка также важны для специфичности пептида к аллелю HLA класса II. В некоторых случаях, фланкирующей областью якорного остатка являются N-концевые остатки. В другом случае, фланкирующей областью якорного остатка являются С-концевые остатки. В еще одном случае, фланкирующей областью якорного остатка являются как N-концевые остатки, так и С-концевые остатки. В некоторых случаях, фланкирующая область якорного остатка фланкирована по меньшей мере двумя якорными остатками. Фланкирующая область якорного остатка, фланкированная якорными остатками, является «разделительной областью».

«Главный комплекс гистосовместимости» или «MHC» является кластером генов, который играет роль в контроле клеточных взаимодействий, ответственных за физиологические иммунные ответы. У людей комплекс MHC также известен как комплекс человеческого лейкоцитарного антигена (HLA). Подробное описание комплексов MHC и HLA см. в Paul, Fundamental Immunology, 3^rd Ed., Raven Press, New York (1993). «Белки или молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC)», «молекулы MHC», «белки MHC» или «белки HLA» следует понимать как означающие белки, способные связывать пептиды, возникающие в результате протеолитического расщепления белковых антигенов и представляющие потенциальные эпитопы лимфоцитов (например, эпитоп Т-клетки и эпитоп В-клетки), транспортирующие их на поверхность клетки и презентирующие их там специфическим клеткам, в частности цитотоксическим Т-лимфоцитам, Т-хелперным клеткам или В-клеткам. Главный комплекс гистосовместимости в геноме содержит генетическую область, генные продукты которой, экспрессируемые на поверхности клетки, важны для связывания и презентации эндогенных и/или чужеродных антигенов и, таким образом, для регулирования иммунологических процессов. Главный комплекс гистосовместимости подразделяется на две группы генов, кодирующих разные белки, а именно молекулы MHC класса I и молекулы MHC класса II. Клеточная биология и профили экспрессии двух классов MHC адаптированы к этим различным ролям.

«Человеческим лейкоцитарным антигеном» или «HLA» является человеческий белок главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или класса II (см., например, Stites, et al., Immunology, 8^th Ed., Lange Publishing, Los Altos, Calif. (1994).

«Стабильность пептид-MHC (pMHC)» относится к продолжительности времени, которое требуется половине количества конкретного пептида для диссоциации от родственного HLA в биохимическом анализе.

«Антигенпрезентирующими клетками» (APC) являются клетки, которые презентируют пептидные фрагменты белковых антигенов в ассоциации с молекулами МНС на своей клеточной поверхности. Некоторые APC могут активировать антигенспецифические Т-клетки. Зрелые профессиональные антигенпрезентирующие клетки очень эффективно интернализуют антиген либо путем фагоцитоза, либо посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, и затем экспонируют фрагмент антигена, связанного с молекулой MHC класса II, на своей мембране. Т-клетка распознает и взаимодействует с молекулярным комплексом антиген-МНС класса II на мембране антигенпрезентирующей клетки. Затем антигенпрезентирующая клетка продуцирует дополнительный костимулирующий сигнал, что приводит к активации Т-клетки. Экспрессия костимулирующих молекул является определяющей чертой профессиональных антигенпрезентирующих клеток. Основными типами профессиональных антигенпрезентирующих клеток являются дендритные клетки, которые имеют самый широкий спектр антигенпрезентации и, вероятно, являются наиболее важными антигенпрезентирующими клетками, макрофаги, В-клетки и некоторые активированные эпителиальные клетки. «Дендритными клетками (ДК)» являются популяции лейкоцитов, которые презентируют антигены, захваченные в периферических тканях, Т-клеткам посредством путей презентации антигенов МНС класса II и I. Хорошо известно, что дендритные клетки являются мощными индукторами иммунных ответов, и активация этих клеток является важным этапом индукции противоопухолевого иммунитета. Дендритные клетки удобно классифицировать как «незрелые» и «зрелые» клетки, которые можно использовать как простой способ различения двух хорошо охарактеризованных фенотипов. Однако эту номенклатуру не следует истолковывать как исключающую все возможные промежуточные стадии дифференциации. Незрелые дендритные клетки характеризуются как антигенпрезентирующие клетки с высокой способностью к поглощению и процессингу антигена, что коррелирует с высокой экспрессией рецептора Fc (FcR) и маннозного рецептора. Зрелый фенотип обычно характеризуется более низкой экспрессией этих маркеров, но высокой экспрессией молекул клеточной поверхности, ответственных за активацию Т-клеток, таких как МНС класса I и класса II, молекулы адгезии (например, CD54 и CD11) и костимулирующие молекулы (например, CD40, CD80, CD86 и 4-1 ВВ).

Термины «полинуклеотид», «нуклеотид», «нуклеиновая кислота», «полинуклеиновая кислота» или «олигонуклеотид» и их грамматические эквиваленты используют в настоящем изобретении взаимозаменяемо и они относятся к полимерам нуклеотидов любой длины и включают ДНК и РНК, например, иРНК. Таким образом, эти термины включают двухцепочечную и одноцепочечную ДНК, триплексную ДНК, а также двухцепочечную и одноцепочечную РНК. Он также содержит модифицированные, например, путем метилирования и/или кэппирования, и не модифицированные формы полинуклеотида. Термин также включает молекулы, которые включают не встречающиеся в природе или синтетические нуклеотиды, а также аналоги нуклеотидов. Последовательности нуклеиновых кислот и векторы, описанные или предполагаемые в настоящем изобретении, могут быть введены в клетку, например, посредством трансфекции, трансформации или трансдукции. Нуклеотиды могут быть дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифицированными нуклеотидами или основаниями и/или их аналогами или любым субстратом, который может быть включен в полимер с помощью ДНК или РНК полимеразы. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид и нуклеиновая кислота могут быть иРНК, транскрибированной in vitro. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, который вводят с использованием способов настоящего описания, является иРНК.

«Эталон» может использоваться для корреляции и сравнения результатов, полученных в способах настоящего описания из образца опухоли. Обычно «эталон» может быть получен на основе одного или нескольких нормальных образцов, в частности образцов, на которых не влияет рак, полученных от пациента или одного или нескольких разных индивидуумов, например, здоровых индивидуумов, в частности, индивидуумов одного вида. «Эталон» можно определить эмпирически путем тестирования достаточно большого количества нормальных образцов.

Термин «мутация» или «мутант» относится к изменению или различию в последовательности нуклеиновой кислоты (нуклеотидная замена, добавление, вставка или делеция) по сравнению с эталоном. «Соматическая мутация» может произойти в любой из клеток тела, кроме зародышевых клеток (сперматозоидов и яйцеклеток), и поэтому не передается детям. Эти изменения могут (но не всегда) вызывать рак или другие заболевания. В некоторых вариантах осуществления, мутация является не синонимичной мутацией. Термин «не синонимичная мутация» относится к мутации, например, нуклеотидной замене, которая действительно приводит к замене аминокислоты, такой как замена аминокислоты в продукте трансляции. «Сдвиг рамки считывания» происходит, если мутация нарушает нормальную фазу периодичности кодона гена (также известную как «рамка считывания»), что приводит к трансляции последовательности не нативного белка. Возможно, что разные мутации в гене приведут к одной и той же измененной рамке считывания. «НеоORF» может быть создан, если открытая рамка считывания (ORF) изменяется в результате различных мутационных событий в геноме, таких как миссенс-мутации, слитые транскрипты, сдвиги рамок и/или потери стоп-кодонов. НеоORF может кодировать новые аминокислотные последовательности, которые не присутствуют в нормальном геноме.

«Консервативной аминокислотной заменой» является замена, при которой один аминокислотный остаток заменяется другим аминокислотным остатком, имеющим аналогичную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, были определены в данной области техники, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), не заряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), не полярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Например, замена тирозина фенилаланином является консервативной заменой. Способы идентификации консервативных замен нуклеотидов и аминокислот, которые не устраняют функцию пептида, хорошо известны в данной области техники.

«Нативная» последовательность или последовательность «дикого типа» относится к последовательности, встречающейся в природе. Такая последовательность может содержать более длинную последовательность в природе.

Используемый в настоящем изобретении термин «аффинность» относится к мере силы связывания между двумя членами пары связывания, например, HLA-связывающим пептидом, и HLA класса I или II. K_D является константой диссоциации в единицах молярности. Константа аффинности обратна константе диссоциации. Константу аффинности иногда используют как общий термин для описания этого химического соединения. Она является прямой мерой энергии связывания. Аффинность может быть определена экспериментально, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием коммерчески доступных устройств Biacore SPR. Аффинность также может быть выражена как ингибирующая концентрация 50 (IC₅₀), концентрация, при которой замещается 50% пептида. Точно так же ln(IC₅₀) относится к натуральному логарифму IC₅₀. K_off относится к константе скорости диссоциации, например, для диссоциации HLA-связывающего пептида и HLA класса I или II. В этом описании «данные связывания» или результаты «анализа связывания» могут быть выражены в единицах «IC₅₀». IC₅₀ является концентрацией тестируемого пептида в анализе связывания, при котором наблюдается 50% ингибирование связывания меченого эталонного пептида. Принимая во внимание условия, в которых выполняются анализы (т.е., ограничение HLA белка и меченые концентрации эталонного пептида), эти значения аппроксимируют К_D значения. Анализы для определения связывания хорошо известны в данной области техники и подробно описаны, например, в публикациях РСТ WO 94/20127 и WO 94/03205 и других публикациях, таких как Sidney et al., Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998); Sidney, et al., J. Immunol. 154:247 (1995); и Sette, et al., Mol. Immunol. 31:813 (1994). Альтернативно, связывание может быть выражено относительно связывания стандартным эталонным пептидом. Например, это может быть основано на его IC₅₀ относительно IC₅₀ эталонного стандартного пептида. Связывание также может быть определено с использованием других систем анализа, в том числе с использованием: живых клеток (например, Ceppellini et al., Nature 339:392 (1989); Christnick et al., Nature 352:67 (1991); Busch et al., Int. Immunol. 2:443 (1990); Hill et al., J. Immunol. 147:189 (1991); del Guercio et al., J. Immunol. 154:685 (1995)), бесклеточные системы с использованием лизатов моющих средств (например, Cerundolo et al., J. Immunol. 21:2069 (1991)), иммобилизованный очищенный MHC (например, Hill et al., J. Immunol. 152, 2890 (1994); Marshall et al., J. Immunol. 152:4946 (1994)), системы ELISA (например, Reay et al., EMBO J. 11:2829 (1992)), поверхностный плазмонный резонанс (например, Khilko et al., J. Biol. Chem. 268:15425 (1993)); анализы растворимой фазы с большой плотностью потока (Hammer et al., J. Exp. Med. 180:2353 (1994)) и измерение стабилизации или сборки MHC класса I (например, Ljunggren et al., Nature 346:476 (1990); Schumacher et al., Cell 62:563 (1990); Townsend et al., Cell 62:285 (1990); Parker et al., J. Immunol. 149:1896 (1992)). «Перекрестное связывание» указывает на то, что пептид связывается более чем одной молекулой HLA; синонимом является вырожденное связывание.

Используемый в настоящем изобретении термин «встречающийся в природе» и его грамматические эквиваленты относятся к тому факту, что объект можно найти в природе. Например, пептид или нуклеиновая кислота, которые присутствуют в организме (включая вирусы) и могут быть выделены из природного источника, и которые не были преднамеренно модифицированы человеком в лаборатории, являются встречающимися в природе.

«Процессинг антигена» или «процессинг» и его грамматические эквиваленты относятся к расщеплению полипептида или антигена на продукты процессинга, которые являются фрагментами указанного полипептида или антигена (например, расщеплению полипептида на пептиды) и ассоциации одного или нескольких таких фрагментов (например, через связывание) с молекулами MHC для презентации клетками, например антигенпрезентирующими клетками, специфическим Т-клеткам.

Термин «субъект» относится к любому животному (например, млекопитающему), включая, но не ограничиваясь ими, людей, приматов, не относящихся к человеку, собак, кошек, грызунов и подобных, которое подлежит конкретному лечению. Как правило, термины «субъект» и «пациент» используют в настоящем изобретении взаимозаменяемо по отношению к субъекту-человеку.

«Клетка» и их грамматические эквиваленты относятся к клетке человеческого или не человеческого животного происхождения.

«Т-клетка» включает CD4⁺ Т-клетки и CD8⁺ Т-клетки. Термин Т-клетка также включает как Т-хелперные Т-клетки 1 типа, так и Т-хелперные Т-клетки 2 типа.

Согласно настоящему описанию термин «вакцина» относится к фармацевтическому препарату (фармацевтической композиции) или продукту, который при введении индуцирует иммунный ответ, например клеточный или гуморальный иммунный ответ, который распознает и атакует патоген или больную клетку, такую как раковая клетка. Вакцина может использоваться для профилактики или лечения заболевания. Термин «индивидуализированная противораковая вакцина» или «персонализированная противораковая вакцина» относится к конкретному больному раком и означает, что противораковая вакцина адаптирована к потребностям или особым обстоятельствам индивидуального больного раком.

Термины «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» или «терапевтический эффект» относятся к количеству терапевтического агента, эффективному для «лечения» заболевания или нарушения у субъекта или млекопитающего. Терапевтически эффективное количество лекарственного средства имеет терапевтический эффект и как таковое может предотвращать развитие заболевания или нарушения; замедлить развитие болезни или нарушения; замедлить прогрессирование заболевания или нарушения; облегчить до некоторой степени один или более симптомов, связанных с заболеванием или нарушением; снизить заболеваемость и смертность; улучшить качество жизни; или комбинацию таких эффектов.

Термины «лечение», или «лечение», или «лечить», или «облегчение», или «облегчать» относятся к обоим (1) терапевтическим мерам, которые излечивают, замедляют, уменьшают симптомы и/или останавливают прогрессирование диагностированного патологического состояния или нарушения; и (2) профилактические или предупредительные меры, которые предотвращают или замедляют развитие патологического состояния или нарушения-мишени. Таким образом, в число нуждающихся в лечении входят лица, уже страдающие этим расстройством; те, кто склонен к расстройству; и те, у кого расстройство должно быть предотвращено.

«Фармацевтически приемлемая» относится к обычно не токсичной, инертной и/или физиологически совместимой композиции или компоненту композиции.

«Фармацевтический эксципиент» или «эксципиент» содержит такой материал, как адъювант, носитель, рН-регуляторы и буферные агенты, агенты, регулирующие тоничность, смачивающие агенты, консерванты и подобные. «Фармацевтическим эксципиентом» является эксципиент, который фармацевтически приемлем.

«Иммуномодулирующий агент» или его грамматический эквивалент, применяемый в настоящем описании, может относиться к веществу, которое может стимулировать или подавлять иммунную систему и может помочь телу индивидуума бороться с заболеванием, например, инфекцией, раком и т.д. Примеры специфических иммуномодулирующих агентов, которые воздействуют на определенные части иммунной системы, включают, но не ограничены ими, моноклональные антитела, цитокины и вакцины. Неспецифические иммуномодулирующие агенты влияют на иммунную систему в целом, и неограничивающие примеры включают Bacillus Calmette-Guerin (BCG) и левамизол.

Термин «рак» и его грамматические эквиваленты, используемые в настоящем изобретении, могут относиться к гиперпролиферации клеток, уникальная черта которых - потеря нормального контроля - приводит к нерегулируемому росту, отсутствию дифференциации, локальному поражению тканей и метастазированию. Что касается композиций и способов по изобретению, раком может быть любой рак, включая любой из острого лимфоцитарного рака, острого миелоидного лейкоза, альвеолярной рабдомиосаркомы, рака мочевого пузыря, рака костей, рака мозга, рака молочной железы, рака заднего прохода, анального канала, прямой кишки, рака глаза, рака внутрипеченочного желчного протока, рака суставов, рака шеи, желчного пузыря или плевры, рака носа, носово й полости или среднего уха, рака полости рта, рака вульвы, хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелоидного рака, рака толстой кишки, рака пищевода, рака шейки матки, фибросаркомы, карциноидной опухоли желудочно-кишечного тракта, лимфомы Ходжкина, рака гортаноглотки, рака почки, рака гортани, лейкоза, гемобластозов, рака печени, рака легких, лимфомы, злокачественной мезотелиомы, мастоцитомы, меланомы, множественной миеломы, рака носоглотки, неходжкинской лимфомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, брюшины, сальника и брыжейки, рака глотки, рака предстательной железы , рака толстой кишки, рака почек, рака кожи, рака тонкой кишки, рака мягких тканей, солидных опухолей, рака желудка, рака яичек, рака щитовидной железы, рака мочеточника и/или рака мочевого пузыря. Используемый в настоящем изобретении термин «опухоль» относится к аномальному росту клеток или тканей, например, злокачественного типа или доброкачественного типа.

Термин «экзом» относится к части генома, которая кодирует функциональные белки, или к последовательности, охватывающей все экзоны или кодирующие области генов, кодирующих белок в геноме. Он составляет приблизительно 1-2% всего генома в зависимости от вида.

«Разбавитель» включает стерильные жидкости, такие как вода и масла, в том числе масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и подобные. Вода также является разбавителем для фармацевтических композиций. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно использовать в качестве разбавителей, например, в растворах для инъекций.

Под «рецептором» следует понимать биологическую молекулу или группу молекул, способную связывать лиганд. Рецептор может служить для передачи информации в клетке, клеточном образовании или организме. Рецептор содержит по меньшей мере одну рецепторную единицу, например, где каждая рецепторная единица может состоять из белковой молекулы. Рецептор имеет структуру, которая дополняет структуру лиганда и может образовывать комплекс лиганда в качестве партнера по связыванию. Информация передается, в частности, путем конформационных изменений рецептора после комплексообразования лиганда на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления, под рецептором следует понимать конкретные белки MHC классов I и II, способные образовывать комплекс рецептор/лиганд с лигандом, в частности, пептид или пептидный фрагмент подходящей длины.

Под «лигандом» следует понимать молекулу, которая имеет структуру, комплементарную структуре рецептора, и способна образовывать комплекс с этим рецептором. В некоторых вариантах осуществления, под лигандом следует понимать пептид или пептидный фрагмент, который имеет подходящую длину и подходящие связывающие мотивы в своей аминокислотной последовательности, так что пептид или пептидный фрагмент способен образовывать комплекс с белками MHC класса I или MHC класса II.

В некоторых вариантах осуществления, «комплекс рецептор/лиганд» также следует понимать как означающий «комплекс рецептор/пептид» или «комплекс рецептор/пептидный фрагмент», включая молекулу MHC класса I или класса II, презентирующую пептид или пептидный фрагмент.

Термин «мотив» относится к профилю остатков в аминокислотной последовательности определенной длины, например, пептиду длиной менее приблизительно 15 аминокислотных остатков или длиной менее приблизительно 13 аминокислотных остатков, например, от приблизительно 8 до приблизительно 13 аминокислотных остатков (например, 8, 9, 10, 11, 12 или 13) для мотива HLA класса I и от приблизительно 6 до приблизительно 25 аминокислотных остатков (например, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) для мотива HLA класса II, который распознается конкретной молекулой HLA. Мотивы обычно различны для каждого белка HLA, кодируемого данным аллелем HLA человека. Эти мотивы отличаются их профилями первичных и вторичных якорных остатков. В некоторых вариантах осуществления, мотив MHC класса I идентифицирует пептид длиной 9, 10 или 11 аминокислотных остатков.

Термин «идентичный» и его грамматические эквиваленты, используемые в настоящем изобретении, или «идентичность последовательностей» в контексте двух последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей полипептидов относятся к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия в пределах указанного окна сравнения. «Окно сравнения», в настоящем изобретении, относится к сегменту из по меньшей мере приблизительно 20 непрерывных положений, обычно от приблизительно 50 до приблизительно 200, чаще от приблизительно 100 до приблизительно 150, в котором последовательность может сравниваться с эталонной последовательностью из того же количества непрерывных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области техники. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить с помощью алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981); с помощью алгоритма выравнивания Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970); методом поиска сходства Pearson and Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444 (1988); с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов (включая, помимо прочего, CLUSTAL в программе PC/Gene от Intelligentics, Mountain View Calif., GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis., U.S.A.); программа CLUSTAL хорошо описана в Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244 (1988) и Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989); Corpet et al., Nucleic Acids Res., 16:10881-10890 (1988); Huang et al., Computer Applications in the Biosciences, 8:155-165 (1992); и Pearson et al., Methods in Molecular Biology, 24:307-331 (1994). Выравнивание также часто выполняют путем осмотра и выравнивания вручную. В одном классе вариантов осуществления, полипептиды в настоящем изобретении по меньшей мереимеют по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с эталонным полипептидом или его фрагментом, например, по данным BLASTP (или CLUSTAL, или любого другого доступного программного обеспечения для выравнивания) с использованием параметров по умолчанию. Точно так же, нуклеиновые кислоты также могут быть описаны со ссылкой на исходную нуклеиновую кислоту, например, они могут иметь 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с эталонной нуклеиновой кислотой или ее фрагментом, например, по данным BLASTN (или CLUSTAL, или любого другого доступного программного обеспечения для выравнивания) с использованием параметров по умолчанию. Если говорят, что одна молекула имеет определенную долю идентичности последовательности с большей молекулой, это означает, что, если две молекулы оптимально выровнены, указанная доля остатков в меньшей молекуле находит совпадающий остаток в большей молекуле в соответствии с порядком, которым две молекулы оптимально выровнены.

Термин «по существу идентичный» и его грамматические эквиваленты применительно к последовательностям нуклеиновой кислоты или аминокислоты означают, что последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислоты содержит последовательность, которая имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности или более, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% и по меньшей мере 99% по сравнению с эталонной последовательностью с использованием программ, описанных выше, например, BLAST, с использованием стандартных параметров. Например, программа BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) использует по умолчанию длину слова (W) 11, ожидание (E) 10, M=5, N=-4 и сравнение обеих цепочек. Для аминокислотных последовательностей, программа BLASTP использует по умолчанию длину слова (W) 3, ожидание (E) 10, и матрицу оценок BLOSUM62 (см. Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)). Долю идентичности последовательности определяют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, при этом часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. гэпы) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавления или делеции) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Доля рассчитывается путем определения количества положений, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты или аминокислотный остаток встречается в обеих последовательностях, чтобы получить количество совпадающих положений, путем деления количества совпадающих положений на общее количество положений в окне сравнения и умножения результата на 100 для получения доли идентичности последовательности. В вариантах осуществления, существенная идентичность существует в области последовательностей длиной, по меньшей мере приблизительно 50 остатков, в области по меньшей мере приблизительно 100 остатков, и в вариантах осуществления, последовательности по существу идентичны, по меньшей мере приблизительно в 150 остатках. В вариантах осуществления, последовательности по существу идентичны по всей длине кодирующих областей.

Используемый в настоящем изобретении термин «вектор» означает конструкцию, которая способна доставлять и обычно экспрессировать один или более представляющих интерес генов или последовательностей в клетке-хозяине. Примеры векторов включают, но не ограничены ими, вирусные векторы, векторы экспрессии «голой» ДНК или РНК, плазмидные, космидные или фаговые векторы, векторы экспрессии ДНК или РНК, связанные с катионными конденсирующими агентами, и векторы экспрессии ДНК или РНК, инкапсулированные в липосомы.

Полипептидом, антителом, полинуклеотидом, вектором, клеткой или композицией, которые «выделены», являются полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция, которые находятся в форме, не встречающейся в природе. Выделенные полипептиды, антитела, полинуклеотиды, векторы, клетки или композиции включают такие, которые были очищены до такой степени, что они больше не находятся в той форме, в которой они встречаются в природе. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция, которые выделены, являются по существу чистыми. В некоторых вариантах осуществления, «выделенный полинуклеотид» охватывает реакцию ПЦР или количественную ПЦР, включающую полинуклеотид, амплифицированный в результате реакции ПЦР или количественной ПЦР.

Термины «выделенный», «биологически чистый» или их грамматические эквиваленты относятся к материалу, который по существу или по существу свободен от компонентов, которые обычно сопровождают материал, поскольку он находится в нативном состоянии. Таким образом, выделенные пептиды, описанные в настоящем изобретении, не содержат некоторых или всех материалов, обычно связанных с пептидами в их среде in situ. «Выделенный» эпитоп относится к эпитопу, который не содержит всю последовательность антигена, из которого был получен эпитоп. Обычно «выделенный» эпитоп не имеет присоединенных к нему дополнительных аминокислотных остатков, что дает последовательность, которая имеет 100% идентичность по всей длине нативной последовательности. Нативной последовательностью может быть последовательность, такая как опухолеассоциированный антиген, из которой получен эпитоп. Таким образом, термин «выделенный» означает, что материал удален из его исходной среды (например, естественной среды, если он встречается в природе). «Изолированной» нуклеиновой кислотой является нуклеиновая кислота, удаленная из естественной среды. Например, встречающийся в природе полинуклеотид или пептид, присутствующий в живом организме, не выделяют, но выделяют тот же полинуклеотид или пептид, отделенный от некоторых или всех сосуществующих материалов в природной системе. Такой полинуклеотид может быть частью вектора, и/или такой полинуклеотид или пептид может быть частью композиции, и все же быть «выделенным» в том смысле, что такой вектор или композиция не является частью своего природного окружения. Выделенные молекулы РНК включают in vivo или in vitro РНК-транскрипты молекул ДНК, описанных в настоящем изобретении, и, кроме того, включают такие молекулы, полученные синтетическим путем.

Используемый в настоящем изобретении термин «по существу чистый» относится к продукту, который является, по меньшей мере 50% чистым (т. е. не содержит примесей), по меньшей мере 90% чистым, по меньшей мере 95% чистым, по меньшей мере 98% чистым или по меньшей мере 99% чистым.

«Трансфекция», «трансформация» или «трансдукция» в контексте настоящего описания относятся к введению одного или нескольких экзогенных полинуклеотидов в клетку-хозяина с использованием физических или химических способов. Многие способы трансфекции известны в данной области техники и включают, например, копреципитацию ДНК фосфатом кальция (см., например, Murray E. J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)); DEAE-декстран; электропорацию; катионную трансфекцию, опосредованную липосомами; бомбардировку микрочастицами с помощью частиц вольфрама (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); и копреципитацию ДНК фосфатом стронция (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)). Фаговые или вирусные векторы могут быть введены в клетки-хозяева после роста инфекционных частиц в подходящих упаковывающих клетках, многие из которых коммерчески доступны.

2. Улучшенное расщепление и его использование

Одним из критических препятствий на пути разработки лечебной и опухолеспецифической иммунотерапии является недостаточный процессинг и высвобождение минимальных эпитопов для презентации антигена для создания адекватных иммунных ответов. Процессинг и презентация антигена относятся к процессам, которые происходят в клетке, которые приводят к фрагментации или протеолизу белков, ассоциации белковых фрагментов или пептидов с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) и экспрессии пептид-MHC (pMHC) молекул на поверхности клетки для распознавания Т-клеточным рецептором (TCR) на Т-клетке. Презентация антигена опосредуется молекулами MHC класса I и молекулами MHC класса II, обнаруженными на поверхности антигенпрезентирующих клеток (APC) и некоторых других клеток. Молекулы MHC класса I и MHC класса II доставляют короткие пептиды на поверхность клетки, позволяя распознавать эти пептиды цитотоксическими (CD8⁺) и хелперными (CD4⁺) Т-клетками, соответственно. TCR может распознавать антиген только в форме пептида, связанного с молекулой MHC на поверхности клетки, и антигены, распознаваемые T-клетками, являются пептиды, которые возникают в результате разрушения макромолекулярных структур, развертывания отдельных белков и их расщепления на короткие фрагменты через процессинг антигена.

Презентация антигена на поверхности клетки требует правильного процессинга пептидов для высвобождения минимальных эпитопов протеасомами, аминопептидаз цитозольного и эндоплазматического ретикулума (ER), эффективного транспортера, ассоциированного с транспортом процессинга антигена (TAP), и достаточного связывания с молекулами MHC класса I. Эффективность создания эпитопа зависит не только от самого эпитопа, но также от его фланкирующих областей или аминокислотной последовательности, фланкирующей аминокислотную последовательность эпитопа. Эффективность процессинга минимального эпитопа из пептида, содержащего последовательность эпитопа и аминокислотную последовательность, фланкирующую последовательность эпитопа, полностью не изучена, но известно, что на нее влияют несколько факторов, включая конкретные аминокислотные остатки по обе стороны от сайта расщепления в пептиде. и другие конкурирующие сайты расщепления поблизости.

Одним из способов решения проблемы недостаточного процессинга и высвобождения минимального эпитопа является изучение и разработка конкретных аминокислотных остатков или последовательностей, которые могут быть добавлены к N- и/или C-концу последовательности эпитопа для усиления расщепления и процессинга пептидов и презентации эпитопов. Например, аминокислотные остатки или последовательности из других эпитопов, которые, как известно, эффективно процессируются, могут быть добавлены к последовательности эпитопа. Другим примером является использование аминокислотных остатков, которые, как известно, обычно наблюдаются вокруг эпитопов (Abelin, et al., 2017, Immunity 46, 315-326). Этот подход может дать дополнительные преимущества, включая облегчение производства (например, синтеза, очистки и/или составления) или более легкую последующую модификацию (например, конъюгацию с другими молекулами) пептидов.

Другим способом преодоления существующих препятствий для эффективного процессинга и высвобождения минимальных эпитопов является использование расщепляемого протеазой линкера для таргетирования пептида, содержащего эпитоп, для сайт-специфического процессинга протеазой для высвобождения эпитопа. Например, специфические линкеры, которые могут быть легко расщеплены внутри дендритных клеток (DC) с высвобождением минимальных последовательностей эпитопов, можно использовать для усиления CD8-зависимых иммунных ответов после вакцинации. Кроме того, эти пептиды не будут иметь неселективного связывания с молекулами МНС класса I на поверхности не профессиональных APC, и вместо этого будут проходить через специфические пути (например, эндоцитоз) для надлежащего процессинга и презентирования Т-клеткам. Еще одним примером обеспечения достаточного процессинга и презентации эпитопа является объединение двух стратегий, т.е. конкретных аминокислотных остатков и конкретных линкеров.

Изобретение относится к полипептиду, содержащему последовательность эпитопа, кодируемую геномом субъекта, аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая может кодироваться или не кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует последовательность эпитопа, в геноме субъекта, аминокислоту или аминокислотную последовательность и/или линкер. Добавление аминокислоты, аминокислотной последовательности и/или линкера к последовательности эпитопа может усилить процессинг эпитопа и презентацию APC для создания иммунного ответа. В одном аспекте, аминокислотой или аминокислотной последовательностью является аминокислотная последовательность или пептидная последовательность. В одном варианте осуществления, аминокислотная последовательность или пептидная последовательность не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует последовательность эпитопа. В другом варианте осуществления, аминокислота или аминокислотная последовательность является непрерывной с последовательностью эпитопа и кодируется геномом субъекта, который кодирует последовательность эпитопа. Например, аминокислота или аминокислотная последовательность, непрерывная с последовательностью эпитопа, может содержать один или более аминокислотных остатков, которые усиливают расщепление полипептида (например, лизина). В таком варианте осуществления, полипептид может содержать аминокислоту или аминокислотную последовательность, непрерывную с последовательностью эпитопа, и может дополнительно содержать аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует последовательность эпитопа в геноме субъекта.

В некоторых вариантах осуществления, эпитоп презентируется MHC класса I APC. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп презентируется MHC класса II APC. В некоторых вариантах осуществления, каждая аминокислота эпитопа является аминокислотой пептидной последовательности, содержащей любую непрерывную аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты в геноме субъекта. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп содержит от 8 до 12 непрерывных аминокислотных остатков и презентируется MHC класса I APC. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп содержит 8, 9, 10, 11 или 12 непрерывных аминокислотных остатков и презентируется MHC класса I APC. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп содержит от 9 до 25 непрерывных аминокислотных остатков и презентируется MHC класса II APC. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп содержит 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 непрерывных аминокислотных остатков и презентируется MHC класса II АРС. В некоторых вариантах осуществления, последовательность эпитопа содержит 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 непрерывных аминокислотных остатков из которых одна из несколько из 13-25 аминокислот, необязательно присутствуют и, по меньшей мере одна аминокислота является мутантной аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления, последовательность эпитопа содержит AA₁AA₂AA₃AA₄AA₅AA₆AA₇AA₈AA₉AA₁₀AA₁₁AA₁₂AA₁₃AA₁₄AA₁₅AA₁₆AA₁₇AA₁₈AA₁₉AA₂₀AA₂₁AA₂₂AA₂₃AA₂₄AA₂₅, где каждая AA является аминокислотой, и одна или несколько из AA₉, AA₁₀, AA₁₁, AA₁₂, AA₁₃, AA₁₄, AA₁₅, AA₁₆, AA₁₇, AA₁₈, AA₁₉, AA₂₀, AA₂₁, AA₂₂, AA₂₃, AA₂₄ и AA₂₅ необязательно присутствуют, и, по меньшей мере одна AA является мутантной аминокислотой.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, содержащий последовательность эпитопа и аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая является непрерывной с последовательностью эпитопа и кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует эпитоп, в геноме субъекта, может не содержать линкер. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, содержащий последовательность эпитопа и аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая является непрерывной с последовательностью эпитопа и кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует эпитоп в геноме субъекта, может содержать линкер. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, содержащий последовательность эпитопа и аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует последовательность эпитопа, может дополнительно содержать линкер. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, содержащий последовательность эпитопа и аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует последовательность эпитопа, может не содержат линкер.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота или аминокислотная последовательность содержит от 0 до 1000 аминокислотных остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления, аминокислота или аминокислотная последовательность, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, содержит от 0 до 1000 аминокислотных остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления, аминокислота или аминокислотная последовательность, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, содержит от 0 до 1000 аминокислотных остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления аминокислота или аминокислотная последовательность содержит более 0, более 1, более 2, более 3, более 4, более 5, более 6, более 7, более 8, более 9, более 10, более 15, более 20, более 25, более 30, более 35, более 40, более 45, более 50, более 55, более 60, более 65, более 70, более 75, более 80, более 85, более 90, более 95, более 100, более 150, более 200, более 250, более 300, более 350, более 400, более 450, более 500, более 550, более 600, более 650, более 700, более 750, более 800, более 850, более 900 или более 950 аминокислотных остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления, аминокислота или аминокислотная последовательность, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, содержит более 0, более 1, более 2, более 3, более 4, более 5, более 6, более 7, более 8, более 9, более 10, более 15, более 20, более 25, более 30, более 35, более 40, более 45, более 50, более 55, более 60, более 65, более 70, более 75, более 80, более 85, более 90, более 95, более 100, более 150, более 200, более 250, более 300, более 350, более 400, более 450, более 500, более 550, более 600, более 650, более 700, более 750, более 800, более 850, более 900 или более 950 аминокислотных остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления, аминокислота или аминокислотная последовательность, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, содержит более 0, более 1, более 2, более 3, более 4, более 5, более 6, более 7, более 8, более 9, более 10, более 15, более 20, более 25, более 30, более 35, более 40, более 45, более 50, более 55, более 60, более 65, более 70, более 75, более 80, более 85, более 90, более 95, более 100, более 150, более 200, более 250, более 300, более 350, более 400, более 450, более 500, более 550, более 600, более 650, более 700, более 750, более 800, более 850, более 900 или более 950 аминокислотных остатков в длину.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота или аминокислотная последовательность содержит 1-5 или 7-1000 аминокислотных остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления аминокислота или аминокислотная последовательность не содержит 6 аминокислотных остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления, аминокислота или аминокислотная последовательность пептидной последовательности, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, содержит 1-5 или 7-1000 аминокислотных остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления, аминокислота или аминокислотная последовательность пептидной последовательности, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, не содержит 6 аминокислотных остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления, аминокислота или аминокислотная последовательность пептидной последовательности, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, содержит 1-4 или 6-1000 аминокислотных остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления, аминокислота или аминокислотная последовательность пептидной последовательности, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, не содержит 5 аминокислотных остатков в длину.

В некоторых вариантах осуществления полипептид дополнительно содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не состоит из четырех различных эпитопов, презентированных МНС класса I. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не содержит четырех различных эпитопов, презентированных MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит по меньшей мере два разных эпитопа, презентированных МНС класса I. В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит по меньшей мере три по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть различных эпитопов, презентированных МНС класса I. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп содержит по меньшей мере одну мутантную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна мутантная аминокислота кодируется вставкой, делецией, сдвигом рамки считывания, неоORF или точечной мутацией в последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта. В некоторых вариантах осуществления, аминокислота или аминокислотная последовательность пептидной последовательности, которая не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже или выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, отщепляется от эпитопа, если полипептид обрабатывается APC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит по меньшей мере две разные полипептидные молекулы. В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит по меньшей мере три по меньшей мере четыре или по меньшей мере пять разных полипептидных молекул.

В некоторых вариантах осуществления, настоящее описание содержит полипептид, содержащий аминокислоту или аминокислотную последовательность пептидной последовательности, которая не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже или выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп и/или линкер. Аминокислота или аминокислотная последовательность и/или линкер могут придавать полипептиду желаемые свойства, такие как повышенная растворимость, стабильность, иммуногенность, процессинг антигена или презентация антигена. В некоторых вариантах осуществления, полипептид может содержать аминокислоту или аминокислотную последовательность, которые усиливают процессинг и презентацию эпитопов APC, например, для создания иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления, полипептид может содержать аминокислоту или аминокислотную последовательность либо на N-, либо на С-конце последовательности эпитопа. В некоторых вариантах осуществления, аминокислота или аминокислотная последовательность могут содержать полилизин (поли-Lys или полиК) или полиаргинин (поли-Arg или полиR). В некоторых вариантах осуществления, аминокислота или аминокислотная последовательность могут быть из полипептидной последовательности белка, не экспрессированного у субъекта, экспрессирующей эпитоп (например, не кодированный геномом субъекта, кодирующим последовательность эпитопа). В другом варианте осуществления, полипептид может содержать линкер, расщепляемый протеазой. В некоторых вариантах осуществления, полипептид может содержать как расщепляемый протеазой линкер, так и аминокислоту или аминокислотную последовательность. В некоторых вариантах осуществления, изобретение относится к полипептид формулы (I), (II), (III) и/или (IV) или фармацевтически приемлемая соль полипептида формулы (I), (II), (III) и/или (IV), где стереохимия не определена, например, рацемат или смесь диастереомеров или отдельных диастереомеров. Специалисту в данной области техники известно, что на любой стадии получения соединений формулы (I), (II), (III) и/или (IV), смеси изомеров (например, рацематы) соединений, соответствующих любой из формул (I), (II), (III), и/или может быть использованы. На любой стадии получения, единственный стереоизомер может быть получен путем его выделения из смеси изомеров (например, рацемата) с использованием, например, хирального хроматографического разделения.

В некоторых вариантах осуществления, линкер содержит не полипептидный линкер. В некоторых вариантах осуществления, линкер содержит химический линкер. В некоторых вариантах осуществления, линкер содержит не природную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления, не природная аминокислота содержит β -γ-δ-аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления, не природная аминокислота содержит производные L-α-аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, линкер не содержит аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления, линкер не содержит природную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления, линкер содержит связь, отличную от пептидной связи. В некоторых вариантах осуществления, линкер содержит дисульфидную связь. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, описанный в настоящем изобретении, содержит более одного линкера. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, описанный в настоящем изобретении, содержит первый линкер и второй линкер, где первый линкер находится на N-конце эпитопа, и второй линкер находится на С-конце эпитопа. В некоторых вариантах осуществления, первый линкер и второй линкер являются разными. В некоторых вариантах осуществления, первый линкер и второй линкер являются одинаковыми.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит гидрофильный хвост. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, содержащий эпитопную последовательность, аминокислоту или аминокислотную последовательность пептидной последовательности, которая не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже или выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп и/или линкер, обладает повышенной растворимостью по сравнению с полипептидом, содержащим ту же последовательность эпитопа без аминокислоты или аминокислотной последовательности и/или линкера. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, содержащий последовательность эпитопа и аминокислоту или аминокислотную последовательность, непрерывную с последовательностью эпитопа, кодированной последовательностью нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, обладает повышенной растворимостью по сравнению с полипептидом, содержащим ту же последовательность эпитопа, но без аминокислоты или последовательности аминокислот. Например, аминокислота или аминокислотная последовательность, примыкающая к последовательности эпитопа, может содержать один или более аминокислотных остатков, повышающих растворимость полипептида (например, лизина). В таком варианте осуществления, полипептид может содержать аминокислоту или аминокислотную последовательность, непрерывную с последовательностью эпитопа, и может дополнительно содержать аминокислоту или аминокислотную последовательность пептидной последовательности, которая не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже или выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп.

В некоторых вариантах осуществления, эпитоп высвобождается из полипептида, содержащего последовательность эпитопа, если полипептид процессируется APC. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп высвобождается с более высокой скоростью, если полипептид дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп и/или линкер, по сравнению с полипептидом, который содержит тот же эпитоп, но не содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп и/или линкер. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп высвобождается с более высокой скоростью, если полипептид дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, который кодирует эпитоп и/или линкер, по сравнению с полипептидом, который содержит тот же эпитоп, но не содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно после последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, и/или линкер. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп высвобождается с более высокой скоростью, если аминокислота или аминокислотная последовательность не относится к пептидной последовательности белка, экспрессируемого у субъекта. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп высвобождается с более высокой скоростью, если полипептид содержит линкер, по сравнению с полипептидом, который содержит тот же эпитоп, но не содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп высвобождается с более высокой скоростью, если полипептид содержит линкер, который расщепляется протеазой, по сравнению с полипептидом, который содержит тот же эпитоп, но не содержит линкер, который расщепляется протеазой.

В некоторых вариантах осуществления, эпитоп высвобождается с более высокой скоростью, если полипептид, содержащий эпитоп и аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, и/или линкер, по сравнению с соответствующим полипептидом, который содержит тот же эпитоп и аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, но не содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп и/или линкер.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется с более высокой скоростью, если полипептид содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп и/или линкер, по сравнению с соответствующим полипептидом такой же длины и эпитопом, и аминокислота или аминокислотная последовательность кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется с более высокой скоростью, если полипептид содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп и/или линкер, по сравнению с соответствующим полипептидом такой же длины и эпитопом, и аминокислота или аминокислотная последовательность кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется с более высокой скоростью, если аминокислота или аминокислотная последовательность не принадлежит пептидной последовательности белка, экспрессируемого у субъекта. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется с более высокой скоростью, если полипептид содержит линкер, по сравнению с полипептидом, который содержит тот же эпитоп, но не содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется с более высокой скоростью, если полипептид содержит линкер, который расщепляется протеазой, по сравнению с полипептидом, который содержит тот же эпитоп, но не содержит линкер, который расщепляется протеазой.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется с более высокой скоростью, если полипептид дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида такой же длины, который содержит последовательность эпитопа и аминокислоту или аминокислотную последовательность, непрерывную с последовательностью эпитопа, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты и не содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется с более высокой скоростью, если полипептид дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида такой же длины, который содержит последовательность эпитопа и аминокислоту или аминокислотную последовательность, непрерывную с последовательностью эпитопа, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты и не содержит линкер.

[0151] В некоторых вариантах осуществления полипептид расщепляется с более высокой скоростью, если полипептид содержит (i) аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, и (ii) аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, и/или (iii) линкер по сравнению с соответствующим полипептидом той же длины и эпитопом и аминокислотой или аминокислотной последовательностью, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется в линкерной области, если полипептид процессируется APC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется в линкерной области с более высокой скоростью, если полипептид дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп и линкер, по сравнению с соответствующим полипептидом такой же длины и эпитопом, и аминокислота или аминокислотная последовательность кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется в линкерной области с более высокой скоростью, если полипептид дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп и линкер, по сравнению с соответствующим полипептидом такой же длины и эпитопом, и аминокислота или аминокислотная последовательность кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется в линкерной области с более высокой скоростью, если аминокислота или аминокислотная последовательность не относится к пептидной последовательности белка, экспрессируемого у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления, презентация эпитопа APC усиливается, если полипептид процессируется APC. В некоторых вариантах осуществления, презентация эпитопа APC усиливается, если полипептид, содержащий эпитоп, дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп и/или линкер, по сравнению с соответствующим полипептидом такой же длины и эпитопом, и аминокислота или аминокислотная последовательность кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп. В некоторых вариантах осуществления, презентация эпитопа APC усиливается, если полипептид, содержащий эпитоп, дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп и/или линкер, по сравнению с соответствующим полипептидом такой же длины и эпитопом, и аминокислота или аминокислотная последовательность кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп. В некоторых вариантах осуществления, презентация эпитопа APC усиливается, если аминокислота или аминокислотная последовательность не являются пептидной последовательностью белка, экспрессируемого у субъекта. В некоторых вариантах осуществления, презентация эпитопа APC усиливается, если полипептид содержит линкер, по сравнению с полипептидом, который содержит тот же эпитоп, но не содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления, презентация эпитопа APC усиливается, если полипептид содержит линкер, расщепляемый протеазой, по сравнению с полипептидом, который содержит тот же эпитоп, но не содержит линкер, расщепляемый протеазой.

В некоторых вариантах осуществления презентация эпитопа APC усиливается, если полипептид дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида той же длины, который содержит последовательность эпитопа и аминокислоту или аминокислотную последовательность, непрерывную с последовательностью эпитопа, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, и не содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления, презентация эпитопа APC усиливается, если полипептид дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида той же длины, который содержит последовательность эпитопа и аминокислоту или аминокислотную последовательность, непрерывную с последовательностью эпитопа, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, и не содержит линкер.

В некоторых вариантах осуществления, презентация эпитопа APC усиливается, если полипептид содержит (i) аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, и (ii) аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, и/или (iii) линкер, по сравнению с соответствующим полипептидом такой же длины и эпитопом, и аминокислота или аминокислотная последовательность кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп.

В некоторых вариантах осуществления, иммуногенность повышается, если полипептид процессируется APC. В некоторых вариантах осуществления, иммуногенность повышается, если полипептид, содержащий эпитоп, дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп и/или линкер, по сравнению с соответствующим полипептидом той же длины и эпитопом, и аминокислота или аминокислотная последовательность кодируются последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп. В некоторых вариантах осуществления, иммуногенность повышается, если полипептид, содержащий эпитоп, дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп и/или линкер, по сравнению с соответствующим полипептидом той же длины и эпитопом, и аминокислота или аминокислотная последовательность кодируются последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп. В некоторых вариантах осуществления, иммуногенность повышается, если аминокислота или аминокислотная последовательность не являются пептидной последовательностью белка, экспрессируемого у субъекта. В некоторых вариантах осуществления, иммуногенность повышается, если полипептид содержит линкер, по сравнению с полипептидом, который содержит тот же эпитоп, но не содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления иммуногенность повышается, если полипептид содержит линкер, расщепляемый протеазой, по сравнению с полипептидом, который содержит тот же эпитоп, но не содержит линкер, расщепляемый протеазой.

В некоторых вариантах осуществления, иммуногенность повышается, если полипептид дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида такой же длины, который содержит последовательность эпитопа и аминокислоту или аминокислотную последовательность, непрерывную с последовательностью эпитопа, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, и не содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления, иммуногенность усиливается, если полипептид дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида такой же длины, который содержит последовательность эпитопа и аминокислоту или аминокислотную последовательность, непрерывную с последовательностью эпитопа, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, и не содержит линкер.

В некоторых вариантах осуществления, иммуногенность усиливается, если полипептид содержит (i) аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, и (ii) аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, и/или (iii) линкер, по сравнению с соответствующим полипептидом такой же длины и эпитопом, и аминокислота или аминокислотная последовательность кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп.

В некоторых вариантах осуществления, противоопухолевая активность усиливается, если полипептид процессируется APC. В некоторых вариантах осуществления, противоопухолевая активность APC усиливается, если полипептид, содержащий эпитоп, дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп и/или линкер, по сравнению с соответствующим полипептидом такой же длины и эпитопом, и аминокислота или аминокислотная последовательность, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп. В некоторых вариантах осуществления, противоопухолевая активность усиливается, если полипептид, содержащий эпитоп, дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геном субъекта, которая кодирует эпитоп и/или линкер, по сравнению с соответствующим полипептидом такой же длины и эпитопом, и аминокислота или аминокислотная последовательность кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, кодирующей эпитоп. В некоторых вариантах осуществления, противоопухолевая активность усиливается, если аминокислота или аминокислотная последовательность не относится к пептидной последовательности белка, экспрессируемого у субъекта. В некоторых вариантах осуществления, противоопухолевая активность усиливается, если полипептид содержит линкер, по сравнению с полипептидом, который содержит тот же эпитоп, но не содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления, противоопухолевая активность усиливается, если полипептид содержит линкер, который расщепляется протеазой, по сравнению с полипептидом, который содержит тот же эпитоп, но не содержит линкер, который расщепляется протеазой.

В некоторых вариантах осуществления, противоопухолевая активность усиливается, если полипептид дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида той же длины, который содержит последовательность эпитопа и аминокислоту или аминокислотную последовательность, непрерывную с последовательностью эпитопа, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, и не содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления противоопухолевая активность усиливается, если полипептид дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая не содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида той же длины, который содержит последовательность эпитопа и аминокислоту или аминокислотную последовательность, непрерывную с последовательностью эпитопа, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, и не содержит линкер.

В некоторых вариантах осуществления, противоопухолевая активность усиливается, если полипептид содержит (i) аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, и (ii) аминокислота или аминокислотная последовательность, которая не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп, и/или (iii) линкер, по сравнению с соответствующим полипептидом такой же длины и эпитопом, и аминокислота или аминокислотная последовательность кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп.

В некоторых вариантах осуществления, APC презентирует эпитоп к иммунной клетке, если полипептид процессируется APC. В некоторых вариантах осуществления, APC презентирует эпитоп предпочтительно или специфически к иммунной клетке, если полипептид процессируется APC. В некоторых вариантах осуществления, APC презентирует эпитоп к фагоцитарной клетке, если полипептид процессируется APC. В некоторых вариантах осуществления, APC презентирует эпитоп предпочтительно или специфически к фагоцитарной клетке, если полипептид процессируется APC. В некоторых вариантах осуществления, APC презентирует эпитоп к дендритной клетке, макрофагу, тучной клетке, нейтрофилу или моноциту, если полипептид процессируется APC. В некоторых вариантах осуществления, APC презентирует эпитоп предпочтительно или специфически к дендритной клетке, макрофагу, тучной клетке, нейтрофилу или моноциту.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из поли-Lys (полиK) и поли-Arg (полиR). В предпочтительном варианте полипептид содержит полиК-последовательность. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из полиК-АА-АА и полиR-АА-АА, где каждая АА является аминокислотой или ее аналогом или производным. В предпочтительном варианте, полипептид содержит полиК-АА-АА. В некоторых вариантах осуществления, полиК содержит поли-L-Lys. В некоторых вариантах осуществления, полиК содержит по меньшей мере два непрерывных лизиновых остатка. В некоторых вариантах осуществления, полиК содержит по меньшей мере три непрерывных лизиновых остатка, например, Lys-Lys-Lys. В предпочтительном варианте осуществления, полиК содержит по меньшей мере четыре непрерывных лизиновых остатка(SEQ ID NO: 1), например, Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 1), также известные как K4 (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах осуществления, полиК содержит по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять или по меньшей мере 10 последовательных лизиновых остатков (SEQ ID NO: 305). В некоторых вариантах осуществления, полиR содержит поли-L-Arg. В некоторых вариантах осуществления, полиR содержит по меньшей мере два непрерывных аргининовых остатка. В некоторых вариантах осуществления, полиR содержит по меньшей мере три непрерывных аргининовых остатка, например, Arg-Arg-Arg. В некоторых вариантах осуществления, полиR содержит по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть или по меньшей мере семь непрерывных аргининовых остатков (SEQ ID NO: 306). В некоторых вариантах осуществления, полиR содержит по меньшей мере восемь непрерывных аргининовых остатков (SEQ ID NO: 307), например, Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg (SEQ ID NO: 307), также известные как R8 (SEQ ID NO: 307). В некоторых вариантах осуществления, полиR содержит по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять или по меньшей мере 10 последовательных аргининовых остатков (SEQ ID NO: 308). В некоторых вариантах осуществления, каждая из лизиновых единиц в полиК и/или аргининовых единиц в полиR может иметь (L) стереохимическую конфигурацию, (D) стереохимическую конфигурацию или любую смесь (L) и (D) стереохимической конфигурации.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит линкер, выбранный из группы, состоящей из дисульфида, п-аминобензилоксикарбонила (PABC) и AA-AA-PABC, где AA является аминокислотой или ее аналогом или производным. В некоторых вариантах осуществления, AA-AA-PABC выбран из группы, состоящей из аланин-лизин-PABC (Ala-Lys-PABC), валин-цитруллин-PABC (Val-Cit-PABC) и фенилаланин-лизин-PABC (Phe -Lys-PABC). В некоторых вариантах осуществления, AA-AA-PABC является Ala-Lys-PABC. В некоторых вариантах осуществления, AA-AA-PABC является Val-Cit-PABC. В некоторых вариантах осуществления, AA-AA-PABC является Phe-Lys-PABC. В некоторых вариантах осуществления, каждая из валиновых и цитруллиновых единиц в Val-Cit-PABC имеет стереохимическую конфигурацию (L). В некоторых вариантах осуществления, каждая из фенилаланиновых и лизиновых единиц в Phe-Lys-PABC имеет (L) стереохимическую конфигурацию. В некоторых вариантах осуществления, каждая из валиновых и цитруллиновых единиц в Val-Cit-PABC имеет (D) стереохимическую конфигурацию. В некоторых вариантах осуществления, каждая из фенилаланиновых и лизиновых единиц в Phe-Lys-PABC имеет (D) стереохимическую конфигурацию. В некоторых вариантах осуществления, валиновые и цитруллиновые единицы в Val-Cit-PABC имеют смешанную (L) и (D) стереохимическую конфигурацию. В некоторых вариантах осуществления, фенилаланиновые и лизиновые единицы в Phe-Lys-PABC имеют смешанную (L) и (D) стереохимическую конфигурацию.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит линкер, имеющий следующую структуру:

Формула (II).

В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит линкер, который является

Формула (III) или

Формула (IV),

где R₁ и R₂ независимо являются H или (C₁-C₆) алкилом; j равно 1 или 2; G₁ является Н или СООН; и i равно 1, 2, 3, 4 или 5.

В некоторых вариантах осуществления, A_r и/или A_s являются формулой (III) или формулой (IV), в которой R₁ и R₂ независимо являются H или (C₁-C₆) алкилом; j равно 1 или 2; G¹является H или COOH; и i равно 1, 2, 3, 4 или 5.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит линкер формулы (III) или формулы (IV).

Дисульфидные линкеры формулы (IV) могут быть синтезированы согласно Zhang, Donglu, et al., ACS Med. Chem. Lett. 2016, 7, 988-993; и Pillow, Thomas H., et al., Chem. Sci., 2017, 8, 366-370. PABC-содержащие пептиды могут быть синтезированы согласно Laurent Ducry (ed.), Antibody-Drug Conju gates, Methods in Molecular Biology, vol. 1045, DOI 10.1007/978-1-62703-541-5_5, Springer Science+Business Media, LLC 2013. В некоторых вариантах осуществления, можно использовать любые смолы, изготовленные для твердофазного синтеза пептидов.

Пути процессинга антигена

Описанный в настоящем изобретении полипептид может подвергаться процессингу различными путями для высвобождения эпитопа для презентации эпитопа. Для создания оптимальных пептидных антигенов в пути процессинга и презентации антигена существуют два ключевых события процессинга. Цитозольные белки в основном процессируются протеасомами. Затем короткие пептиды транспортируются в эндоплазматический ретикулум (ER) с помощью транспортера, связанного с процессингом антигена (TAP), для последующей сборки с молекулами MHC класса I. Экзогенные белки в основном презентируются молекулами МНС класса II. Антигены интернализуются несколькими путями, включая фагоцитоз, макропиноцитоз и эндоцитоз, и в конечном итоге переносятся в зрелый или поздний эндосомальный компартмент, где они процессируются и загружаются в молекулы MHC класса II. Цитоплазматические/ядерные антигены также могут быть доставлены в эндосомальную сеть посредством аутофагии для последующего процессинга и презентирования молекулами MHC класса II.

Первоначальный протеолиз пептидов происходит в цитозоле клетки и расщепляет более крупные фрагменты белка на более мелкие пептиды протеасомой или иммунопротеасомой. Это событие процессинга часто отвечает за образование последнего C-концевого остатка пептидов, которые связываются с MHC класса I. Протеасомой является большой протеолитический комплекс, который содержит несколько субъединиц, включая две субъединицы, большую многофункциональную протеазу (LMP) 2 и LMP7. Белки, связанные для деградации, таргетированы на протеасому за счет ковалентной связи с убиквитином. LMP2 и LMP7 индуцируют протеолитический комплекс создавать пептиды, которые связываются с MHC I класса I. Пептиды, образующиеся в цитозоле, затем транспортируются через TAP в ER. Поскольку TAP предпочтительно транспортирует пептиды из 11-14 аминокислот, пептиды часто являются слишком длинными для стабильного связывания MHC класса I и требуют дальнейшего процессинга при попадании в ER. Этот процессинг содержит обрезку N-концевой области антигенных пептидов аминопептидазой эндоплазматического ретикулума (ERAP) 1 и ERAP2. Этот процесс создает пул пептидов, которые имеют высокое сродство для ассоциации MHC класса I.

В нормальных клеточных средах классические молекулы МНС класса II экспрессируются только на профессиональных APC, таких как дендритные клетки (DC) или макрофаги. Экзогенные или внеклеточные антигены, которые интернализуются фагоцитозом, эндоцитозом или пиноцитозом, преимущественно презентируются на MHC класса II к CD4+ Т-клеткам. Однако небольшое подмножество цитозольных антигенов также экспрессируется на MHC класса II в результате аутофагии. Коротко, эндоцитозированные антигены процессируются в везикулярном пути, состоящем из все более кислых и протеолитически активных компартментов, классически описываемых как ранние эндосомы (pH 6,0 - pH 6,5), поздние эндосомы или эндолизосомы (pH 5,0 - pH 6,0) и лизосомы (pH 4,5 - рН 5,0). Антигены, интернализированные фагоцитозом, следуют сходным путем, оканчиваясь в фаголизосомах, образованных путем слияния фагосом и лизосом. Лизосомы и фаголизосомы (рН 4,0 - рН 4,5) содержат ряд кислых протеаз с оптимальным рН, обычно называемых катепсинами. В сильно деградирующих клетках, таких как макрофаги, последовательное расщепление этими ферментами приводит к очень коротким пептидам и свободным аминокислотам, которые перемещаются в цитозоль для пополнения тРНК для синтеза нового белка. В APC, которые менее протеолитически активны, более крупные промежуточные соединения образуют доминирующий источник пептидов для связывания MHC класса II, и эти пептиды обычно состоят из 13-18 аминокислот.

MHC и класса I и класса II могут получать доступ к пептидам, процессируемым из эндогенных и экзогенных антигенов. Например, MHC класса II связывают пептиды, полученные из эндогенных мембранных белков, которые деградируют в лизосоме. Точно так же, MHC класса I может связывать пептиды, полученные из экзогенных белков, интернализованных эндоцитозом или фагоцитозом, феномен, называемый перекрестной презентацией. Конкретные подмножества DC особенно хорошо опосредуют этот процесс, который критически важен для инициирования первичного ответа наивными CD8+ Т-клетками.

В одном аспекте, изобретение относится к способу расщепления полипептида, включающий контакт полипептида, описанного в настоящем изобретении, с APC. В некоторых вариантах осуществления, способ можно проводить in vivo. В некоторых вариантах осуществления, способ можно проводить in vitro.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован перед расщеплением. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован перед протеасомным и/или иммунопротеасомным процессингом. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован по лизиновому остатку. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован по лизиновому остатку, которого нет в последовательности эпитопа. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован по лизиновому остатку на полиК. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован на первом лизине на полиК. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован на втором лизине на полиК. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован на третьем лизине на полиК. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован на четвертом лизине на полиК. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован на пятом, шестом, седьмом, восьмом, девятом или десятом лизине на полиК. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован, по меньшей мере на одном лизиновом остатке. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован более чем на одном лизиновом остатке. В некоторых вариантах осуществления полипептид, убиквитинирован более чем на одном лизиновом остатке на полиК. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован на каждом лизиновом остатке. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован на каждом лизиновом остатке на полиК. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован на двух лизиновых остатках на полиК. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован на трех лизиновых остатках на полиК. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован на четырех лизиновых остатках на полиК. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован на пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти лизиновых остатках на полиК. В некоторых вариантах осуществления, полипептид последовательно убиквитинирован на каждом лизиновом остатке на полиК. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не подвергается последовательному убиквитинированию каждого лизинового остатка на полиK.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован на лизиновом остатке на Ala-Lys-PABC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован на лизиновом остатке на Phe-Lys-PABC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит полиK и AA-AA-PABC, где каждая AA является аминокислотой, ее аналогом или производным. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован на по меньшей мере одном лизиновом остатке на полиK и AA-AA-PABC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован на одном или нескольких лизиновых остаткам на полиK и AA-AA-PABC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован на одном или нескольких лизиновых остатках на полиK и Ala-Lys-PABC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид убиквитинирован на одном или нескольких лизиновых остатках на полиK и Phe-Lys-PABC.

В некоторых вариантах осуществления полипептид интернализуется APC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид интернализуется APC посредством эндоцитоза. В некоторых вариантах осуществления, полипептид интернализуется APC посредством фагоцитоза. В некоторых вариантах осуществления, полипептид интернализуется APC посредством пиноцитоза. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется в цитоплазме. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется в эндосоме. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется в эндолизосоме. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется в лизосоме. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется в ER. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется аминопептидазой. В некоторых вариантах осуществления, аминопептидазой является регулируемая инсулином аминопептидаза (IRAP). В некоторых вариантах осуществления, аминопептидазой является аминопептидаза эндоплазматического ретикулума (ERAP). В некоторых вариантах осуществления, полипептид процессируется трипсиноподобным доменом протеасомы и/или иммунопротеасомы. В некоторых вариантах осуществления, трипсиноподобный домен обладает трипсиноподобной активностью. В некоторых вариантах осуществления, трипсиноподобный домен обладает химотрипсиноподобной активностью. В некоторых вариантах осуществления, трипсиноподобная активность включает активность пептидилглутамилпептидгидролазы (PGPH). В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется протеазой. В некоторых вариантах осуществления, протеазой является трипсиноподобная протеаза. В некоторых вариантах осуществления, протеазой является химотрипсиноподобная протеаза. В некоторых вариантах осуществления, протеазой является пептидилглутамилпептидгидролаза (PGPH). В некоторых вариантах осуществления, протеаза выбрана из группы, состоящей из аспарагинпептидлиазы, аспарагиновой протеазы, цистеинпротеазы, глутаминовой протеазы, металлопротеазы, серинпротеазы и треонинпротеазы. В предпочтительном варианте осуществления, протеазой является цистеинпротеаза. В некоторых вариантах осуществления, цистеинпротеаза выбрана из группы, состоящей из кальпаина, каспазы, катепсина B, катепсина C, катепсина F, катепсина H, катепсина K, катепсина L1, катепсина L2, катепсина O, катепсина S, катепсина W и катепсина Z. В некоторых вариантах осуществления, протеазой является катепсин B. В некоторых вариантах осуществления, протеазой является катепсин C. В некоторых вариантах осуществления, протеазой является катепсин F. В некоторых вариантах осуществления, протеазой является катепсин Z.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется на лизиновом остатке. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется на лизиновом остатке на полиK. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется на первом лизиновом остатке на полиK. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется на втором лизиновом остатке на полиK. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется на третьем лизиновом остатке на полиK. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется на четвертом лизиновом остатке на полиK. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется на пятом, шестом, седьмом, восьмом, девятом или десятом лизиновом остатке на полиK. В некоторых вариантах осуществления, полипептид имеет уходит на более чем одном лизиновом остатке на полиK. В некоторых вариантах осуществления, полипептид уходит на каждом лизиновом остатке на полиK. В некоторых вариантах осуществления, полипептид последовательно расщепляется на каждом лизиновом остатке на полиK. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не расщепляется последовательно на каждом лизиновом остатке на полиK.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется на AA-AA-PABC, где каждая AA является аминокислотой или ее аналогом или производным. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется на Ala-Lys-PABC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется на лизиновом остатке в Ala-Lys-PABC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется на Phe-Lys-PABC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется на лизиновом остатке в Phe-Lys-PABC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется на Val-Cit-PABC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид расщепляется на цитруллиновом остатке (Cit) в Val-Cit-PABC. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп высвобождается при расщеплении полипептида.

Одним из основных недостатков пептидных лекарственных средств, ограничивающих их системное терапевтическое применение, является протеолитическая деградация пептидов. Пептиды, вводимые путем инъекции, достигают кровотока, в котором содержатся протеазы, участвующие в гемостазе, фибринолизе и преобразовании тканей, т.е. в важных процессах в случае повреждения. Таким образом, важно стабилизировать пептид против протеаз, присутствующих в крови, сыворотке или плазме. В одном аспекте, описанный в настоящем изобретении полипептид стабилен в плазме, крови и/или сыворотке. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не расщепляется перед интернализацией APC в субъекте. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не расщепляется перед процессингом APC в субъекте. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не расщепляется в крови субъекта до интернализации APC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не расщепляется в крови субъекта до процессинга APC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не расщепляется протеазой крови. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не расщепляется плазмином. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не расщепляется калликреином плазмы. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не расщепляется тканевым калликреином. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не расщепляется тромбином. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не расщепляется фактором свертывания крови. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не расщепляется фактором XII свертывания крови. В некоторых вариантах осуществления, полипептид стабилен в плазме человека. В некоторых вариантах осуществления, полипептид стабилен в крови человека. В некоторых вариантах осуществления, полипептид стабилен в сыворотке крови человека.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид имеет период полужизни в плазме человека от 1 часа до 5 дней. В некоторых вариантах осуществления, полипептид имеет период полужизни от приблизительно 1 часа до приблизительно 120 часов. В некоторых вариантах осуществления, полипептид имеет период полужизни от приблизительно 1 часа до приблизительно 5 часов, от приблизительно 1 часа до приблизительно 10 часов, от приблизительно 1 часа до приблизительно 12 часов, от приблизительно 1 часа до приблизительно 24 часов, от приблизительно 1 часа до приблизительно 36 часов. от приблизительно 1 часа до приблизительно 48 часов, от приблизительно 1 часа до приблизительно 60 часов, от приблизительно 1 часа до приблизительно 72 часов, от приблизительно 1 часа до приблизительно 84 часов, от приблизительно 1 часа до приблизительно 96 часов, от приблизительно 1 часа до приблизительно 120 часов, от приблизительно 5 часов до приблизительно 10 часов, от приблизительно 5 часов до приблизительно 12 часов, от приблизительно 5 часов до приблизительно 24 часов, от приблизительно 5 часов до приблизительно 36 часов, от приблизительно 5 часов до приблизительно 48 часов, от приблизительно 5 часов до приблизительно 60 часов, приблизительно 5 часов до приблизительно 72 часов, от приблизительно 5 часов до приблизительно 84 часов, от приблизительно 5 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 5 часов до приблизительно 120 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 12 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 24 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 36 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 48 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 60 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 72 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 84 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 120 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 24 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 36 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 48 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 60 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 72 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 84 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 120 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 36 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 48 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 60 часов, приблизительно 24 часов до приблизительно 72 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 84 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 120 часов, от приблизительно 36 часов до приблизительно 48 часов, от приблизительно 36 часов до приблизительно 60 часов, от приблизительно 36 часов до от приблизительно 72 часов, от приблизительно 36 часов до приблизительно 84 часов, от приблизительно 36 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 36 часов до приблизительно 120 часов, от приблизительно 48 часов до приблизительно 60 часов, от приблизительно 48 часов до приблизительно 72 часов, от приблизительно 48 часов до приблизительно 84 часов, от приблизительно 48 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 48 часов до приблизительно 120 часов, от приблизительно 60 часов до приблизительно 72 часов, от приблизительно 60 часов до приблизительно 84 часов, от 60 часов до 96 часов, от приблизительно 60 часов до приблизительно 120 часов, от приблизительно 72 часов до приблизительно 84 часов, от приблизительно 72 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 72 часов до приблизительно 120 часов, от приблизительно 84 часов до приблизительно 96 часов, приблизительно 84 часов до приблизительно 120 часов или от приблизительно 96 часов до приблизительно 120 часов. В некоторых вариантах осуществления, полипептид имеет период полужизни приблизительно 1 час, приблизительно 5 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 24 часа, приблизительно 36 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 60 часов, приблизительно 72 часа, приблизительно 84 часа, приблизительно 96 часов или приблизительно 120 часов. В некоторых вариантах осуществления, полипептид имеет период полужизни по меньшей мере приблизительно 1 час, приблизительно 5 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 24 часа, приблизительно 36 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 60 часов, приблизительно 72 часа, приблизительно 84 часа, или приблизительно 96 часов. В некоторых вариантах осуществления, полипептид имеет период полужизни, самое большее, приблизительно 5 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 24 часа, приблизительно 36 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 60 часов, приблизительно 72 часа, приблизительно 84 часа, приблизительно 96 часов, или приблизительно 120 часов.

3. Неоантигены и их использование

Одним из критических препятствий для разработки лечебной и опухолеспецифической иммунотерапии является идентификация и селекция высокоспецифичных и ограниченных опухолевых антигенов, чтобы избежать аутоиммунитета. Опухолевые неоантигены, возникающие в результате генетических изменений (например, инверсий, транслокаций, делеций, миссенс-мутаций, мутаций сайта сплайсинга и т.д.) в злокачественных клетках, представляют наиболее опухолеспецифический класс антигенов. Неоантигены редко используют в противораковых вакцинах или иммуногенных композициях из-за технических трудностей их идентификации, селекции оптимизированных антигенов и получения неоантигенов для использования в вакцинах или иммуногенных композициях. Эти проблемы могут быть решены путем: идентификации мутаций в новообразованиях/опухолях, которые присутствуют на уровне ДНК в опухоли, но не в соответствующих образцах зародышевой линии от большого количества субъектов, страдающих раком; анализа идентифицированных мутаций с помощью одного или нескольких алгоритмов прогнозирования связывания пептид-MHC для создания множества неоантигенных Т-клеточных эпитопов, которые экспрессируются в новообразовании/опухоли и которые связываются с высокой долей аллелей HLA пациента; и синтеза множества неоантигенных пептидов, выбранных из наборов всех неоантигенных пептидов и спрогнозированных связывающих пептидов, для применения в противораковой вакцине или иммуногенной композиции, подходящей для лечения большого количества субъектов, страдающих раком.

Например, трансляция информации о секвенировании пептидов в терапевтическую вакцину может включать прогнозирование мутантных пептидов, которые могут связываться с молекулами HLA у большого количества индивидуумов. Эффективный выбор конкретных мутаций для использования в качестве иммуногена требует способности спрогнозировать, какие мутировавшие пептиды будут эффективно связываться с высокой долей аллелей HLA пациента. В последнее время подходы к обучению на основе нейронных сетей с проверенными связывающими и не связывающими пептидами повысили точность алгоритмов прогнозирования для основных аллелей HLA-A и -B. Однако даже при использовании усовершенствованных алгоритмов на основе нейронных сетей для кодирования правил связывания HLA-пептидов несколько факторов ограничивают возможности предсказания пептидов, презентированных на аллелях HLA.

Другой пример трансляции информации о секвенировании пептидов в терапевтическую вакцину может включать составление лекарственного средства в виде мультиэпитопной вакцины длинных пептидов. Таргетирование максимально возможного на практике количества мутировавших эпитопов позволяет использовать огромные возможности иммунной системы, предотвращает возможность ускользания от иммунологического надзора из-за понижающей модуляции иммунно-таргетного генного продукта, и компенсирует известную неточность подходов к прогнозированию эпитопов. Синтетические пептиды предоставляют полезные средства для эффективного получения множества иммуногенов и для быстрого транслирования идентификации мутантных эпитопов в эффективную вакцину. Пептиды можно легко синтезировать химическим путем и легко очистить с использованием реагентов, свободных от загрязняющих бактерий или животных веществ. Небольшой размер позволяет четко сфокусировать внимание на мутированной области белка, а также снижает нерелевантную антигенную конкуренцию со стороны других компонентов (не мутантного белка или антигенов вирусных векторов).

Еще один пример транслирования информации о пептидной последовательности в терапевтическую вакцину может включать комбинацию с сильным вакцинным адъювантом. Для эффективных вакцин может потребоваться сильный адъювант, чтобы инициировать иммунный ответ. Например, поли-ICLC, агонист TLR3 и РНК-хеликазных доменов MDA5 и RIG3, продемонстрировал несколько желательных свойств для вакцинного адъюванта. Эти свойства включают индукцию локальной и системной активации иммунных клеток in vivo, продуцирование стимулирующих хемокинов и цитокинов и стимуляцию антигенпрезентации дендритными клетками (DC). Кроме того, поли-ICLC может индуцировать устойчивые ответы CD4⁺и CD8⁺у людей. Важно отметить, что поразительное сходство в активации путей транскрипции и сигнальной трансдукции наблюдалось у субъектов, вакцинированных поли-ICLC, и у добровольцев, получивших высокоэффективную репликационно-компетентную вакцину против желтой лихорадки. Кроме того, >90% пациентов с карциномой яичников, иммунизированных поли-ICLC в сочетании с пептидной вакциной NYESO-1 (в дополнение к Монтаниду), показали индукцию CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток, а также ответы антител на пептид в недавнем исследовании фазы 1. В то же время поли-ICLC был обширно протестирован в более чем 25 клинических испытаниях на сегодняшний день и показал относительно благоприятный профиль токсичности.

Пептиды

[0186] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к выделенным пептидам, которые содержат опухолеспецифическую мутацию. Эти пептиды и полипептиды упоминаются в настоящем изобретении как «неоантигенные пептиды» или «неоантигенные полипептиды». Термин «пептид» используется взаимозаменяемо с «мутантным пептидом», «пептидом неоантигена» и «неоантигенным пептидом» в настоящем описании для обозначения серии остатков, обычно L-аминокислот, связанных друг с другом, обычно пептидными связями между α-амино и карбоксильными группами соседних аминокислот. Аналогичным образом, термин «полипептид» используется взаимозаменяемо с «мутантным полипептидом», «полипептидом неоантигена» и «неоантигенным полипептидом» в настоящем описании для обозначения ряда остатков, например, L-аминокислот, связанных друг с другом, обычно пептидными связями между α-амино и карбоксильными группами соседних аминокислот. Полипептиды или пептиды могут иметь различную длину, либо в их нейтральных (незаряженных) формах, либо в формах, которыми являются соли, и либо не содержат модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепи или фосфорилирование, либо содержат эти модификации, в зависимости от условия о том, что модификация не нарушает биологическую активность полипептидов, как описано в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления, для идентификации опухолеспецифических мутаций используют способы геномного или экзомного секвенирования. В соответствии с настоящим описанием можно использовать любой подходящий способ секвенирования, например, технологии секвенирования следующего поколения (NGS). В будущем, способы секвенирования третьего поколения могут заменить технологию NGS, чтобы ускорить стадию секвенирования способа. В целях пояснения: термины «секвенирование следующего поколения» или «NGS» в контексте настоящего описания означают все новые технологии высокопроизводительного секвенирования, которые, в отличие от «традиционной» методологии секвенирования, известной как химия Сэнгера, считывают профили нуклеиновых кислот случайным образом, параллельно по всему геному, разбив весь геном на мелкие кусочки. Такие технологии NGS (также известные как технологии массивного параллельного секвенирования) способны доставлять информацию о последовательностях нуклеиновых кислот всего генома, экзома, транскриптома (все транскрибированные последовательности генома) или метилома (все метилированные последовательности генома) за очень короткие периоды времени, например, в течение 1-2 недель, например, в течение 1-7 дней или менее чем за 24 часа, и, в принципе, допускают подходы к секвенированию отдельных клеток. Несколько платформ NGS, которые имеются в продаже или которые упоминаются в литературе, могут использоваться в контексте настоящего описания, например, те, которые подробно описаны в WO 2012/159643.

В некоторых вариантах осуществления, описанный в настоящем изобретении полипептид может содержать, но не ограничен ими, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 25, приблизительно 26, приблизительно 27, приблизительно 28, приблизительно 29, приблизительно 30, приблизительно 31, приблизительно 32, приблизительно 33, приблизительно 34, приблизительно 35, приблизительно 36, приблизительно 37, приблизительно 38, приблизительно 39, приблизительно 40, приблизительно 41, приблизительно 42, приблизительно 43, приблизительно 44, приблизительно 45, приблизительно 46, приблизительно 47, приблизительно 48, приблизительно 49, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 110, приблизительно 120, приблизительно 150, приблизительно 200, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 450, приблизительно 500, приблизительно 600, приблизительно 700, приблизительно 800, приблизительно 900, приблизительно 1000, приблизительно 1500, приблизительно 2000, приблизительно 2500, приблизительно 3000, приблизительно 4000, приблизительно 5000, приблизительно 7500, приблизительно 10000 аминокислот или более аминокислотных остатков, и любой диапазон, производный от них. В конкретных вариантах осуществления, молекула неоантигенного пептида равна или меньше 100 аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления полипептид может иметь длину от приблизительно 8 до приблизительно 50 аминокислотных остатков или от приблизительно 8 до приблизительно 30, от приблизительно 8 до приблизительно 20, от приблизительно 8 до приблизительно 18, от приблизительно 8 до приблизительно 15 или от приблизительно 8 до приблизительно 12 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, пептиды могут иметь длину от приблизительно 8 до приблизительно 500 аминокислотных остатков или от приблизительно 8 до приблизительно 450, от приблизительно 8 до приблизительно 400, от приблизительно 8 до приблизительно 350, от приблизительно 8 до приблизительно 300, от приблизительно 8 до приблизительно 250, от приблизительно 8 до приблизительно 200, от приблизительно 8 до приблизительно 150, от приблизительно 8 до приблизительно 100, от приблизительно 8 до приблизительно 50 или от приблизительно 8 до приблизительно 30 аминокислотных остатков.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид может иметь длину по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или более аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, полипептид может иметь длину по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 или более аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, полипептид может иметь в длину не более 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или меньше аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, полипептид может иметь длину не более 88, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 или меньше аминокислотных остатков.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид имеет общую длину по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, по меньшей мере 90, по меньшей мере 100, по меньшей мере 150, по меньшей мере 200, по меньшей мере 250, по меньшей мере 300, по меньшей мере 350, по меньшей мере 400, по меньшей мере 450, по меньшей мере 500, по меньшей мере 1000 или по меньшей мере 1500 аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет общую длину не более 8, не более 9, не более 10, не более 11, не более 12, не более 13, не более 14, не более 15, не более 16, не более 17, не более 18, не более 19, не более 20, не более 21, не более 22, не более 23, не более 24, не более 25, не более 26, не более 27, не более 28, не более 29, не более не более 30, не более 40, не более 50, не более 60, не более 70, не более 80, не более 90, не более 100, не более 150, не более 200, не более 250, не более 300, не более 350, не более 400, не более 450, не более 500, не более 1000 или не более 1500 аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, описанный в настоящем изобретении, может содержать эпитоп. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп может содержать, но не ограничен ими, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 25, приблизительно 26, приблизительно 27, приблизительно 28, приблизительно 29, приблизительно 30, приблизительно 31, приблизительно 32, приблизительно 33, приблизительно 34, приблизительно 35, приблизительно 36, приблизительно 37, приблизительно 38, приблизительно 39, приблизительно 40, приблизительно 41, приблизительно 42, приблизительно 43, приблизительно 44, приблизительно 45, приблизительно 46, приблизительно 47, приблизительно 48, приблизительно 49, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 110, приблизительно 120, приблизительно 150, приблизительно 200, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 450, приблизительно 500, приблизительно 600, приблизительно 700, приблизительно 800, приблизительно 900, приблизительно 1000, приблизительно 1500, приблизительно 2000, приблизительно 2500, приблизительно 3000, приблизительно 4000, приблизительно 5000, приблизительно 7500, приблизительно 10000 аминокислот или больше аминокислотных остатков, и любой диапазон, который можно получить из них.

В некоторых вариантах осуществления, эпитоп может иметь длину от приблизительно 8 до приблизительно 50 аминокислотных остатков, или от приблизительно 8 до приблизительно 30, от приблизительно 8 до приблизительно 20, от приблизительно 8 до приблизительно 18, от приблизительно 8 до приблизительно 15, или от приблизительно 8 до приблизительно 12 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, пептиды могут иметь длину от приблизительно 8 до приблизительно 500 аминокислотных остатков или от приблизительно 8 до приблизительно 450, от приблизительно 8 до приблизительно 400, от приблизительно 8 до приблизительно 350, от приблизительно 8 до приблизительно 300, от приблизительно 8 до приблизительно 250, от приблизительно 8 до приблизительно 200, от приблизительно 8 до приблизительно 150, от приблизительно 8 до приблизительно 100, от приблизительно 8 до приблизительно 50 или от приблизительно 8 до приблизительно 30 аминокислотных остатков.

В некоторых вариантах осуществления, эпитоп может иметь длину по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или более аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп может иметь длину по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 или более аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп может иметь длину не более 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или менее аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, эпитопов может иметь длину не более 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 или менее аминокислотных остатков.

Более длинный пептид можно создать несколькими способами. В некоторых вариантах осуществления, если HLA-связывающие пептиды спрогнозированы или известны, более длинный пептид содержит (1) индивидуальные связывающие пептиды с удлинениями на 2-5 аминокислот по направлению к N- и C-концу каждого соответствующего генного продукта; или (2) конкатенацию некоторых или всех связывающих пептидов с расширенными последовательностями для каждого. В других вариантах осуществления, если секвенирование выявляет длинную (>10 остатков) последовательность неоэпитопа, присутствующую в опухоли (например, из-за сдвига рамки считывания, сквозного прочитывания или включения интрона, что приводит к новой пептидной последовательности), более длинный пептид может состоять из полного удлинения новых опухолеспецифических аминокислот в виде либо одного более длинного пептида, либо нескольких накладывающихся более длинных пептидов. В некоторых вариантах осуществления, предполагается, что использование более длинного пептида делает возможным эндогенный процессинг клетками пациента и может привести к более эффективной презентации антигена и индукции Т-клеточного ответа. В некоторых вариантах осуществления, могут использоваться два или более пептидов, где пептиды накладываются и расположены на длинном неоантигенном пептиде.

В некоторых вариантах осуществления, иммуногенный антиген, неоантигенный пептид или его эпитоп для МНС класса I имеет длину 12 или менее аминокислотных остатков и обычно состоит из от приблизительно 8 до приблизительно 12 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, иммуногенный антиген, неоантигенный пептид или его эпитоп для МНС класса I содержит приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11 или приблизительно 12 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, иммуногенный антиген, неоантигенный пептид или его эпитоп для МНС класса II имеет длину 25 или менее аминокислотных остатков и обычно состоит из от приблизительно 9 до приблизительно 25 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, иммуногенный антиген, неоантигенный пептид или его эпитоп для MHC класса II содержит приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24 или приблизительно 25 аминокислотных остатков.

В некоторых вариантах осуществления, антиген, неоантигенный пептид или эпитоп связывает белок HLA (например, HLA MHC класса I или HLA MHC класса II). В конкретных вариантах осуществления, антиген, неоантигенный пептид или эпитоп связывает белок HLA с большей аффинностью, чем соответствующий пептид дикого типа. В конкретных вариантах осуществления, антиген, неоантигенный пептид или эпитоп имеет IC₅₀ или K_D, по меньшей мере менее 5000 нМ, по меньшей мере менее 500 нМ, по меньшей мере менее 100 нМ, по меньшей мере менее 50 нМ или меньше. В некоторых вариантах осуществления, антиген, неоантигенный пептид или эпитоп связывается с HLA класса I MHC. В некоторых вариантах осуществления, антиген, неоантигенный пептид или эпитоп связывается с HLA класса I MHC с аффинностью от 0,1 до 2000 нМ. В некоторых вариантах осуществления, антиген, неоантигенный пептид или эпитоп связывается с HLA класса I MHC с аффинностью 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 или 2000 нМ. В некоторых вариантах осуществления, антиген, неоантигенный пептид или эпитоп связывается с HLA класса II MHC. В некоторых вариантах осуществления, антиген, неоантигенный пептид или эпитоп связывается с HLA MHC класса II с аффинностью от 0,1 нМ до 2000 нМ, от 1 нМ до 1000 нМ, от 10 нМ до 500 нМ или менее чем 1000 нМ. В некоторых вариантах осуществления, антиген, неоантигенный пептид или эпитоп связывается с HLA MHC класса II с аффинностью 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 или 2000 нМ.

В некоторых вариантах осуществления, антиген, неоантигенный пептид или эпитоп связывается с HLA класса I MHC со стабильностью от 10 минут до 24 часов. В некоторых вариантах осуществления, антиген, неоантигенный пептид или эпитоп связывается с HLA MHC класса I со стабильностью 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут. В некоторых вариантах осуществления, антиген, неоантигенный пептид или эпитоп связывается с HLA MHC класса I со стабильностью 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 часа. В некоторых вариантах осуществления, антиген, неоантигенный пептид или эпитоп связывается с HLA MHC класса II со стабильностью от 10 минут до 24 часов. В некоторых вариантах осуществления, антиген, неоантигенный пептид или эпитоп связывается с HLA MHC класса II со стабильностью 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут. В некоторых вариантах осуществления, антиген, неоантигенный пептид или эпитоп связывается с HLA MHC класса II со стабильностью 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 часа.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид может иметь значение pI от приблизительно 0,5 до приблизительно 12, от приблизительно 2 до приблизительно 10 или от приблизительно 4 до приблизительно 8. В некоторых вариантах осуществления, пептиды могут иметь значение pI, равное, по меньшей мере 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 или более. В некоторых вариантах осуществления, полипептид может иметь значение pI не более 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 или менее.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, описанный в настоящем изобретении, содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность пептидной последовательности, которая не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, описанный в настоящем изобретении, содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность пептидной последовательности, которая не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп. В некоторых вариантах осуществления, аминокислота или аминокислотная последовательность содержит 0-1000, 1-900, 5-800, 10-700, 20-600, 30-500, 40-400, 50-300, 60-200 или 70-100 аминокислотных остатков. В предпочтительном варианте осуществления, аминокислота или аминокислотная последовательность содержит от 1 до 20 аминокислотных остатков. В других предпочтительных вариантах осуществления, аминокислота или аминокислотная последовательность содержит от 5 до 12 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, аминокислота или аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, по меньшей мере 90, по меньшей мере 100, по меньшей мере 150, по меньшей мере 200, по меньшей мере 250, по меньшей мере 300, по меньшей мере 350, по меньшей мере 400, по меньшей мере 450, по меньшей мере 500, по меньшей мере 1000 или по меньшей мере 1500 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, аминокислота или аминокислотная последовательность содержит приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 25, приблизительно 26, приблизительно 27, приблизительно 28, приблизительно 29, приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 150, приблизительно 200, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 450, приблизительно 500, приблизительно 1000, или приблизительно 1500 аминокислотных остатков.

В одном аспекте изобретение относится к способу получения полипептида, включающему связывание аминокислоты или аминокислотной последовательности и/или линкера с N- и/или C-концом последовательности, содержащей последовательность эпитопа. В некоторых вариантах осуществления, описанный в настоящем изобретении полипептид может быть в растворе, лиофилизирован или может находиться в кристаллической форме. В некоторых вариантах осуществления, описанный в настоящем изобретении полипептид может быть получен синтетически, с помощью технологии рекомбинантной ДНК или химического синтеза, или может быть выделен из природных источников, таких как нативные опухоли или патогенные организмы. Эпитопы или неоэпитопы можно синтезировать индивидуально или прямо или косвенно соединять в полипептиде. Хотя описанный в настоящем изобретении полипептид может по существу не содержать других природных белков клетки-хозяина и их фрагментов, в некоторых вариантах осуществления, полипептид может быть синтетически конъюгирован для присоединения к нативным фрагментам или частицам.

В некоторых вариантах осуществления, описанный в настоящем изобретении полипептид может быть получен различными способами. В некоторых вариантах осуществления, полипептид можно синтезировать в растворе или на твердой подложке обычными методами. Коммерчески доступны различные автоматические синтезаторы, которые можно использовать в соответствии с известными протоколами. См., например, Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. Ed., Pierce Chemical Co., 1984. Кроме того, индивидуальный полипептид можно соединить с использованием химического лигирования для получения полипептидов большего размера, которые все еще находятся в рамках настоящего описания.

Альтернативно, можно использовать технологию рекомбинантной ДНК, при которой нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид или часть полипептида, вставляется в вектор экспрессии, трансформируется или трансфицируется в подходящую клетку-хозяина и культивируется в условиях, подходящих для экспрессии. Эти процедуры, как правило, известны в данной области техники, как описано в целом в Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Таким образом, рекомбинантные пептиды, которые содержат один или более неоантигенных пептидов, описанных в настоящем изобретении, могут быть использованы для презентации соответствующего Т-клеточного эпитопа.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит по меньшей мере одну мутантную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна мутантная аминокислота кодируется вставкой одного или нескольких нуклеотидов в последовательность нуклеиновой кислоты в геноме субъекта. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна мутантная аминокислота кодируется делецией одного или нескольких нуклеотидов в последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна мутантная аминокислота кодируется сдвигом рамки считывания в последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта. Сдвиг рамки считывания происходит, если мутация нарушает нормальную фазу периодичности кодонов гена (также известную как «рамка считывания»), что приводит к трансляции не нативной белковой последовательности. Для разных мутаций в гене существует возможность достичь одной и той же измененной рамки считывания. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна мутантная аминокислота кодируется неоORF в последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна мутантная аминокислота кодируется точечной мутацией в последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна мутантная аминокислота кодируется геном с мутацией, дающей слитый полипептид, делецию внутри рамки считывания, вставку, экспрессию эндогенных ретровирусных полипептидов и опухолеспецифическую сверхэкспрессию полипептидов. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна мутантная аминокислота кодируется слиянием первого гена со вторым геном в геноме субъекта. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна мутантная аминокислота кодируется слиянием внутри рамки считывания первого гена со вторым геном в геноме субъекта. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна мутантная аминокислота кодируется слиянием первого гена с экзоном сплайс-варианта первого гена в геноме субъекта. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна мутантная аминокислота кодируется слиянием первого гена с криптическим экзоном первого гена в геноме субъекта.

В некоторых аспектах, настоящее раскрытие относится к полипептиду, содержащему по меньшей мере две полипептидных молекулы. В некоторых вариантах осуществления, два или более из по меньшей мере двух полипептидов или молекул полипептида содержат эпитоп. В некоторых вариантах осуществления, два или более из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул содержат один и тот же эпитоп. В некоторых вариантах осуществления, два или более из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул содержат один и тот же эпитоп одинаковой длины. В некоторых вариантах осуществления, два или более из по меньшей мере двух полипептидов или молекул полипептида содержат аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая является пептидной последовательностью, которая не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп. В некоторых вариантах осуществления, аминокислота или аминокислотная последовательность, которая является пептидной последовательностью, которая не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп двух или нескольких из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул, одинаковы. В некоторых вариантах осуществления, аминокислота или аминокислотная последовательность, которая является пептидной последовательностью, которая не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп двух или нескольких из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул, одинаковы.

В некоторых вариантах осуществления два или более из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул содержат линкер. В некоторых вариантах осуществления, два или более из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул содержат линкер на N- и/или С-конце эпитопа. В некоторых вариантах осуществления, два или более из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул содержат разные линкеры. В некоторых вариантах осуществления, первый полипептид или полипептидная молекула из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул, не содержит линкер, и второй полипептид или полипептидная молекула из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул, содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления, первый полипептид или полипептидная молекула из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул, не содержит линкер на N-конце эпитопа, и второй полипептид или полипептидная молекула из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул содержат линкер на N-конце эпитопа. В некоторых вариантах осуществления, первый полипептид или полипептидная молекула из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул, не содержит линкер на С-конце эпитопа, и второй полипептид или полипептидная молекула из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул, содержат линкер на С-конце эпитопа. В некоторых вариантах осуществления, первый полипептид или полипептидная молекула из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул содержит линкер, и второй полипептид или полипептидная молекула из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул, не содержат линкер. В некоторых вариантах осуществления, первый полипептид или полипептидная молекула из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул содержит линкер на N-конце эпитопа, и второй полипептид или полипептидная молекула из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул, не содержит линкер на N-конце эпитопа. В некоторых вариантах осуществления, первый полипептид или полипептидная молекула из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул содержит линкер на С-конце эпитопа, и второй полипептид или полипептидная молекула из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул, не содержит линкер на С-конце эпитопа.

Дисульфидные линкеры могут быть синтезированы с использованием хорошо известных в данной области техники способов. Например, дисульфидные линкеры можно синтезировать согласно Zhang, Donglu, et al., ACS Med. Chem. Lett. 2016, 7, 988-993; и Pillow, Thomas H., et al., Chem. Sci., 2017, 8, 366-370. Пример синтеза дисульфидного линкера и синтеза дисульфидсодержащего пептида показан в примерах 3 и 4. PABC-содержащие пептиды могут быть синтезированы с использованием хорошо известных в данной области техники способов. Например, PABC-содержащие пептиды можно синтезировать в соответствии с Laurent Ducry (ed.), Antibody-Drug Conju gates, Methods in Molecular Biology, vol. 1045, DOI 10.1007/978-1-62703-541-5_5, Springer Science+Business Media, LLC 2013. Пример синтеза пептида, содержащего PABC, показан в примере 5. В некоторых вариантах осуществления, могут использоваться любые смолы, изготовленные для твердофазного пептидного синтеза.

В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10 или более полипептидов или полипептидных молекул. Например, полипептид может содержать 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 или более полипептидов или полипептидных молекул.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, содержащий антиген, неоантигенный пептид или эпитоп, содержит эпитоп RAS. В некоторых вариантах осуществления, пептид может быть получен из белка с мутации по типу замены, например, мутацией KRAS G12C, G12D, G12V, Q61H или Q61L, или мутацией NRAS Q61K или Q61R. Замена может быть размещена в любом месте по длине пептида. Например, она может быть размещена в N-концевой трети пептида, в центральной трети пептида или в C-концевой трети пептида. В другом варианте осуществления, замененный остаток расположен в 2-5 остатках от N-конца или в 2-5 остатках от С-конца. Пептиды могут быть аналогичным образом получены из опухолеспецифических инсерционных мутаций, если пептид содержит один или более или все вставленные остатки. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп содержит мутантную последовательность RAS, которая содержит по меньшей мере 8 непрерывных аминокислот мутантного белка RAS, содержащего мутацию в G12, G13 или Q61 и мутацию в G12, G13 или Q61. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере 8 непрерывных аминокислот мутантного белка RAS, содержащего мутацию на G12, G13 или Q61, включают G12A, G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K мутацию. В некоторых вариантах осуществления, мутация нам G12, G13 или Q61 содержит G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K или Q61R мутацию.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, содержащий эпитоп RAS, дополнительно содержит аминокислотную последовательность. В некоторых вариантах осуществления, аминокислотной последовательностью является белок цитомегаловируса (CMV), такой как pp65. В некоторых вариантах осуществления, аминокислотной последовательностью является белок вируса иммунодефицита человека (HIV). В некоторых вариантах осуществления, аминокислотной последовательностью является белок MART-1. В некоторых вариантах осуществления, аминокислотная последовательность белка CMV, такого как pp65, содержит 1, 2, 3 или более 3 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, аминокислотная последовательность белка CMV, такого как pp65, содержит 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, аминокислотная последовательность белка HIV содержит 1, 2, 3 или более 3 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, аминокислотная последовательность белка HIV содержит 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, аминокислотная последовательность белка MART-1 содержит 1, 2, 3 или более 3 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, аминокислотная последовательность белка MART-1 содержит 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 аминокислотных остатков.

В некоторых вариантах осуществления, эпитоп RAS связывается с белком, кодируемым аллелем HLA. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп RAS связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, с аффинностью менее 10 мкМ, менее 9 мкМ, менее 8 мкМ, менее 7 мкМ, менее 6 мкМ, менее 5 мкМ, менее 4 мкМ, менее 3 мкМ, менее 2 мкМ, менее 1 мкМ, менее 950 нМ, менее 900 нМ, менее 850 нМ, менее 800 нМ, менее 750 нМ, менее 600 нМ, менее 550 нМ, менее 500 нМ, менее 450 нМ, менее 400 нМ, менее 350 нМ, менее 300 нМ, менее 250 нМ, менее 200 нМ, менее 150 нМ, менее 100 нМ, менее 90 нМ, менее 80 нМ, менее 70 нМ, менее 60 нМ, менее 50 нМ, менее 40 нМ, менее 30 нМ, менее 20 нМ или менее 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп RAS связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, со стабильностью более 24 часов, более 23 часов, более 22 часов, более 21 часа, более 20 часов, более 19 часов, более 18 часов, более 17 часов, более 16 часов, более 15 часов, более 14 часов, более 13 часов, более 12 часов, более 11 часов, более 10 часов, более 9 часов, более 8 часов, более 7 часов, более 6 часов, более 5 часов, более 4 часов, более 3 часов, более 2 часов, более 1 часа, более 55 минут, более 50 минут, более 45 минут, более 40 минут, более 35 минут, более 30 минут, более 25 минут, более 20 минут, более 15 минут, более 10 минут, более 9 минут, более 8 минут, более 7 минут, более 6 минут, более 5 минут, более 4 минут, более 3 минут, более 2 минут или более 1 минуты.

В некоторых вариантах осуществления, аллель HLA выбран из группы, состоящей из аллеля HLA-A02:01, аллеля HLA-A03:01, аллеля HLA-A11:01, аллеля HLA-A03:02, аллеля HLA-A30:01, аллеля HLA-A31:01, аллеля HLA-A33:01, аллеля HLA-A33:03, аллеля HLA-A68:01, аллеля HLA-A74:01 и/или аллеля HLA-C08:02 и любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления, аллелем HLA является HLA-A02:01. В некоторых вариантах осуществления, аллелем HLA является аллель HLA-A03:01. В некоторых вариантах осуществления, аллелем HLA является аллель HLA-A11:01. В некоторых вариантах осуществления, аллелем HLA является аллель HLA-A03:02. В некоторых вариантах осуществления, аллелем HLA является аллель HLA-A30:01. В некоторых вариантах осуществления, аллелем HLA является аллель HLA-A31:01. В некоторых вариантах осуществления, аллелем HLA является аллель HLA-A33:01. В некоторых вариантах осуществления, аллелем HLA является аллель HLA-A33:03. В некоторых вариантах осуществления, аллелем HLA является аллель HLA-A68:01. В некоторых вариантах осуществления, аллелем HLA является аллель HLA-A74:01. В некоторых вариантах осуществления, аллелем HLA является HLA-C08:02.

В некоторых аспектах, настоящее раскрытие относится к композиции, содержащей один полипептид, содержащий первый пептид и второй пептид, или один полинуклеотид, кодирующий первый пептид и второй пептид. В некоторых вариантах осуществления, композиция, представленная в настоящем изобретении, содержит один или более дополнительных пептидов, при этом один или более дополнительных пептидов содержат третий неоэпитоп. В некоторых вариантах осуществления, первый пептид и второй пептид кодированы последовательностью, транскрибируемой с одного и того же сайта начала транскрипции. В некоторых вариантах осуществления, первый пептид кодируется последовательностью, транскрибируемой из первого сайта начала транскрипции, и второй пептид кодируется последовательностью, транскрибируемой из второго сайта начала транскрипции. В некоторых вариантах осуществления, полипептид имеет длину по меньшей мере 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 7500 или 10000 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит первую последовательность, имеющую по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности с соответствующей последовательностью дикого типа; и вторую последовательность, имеющую по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности с соответствующей последовательностью дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, полипептид содержит первую последовательность из по меньшей мере 8 или 9 непрерывных аминокислот с по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с соответствующей последовательностью дикого типа; и вторю последовательность из по меньшей мере 16 или 17 непрерывных аминокислот с по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с соответствующей последовательностью дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления, второй пептид длиннее первого пептида. В некоторых вариантах осуществления, первый пептид длиннее второго пептида. В некоторых вариантах осуществления, первый пептид имеет длину по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 7500 или 10000 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, второй пептид имеет длину по меньшей мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 7500 или 10000 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, первый пептид содержит последовательность, по меньшей мере из 9 непрерывных аминокислот с по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с соответствующей последовательностью дикого типа. В некоторых вариантах осуществления второй пептид содержит последовательность из по меньшей мере 17 непрерывных аминокислот с по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с соответствующей последовательностью дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления первый пептид, второй пептид или оба содержат по меньшей мере одну фланкирующую последовательность, где по меньшей мере одна фланкирующая последовательность расположена выше или ниже неоэпитопов. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна фланкирующая последовательность имеет по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с соответствующей последовательностью дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна фланкирующая последовательность содержит последовательность, отличную от дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одной фланкирующаей последовательностью является N-концевая фланкирующая последовательность. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одной фланкирующей последовательностью является С-концевая фланкирующая последовательность. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна фланкирующая последовательность первого пептида имеет по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с по меньшей мере одной фланкирующей последовательностью второго пептида. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна фланкирующая область первого пептида отличается от, по меньшей мере одной фланкирующей области второго пептида. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере один фланкирующий остаток содержит мутацию.

В некоторых вариантах осуществления, пептид содержит последовательность неоэпитопа, содержащую по меньшей мере одну мутантную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления, пептид содержит последовательность неоэпитопа, содержащую по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более мутантных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, пептид содержит последовательность неоэпитопа, полученную из белка, содержащего по меньшей мере одну мутантную аминокислоту и по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более не мутантных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, пептид содержит последовательность неоэпитопа, полученную из белка, содержащего по меньшей мере одну мутантную аминокислоту и по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более не мутантных аминокислот вы, по меньшей мере одной мутантной аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления, пептид содержит последовательность неоэпитопа, полученную из белка, содержащего по меньшей мере одну мутантную аминокислоту и по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более не мутантных аминокислот ниже по меньшей мере одной мутантной аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления, пептид содержит последовательность неоэпитопа, полученную из белка, содержащего по меньшей мере одну мутантную аминокислоту; по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более не мутантных аминокислот выше по меньшей мере одной мутантной аминокислоты; и по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более не мутантных аминокислот ниже по меньшей мере одной мутантной аминокислоты.

В некоторых вариантах осуществления, пептид содержит последовательность неоэпитопа, полученную из белка, содержащего по меньшей мере одну мутантную аминокислоту, и последовательность выше по меньшей мере одной мутантной аминокислоты с по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с соответствующей последовательностью дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, пептид содержит последовательность неоэпитопа, полученную из белка, содержащего по меньшей мере одну мутантную аминокислоту, и последовательность ниже по меньшей мере одной мутантной аминокислоты с по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с соответствующей последовательностью дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, пептид содержит последовательность неоэпитопа, полученную из белка, содержащего по меньшей мере одну мутантную аминокислоту, последовательность выше по меньшей мере одной мутантной аминокислоты с по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с соответствующей последовательностью дикого типа, и последовательность ниже по меньшей мере одной мутантной аминокислоты с по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с соответствующей последовательностью дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления, пептид содержит последовательность неоэпитопа, полученную из белка, содержащего по меньшей мере одну мутантную аминокислоту, и последовательность выше по меньшей мере одной мутантной аминокислоты, содержащую по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более непрерывных аминокислот с по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с соответствующей последовательностью дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, пептид содержит последовательность неоэпитопа, полученную из белка, содержащего по меньшей мере одну мутантную аминокислоту, и последовательность ниже по меньшей мере одной мутантной аминокислоты, содержащую по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более непрерывных аминокислот с по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с соответствующей последовательностью дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, пептид содержит последовательность неоэпитопа, полученную из белка, содержащего по меньшей мере одну мутантную аминокислоту, последовательность выше по меньшей мере одной мутантной аминокислоты, содержащую по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более непрерывных аминокислот с по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с соответствующей последовательностью дикого типа, и последовательность ниже по меньшей мере одной мутантной аминокислоты, содержащую по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более непрерывных аминокислот, с по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с соответствующей последовательностью дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления, эпитопом является эпитоп TMPRSS2:ERG. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп TMPRSS2:ERG содержит аминокислотную последовательность ALNSEALSV (SEQ ID NO: 304). В некоторых вариантах осуществления полипептид, содержащий RAS эпитоп, содержит аминокислотную последовательность GADGVGKSAL (SEQ ID NO: 4), GACGVGKSAL (SEQ ID NO: 5), GAVGVGKSAL (SEQ ID NO: 6), GADGVGKSA (SEQ ID NO: 7), GACGVGKSA (SEQ ID NO: 8), GAVGVGKSA (SEQ ID NO: 9), KLVVVGACGV (SEQ ID NO: 10), FLVVVGACGL (SEQ ID NO: 11), FMVVVGACGI (SEQ ID NO: 12), FLVVVGACGI (SEQ ID NO: 13), FMVVVGACGV (SEQ ID NO: 14), FLVVVGACGV (SEQ ID NO: 15), MLVVVGACGV (SEQ ID NO: 16), FMVVVGACGL (SEQ ID NO: 17), YLVVVGACGV (SEQ ID NO: 18), KMVVVGACGV (SEQ ID NO: 19), YMVVVGACGV (SEQ ID NO: 20), MMVVVGACGV (SEQ ID NO: 21), DTAGHEEY (SEQ ID NO: 22), TAGHEEYSAM (SEQ ID NO: 23), DILDTAGHE (SEQ ID NO: 24), DILDTAGH (SEQ ID NO: 25), ILDTAGHEE (SEQ ID NO: 26), ILDTAGHE (SEQ ID NO: 27), DILDTAGHEEY (SEQ ID NO: 28), DTAGHEEYS (SEQ ID NO: 29), LLDILDTAGH (SEQ ID NO: 30), DILDTAGRE (SEQ ID NO: 31), DILDTAGR (SEQ ID NO: 32), ILDTAGREE (SEQ ID NO: 33), ILDTAGRE (SEQ ID NO: 34), CLLDILDTAGR (SEQ ID NO: 35), TAGREEYSAM (SEQ ID NO: 36), REEYSAMRD (SEQ ID NO: 37), DTAGKEEYSAM (SEQ ID NO: 38), CLLDILDTAGK (SEQ ID NO: 39), DTAGKEEY (SEQ ID NO: 40), LLDILDTAGK (SEQ ID NO: 41), ILDTAGKE (SEQ ID NO: 42), ILDTAGKEE (SEQ ID NO: 43), DTAGLEEY (SEQ ID NO: 44), ILDTAGLE (SEQ ID NO: 45), DILDTAGL (SEQ ID NO: 46), ILDTAGLEE (SEQ ID NO: 47), GLEEYSAMRDQY (SEQ ID NO: 48), LLDILDTAGLE (SEQ ID NO: 49), LDILDTAGL (SEQ ID NO: 50), DILDTAGLE (SEQ ID NO: 51), DILDTAGLEEY (SEQ ID NO: 52), AGVGKSAL (SEQ ID NO: 53), GAAGVGKSAL (SEQ ID NO: 54), AAGVGKSAL (SEQ ID NO: 55), CGVGKSAL (SEQ ID NO: 56), ACGVGKSAL (SEQ ID NO: 57), DGVGKSAL (SEQ ID NO: 58), ADGVGKSAL (SEQ ID NO: 59), DGVGKSALTI (SEQ ID NO: 60), GARGVGKSA (SEQ ID NO: 61), KLVVVGARGV (SEQ ID NO: 62), VVVGARGV (SEQ ID NO: 63), SGVGKSAL (SEQ ID NO: 64), VVVGASGVGK (SEQ ID NO: 65), GASGVGKSAL (SEQ ID NO: 66), VGVGKSAL (SEQ ID NO: 67), VVVGAGCVGK (SEQ ID NO: 68), KLVVVGAGC (SEQ ID NO: 69), GDVGKSAL (SEQ ID NO: 70), DVGKSALTI (SEQ ID NO: 71), VVVGAGDVGK (SEQ ID NO: 72), TAGKEEYSAM (SEQ ID NO: 73), DTAGHEEYSAM (SEQ ID NO: 74), TAGHEEYSA (SEQ ID NO: 75), DTAGREEYSAM (SEQ ID NO: 76), TAGKEEYSA (SEQ ID NO: 77), AAGVGKSA (SEQ ID NO: 78), AGCVGKSAL (SEQ ID NO: 79), AGDVGKSAL (SEQ ID NO: 80), AGKEEYSAMR (SEQ ID NO: 81), AGVGKSALTI (SEQ ID NO: 82), ARGVGKSAL (SEQ ID NO: 83), ASGVGKSA (SEQ ID NO: 84), ASGVGKSAL (SEQ ID NO: 85), AVGVGKSA (SEQ ID NO: 86), CVGKSALTI (SEQ ID NO: 87), DILDTAGK (SEQ ID NO: 88), DILDTAGREEY (SEQ ID NO: 89), DTAGHEEYSAMR (SEQ ID NO: 90), DTAGKEEYS (SEQ ID NO: 91), DTAGKEEYSAMR (SEQ ID NO: 92), DTAGLEEYS (SEQ ID NO: 93), DTAGLEEYSA (SEQ ID NO: 94), DTAGLEEYSAMR (SEQ ID NO: 95), DTAGREEYS (SEQ ID NO: 96), DTAGREEYSAMR (SEQ ID NO: 97), GAAGVGKSA (SEQ ID NO: 98), GACGVGKSA (SEQ ID NO: 8), GACGVGKSAL (SEQ ID NO: 5), GADGVGKS (SEQ ID NO: 99), GAGDVGKSA (SEQ ID NO: 100), GAGDVGKSAL (SEQ ID NO: 101), GASGVGKSA (SEQ ID NO: 102), GCVGKSAL (SEQ ID NO: 103), GCVGKSALTI (SEQ ID NO: 104), GHEEYSAM (SEQ ID NO: 105), GKEEYSAM (SEQ ID NO: 106), GLEEYSAMR (SEQ ID NO: 107), GREEYSAM (SEQ ID NO: 108), GREEYSAMR (SEQ ID NO: 109), HEEYSAMRD (SEQ ID NO: 110), KEEYSAMRD (SEQ ID NO: 111), KLVVVGASG (SEQ ID NO: 112), LDILDTAGR (SEQ ID NO: 113), LEEYSAMRD (SEQ ID NO: 114), LVVVGARGV (SEQ ID NO: 115), LVVVGASGV (SEQ ID NO: 116), REEYSAMRDQY (SEQ ID NO: 117), RGVGKSAL (SEQ ID NO: 118), TAGLEEYSA (SEQ ID NO: 119), TEYKLVVVGAA (SEQ ID NO: 120), VGAAGVGKSA (SEQ ID NO: 121), VGADGVGK (SEQ ID NO: 122), VGASGVGKSA (SEQ ID NO: 123), VGVGKSALTI (SEQ ID NO: 124), VVVGAAGV (SEQ ID NO: 125), VVVGAVGV (SEQ ID NO: 126), YKLVVVGAC (SEQ ID NO: 127), YKLVVVGAD (SEQ ID NO: 128), YKLVVVGAR (SEQ ID NO: 129) или DILDTAGKE (SEQ ID NO: 130).

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, содержащий эпитоп RAS, дополнительно содержит, например, на N-конце аминокислотную последовательность K, K, KK, KKK, KKKK (SEQ ID NO: 1), KKKKK (SEQ ID NO: 3), KKKKKKK (SEQ ID NO: 223), KKKKKKKK (SEQ ID NO: 224), KTEY (SEQ ID NO: 225), KTEYK (SEQ ID NO: 226), KTEYKL (SEQ ID NO: 227), KTEYKLV (SEQ ID NO: 228), KTEYKLVV (SEQ ID NO: 229), KTEYKLVVV (SEQ ID NO: 230), KKTEY (SEQ ID NO: 231), KKTEYK (SEQ ID NO: 232), KKTEYKL (SEQ ID NO: 233), KKTEYKLV (SEQ ID NO: 234), KKTEYKLVV (SEQ ID NO: 235), KKTEYKLVVV (SEQ ID NO: 236), KKKTEY (SEQ ID NO: 237), KKKTEYK (SEQ ID NO: 238), KKKTEYKL (SEQ ID NO: 239), KKKTEYKLV (SEQ ID NO: 240), KKKTEYKLVV (SEQ ID NO: 241), KKKTEYKLVVV (SEQ ID NO: 242), KKKKTEY (SEQ ID NO: 243), KKKKTEYK (SEQ ID NO: 244), KKKKTEYKL (SEQ ID NO: 245), KKKKTEYKLV (SEQ ID NO: 246), KKKKTEYKLVV (SEQ ID NO: 247), KKKKTEYKLVVV (SEQ ID NO: 248), IDIIMKIRNA (SEQ ID NO: 131), FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFIIFFIFFWMC (SEQ ID NO: 132), FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFAAFWFW (SEQ ID NO: 133), IFFIFFIIFFFFFFFFFFFFIIIIIIIWEC (SEQ ID NO: 134), FIFFFIIFFFFFIFFFFFIFIIIIIIFWEC (SEQ ID NO: 135), TEY, TEYK (SEQ ID NO: 249), TEYKL (SEQ ID NO: 250), TEYKLV (SEQ ID NO: 136), TEYKLVV (SEQ ID NO: 251), TEYKLVVV (SEQ ID NO: 252), WQAGILAR (SEQ ID NO: 137), HSYTTAE (SEQ ID NO: 138), PLTEEKIK (SEQ ID NO: 139), GALHFKPGSR (SEQ ID NO: 140), RRANKDATAE (SEQ ID NO: 141), KAFISHEEKR (SEQ ID NO: 142), TDLSSRFSKS (SEQ ID NO: 143), FDLGGGTFDV (SEQ ID NO: 144), CLLLHYSVSK (SEQ ID NO: 145), KKKKIIMKIRNA (SEQ ID NO: 146) или MTEYKLVVV (SEQ ID NO: 147).

В некоторых вариантах осуществления полипептид, содержащий RAS эпитоп, дополнительно содержит, например, на С-конце, аминокислотные последовательности K, KK, KKK, KKKK (SEQ ID NO: 1), KKKKK (SEQ ID NO: 3), KKKKKKK (SEQ ID NO: 223), KKKKKKKK (SEQ ID NO: 224), KKNKKDDI (SEQ ID NO: 148), KKNKKDDIKD (SEQ ID NO: 149), AGNDDDDDDDDDDDDDDDDDKKDKDDDDDD (SEQ ID NO: 150), AGNKKKKKKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 151), AGRDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD (SEQ ID NO: 152), SALTI (SEQ ID NO: 153), SALTIQL (SEQ ID NO: 154), GKSALTIQL (SEQ ID NO: 155), GKSALTI (SEQ ID NO: 156), SALTIK (SEQ ID NO: 253), SALTIQLK (SEQ ID NO: 254), GKSALTIQLK (SEQ ID NO: 255), GKSALTIK (SEQ ID NO: 256), SALTIKK (SEQ ID NO: 257), SALTIQLKK (SEQ ID NO: 258), GKSALTIQLKK (SEQ ID NO: 259), GKSALTIKK (SEQ ID NO: 260), SALTIKKK (SEQ ID NO: 261), SALTIQLKKK (SEQ ID NO: 262), GKSALTIQLKKK (SEQ ID NO: 263), GKSALTIKKK (SEQ ID NO: 264), SALTIKKKK (SEQ ID NO: 265), SALTIQLKKKK (SEQ ID NO: 266), GKSALTIQLKKKK (SEQ ID NO: 267), GKSALTI (SEQ ID NO: 156),KKKK (SEQ ID NO: 1), QGQNLKYQ (SEQ ID NO: 157), ILGVLLLI (SEQ ID NO: 158), EKEGKISK (SEQ ID NO: 159), AASDFIFLVT (SEQ ID NO: 160), KELKQVASPF (SEQ ID NO: 161), KKKLINEKKE (SEQ ID NO: 162), KKCDISLQFF (SEQ ID NO: 163), KSTAGDTHLG (SEQ ID NO: 164), ATFYVAVTVP (SEQ ID NO: 165), LTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDG (SEQ ID NO: 166) или TIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGE (SEQ ID NO: 167).

В некоторых вариантах осуществления полипептид, содержащий RAS эпитоп, выбран из группы, состоящей из KTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 268), KTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 269), KTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 270), KTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 271), KKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 272), KKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 273), KKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 274), KKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 275), KKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 276), KKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 277), KKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 278), KKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 279), KKKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 280), KKKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 281), KKKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 282), KKKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 283), KKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKK (SEQ ID NO: 284), KKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKK (SEQ ID NO: 285), KKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKK (SEQ ID NO: 286), KKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKK (SEQ ID NO: 287), TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLK (SEQ ID NO: 288), TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLK (SEQ ID NO: 289), TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLK (SEQ ID NO: 290), TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLK (SEQ ID NO: 291), TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKK (SEQ ID NO: 292), TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKK (SEQ ID NO: 293), TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKK (SEQ ID NO: 294), TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKK (SEQ ID NO: 295), TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKKK (SEQ ID NO: 296), TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKKK (SEQ ID NO: 297), TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKKK (SEQ ID NO: 298), TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKKK (SEQ ID NO: 299), TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKKKK (SEQ ID NO: 300), TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKKKK (SEQ ID NO: 301) и TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKKKK (SEQ ID NO: 302), TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKKKK (SEQ ID NO: 303) В некоторых вариантах осуществления, полипептид, содержащий RAS эпитоп, выбран из группы, состоящей из KKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 277), KKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 278), KKKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 280) и KKKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 283). В некоторых вариантах осуществления, полипептидом, содержащим RAS эпитоп, является KKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 277). В некоторых вариантах осуществления, полипептидом, содержащим RAS эпитоп, является KKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 278). В некоторых вариантах осуществления, полипептидом, содержащим RAS эпитоп, является KKKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 280). В некоторых вариантах осуществления, полипептидом, содержащим RAS эпитоп, является KKKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 283).

В некоторых вариантах осуществления пептид, содержащий мутацию KRAS G12C, содержит последовательность MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDS YRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE (SEQ ID NO: 309). В некоторых вариантах осуществления пептид, содержащий мутацию KRAS G12 C, содержит последовательность неоэпитопа KLVVVGACGV (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах осуществления пептид, содержащий мутацию KRAS G12 C, содержит последовательность неоэпитопа LVVVGACGV (SEQ ID NO: 310). В некоторых вариантах осуществления пептид, содержащий мутацию KRAS G12 C, содержит последовательность неоэпитопа VVGACGVGK (SEQ ID NO: 200). В некоторых вариантах осуществления пептид, содержащий мутацию KRAS G12 C, содержит последовательность неоэпитопа VVVGACGVGK (SEQ ID NO: 197).

В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию KRAS G12D, содержит последовательность MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDP TIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE (SEQ ID NO: 311). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию KRAS G12D, содержит последовательность неоэпитопа VVGADGVGK (SEQ ID NO: 206). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию KRAS G12D, содержит последовательность неоэпитопа VVVGADGVGK (SEQ ID NO: 203). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию KRAS G12D, содержит последовательность неоэпитопа KLVVVGADGV (SEQ ID NO: 312). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию KRAS G12D, содержит последовательность неоэпитопа LVVVGADGV (SEQ ID NO: 313).

В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию KRAS G12V, содержит последовательность MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDP TIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE (SEQ ID NO: 314). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию KRAS G12V, содержит последовательность неоэпитопа KLVVVGAVGV (SEQ ID NO: 315). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию KRAS G12V, содержит последовательность неоэпитопа LVVVGAVGV (SEQ ID NO: 316). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию KRAS G12V, содержит последовательность неоэпитопа VVGAVGVGK (SEQ ID NO: 220). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию KRAS G12V, содержит последовательность неоэпитопа VVVGAVGVGK (SEQ ID NO: 218).

В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию KRAS Q61H, содержит последовательность AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVV IDGETCLLDILDTAGHEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM (SEQ ID NO: 317). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию KRAS Q61H, содержит последовательность неоэпитопа ILDTAGHEEY (SEQ ID NO: 318).

В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию KRAS Q61L, содержит последовательность AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVV IDGETCLLDILDTAGLEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM (SEQ ID NO: 319). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию KRAS Q61L, содержит последовательность неоэпитопа ILDTAGLEEY (SEQ ID NO: 320). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию KRAS Q61L, содержит последовательность неоэпитопа LLDILDTAGL (SEQ ID NO: 321).

В некоторых вариантах осуществления пептид, содержащий мутацию NRAS Q61K, содержит последовательность AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVV IDGETCLLDILDTAGKEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPM (SEQ ID NO: 322). В некоторых вариантах осуществления пептид, содержащий мутацию NRAS Q61K, содержит последовательность неоэпитопа ILDTAGKEEY (SEQ ID NO: 323).

В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию NRAS Q61R, содержит последовательность AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVV IDGETCLLDILDTAGREEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPM (SEQ ID NO: 324). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию NRAS Q61R, содержит последовательность неоэпитопа ILDTAGREEY (SEQ ID NO: 325).

В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS Q61H, содержит последовательность TCLLDILDTAGHEEYSAMRDQYM (SEQ ID NO: 326). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS Q61H, содержит последовательность, представленную в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления пептидная последовательность, представленная в таблице 1, связывается или, как спрогнозировано, связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, где указанный аллель представлен в соответствующем столбце таблицы 1 рядом с пептидной последовательностью.

Таблица 1. Пептидные последовательности, содержащие мутацию RAS Q61H, соответствующий аллель HLA и ранг связывающего потенциала Пептид SEQ ID NO: Аллель Ранг связывающего потенциала ILDTAGHEEY 318 HLA-A36:01 1 ILDTAGHEEY 318 HLA-A01:01 2 DTAGHEEYSAM 74 HLA-A26:01 3 DTAGHEEYSAM 74 HLA-A25:01 4 GHEEYSAM 105 HLA-B15:09 4 DTAGHEEY 22 HLA-A26:01 5 ILDTAGHEE 26 HLA-C08:02 5 AGHEEYSAM 327 HLA-C01:02 6 AGHEEYSAM 327 HLA-B46:01 6 DTAGHEEY 22 HLA-A25:01 6 DTAGHEEY 22 HLA-A01:01 6 DTAGHEEY 22 HLA-B18:01 7 DTAGHEEY 22 HLA-A36:01 7 ILDTAGHEE 26 HLA-C05:01 7 ILDTAGHEE 26 HLA-A02:07 7 ILDTAGHEEY 318 HLA-A29:02 7 ILDTAGHEEY 318 HLA-C08:02 7 HEEYSAMRD 110 HLA-B49:01 8 TAGHEEYSA 75 HLA-B35:03 8 DTAGHEEYS 29 HLA-A68:02 9 DTAGHEEYSAMR 90 HLA-A68:01 9 GHEEYSAM 105 HLA-B39:01 9 ILDTAGHEE 26 HLA-A01:01 9 LDTAGHEEY 328 HLA-B53:01 9 HEEYSAMRD 110 HLA-B41:01 10 ILDTAGHEE 26 HLA-A36:01 10 DTAGHEEY 22 HLA-B58:01 11 LLDILDTAGH 30 HLA-A01:01 12 TAGHEEYSAM 23 HLA-B35:03 12 LDTAGHEEY 328 HLA-B35:01 13 DILDTAGHE 24 HLA-A26:01 14 DTAGHEEY 22 HLA-C12:03 14 ILDTAGHEEY 318 HLA-C05:01 14 AGHEEYSAM 327 HLA-A30:02 15 DILDTAGHEEY 28 HLA-A25:01 15 DTAGHEEY 22 HLA-C02:02 15 ILDTAGHEE 26 HLA-C04:01 15 DILDTAGH 25 HLA-A26:01 16 ILDTAGHEE 26 HLA-A02:01 16 LDTAGHEEY 328 HLA-A29:02 16 ILDTAGHE 27 HLA-A01:01 17 LDTAGHEEY 328 HLA-B18:01 17 AGHEEYSAM 327 HLA-C14:03 18 DILDTAGHEEY 28 HLA-A29:02 18 DTAGHEEYS 29 HLA-A26:01 18 ILDTAGHEEY 318 HLA-B15:01 18 DTAGHEEYSA 329 HLA-A68:02 19 ILDTAGHE 27 HLA-C05:01 19 ILDTAGHEEY 318 HLA-A02:07 19 ILDTAGHEEY 318 HLA-A30:02 19 LDTAGHEEY 328 HLA-A36:01 19 AGHEEYSAM 327 HLA-C14:02 20 AGHEEYSAM 327 HLA-B15:03 20 LLDILDTAGH 30 HLA-A02:07 20

В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS Q61R, содержит последовательность TCLLDILDTAGREEYSAMRDQYM (SEQ ID NO: 330). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS Q61R, содержит последовательность, представленную в таблице 2. В некоторых вариантах осуществления, пептидная последовательность, представленная в таблице 2, связывается или, как спрогнозировано, связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, где аллель указан в соответствующем столбце в таблице 2 рядом с пептидной последовательностью.

Таблица 2. Пептидные последовательности, содержащие мутацию RAS Q61R, соответствующий аллель HLA и ранг потенциала связывания Пептид SEQ ID NO: Аллель Ранг связывающего потенциала ILDTAGREEY 325 HLA-A36:01 1 ILDTAGREEY 325 HLA-A01:01 2 DTAGREEYSAM 76 HLA-A26:01 3 DILDTAGR 32 HLA-A33:03 4 DILDTAGR 32 HLA-A68:01 5 DTAGREEY 331 HLA-A26:01 6 DTAGREEYSAM 76 HLA-A25:01 6 CLLDILDTAGR 35 HLA-A74:01 7 DTAGREEY 331 HLA-A01:01 7 REEYSAMRD 37 HLA-B41:01 7 GREEYSAMR 109 HLA-B27:05 8 ILDTAGREE 33 HLA-C08:02 8 ILDTAGREEY 325 HLA-A29:02 8 REEYSAMRD 37 HLA-B49:01 8 AGREEYSAM 332 HLA-B46:01 9 DTAGREEY 331 HLA-B18:01 9 DTAGREEY 331 HLA-A25:01 9 DTAGREEY 331 HLA-A36:01 9 DILDTAGR 32 HLA-A74:01 10 DILDTAGRE 31 HLA-A26:01 10 ILDTAGREE 33 HLA-C05:01 10 DILDTAGR 32 HLA-A26:01 11 GREEYSAM 108 HLA-B39:01 11 AGREEYSAM 332 HLA-B15:03 12 GREEYSAM 108 HLA-C07:02 12 ILDTAGREE 33 HLA-A01:01 12 TAGREEYSA 333 HLA-B35:03 12 ILDTAGREEY 325 HLA-A30:02 13 DTAGREEYS 96 HLA-A68:02 14 ILDTAGRE 34 HLA-A01:01 14 CLLDILDTAGR 35 HLA-A31:01 15 DTAGREEYSAMR 97 HLA-A68:01 15 LLDILDTAGR 334 HLA-A01:01 15 DTAGREEY 331 HLA-B58:01 16 ILDTAGREEY 325 HLA-C08:02 16 DILDTAGR 32 HLA-A31:01 17 ILDTAGREE 33 HLA-C04:01 17 ILDTAGREEY 325 HLA-A32:01 17 LLDILDTAGR 334 HLA-A74:01 17 TAGREEYSAM 36 HLA-B35:03 17 DILDTAGREEY 89 HLA-A32:01 18 ILDTAGRE 34 HLA-C05:01 18 ILDTAGREE 33 HLA-A02:07 18 REEYSAMRD 37 HLA-B40:01 18 AGREEYSAM 332 HLA-B15:01 19 AGREEYSAMR 335 HLA-A31:01 19 ILDTAGRE 34 HLA-A36:01 19 LDILDTAGR 113 HLA-A68:01 19 LDTAGREEY 336 HLA-A29:02 19 LDTAGREEY 336 HLA-B35:01 19 REEYSAMRD 37 HLA-B45:01 19 REEYSAMRDQY 117 HLA-A36:01 19 DTAGREEY 331 HLA-C02:02 20

В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS Q61K, содержит последовательность TCLLDILDTAGKEEYSAMRDQYM (SEQ ID NO: 337). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS Q61K, содержит последовательность, представленную в таблице 3. В некоторых вариантах осуществления, пептидная последовательность, представленная в таблице 3, связывается или, по прогнозам, связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, указанный аллель представлен в соответствующем столбце таблицы 3 рядом с пептидной последовательностью.

Таблица 3. Последовательности пептидов, содержащие мутацию RAS Q61K, соответствующий аллель HLA и ранг связывающего потенциала Пептид SEQ ID NO: Аллель Ранг связывающего потенциала ILDTAGKEEY 323 HLA-A36:01 1 ILDTAGKEEY 323 HLA-A01:01 2 DTAGKEEYSAM 38 HLA-A26:01 3 CLLDILDTAGK 39 HLA-A03:01 4 DTAGKEEY 40 HLA-A01:01 5 DTAGKEEY 40 HLA-A26:01 5 DTAGKEEYSAM 38 HLA-A25:01 5 AGKEEYSAM 338 HLA-B46:01 6 DILDTAGKE 130 HLA-A26:01 7 KEEYSAMRD 111 HLA-B41:01 7 DTAGKEEY 40 HLA-B18:01 8 GKEEYSAM 106 HLA-B15:03 8 ILDTAGKEE 43 HLA-C08:02 8 ILDTAGKEEY 323 HLA-A29:02 8 DTAGKEEYS 91 HLA-A68:02 9 LDTAGKEEY 339 HLA-B53:01 9 TAGKEEYSA 77 HLA-B35:03 9 DILDTAGK 88 HLA-A68:01 10 DTAGKEEY 40 HLA-A36:01 10 KEEYSAMRD 111 HLA-B49:01 10 LDTAGKEEY 339 HLA-C07:01 10 DTAGKEEYSAMR 92 HLA-A68:01 11 ILDTAGKEE 43 HLA-C05:01 11 ILDTAGKEEY 323 HLA-C08:02 11 LLDILDTAGK 41 HLA-A01:01 12 AGKEEYSAM 338 HLA-A30:02 13 DTAGKEEY 40 HLA-A25:01 13 DTAGKEEYS 91 HLA-A26:01 13 ILDTAGKE 42 HLA-C05:01 13 LDTAGKEEY 339 HLA-B35:01 13 AGKEEYSAMR 81 HLA-A31:01 14 DILDTAGK 88 HLA-A33:03 14 ILDTAGKE 42 HLA-A01:01 14 ILDTAGKEE 43 HLA-A01:01 14 ILDTAGKEE 43 HLA-A02:07 14 TAGKEEYSAM 73 HLA-B35:03 14 AGKEEYSAM 338 HLA-B15:01 15 ILDTAGKEEY 323 HLA-A30:02 15 LDTAGKEEY 339 HLA-B46:01 15 DTAGKEEY 40 HLA-B58:01 16 ILDTAGKEEY 323 HLA-C05:01 17 AGKEEYSAM 338 HLA-A30:01 18 AGKEEYSAM 338 HLA-B15:03 18 DTAGKEEY 40 HLA-C02:02 18 LDTAGKEEY 339 HLA-A29:02 18

В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS Q61L, содержит последовательность TCLLDILDTAGLEEYSAMRDQYM (SEQ ID NO: 340). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS Q61L, содержит последовательность, представленную в таблице 4. В некоторых вариантах осуществления, пептидная последовательность, представленная в таблице 4, связывается или, по прогнозам, связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, причем этот аллель указан в соответствующем столбце в таблице 4 рядом с пептидной последовательностью.

Таблица 4. Пептидные последовательности, включающие мутацию RAS Q61L, соответствующий аллель HLA и ранг связывающего потенциала Пептид SEQ ID NO: Аллель Ранг связывающего потенциала ILDTAGLEEY 320 HLA-A36:01 1 ILDTAGLEEY 320 HLA-A01:01 2 LLDILDTAGL 321 HLA-A02:07 3 GLEEYSAMRDQY 48 HLA-A36:01 4 DTAGLEEY 44 HLA-A25:01 5 DTAGLEEY 44 HLA-A26:01 5 DTAGLEEYSAM 341 HLA-A26:01 5 DTAGLEEY 44 HLA-A01:01 6 ILDTAGLEE 47 HLA-C08:02 6 ILDTAGLEE 47 HLA-A01:01 6 CLLDILDTAGL 342 HLA-A02:04 7 ILDTAGLEE 47 HLA-A36:01 7 LLDILDTAGL 321 HLA-A01:01 7 DILDTAGL 46 HLA-B14:02 8 DILDTAGLEEY 52 HLA-A25:01 8 DTAGLEEYS 93 HLA-A68:02 8 DTAGLEEYSAM 341 HLA-A25:01 8 GLEEYSAMR 107 HLA-A74:01 8 ILDTAGLE 45 HLA-A01:01 8 DILDTAGLEEY 52 HLA-A26:01 9 DTAGLEEY 44 HLA-A36:01 9 ILDTAGLEEY 320 HLA-A29:02 9 DILDTAGL 46 HLA-B08:01 10 DTAGLEEY 44 HLA-B18:01 10 ILDTAGLEE 47 HLA-A02:07 10 LDTAGLEEY 343 HLA-B35:01 10 CLLDILDTAGL 342 HLA-A02:01 11 DTAGLEEY 44 HLA-C02:02 11 ILDTAGLEE 47 HLA-C05:01 11 ILDTAGLEEY 320 HLA-C08:02 11 ILDTAGLEEY 320 HLA-A02:07 11 LLDILDTAGL 321 HLA-C08:02 11 DILDTAGL 46 HLA-A26:01 12 LDTAGLEEY 343 HLA-B53:01 12 DTAGLEEY 44 HLA-C03:02 13 DTAGLEEY 44 HLA-B58:01 13 ILDTAGLEEY 320 HLA-A30:02 13 LLDILDTAGL 321 HLA-C05:01 13 LLDILDTAGL 321 HLA-C04:01 13 DTAGLEEYSAMR 95 HLA-A68:01 14 ILDTAGLE 45 HLA-A36:01 15 LLDILDTAGL 321 HLA-A02:01 15 AGLEEYSAM 344 HLA-B15:03 16 DTAGLEEYSA 94 HLA-A68:02 16 GLEEYSAMRDQY 48 HLA-A01:01 16 ILDTAGLE 45 HLA-C04:01 16 ILDTAGLEEY 320 HLA-B15:01 16 LDILDTAGL 50 HLA-B37:01 16 AGLEEYSAM 344 HLA-A30:02 17 AGLEEYSAM 344 HLA-B48:01 17 AGLEEYSAMR 345 HLA-A31:01 17 ILDTAGLEE 47 HLA-C04:01 17 LDTAGLEEY 343 HLA-C03:02 17 AGLEEYSAM 344 HLA-C14:02 18 GLEEYSAMR 107 HLA-A31:01 18 LEEYSAMRD 114 HLA-B41:01 18 LLDILDTAGLE 49 HLA-A01:01 18 AGLEEYSAM 344 HLA-C14:03 19 LDILDTAGL 50 HLA-B40:02 19 LDTAGLEEY 343 HLA-A29:02 19 DILDTAGLE 51 HLA-A26:01 20 DTAGLEEY 44 HLA-B15:01 20 ILDTAGLEEY 320 HLA-A02:01 20 LDTAGLEEY 343 HLA-A36:01 20 LDTAGLEEY 343 HLA-B46:01 20 DTAGLEEY 44 HLA-A68:02 21 DTAGLEEY 44 HLA-C12:03 21 ILDTAGLE 45 HLA-C05:01 21 LDTAGLEEY 343 HLA-B18:01 21 LEEYSAMRD 114 HLA-B49:01 21 TAGLEEYSA 119 HLA-B54:01 21 DILDTAGLEEY 52 HLA-A29:02 22 GLEEYSAM 346 HLA-C05:01 22

В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS G12A, содержит последовательность MTEYKLVVVGAAGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 347). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS G12A, содержит последовательность, представленную в таблице 5. В некоторых вариантах осуществления, пептидная последовательность, представленная в таблице 5, связывается или по прогнозам связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, этот аллель указан в соответствующем столбце в таблице 5 рядом с пептидной последовательностью.

Таблица 5. Пептидные последовательности, содержащие мутацию RAS G12A, соответствующий аллель HLA и ранг связывающего потенциала Пептид SEQ ID NO: Аллель Ранг связывающего потенциала AAGVGKSAL 55 HLA-C03:04 1 VVVGAAGVGK 192 HLA-A11:01 1 VVGAAGVGK 194 HLA-A11:01 2 TEYKLVVVGAA 120 HLA-B50:01 3 VVGAAGVGK 194 HLA-A03:01 3 VVVGAAGVGK 192 HLA-A68:01 3 AAGVGKSAL 55 HLA-C08:02 4 AAGVGKSAL 55 HLA-C08:01 4 AAGVGKSAL 55 HLA-B46:01 4 AAGVGKSAL 55 HLA-B81:01 5 GAAGVGKSAL 54 HLA-B48:01 5 LVVVGAAGV 348 HLA-A68:02 5 AAGVGKSAL 55 HLA-C03:04 1 VVVGAAGVGK 192 HLA-A11:01 1 VVGAAGVGK 194 HLA-A11:01 2 TEYKLVVVGAA 120 HLA-B50:01 3 VVGAAGVGK 194 HLA-A03:01 3 VVVGAAGVGK 192 HLA-A68:01 3 AAGVGKSAL 55 HLA-C08:02 4 AAGVGKSAL 55 HLA-C08:01 4 AAGVGKSAL 55 HLA-B46:01 4 AAGVGKSAL 55 HLA-B81:01 5 AAGVGKSAL 55 HLA-C03:02 5 AAGVGKSAL 55 HLA-C01:02 5 GAAGVGKSAL 54 HLA-B48:01 5 LVVVGAAGV 348 HLA-A68:02 5 AAGVGKSAL 55 HLA-C03:03 6 VVGAAGVGK 194 HLA-A68:01 6 GAAGVGKSAL 54 HLA-B81:01 7 VVVGAAGVGK 192 HLA-A03:01 7 AAGVGKSAL 55 HLA-C05:01 8 AAGVGKSAL 55 HLA-C12:03 8 GAAGVGKSA 98 HLA-B46:01 8 VVGAAGVGK 194 HLA-A30:01 8 GAAGVGKSA 98 HLA-B55:01 9 KLVVVGAAGV 349 HLA-A02:01 9 AGVGKSAL 53 HLA-B08:01 10 GAAGVGKSAL 54 HLA-C03:04 10 AAGVGKSAL 55 HLA-C17:01 11 GAAGVGKSAL 54 HLA-C03:03 11 VVVGAAGV 125 HLA-A68:02 11 YKLVVVGAA 350 HLA-B54:01 11 AAGVGKSAL 55 HLA-B48:01 12 AGVGKSAL 53 HLA-C03:04 12 AGVGKSAL 53 HLA-C07:01 12 VVVGAAGVGK 192 HLA-A30:01 12 AAGVGKSA 78 HLA-B46:01 13 KLVVVGAAGV 349 HLA-A02:07 13 YKLVVVGAA 350 HLA-B50:01 13 AAGVGKSAL 55 HLA-B07:02 14 GAAGVGKSAL 54 HLA-A68:02 14 VVGAAGVGK 194 HLA-A74:01 14 AGVGKSAL 53 HLA-C08:01 15 GAAGVGKSAL 54 HLA-C17:01 15 GAAGVGKSAL 54 HLA-C08:01 16 GAAGVGKSAL 54 HLA-B35:03 16 AAGVGKSAL 55 HLA-C02:02 17 AAGVGKSAL 55 HLA-B35:03 17 AAGVGKSAL 55 HLA-C12:02 17 AAGVGKSAL 55 HLA-C14:03 17 GAAGVGKSA 98 HLA-B50:01 17 AGVGKSAL 53 HLA-C03:02 18 GAAGVGKSA 98 HLA-C03:04 18 LVVVGAAGV 348 HLA-B55:01 18 TEYKLVVVGAA 120 HLA-B41:01 18 AGVGKSAL 53 HLA-C01:02 19 GAAGVGKSA 98 HLA-B54:01 19 GAAGVGKSAL 54 HLA-B07:02 19 VGAAGVGKSA 121 HLA-B55:01 19 AGVGKSAL 53 HLA-B48:01 20 AGVGKSALTI 82 HLA-B49:01 20 VVVGAAGV 125 HLA-B55:01 20

В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS G12C, содержит последовательность MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 351). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS G12C, содержит последовательность, представленную в таблице 6. В некоторых вариантах осуществления, пептидная последовательность, представленная в таблице 6, связывается или по прогнозам связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, этот аллель указан в соответствующем столбце в таблице 6 рядом с пептидной последовательностью.

Таблица 6. Пептидные последовательности, содержащие мутацию RAS G12C, соответствующий аллель HLA и ранг связывающего потенциала Пептид SEQ ID NO: Аллель Ранг связывающего потенциала VVVGACGVGK 197 HLA-A11:01 1 VVGACGVGK 200 HLA-A03:01 2 VVGACGVGK 200 HLA-A11:01 3 VVVGACGVGK 197 HLA-A68:01 4 VVGACGVGK 200 HLA-A68:01 5 VVVGACGVGK 197 HLA-A03:01 5 VVGACGVGK 200 HLA-A30:01 6 ACGVGKSAL 57 HLA-B81:01 7 ACGVGKSAL 57 HLA-C01:02 7 ACGVGKSAL 57 HLA-C14:03 8 ACGVGKSAL 57 HLA-C03:04 9 VVVGACGVGK 197 HLA-A30:01 9 ACGVGKSAL 57 HLA-C14:02 10 CGVGKSAL 56 HLA-B08:01 10 KLVVVGACGV 10 HLA-A02:01 10 ACGVGKSAL 57 HLA-B07:02 11 GACGVGKSAL 5 HLA-B48:01 12 GACGVGKSAL 5 HLA-C03:03 13 ACGVGKSAL 57 HLA-B48:01 14 ACGVGKSAL 57 HLA-B40:01 14 YKLVVVGAC 127 HLA-B48:01 14 YKLVVVGAC 127 HLA-B15:03 14 GACGVGKSA 8 HLA-B46:01 15 GACGVGKSAL 5 HLA-C03:04 15 GACGVGKSAL 5 HLA-C01:02 15 LVVVGACGV 310 HLA-A68:02 15 CGVGKSAL 56 HLA-C03:04 16 GACGVGKSAL 5 HLA-C08:02 16 VVGACGVGK 200 HLA-A74:01 16

В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS G12D, содержит последовательность MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 352). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS G12D, содержит последовательность, представленную в таблице 7. В некоторых вариантах осуществления, пептидная последовательность, представленная в таблице 7, связывается или предположительно связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, этот аллель указан в соответствующем столбце в таблице 7 рядом с пептидной последовательностью.

Таблица 7. Пептидные последовательности, содержащие мутацию RAS G12D, соответствующий аллель HLA и ранг потенциала связывания Пептид SEQ ID NO: Аллель Ранг связывающего потенциала GADGVGKSAL 4 HLA-C08:02 1 GADGVGKSAL 4 HLA-C05:01 2 VVVGADGVGK 203 HLA-A11:01 3 DGVGKSAL 58 HLA-B14:02 4 VVGADGVGK 206 HLA-A11:01 4 VVGADGVGK 206 HLA-A03:01 5 DGVGKSAL 58 HLA-B08:01 6 VVVGADGVGK 203 HLA-A68:01 6 GADGVGKSAL 4 HLA-C03:03 7 VVGADGVGK 206 HLA-A30:01 7 ADGVGKSAL 59 HLA-B37:01 8 GADGVGKSAL 4 HLA-C08:01 8 VVGADGVGK 206 HLA-A68:01 8 GADGVGKSA 7 HLA-C08:02 9 GADGVGKSAL 4 HLA-B35:03 9 GADGVGKS 99 HLA-C05:01 10 GADGVGKSA 7 HLA-C05:01 10 ADGVGKSAL 59 HLA-C07:01 11 VVVGADGVGK 203 HLA-A03:01 11 ADGVGKSAL 59 HLA-B40:02 12 ADGVGKSAL 59 HLA-B46:01 13 GADGVGKSAL 4 HLA-C03:04 13 ADGVGKSAL 59 HLA-B81:01 14 GADGVGKSAL 4 HLA-C17:01 14 VVVGADGVGK 203 HLA-A30:01 14 GADGVGKSA 7 HLA-B35:03 15 GADGVGKSA 7 HLA-B46:01 15 GADGVGKSAL 4 HLA-B48:01 15 KLVVVGADGV 312 HLA-A02:01 15 LVVVGADGV 313 HLA-A68:02 15 VGADGVGKSA 353 HLA-B55:01 15 VVGADGVGK 206 HLA-A74:01 16 GADGVGKSA 7 HLA-B53:01 17 KLVVVGADGV 312 HLA-A02:07 17 VGADGVGK 122 HLA-A68:01 17 YKLVVVGAD 128 HLA-B48:01 17 ADGVGKSAL 59 HLA-C14:03 18 DGVGKSALTI 60 HLA-B51:01 18 VGADGVGK 122 HLA-A11:01 18

В некоторых вариантах осуществления пептид, содержащий мутацию RAS G12R, содержит последовательность MTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 354). В некоторых вариантах осуществления пептид, содержащий мутацию RAS G12R, содержит последовательность, представленную в таблице 8. В некоторых вариантах осуществления пептидная последовательность, представленная в таблице 8, связывается или по прогнозам связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, указанный аллель представлен в соответствующем столбце таблицы 8 рядом с пептидной последовательностью.

Таблица 8. Пептидные последовательности, содержащие мутацию RAS G12R, соответствующий аллель HLA и ранг связывающего потенциала Пептид SEQ ID NO: Аллель Ранг связывающего потенциала VVGARGVGK 210 HLA-A11:01 1 VVVGARGVGK 208 HLA-A68:01 1 GARGVGKSA 61 HLA-B46:01 2 ARGVGKSAL 83 HLA-B27:05 3 GARGVGKSA 61 HLA-B55:01 3 RGVGKSAL 118 HLA-C07:01 4 VVGARGVGK 210 HLA-A30:01 5 ARGVGKSAL 83 HLA-B38:01 6 ARGVGKSAL 83 HLA-B14:02 6 VVGARGVGK 210 HLA-A68:01 6 VVVGARGVGK 208 HLA-A03:01 7 GARGVGKSAL 355 HLA-B48:01 8 RGVGKSAL 118 HLA-B48:01 8 RGVGKSALTI 356 HLA-A23:01 8 ARGVGKSAL 83 HLA-C06:02 9 GARGVGKSA 61 HLA-A30:01 9 GARGVGKSAL 355 HLA-B81:01 9 VVVGARGVGK 208 HLA-A30:01 9 GARGVGKSAL 355 HLA-B07:02 10 LVVVGARGV 115 HLA-C06:02 10 RGVGKSAL 118 HLA-B81:01 10 VVGARGVGK 210 HLA-A74:01 11 KLVVVGARGV 62 HLA-A02:01 12 LVVVGARGV 115 HLA-B55:01 12 YKLVVVGAR 129 HLA-A33:03 12 KLVVVGAR 357 HLA-A74:01 13 KLVVVGARGV 62 HLA-B13:02 13 RGVGKSAL 118 HLA-C01:02 13 LVVVGARGV 115 HLA-A68:02 14 VVVGARGV 63 HLA-B55:01 14 ARGVGKSAL 83 HLA-B15:09 15 ARGVGKSAL 83 HLA-C14:03 16 GARGVGKSA 61 HLA-B54:01 16 VVVGARGV 63 HLA-B52:01 16

В некоторых вариантах осуществления пептид, содержащий мутацию RAS G12S, содержит последовательность MTEYKLVVVGASGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 358). В некоторых вариантах осуществления пептид, содержащий мутацию RAS G12S, содержит последовательность, представленную в таблице 9. В некоторых вариантах осуществления пептидная последовательность, представленная в таблице 9, связывается или по прогнозам связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, указанный аллель указан в соответствующем столбце в таблице 9 рядом с пептидной последовательностью.

Таблица 9. Пептидные последовательности, содержащие мутацию RAS G12S, соответствующий аллель HLA и ранг связывающего потенциала Пептид SEQ ID NO: Аллель Ранг связывающего потенциала VVVGASGVGK 65 HLA-A11:01 1 VVGASGVGK 215 HLA-A11:01 2 VVGASGVGK 215 HLA-A03:01 3 VVVGASGVGK 65 HLA-A68:01 4 ASGVGKSAL 85 HLA-C03:04 5 ASGVGKSAL 85 HLA-B46:01 5 VVGASGVGK 215 HLA-A68:01 6 VVVGASGVGK 65 HLA-A03:01 6 ASGVGKSAL 85 HLA-C01:02 7 GASGVGKSAL 66 HLA-B48:01 7 ASGVGKSAL 85 HLA-C07:01 8 ASGVGKSAL 85 HLA-C08:02 9 GASGVGKSAL 66 HLA-B81:01 9 SGVGKSAL 64 HLA-B08:01 9 ASGVGKSAL 85 HLA-C03:03 10 ASGVGKSAL 85 HLA-C03:02 10 SGVGKSAL 64 HLA-B14:02 10 VVGASGVGK 215 HLA-A30:01 10 ASGVGKSAL 85 HLA-C08:01 11 VVVGASGVGK 65 HLA-A30:01 11 GASGVGKSAL 66 HLA-B35:03 12 SGVGKSAL 64 HLA-C07:01 12 ASGVGKSAL 85 HLA-B81:01 13 GASGVGKSA 102 HLA-B55:01 13 GASGVGKSAL 66 HLA-C03:03 13 KLVVVGASGV 359 HLA-A02:01 13 LVVVGASGV 116 HLA-A68:02 13 SGVGKSAL 64 HLA-C01:02 13 ASGVGKSA 84 HLA-B46:01 14 ASGVGKSAL 85 HLA-C15:02 14 GASGVGKSAL 66 HLA-C08:01 15 SGVGKSAL 64 HLA-C03:04 15 ASGVGKSAL 85 HLA-C05:01 16 GASGVGKSAL 66 HLA-C03:04 16 VVGASGVGK 215 HLA-A74:01 16 ASGVGKSAL 85 HLA-B48:01 17 GASGVGKSAL 66 HLA-C01:02 17 SGVGKSAL 64 HLA-C03:02 17 SGVGKSALTI 360 HLA-A23:01 17 VGASGVGKSA 123 HLA-B55:01 18 ASGVGKSAL 85 HLA-C12:03 19 ASGVGKSAL 85 HLA-B57:03 19 KLVVVGASGV 359 HLA-A02:07 19 SGVGKSAL 64 HLA-B81:01 19 ASGVGKSAL 85 HLA-C17:01 20 KLVVVGASG 112 HLA-A32:01 20

В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS G12V, содержит последовательность MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 361). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS G12V, содержит последовательность, представленную в таблице 10. В некоторых вариантах осуществления, пептидная последовательность, представленная в таблице 10, связывается или по прогнозам связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, указанный аллель представлен в соответствующем столбце таблицы 10 рядом с пептидной последовательностью.

Таблица 10. Пептидные последовательности, содержащие мутацию RAS G12V, соответствующий аллель HLA и ранг потенциала связывания Пептид SEQ ID NO: Аллель Ранг связывающего потенциала VVGAVGVGK 220 HLA-A03:01 1 VVGAVGVGK 220 HLA-A11:01 2 VVVGAVGVGK 218 HLA-A11:01 2 VVVGAVGVGK 218 HLA-A68:01 3 VVGAVGVGK 220 HLA-A68:01 4 LVVVGAVGV 316 HLA-A68:02 5 VVGAVGVGK 220 HLA-A30:01 5 AVGVGKSAL 362 HLA-B81:01 6 KLVVVGAVGV 315 HLA-A02:01 6 AVGVGKSAL 362 HLA-B46:01 7 GAVGVGKSAL 6 HLA-C03:03 7 GAVGVGKSAL 6 HLA-B48:01 7 VVVGAVGVGK 218 HLA-A03:01 7 AVGVGKSAL 362 HLA-C03:04 8 GAVGVGKSAL 6 HLA-C03:04 8 KLVVVGAVGV 315 HLA-A02:07 9 VGVGKSAL 67 HLA-B08:01 9 VVVGAVGV 126 HLA-A68:02 9 AVGVGKSAL 362 HLA-C08:02 10 AVGVGKSAL 362 HLA-B07:02 10 GAVGVGKSAL 6 HLA-B35:03 10 AVGVGKSAL 362 HLA-C08:01 11 AVGVGKSAL 362 HLA-C01:02 11 GAVGVGKSA 9 HLA-B55:01 11 GAVGVGKSAL 6 HLA-B81:01 11 GAVGVGKSAL 6 HLA-C08:01 11 KLVVVGAVGV 315 HLA-B13:02 11 VGVGKSAL 67 HLA-C03:04 11 AVGVGKSAL 362 HLA-A32:01 12 GAVGVGKSA 9 HLA-B46:01 12 VGVGKSAL 67 HLA-C03:02 12 VGVGKSALTI 124 HLA-A23:01 12 GAVGVGKSA 9 HLA-B54:01 13 VGVGKSAL 67 HLA-C01:02 .3 AVGVGKSAL 362 HLA-B48:01 14 AVGVGKSAL 362 HLA-C03:03 14 AVGVGKSAL 362 HLA-B42:01 14 LVVVGAVGV 316 HLA-B55:01 14 VGVGKSAL 67 HLA-C08:01 14 VVGAVGVGK 220 HLA-A74:01 14 AVGVGKSAL 362 HLA-C05:01 15 AVGVGKSAL 362 HLA-C03:02 15 GAVGVGKSA 9 HLA-C03:04 15 KLVVVGAVGV 315 HLA-A02:04 15 LVVVGAVGV 316 HLA-A02:07 15 VGVGKSAL 67 HLA-B14:02 15 VVVGAVGVGK 218 HLA-A30:01 15 VVGAVGVGK 220 HLA-B81:01 16 VVVGAVGV 126 HLA-B55:01 16 AVGVGKSAL 362 HLA-C14:03 17 AVGVGKSAL 362 HLA-B15:01 17 LVVVGAVGV 316 HLA-B54:01 17 AVGVGKSA 86 HLA-B55:01 18 AVGVGKSAL 362 HLA-C17:01 18 GAVGVGKSA 9 HLA-B50:01 19 GAVGVGKSAL 6 HLA-C17:01 19 YKLVVVGAV 363 HLA-A02:04 19 GAVGVGKSAL 6 HLA-B35:01 20 VVGAVGVGK 220 HLA-A31:01 20 YKLVVVGAV 363 HLA-B51:01 20

В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS G13C, содержит последовательность MTEYKLVVVGAGCVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 364). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS G13C, содержит последовательность, представленную в таблице 11. В некоторых вариантах осуществления, пептидная последовательность, представленная в таблице 11, связывается или по прогнозам связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, этот аллель указан в соответствующем столбце в таблице 11 рядом с пептидной последовательностью.

Таблица 11. Пептидные последовательности, включающие мутацию RAS G13C, соответствующий аллель HLA и ранг связывающего потенциала Пептид SEQ ID NO: Аллель Ранг связывающего потенциала VVVGAGCVGK 68 HLA-A11:01 1 VVGAGCVGK 365 HLA-A11:01 2 AGCVGKSAL 79 HLA-C01:02 3 VVGAGCVGK 365 HLA-A03:01 4 VVVGAGCVGK 68 HLA-A68:01 4 CVGKSALTI 87 HLA-B13:02 5 VVGAGCVGK 365 HLA-A68:01 5 VVGAGCVGK 365 HLA-A30:01 6 AGCVGKSAL 79 HLA-B48:01 7 AGCVGKSAL 79 HLA-C03:04 8 GCVGKSALTI 104 HLA-B49:01 8 AGCVGKSAL 79 HLA-C08:02 9 VVVGAGCVGK 68 HLA-A03:01 9 KLVVVGAGC 69 HLA-A30:02 10 GCVGKSAL 103 HLA-C07:01 11 VVGAGCVGK 365 HLA-A74:01 12 AGCVGKSAL 79 HLA-C14:03 13 KLVVVGAGC 69 HLA-B15:01 14

В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS G13D, содержит последовательность MTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQL (SEQ ID NO: 366). В некоторых вариантах осуществления, пептид, содержащий мутацию RAS G13D, содержит последовательность, представленную в таблице 12. В некоторых вариантах осуществления, пептидная последовательность, представленная в таблице 12, связывается или по прогнозам связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, указанный аллель представлен в соответствующем столбце таблицы 12 рядом с пептидной последовательностью.

Таблица 12. Пептидные последовательности, содержащие мутацию RAS G13D, соответствующий аллель HLA и ранг потенциала связывания Пептид SEQ ID NO: Аллель Ранг связывающего потенциала AGDVGKSAL 80 HLA-C08:02 1 AGDVGKSAL 80 HLA-C05:01 2 VVGAGDVGK 367 HLA-A11:01 3 VVVGAGDVGK 72 HLA-A11:01 3 VVVGAGDVGK 72 HLA-A68:01 4 GAGDVGKSA 100 HLA-B46:01 5 GAGDVGKSAL 101 HLA-B48:01 5 VVGAGDVGK 367 HLA-A68:01 5 VVGAGDVGK 367 HLA-A03:01 5 AGDVGKSAL 80 HLA-C03:04 6 AGDVGKSAL 80 HLA-C04:01 6 AGDVGKSAL 80 HLA-C01:02 6 DVGKSALTI 71 HLA-B13:02 6 DVGKSALTI 71 HLA-A25:01 6 GDVGKSAL 70 HLA-C07:01 6 GDVGKSAL 70 HLA-B40:02 7 GDVGKSAL 70 HLA-B37:01 8 AGDVGKSAL 80 HLA-B48:01 9 DVGKSALTI 71 HLA-B51:01 10 VVGAGDVGK 367 HLA-A30:01 10 GAGDVGKSAL 101 HLA-C08:01 11 GAGDVGKSAL 101 HLA-B81:01 11 AGDVGKSAL 80 HLA-C08:01 12 GAGDVGKSAL 101 HLA-C03:04 12 DVGKSALTI 71 HLA-B53:01 13 AGDVGKSAL 80 HLA-B07:02 14 AGDVGKSAL 80 HLA-B46:01 14 DVGKSALTI 71 HLA-A26:01 14 VVGAGDVGK 367 HLA-A74:01 14 GAGDVGKSA 100 HLA-B54:01 15 DVGKSALTI 71 HLA-B38:01 16 GAGDVGKSAL 101 HLA-C03:03 16 VVVGAGDVGK 72 HLA-A03:01 16

В некоторых вариантах осуществления, описанный в настоящем изобретении полипептид не содержит эпитоп RAS. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп не является эпитопом RAS. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не содержит KKKKKPKRDGYMFLKAESKIMFAT (SEQ ID NO: 168), KKKKYMFLKAESKIMFATLQRSS (SEQ ID NO: 169), KKKKKAESKIMFATLQRSSLWCL (SEQ ID NO: 170), KKKKKIMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 171) или KKKKMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 172).

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, содержащий антиген, неоантигенный пептид или эпитоп, содержит эпитоп GATA3. В некоторых вариантах осуществления, GATA3 эпитоп содержит аминокислотную последовательность MLTGPPARV (SEQ ID NO: 173), SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 174), VLPEPHLAL (SEQ ID NO: 175), KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 176), KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 177), ESKIMFATL (SEQ ID NO: 178), KRDGYMFL (SEQ ID NO: 179), PAVPFDLHF (SEQ ID NO: 180), AESKIMFATL (SEQ ID NO: 181), FATLQRSSL (SEQ ID NO: 182), ARVPAVPFD (SEQ ID NO: 183), IMKPKRDGY (SEQ ID NO: 184), DGYMFLKA (SEQ ID NO: 185), MFLKAESKIMF (SEQ ID NO: 186), LTGPPARV (SEQ ID NO: 187), ARVPAVPF (SEQ ID NO: 188), SMLTGPPAR (SEQ ID NO: 189), RVPAVPFDL (SEQ ID NO: 190) или LTGPPARVP (SEQ ID NO: 191).

Модификации пептидов

В некоторых вариантах осуществления, настоящее описание включает модифицированные пептиды. Модификация может включать ковалентную химическую модификацию, которая не изменяет первичную аминокислотную последовательность самого антигенного пептида. Модификации могут давать пептиды с желаемыми свойствами, например, продлевая период полужизни in vivo, увеличивая стабильность, уменьшая клиренс, изменяя иммуногенность или аллергенность, делая возможным повышение определенных антител, таргетирование клеток, поглощение антигена, процессинг антигена, HLA аффинность, HLA стабильность или презентацию антигена. В некоторых вариантах осуществления, пептид может содержать одну или несколько последовательностей, которые усиливают процессинг и презентацию эпитопов APC, например, для создания иммунного ответа.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид может быть модифицирован для придания желаемых свойств. Например, способность пептидов индуцировать активность цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) может быть усилена путем связывания с последовательностью, которая содержит по меньшей мере один эпитоп, способный индуцировать ответ Т-хелперных клеток. В некоторых вариантах осуществления, конъюгаты иммуногенных пептидов/Т-хелперов связаны спейсерной молекулой. В некоторых вариантах осуществления, спейсер содержит относительно малые нейтральные молекулы, такие как аминокислоты или миметики аминокислот, которые, по существу, не заряжены в физиологических условиях. Спейсеры могут быть выбраны, например, из Ala, Gly или других нейтральных спейсеров не полярных аминокислот или нейтральных полярных аминокислот. Следует понимать, что необязательно присутствующий спейсер не обязательно должен состоять из одинаковых остатков и, таким образом, может быть гетеро- или гомо-олигомером. Неоантигенный пептид может быть связан с Т-хелперным пептидом либо прямо, либо через спейсер либо на амино-, либо на карбокси-конце пептида. Амино конец либо неоантигенного пептида, либо Т-хелперного пептида может быть ацилирован. Примеры Т-хелперных пептидов включают остатки 830-843 столбнячного токсина, остатки 307-319 гриппа и остатки 382-398 циркумспорозоитного белка малярии и остатки 378-389.

Пептидные последовательности по настоящему изобретению необязательно могут быть изменены через изменения на уровне ДНК, в частности, путем мутации ДНК, которая кодирует пептид, в заранее выбранных основаниях, так что генерируются кодоны, которые будут транслироваться в желаемые аминокислоты.

В некоторых вариантах осуществления, описанный в настоящем изобретении пептид может содержать замены для модификации физического свойства (например, стабильности или растворимости) полученного пептида. Например, пептиды можно модифицировать заменой цистеина (C) на α-аминомасляную кислоту («B»). Благодаря своей химической природе, цистеин имеет склонность образовывать дисульфидные мостики и в значительной степени изменять структуру пептида, чтобы снизить связывающую способность. Замена C на α-аминомасляную кислоту не только облегчает эту проблему, но и в некоторых случаях фактически улучшает способность связывания и перекрестного связывания. Замена цистеина на α-аминомасляную кислоту может происходить в любом остатке неоантигенного пептида, например, в якорных или не якорных положениях эпитопа или аналога внутри пептида или в других положениях пептида.

Пептид также может быть модифицирован через удлинение или уменьшение аминокислотной последовательности соединения, например, через добавление или удаление аминокислот. Пептиды или аналоги также могут быть модифицированы через изменение порядка или состава определенных остатков. Специалистам в данной области техники будет понятно, что некоторые аминокислотные остатки, необходимые для биологической активности, например, те, которые находятся в критических сайтах контакта, или консервативные остатки, как правило, не могут быть изменены без неблагоприятного воздействия на биологическую активность. Не критические аминокислоты не должны ограничиваться теми, которые встречаются в природе в белках, такими как L-α-аминокислоты или их D-изомеры, но могут также включать не природные аминокислоты, такие как β -γ-δ-аминокислоты, а также многие производные L-α-аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления, пептид может быть модифицирован с использованием ряда пептидов с одинарными аминокислотными заменами для определения влияния электростатического заряда, гидрофобности и т.д. на связывание HLA. Например, серия положительно заряженных (например, Lys или Arg) или отрицательно заряженных (например, Glu) аминокислотных замен может быть проведена по длине пептида, выявляя различные профили чувствительности к различным молекулам HLA и Т-клеточным рецепторам. Кроме того, можно использовать множественные замены с использованием малых, относительно нейтральных фрагментов, таких как Ala, Gly, Pro или подобные остатки. Замены могут быть гомо-олигомерами или гетеро-олигомерами. Число и типы остатков, которые заменяются или добавляются, зависят от необходимого расстояния между основными точками контакта и определенных функциональных атрибутов, которые ищутся (например, гидрофобность по сравнению с гидрофильностью). Повышенная аффинность связывания с молекулой HLA или Т-клеточным рецептором также может быть достигнута такими заменами по сравнению с аффинностью исходного пептида. В любом случае в таких заменах должны использоваться аминокислотные остатки или другие молекулярные фрагменты, выбранные таким образом, чтобы избежать, например, пространственного и зарядового вмешательства, которое могло бы нарушить связывание. Аминокислотными заменами обычно являются одиночные остатки. Замены, делеции, вставки или любые их комбинации могут быть объединены для получения конечного пептида.

В некоторых вариантах осуществления, описанный в настоящем изобретении пептид может содержать миметики аминокислот или не природные аминокислотные остатки, например, D- или L-нафилаланин; D- или L-фенилглицин; D- или L-2-тиенеилаланин; D- или L-1,2,3- или 4-пиренеилаланин; D- или L-3 тиенеилаланин; D- или L-(2-пиридинил)аланин; D- или L-(3-пиридинил)аланин; D- или L-(2-пиразинил)аланин; D- или L-(4-изопропил)фенилглицин; D-(трифторметил)фенилглицин; D-(трифторметил)фенилаланин; D-ρ-фторфенилаланин; D- или L-ρ-бифенилфенилаланин; D- или L-ρ-метоксибифенилфенилаланин; D- или L-2-индол(аллил)аланины; и, D- или L-алкилаланины, где алкильной группой может быть замещенный или не замещенный метил, этил, пропил, гексил, бутил, пентил, изопропил, изобутил, втор-изотил, изопентил или не кислые аминокислотные остатки. Ароматические кольца не природной аминокислоты включают, например, тиазолильное, тиофенильное, пиразолильное, бензимидазолильное, нафтильное, фуранильное, пирролильное и пиридильное ароматические кольца. Модифицированные пептиды, которые имеют различные миметики аминокислот или не природные аминокислотные остатки, могут иметь повышенную стабильность in vivo. Такие пептиды также могут иметь улучшенные свойства хранения или производства.

В некоторых вариантах осуществления, описанный в настоящем изобретении пептид может быть модифицирован концевым-NH₂ ацилированием, например, ацетилированием алканоилом (C₁-C₂₀) или тиогликолилом, амидированием концевого карбоксила, например, аммиаком, метиламином и т.д. В некоторых вариантах осуществления, эти модификации могут представлять сайты для связывания с подложкой или другой молекулой. В некоторых вариантах осуществления, описанный в настоящем изобретении пептид может содержать модификации, такие как, но не ограниченные ими, гликозилирование, окисление боковой цепи, биотинилирование, фосфорилирование, добавление поверхностно-активного материала, например, липида, или может быть химически модифицирован, например, ацетилированием и т.д. Более того, связи в пептиде могут отличаться от пептидных связей, например, ковалентные связи, сложные эфирные или простые эфирные связи, дисульфидные связи, водородные связи, ионные связи и т.д.

В некоторых вариантах осуществления, пептид, описанный в настоящем изобретении, может содержать носители, такие как хорошо известные в данной области техники, например, тиреоглобулин, альбумины, такие как сывороточный альбумин человека, столбнячный токсин, остатки полиаминокислот, такие как поли-L-лизин- и поли-L-глутаминовая кислота, белки вируса гриппа, коровый белок вируса гепатита В и подобные.

Пептиды могут быть дополнительно модифицированы, чтобы содержать дополнительные химические группы, обычно не являющиеся частью белка. Эти дериватизированные группы могут улучшать растворимость, биологический период полужизни, абсорбцию белка или аффинность связывания. Группы также могут уменьшать или устранять любые желательные побочные эффекты пептидов и подобные. Обзор этих групп можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000). Например, неоантигенные пептиды, обладающие желаемой активностью, могут быть модифицированы по мере необходимости для обеспечения определенных желаемых свойств, например, улучшенных фармакологических характеристик, при одновременном увеличении или по меньшей мере сохранении по существу всей биологической активности не модифицированного пептида для связывания желаемой молекулы HLA и активации соответствующей Т-клетки. Например, пептид может подвергаться различным изменениям, таким как замены, как консервативные, так и не консервативные, где такие изменения могут обеспечить определенные преимущества при их использовании, такие как улучшенное связывание HLA. Такие консервативные замены могут включать замену аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, биологически и/или химически сходным, например, одного гидрофобного остатка на другой или одного полярного остатка на другой. Действие замен одиночных аминокислот можно также исследовать с использованием D-аминокислот. Такие модификации могут быть выполнены с использованием хорошо известных процедур синтеза пептидов, как описано, например, в Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany & Merrifield, The Peptides, Gross & Meienhofer, eds. (N.Y., Academic Press), pp. 1-284 (1979); и Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, III., Pierce), 2d Ed. (1984).

В некоторых вариантах осуществления, описанный в настоящем изобретении пептид может быть конъюгирован с большими, медленно метаболизируемыми макромолекулами, такими как белки; полисахариды, такие как сефароза, агароза, целлюлоза, целлюлозные гранулы; полимерные аминокислоты, такие как полиглутаминовая кислота, полилизин; сополимеры аминокислот; инактивированные вирусные частицы; инактивированные бактериальные токсины, такие как токсин дифтерии, столбняка, холеры, молекулы лейкотоксина; инактивированные бактерии; и дендритные клетки.

Изменения пептида, которые могут включать, но не ограничены ими, конъюгацию с белком-носителем, конъюгацию с лигандом, конъюгацию с антителом, ПЭГилирование, полисиалилирование, HESилирование, рекомбинантные миметики PEG, слияние Fc, слияние с альбумином, присоединение наночастиц, инкапсулирование наночастиц, слияние с холестерином, слияние с железом, ацилирование, амидирование, гликозилирование, окисление боковой цепи, фосфорилирование, биотинилирование, добавление поверхностно-активного материала, добавление миметиков аминокислот или добавление не природных аминокислот.

Гликозилирование может влиять на физические свойства белков, а также может иметь важное значение для стабильности, секреции и субклеточной локализации белка. Правильное гликозилирование может иметь важное значение для биологической активности. Фактически, некоторые гены эукариотических организмов при экспрессии в бактериях (например, E. coli), в которых отсутствуют клеточные процессы для гликозилирования белков, дают белки, которые восстанавливаются с небольшой активностью или отсутствующей активностью из-за того, что в них отсутствует гликозилирование. Добавление сайтов гликозилирования может быть выполнено путем изменения аминокислотной последовательности. Изменение пептида или белка может быть выполнено, например, путем добавления или замены одним или несколькими сериновыми или треониновыми остатками (для О-связанных сайтов гликозилирования) или аспарагиновыми остатками (для N-связанных сайтов гликозилирования). Структуры N-связанных и O-связанных олигосахаридов и сахарных остатков, обнаруженных в каждом типе, могут быть разными. Одним типом сахара, который обычно встречается в обоих, является N-ацетилнейраминовая кислота (далее именуемая сиаловой кислотой). Сиаловая кислота обычно является концевым остатком как N-связанных, так и O-связанных олигосахаридов, и в силу своего отрицательного заряда, может придавать кислотные свойства гликопротеину. Варианты осуществления настоящего описания включают создание и использование вариантов N-гликозилирования. Удаление углеводов может быть выполнено химическим или ферментативным путем или путем замены кодонов, кодирующих аминокислотные остатки, которые гликозилированы. Методы химического дегликозилирования известны, и ферментативное расщепление углеводных групп на полипептидах может быть достигнуто с использованием различных эндо- и экзогликозидаз.

Дополнительные подходящие компоненты и молекулы для конъюгации включают, например, молекулы для таргетирования лимфатической системы, тиреоглобулин; альбумины, такие как сывороточный альбумин человека (HAS); столбнячный токсин; токсин дифтерии; полиаминокислоты, такие как поли (D-лизин:D-глутаминовая кислота); VP6 полипептиды ротавирусов; гемагглютинин вируса гриппа, нуклеопротеин вируса гриппа; гемоцианин лимфы улитки (KLH); и коровый белок и поверхностный антиген вируса гепатита В; или любая комбинация вышеперечисленных.

Другим типом модификации является конъюгирование (например, связывание) одного или нескольких дополнительных компонентов или молекул на N- и/или C-конце полипептидной последовательности, такой как другой белок (например, белок, имеющий аминокислотную последовательность, гетерологичную рассматриваемому белку) или молекула-носитель. Таким образом, типовая полипептидная последовательность может быть представлена в виде конъюгата с другим компонентом или молекулой. В некоторых вариантах осуществления, слияние альбумина с пептидом или белком по настоящему описанию может, например, быть достигнуто с помощью генетических манипуляций, так что ДНК, кодирующая HSA, или его фрагмент, присоединяется к ДНК, которая кодирует один или более полипептидных последовательностей. После этого подходящий хозяин может быть трансформирован или трансфицирован слитыми нуклеотидными последовательностями, например, в форме подходящей плазмиды, чтобы экспрессировать слитый полипептид. Экспрессия может осуществляться in vitro, например, из прокариотических или эукариотических клеток, или in vivo, например, из трансгенного организма. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, экспрессия слитого белка осуществляется в линиях клеток млекопитающих, например в линиях клеток СНО. Кроме того, сам альбумин может быть модифицирован для увеличения периода его полужизни в кровотоке. Слияние модифицированного альбумина с одним или несколькими полипептидами может быть достигнуто методами генетической манипуляции, описанными выше, или путем химической конъюгации; полученная слитая молекула имеет период полужизни, который превышает таковой у слияний с не модифицированным альбумином (см., например, WO2011/051489). Несколько стратегий связывания альбумина были разработаны как альтернативы прямому слиянию, включая связывание альбумина через цепь конъюгированных жирных кислот (ацилирование). Поскольку сывороточный альбумин является транспортным белком для жирных кислот, эти природные лиганды с альбуминсвязывающей активностью используют для продления периода полужизни низкомолекулярных белковых терапевтических агентов.

Дополнительные кандидатные компоненты и молекулы для конъюгации включают те, которые подходят для выделения или очистки. Неограничивающие примеры включают связывающие молекулы, такие как биотин (пара специфического связывания биотин-авидин), антитело, рецептор, лиганд, лектин или молекулы, которые содержат твердую подложку, включая, например, пластиковые или полистирольные гранулы, пластины или шарики, магнитные шарики, тест-полоски и мембраны. Для разделения конъюгатов по разнице зарядов могут использоваться такие способы очистки, как катионообменная хроматография, которая эффективно разделяет конъюгаты по их разным молекулярным массам. Содержание фракций, полученных катионообменной хроматографией, может быть идентифицировано по молекулярной массе с использованием обычных способов, например масс-спектроскопии, SDS-PAGE или других известных способов разделения молекулярных единиц по молекулярной массе.

В некоторых вариантах осуществления, амино- или карбоксильный конец пептидной или белковой последовательности по настоящему описанию может быть слит с Fc областью иммуноглобулина (например, Fc человека) с образованием слитого конъюгата (или слитой молекулы). Было показано, что Fc слитые конъюгаты увеличивают системный период полужизни биофармацевтических препаратов, и, таким образом, биофармацевтический продукт может потребовать менее частого введения. Fc связывается с неонатальным Fc рецептором (FcRn) в эндотелиальных клетках, выстилающих кровеносные сосуды, и при связывании Fc слитая молекула защищена от деградации и повторно высвобождается в кровоток, удерживая молекулу в кровотоке дольше. Таким образом, Fc связывание считается механизмом, с помощью которого эндогенный IgG сохраняет свой длительный период полужизни в плазме. Более поздняя технология Fc слияния связывает одну копию биофармацевтического агента с Fc областью антитела для оптимизации фармакокинетических и фармакодинамических свойств биофармацевтического агента по сравнению с традиционными Fc-слитыми конъюгатами.

Настоящее описание предполагает использование других модификаций пептидов, известных или разрабатываемых в настоящее время, для улучшения одного или нескольких свойств. Один из таких способов продления периода полужизни в кровотоке, увеличения стабильности, уменьшения клиренса или изменения иммуногенности или аллергенности пептида по настоящему описанию включает модификацию пептидных последовательностей путем гезилирования, в котором используются производные гидроксиэтилкрахмала, связанные с другими молекулами с целью изменения характеристики молекулы. Различные аспекты гезилирования описаны, например, в заявках на патент США №№ 2007/0134197 и 2006/0258607.

Стабильность пептидов можно оценить несколькими способами. Например, пептидазы и различные биологические среды, такие как плазма и сыворотка человека, были использованы для тестирования стабильности. См., например, Verhoef, et al., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinetics 11:291 (1986). Период полужизни описанных в настоящем изобретении пептидов удобно определять с использованием анализа 25% сыворотки человека (об./об.). Протокол следующий: объединенную сыворотку человека (тип AB, не инактивированную нагреванием) разрушают центрифугированием перед использованием. Затем сыворотку разводят до 25% RPMI-1640 или другой подходящей средой для культивирования тканей. Через заранее определенные интервалы времени небольшое количество реакционного раствора удаляют и добавляют либо к 6% водной трихлоруксусной кислоте (TCA), либо к этанолу. Мутный реакционный образец охлаждают (4°C) в течение 15 минут, и затем центрифугируют для пеллетирования осажденных белков сыворотки. Затем присутствие пептидов определяют ВЭЖХ с обращенной фазой с использованием условий стабильность-специфической хроматографии.

Проблемы, связанные с коротким периодом полужизни в плазме или склонностью к протеазной деградации, можно решить с помощью различных модификаций, включая конъюгацию или связывание пептидной или белковой последовательности с любым из множества не белковых полимеров, например, полиэтиленгликолем (PEG), полипропиленгликолем или полиоксиалкиленами (см., например, обычно через связующую группу, ковалентно связанную как с белком, так и с не белковым полимером, например, PEG). Было показано, что такие PEG-конъюгированные биомолекулы обладают клинически полезными свойствами, включая лучшую физическую и термическую стабильность, защиту от склонности к ферментативному расщеплению, повышенную растворимость, более длительный период полужизни в кровотоке in vivo и сниженный клиренс, сниженную иммуногенность и антигенность, и сниженную токсичность.

PEG, подходящие для конъюгирования с полипептидной или белковой последовательностью, обычно растворимы в воде при комнатной температуре и имеют общую формулу R-(O-CH₂-CH₂)_n-OR, где R является водородом или защитной группой, такой, как алкильная или алканольная группа, и где n является целым числом от 1 до 1000. Если R является защитной группой, она обычно имеет от 1 до 8 атомов углерода. PEG, конъюгированный с полипептидной последовательностью, может быть линейным или разветвленным. Разветвленные производные PEG, «звездообразные PEG» и PEG с множеством ответвлений рассматриваются настоящим описанием. В настоящем описании также рассматриваются композиции конъюгатов, в которых PEG имеют разные значения n и, таким образом, разные различные PEG присутствуют в определенных соотношениях. Например, некоторые композиции содержат смесь конъюгатов, где n=1, 2, 3 и 4. В некоторых композициях, доля конъюгатов, где n=1, составляет 18-25%, доля конъюгатов, где n=2, составляет 50-66%, доля конъюгатов, где n=3, составляет 12-16%, и доля конъюгатов, где n=4, составляет до 5%. Такие композиции могут быть получены в условиях реакции и способами очистки, известными в данной области техники. Например, для разделения конъюгатов можно использовать катионообменную хроматографию, и затем идентифицируют фракцию, которая содержит конъюгат, имеющий, например, желаемое количество присоединенных PEG, очищенный от не модифицированных белковых последовательностей и конъюгатов, имеющих другое количество присоединенных PEG.

PEG может быть связан с пептидом или белком по настоящему изобретению через концевую реакционноспособную группу («спейсер»). Спейсером является, например, концевая реакционноспособная группа, которая опосредует связь между свободными амино или карбоксильными группами одной или нескольких полипептидных последовательностей и PEG. PEG, имеющий спейсер, который может быть связан со свободной аминогруппой, содержит N-гидроксисукцинилимид PEG, который может быть получен путем активации сложного эфира янтарной кислоты PEG с N-гидроксисукцинилимидом. Другим активированным PEG, который может быть связан со свободной аминогруппой, является 2,4-бис(О-метоксиполиэтиленгликоль)-6-хлор-s-триазин, который может быть получен взаимодействием монометилового эфира PEG с циануровым хлоридом. Активированный PEG, связанный со свободной карбоксильной группой, включает полиоксиэтилендиамин.

Конъюгация одной или нескольких пептидных или белковых последовательностей по настоящему изобретению с PEG, имеющим спейсер, может быть осуществлена различными общепринятыми способами. Например, реакцию конъюгации можно проводить в растворе при pH от 5 до 10, при температуре от 4°C до комнатной температуры в течение от 30 минут до 20 часов, используя молярное отношение реагента к пептиду/белку от 4:1 до 30:1. Условия реакции могут быть выбраны так, чтобы направить реакцию в сторону получения преимущественно желаемой степени замещения. Как правило, низкая температура, низкий pH (например, pH=5) и короткое время реакции имеют тенденцию к уменьшению количества прикрепленных PEG, тогда как высокая температура, от нейтрального до высокого pH (например, pH >7) и более длительное время реакции имеют тенденцию для увеличения количества прикрепленных PEG. Для прекращения реакции можно использовать различные средства, известные в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления, реакцию останавливают подкислением реакционной смеси и замораживанием, например, при -20°C.

Неоэпитопы

Неоэпитоп содержит часть неодетерминанты неоантигенного пептида или неоантигенного полипептида, которая распознается иммунной системой. Неоэпитоп относится к эпитопу, который не присутствует в эталоне, таком как здоровая клетка, например, не злокачественная клетка или клетка зародышевой линии, но обнаруживается в больной клетке, например, раковой клетке. Сюда включены ситуации, когда соответствующий эпитоп обнаруживается в нормальной здоровой клетке или клетке зародышевой линии, но из-за одной или нескольких мутаций в больной клетке, например, раковой клетке, последовательность эпитопа изменяется так, что в результате получается неоэпитоп. Термин «неоэпитоп» используется взаимозаменяемо с «опухолеспецифическим эпитопом» или «опухолеспецифическим неоэпитопом» в настоящем описании для обозначения серии остатков, обычно L-аминокислот, соединенных друг с другом, обычно пептидными связями между α-амино и карбоксильными группами соседних аминокислот. Неоэпитоп может иметь различную длину либо в их нейтральных (незаряженных) формах, либо в формах, которые являются солями, и либо не содержит модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепи или фосфорилирование, либо содержит эти модификации, при условии, что модификация не нарушает биологическую активность полипептидов, как описано в настоящем изобретении. Настоящее изобретение относится к выделенным неоэпитопам, которые содержат опухолеспецифическую мутацию таблиц 1-12.

В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, описанные в настоящем изобретении для MHC класса I HLA, имеют длину 12 или менее аминокислотных остатков или менее и обычно состоят из от приблизительно 8 до приблизительно 12 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитопы, описанные в настоящем изобретении для MHC класса I HLA, содержат приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11 или приблизительно 12 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитопы, описанные в настоящем изобретении для MHC класса II HLA, имеют длину 25 или менее аминокислотных остатков и обычно состоят из от приблизительно 9 до приблизительно 25 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитопы, описанные в настоящем изобретении для MHC класса II HLA, содержат приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24 или приблизительно 25 аминокислотных остатков.

В некоторых вариантах осуществления, описанная в настоящем изобретении композиция содержит первый пептид, содержащий первый неоэпитоп белка, и второй пептид, содержащий второй неоэпитоп того же белка, где первый пептид отличается от второго пептида, и где первый неоэпитоп содержит мутацию, и второй неоэпитоп содержит ту же мутацию. В некоторых вариантах осуществления, описанная в настоящем изобретении композиция содержит первый пептид, содержащий первый неоэпитоп первой области белка, и второй пептид, содержащий второй неоэпитоп второй области того же белка, где первая область содержит по меньшей мере одну аминокислоту второй области, где первый пептид отличается от второго пептида, и где первый неоэпитоп содержит первую мутацию, и второй неоэпитоп содержит вторую мутацию. В некоторых вариантах осуществления, первая и вторая мутации одинаковы. В некоторых вариантах осуществления, мутация выбрана из группы, состоящей из точечной мутации, мутации сайта сплайсинга, мутации сдвига рамки считывания, мутации сквозного прочитывания, мутации слияния гена и любой их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп связывается с белком HLA класса I с образованием комплекса HLA класса I-пептид. В некоторых вариантах осуществления, второй неоэпитоп связывается с белком HLAa класса II с образованием комплекса HLA класса II-пептид. В некоторых вариантах осуществления, второй неоэпитоп связывается с белком HLA класса I с образованием комплекса HLA класса I-пептид. В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп связывается с белком HLA класса II с образованием комплекса HLA класса II-пептид. В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп активирует CD8⁺ Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп активирует CD4⁺ Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления, второй неоэпитоп активирует CD4⁺ Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления, второй неоэпитоп активирует CD8⁺ Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления, TCR CD4⁺ Т-клетки связывается с комплексом HLA класса II-пептид. В некоторых вариантах осуществления, TCR CD8⁺ Т-клетки связывается с комплексом HLA класса II-пептид. В некоторых вариантах осуществления, TCR CD8⁺Т-клетки связывается с комплексом HLA класса I-пептид. В некоторых вариантах осуществления, TCR CD4⁺Т-клетки связывается с комплексом HLA класса I-пептид.

В некоторых вариантах осуществления, второй неоэпитоп длиннее первого неоэпитопа. В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп имеет длину по меньшей мере 8 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп имеет длину от 8 до 12 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп содержит последовательность, по меньшей мере из 8 непрерывных аминокислот, где по меньшей мере 1 из 8 непрерывных аминокислот отличается в соответствующих положениях последовательности дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп содержит последовательность, по меньшей мере из 8 непрерывных аминокислот, где по меньшей мере 2 из 8 непрерывных аминокислот отличаются в соответствующих положениях последовательности дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, второй неоэпитоп имеет длину по меньшей мере 16 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, второй неоэпитоп имеет длину от 16 до 25 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, второй неоэпитоп содержит последовательность, по меньшей мере из 16 непрерывных аминокислот, где по меньшей мере 1 из 16 непрерывных аминокислот отличается в соответствующих положениях последовательности дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, второй неоэпитоп содержит последовательность по меньшей мере из 16 непрерывных аминокислот, где по меньшей мере 2 из 16 непрерывных аминокислот отличаются в соответствующих положениях последовательности дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп содержит по меньшей мере один якорный остаток. В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп, второй неоэпитоп или оба они содержат по меньшей мере один якорный остаток. В одном варианте осуществления, по меньшей мере один якорный остаток первого неоэпитопа находится в каноническом якорном положении или не каноническом якорном положении. В другом варианте осуществления, по меньшей мере один якорный остаток второго неоэпитопа находится в каноническом якорном положении или не каноническом якорном положении. В еще одном варианте осуществления, по меньшей мере один якорный остаток первого неоэпитопа отличается от, по меньшей мере одного якорного остатка второго неоэпитопа.

В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одним якорный остатком является остаток дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одним якорным остатком является замена. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере один якорный остаток не содержит мутацию.

В некоторых вариантах осуществления, второй неоэпитоп или оба содержат по меньшей мере одну фланкирующую область якорного остатка. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп содержит по меньшей мере один якорный остаток. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере один якорный остаток содержит по меньшей мере два якорных остатка. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере два якорных остатка разделены областью разделения, содержащей, по меньшей мере 1 аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна фланкирующая область якорного остатка находится за пределами области разделения. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна фланкирующая область якорного остатка находится (а) выше N-концевого якорного остатка, по меньшей мере двух якорных остатков; (b) ниже C-концевого якорного остатка, по меньшей мере двух якорных остатков; или оба (а) и (b).

В некоторых вариантах осуществления, неоэпитопы связывают белок HLA (например, HLA MHC класса I или HLA MHC класса II). В некоторых вариантах осуществления, неоэпитопы связывают белок HLA с большей аффинностью, чем соответствующий пептид дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп имеет IC₅₀ менее 5000 нМ, менее 1000 нМ, менее 500 нМ, менее 100 нМ, менее 50 нМ или менее. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп может иметь аффинность связывания с HLA от приблизительно 1 пМ до приблизительно 1 мМ, от приблизительно 100 пМ до приблизительно 500 мкМ, от приблизительно 500 пМ до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 1 нМ до приблизительно 1 мкМ, или от приблизительно 10 нМ до приблизительно 1 мкМ. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп может иметь аффинность связывания HLA, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 или 2000 нМ или более. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп может иметь аффинность связывания HLA не более 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 или 2000 нМ.

В некоторых вариантах осуществления, первый и/или второй неоэпитоп связывается с белком HLA с большей аффинностью, чем соответствующий неоэпитоп дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, первый и/или второй неоэпитоп связывается с белком HLA с K_D или IC₅₀ менее 1000 нМ, 900 нМ, 800 нМ, 700 нМ, 600 нМ, 500 нМ, 250 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ или 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления, первый и/или второй неоэпитоп связывается с белком HLA класса I с K_D или IC₅₀ менее 1000 нМ, 900 нМ, 800 нМ, 700 нМ, 600 нМ, 500 нМ, 250 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ или 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления, первый и/или второй неоэпитоп связывается с белком HLA класса II с K_D или IC₅₀ менее 2000 нМ, 1500 нМ, 1000 нМ, 900 нМ, 800 нМ, 700 нМ, 600 нМ, 500 нМ, 250 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ или 10 нМ.

В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп связывается с HLA MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп связывается с HLA MHC класса I с аффинностью от 0,1 нМ до 2000 нМ. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп связывается с HLA MHC класса I с аффинностью 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 или 2000 М. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп связывается с HLA MHC класса II. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп связывается с HLA MHC класса II с аффинностью от 0,1 нМ до 2000 нМ, от 1 нМ до 1000 нМ, от 10 нМ до 500 нМ или менее 1000 нМ. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп связывается с HLA MHC класса II с аффинностью 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 или 2000 нМ.

В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп связывается с HLA MHC класса I со стабильностью от 10 минут до 24 часов. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп связывается с HLA MHC класса I со стабильностью 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп связывается с HLA MHC класса I со стабильностью 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 часа. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп связывается с HLA MHC класса II со стабильностью от 10 минут до 24 часов. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп связывается с HLA MHC класса II со стабильностью 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп связывается с HLA MHC класса II со стабильностью 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 часа.

В одном аспекте, первый и/или второй неоэпитоп связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, экспрессируемым субъектом. В другом аспекте, мутация отсутствует в не раковых клетках субъекта. В еще одном аспекте, первый и/или второй неоэпитоп кодируется геном или экспрессированным геном раковых клеток субъекта. В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп содержит мутацию, как показано в столбце 1 таблиц 1-12. В некоторых вариантах осуществления, второй неоэпитоп содержит мутацию, как показано в столбце 1 таблиц 1-12. Например, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп могут содержать последовательность ALNSEALSVV (SEQ ID NO: 368). Например, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп могут содержать последовательность MALNSEALSV (SEQ ID NO: 369).

В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп происходят из белка KRAS. В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп происходят из белка NRAS. В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп происходят из белка KRAS, содержащего мутацию G12C, G12D, G12V, Q61H или Q61L замены. В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп происходят из белка NRAS, содержащего мутацию Q61K или Q61R замены. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп содержит мутацию замены, например, KRAS G12C, G12D, G12V, Q61H или Q61L мутацию или NRAS Q61K или Q61R мутацию. В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп происходят из KRAS или NRAS белковой последовательности MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVV IDGETCLLDILDTAGQE (SEQ ID NO: 309). Например, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп могут содержать последовательность KLVVVGACGV (SEQ ID NO: 10). Например, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп могут содержать последовательность LVVVGACGV (SEQ ID NO: 310). Например, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп могут содержать последовательность VVGACGVGK (SEQ ID NO: 200). Например, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп могут содержать последовательность VVVGACGVGK (SEQ ID NO: 197). В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп происходят из KRAS или NRAS белковой последовательности MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEVVGADGVGK (SEQ ID NO: 370). Например, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп могут содержать последовательность VVVGADGVGK (SEQ ID NO: 203). Например, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп могут содержать последовательность KLVVVGADGV (SEQ ID NO: 312). Например, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп могут содержать последовательность LVVVGADGV (SEQ ID NO: 313).

В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп происходят из KRAS или NRAS белковой последовательности MTEYKLVVVGAVGVG KSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE (SEQ ID NO: 314). Например, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп могут содержать последовательность KLVVVGAVGV (SEQ ID NO: 315). Например, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп могут содержать последовательность LVVVGAVGV (SEQ ID NO: 316). Например, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп могут содержать последовательность VVGAVGVGK (SEQ ID NO: 220). Например, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп могут содержать последовательность VVVGAVGVGK (SEQ ID NO: 218).

В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп происходят из KRAS или NRAS белковой последовательности AGGVGKSALTIQ LIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGHEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM (SEQ ID NO: 317). Например, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп могут содержать последовательность ILDTAGHEEY (SEQ ID NO: 318).

В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп происходят из KRAS или NRAS белковой последовательности AGGVGKSALTIQLIQ NHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGLEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM (SEQ ID NO: 319). Например, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп могут содержать последовательность ILDTAGLEEY(SEQ ID NO: 320). Например, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп могут содержать последовательность LLDILDTAGL (SEQ ID NO: 321).

В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп происходят из KRAS или NRAS белковой последовательности AGGVGKSALTIQLIQ NHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGKEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINDSQUEQUEQUEQ (SEQ ID NO: 322). Например, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп могут содержать последовательность ILDTAGKEEY (SEQ ID NO: 323).

В некоторых вариантах осуществления, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп происходят из KRAS или NRAS белковой последовательности AGGVGKSALTIQLIQN HFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGREEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPM (SEQ ID NO: 324). Например, первый неоэпитоп и второй неоэпитоп могут содержать последовательность ILDTAGREEY (SEQ ID NO: 325).

В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из: DTAGHEEY (SEQ ID NO: 22), TAGHEEYSAM (SEQ ID NO: 23), DILDTAGHE (SEQ ID NO: 24), DILDTAGH (SEQ ID NO: 25), ILDTAGHEE (SEQ ID NO: 26), ILDTAGHE (SEQ ID NO: 27), DILDTAGHEEY (SEQ ID NO: 28), DTAGHEEYS (SEQ ID NO: 29), LLDILDTAGH (SEQ ID NO: 30), DILDTAGRE (SEQ ID NO: 31), DILDTAGR (SEQ ID NO: 32), ILDTAGREE (SEQ ID NO: 33), ILDTAGRE (SEQ ID NO: 34), CLLDILDTAGR (SEQ ID NO: 35), TAGREEYSAM (SEQ ID NO: 36), REEYSAMRD (SEQ ID NO: 37), DTAGKEEYSAM (SEQ ID NO: 38), CLLDILDTAGK (SEQ ID NO: 39), DTAGKEEY (SEQ ID NO: 40), LLDILDTAGK (SEQ ID NO: 41), ILDTAGKE (SEQ ID NO: 42), ILDTAGKEE (SEQ ID NO: 43), DTAGLEEY (SEQ ID NO: 44), ILDTAGLE (SEQ ID NO: 45), DILDTAGL (SEQ ID NO: 46), ILDTAGLEE (SEQ ID NO: 47), GLEEYSAMRDQY (SEQ ID NO: 48), LLDILDTAGLE (SEQ ID NO: 49), LDILDTAGL (SEQ ID NO: 50), DILDTAGLE (SEQ ID NO: 51), DILDTAGLEEY (SEQ ID NO: 52), AGVGKSAL (SEQ ID NO: 53), GAAGVGKSAL (SEQ ID NO: 54), AAGVGKSAL (SEQ ID NO: 55), CGVGKSAL (SEQ ID NO: 56), ACGVGKSAL (SEQ ID NO: 57), DGVGKSAL (SEQ ID NO: 58), ADGVGKSAL (SEQ ID NO: 59), DGVGKSALTI (SEQ ID NO: 60), GARGVGKSA (SEQ ID NO: 61), KLVVVGARGV (SEQ ID NO: 62), VVVGARGV (SEQ ID NO: 63), SGVGKSAL (SEQ ID NO: 64), VVVGASGVGK (SEQ ID NO: 65), GASGVGKSAL (SEQ ID NO: 66), VGVGKSAL (SEQ ID NO: 67), VVVGAGCVGK (SEQ ID NO: 68), KLVVVGAGC (SEQ ID NO: 69), GDVGKSAL (SEQ ID NO: 70), DVGKSALTI (SEQ ID NO: 71), VVVGAGDVGK (SEQ ID NO: 72), TAGKEEYSAM (SEQ ID NO: 73), DTAGHEEYSAM (SEQ ID NO: 74), TAGHEEYSA (SEQ ID NO: 75), DTAGREEYSAM (SEQ ID NO: 76), TAGKEEYSA (SEQ ID NO: 77), AAGVGKSA (SEQ ID NO: 78), AGCVGKSAL (SEQ ID NO: 79), AGDVGKSAL (SEQ ID NO: 80), AGKEEYSAMR (SEQ ID NO: 81), AGVGKSALTI (SEQ ID NO: 82), ARGVGKSAL (SEQ ID NO: 83), ASGVGKSA (SEQ ID NO: 84), ASGVGKSAL (SEQ ID NO: 85), AVGVGKSA (SEQ ID NO: 86), CVGKSALTI (SEQ ID NO: 87), DILDTAGK (SEQ ID NO: 88), DILDTAGREEY (SEQ ID NO: 89), DTAGHEEYSAMR (SEQ ID NO: 90), DTAGKEEYS (SEQ ID NO: 91), DTAGKEEYSAMR (SEQ ID NO: 92), DTAGLEEYS (SEQ ID NO: 93), DTAGLEEYSA (SEQ ID NO: 94), DTAGLEEYSAMR (SEQ ID NO: 95), DTAGREEYS (SEQ ID NO: 96), DTAGREEYSAMR (SEQ ID NO: 97), GAAGVGKSA (SEQ ID NO: 98), GACGVGKSA (SEQ ID NO: 8), GACGVGKSAL (SEQ ID NO: 5), GADGVGKS (SEQ ID NO: 99), GAGDVGKSA (SEQ ID NO: 100), GAGDVGKSAL (SEQ ID NO: 101), GASGVGKSA (SEQ ID NO: 102), GCVGKSAL (SEQ ID NO: 103), GCVGKSALTI (SEQ ID NO: 104), GHEEYSAM (SEQ ID NO: 105), GKEEYSAM (SEQ ID NO: 106), GLEEYSAMR (SEQ ID NO: 107), GREEYSAM (SEQ ID NO: 108), GREEYSAMR (SEQ ID NO: 109), HEEYSAMRD (SEQ ID NO: 110), KEEYSAMRD (SEQ ID NO: 111), KLVVVGASG (SEQ ID NO: 112), LDILDTAGR (SEQ ID NO: 113), LEEYSAMRD (SEQ ID NO: 114), LVVVGARGV (SEQ ID NO: 115), LVVVGASGV (SEQ ID NO: 116), REEYSAMRDQY (SEQ ID NO: 117), RGVGKSAL (SEQ ID NO: 118), TAGLEEYSA (SEQ ID NO: 119), TEYKLVVVGAA (SEQ ID NO: 120), VGAAGVGKSA (SEQ ID NO: 121), VGADGVGK (SEQ ID NO: 122), VGASGVGKSA (SEQ ID NO: 123), VGVGKSALTI (SEQ ID NO: 124), VVVGAAGV (SEQ ID NO: 125), VVVGAVGV (SEQ ID NO: 126), YKLVVVGAC (SEQ ID NO: 127), YKLVVVGAD (SEQ ID NO: 128), YKLVVVGAR (SEQ ID NO: 129) и DILDTAGKE (SEQ ID NO: 130).

В некоторых вариантах осуществления неоэпитоп содержит эпитоп RAS. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп содержит мутантную последовательность RAS, которая содержит по меньшей мере 8 непрерывных аминокислот мутантного белка RAS, содержащего мутацию на G12, G13 или Q61 и мутацию на G12, G13 или Q61. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере 8 непрерывных аминокислот мутантного белка RAS, содержащего мутацию на G12, G13 или Q61, содержат G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K или Q61R мутацию. В некоторых вариантах осуществления, мутация на G12, G13 или Q61 содержит мутацию G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K или Q61R.

В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп, содержащий мутантную последовательность RAS, содержит аминокислотную последовательность GADGVGKSAL (SEQ ID NO: 4), GACGVGKSAL (SEQ ID NO: 5), GAVGVGKSAL (SEQ ID NO: 6), GADGVGKSA (SEQ ID NO: 7), GACGVGKSA (SEQ ID NO: 8), GAVGVGKSA (SEQ ID NO: 9), KLVVVGACGV (SEQ ID NO: 10), FLVVVGACGL (SEQ ID NO: 11), FMVVVGACGI (SEQ ID NO: 12), FLVVVGACGI (SEQ ID NO: 13), FMVVVGACGV (SEQ ID NO: 14), FLVVVGACGV (SEQ ID NO: 15), MLVVVGACGV (SEQ ID NO: 16), FMVVVGACGL (SEQ ID NO: 17), YLVVVGACGV (SEQ ID NO: 18), KMVVVGACGV (SEQ ID NO: 19), YMVVVGACGV (SEQ ID NO: 20), MMVVVGACGV (SEQ ID NO: 21), DTAGHEEY (SEQ ID NO: 22), TAGHEEYSAM (SEQ ID NO: 23), DILDTAGHE (SEQ ID NO: 24), DILDTAGH (SEQ ID NO: 25), ILDTAGHEE (SEQ ID NO: 26), ILDTAGHE (SEQ ID NO: 27), DILDTAGHEEY (SEQ ID NO: 28), DTAGHEEYS (SEQ ID NO: 29), LLDILDTAGH (SEQ ID NO: 30), DILDTAGRE (SEQ ID NO: 31), DILDTAGR (SEQ ID NO: 32), ILDTAGREE (SEQ ID NO: 33), ILDTAGRE (SEQ ID NO: 34), CLLDILDTAGR (SEQ ID NO: 35), TAGREEYSAM (SEQ ID NO: 36), REEYSAMRD (SEQ ID NO: 37), DTAGKEEYSAM (SEQ ID NO: 38), CLLDILDTAGK (SEQ ID NO: 39), DTAGKEEY (SEQ ID NO: 40), LLDILDTAGK (SEQ ID NO: 41), ILDTAGKE (SEQ ID NO: 42), ILDTAGKEE (SEQ ID NO: 43), DTAGLEEY (SEQ ID NO: 44), ILDTAGLE (SEQ ID NO: 45), DILDTAGL (SEQ ID NO: 46), ILDTAGLEE (SEQ ID NO: 47), GLEEYSAMRDQY (SEQ ID NO: 48), LLDILDTAGLE (SEQ ID NO: 49), LDILDTAGL (SEQ ID NO: 50), DILDTAGLE (SEQ ID NO: 51), DILDTAGLEEY (SEQ ID NO: 52), AGVGKSAL (SEQ ID NO: 53), GAAGVGKSAL (SEQ ID NO: 54), AAGVGKSAL (SEQ ID NO: 55), CGVGKSAL (SEQ ID NO: 56), ACGVGKSAL (SEQ ID NO: 57), DGVGKSAL (SEQ ID NO: 58), ADGVGKSAL (SEQ ID NO: 59), DGVGKSALTI (SEQ ID NO: 60), GARGVGKSA (SEQ ID NO: 61), KLVVVGARGV (SEQ ID NO: 62), VVVGARGV (SEQ ID NO: 63), SGVGKSAL (SEQ ID NO: 64), VVVGASGVGK (SEQ ID NO: 65), GASGVGKSAL (SEQ ID NO: 66), VGVGKSAL (SEQ ID NO: 67), VVVGAGCVGK (SEQ ID NO: 68), KLVVVGAGC (SEQ ID NO: 69), GDVGKSAL (SEQ ID NO: 70), DVGKSALTI (SEQ ID NO: 71), VVVGAGDVGK (SEQ ID NO: 72), TAGKEEYSAM (SEQ ID NO: 73), DTAGHEEYSAM (SEQ ID NO: 74), TAGHEEYSA (SEQ ID NO: 75), DTAGREEYSAM (SEQ ID NO: 76), TAGKEEYSA (SEQ ID NO: 77), AAGVGKSA (SEQ ID NO: 78), AGCVGKSAL (SEQ ID NO: 79), AGDVGKSAL (SEQ ID NO: 80), AGKEEYSAMR (SEQ ID NO: 81), AGVGKSALTI (SEQ ID NO: 82), ARGVGKSAL (SEQ ID NO: 83), ASGVGKSA (SEQ ID NO: 84), ASGVGKSAL (SEQ ID NO: 85), AVGVGKSA (SEQ ID NO: 86), CVGKSALTI (SEQ ID NO: 87), DILDTAGK (SEQ ID NO: 88), DILDTAGREEY (SEQ ID NO: 89), DTAGHEEYSAMR (SEQ ID NO: 90), DTAGKEEYS (SEQ ID NO: 91), DTAGKEEYSAMR (SEQ ID NO: 92), DTAGLEEYS (SEQ ID NO: 93), DTAGLEEYSA (SEQ ID NO: 94), DTAGLEEYSAMR (SEQ ID NO: 95), DTAGREEYS (SEQ ID NO: 96), DTAGREEYSAMR (SEQ ID NO: 97), GAAGVGKSA (SEQ ID NO: 98), GACGVGKSA (SEQ ID NO: 8), GACGVGKSAL (SEQ ID NO: 5), GADGVGKS (SEQ ID NO: 99), GAGDVGKSA (SEQ ID NO: 100), GAGDVGKSAL (SEQ ID NO: 101), GASGVGKSA (SEQ ID NO: 102), GCVGKSAL (SEQ ID NO: 103), GCVGKSALTI (SEQ ID NO: 104), GHEEYSAM (SEQ ID NO: 105), GKEEYSAM (SEQ ID NO: 106), GLEEYSAMR (SEQ ID NO: 107), GREEYSAM (SEQ ID NO: 108), GREEYSAMR (SEQ ID NO: 109), HEEYSAMRD (SEQ ID NO: 110), KEEYSAMRD (SEQ ID NO: 111), KLVVVGASG (SEQ ID NO: 112), LDILDTAGR (SEQ ID NO: 113), LEEYSAMRD (SEQ ID NO: 114), LVVVGARGV (SEQ ID NO: 115), LVVVGASGV (SEQ ID NO: 116), REEYSAMRDQY (SEQ ID NO: 117), RGVGKSAL (SEQ ID NO: 118), TAGLEEYSA (SEQ ID NO: 119), TEYKLVVVGAA (SEQ ID NO: 120), VGAAGVGKSA (SEQ ID NO: 121), VGADGVGK (SEQ ID NO: 122), VGASGVGKSA (SEQ ID NO: 123), VGVGKSALTI (SEQ ID NO: 124), VVVGAAGV (SEQ ID NO: 125), VVVGAVGV (SEQ ID NO: 126), YKLVVVGAC (SEQ ID NO: 127), YKLVVVGAD (SEQ ID NO: 128), YKLVVVGAR (SEQ ID NO: 129) или DILDTAGKE (SEQ ID NO: 130).

В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп, содержащий мутантную последовательность RAS, связывается с белком, кодируемым аллелем HLA. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп, содержащий мутантную последовательность RAS, связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, с аффинностью менее 10 мкМ, менее 9 мкМ, менее 8 мкМ, менее 7 мкМ, менее 6 мкМ, менее 5 мкМ, менее 4 мкМ, менее 3 мкМ, менее 2 мкМ, менее 1 мкМ, менее 950 нМ, менее 900 нМ, менее 850 нМ, менее 800 нМ, менее 750 нМ, менее 600 нМ, менее 550 нМ, менее 500 нМ, менее 450 нМ, менее 400 нМ, менее 350 нМ, менее 300 нМ, менее 250 нМ, менее 200 нМ, менее 150 нМ, менее 100 нМ, менее 90 нМ, менее 80 нМ, менее 70 нМ, менее 60 нМ, менее 50 нМ, менее 40 нМ, менее 30 нМ, менее 20 нМ или менее 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп, содержащий мутантную последовательность RAS, связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, со стабильностью более 24 часов, более 23 часов, более 22 часов, более 21 часа, более 20 часов, более 19 часов, более 18 часов, более 17 часов, более 16 часов, более 15 часов, более 14 часов, более 13 часов, более 12 часов, более 11 часов, более 10 часов, более 9 часов, более 8 часов, более 7 часов, более 6 часов, более 5 часов, более 4 часов, более 3 часов, более 2 часов, более 1 часа, более 55 минут, более 50 минут, более 45 минут, более 40 минут, более 35 минут, более 30 минут, более 25 минут, более 20 минут, более 15 минут, более 10 минут, более 9 минут, более 8 минут, более 7 минут, более 6 минут, более 5 минут, более 4 минут, более 3 минут, более 2 минут или более 1 минуты.

Замена может располагаться где угодно по длине неоэпитопа. Например, она может располагаться в N-концевой трети пептида, в центральной трети пептида или в C-концевой трети пептида. В другом варианте осуществления, замещенный остаток расположен в 2-5 остатках от N-конца или в 2-5 остатках от С-конца. Пептиды могут быть аналогичным образом получены из опухолеспецифических инсерционных мутаций, если пептид содержит один или более или все вставленные остатки.

В некоторых вариантах осуществления, описанный в настоящем изобретении пептид может быть легко синтезирован химическим путем с использованием реагентов, не содержащих загрязняющих бактериальных или животных веществ (Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc.85:2149-54, 1963). В некоторых вариантах осуществления, пептиды получают посредством (1) параллельного твердофазного синтеза на многоканальных приборах с использованием одинаковых условий синтеза и расщепления; (2) очистки на колонке ОФ-ВЭЖХ с десорбцией колонки; и повторной промывкой, но без замещения, между пептидами; с последующим (3) анализом ограниченным набором наиболее информативных анализов. Good Manufacturing Practices (GMP) может быть определена вокруг набора пептидов для отдельного пациента, что требует процедур перенастройки только между синтезами пептидов для разных пациентов. В некоторых вариантах осуществления, можно использовать любые смолы, предназначенные для твердофазного синтеза пептидов.

Полинуклеотиды

Альтернативно, нуклеиновая кислота (например, полинуклеотид), кодирующая пептид по настоящему изобретению, может быть использована для получения неоантигенного пептида in vitro. Полинуклеотид может представлять собой, например, ДНК, кДНК, РНК, либо одно- и/или двухцепочечную, либо нативные, либо стабилизированные формы полинуклеотидов, такие как, например, полинуклеотиды с фосфоротиатным остовом, или их комбинации, и он может содержать или не содержать интроны до тех пор, пока он кодирует пептид. В некоторых вариантах осуществления, трансляцию in vitro используют для получения пептида.

Изобретение относится к неоантигенные полинуклеотиды, кодирующие каждый из неоантигенных полипептидов, описанных в настоящем описании. Термин «полинуклеотид», «нуклеотиды» или «нуклеиновая кислота» используется взаимозаменяемо с терминами «мутантный полинуклеотид», «мутантный нуклеотид», «мутантная нуклеиновая кислота», «неоантигенный полинуклеотид», «неоантигенный нуклеотид» или «неоантигенная мутантная нуклеиновая кислота» в настоящем описании. Различные последовательности нуклеиновых кислот могут кодировать один и тот же пептид из-за повторяемости генетического кода. Каждая из этих нуклеиновых кислот подпадает под объем настоящего изобретения. Нуклеиновыми кислотами, кодирующими пептиды, могут быть ДНК или РНК, например, иРНК, или комбинацию ДНК и РНК. В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид, является самоамплифицирующаяся иРНК (Brito et al., Adv. Genet. 2015; 89:179-233). Любой подходящий полинуклеотид, кодирующий пептид, описанный в настоящем изобретении, подпадает в объем настоящего описания.

В некоторых вариантах осуществления, кодирующие последовательности для двух последовательных антигенных пептидов разделены спейсером или линкером. В некоторых вариантах осуществления, кодирующие последовательности двух последовательных антигенных пептидов примыкают друг к другу. В некоторых вариантах осуществления, кодирующие последовательности для двух последовательных антигенных пептидов не разделены спейсером или линкером.

В некоторых вариантах осуществления, спейсер или линкер содержит до 5000 нуклеотидных остатков. Типовой последовательностью спейсера является GGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGC (SEQ ID NO: 371). Другой типовой последовательностью спейсера является GGCGGCAGCCTGGGCGGCGGCGGCAGCGGC (SEQ ID NO: 372). Другой типовой последовательностью спейсера является GGCGTCGGCACC (SEQ ID NO: 373). Другой типовой последовательностью спейсера является CAGCTGGGCCTG (SEQ ID NO: 374). Другой типовой последовательностью спейсера является последовательность, кодирующая лизин, такая как AAA или AAG. Другой типовой последовательностью спейсера является CAACTGGGATTG (SEQ ID NO: 375).

В некоторых вариантах осуществления, иРНК содержит одну или несколько дополнительных структур для усиления процессинга и презентирования антигенного эпитопа APC.

В некоторых вариантах осуществления, линкер или спейсерная область могут содержать сайты расщепления. Сайты расщепления обеспечивают расщепление белкового продукта, содержащего цепочки последовательностей эпитопа, на отдельные последовательности эпитопа для презентации. Предпочтительные сайты расщепления расположены рядом с определенными эпитопами, чтобы избежать непреднамеренного расщепления эпитопов внутри последовательностей. В некоторых вариантах осуществления, дизайн эпитопов и областей расщепления на цепочках эпитопов, кодирующих иРНК, не является случайным.

Термин «РНК» включает и, в некоторых вариантах осуществления, относится к «иРНК». Термин «иРНК» означает «информационная РНК» и относится к «транскрипту», который создается с использованием матрицы ДНК и кодирует пептид или полипептид. Обычно иРНК содержит 5'-UTR, область, кодирующую белок, и 3'-UTR. иРНК имеет ограниченный период полужизни в клетках и in vitro. В некоторых вариантах осуществления, иРНК является самоамплифицирующаяся иРНК. В контексте настоящего описания, иРНК может быть получена путем транскрипции in vitro из матрицы ДНК. Методика транскрипции in vitro известна специалисту в данной области техники. Например, имеется множество коммерчески доступных наборов для транскрипции in vitro.

При необходимости, можно изменять стабильность и эффективность трансляции РНК. Например, РНК может быть стабилизирована, и ее трансляция может быть увеличена одной или несколькими модификациями, имеющими стабилизирующие эффекты и/или повышающими эффективность трансляции РНК. Такие модификации описаны, например, в PCT/EP2006/009448, включенной в настоящий документ посредством ссылки. Для увеличения экспрессии РНК, используемой в соответствии с настоящим описанием, ее можно модифицировать в пределах кодирующей области, т.е., последовательности, кодирующей экспрессируемый пептид или белок, без изменения последовательности экспрессируемого пептида или белка, чтобы увеличить содержание GC для увеличения стабильности иРНК и для оптимизации кодонов и, таким образом, для повышения трансляции в клетках.

Термин «модификация» в контексте РНК, используемой в настоящем изобретении, включает любую модификацию РНК, которая в природе не присутствует в указанной РНК. В некоторых вариантах осуществления, РНК не имеет не кэпированных 5'-трифосфатов. Удаление таких не кэпированных 5'-трифосфатов может быть достигнуто обработкой РНК фосфатазой. В других вариантах осуществления, РНК может иметь модифицированные рибонуклеотиды для повышения ее стабильности и/или снижения цитотоксичности. В некоторых вариантах осуществления, 5-метилцитидин может быть частично или полностью заменен в РНК, например, на цитидин. Альтернативно, псевдоуридин частично или полностью заменен, например, уридином.

В некоторых вариантах осуществления, термин «модификация» относится к предоставлению РНК с 5'-кэпом или аналогом 5'-кэпа. Термин «5'-кэп» относится к структуре кэпа, обнаруженной на 5'-конце молекулы иРНК, и обычно состоит из гуанозинового нуклеотида, связанного с иРНК через необычную 5'-5'-трифосфатную связь. В некоторых вариантах осуществления, этот гуанозин метилирован в 7 положении. Термин «обычный 5'-кэп» относится к встречающемуся в природе 5'-кэпу РНК, к 7-метилгуанозиновому кэпу (m G). В контексте настоящего описания, термин «5'-кэп» включает аналог 5'-кэпа, который напоминает структуру кэпа РНК и модифицирован, чтобы обладать способностью стабилизировать РНК и/или усиливать трансляцию РНК, если она присоединена к ней, in vivo и/или в клетке.

В некоторых вариантах осуществления, иРНК, кодирующую неоантигенный пептид по настоящему описанию, вводят субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления, настоящее раскрытие относится к молекулы РНК, олигорибонуклеотида и полирибонуклеотида, содержащие модифицированный нуклеозид, векторы для генной терапии, содержащие их, способы генной терапии и способы подавления транскрипции генов, включающие их. В некоторых вариантах осуществления, вводимая иРНК содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеозид.

Полинуклеотиды, кодирующие описанные в настоящем изобретении пептиды, могут быть синтезированы химическими методами, например методом фосфотриэфира Matteucci, et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981). Полинуклеотиды, кодирующие пептиды, содержащие или состоящие из аналога, могут быть получены простой заменой соответствующих и желаемых оснований нуклеиновой кислоты на те, которые кодируют нативный эпитоп.

В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотиды могут содержать кодирующую последовательность для пептида или белка, слитого в одной и той же рамке считывания с полинуклеотидом, который помогает, например, в экспрессии и/или секреции пептида или белка из клетки-хозяина (например, лидерную последовательность, которая функционирует как секреторная последовательность для контроля транспорта полипептида из клетки). Полипептид, имеющий лидерную последовательность, является пред-белком и может иметь лидерную последовательность, отщепляемую клеткой-хозяином с образованием зрелой формы полипептида.

В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотиды могут содержать кодирующую последовательность для пептида или белка, слитого в той же рамке считывания с маркерной последовательностью, которая позволяет, например, очищать кодированный пептид, который затем может быть включен в персонализированную вакцину против болезни или иммуногенную композицию. Например, последовательность маркера может быть гексагистидиновой меткой (SEQ ID NO: 376), поставляемой вектором pQE-9 для обеспечения очистки зрелого полипептида, слитого с маркером, в случае бактериального хозяина, или последовательность маркера может быть гемагглютининовой (HA) меткой, полученная из белка гемагглютинина гриппа, если используется млекопитающее-хозяин (например, клетки COS-7). Дополнительные метки включают, но не ограничены ими, метки Кальмодулина, метки FLAG, метки Myc, метки S, метки SBP, Softag 1, Softag 3, метку V5, метку Xpress, Isopeptag, SpyTag, метки белка-носителя биотина карбоксила (BCCP), метки GST, метки флуоресцентных белков (например, метки зеленого флуоресцентного белка), метки связывающих мальтозу белков, метки Nus, Strep-tag, тиоредоксиновые метки, TC метку, Ty метку и подобные.

В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотиды могут содержать кодирующую последовательность для одного или нескольких описанных в настоящем изобретении пептидов или белков, слитых в одной и той же рамке считывания, чтобы создать единую конкатамеризованную неоантигенную пептидную конструкцию, способную продуцировать множество неоантигенных пептидов.

В некоторых вариантах осуществления, последовательность ДНК конструируют с использованием рекомбинантной технологии путем выделения или синтеза последовательности ДНК, которая кодирует представляющий интерес белок дикого типа. Необязательно, последовательность может быть мутагенезирована с помощью сайт-специфического мутагенеза для получения ее функциональных аналогов. См., например, Zoeller et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984) и патент США № 4,588,585. В другом варианте осуществления, последовательность ДНК, кодирующая представляющий интерес пептид или белок, может быть сконструирована путем химического синтеза с использованием синтезатора олигонуклеотидов. Такие олигонуклеотиды могут быть сконструированы на основе аминокислотной последовательности желаемого пептида и выбора тех кодонов, которые предпочтительны в клетке-хозяине, в которой продуцируется представляющий интерес рекомбинантный полипептид. Для синтеза выделенной полинуклеотидной последовательности, которая кодирует представляющий интерес выделенный полипептид, можно применять стандартные способы. Например, полная аминокислотная последовательность может быть использована для конструирования гена с обратной трансляцией. Кроме того, можно синтезировать олигомер ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую конкретный выделенный полипептид. Например, можно синтезировать и затем лигировать несколько малых олигонуклеотидов, кодирующих части желаемого полипептида. Отдельные олигонуклеотиды обычно содержат 5'- или 3' липкие концы для комплементарной сборки.

После сборки (например, путем синтеза, сайт-направленного мутагенеза или другого способа) полинуклеотидные последовательности, кодирующие конкретный выделенный полипептид, представляющий интерес, вставляют в вектор экспрессии и, необязательно, функционально связывают с последовательностью контроля экспрессии, подходящей для экспрессии белка в желаемого хозяина. Правильная сборка может быть подтверждена секвенированием нуклеотидов, рестрикционным картированием и экспрессией биологически активного полипептида в подходящем хозяине. Как хорошо известно в данной области техники, для получения высоких уровней экспрессии трансфицированного гена в хозяине, ген может быть функционально связан с последовательностями контроля транскрипционной и трансляционной экспрессии, которые функциональны в хозяине для выбранной экспрессии. Таким образом, настоящее описание также относится к векторам и векторам экспрессии, применимым для продуцирования и введения неоантигенных полипептидов и неоэпитопов, описанных в настоящем изобретении, а также к клеткам-хозяевам, содержащим такие векторы.

В некоторых вариантах осуществления, также может быть получен вектор экспрессии, способный экспрессировать пептид или белок, как описано в настоящем изобретении. Векторы экспрессии для различных типов клеток хорошо известны в данной области техники и могут быть выбраны без излишних экспериментов. Как правило, ДНК вставляют в вектор экспрессии, такой как плазмида, в правильной ориентации и с правильной рамкой считывания для экспрессии. При необходимости, ДНК может быть связана с соответствующими транскрипционными и трансляционными регуляторными контрольными нуклеотидными последовательностями, которые распознаются желаемым хозяином (например, бактериями), хотя такие контроли обычно доступны в векторе экспрессии. Затем вектор вводят в бактерию-хозяина для клонирования с использованием стандартных методик (см., например, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Большое количество векторов и систем-хозяев, подходящих для продуцирования и введения неоантигенного полипептида, описанного в настоящем изобретении, известно специалистам в данной области техники и коммерчески доступно. Следующие векторы представлены в качестве примера. Бактериальные: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); pCR (Invitrogen). Эукаритоные: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia); p75.6 (Valentis); pCEP (Invitrogen); pCEI (Epimmune). Однако можно использовать любую другую плазмиду или вектор, если они являются реплицируемыми и жизнеспособными в хозяине.

Полинуклеотиды, кодирующие неоантигенные пептиды, описанные в настоящем изобретении, также могут содержать последовательность сигнала убиквитинирования и/или таргетную последовательность, такую как сигнальная последовательность эндоплазматического ретикулума (ER), для облегчения перемещения полученного пептида в эндоплазматический ретикулум.

В некоторых вариантах осуществления, неоантигенный пептид, описанный в настоящем изобретении, также можно вводить и/или экспрессировать вирусными или бактериальными векторами. Примеры векторов экспрессии включают ослабленных вирусных хозяев, таких как коровья оспа или оспа птиц. Векторы осповакцины и способы, применяемые в протоколах иммунизации, описаны, например, в патенте США № 4,722,848. Другим вектором является BCG (Bacille Calmette Guerin). Векторы BCG описаны Stover et al., Nature 351:456-460 (1991). Широкий спектр других векторов, применяемых для терапевтического введения или иммунизации неоантигенных полипептидов, описанных в настоящем изобретении, например, адено- и аденоассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы, векторы Salmonella Typhimurium, детоксифицированные векторы токсина сибирской язвы, векторы вируса Сендай, векторы поксвируса, векторы оспы канареек и подобные, будут очевидны специалистам в данной области техники из приведенного в настоящем изобретении описания. В некоторых вариантах осуществления, вектором является модифицированная вакцина Ankara (VA) (например, Bavarian Noridic (MVA-BN)).

Различные системы культивирования клеток млекопитающих или насекомых также успешно используют для экспрессии рекомбинантного белка. Экспрессия рекомбинантных белков в клетках млекопитающих может быть осуществлена, поскольку такие белки, как правило, правильно уложены, должным образом модифицированы и полностью функциональны. Примеры подходящих линий клеток-хозяев млекопитающих включают линии COS-7 клеток почек обезьян, описанные Gluzman (Cell 23:175, 1981), и другие клеточные линии, способные экспрессировать соответствующий вектор, включая, например, L клетки, C127, 3T3, яичник китайского хомячка (CHO), 293, клеточные линии HeLa и BHK. Векторы экспрессии млекопитающих могут содержать нетранскрибируемые элементы, такие как точка начала репликации, подходящий промотор и энхансер, связанные с экспрессируемым геном, и другие 5' или 3' фланкирующие нетранскрибируемые последовательности, и также 5' или 3' нетранслируемые последовательности, такие как необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, сайты донора и акцептора сплайсинга и последовательности терминации транскрипции. Обзор бакуловирусных систем для продуцирования гетерологичных белков в клетках насекомых представлен Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).

Клетки-хозяева генетически сконструированы (трансдуцированы, трансформированы или трансфицированы) векторами, которыми могут быть, например, вектор клонирования или вектор экспрессии. Вектор может быть, например, в форме плазмиды, вирусной частицы, фага и т.д. Сконструированные клетки-хозяева могут быть культивированы в обычных питательных средах, модифицированных подходящим образом для активации промоторов, селекции трансформантов или амплификации полинуклеотидов. Условиями культивирования, такими как температура, pH и подобные, являются такие, которые ранее использовались с клеткой-хозяином, выбранной для экспрессии, и будут очевидны для обычного специалиста в данной области техники.

В качестве типовых примеров подходящих хозяев могут быть указаны: бактериальные клетки, такие как E.coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium и различные виды из родов Pseudomonas, Streptomyces и Staphylococcus; клетки грибов, такие как дрожжи; клетки насекомых, такие как Drosophila и Sf9; клетки животных, такие как линии COS-7 фибробластов почек обезьян, описанные Gluzman, Cell 23:175 (1981), и другие клеточные линии, способные экспрессировать совместимый вектор, например клеточные линии C127, 3T3, CHO, HeLa и BHK или меланома Боуэса; растительные клетки и т.д. Считается, что выбор подходящего хозяина находится в пределах компетенции специалистов в данной области техники, исходя из идей, изложенных в настоящем изобретении.

Описанные в настоящем изобретении полинуклеотиды можно вводить и экспрессировать в клетках человека (например, иммунных клетках, включая дендритные клетки). Таблицу использования кодонов человека можно использовать для выбора кодона для каждой аминокислоты. Такие полинуклеотиды содержат спейсерные аминокислотные остатки между эпитопами и/или аналогами, такие как описаны выше, или могут содержать встречающиеся в природе фланкирующие последовательности, соседние к эпитопам и/или аналогам (и/или CTL (например, CD8⁺), Th (например, CD4⁺) и В-клеточные эпитопы).

Стандартные регуляторные последовательности, хорошо известные специалистам в данной области техники, могут быть включены в вектор для обеспечения экспрессии в клетках-мишенях человека. Желательны несколько векторных элементов: промотор с расположенным ниже сайтом клонирования полинуклеотида, например, вставка минигена; сигнал полиаденилирования для эффективного прекращения транскрипции; точка начала репликации E.coli; и селектируемый маркер E. coli (например, резистентность к ампициллину или канамицину). Для этой цели можно использовать множество промоторов, например, промотор цитомегаловируса человека (hCMV). См., например, патенты США №№ 5,580,859 и 5,589,466 для других подходящих промоторных последовательностей. В некоторых вариантах осуществления, промотором является промотор CMV-IE.

Векторы могут быть введены в ткани животных множеством различных способов. Двумя наиболее популярными подходами являются инъекция ДНК в солевом растворе с использованием стандартной иглы для подкожных инъекций и доставка генной пушкой. Схематическое изображение конструкции плазмиды ДНК вакцины и ее последующей доставки этими двумя способами хозяину показано в Scientific American (Weiner et al., (1999) Scientific American 281 (1): 34-41). Инъекцию в солевом растворе обычно проводят внутримышечно (IM) в скелетные мышцы или внутрикожно (ID), при этом ДНК доставляется во внеклеточные пространства. Этому может способствовать электропорация путем временного повреждения мышечных волокон миотоксинами, такими как бупивакаин; или путем применения гипертонических растворов солевого раствора или сахарозы (Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410). На иммунные ответы на этот метод доставки могут влиять многие факторы, включая тип иглы, положение иглы, скорость инъекции, объем инъекции, тип мышц, возраст, пол и физиологическое состояние животного, которому вводят инъекцию (Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410).

Доставка генной пушкой, другой широко используемый способ доставки, баллистически ускоряет плазмидную ДНК (пДНК), которая была адсорбирована на микрочастицах золота или вольфрама в клетки-мишени, с использованием сжатого гелия в качестве ускорителя (Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410; Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88).

Альтернативные способы доставки могут включать аэрозольную инстилляцию голой ДНК на поверхности слизистых оболочек, таких как слизистая оболочка носа и легких (Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88) и местное введение пДНК для глаз и слизистой оболочки влагалища (Lewis et al., (1999) Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88). Доставка на поверхность слизистой оболочки также достигается с использованием препаратов катионных липосом-ДНК, биоразлагаемых микросфер, векторов ослабленных Shigella или Listeria для перорального введения на слизистую оболочку кишечника и рекомбинантных аденовирусных векторов. ДНК или РНК также могут быть доставлены в клетки после легкого механического разрушения клеточной мембраны, временно повышая проницаемость клеток. Такое легкое механическое разрушение мембраны может быть достигнуто путем осторожного проталкивания клеток через небольшое отверстие (Sharei et al., Ex Vivo Cytosolic Delivery of Functional Macromolecules to Immune Cells, PLOS ONE (2015)).

Химические средства для введения полинуклеотида в клетку-хозяина включают коллоидные дисперсионные системы, такие как макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, шарики и системы на основе липидов, включая эмульсии масло-в-воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Типовой коллоидной системой для использования в качестве средства доставки in vitro и in vivo является липосома (например, искусственная мембранная везикула). В случае использования не вирусной системы доставки, типовым средством доставки является липосома. «Липосома» представляет собой общий термин, охватывающий множество одно- и многослойных жировых носителей, образованных путем образования замкнутых жировых бислоев или агрегатов. Липосомы можно охарактеризовать как имеющие везикулярные структуры с двухслойной фосфолипидной мембраной и внутренней водной средой. Многослойные липосомы содержат несколько жировых слоев, разделенных водной средой. Они образуются спонтанно, если фосфолипиды суспендируют в избытке водного раствора. Жировые компоненты претерпевают само-реаранжировку перед образованием замкнутых структур и захватывают воду и растворенные вещества между липидными бислоями (Ghosh et al., Glycobiology 5: 505-10 (1991)). Однако также охватываются композиции, которые имеют структуры в растворе, отличные от нормальной везикулярной структуры. Например, жиры могут иметь мицеллярную структуру или просто существовать в виде неоднородных агрегатов жировых молекул. Также рассматриваются комплексы липофектамин-нуклеиновая кислота.

Рассматривается использование жировых составов для введения нуклеиновых кислот в клетку-хозяин (in vitro, ex vivo или in vivo). В другом аспекте, нуклеиновая кислота может быть связана с жиром. Нуклеиновая кислота, связанная с жиром, может быть инкапсулирована внутри водной среды липосомы, вкраплена в жировой бислой липосомы, присоединена к липосоме через связывающую молекулу, которая ассоциирована и с липосомой, и с олигонуклеотидом, заключена в липосому, образует комплекс с липосомой, диспергирована в растворе, содержащем жир, смешана с жиром, объединена с жиром, содержится в виде суспензии в жире, содержится или образует комплекс с мицеллой, или иным образом ассоциирована с жиром. Композиции, ассоциированные с жиром, жиром/ДНК или жиром/вектором экспрессии, не ограничиваются какой-либо конкретной структурой в растворе. Например, они могут присутствовать в двухслойной структуре, в виде мицелл или в «свернутой» структуре. Они также могут быть просто перемешаны в растворе, возможно, образуя агрегаты, неоднородные по размеру или форме. Жирами являются жирные вещества, которые могут быть природными или синтетическими жирами. Например, жиры включают жирные капли, которые естественным образом встречаются в цитоплазме, а также класс соединений, содержащих длинноцепочечные алифатические углеводороды и их производные, такие как жирные кислоты, спирты, амины, аминоспирты и альдегиды. Жиры, пригодные для использования, могут быть получены из коммерческих источников. Исходные растворы жиров в хлороформе или хлороформе/метаноле можно хранить при температуре приблизительно -20°C. Хлороформ используют как единственный растворитель, так как он легче испаряется, чем метанол.

4. Антигенпрезентирующие клетки (APC)

Антигенпрезентирующие клетки (APC) представляют пептидные фрагменты белковых антигенов в ассоциации с молекулами MHC на своей клеточной поверхности. Презентируемый пептид ассоциирован с молекулой MHC в виде комплекса пептид-MHC (pMHC) на клеточной поверхности APC. Процессинг и презентация комплексов пептид-MHC может включать серию последовательных стадий, включающих: опосредованное протеазой расщепление белков; транспорт пептидов в эндоплазматический ретикулум (ER), опосредованный транспортером, ассоциированным с процессингом антигена (TAP); образование молекул пептид-MHC I с использованием вновь синтезированных молекул MHC; и транспорт молекул пептид-MHC к поверхности клетки.

Некоторые APC могут активировать антигенспецифические Т-клетки. Например, Т-клетка, содержащая Т-клеточный рецептор (TCR), которая взаимодействует с pMHC, может быть активирована, стимулирована, индуцирована или размножена при образовании TCR-pMHC. В некоторых вариантах осуществления, MHC (например, MHC класса I или MHC класса II) APC может быть загружен пептидом и презентируется APC путем введения в APC нуклеиновой кислоты (например, РНК), которая кодирует антигенный пептид или полипептид, содержащий презентируемую пептидную последовательность.

С биологической точки зрения, чтобы соматическая мутация вызвала иммунный ответ, необходимо удовлетворить несколько критериев: аллель, содержащий мутацию, должен быть экспрессирован клеткой, мутация должна находиться области, кодирующей белок, и не синонимичной, транслируемый белок должен быть расщеплен протеасомой или другим путем деградации клеточного белка, и эпитоп, содержащий мутацию, должен быть презентируется комплексом MHC, презентируемый эпитоп должен распознаваться TCR и, наконец, комплекс TCR-pMHC должен запустить сигнальный каскад, который активирует Т-клетку.

Моноциты могут циркулировать в кровотоке, и затем перемещаться в ткани, где они могут дифференцировать в макрофаги и дендритные клетки. Классические моноциты обычно характеризуются высоким уровнем экспрессии рецептора клеточной поверхности CD14. Моноциты и В-клетки могут быть компетентными APC, хотя их антигенпрезентирующие способности, по-видимому, ограничиваются реактивацией ранее сенсибилизированных Т-клеток. Эти типы клеток могут быть неспособны напрямую активировать функционально наивные или не примированные популяции Т-клеток. Профессиональные антигенпрезентирующие клетки очень эффективны при интернализации антигена либо путем фагоцитоза, либо посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, и затем отображают фрагмент антигена, связанный с молекулой MHC, на своей мембране. Т-клетка распознает и взаимодействует с комплексом антиген-молекула MHC на мембране APC. Затем APC продуцирует дополнительный костимулирующий сигнал, что приводит к активации Т-клетки. Экспрессия костимулирующих молекул является типовым признаком профессиональных APC.

Профессиональные APC могут очень эффективно интернализировать антиген либо путем фагоцитоза, либо посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, и затем отображать фрагмент антигена, связанный с молекулой MHC, на своей мембране. Т-клетка может распознавать и взаимодействовать с комплексом антиген-молекула MHC на мембране APC. Затем APC может продуцировать дополнительный костимулирующий сигнал, что приводит к активации Т-клетки. Экспрессия костимулирующих молекул может быть определяющим признаком профессиональных антигенпрезентирующих клеток. Примеры профессиональных APC могут включать, но не ограничены ими, дендритные клетки (DC), макрофаги и B-клетки. Профессиональные APC могут экспрессировать высокие уровни MHC класса II, ICAM-1 и B7-2.

Одним из основных типов профессиональных APC являются DC, которые обладают самым широким спектром антигенной презентации. Другие основные типы профессиональных APC включают макрофаги, B-клетки и некоторые активированные эпителиальные клетки. DC являются популяциями лейкоцитов, которые презентируют антигены (например, антигены, захваченные в периферических тканях) Т-клеткам через антигенпрезентирующие пути MHC класса II и I. DC способны активировать как наивные, так и предварительно примированные Т-клетки (например, Т-клетки памяти). DC могут быть популяциями лейкоцитов, которые представляют антигены, захваченные в периферических тканях, Т-клеткам через антигенпрезентирующие пути MHC I и II классов. DC могут быть мощными индукторами иммунных ответов, и активация этих клеток может быть критическим шагом для индукции противоопухолевого иммунитета.

DC можно разделить на «незрелые» и «зрелые» клетки, что может использоваться как простой способ различать два хорошо охарактеризованных фенотипа. Однако эту номенклатуру не следует истолковывать как исключающую все возможные промежуточные стадии дифференциации. Незрелые DC можно охарактеризовать как APC с высокой способностью к захвату и процессингу антигена, что коррелирует с высокой экспрессией рецептора Fcγ и рецептора маннозы. Зрелый фенотип обычно может характеризоваться более низкой экспрессией этих маркеров, но высокой экспрессией молекул клеточной поверхности, ответственных за активацию Т-клеток, таких как MHC класса I и класса II, молекулы адгезии (например, CD54 и CD11) и костимулирующие молекулы (например, CD40, CD80, CD86 и 4-1BB). Зрелые DC могут быть CD11b⁺, CD11c⁺, HLA-DR⁺, CD80⁺, CD86⁺, CD54⁺, CD3⁻, CD19⁻, CD14⁻, CD141⁺ (BDCA-3) и/или CD1a⁺. Созревание DC может быть указано как статус активации DC, при котором такие антигенпрезентирующие DC приводят к примированию Т-клеток, в то время как презентация незрелыми DC приводит к толерантности. Созревание DC может быть вызвано биомолекулами с микробными признаками, обнаруженными врожденными рецепторами (например, бактериальной ДНК, вирусной РНК, эндотоксинами и т.д.), провоспалительными цитокинами (например, TNF, интерлейкинами и интерферонами), лигированием CD40 на поверхности DC с помощью CD40L, и веществами, высвобождаемыми из клеток, которые погибают. Дополнительные не ограничивающие примеры цитокинов, которые могут индуцировать созревание DC, включают IL-4, GM-CSF, TNF-α, IL-1β , PGE1 и IL-6. Например, DC могут быть получены путем культивирования клеток костного мозга in vitro с цитокинами, такими как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и фактор некроза опухоли альфа (TNF-α). Например, DC могут быть получены из CD14+, моноцитов, выделенных из PBMC. Цитокины или факторы роста, которые можно использовать для превращения моноцитов в DC, включают, но не ограничены ими, GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β , PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40 и polyI:C.

Обычно непрофессиональные антигенпрезентирующие клетки постоянно не экспрессируют белки MHC класса II. Белки MHC класса II обычно экспрессируются только при стимуляции непрофессиональных APC определенными цитокинами, такими как IFN-γ.

Источником APC обычно может быть тканевый источник, содержащий APC или предшественники APC, которые способны экспрессировать и презентировать антигенные пептиды in vitro. В некоторых вариантах осуществления, APC способны пролиферировать и становиться профессиональными APC при загрузке РНК-мишенью и/или обработке необходимыми цитокинами или факторами.

В одном аспекте, антигенный полипептид или белок может быть представлен в виде клетки, содержащей такие полипептиды, пептиды, белки или полинуклеотиды, как описано в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, клеткой является антигенпрезентирующая клетка (APC). В некоторых вариантах осуществления, клеткой является дендритная клетка (DC). В некоторых вариантах осуществления, клеткой является зрелая антигенпрезентирующая клетка. В некоторых вариантах осуществления, неоантигенный пептид или белок может быть представлен в виде APC (например, дендритных клеток), содержащих такие полипептиды, пептиды, белки или полинуклеотиды, как описано в настоящем изобретении. В других вариантах осуществления, такие APC используют для стимуляции Т-клеток для использования у пациентов. Таким образом, одним вариантом осуществления настоящего описания является композиция, содержащая, по меньшей мере одну APC (например, дендритную клетку), в которую введены или которая нагружена одним или несколькими неоантигенными пептидами или полинуклеотидами, описанными в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, такие APC являются аутологичными (например, аутологичными дендритными клетками). Альтернативно, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), выделенные от пациента, могут быть загружены неоантигенными пептидами или полинуклеотидами ex vivo. В родственных вариантах осуществления, такие APC или PBMC вводят обратно пациенту. В некоторых вариантах осуществления, APC являются дендритные клетки. В родственных вариантах осуществления, дендритными клетками являются аутологичные дендритные клетки, в которые вводят неоантигенный пептид или нуклеиновую кислоту. Неоантигенный пептид может быть любым подходящим пептидом, который вызывает соответствующий Т-клеточный ответ. Т-клеточная терапия с использованием аутологичных дендритных клеток, в которые ввели пептиды из опухолеассоциированного антигена, описана в Murphy et al. (1996) The Prostate 29, 371-380 and Tjua et al. (1997) The Prostate 32, 272-278. В некоторых вариантах осуществления, Т-клеткой является CTL (например, CD8⁺). В некоторых вариантах осуществления, Т-клеткой является хелперный Т-лимфоцит (Th (например, CD4⁺)).

В некоторых вариантах осуществления, в настоящем описании предложена композиция, содержащая иммуногенную фармацевтическую композицию на клеточной основе, которую также можно вводить субъекту. Например, иммуногенная фармацевтическая композиция на основе APC может быть составлена с использованием любых хорошо известных методик, носителей и эксципиентов, подходящим образом и как известно в данной области техники. APC включают моноциты, клетки, полученные из моноцитов, макрофаги и дендритные клетки. Иногда иммуногенной фармацевтической композицией на основе APC является иммуногенная фармацевтическая композиция на основе дендритных клеток.

Иммуногенная фармацевтическая композиция на основе дендритных клеток может быть получена любыми способами, хорошо известными в данной области техники. В некоторых случаях, иммуногенные фармацевтические композиции на основе дендритных клеток могут быть получены способом ex vivo или in vivo. Способ ex vivo может включать использование аутологичных DC, в которые ex vivo введены полипептиды, описанные в настоящем изобретении, для активации или загрузки DC перед введением пациенту. Способ in vivo может включать таргетирование специфических рецепторов DC с использованием антител, связанных с полипептидами, описанными в настоящем изобретении. Иммуногенная фармацевтическая композиция на основе DC может дополнительно содержать активаторы DC, такие как агонисты TLR3, TLR-7-8 и CD40. Иммуногенная фармацевтическая композиция на основе DC может дополнительно содержать адъюванты и фармацевтически приемлемый носитель.

Антигенпрезентирующие клетки (APC) могут быть получены из множества источников, включая человека и приматов, отличных от человека, других млекопитающих и позвоночных. В некоторых вариантах осуществления, APC могут быть получены из крови человека или позвоночного животного, отличного от человека. APC также можно выделить из обогащенной популяции лейкоцитов. Популяции лейкоцитов могут быть получены способами, известными специалистам в данной области техники. Такие способы обычно включают сбор гепаринизированной крови, аферез или лейкоферез, приготовление лейкоцитарной пленки, розеткообразование, центрифугирование, центрифугирование в градиенте плотности (например, с использованием Фиколла, частиц коллоидной окиси кремния и сахарозы), дифференциальный лизис не лейкоцитарных клеток и фильтрацию. Популяцию лейкоцитов также можно получить путем сбора крови у субъекта, дефибрилляции для удаления тромбоцитов и лизиса красных кровяных телец. Популяция лейкоцитов может быть необязательно обогащена предшественниками моноцитарных дендритных клеток.

Популяции клеток крови могут быть получены от множества субъектов в соответствии с желаемым применением обогащенной популяции лейкоцитов. Субъектом может быть здоровый субъект. Альтернативно, клетки крови могут быть получены от субъекта, нуждающегося в иммуностимуляции, такого как, например, больной раком или другой пациент, для которого иммуностимуляция будет полезной. Аналогично, клетки крови могут быть получены от субъекта, нуждающегося в подавлении иммунитета, такого как, например, пациент, страдающий аутоиммунным заболеванием (например, ревматоидным артритом, диабетом, волчанкой, рассеянным склерозом и подобными). Популяцию лейкоцитов также можно получить от HLA-совместимого здорового человека.

Если кровь используют в качестве источника APC, лейкоциты крови могут быть получены с использованием обычных способов, которые поддерживают их жизнеспособность. Согласно одному аспекту настоящего описания, кровь может быть разведена средой, которая может содержать или не содержать гепарин или другой подходящий антикоагулянт. Объем крови к среде может составлять приблизительно от 1 до 1. Клетки могут быть сконцентрированы центрифугированием крови в среде при приблизительно 1000 об/мин (150 g) при 4°C. Тромбоциты и эритроциты могут быть истощены путем ресуспендирования клеток в любом количестве растворов, известных в данной области техники, которые лизируют эритроциты, например хлорида аммония. Например, смесь может быть средней и содержать хлорид аммония приблизительно 1:1 по объему. Клетки могут быть сконцентрированы центрифугированием и промыты в желаемом растворе до получения популяции лейкоцитов, по существу не содержащих тромбоциты и эритроциты. Любой изотонический раствор, обычно используемый в культуре тканей, можно использовать в качестве среды для отделения лейкоцитов крови от тромбоцитов и эритроцитов. Примерами таких изотонических растворов могут быть физиологический раствор с фосфатным буфером, сбалансированный солевой раствор Хэнкса и полная среда для выращивания. APC и/или клетки-предшественники APC также могут быть очищены элютриацией.

В одном варианте осуществления APC могут быть не номинальными APC при воспалительных или других активированных состояниях. Например, не номинальные APC могут включать эпителиальные клетки, стимулированные интерфероном гамма, Т-клетки, В-клетки и/или моноциты, активированные факторами или условиями, которые индуцируют активность APC. Такие не номинальные APC могут быть получены в соответствии со способами, известными в данной области техники.

APC можно культивировать, размножать, дифференцировать и/или созревать, по желанию, в соответствии с типом APC. APC можно культивировать в любом подходящем культуральном сосуде, таком как, например, культуральные чашки, колбы, культуральные пакеты и биореакторы.

В некоторых вариантах осуществления, APC можно культивировать в подходящей культуре или среде для выращивания для поддержания и/или увеличения количества APC в препарате. Культуральные среды могут быть выбраны в соответствии с типом выделенной APC. Например, зрелые APC, такие как зрелые дендритные клетки, можно культивировать в питательной среде, подходящей для их поддержания и размножения. Питательная среда может быть дополнена аминокислотами, витаминами, антибиотиками, двухвалентными катионами и подобными. Кроме того, в среду для роста могут быть включены цитокины, факторы роста и/или гормоны. Например, для поддержания и/или размножения зрелых дендритных клеток могут быть добавлены цитокины, такие как гранулоцитарно/макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и/или интерлейкин 4 (IL-4). В других вариантах осуществления, можно культивировать и/или размножать незрелые APC. Незрелые дендритные клетки могут сохранять способность захватывать иРНК-мишень и процессировать новый антиген. В некоторых вариантах осуществления, незрелые дендритные клетки можно культивировать в средах, подходящих для их содержания и культивирования. Питательная среда может быть дополнена аминокислотами, витаминами, антибиотиками, двухвалентными катионами и подобными. Кроме того, в среду для роста могут быть включены цитокины, факторы роста и/или гормоны.

Аналогичным образом можно культивировать или размножать другие незрелые APC. Препараты незрелых APC могут созревать с образованием зрелых APC. Созревание APC может происходить во время или после воздействия неоантигенных пептидов. В некоторых вариантах осуществления, можно созревать препараты незрелых дендритных клеток. Подходящие факторы созревания включают, например, цитокины TNF-α, бактериальные продукты (например, BCG) и подобные. В другом аспекте, выделенные предшественники APC можно использовать для получения препаратов незрелых APC. Предшественники APC можно культивировать, дифференцировать и/или созревать. В некоторых вариантах осуществления, моноцитарные предшественники дендритных клеток можно культивировать в присутствии подходящих культуральных сред, дополненных аминокислотами, витаминами, цитокинами и/или двухвалентными катионами, для стимуляции дифференциации моноцитарных предшественников дендритных клеток в незрелые дендритные клетки. В некоторых вариантах осуществления, предшественники APC выделяют из РВМС. РВМС можно получить от донора, например, донора-человека, и их можно использовать свежими или заморозить для использования в будущем. В некоторых вариантах осуществления, APC получают из одного или нескольких препаратов APC. В некоторых вариантах осуществления, APC содержит APC, нагруженную первым и вторым неоантигенными пептидами, содержащими первый и второй неоэпитопы, или полинуклеотидами, кодирующими первый и второй неоантигенные пептиды, содержащие первый и второй неоэпитопы. В некоторых вариантах осуществления, APC является аутологичная APC, аллогенная APC или искусственная APC.

5. Адъюванты

Адъювант можно использовать для усиления иммунного ответа (гуморального и/или клеточного), вызываемого у пациента, получающего композицию, предложенную в настоящем изобретении. Иногда адъюванты могут вызывать ответ типа Th1. В других случаях, адъюванты могут вызывать ответ типа Th2. Ответ типа Th1 может характеризоваться продуцированием цитокинов, таких как IFN-γ, в отличие от ответа типа Th2, который может характеризоваться продуцированием цитокинов, таких как IL-4, IL-5 и IL-10.

В некоторых аспектах, адъюванты на основе липидов, такие как MPLA и MDP, можно использовать с иммуногенными фармацевтическими композициями, описанными в настоящем изобретении. Монофосфориллипид А (MPLA), например, является адъювантом, который вызывает повышенную презентацию липосомального антигена специфическим Т-лимфоцитам. Кроме того, мурамилдипептид (MDP) также можно использовать в качестве подходящего адъюванта в сочетании с иммуногенными фармацевтическими составами, описанными в настоящем изобретении.

Подходящие адъюванты известны в данной области техники (см. WO 2015/095811) и включают, но не ограничены ими, поли(I:C), поли-ICLC, хилтонол, агонист STING, 1018 ISS, соли алюминия, ампливакс, AS15, BCG., CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, имиквимод, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, JuvImmune, LipoVac, MF59, монофосфориллипид A, Монтанид IMS 1312, Монтанид ISA 206, Монтанид ISA 50V, Монтанид ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel®. векторную систему, микрочастицы PLG, резиквимод, SRL172, виросомы и другие вирусоподобные частицы, YF-17D, ловушку VEGF, R848, бета-глюкан, Pam2Cys, Pam3Cys, Pam3CSK4, стимулон Aquila's QS21 (Aquila Biotech, Worcester, Mass., USA)), который получен из сапонина, микобактериальные экстракты и синтетические имитаторы бактериальной клеточной стенки, а также другие запатентованные адъюванты, такие как Ribi's Detox. Quil or Superfos. Адъюванты также включают неполный адъювант Фрейнда или GM-CSF. Несколько иммунологических адъювантов (например, MF59), специфичных для дендритных клеток, и их получение были описаны ранее (Dupuis M, et al., Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27; Allison A C; Dev. Biol. Stand. 1998; 92:3-11) (Mosca et al. Frontiers in Bioscience, 2007; 12:4050-4060) (Gamvrellis et al. Immunol & Cell Biol. 2004; 82: 506-516). Также можно использовать цитокины. Некоторые цитокины напрямую связаны с влиянием на миграцию дендритных клеток в лимфоидные ткани (например, TNF-альфа), ускоряя созревание дендритных клеток в эффективные антигенпрезентирующие клетки для Т-лимфоцитов (например, GM-CSF, PGE1, PGE2, IL-1, IL-1b, IL-4, IL-6 и CD40L) (патент США № 5,849,589, полностью включенный в настоящее описание посредством ссылки) и действуя как иммуноадъюванты (например, IL-12) (Gabrilovich D I, et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418).

Адъювант также может содержать стимулирующие молекулы, такие как цитокины. Неограничивающие примеры цитокинов включают: CCL20, α-интерферон (IFN-a), β -интерферон (IFN-β ), γ-интерферон, фактор роста тромбоцитов (PDGF), TNFα, TNFβ (лимфотоксин альфа (LTα)), GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), кожный хемокин, привлекающий Т-клетки (CTACK), эпителиальныйм хемокин, экспрессируемый тимусом (TECK), эпителиальный хемокин, ассоциированный со слизистыми (MEC), IL-12, IL-15, IL-28, MHC, CD80, CD86, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, MCP-1, MIP-la, MIP-1-, IL-8, L-селектин, P-селектин, E-селектин, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, мутантные формы IL-18, CD40, CD40L, фактор роста сосудов, фактор роста фибробластов, IL-7, фактор роста нервов, рост эндотелия сосудов фактор, Fas, рецептор TNF, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DRS, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, каспазу ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IκB, неактивный NIK, SAP K, SAP-I, JNK, гены ответа на интерферон, NFκB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI и TAP2.

Дополнительные адъюванты включают: MCP-1, MIP-la, MIP-lp, IL-8, RANTES, L-селектин, P-селектин, E-селектин, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, мутантные формы IL-18, CD40, CD40L, фактор роста сосудов, фактор роста фибробластов, IL-7, IL-22, фактор роста нервов, фактор роста эндотелия сосудов, Fas, рецептор TNF, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, каспазу ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IκB, Inactive NIK, SAP K, SAP-1, JNK, гены ответа на интерферон, NFκB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 и их функциональные фрагменты.

В некоторых аспектах, адъювант может быть модулятором толл-подобного рецептора (TLR). Примеры модуляторов TLR включают агонисты TLR-9 и не ограничиваются низкомолекулярными модуляторами TLR, такими как Имиквимод. Другие примеры адъювантов, которые используют в комбинации с иммуногенной фармацевтической композицией, описанной в настоящем изобретении, могут включать, но не ограничиваются ими, сапонин, CpG ODN и подобные. Иногда адъювант выбирают из анатоксинов бактерий, блок-полимеров полиоксипропилена-полиоксиэтилена, солей алюминия, липосом, полимеров CpG, эмульсий масло-в-воде или их комбинаций. Иногда адъювантом является эмульсия масло в воде. Эмульсия масло в воде может включать, по меньшей мере одно масло и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, при этом масла и поверхностно-активные вещества являются биоразлагаемыми (метаболизируемыми) и биосовместимыми. Капли масла в эмульсии могут иметь диаметр менее 5 мкм и даже субмикронный диаметр, причем эти небольшие размеры достигаются с помощью микрофлюидизатора для получения стабильных эмульсий. Капли размером менее 220 нм можно подвергать стерилизации на фильтре.

6. Способы лечения и фармацевтические композиции

Неоантигенные терапевтические средства (например, полипептиды или полинуклеотиды, APC или дендритные клетки, содержащие полипептиды или полинуклеотиды), описанные в настоящем изобретении, применимы во множестве областей применения, включая, но не ограничиваясь ими, терапевтические методы лечения, такие как лечение рака. В некоторых вариантах осуществления, способы терапевтического лечения включают иммунотерапию. В некоторых вариантах осуществления, неоантигенный пептид полезен для активации, стимуляции, усиления и/или улучшения иммунного ответа, перенаправления существующего иммунного ответа на новую мишень, повышения иммуногенности опухоли, ингибирования роста опухоли, уменьшения объема опухоли, увеличения апоптоза опухолевых клеток и/или снижения канцерогенности опухоли. Способы применения могут быть in vitro, ex vivo или in vivo.

В некоторых аспектах настоящее изобретение представляет способы активации иммунного ответа у субъекта с использованием полипептида, клетки или фармацевтической композиции, содержащей неоантигенный пептид или белок, описанные в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение представляет способы профилактики субъекта, включающие контакт клетки субъекта с полипептидом, клеткой или фармацевтической композицией, содержащей неоантигенный пептид или белок, описанные в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение представляет способы стимулирования иммунного ответа у субъекта с использованием полипептида, клетки или фармацевтической композиции, содержащей неоантигенный пептид или белок, описанные в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение представляет способы усиления иммунного ответа у субъекта с использованием полипептида, клетки или фармацевтической композиции, содержащей неоантигенный пептид или белок, описанные в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение представляет способы усиления иммунного ответа с использованием полипептида, клетки или фармацевтической композиции, содержащей неоантигенный пептид или белок, описанные в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления, активация, стимулирование, усиление и/или улучшение иммунного ответа включает повышение клеточно-опосредованного иммунитета. В некоторых вариантах осуществления, активация, стимулирование, усиление и/или улучшение иммунного ответа включает повышение активности Т-клеток или гуморального иммунитета. В некоторых вариантах осуществления активация, стимулирование, усиление и/или улучшение иммунного ответа включает повышение активности цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) или хелперных Т-лимфоцитов (Th). В некоторых вариантах осуществления, активация, стимулирование, усиление и/или улучшение иммунного ответа включает повышение активности естественных киллеров (NK). В некоторых вариантах осуществления, активация, стимулирование, усиление и/или улучшение иммунного ответа включает повышение активности Т-клеток и повышение активности NK-клеток. В некоторых вариантах осуществления, активация, стимулирование, усиление и/или улучшение иммунного ответа включает повышение активности CTL и повышение активности NK-клеток. В некоторых вариантах осуществления активация, стимулирование, усиление и/или улучшение иммунного ответа включает ингибирование или снижение супрессивной активности Т-регуляторных (Treg) клеток. В некоторых вариантах осуществления, активация, стимулирование, усиление и/или улучшение иммунного ответа включает повышение противоопухолевой активности. В некоторых вариантах осуществления, активация, стимулирование, усиление и/или улучшение иммунного ответа включает повышение иммуногенности. В некоторых вариантах осуществления, иммунный ответ является результатом антигенной стимуляции. В некоторых вариантах осуществления, антигенной стимуляцией является опухолевая клетка. В некоторых вариантах осуществления, антигенной стимуляцией является рак.

В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение представляет способы активации, стимуляции, усиления и/или улучшения иммунного ответа с использованием полипептида, клетки или фармацевтической композиции, содержащей неоантигенный пептид или белок, описанных в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества полипептида, который доставляет неоантигенный пептид или полинуклеотид к опухолевой клетке. В некоторых вариантах осуществления, способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества неоантигенного полипептида, интернализованного опухолевой клеткой. В некоторых вариантах осуществления, способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества неоантигенного полипептида, который интернализуется опухолевой клеткой, и неоантигенный пептид процессируется клеткой. В некоторых вариантах осуществления, способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества неоантигенного полипептида, интернализованного опухолевой клеткой, и неоэпитоп представлен на поверхности опухолевой клетки. В некоторых вариантах осуществления, способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества неоантигенного полипептида, который интернализуется опухолевой клеткой, процессируется клеткой, и антигенный пептид презентируется на поверхности опухолевой клетки.

В некоторых вариантах осуществления, способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества неоантигенного полипептида или полинуклеотида, описанного в настоящем изобретении, который доставляет экзогенный полипептид, содержащий, по меньшей мере один неоантигенный пептид, в опухолевую клетку, где по меньшей мере один неоэпитоп, полученный из неоантигенного пептида, презентируется на поверхности опухолевой клетки. В некоторых вариантах осуществления, антигенный пептид презентируется на поверхности опухолевой клетки в комплексе с молекулой MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления, антигенный пептид презентируется на поверхности опухолевой клетки в комплексе с молекулой MHC класса II.

В некоторых вариантах осуществления, способ включает контакт опухолевой клетки с неоантигенным полипептидом или полинуклеотидом, описанным в настоящем изобретении, который доставляет экзогенный полипептид, содержащий, по меньшей мере один неоантигенный полипептид, в опухолевую клетку, где презентирован, по меньшей мере один неоэпитоп, полученный, по меньшей мере из одного неоантигенного полипептида, на поверхности опухолевой клетки. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп презентируется на поверхности опухолевой клетки в комплексе с молекулой MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления, неоэпитоп презентируется на поверхности опухолевой клетки в комплексе с молекулой MHC класса II.

В некоторых вариантах осуществления, способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества неоантигенного полипептида или полинуклеотида, описанного в настоящем изобретении, который доставляет экзогенный полипептид, содержащий, по меньшей мере один антигенный пептид, в опухолевую клетку, где эпитоп или неоэпитоп презентируется на поверхности опухолевой клетки, и индуцируется иммунный ответ против опухолевой клетки. В некоторых вариантах осуществления, иммунный ответ на эпитоп или неоэпитоп усиливается. В некоторых вариантах осуществления, иммунный ответ против опухолевой клетки усиливается. В некоторых вариантах осуществления, неоантигенный полипептид или полинуклеотид доставляет экзогенный полипептид, содержащий, по меньшей мере один неоантигенный пептид, в опухолевую клетку, где эпитоп или неоэпитоп презентируется на поверхности опухолевой клетки, и рост опухоли ингибируется.

В некоторых вариантах осуществления, способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества неоантигенного полипептида или полинуклеотида, описанного в настоящем изобретении, который доставляет экзогенный полипептид, содержащий, по меньшей мере один неоантигенный пептид, в опухолевую клетку, где неоэпитоп, полученный, по меньшей мере из одного неоантигенного пептида, презентируется на поверхности опухолевой клетки, и индуцируется Т-клеточное уничтожение, направленное против опухолевой клетки. В некоторых вариантах осуществления, усиливается Т-клеточное уничтожение, направленное против опухолевой клетки. В некоторых вариантах осуществления повышается Т-клеточное уничтожение, направленное против опухолевой клетки.

В некоторых вариантах осуществления, способ усиления иммунного ответа у субъекта включает введение субъекту терапевтически эффективного количества неоантигенного терапевтического агента, описанного в настоящем изобретении, где агентом является антитело, которое специфически связывает неоантиген, описанный в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, способ усиления иммунного ответа у субъекта включает введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела.

Настоящее раскрытие относится к способам перенаправления существующего иммунного ответа на опухоль. В некоторых вариантах осуществления, способ перенаправления существующего иммунного ответа на опухоль включает введение субъекту терапевтически эффективного количества неоантигенного терапевтического агента, описанного в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, существующий иммунный ответ направлен против вируса. В некоторых вариантах осуществления, вирус выбран из группы, состоящей из: вируса кори, вируса ветряной оспы (VZV; вируса ветряной оспы), вируса гриппа, вируса эпидемического паротита, полиовируса, вируса краснухи, ротавируса, вируса гепатита А (HAV), вируса гепатита В (HBV), вируса Эпштейн-Барр (EBV) и цитомегаловируса (CMV). В некоторых вариантах осуществления, вирусом является вирус ветряной оспы. В некоторых вариантах осуществления, вирусом является цитомегаловирус. В некоторых вариантах осуществления, вирусом является вирус кори. В некоторых вариантах осуществления, существующий иммунный ответ был приобретен после естественной вирусной инфекции. В некоторых вариантах осуществления, существующий иммунный ответ был приобретен после вакцинации против вируса. В некоторых вариантах осуществления, существующим иммунным ответом является клеточно-опосредованный ответ. В некоторых вариантах осуществления, существующий иммунный ответ включает клетки CTL или Th.

В некоторых вариантах осуществления, способ перенаправления существующего иммунного ответа на опухоль у субъекта включает введение слитого белка, содержащего (i) антитело, которое специфически связывает неоантиген, и (ii) по меньшей мере один неоантигенный пептид, описанный в настоящем изобретении, где (a) слитый белок интернализуется опухолевой клеткой после связывания с опухолеассоциированным антигеном или неоэпитопом; (b) неоантигенный пептид процессируется и презентируется на поверхности опухолевой клетки, ассоциированной с молекулой MHC класса I; и (c) комплекс неоантигенный пептид/MHC Class I распознается CTL. В некоторых вариантах осуществления, CTL являются Т-клетки памяти. В некоторых вариантах осуществления, Т-клетки памяти являются результатом вакцинации неоантигенным пептидом.

Настоящее раскрытие относится к способам повышения иммуногенности опухоли. В некоторых вариантах осуществления, способ повышения иммуногенности опухоли включает контакт опухоли или опухолевых клеток с эффективным количеством неоантигенного терапевтического агента, описанного в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, способ повышения иммуногенности опухоли включает введение субъекту терапевтически эффективного количества неоантигенного терапевтического агента, описанного в настоящем изобретении.

Настоящее раскрытие также относится к способам ингибирования роста опухоли с использованием неоантигенного терапевтического агента, описанного в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, способ ингибирования роста опухоли включает контакт смеси клеток с терапевтическим неоантигеном in vitro. Например, иммортализованную клеточную линию или линию раковых клеток, смешанную с иммунными клетками (например_,Т-клетками), культивируют в среде, к которой добавлен неоантигенный пептид. В некоторых вариантах осуществления, опухолевые клетки выделяют из образца пациента, например биопсии ткани, плеврального выпота или образца крови, смешивают с иммунными клетками (например, Т-клетками) и культивируют в среде, в которую добавлен неоантигенный терапевтический агент. В некоторых вариантах осуществления, неоантигенный терапевтический агент увеличивает, стимулирует и/или усиливает активность иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления, неоантигенный терапевтический агент подавляет рост опухолевых клеток. В некоторых вариантах осуществления, неоантигенный терапевтический агент активирует уничтожение опухолевых клеток.

В некоторых вариантах осуществления, субъектом является млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления, субъектом является человек. В некоторых вариантах осуществления, у субъекта есть опухоль или у субъекта была опухоль, которая была, по меньшей мере частично удалена.

В некоторых вариантах осуществления способ ингибирования роста опухоли включает перенаправление существующего иммунного ответа на новую мишень, включая введение субъекту терапевтически эффективного количества неоантигенного терапевтического агента, где существующий иммунный ответ направлен против антигенного пептида, доставленного в опухолевую клетку неоантигенным пептидом.

В некоторых вариантах осуществления, опухоль содержит раковые стволовые клетки. В некоторых вариантах осуществления, частота раковых стволовых клеток в опухоли снижается путем введения неоантигенного терапевтического агента. В некоторых вариантах осуществления, предложен способ снижения частоты встречаемости раковых стволовых клеток в опухоли у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества неоантигенного терапевтического агента.

Кроме того, в некоторых аспектах, настоящее раскрытие относится к способу снижения онкогенности опухоли у субъекта, включающему введение субъекту терапевтически эффективного количества неоантигенного терапевтического агента, описанного в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, опухоль содержит раковые стволовые клетки. В некоторых вариантах осуществления, канцерогенность опухоли снижается за счет снижения частоты встречаемости раковых стволовых клеток в опухоли. В некоторых вариантах осуществления, способы включают использование неоантигенного терапевтического агента, описанного в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, частота раковых стволовых клеток в опухоли снижается путем введения неоантигенного терапевтического агента, описанного в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления, опухолью является солидная опухоль. В некоторых вариантах осуществления, опухолью является опухоль, выбранная из группы, состоящей из: колоректальной опухоли, опухоли поджелудочной железы, опухоли легкого, опухоли яичника, опухоли печени, опухоли молочной железы, опухоли почки, опухоли предстательной железы , нейроэндокринной опухоли, опухоли желудочно-кишечного тракта, меланомы, опухоли шейки матки, опухоли мочевого пузыря, глиобластомы и опухоли головы и шеи. В некоторых вариантах осуществления, опухолью является колоректальная опухоль. В некоторых вариантах осуществления, опухолью является опухоль яичника. В некоторых вариантах осуществления, опухолью является опухоль молочной железы. В некоторых вариантах осуществления, опухолью является опухоль легкого. В некоторых вариантах осуществления, опухолью является опухоль поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления, опухолью является опухоль меланомы. В некоторых вариантах осуществления, опухолью является солидная опухоль.

Настоящее описание дополнительно представляет способы лечения рака у субъекта, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества неоантигенного терапевтического агента, описанного в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, способ лечения рака включает перенаправление существующего иммунного ответа на новую мишень, способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества неоантигенного терапевтического агента, при этом существующий иммунный ответ направлен против антигенного пептида, доставленного в раковую клетку неоантигенным пептидом.

Настоящее раскрытие относится к способам лечения рака, включающим введение субъекту терапевтически эффективного количества неоантигенного терапевтического агента, описанного в настоящем изобретении (например, субъекту, нуждающемуся в лечении). В некоторых вариантах осуществления, субъектом является млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления, субъектом является человек. В некоторых вариантах осуществления, у субъекта имеется раковая опухоль. В некоторых вариантах осуществления, у субъекта удалили опухоль, по меньшей мере частично.

Субъектами могут быть, например, млекопитающие, люди, беременные женщины, пожилые люди, взрослые, молодые люди, подростки, дети, малыши, младенцы, груднички или новорожденные. Субъект может быть пациентом. В некоторых случаях, субъектом может быть человек. В некоторых случаях, субъектом может быть ребенок (т.е. молодой человек, не достигший возраста полового созревания). В некоторых случаях, субъектом может быть младенец. В некоторых случаях, субъектом может быть младенец, находящийся на искусственном вскармливании. В некоторых случаях, субъектом может быть человек, включенный в клиническое исследование. В некоторых случаях, субъектом может быть лабораторное животное, например млекопитающее или грызун. В некоторых случаях, субъектом может быть мышь. В некоторых случаях, субъект может страдать ожирением или избыточным весом.

В некоторых вариантах осуществления субъекта ранее лечили одним или несколькими различными способами лечения рака. В некоторых вариантах осуществления, субъекта ранее лечили одним или несколькими из радиотерапии, химиотерапии или иммунотерапии. В некоторых вариантах осуществления, субъекта ранее лечили одной, двумя, тремя, четырьмя или пятью линиями терапии. В некоторых вариантах осуществления, предшествующей терапией является цитотоксическая терапия.

В некоторых вариантах осуществления раком является рак, выбранный из группы, состоящей из колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака легких, рака яичников, рака печени, рака молочной железы, рака почки, рака предстательной железы , рака желудочно-кишечного тракта, меланомы, рака шейки матки, нейроэндокринного рака, рака мочевого пузыря, рака матки, глиобластомы и рака головы и шеи. В некоторых вариантах осуществления, раком является рак поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления, раком является рак яичников. В некоторых вариантах осуществления, раком является колоректальный рак. В некоторых вариантах осуществления, раком является рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления, раком является рак предстательной железы . В некоторых вариантах осуществления, раком является рак легкого. В некоторых вариантах осуществления, раком является немелкоклеточный рак легкого. В некоторых вариантах осуществления, раком является рак матки. В некоторых вариантах осуществления, раком является рак печени. В некоторых вариантах осуществления, раком является меланома. В некоторых вариантах осуществления, раком является солидный рак. В некоторых вариантах осуществления, раком является солидная опухоль.

В некоторых вариантах осуществления, раком является гематологический рак. В некоторых вариантах осуществления, рак выбран из группы, состоящей из: острого миелогенного лейкоза (AML), лимфомы Ходжкина, множественной миеломы, Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза (T-ALL), хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), волосатоклеточного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза (CML), неходжкинской лимфомы, диффузной B-крупноклеточной лимфомы (DLBCL), мантийноклеточной лимфомы (MCL) и кожной Т-клеточной лимфомы (CTCL).

В некоторых вариантах осуществления, неоантигенное терапевтическое средство вводят в виде комбинированной терапии. Комбинированная терапия двумя или несколькими терапевтическими агентами использует агенты, действующие разными механизмами действия, хотя это и не обязательно. Комбинированная терапия с использованием агентов с разными механизмами действия может давать аддитивные или синергетические эффекты. Комбинированная терапия может позволить использовать более низкую дозу каждого агента, чем при монотерапии, тем самым уменьшая токсические побочные эффекты и/или увеличивая терапевтический индекс агентов. Комбинированная терапия может снизить вероятность развития резистентных раковых клеток. В некоторых вариантах осуществления, комбинированная терапия включает терапевтический агент, влияющий на иммунный ответ (например, усиливающий или активирующий ответ), и терапевтический агент, влияющий (например, ингибирующий или убивающий) на опухолевые/раковые клетки.

В некоторых случаях, иммуногенная фармацевтическая композиция может вводиться с дополнительным агентом. Выбор дополнительного агента может зависеть, по меньшей мере частично, от состояния, которое лечат. Дополнительный агент может включать, например, агент-ингибитор контрольной точки, такой как анти-PD1, анти-CTLA4, анти-PD-L1, анти-CD40 или анти-TIM3 агент (например, анти-PD1, анти-CTLA4, анти-PD-L1, анти-CD40 или анти-TIM3 антитело); или любые агенты, оказывающие терапевтическое действие на патогенную инфекцию (например, вирусную инфекцию), включая, например, лекарственные средства, используемые для лечения воспалительных состояний, такие как NSAID, например, ибупрофен, напроксен, ацетаминофен, кетопрофен или аспирин. Например, ингибитор контрольной точки может быть антагонистом PD-1/PD-L1, выбранным из группы, состоящей из: ниволумаба (ONO-4538/BMS-936558, MDX1 106, OPDIVO), пембролизумаба (MK-3475, KEYTRUDA), пидилизумаба (CT-011) и MPDL328OA (ROCHE). В качестве другого примера, составы могут дополнительно содержать одну или несколько добавок, таких как витамин C, E или другие антиоксиданты.

Способы по настоящему описанию можно использовать для лечения любого типа рака, известного в данной области техники. Неограничивающие примеры рака, подлежащего лечению способами настоящего описания, могут включать меланому (например, метастатическую злокачественную меланому), рак почек (например, светлоклеточную карциному), рак предстательной железы (например, гормонорезистентную аденокарциному предстательной железы), аденокарциному поджелудочной железы, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак легких (например, немелкоклеточный рак легких), рак пищевода, плоскоклеточный рак головы и шеи, рак печени, рак яичников, рак шейки матки, рак щитовидной железы, глиобластому, глиому, лейкоз, лимфому и другие злокачественные новообразования.

Кроме того, заболевание или состояние, представленное в настоящем изобретении, включает рефрактерные или рецидивирующие злокачественные новообразования, рост которых можно ингибировать с помощью способов лечения по настоящему описанию. В некоторых вариантах осуществления, рак, подлежащий лечению способами лечения по настоящему изобретению, выбран из группы, состоящей из карциномы, плоскоклеточной карциномы, аденокарциномы, саркомы, рака эндометрия, рака молочной железы, рака яичников, рака шейки матки, рака фаллопиевой трубы, первичного рака брюшины, рака толстой кишки, колоректального рака, плоскоклеточной карциномы аногенитальной области, меланомы, почечно-клеточного рака, рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, плоскоклеточного рака легкого, рака желудка, рака мочевого пузыря, рака желчного пузыря, рака печени, рака щитовидной железы, рака гортани, рака слюнных желез, рака пищевода, рака головы и шеи, глиобластомы, глиомы, плоскоклеточного рака головы и шеи, рака предстательной железы , рака поджелудочной железы, мезотелиомы, саркомы, гематологического рака, лейкоза, лимфомы, невромы и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления, рак, подлежащий лечению способами по настоящему описанию, включает, например, карциному, плоскоклеточную карциному (например, цервикального канала, века, конъюнктивы, влагалища, легкого, полости рта, кожи, мочевого пузыря, языка, гортани и пищевода) и аденокарциному (например, предстательной железы, тонкой кишки, эндометрия, цервикального канала, толстой кишки, легких, поджелудочной железы, пищевода, прямой кишки, матки, желудка, молочной железы и яичников). В некоторых вариантах осуществления, рак, подлежащий лечению способами по настоящему описанию, дополнительно включает саркому (например, миогенную саркому), лейкоз, неврому, меланому и лимфому. В некоторых вариантах осуществления, раком, подлежащим лечению способами по настоящему описанию, является рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления, раком, подлежащим лечению способами лечения по настоящему описанию, является трижды негативный рак молочной железы (TNBC). В некоторых вариантах осуществления, раком, подлежащим лечению способами лечения по настоящему описанию, является рак яичников. В некоторых вариантах осуществления, раком, подлежащим лечению способами лечения по настоящему описанию, является колоректальный рак.

В некоторых вариантах осуществления, пациент или популяция пациентов, подлежащих лечению фармацевтической композицией по настоящему описанию, имеют солидную опухоль. В некоторых вариантах осуществления, солидной опухолью является меланома, почечно-клеточная карцинома, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, рак толстой кишки, рак желчного пузыря, рак гортани, рак печени, рак щитовидной железы, рак желудка, рак слюнных желез, рак предстательной железы , рак поджелудочной железы или карцинома из клеток Меркеля. В некоторых вариантах осуществления, пациент или популяция пациентов, подлежащих лечению фармацевтической композицией по настоящему описанию, имеют гематологический рак. В некоторых вариантах осуществления, пациент имеет гематологический рак, такой как диффузная В-крупноклеточная лимфома («DLBCL»), лимфома Ходжкина («HL»), неходжкинская лимфома («NHL»), фолликулярная лимфома («FL»), острый миелоидный лейкоз («AML») или множественная миелома («MM»). В некоторых вариантах осуществления, пациент или популяция пациентов, подлежащих лечению, имеют рак, выбранный из группы, состоящей из рака яичников, рака легких и меланомы.

Конкретные примеры рака, который можно предотвратить и/или лечить в соответствии с настоящим описанием, включают, но не ограничены ими, следующие: рак почки, рак почки, мультиформную глиобластому, метастатический рак молочной железы; карциному молочной железы; саркому молочной железы; нейрофиброму; нейрофиброматоз; детские опухоли; нейробластому; злокачественную меланому; карциномы эпидермиса; лейкозы, такие как, но не ограничиваясь ими, острый лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острые миелоцитарные лейкозы, такие как миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный, эритролейкозный лейкоз и миелодиспластический синдром, хронические лейкозы, такие как, но не ограничиваясь ими, хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз; истинная полицитемия; лимфомы, такие как, но не ограничиваясь ими, болезнь Ходжкина, неходжкинская болезнь; множественные миеломы, такие как, но не ограничиваясь ими, вялотекущая множественная миелома, несекреторная миелома, остеосклеротическая миелома, лейкоз плазматических клеток, солитарная плазмоцитома и экстрамедуллярная плазмоцитома; макроглобулинемия Вальденстрема; моноклональная гаммапатия неустановленной значимости; доброкачественная моноклональная гаммапатия; болезнь тяжелых цепей; рак кости и саркомы соединительной ткани, такие как, но не ограничиваясь ими, саркома кости, миеломная болезнь кости, множественная миелома, остеосаркома кости, вызванная холестеатомой, болезнь Педжета кости, остеосаркома, хондросаркома, саркома Юинга, злокачественная гигантоклеточная опухоль, фибросаркома кости, хордома, периостальная саркома, саркома мягких тканей, ангиосаркома (гемангиосаркома), фибросаркома, саркома Капоши, лейомиосаркома, липосаркома, лимфангиосаркома, неврилеммома, рабдомиосаркома и синовиальная саркома; опухоли головного мозга, такие как, но не ограниченные ими, глиома, астроцитома, глиома ствола головного мозга, эпендимома, олигодендроглиома, не глиальная опухоль, акустическая невринома, краниофарингиома, медуллобластома, менингиома, пинеоцитома, пинеобластома и первичная лимфома головного мозга; рак молочной железы, включая, но не ограничиваясь ими, аденокарциному, лобулярную (мелкоклеточную) карциному, внутрипротоковую карциному, медуллярный рак молочной железы, муцинозный рак молочной железы, тубулярный рак молочной железы, папиллярный рак молочной железы, болезнь Педжета (включая ювенильную болезнь Педжета) и воспалительный рак молочной железы; рак надпочечников, такой как, но не ограничиваясь ими, феохромоцитома и адренокортикальная карцинома; рак щитовидной железы, такой как, но не ограничиваясь ими, папиллярный или фолликулярный рак щитовидной железы, медуллярный рак щитовидной железы и анапластический рак щитовидной железы; рак поджелудочной железы, такой как, но не ограничиваясь ими, инсулинома, гастринома, глюкагонома, випома, опухоль, секретирующая соматостатин, и карциноидная опухоль или опухоль из островковых клеток; рак гипофиза, такой как, но не ограничиваясь этим, болезнь Кушинга, пролактин-секретирующая опухоль, акромегалия и несахарный диабет; рак глаз, такой как, но не ограничивающийся ими, меланома глаза, такая как меланома радужной оболочки, меланома хориоидеи и меланома цилиарного тела, и ретинобластома; рак влагалища, такой как плоскоклеточная карцинома, аденокарцинома и меланома; рак вульвы, такой как плоскоклеточная карцинома, меланома, аденокарцинома, базально-клеточная карцинома, саркома и болезнь Педжета; рак шейки матки, такой как, но не ограничиваясь ими, плоскоклеточная карцинома и аденокарцинома; рак матки, такой как, но не ограничиваясь ими, карцинома эндометрия и саркома матки; рак яичников, такой как, но не ограничиваясь ими, эпителиальная карцинома яичника, пограничная опухоль, опухоль зародышевых клеток и стромальная опухоль; карцинома шейки матки; рак пищевода, такой как, но не ограничиваясь ими, плоскоклеточный рак, аденокарцинома, аденоидно-кистозная карцинома, мукоэпидермоидная карцинома, аденосквамозная карцинома, саркома, меланома, плазмоцитома, веррукозная карцинома и овсяноклеточная (мелкоклеточная) карцинома; рак желудка, такой как, но не ограничиваясь ими, аденокарцинома, грибковая (полипоидная), язвенная, поверхностно-распространяющаяся, диффузно-распространяющаяся, злокачественная лимфома, липосаркома, фибросаркома и карциносаркома; рак толстой кишки; колоректальный рак, колоректальный рак с мутацией KRAS; карциному толстой кишки; рак прямой кишки; рак печени, такой как, но не ограничиваясь ими, гепатоцеллюлярная карцинома и гепатобластома, рак желчного пузыря, такой как аденокарцинома; холангиокарциномы, такие как, но не ограничиваясь ими, папиллярная, узловая и диффузная; рак легких, такой как KRAS-мутированный немелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, плоскоклеточная карцинома (эпидермоидная карцинома), аденокарцинома, крупноклеточная карцинома и мелкоклеточный рак легкого; карциному легкого; рак яичка, такой как, но не ограничиваясь ими, зародышевая опухоль, семинома, анапластический, классический (типичный), сперматоцитарный, несеминомный, эмбриональный рак, тератомный рак, хориокарциному (опухоль желточного мешка), рак предстательной железы , такой как, но не ограничиваясь ими, андроген-независимый рак предстательной железы , андрогензависимый рак предстательной железы , аденокарцинома, лейомиосаркома и рабдомиосаркома; пенитенциарные раки; рак ротовой полости, такой как, но не ограничиваясь ими, плоскоклеточная карцинома; базальный рак; рак слюнных желез, такой как, но не ограничиваясь ими, аденокарцинома, мукоэпидермоидная карцинома и аденоидно-кистозная карцинома; рак глотки, такой как, но не ограничиваясь ими, плоскоклеточный рак и веррукозный рак; рак кожи, такой как, но не ограничиваясь ими, базальноклеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома и меланома, поверхностно распространяющаяся меланома, узловая меланома, злокачественная меланома лентиго, акралентигинозная меланома; рак почки, такой как, но не ограничиваясь ими, почечно-клеточный рак, аденокарцинома, гипернефрома, фибросаркома, переходно-клеточный рак (почечной лоханки и/или матки); почечная карцинома; опухоль Вильмса; рак мочевого пузыря, такой как, но не ограничиваясь ими, переходно-клеточная карцинома, плоскоклеточный рак, аденокарцинома, карциносаркома. Кроме того, рак включает миксосаркому, остеогенную саркому, эндотелиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, мезотелиому, синовиому, гемангиобластому, эпителиальную карциному, цистаденокарциному, бронхогенную карциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, папиллярную карциному и папиллярную аденокарциному.

Раки включают, но не ограничены ими, В-клеточный рак, например, множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, заболевания тяжелых цепей, такие как, например, болезнь альфа-цепей, болезнь гамма-цепей и болезнь мю-цепей, доброкачественную моноклональную гаммапатию и иммуноцитарный амилоидоз, меланомы, рак молочной железы, рак легких, рак бронхов, колоректальный рак, рак предстательной железы (например, метастатический, гормонорезистентный рак предстательной железы ), рак поджелудочной железы, рак желудка, рак яичников, рак мочевого пузыря, рак головного мозга или центральной нервной системы, рак периферической нервной системы, рак пищевода, рак шейки матки, рак матки или эндометрия, рак полости рта или глотки, рак печени, рак почки, рак яичек, рак желчных путей, рак тонкой кишки или аппендикса, рак слюнной железы, рак щитовидной железы, рак надпочечников, остеосаркому, хондросаркому, рак гематологических тканей и подобные. Другие неограничивающие примеры типов рака, применимые к способам, охватываемым настоящим описанием, включают саркомы и карциномы человека, например, фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеогенную саркому, хордому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, синовиому, мезотелиому, опухоль Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, карциному толстой кишки, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичников, плоскоклеточную карциному, базальноклеточную карциному, аденокарциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, папиллярную карциному, папиллярные аденокарциномы, цистаденокарциному, медуллярную карциному, бронхогенную карциному, почечно-клеточную карциному, гепатому, карциному желчных протоков, рак печени, хориокарциному, семиному, эмбриональную карциному, опухоль Вильмса, рак шейки матки, рак костей, опухоль головного мозга, рак яичек, карциному легких, мелкоклеточную карциному легких, карциному мочевого пузыря, эпителиальную карциному, глиому, астроцитому, медуллобластому, краниофарингиому, эпендимому, пинеалому, гемангиобластому, акустическую неврому, олигодендроглиому, менингиому, меланому, нейробластому, ретинобластому; лейкозы, например, острый лимфоцитарный лейкоз и острый миелоцитарный лейкоз (миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный и эритролейкоз); хронический лейкоз (хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз и хронический лимфоцитарный лейкоз); и истинную полицитемию, лимфому (болезнь Ходжкина и неходжкинскую болезнь), множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема и болезнь тяжелых цепей. В некоторых вариантах осуществления, раком, фенотип которого определяется способом по настоящему описанию, является эпителиальный рак, такой как, но не ограниченный ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, рак толстой кишки, гинекологические раковые заболевания, рак почек, рак гортани, рак легких, рак полости рта, рак головы и шеи, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы или рак кожи. В других вариантах осуществления, раком является рак молочной железы, рак предстательной железы, рак легких или рак толстой кишки. В других вариантах осуществления, эпителиальным раком является немелкоклеточный рак легкого, непапиллярный почечно-клеточный рак, шейный рак, карцинома яичников (например, серозный рак яичников) или карцинома молочной железы. Эпителиальный рак можно охарактеризовать различными другими способами, включая, но не ограничиваясь ими, серозный, эндометриоидный, муцинозный, светлоклеточный, бреннеровский или недифференцированный. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение используют для лечения, диагностики и/или прогнозирования лимфомы или ее подтипов, включая, но не ограничиваясь ими, мантийноклеточную лимфому. Лимфопролиферативные нарушения также считаются пролиферативными заболеваниями.

В некоторых вариантах осуществления комбинация агента, описанного в настоящем изобретении, и по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента дает аддитивные или синергические результаты. В некоторых вариантах осуществления, комбинированная терапия приводит к увеличению терапевтического индекса агента. В некоторых вариантах осуществления, комбинированная терапия приводит к увеличению терапевтического индекса дополнительных терапевтических агентов. В некоторых вариантах осуществления, комбинированная терапия приводит к снижению токсичности и/или побочных эффектов агента. В некоторых вариантах осуществления, комбинированная терапия приводит к снижению токсичности и/или побочных эффектов дополнительных терапевтических агентов.

В некоторых вариантах осуществления, помимо введения неоантигенного терапевтического агента, описанного в настоящем изобретении, способ или лечение дополнительно включает введение, по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента. Дополнительный терапевтический агент можно вводить до, одновременно и/или после введения агента. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент содержит 1, 2, 3 или более дополнительных терапевтических агентов.

Терапевтические агенты, которые можно вводить в комбинации с неоантигенным терапевтическим агентом, описанным в настоящем изобретении, включают химиотерапевтические агенты. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, способ или лечение включает введение агента, описанного в настоящем изобретении, в комбинации с химиотерапевтическим агентом или в комбинации с коктейлем из химиотерапевтических агентов. Лечение агентом может происходить до, одновременно или после проведения химиотерапии. Комбинированное введение может включать совместное введение либо в одном фармацевтическом составе, либо с использованием отдельных составов, либо последовательное введение в любом порядке, но обычно в течение периода времени, такого, чтобы все активные агенты могли проявить свою биологическую активность одновременно. Приготовление и схемы дозирования таких химиотерапевтических агентов можно использовать в соответствии с инструкциями производителей или как определено эмпирически опытным практикующим врачом. Приготовление и схемы дозирования для такой химиотерапии также описаны в The Chemotherapy Source Book, 4th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.

Пригодные для использования классы химиотерапевтических агентов включают, например, антитубулиновые агенты, ауристатины, связывающие агенты малых бороздок ДНК, ингибиторы репликации ДНК, алкилирующие агенты (например, комплексы платины, такие как цисплатин, моно(платина), бис(платина) и трехъядерные комплексы платины и карбоплатин), антрациклины, антибиотики, антифолаты, антиметаболиты, химиотерапевтические сенсибилизаторы, дуокармицины, этопозиды, фторированные пиримидины, ионофоры, лекситропсины, нитрозомочевины, платинолы, пуриновые антиметаболиты, пуромицины, радиационные сенсибилизаторы, стероиды, таксаны, ингибиторы топоизомеразы, алкалоиды барвинка и подобные. В некоторых вариантах осуществления, вторым терапевтическим агентом является алкилирующий агент, антиметаболит, антимитотик, ингибитор топоизомеразы или ингибитор ангиогенеза.

Химиотерапевтические агенты, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают, но не ограничены ими, алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламим; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномицины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, каминомицин, карзинофиллин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, кьюламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пуринов, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитозинарабинозид, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-FU; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства, угнетающие функции надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; восполнители фолиевой кислоты, такие как фолиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамидный гликозид; аминолевулиновая кислота; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; эльформитин; ацетат эллиптиния; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK; разоксан; сизофуран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (Ara-C); таксоиды, например, паклитаксел (TAXOL) и доцетаксел (TAXOTERE); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; СРТ11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевая кислота; эсперамицины; капецитабин (XELODA); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленных. Химиотерапевтические агенты также включают антигормональные агенты, которые регулируют или ингибируют действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (FARESTON); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и госерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленных. В некоторых вариантах осуществления, дополнительным терапевтическим агентом является цисплатин. В некоторых вариантах осуществления, дополнительным терапевтическим агентом является карбоплатин.

В некоторых вариантах осуществления, химиотерапевтическим агентом является ингибитор топоизомеразы. Ингибиторами топоизомеразы являются химиотерапевтические агенты, которые препятствуют действию фермента топоизомеразы (например, топоизомеразы I или II). Ингибиторы топоизомеразы включают, но не ограничены ими, доксорубицин HCl, даунорубицин цитрат, митоксантрон HCl, актиномицин D, этопозид, топотекан HCl, тенипозид (VM-26) и иринотекан, а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любых из них. В некоторых вариантах осуществления, дополнительным терапевтическим агентом является иринотекан.

В некоторых вариантах осуществления, химиотерапевтическим средством является антиметаболит. Антиметаболитом является химическое вещество со структурой, которая подобна метаболиту, необходимому для нормальных биохимических реакций, но достаточно отличается, чтобы влиять на одну или несколько нормальных функций клеток, таких как деление клеток. Антиметаболиты включают, но не ограничиваются ими, гемцитабин, фторурацил, капецитабин, метотрексат натрия, ралитрексед, пеметрексед, тегафур, цитозин арабинозид, тиогуанин, 5-азацитидин, 6-меркаптопурин, азатиоприн, 6-тиогуанин, пентостатин, флударабин фосфат и кладрибин, а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из них. В некоторых вариантах осуществления, дополнительным терапевтическим агентом является гемцитабин.

В некоторых вариантах осуществления, химиотерапевтическим агентом является антимитотический агент, включая, но не ограничиваясь ими, агенты, связывающие тубулин. В некоторых вариантах осуществления, агентом является таксан. В некоторых вариантах осуществления, агентом является паклитаксел или доцетаксел, или фармацевтически приемлемая соль, кислота или производное паклитаксела или доцетаксела. В некоторых вариантах осуществления, агентом является паклитаксел (TAXOL), доцетаксел (TAXOTERE), альбумин-связанный паклитаксел (ABRAXANE), DHA-паклитаксел или PG-паклитаксел. В некоторых альтернативных вариантах осуществления, антимитотический агент содержит алкалоид барвинка, такой как винкристин, винбластин, винорелбин или виндезин, или их фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные. В некоторых вариантах осуществления, антимитотическим агентом является ингибитор кинезина Eg5 или ингибитор митотической киназы, такой как Aurora A или Plk1. В некоторых вариантах осуществления, дополнительным терапевтическим агентом является паклитаксел. В некоторых вариантах осуществления, дополнительным терапевтическим агентом является альбумин-связанный паклитаксел.

В некоторых вариантах осуществления, дополнительный терапевтический агент содержит агент, такой как малая молекула. Например, лечение может включать комбинированное введение агента по настоящему изобретению с малой молекулой, которая действует как ингибитор против опухолеассоциированных антигенов, включая, но не ограничиваясь ими, EGFR, HER2 (ErbB2) и/или VEGF. В некоторых вариантах осуществления, агент по настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором протеинкиназы, выбранным из группы, состоящей из: гефитиниба (IRESSA), эрлотиниба (TARCEVA), сунитиниба (SUTENT), лапатаниба, вандетаниба (ZACTIMA), AEE788, CI-1033, седираниба (RECENTIN), сорафениба (NEXAVAR) и пазопаниба (GW786034B). В некоторых вариантах осуществления, дополнительное терапевтическое средство содержит ингибитор mTOR. В другом варианте осуществления, дополнительным терапевтическим агентом является химиотерапия или другие ингибиторы, снижающие количество Treg клеток. В некоторых вариантах осуществления, терапевтическим агентом является циклофосфамид или анти-CTLA4 антитело. В другом варианте осуществления, дополнительный терапевтический агент уменьшает присутствие супрессорных клеток миелоидного происхождения. В другом варианте осуществления, дополнительным терапевтическим агентом является карботаксол. В другом варианте осуществления, дополнительное терапевтическое средство сдвигает клетки к Т-хелперному 1 ответу. В другом варианте осуществления, дополнительным терапевтическим агентом является ибрутиниб.

В некоторых вариантах осуществления, дополнительный терапевтический агент содержит биологическую молекулу, такую как антитело. Например, лечение может включать комбинированное введение агента по настоящему изобретению с антителами против опухолеассоциированных антигенов, включая, но не ограничиваясь ими, антитела, которые связывают EGFR, HER2/ErbB2 и/или VEGF. В некоторых вариантах осуществления, дополнительным терапевтическим агентом является антитело, специфичное к маркеру раковых стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления, дополнительным терапевтическим агентом является антитело, которое является ингибитором ангиогенеза (например, антитело против VEGF или рецептора VEGF). В некоторых вариантах осуществления, дополнительным терапевтическим агентом является бевацизумаб (AVASTIN), рамуцирумаб, трастузумаб (HERCEPTIN), пертузумаб (OMNITARG), панитумумаб (VECTIBIX), нимотузумаб, залутумумаб или цетуксимаб (ERBITUX).

Агенты и композиции согласно настоящему изобретению можно использовать отдельно или в сочетании с обычными терапевтическими схемами, такими как хирургическое вмешательство, облучение, химиотерапия и/или трансплантация костного мозга (аутологическая, сингенная, аллогенная или неродственная). Набор опухолевых антигенов может быть полезен, например, для большой части больных раком.

В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере один или более химиотерапевтических агентов можно вводить в дополнение к композиции, содержащей иммуногенную вакцину. В некоторых вариантах осуществления, один или более химиотерапевтических агентов могут принадлежать к разным классам химиотерапевтических агентов.

Примеры химиотерапевтических агентов включают, но не ограничены ими, алкилирующие агенты, такие как азотистые иприты (например, мехлорэтамин (азотистый иприт), хлорамбуцил, циклофосфамид (Cytoxan®), ифосфамид и мелфалан); нитрозомочевины (например, N-нитрозо-N-метилмочевина, стрептозоцин, кармустин (BCNU), ломустин и семустин); алкилсульфонаты (например, бусульфан); тетразины (например, дакарбазин (DTIC), митозоломид и темозоломид (Temodar®)); азиридины (например, тиотепа, митомицин и диазиквон); и препараты платины (например, цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин); не классические алкилирующие агенты, такие как прокарбазин и алтретамин (гексаметилмеламин); антиметаболитные агенты, такие как 5-фторурацил (5-FU), 6-меркаптопурин (6-MP), капецитабин (Xeloda®), кладрибин, клофарабин, цитарабин (Ara-C®), децитабин, флоксуридин, флударабин, неларабин, гемцитабин (Gemzar®), гидроксимочевина, метотрексат, пеметрексед (Alimta®), пентостатин, тиогуанин, Видаза; ингибиторы полимеризации тубулина, такие как алкалоиды барвинка (например, винкристин, винбластин, винорелбин, виндезин и винфлюнин); таксаны (например, паклитаксел (Taxol®), доцетаксел (Taxotere®)); подофиллотоксин (например, этопозид и тенипозид); эпотилоны (например, иксабепилон (Ixempra®)); эстрамустин (Emcyt®); противоопухолевые антибиотики, такие как антрациклины (например, даунорубицин, доксорубицин (Adriamycin®, эпирубицин, идарубицин); актиномицин-D и блеомицин; ингибиторы топоизомеразы I, такие как топотекан и иринотекан (CPT-11); ингибиторы топоизомеразы II, такие как этопозид (VP-16), тенипозид, митоксантрон, новобиоцин, мербарон и акларубицин; кортикостероиды, такие как преднизон, метилпреднизолон (Solumedrol®) и дексаметазон (Decadron®); L-аспарагиназа; бортезомиб (Velcade®); иммунотерапевтические агенты, такие как ритуксимаб (Rituxan®), алемтузумаб (Campath®), талидомид, леналидомид (Revlimid®), BCG, интерлейкин-2, интерферон-альфа и противораковые вакцины, такие как Provenge®; гормональные терапевтические агенты, такие как фулвестрант (Faslodex®), тамоксифен, торемифен (Fareston®), анастрозол (Arimidex®), экземестан (Aromasin®), летрозол (Femara®), мегестрола ацетат (Megace®), эстрогены, бикалутамид (Casodex®), флутамид (Eulexin®), нилутамид (Nilandron®), лейпролид (Lupron®) и гозерелин (Zoladex®); дифференцирующие агенты, такие как ретиноиды, третиноин (ATRA или Atralin®), бексаротен (Targretin®) и триоксид мышьяка (Arsenox®); и таргетные терапевтические агенты, такие как иматиниб (Gleevec®), гефитиниб (Iressa®) и сунитиниб (Sutent®). В некоторых вариантах осуществления, химиотерапией является коктейльная терапия. Примеры коктейльной терапии включают, но не ограничены ими, CHOP/R-CHOP (ритуксан, циклофосфамид, гидроксидоксорубицин, винкристин и преднизон), EPOCH (этопозид, преднизон, винкристин, циклофосфамид, гидроксидоксорубицин), Hyper-CVAD (циклофосфамид, винкристин, гидроксидоксорубицин, дексаметазон), FOLFOХ (фторурацил (5-FU), лейковорин, оксалиплатин), ICE (ифосфамид, карбоплатин, этопозид), DHAP (высокие дозы цитарабина [ara-C], дексаметазон, цисплатин), ESHAP (этопозид, метилпреднизолон, цитарабин [ara-C], цисплатин) и CMF (циклофосфамид, метотрексат, флуурацил).

В некоторых вариантах осуществления, дополнительный терапевтический агент включает второй иммунотерапевтический агент. В некоторых вариантах осуществления, дополнительный иммунотерапевтический агент включает, но не ограничен ими, колониестимулирующий фактор, интерлейкин, антитело, которое блокирует иммуносупрессивные функции (например, анти-CTLA-4 антитело, анти-CD28 антитело, анти-CD3 антитело, анти-PD-1 антитело, анти-PD-L1 антитело, анти-TIGIT антитело), антитело, которое усиливает функции иммунных клеток (например, анти-GITR антитело, анти-OX-40 антитело, анти-CD40 антитело или анти-4-1BB антитело), толл-подобный рецептор (например, TLR4, TLR7, TLR9), растворимый лиганд (например, GITRL, GITRL-Fc, OX-40L, OX-40L-Fc, CD40L, CD40L-Fc, 4-1BB лиганд или 4-1BB-Fc лиганд), или член семейства B7 (например, CD80, CD86). В некоторых вариантах осуществления, дополнительный иммунотерапевтический агент таргетирует CTLA-4, CD28, CD3, PD-1, PD-L1, TIGIT, GITR, OX-40, CD-40 или 4-1BB.

В некоторых вариантах осуществления, дополнительным терапевтическим агентом является ингибитор иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления, ингибитором иммунной контрольной точки является анти-PD-1 антитело, анти-PD-L1 антитело, анти-CTLA-4 антитело, анти-CD28 антитело, анти-TIGIT антитело, агнти-LAG3 антитело, анти-TIM3 антитело, анти-GITR антитело, анти-4-1BB антитело или анти-OX-40 антитело. В некоторых вариантах осуществления, дополнительным терапевтическим агентом является анти-TIGIT антитело. В некоторых вариантах осуществления, дополнительным терапевтическим агентом является анти-PD-1 антитело, выбранное из группы, состоящей из: ниволумаба (OPDIVO), пембролизумаба (KEYTRUDA), пидилзумаба, MEDI0680, REGN2810, BGB-A317 и PDR001. В некоторых вариантах осуществления, дополнительным терапевтическим агентом является анти-PD-L1 антитело, выбранное из группы, состоящей из: BMS935559 (MDX-1105), атексолизумаба (MPDL3280A), дурвалумаба (MEDI4736) и авелумаба (MSB0010718C). В некоторых вариантах осуществления, дополнительны темрапевтическим агентом является анти-CTLA-4 антитело, выбранное из группы, состоящей из ипилимумаба (YERVOY) и тремелимумаба. В некоторых вариантах осуществления, дополнительным терапевтическим агентом является анти-LAG-3 антитело, выбранное из группы, состоящей из: BMS-986016 и LAG525. В некоторых вариантах осуществления, дополнительным терапевтическим агентом является анти-OX-40 антитело, выбранное из группы, состоящей из: MEDI6469, MEDI0562 и MOXR0916. В некоторых вариантах осуществления, дополнительным терапевтическим агентом является анти-4-1BB антитело, выбранное из группы, состоящей из: PF-05082566.

В некоторых вариантах осуществления, терапевтический неоантиген можно вводить в комбинации с биологической молекулой, выбранной из группы, состоящей из: адреномедуллина (AM), ангиопоэтина (Ang), BMP, BDNF, EGF, эритропоэтина (EPO), FGF, GDNF, гранулоцитарного колониестиулирующего фактора (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF), фактора стволовых клеток (SCF), GDF9, HGF, HDGF, IGF, фактора, стимулирующего миграцию, миостатина (GDF-8), NGF, нейротрофинов, PDGF, тромбопоэтина, TGF-α, TGF-β , TNF-α, VEGF, PlGF, гамма-IFN, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15 и IL-18.

В некоторых вариантах осуществления, лечение неоантигенным терапевтическим агентом, описанным в настоящем изобретении, может сопровождаться хирургическим удалением опухолей, удалением раковых клеток или любой другой хирургической терапией, которую лечащий врач сочтет необходимой.

В некоторых вариантах осуществления лечение включает введение неоантигенного терапевтического агента, описанного в настоящем изобретении, в сочетании с радиационной терапией. Лечение агентом может происходить до, одновременно или после радиационной терапии. Схему дозирования такой радиационной терапии может определить квалифицированный практикующий врач.

Комбинированное введение может включать совместное введение либо в одном фармацевтическом составе, либо с использованием отдельных составов, либо последовательное введение в любом порядке, но обычно в течение периода времени, такого, чтобы все активные агенты могли проявить свою биологическую активность одновременно.

Следует понимать, что комбинацию неоантигенного терапевтического агента, описанного в настоящем изобретении, и по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента можно вводить в любом порядке или одновременно. В некоторых вариантах осуществления, агент будет вводиться пациентам, ранее проходившим лечение вторым терапевтическим средством. В некоторых других вариантах осуществления, неоантигенный терапевтический агент и второй терапевтический агент будут вводиться по существу одновременно или одновременно. Например, субъекту можно давать агент во время прохождения курса лечения вторым терапевтическим агентом (например, химиотерапией). В некоторых вариантах осуществления, неоантигенный терапевтический агент будет вводиться в течение 1 года после лечения вторым терапевтическим агентом. Кроме того, следует понимать, что два (или несколько) агентов или лечений могут быть введены субъекту в течение нескольких часов или минут (т.е. по существу одновременно).

Для лечения заболевания, подходящая доза неоантигенного терапевтического агента, описанного в настоящем изобретении, зависит от типа заболевания, которое подлежит лечению, тяжести и течения заболевания, реакции на заболевание, от того, вводят ли агент в терапевтических или профилактических целях, предыдущей терапии, истории болезни пациента и так далее, все на усмотрение лечащего врача. Неоантигенный терапевтический агент можно вводить один раз или в течение серии курсов лечения, продолжающихся от нескольких дней до нескольких месяцев, или до тех пор, пока не произойдет излечение или не будет достигнуто уменьшение болезненного состояния (например, уменьшение размера опухоли). Оптимальные схемы дозирования могут быть рассчитаны на основе измерений накопления лекарственного средства в организме пациента и будут варьировать в зависимости от относительной эффективности отдельного агента. Лечащий врач может определить оптимальные дозировки, методики дозирования и частоту повторения.

В некоторых вариантах осуществления, неоантигенный терапевтический агент можно вводить в начальной более высокой «нагрузочной» дозе с последующим введением одной или несколькими более низкими дозами. В некоторых вариантах осуществления, также может изменяться частота введения. В некоторых вариантах осуществления, схема дозирования может включать введение начальной дозы с последующими дополнительными дозами (или «поддерживающими» дозами) один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели или один раз в месяц. Например, схема дозирования может включать введение начальной нагрузочной дозы с последующим еженедельным введением поддерживающей дозы, например, половины начальной дозы; схема дозирования может включать введение начальной нагрузочной дозы с последующим введением поддерживающих доз, например, половины начальной дозы каждые две недели; или схема дозирования может включать введение трех начальных доз в течение 3 недель с последующими поддерживающими дозами, например, в таком же количестве каждые две недели.

Как известно специалистам в данной области техники, введение любого терапевтического агента может приводить к побочным эффектам и/или токсичности. В некоторых случаях, побочные эффекты и/или токсичность настолько серьезны, что препятствуют введению конкретного агента в терапевтически эффективной дозе. В некоторых случаях, терапию необходимо прекратить, и можно попробовать другие агенты. Однако многие агенты одного и того же терапевтического класса проявляют сходные побочные эффекты и/или токсичность, что означает, что пациент либо должен прекратить терапию, либо, если возможно, страдать от неприятных побочных эффектов, связанных с терапевтическим агентом.

В некоторых вариантах осуществления, схема дозирования может быть ограничена определенным количеством введений или «циклов». В некоторых вариантах осуществления, агент вводят в течение 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более циклов. Например, агент вводят каждые 2 недели в течение 6 циклов, агент вводят каждые 3 недели в течение 6 циклов, агент вводят каждые 2 недели в течение 4 циклов, агент вводят каждые 3 недели в течение 4 циклов и т.д. Схем дозирования могут быть определены и впоследствии изменены специалистами в данной области техники.

Настоящее раскрытие относится к способам введения субъекту неоантигенного терапевтического агента, описанного в настоящем изобретении, включающие использование стратегии прерывистого дозирования для введения одного или нескольких агентов, которые могут снизить побочные эффекты и/или токсичность, связанные с введением агента, химиотерапевтического агента и т.д. В некоторых вариантах осуществления, способ лечения рака у человека включает введение субъекту терапевтически эффективной дозы неоантигенного терапевтического агента в комбинации с терапевтически эффективной дозой химиотерапевтического агента, где один или оба агента вводят в соответствии со стратегией периодического дозирования. В некоторых вариантах осуществления, способ лечения рака у субъекта-человека включает введение субъекту терапевтически эффективной дозы неоантигенного терапевтического агента в комбинации с терапевтически эффективной дозой второго иммунотерапевтического агента, где один или оба агента вводят в соответствии со стратегией прерывистого дозирования. В некоторых вариантах осуществления, стратегия прерывистого дозирования включает введение субъекту начальной дозы неоантигенного терапевтического агента и введение последующих доз агента приблизительно раз в 2 недели. В некоторых вариантах осуществления, стратегия прерывистого дозирования включает введение субъекту начальной дозы неоантигенного терапевтического агента и введение последующих доз агента приблизительно один раз каждые 3 недели. В некоторых вариантах осуществления, стратегия прерывистого дозирования включает введение субъекту начальной дозы неоантигенного терапевтического агента и введение последующих доз агента приблизительно один раз каждые 4 недели. В некоторых вариантах осуществления, агент вводят с использованием стратегии прерывистого дозирования, и дополнительный терапевтический агент вводят еженедельно.

Настоящее раскрытие относится к композициям, содержащим неоантигенный терапевтический агент, описанный в настоящем изобретении. Настоящее раскрытие также относится к фармацевтическим композициям, содержащим неоантигенный терапевтический агент, описанный в настоящем изобретении, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические композиции находят применение в иммунотерапии. В некоторых вариантах осуществления, композиции находят применение для ингибирования роста опухоли. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические композиции находят применение для ингибирования роста опухоли у субъекта (например, пациента-человека). В некоторых вариантах осуществления, композиции находят применение при лечении рака. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические композиции находят применение при лечении рака у субъекта (например, пациента-человека).

Составы готовят для хранения и использования путем комбинирования неоантигенного терапевтического агента по настоящему описанию с фармацевтически приемлемым носителем (например, носителем или эксципиентом). Специалисты в данной области техники обычно считают фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты и/или стабилизаторы не активными ингредиентами состава или фармацевтической композиции. Типовые составы перечислены в WO 2015/095811.

Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничены ими, не токсичные буферы, такие как фосфатные, цитратные и другие органические кислоты; соли, такие как хлорид натрия; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты, такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехол, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол; низкомолекулярные полипептиды (например, менее приблизительно 10 аминокислотных остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; углеводы, такие как моносахариды, дисахариды, глюкоза, манноза или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов, такие как комплексы Zn-белок; и неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN или полиэтиленгликоль (PEG). (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22st Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London). В некоторых вариантах осуществления, носителем является 5% раствор декстрозы в воде.

В одном аспекте, изобретение относится к фармацевтически приемлемым или физиологически приемлемым композициям, включающим растворители (водные или неводные), растворы, эмульсии, дисперсионные среды, покрытия, изотонические агенты и агенты, способствующие или замедляющие абсорбцию, совместимые с фармацевтическим введением. Таким образом, фармацевтические композиции или фармацевтические составы относятся к композиции, подходящей для фармацевтического применения у субъекта. Композиции могут быть составлены так, чтобы быть совместимыми с конкретным путем введения (т.е. системным или местным). Таким образом, композиции включают носители, разбавители или эксципиенты, подходящие для введения различными путями.

В некоторых вариантах осуществления, композиция может дополнительно содержать приемлемую добавку для повышения стабильности иммунных клеток в композиции. Приемлемые добавки не могут изменить специфическую активность иммунных клеток. Примеры приемлемых добавок включают, но не ограничены ими, сахар, такой как маннит, сорбит, глюкоза, ксилит, трегалоза, сорбоза, сахароза, галактоза, декстран, декстроза, фруктоза, лактоза и их смеси. Приемлемые добавки можно комбинировать с приемлемыми носителями и/или эксципиентами, такими как декстроза. Альтернативно, примеры приемлемых добавок включают, но не ограничены ими, поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат 20 или полисорбат 80, для повышения стабильности пептида и уменьшения желирования раствора. Поверхностно-активное вещество можно добавлять в композицию в количестве от 0,01% до 5% раствора. Добавление таких приемлемых добавок увеличивает стабильность и период полужизни композиции при хранении.

Описанные в настоящем изобретении фармацевтические композиции можно вводить любым количеством способов как для местного, так и для системного лечения. Введение может быть местным, путем эпидермальных или трансдермальных пластырей, мазей, лосьонов, кремов, гелей, капель, суппозиториев, спреев, жидкостей и порошков; легочным, путем ингаляции или вдувания порошков или аэрозолей, в том числе с помощью небулайзера, интратрахеально и интраназально; пероральным; или парентеральным, включая внутривенное, внутриартериальное, внутриопухолевое, подкожное, внутрибрюшинное, внутримышечное (например, инъекцию или инфузию) или внутричерепное (например, интратекальное или внутрижелудочковое).

Фармацевтическую композицию можно вводить, например, путем инъекции. Введение может быть внутрикожной инъекцией, интраназальным спреем, внутримышечной инъекцией, внутрибрюшинной инъекцией, внутривенной инъекцией, пероральным введением или подкожной инъекцией. Композиции для инъекций включают водные растворы (если они водорастворимы) или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Для внутривенного введения подходящие носители включают солевой раствор, бактериостатическую воду или физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS). Носителем может быть растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и подобные) и их подходящие смеси. Текучесть можно поддерживать, например, за счет использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Антибактериальные и противогрибковые средства включают, например, парабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновую кислоту и тимеросал. В композицию могут быть включены изотонические агенты, например сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит и хлорид натрия. Полученные растворы могут быть упакованы для использования как есть или лиофилизированы; лиофилизированный препарат может быть позже объединен со стерильным раствором перед введением. Для внутривенного введения, инъекции или инъекции в место поражения, активный ингредиент будет в форме парентерально приемлемого апирогенного водного раствора, который имеет подходящий pH, изотоничность и стабильность. Специалисты в данной области техники вполне способны приготовить подходящие растворы, используя, например, изотонические носители, такие как инъекция хлорида натрия, инъекция Рингера, лактатированная инъекция Рингера. При необходимости могут быть включены консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки. Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем включения активного ингредиента в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно, дисперсии готовят путем включения активного ингредиента в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций, предпочтительными способами приготовления могут быть вакуумная сушка и сублимационная сушка, которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из его предварительно стерильно отфильтрованного раствора.

Композиции обычно можно вводить внутривенно, например, путем инъекции стандартной дозы. Для инъекции, активный ингредиент может быть в форме парентерально приемлемого водного раствора, который по существу апирогенный и имеет подходящий pH, изотоничность и стабильность. Подходящие растворы можно приготовить с использованием, например, изотонических носителей, таких как инъекция хлорида натрия, инъекция Рингера, лактатированная инъекция Рингера. При необходимости, могут быть включены консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки. Кроме того, композиции можно вводить путем аэрозолизации.

Если композиции рассматриваются для использования в лекарственных средствах или в любом из способов, представленных в настоящем изобретении, предполагается, что композиция может быть по существу апирогенной, так что композиция не будет вызывать воспалительную реакцию или небезопасную аллергическую реакцию при введении пациенту-человеку. Тестирование композиций на пирогены и приготовление композиций, по существу апирогенных, хорошо понятны специалисту в данной области техники и могут быть выполнены с использованием коммерчески доступных наборов.

Приемлемые носители могут содержать соединение, которое стабилизирует, увеличивает или задерживает абсорбцию, или увеличивает или задерживает клиренс. Такие соединения включают, например, углеводы, такие как глюкоза, сахароза или декстраны; низкомолекулярные белки; композиции, снижающие клиренс или гидролиз пептидов; или эксципиенты, или другие стабилизаторы, и/или буферы. Агенты, замедляющие абсорбцию, включают, например, моностеарат алюминия и желатин. Моющие вещества также можно использовать для стабилизации или увеличения или уменьшения абсорбции фармацевтической композиции, включая липосомальные носители. Для защиты от перевара соединение может образовывать комплекс с композицией, чтобы сделать его устойчивым к кислотному и ферментативному гидролизу, или соединение может образовывать комплекс с подходящим устойчивым носителем, таким как липосома. Средства защиты соединений от перевара известны в данной области техники (например, Fix (1996) Pharm Res. 13:1760 1764; Samanen (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:119 135; и патент США № 5,391,377).

Композиции можно вводить способом, совместимым с дозированным составом, и в терапевтически эффективном количестве. Вводимое количество зависит от субъекта, которого лечат, способности иммунной системы субъекта использовать активный ингредиент и желаемой степени связывающей способности. Точные количества активного ингредиента, необходимые для введения, зависят от суждения практикующего врача и индивидуальны для каждого индивидуума. Подходящие схемы для начального введения и повторных инъекций также варьируются, но типовыми являются начальное введение с последующими повторными дозами с интервалом в один или более часов с последующей инъекцией или другим введением. Альтернативно рассматриваются непрерывные внутривенные инфузии, достаточные для поддержания концентраций в крови.

В некоторых случаях, фармацевтические композиции, содержащие один или более агентов, оказывают местное и региональное действие при местном введении или инъекции в определенные места инфекции или рядом с ними. Прямое местное нанесение, например, вязкой жидкости, раствора, суспензии, растворов на основе диметилсульфоксида (DMSO), липосомальных составов, геля, желе, крема, лосьона, мази, суппозитория, пены или аэрозольного спрея, можно использовать для местного введения для создания, например, локальных и/или региональных эффектов. Фармацевтически подходящие носители для такого состава включают, например, низшие алифатические спирты, полигликоли (например, глицерин или полиэтиленгликоль), сложные эфиры жирных кислот, масла, жиры, силиконы и подобные. Такие препараты могут также включать консерванты (например, сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты) и/или антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту и токоферол). См. также Dermatological Formulations: Percutaneous absorption, Barry (Ed.), Marcel Dekker Incl, 1983. В другом варианте осуществления, локальные/местные составы, содержащие транспортер, носитель или ингибитор ионных каналов, используют для лечения эпидермальных или мукозальных вирусных инфекций.

В некоторых случаях, иммуногенная фармацевтическая композиция может включать носители и эксципиенты (включая, помимо прочего, буферы, углеводы, маннит, белки, полипептиды или аминокислоты, такие как глицин, антиоксиданты, бактериостаты, хелатирующие агенты, суспендирующие агенты, загустители и/или консерванты), воду, масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и подобные, солевые растворы, водные растворы декстрозы и глицерина, ароматизаторы, красители, вещества, снижающие клейкость, и другие приемлемые добавки, адъюванты или связующие агенты, другие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как pH буферные агенты, агенты, регулирующие тоничность, эмульгирующие агенты, смачивающие агенты и подобные. Примеры эксципиентов включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и подобные. В других случаях, фармацевтический препарат по существу не содержит консерванты. В других случаях, фармацевтический препарат может содержать, по меньшей мере один консервант. Следует понимать, что хотя любой подходящий носитель, известный специалистам в данной области техники, может быть использован для введения описанных в настоящем изобретении фармацевтических композиций, тип носителя будет варьировать в зависимости от способа введения.

Иммуногенная фармацевтическая композиция может включать консерванты, такие как тиомерсал или 2-феноксиэтанол. В некоторых случаях, иммуногенная фармацевтическая композиция по существу не содержит (например, <10 мкг/мл) ртутный материал, например, не содержит тиомерсал. Сукцинат α-токоферола может использоваться как альтернатива ртутным соединениям.

Для контроля тоничности, в иммуногенную фармацевтическую композицию можно включить физиологическую соль, такую как натриевая соль. Другие соли могут включать хлорид калия, дигидрофосфат калия, динатрийфосфат и/или хлорид магния и подобные.

Иммуногенная фармацевтическая композиция может иметь осмоляльность от 200 мОсм/кг до 400 мОсм/кг, 240-360 мОсм/кг или в пределах 290-310 мОсм/кг.

Иммуногенная фармацевтическая композиция может содержать один или более буферов, таких как Tris буфер; боратный буфер; сукцинатный буфер; гистидиновый буфер (особенно с адъювантом гидроксида алюминия); или цитратный буфер. Буферы в некоторых случаях включены в диапазоне 5-20 или 10-50 мМ.

Иммуногенная фармацевтическая композиция может содержать модификатор рН. В некоторых вариантах осуществления, модификатор рН присутствует в концентрации менее 1 мМ или более 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, модификатор рН присутствует в концентрации менее 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 нМ или 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, модификатор рН присутствует в концентрации более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 или 900 мМ. В некоторых вариантах осуществления, модификатором рН является дикарбоксилат. В некоторых вариантах осуществления, модификатором рН является трикарбоксилат. В некоторых вариантах осуществления, модификатором pH является дикарбоксилат янтарной кислоты. В некоторых вариантах осуществления, модификатором pH является дисукцинат. В некоторых вариантах осуществления, модификатором рН является трикарбоксилат лимонной кислоты. В некоторых вариантах осуществления, модификатором рН является трицитрат. В некоторых вариантах осуществления, модификатором рН является динатрийсукцинат. В некоторых вариантах осуществления, дикарбоксилат янтарной кислоты присутствует в фармацевтической композиции в концентрации от 0,1 мМ до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, дисукцинат присутствует в фармацевтической композиции в концентрации от 0,1 мМ до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, дикарбоксилат янтарной кислоты присутствует в фармацевтической композиции в концентрации от 1 мМ до 5 мМ. В некоторых вариантах осуществления, дисукцинат присутствует в фармацевтической композиции в концентрации от 1 мМ до 5 мМ. рН иммуногенной фармацевтической композиции может составлять от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,5, от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0, от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5 или от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,8.

Иммуногенная фармацевтическая композиция может быть стерильной. Иммуногенная фармацевтическая композиция может быть апирогенной, например, содержащей <1 EU (единица эндотоксина, стандартная мера) на дозу, и может содержать <0,1 EU на дозу. Композиция может быть без глютена.

Иммуногенная фармацевтическая композиция может включать моющее вещество, например поверхностно-активное вещество на основе сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана (известное как «Tweens») или октоксинол (такой как октоксинол-9 (Triton X-100) или трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол). Моющее средство может присутствовать только в следовых количествах. Иммуногенная фармацевтическая композиция может включать менее 1 мг/мл каждого из октоксинола-10 и полисорбата 80. Другими остаточными компонентами в следовых количествах могут быть антибиотики (например, неомицин, канамицин, полимиксин B).

Иммуногенная фармацевтическая композиция может быть составлена в виде стерильного раствора или суспензии, в подходящих носителях, хорошо известных в данной области техники. Фармацевтические композиции могут быть стерилизованы общепринятыми, хорошо известными методами стерилизации, или могут быть стерилизованы фильтрованием. Полученные водные растворы могут быть упакованы для использования как есть или лиофилизированы, где лиофилизированный препарат перед введением объединяют со стерильным раствором.

Фармацевтические композиции, содержащие, например, активный агент, такой как описанные в настоящем изобретении иммунные клетки, в сочетании с одним или несколькими адъювантами, могут быть составлены таким образом, чтобы иметь определенные молярные соотношения. Например, можно использовать молярные соотношения от приблизительно 99:1 до приблизительно 1:99 активного агента, такого как описанная в настоящем изобретении иммунная клетка, в комбинации с одним или несколькими адъювантами. В некоторых случаях, диапазон молярных соотношений активного агента, такого как описанная в настоящем изобретении иммунная клетка, в комбинации с одним или несколькими адъювантами, может быть выбран от приблизительно 80:20 до приблизительно 20:80; от приблизительно 75:25 до приблизительно 25:75, от приблизительно 70:30 до приблизительно 30:70, от приблизительно 66:33 до приблизительно 33:66, от приблизительно 60:40 до приблизительно 40:60; приблизительно 50:50; и от приблизительно 90:10 до приблизительно 10:90. Молярное соотношение активного агента, такого как описанная в настоящем изобретении иммунная клетка, в сочетании с одним или несколькими адъювантами, может составлять приблизительно 1:9, и, в некоторых случаях, может составлять приблизительно 1:1. Активный агент, такой как описанная в настоящем изобретении иммунная клетка, в комбинации с одним или несколькими адъювантами может быть составлен вместе, в одной и той же дозированной единице, например, в одном флаконе, суппозитории, таблетке, капсуле, аэрозольном спрее; или каждый агент, форма и/или соединение могут быть составлены в виде отдельных единиц, например, двух флаконов, суппозиториев, таблеток, двух капсул, таблетки и флакона, аэрозольного спрея и подобных.

Терапевтический состав может быть в стандартной дозированной форме. Такие составы включают таблетки, пилюли, капсулы, порошки, гранулы, растворы или суспензии в воде или не водной среде или суппозитории.

Описанные в настоящем изобретении неоантигенные пептиды также могут быть заключены в микрокапсулы. Такие микрокапсулы готовят, например, методами коацервации или межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметацилатные) микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях, как описано в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22st Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.

В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические составы включают неоантигенное терапевтическое средство, описанное в настоящем изобретении, в комплексе с липосомами. Способы получения липосом известны специалистам в данной области техники. Например, некоторые липосомы можно получить путем выпаривания с обращенной фазой с жировой композицией, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и производное PEG фосфатидилэтаноламина (PEG-PE). Липосомы могут быть экструдированы через фильтры с определенным размером пор, чтобы получить липосомы желаемого диаметра.

В некоторых вариантах осуществления, могут быть получены препараты с замедленным высвобождением, содержащие неоантигенные пептиды, описанные в настоящем изобретении. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие агент, где матрицы находятся в форме формованных изделий (например, пленок или микрокапсул). Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели, такие как поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт), полилактиды, сополимеры L-глутаминовой кислоты и 7-этил-L-глутамата, неразлагаемый этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной и гликолевой кислот, такие как LUPRON DEPOT™ (микросферы для инъекций, состоящие из сополимера молочной и гликолевой кислот и ацетата лейпролида), изобутират ацетата сахарозы и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.

Настоящее раскрытие относится к способы лечения, включающие иммуногенную вакцину. Представлены способы лечения заболевания (например, рака или вирусной инфекции). Способ может включать введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей иммуногенный антиген. В некоторых вариантах осуществления, антиген включает вирусный антиген. В некоторых вариантах осуществления, антиген включает опухолевый антиген.

Неограничивающие примеры вакцин, которые могут быть получены, включают вакцину на основе пептидов, вакцину на основе нуклеиновой кислоты, вакцину на основе антитела и вакцину на основе антигенпрезентирующих клеток.

Композиции вакцины могут быть составлены с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, включая эксципиенты и вспомогательные вещества, которые облегчают обработку активных агентов в препараты, которые можно использовать фармацевтически. Правильный состав может зависеть от выбранного пути введения. Любые из хорошо известных методик, носителей и эксципиентов могут быть использованы подходящим образом и как это понимается в данной области техники.

В некоторых случаях, вакцинную композицию составляют как вакцину на основе пептидов, вакцину на основе нуклеиновых кислот, вакцину на основе антитела или вакцину на основе клеток. Например, вакцинная композиция может включать голую кДНК в составах катионных жиров; липопептиды (например, ., Vitiello, A. et al., J. Clin. Invest. 95:341, 1995), голые кДНК или пептиды, инкапсулированные, например, в поли(DL-лактид-со-гликолид) («PLG») микросферы (см., например, Eldridge, et al., Molec. Immunol. 28:287-294, 1991: Alonso et al, Vaccine 12:299-306, 1994; Jones et al, Vaccine 13:675-681, 1995); пептидную композицию, содержащуюся в иммуностимулирующих комплексах (ISCOMS) (например, Takahashi et al, Nature 344:873-875, 1990; Hu et al, Clin. Exp. Immunol. 113:235-243, 1998); или множественные системы антигенных пептидов (MAP) (см., например, Tam, J. P., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 85:5409-5413, 1988; Tarn, J.P., J. Immunol. Methods 196:17-32, 1996). Иногда вакцину составляют как вакцину на основе пептидов или вакцину на основе нуклеиновой кислоты, в которой нуклеиновая кислота кодирует полипептиды. Иногда вакцину составляют как вакцину на основе антитела. Иногда вакцина составляется как вакцина на клеточной основе.

Аминокислотная последовательность идентифицированного болезнь-специфического иммуногенного неоантигенного пептида может быть использована для разработки фармацевтически приемлемой композиции. Источником антигена могут быть, но не ограничены ими, природные или синтетические белки, включая гликопротеины, пептиды и суперантигены; комплексы антитело/антиген; липопротеины; РНК или продукт ее трансляции; и ДНК или полипептид, кодированный ДНК. Источник антигена также может включать не трансформированные, трансформированные, трансфицированные или трансдуцированные клетки или клеточные линии. Клетки могут быть трансформированы, трансфицированы или трансдуцированы с использованием любого из множества векторов экспрессии или ретровирусных векторов, известных специалистам в данной области техники, которые можно использовать для экспрессии рекомбинантных антигенов. Экспрессия также может быть достигнута в любой подходящей клетке-хозяине, которая была трансформирована, трансфицирована или трансдуцирована вектором экспрессии или ретровирусным вектором, содержащим молекулу ДНК, кодирующую рекомбинантные антигены. Можно использовать любое количество протоколов трансфекции, трансформации и трансдукции, известных специалистам в данной области техники. Рекомбинантные векторы осповакцины и клетки, инфицированные вектором осповакцины, можно использовать в качестве источника антигена.

Фармацевтическая композиция может содержать синтетический болезнь-специфический иммуногенный неоантигенный пептид. Фармацевтическая композиция может содержать два или более болезнь-специфичных иммуногенных неоантигенных пептида. Фармацевтическая композиция может содержать предшественник болезнь-специфичного иммуногенного пептида (такого как белок, пептид, ДНК и РНК). Предшественник болезнь-специфичного иммуногенного пептида может создаваться или быть созданным для идентифицированного болезнь-специфичного иммуногенного неоантигенного пептида. В некоторых вариантах осуществления, терапевтическая композиция содержит предшественник иммуногенного пептида. Предшественник болезнь-специфичного иммуногенного пептида может быть пролекарством. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция, содержащая болезнь-специфичный иммуногенный неоантигенный пептид, может дополнительно включать адъювант. Например, неоантигенный пептид можно использовать в качестве вакцины. В некоторых вариантах осуществления, иммуногенная вакцина может содержать фармацевтически приемлемый иммуногенный неоантигенный пептид. В некоторых вариантах осуществления, иммуногенная вакцина может содержать фармацевтически приемлемый предшественник иммуногенного неоантигенного пептида (такого как белок, пептид, ДНК и РНК). В некоторых вариантах осуществления, способ лечения содержит введение субъекту эффективного количества антитела, специфически распознающего иммуногенный неоантигенный пептид.

Описанные в настоящем изобретении способы применимы в контексте персонализированной медицины, где иммуногенные неоантигенные пептиды используют для разработки терапевтических агентов (таких как вакцины или терапевтические антитела) для одного и того же индивидуума. Таким образом, способ лечения заболевания у субъекта может включать идентификацию иммуногенного неоантигенного пептида у субъекта в соответствии со способами, описанными в настоящем изобретении; и синтез пептида (или его предшественника); и введение пептида или антитела, специфически распознающего пептид, субъекту.

В некоторых вариантах осуществления, идентификация эпитопа, экспрессируемого опухолевыми клетками субъекта, или иммуногенного неоантигенного пептида включает выбор множества последовательностей нуклеиновых кислот из пула последовательностей нуклеиновых кислот, секвенированных из опухолевых клеток субъекта, которые кодируют множество кандидатных пептидных последовательностей, содержащих одну или несколько различных мутаций, отсутствующих в пуле последовательностей нуклеиновых кислот, секвенированных из не опухолевых клеток субъекта, где пул последовательностей нуклеиновых кислот, секвенированных из опухолевых клеток субъекта, и пул последовательностей нуклеиновых кислот, секвенированных из не опухолевых клеток субъекта, секвенированы путем полногеномного секвенирования или полноэкзомного секвенирования. В некоторых вариантах осуществления, идентификация эпитопа, экспрессированного опухолевыми клетками субъекта или иммуногенным неоантигенным пептидом, дополнительно включает прогнозирование или измерение того, какие кандидатные пептидные последовательности из множества возможных пептидных последовательностей образуют комплекс с белком, кодируемым аллелем HLA того же субъекта, посредством анализа связывания пептида HLA. В некоторых вариантах осуществления, идентификация эпитопа, экспрессируемого опухолевыми клетками субъекта или иммуногенным неоантигенным пептидом, дополнительно включает выбор множества выбранных опухолеспецифических пептидов или одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих множество выбранных опухолеспецифических пептидов из кандидатных пептидных последовательностей на основе анализа связывания пептида HLA. В некоторых вариантах осуществления, эпитопом, экспрессируемым опухолевыми клетками субъекта, является неоантиген, опухолеассоциированный антиген, антиген, ассоциированный с мутированной опухолью, и/или где экспрессия эпитопа в опухолевых клетках субъекта выше по сравнению с экспрессией эпитопа в нормальных клетках субъекта.

В некоторых вариантах осуществления, профиль экспрессии иммуногенного неоантигена может служить важной основой для создания специфичных для пациента вакцин. В некоторых вариантах осуществления, профиль экспрессии иммуногенного неоантигена может служить важной основой для создания вакцины для группы пациентов с конкретным заболеванием. Таким образом, конкретные заболевания, например, определенные типы опухолей, можно селективно лечить в группе пациентов.

В некоторых вариантах осуществления, пептидами, описанными в настоящем изобретении, являются структурно нормальные антигены, которые могут распознаваться аутологичными анти-больными Т-клетками в большой группе пациентов. В некоторых вариантах осуществления, определяют профиль экспрессии антигена в группе больных субъектов, заболевание которых экспрессирует структурно нормальные неоантигены.

В некоторых вариантах осуществления, описанная в настоящем изобретении фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере два полипептида, содержащих, по меньшей мере две полипептидных молекулы. В некоторых вариантах осуществления, два или более из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул содержат один и тот же эпитоп одинаковой длины. В некоторых вариантах осуществления, два или более из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул содержат одну и ту же аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая относится к пептидной последовательности, которая не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп. В некоторых вариантах осуществления, два или более из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул содержат другой линкер. В некоторых вариантах осуществления, первый полипептид из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул, не содержит линкер, и второй полипептид из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул, содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления, первый полипептид из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул, не содержит линкер на N-конце эпитопа, и второй полипептид из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул, содержит линкер на N-конце эпитопа. В некоторых вариантах осуществления, первый полипептид из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул, не содержит линкер на С-конце эпитопа, и второй полипептид из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул содержит линкер на С-конце эпитопа. В некоторых вариантах осуществления, первый полипептид из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул содержит линкер, и второй полипептид из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул не содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления, первый полипептид из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул содержит линкер на N-конце эпитопа, и второй полипептид из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул не содержит линкер на N-конце эпитопа. В некоторых вариантах осуществления, первый полипептид из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул содержит линкер на С-конце эпитопа, и второй полипептид из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул не содержит линкер на С-конце эпитопа.

В некоторых вариантах осуществления, эпитоп присутствует в фармацевтической композиции в количестве от 1 нг до 10 мг или от 5 мкг до 1,5 мг. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп присутствует в количестве от 1 нг до 10 мг. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп присутствует в количестве от 1 нг до 100 нг, от 10 нг до 200 нг, от 20 нг до 300 нг, от 30 нг до 400 нг, от 40 нг до 500 нг, от 50 нг до 600 нг, от 60 нг до 700 нг, от 70 нг до 800 нг, от 80 нг до 900 нг, от 90 нг до 1 мкг, от 100 нг до 2 мкг, от 200 нг до 3 мкг, от 300 нг до 4 мкг, от 400 нг до 5 мкг, от 500 нг до 6 мкг, от 600 нг до 7 мкг, от 700 нг до 8 мкг, от 800 нг до 9 мкг, от 900 нг до 10 мкг, от 1 мкг до 100 мкг, от 20 мкг до 200 мкг, от 30 мкг до 300 мкг, от 40 мкг до 400 мкг, от 50 мкг до 500 мкг, от 60 мкг до 600 мкг, от 70 мкг до 700 мкг, от 80 мкг до 800 мкг, от 90 мкг до 900 мкг, от 100 мкг до 1 мг, от 200 мкг до 1,1 мг, от 300 мкг до 1,2 мг, от 400 мкг до 1,3 мг, от 500 мкг до 1,4 мг, от 600 мкг до 1,5 мг, от 700 мкг до 2 мг, от 800 мкг до 3 мг, от 900 мкг до 4 мг, от 1 мг до 5 мг, от 1,3 мг до 6 мг, от 1,5 мг до 7 мг, от 2 мг до 8 мг, от 3 мг до 9 мг или от 4 мг до 10 мг. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп присутствует в количестве приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 или 950 нг. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп присутствует в количестве приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 мкг. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп присутствует в количестве приблизительно 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг.

Существует множество способов получения иммуногенных неоантигенов. Белки или пептиды могут быть получены любым способом, известным специалистам в данной области техники, включая экспрессию белков, полипептидов или пептидов с помощью стандартных молекулярно-биологических методов, выделение белков или пептидов из природных источников, трансляцию in vitro или химический синтез белков или пептидов. В общем, такие болезнь-специфические неоантигены могут быть получены либо in vitro, либо in vivo. Иммуногенные неоантигены могут быть получены in vitro в виде пептидов или полипептидов, которые затем могут быть включены в персонализированную вакцину или иммуногенную композицию и введены субъекту. Получение иммуногенных неоантигенов in vitro может включать синтез пептидов или экспрессию пептида/полипептида из молекулы ДНК или РНК в любой из множества бактериальных, эукариотических или вирусных рекомбинантных систем экспрессии с последующей очисткой экспрессированного пептида/полипептида. Альтернативно, иммуногенные неоантигены могут быть получены in vivo путем введения субъекту молекул (например, ДНК, РНК и вирусных систем экспрессии), которые кодируют иммуногенный неоантиген, после чего кодированные иммуногенные неоантигены экспрессируются. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий иммуногенный неоантигенный пептид, можно использовать для получения неоантигенного пептида in vitro.

В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности к полинуклеотиду, кодирующему иммуногенный неоантиген. Полинуклеотидом может быть, например, ДНК, кДНК, одно- и/или двухцепочечные, нативные или стабилизированные формы полинуклеотидов или их комбинации. Нуклеиновая кислота, кодирующая иммуногенный неоантигенный пептид, может содержать или не содержать интроны, пока она кодирует пептид. В некоторых вариантах осуществления, для получения пептида используется трансляция in vitro.

Также рассматриваются векторы экспрессии, содержащие последовательности, кодирующие неоантиген, а также клетки-хозяева, содержащие векторы экспрессии. Векторы экспрессии, подходящие для использования в настоящем описании, могут содержать, по меньшей мере один элемент контроля экспрессии, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты. Элементы контроля экспрессии встраиваются в вектор для контроля и регулирования экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты. Примеры элементов контроля экспрессии хорошо известны в данной области техники и включают, например, lac систему, операторные и промоторные области фага лямбда, дрожжевые промоторы и промоторы, полученные из полиомы, аденовируса, ретровируса или SV40. Дополнительные функциональные элементы включают, но не ограничены ими, лидерные последовательности, кодоны терминации, сигналы полиаденилирования и любые другие последовательности, необходимые или предпочтительные для соответствующей транскрипции и последующей трансляции последовательности нуклеиновой кислоты в системе-хозяине. Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что правильная комбинация элементов контроля экспрессии будет зависеть от выбранной системы-хозяина. Кроме того, будет понятно, что вектор экспрессии должен содержать дополнительные элементы, необходимые для переноса и последующей репликации вектора экспрессии, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, в системе-хозяине. Примеры таких элементов включают, но не ограничены ими, точки начала репликации и селектируемые маркеры.

Неоантигенные пептиды могут быть представлены в виде молекул РНК или кДНК, кодирующих желаемые неоантигенные пептиды. Один или более неоантигенных пептидов по настоящему описанию могут кодироваться одним вектором экспрессии. Как правило, ДНК встраивают в вектор экспрессии, такой как плазмида, с правильной ориентацией и правильной рамкой считывания для экспрессии, при необходимости ДНК можно связать с соответствующими последовательностями нуклеотидов, регулирующими транскрипцию и трансляцию, распознаваемыми желаемым хозяином (например, бактерией), хотя такие контроли обычно доступны в векторе экспрессии. Затем вектор вводят в бактерию-хозяина для клонирования с использованием стандартных методик. Полезные векторы экспрессии для эукариотических хозяев, особенно млекопитающих или человека, включают, например, векторы, содержащие последовательности контроля экспрессии из SV40, вируса папилломы крупного рогатого скота, аденовируса и цитомегаловируса. Полезные векторы экспрессии для бактериальных хозяев включают известные бактериальные плазмиды, такие как плазмиды из E. coli, включая pCR 1, pBR322, pMB9 и их производные, плазмиды с более широким диапазоном хозяев, такие как M13 и фаги с нитчатой одноцепочечной ДНК. Подходящие клетки-хозяева для экспрессии полипептида обсуждаются в разделе «Полинуклеотиды» [0250]. Подходящие векторы клонирования и экспрессии для использования с бактериальными, грибковыми, дрожжевыми клетками-хозяевами и клетками-хозяевами млекопитающих хорошо известны в данной области техники.

Белки, продуцируемые трансформированным хозяином, могут быть очищены любым подходящим способом. Такие стандартные способы включают хроматографию (например, ионнообменную, аффинную и калибровочную колоночную хроматографию и подобные), центрифугирование, дифференциальную растворимость или любую другую стандартную методику очистки белка. Аффинные метки, такие как гексагистидин (SEQ ID NO: 376), мальтоза-связывающий домен, последовательность оболочки вируса гриппа, глутатион-S-трансфераза и подобные, могут быть присоединены к белку, чтобы обеспечить легкую очистку путем пропускания через колонку с подходящей аффинностью. Выделенные белки также можно физически охарактеризовать с помощью таких методов, как протеолиз, ядерный магнитный резонанс и рентгеновская кристаллография.

Вакцина может содержать вещество, которое связывает полипептидную последовательность, описанную в настоящем изобретении. Веществом может быть антитело. Вакцина на основе антитела может быть составлена с использованием любых хорошо известных методик, носителей и эксципиентов, если они подходят и как известно в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления, пептиды, описанные в настоящем изобретении, можно использовать для создания неоантиген-специфических терапевтических агентов, таких как терапевтические агенты на основе антитела. Например, неоантигены можно использовать для выработки и/или идентификации антител, специфически распознающих неоантигены. Эти антитела можно использовать в качестве терапевтических агентов. Антитело может быть природным антителом, химерным антителом, гуманизированным антителом или может быть фрагментом антитела. Антитело может распознавать один или более полипептидов, описанных в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, антитело может распознавать полипептид, который имеет последовательность с не более 40%, 50%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с полипептидом, описанным в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, антитело может распознавать полипептид, который имеет последовательность с по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с полипептидом, описанным в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, антитело может распознавать полипептидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 30%, 40%, 50%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% длины полипептида, описанного в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, антитело может распознавать полипептидную последовательность, которая имеет не более 30%, 40%, 50%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% длины полипептида, описанного в настоящем изобретении.

Настоящее раскрытие также относится к применению молекул нуклеиновых кислот в качестве носителей для доставки неоантигенных пептидов/полипептидов субъекту, нуждающемуся в этом, in vivo, например, в форме ДНК вакцин.

В некоторых вариантах осуществления, вакциной является вакцина на основе нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота кодирует иммуногенный пептид или предшественник пептида. В некоторых вариантах осуществления, вакцина на основе нуклеиновой кислоты содержит последовательности, фланкирующие последовательность, кодирующую иммуногенный пептид или предшественник пептида. В некоторых вариантах осуществления, вакцина на основе нуклеиновой кислоты содержит более одного иммуногенного эпитопа. В некоторых вариантах осуществления, вакциной на основе нуклеиновой кислоты является вакцина на основе ДНК. Способы доставки обсуждаются в разделе «Полинуклеотиды» [0250].

Полинуклеотид может быть по существу чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки. Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные, такие как системы на основе аденовируса, вируса осповакцины, ретровирусов, вируса герпеса, аденоассоциированного вируса или гибридов, содержащих элементы более чем одного вируса. Не вирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры (например, катионные липосомы).

Один или более неоантигенных пептидов можно кодировать и экспрессировать in vivo с использованием вирусной системы. Вирусные векторы могут быть использованы в качестве рекомбинантных векторов в настоящем описании, где часть вирусного генома удалена для введения новых генов без разрушения инфекционности вируса. Вирусным вектором по настоящему описанию является не патогенный вирус. В некоторых вариантах осуществления, вирусный вектор обладает тропизмом к конкретному типу клеток млекопитающего. В другом варианте осуществления, вирусный вектор по настоящему описанию способен инфицировать профессиональные антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки и макрофаги. В еще одном варианте настоящего описания, вирусный вектор способен инфицировать любую клетку млекопитающего. Вирусный вектор может также инфицировать опухолевые клетки. Вирусные векторы, используемые в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, поксвирус, такой как вирус осповакцины, вирус avipox, вирус оспы домашней птицы и сильно ослабленный вирус осповакцины (Ankara или MVA), ретровирус, аденовирус, бакуловирус и подобные.

Вакцина может быть доставлена разными путями. Пути доставки могут включать пероральное (включая буккальное и сублингвальное), ректальное, назальное, местное, трансдермальный пластырь, легочное, вагинальное, суппозиторий или парентеральное (включая внутримышечное, внутриартериальное, интратекальное, внутрикожное, внутрибрюшинное, подкожное и внутривенное) введение, или в форме, подходящей для введения путем аэрозолизации, ингаляции или инсуффляции. Общую информацию о системах доставки лекарственных средств можно найти в Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore Md. (1999). Описанная в настоящем изобретении вакцина может вводиться в мышцы или может вводиться через внутрикожные или подкожные инъекции, или трансдермально, например, с помощью ионтофореза. Может использоваться эпидермальное введение вакцины. Вакцина, описанная в настоящем изобретении, может вводиться путем внутрикожной инъекции, интраназального спрея, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, внутривенной инъекции, перорального введения, или подкожной инъекции.

В некоторых случаях, вакцина также может быть составлена для введения через носовые ходы. Составы, пригодные для назального введения, где носитель является твердым, может включать в себя грубый порошок, имеющий размер частиц, например, в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 500 микрон, который вводят в порядке, в котором принимается табак, т.е., путем быстрого вдыхания через носовой проход из контейнера с порошком, поднесенного близко к носу. Состав может быть спреем для носа, каплями для носа или для введением аэрозоля с помощью небулайзера. Состав может включать водные или масляные растворы вакцины.

Вакциной может быть жидкий препарат, такой как суспензия, сироп или эликсир. Вакциной также может быть препарат для парентерального, подкожного, внутрикожного, внутримышечного или внутривенного введения (например, инъекционного введения), например, стерильной суспензии или эмульсии.

Вакцина может включать материал для однократной иммунизации, или может включать материал для множественной иммунизации (т.е. «многодозовый» набор). В многодозовых вариантах предпочтительно включение консерванта. Альтернативно (или в дополнение) к включению консерванта в многодозовые композиции, композиции могут содержаться в контейнере, имеющем асептический адаптер для выделения продукта.

Вакцину можно вводить в дозированном объеме приблизительно 0,5 мл, хотя детям можно вводить половинную дозу (т.е. приблизительно 0,25 мл). Иногда вакцину можно вводить в более высокой дозе, например, приблизительно 1 мл.

Вакцину можно вводить в виде курсовой схемы из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более доз. Иногда вакцину вводят в виде курсовой схемы из 1, 2, 3 или 4 доз. Иногда вакцину вводят в виде курса из 1 дозы. Иногда вакцину вводят в виде курса из 2 доз.

Введение первой дозы и второй дозы можно разделить приблизительно 0 дней, 1 днем, 2 днями, 5 днями, 7 днями, 14 днями, 21 днем, 30 днями, 2 месяцами, 4 месяцами, 6 месяцами, 9 месяцами, 1 годом, 1,5 годами, 2 годами, 3 годами, 4 годами и более.

Описанная в настоящем изобретении вакцина может вводиться каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более лет. Иногда, описанную в настоящем изобретении вакцину вводят каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7 или более лет. Иногда, описанную в настоящем изобретении вакцину вводят каждые 4, 5, 6, 7 или более лет. Иногда, описанную в настоящем изобретении вакцину вводят однократно.

Примеры дозировки не являются ограничивающими и используются только для иллюстрации конкретных схем дозирования для введения описанной в настоящем изобретении вакцины. Эффективное количество для использования у людей можно определить на животных моделях. Например, доза для людей может быть составлена для достижения концентраций в крови, печени, месте и/или желудочно-кишечном тракте, которые оказались эффективными для животных. На основании данных о животных и других типов подобных данных, специалисты в данной области техники могут определить эффективные количества вакцинной композиции, подходящей для людей.

Эффективное количество, если речь идет о агенте или комбинации агентов, обычно означает диапазоны доз, способы введения, составы и т.д., которые были рекомендованы или одобрены любой из различных регулирующих или консультативных организаций в области медицины или фармацевтики (например, FDA, AMA) или производителем или поставщиком.

В некоторых аспектах, описанные в настоящем изобретении вакцина и набор могут храниться при температуре от 2°C до 8°C. В некоторых случаях, вакцину не хранят в замороженном виде. В некоторых случаях, вакцину хранят при температуре от -20°C до -80°C. В некоторых случаях вакцину хранят вдали от солнечного света.

7. Наборы

Описанный в настоящем изобретении терапевтический неоантиген может быть представлен в форме набора вместе с инструкциями по введению. Обычно набор содержит желаемый терапевтический неоантиген в контейнере, в стандартной дозированной форме и инструкции по введению. В набор также могут быть включены дополнительные терапевтические средства, например цитокины, лимфокины, ингибиторы контрольных точек, антитела. Другие компоненты набора, которые также могут быть желательными, включают, например, стерильный шприц, бустерные дозировки и другие желательные эксципиенты.

Изобретение также относится к наборам и промышленным изделиям для использования с одним или несколькими описанными в настоящем изобретении способами. Наборы могут содержать один или более неоантигенных полипептидов, содержащих один или более неоэпитопов. Наборы также могут содержать нуклеиновые кислоты, которые кодируют один или более пептидов или белков, описанных в настоящем изобретении, антитела, которые распознают один или более пептидов, описанных в настоящем изобретении, или клетки на основе APC, активированные одним или несколькими пептидами, описанными в настоящем изобретении. Наборы могут дополнительно содержать адъюванты, реагенты и буферы, необходимые для приготовления и доставки вакцин.

Наборы также могут включать носитель, упаковку или контейнер, разделенный на отсеки для размещения одного или нескольких контейнеров, таких как флаконы, пробирки и подобные, каждый из контейнеров содержит один из отдельных элементов, таких как пептиды и адъюванты для использования в способе, описанном в настоящем изобретении. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик.

Представленные в настоящем изобретении готовые изделия содержат упаковочные материалы. Примеры фармацевтических упаковочных материалов включают, но не ограничены ими, блистерные упаковки, флаконы, пробирки, пакеты, контейнеры, бутылки и любой упаковочный материал, подходящий для выбранного состава и предполагаемого способа введения и лечения. Набор обычно включает этикетки с указанием содержимого и/или инструкций по применению, и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению. Также обычно содержится набор инструкций.

Настоящее описание будет описано более подробно посредством конкретных примеров. Следующие примеры предложены в иллюстративных целях и никаким образом не предназначены для ограничения настоящего описания. Специалистам в данной области техники будет легко распознать множество не критических параметров, которые можно изменить или модифицировать для получения альтернативных вариантов осуществления согласно настоящему описанию. Все патенты, патентные заявки и печатные публикации, перечисленные в настоящем изобретении, полностью включены сюда посредством ссылки.

ПРИМЕРЫ

Эти примеры представлены только в иллюстративных целях и не ограничивают объем формулы изобретения, представленной в настоящем изобретении.

Пример 1 - Оценка усиленного расщепления и процессинга полипептидов

Клетки, трансдуцированные Т-клеточным рецептором (TCR), используют для скрининга полипептидов in vitro на процессинг и презентацию эпитопов. В качестве эффекторных клеток получают сконструированные клетки Jurkat, экспрессирующие CD8 вместе с подтвержденными TCR. Для клеток-мишеней, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) со специфическими аллелями HLA стимулируют FLT3-лигандом в течение ночи, нагружают полипептидами, содержащими представляющий интерес эпитоп, в различных контекстах в течение часа и созревают с помощью цитокинов. Сконструированные клетки Jurkat и PBMC совместно культивируют в течение 48 часов и измеряют уровень IL-2, секретируемого сконструированными клетками Jurkat, как показатель распознавания пептидов TCR. Схема эксперимента показана на фиг. 3, и результаты показаны на фиг. 4 и 5.

Пример 2 - Иммуногенность неоантигенного полипептида

Изучают иммуногенность множества полипептидов, сконструированных вокруг определенных эпитопов, а также качество ответов Т-клеток на эти полипептиды. Восемьдесят четыре 8-12-недельных самок мышей C57BL/6 (Taconic Biosciences) произвольно и проспективно распределяют в группы лечения по прибытии. Перед началом исследования животных акклиматизируют в течение трех дней. Животных содержат на стерильном корме для грызунов LabDiet™ 5053 и стерильной воде ad libitum. 12 животных в группе 1 служат не вакцинированным контролем. 12 животных в каждой группе 2-7 получают 50 мкг полиIC:LC и 10 мкг каждого полипептида (определено в таблице 13, выделенная жирным шрифтом последовательность представляет минимальный эпитоп) или молярно соответствующий эквивалент альтернативных пептидных дизайнов (определенных в таблице 14). Kif18b используют в качестве CD4 хелперного пептида и используют в немодифицированном виде у всех мышей в группах 2-7. Кровь собирают с помощью ретро-орбитального кровотечения на 7, 14 и 21 дни. Животных взвешивают и ежедневно контролируют общее состояние здоровья. Животных умерщвляют передозировкой CO₂ на день 21 завершения исследования, если животное потеряло >30% своей массы тела по сравнению с его массой на 0 день; или если животное было признано умирающим.

Таблица 13. Пептиды, использованные в исследовании Антиген Последовательность SEQ ID NO: Ограничение Аллель Модель источника Alg8 AVGITYTWTRLYASVLTGSLVSKTKK 377 MHCI H-2Kb T3 Lama4 IQKISFFDGFEVGFNFRTLQPNGLLFYYT 378 MHCI H-2Kb T3 Adpgk GIPVHLELASMTNMELMSSIVHQQVFPT 379 MHCI H-2Db MC38 Reps1 GRVLELFRAAQLANDVVLQIMELCGATR 380 MHCI H-2Db MC38 Irgq KARDETAALLNSAVLGAAPLFVPPAD 381 MHCI H-2Db MC38 Obsl1 REGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD 382 MHCI H-2Db B16F10 Kif18b PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL 383 MHCII I-Ab B16F10

Таблица 14. Схема эксперимента (см. также фиг. 6) (в таблице описаны «К4» как SEQ ID NO: 1 и «K4-Val-Cit» как SEQ ID NO: 384) Группа Кол-во мышей Уход Антигены (основание хвоста слева) Антигены (загривок) Доза вакцины Лечение вакцинами Сбор тканей 1 12 не леченные Н/Д Н/Д Н/Д Н/Д Н/Д 2 12 Сильные SLP+CD4+хилтонол Kif18b* Alg8, Lama4, Obsl1 10 мкг каждого SLP или эквимолярный SSP
50 мкг хилтонола Путь:
п.к. основание хвоста слева в 100 мкл/ инъекция
Схема:
Дни -21,
-14, -7 ОО кровоток:
Дни -14,
-7, 0 3 12 SLP+CD4+хилтонол Reps1, Adpgk, Irgq, Kif18b* Alg8, Lama4, Obsl1 4 12 SSP+CD4+хилтонол 5 12 K4-SSP+CD4+хилтонол 6 12 K4-Val-Cit-PABC-SSPs+CD4+хилтонол 7 12 K4-дисульфид-SSP+CD4+хилтонол

Тетрамеры MHC производят на месте и используют для измерения размножения пептид-специфических Т-клеток в анализах иммуногенности. Для оценки, тетрамер добавляют к 1×10⁵ клеток в PBS, содержащем 1% FCS и 0,1% азида натрия (буфер FACS). Клетки инкубируют в темноте в течение 15 минут при 37°С. Затем добавляют антитела, специфичные к Т-клеточным маркерам, таким как CD8, и к нерелевантным типам клеток, таким как CD4/CD11b/CD11c/CD19, до конечной концентрации, рекомендованной производителем, и клетки инкубируют в темноте при 4°С в течение 20 минут. Клетки промывают холодным буфером FACS, немедленно анализируют на приборе LSR2 (Becton Dickinson) и анализируют с использованием программного обеспечения FacsDiva (Becton Dickinson). Для анализа тетрамер-положительных клеток, лимфоцитарные ворота берут из графиков прямого и бокового рассеяния. Данные представлены как доля клеток, которые были CD4^- CD11b^- CD11c^- CD19^-CD8⁺/тетрамер⁺.

Иммунизация К4-эпитопом («K4» описан как SEQ ID NO: 1) значительно повышает иммунный ответ на 5 из 6 оцененных эпитопов. Иммунные ответы на Alg8, Lama4, Reps1, Adpgk и Obsl1 значительно усиливаются. Иммунизация К4-эпитопом («K4» описан как SEQ ID NO: 1) повышает иммуногенность слабо иммуногенных эпитопов (например, Obsl1). Иммунизация K4-Val-Cit-PABC-эпитопом («K4-Val-Cit» описан как SEQ ID NO: 384) усиливает Alg8-специфические иммунные ответы. Результаты показаны на фиг. 7-9.

Пример 3 - Синтез дисульфидного линкера (соединение 5)

Стадия 1

2,2'-бис(5-нитропиридил)дисульфид 2 (2 ммоль) суспендируют в 10 мл дихлорметана и соответствующем меркапто спирте 1 (1 ммоль, где R¹ и R² имеют значения, указанные в настоящем изобретении) в дихлорметане (4 мл) добавляют к суспензии. Полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов. Растворитель удаляют при пониженном давлении. Полученный остаток повторно растворяют в 5 мл диметилформамида и очищают с использованием колонки с обращенной фазой C18 с градиентом ацетонитрила и воды, содержащей 0,05% ТФК. Желаемые фракции объединяют и лиофилизируют с получением (5-нитропиридин-2-ил)дисульфанилалкилового спирта 3 (выход ~65-82%, чистота >90%, анализ УЭЖХ-МС/УФ при 220 нм).

Стадия 2

К раствору (5-нитропиридин-2-ил)дисульфанилалкилового спирта 3 (0,5 ммоль, где R¹ и R² имеют значения, указанные в настоящем изобретении) в диметилформамиде (2 мл) добавляют N, N'-диизопропилэтиламин (1,5 ммоль), и затем добавляют 4-нитрофенилхлорформиат 4 (0,55 ммоль). Этот раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов, затем очищают с использованием колонки с обращенной фазой C18 с градиентом ацетонитрила и воды, содержащей 0,05% ТФК. Желаемые фракции объединяют и лиофилизируют с получением 4-нитрофенил-(5-нитропиридин-2-ил)дисульфанилалкилкарбоната 5 (выход ~90-98%, чистота >90%, анализ УЭЖХ-МС/УФ при 220 нм).

Пример 4 - Синтез пептидов, содержащих дисульфид

Стадия 1: получение 4-нитро-2-пиридилтиоактивированного дисульфидного пептида 8.

В соответствии с приведенной выше схемой N-конец пептидной смолы 6 (можно использовать любую смолу, изготовленную для твердофазного пептидного синтеза) ацилируют с использованием линкера 5 (где R¹ и R² имеют значения, указанные в настоящем изобретении) вручную, или программируют соответствующим образом на автоматическом синтезаторе пептидов. Более конкретно, смолу 6 (0,05 ммоль) оставляют набухать в диметилформамиде в течение 5 минут и осушают. Соответствующий 4-нитрофенил-(5-нитропиридин-2-ил)дисульфанилалкилкарбонат 5 (0,2 ммоль) и Oxyma Pure Novabiochem® (также известный как Oxyma Pure, 0,3 ммоль) растворяют в 1 мл диметилформамида, добавленного к набухшей смоле 6, и затем добавляют N, N'-диизопропилэтиламин (0,3 ммоль). Полученную суспензию смолы перемешивают в течение 3 часов, осушают и затем полученную пептид-связанную смолу 7 промывают диметилформамидом (5x, 5 мл), дихлорметаном (5x, 5 мл) и метанолом (2x, 5 мл). Связанную с пептидом смолу 7 сушат при пониженном давлении в течение 1 часа и расщепляют с использованием 3 мл 95% трифторуксусной кислоты (ТФК), 2,5% воды, 2,5% триизопропилсилана (TIPS) при комнатной температуре в течение 3 часов с образованием раствора для расщепления («A»), содержащего и несвязанный пептид 8, и отщепленную смолу из 7. Этот раствор для расщепления A затем фильтруют и осушают в 50 мл коническую пробирку, отщепленную смолу из 7 промывают раствором 95:5 ТФК:вода (1 мл), фильтруют, осушают и объединяют с получением раствора отфильтрованного пептида («В»). Несвязанный пептид 8 выделяют из отфильтрованного раствора пептида B осаждением ледяным диэтиловым эфиром, центрифугируют при 3600 об/мин в течение 5 минут и диэтиловый эфир отгоняют. Полученный пептидный пеллет затем промывают 20 мл ледяного диэтилового эфира, чтобы получить суспензию, которую затем встряхивают и снова центрифугируют при 3600 об/мин в течение 3 минут. Это повторяют всего 3 промывками, чтобы тщательно промыть пеллет с получением 4-нитрофенил-(5-нитропиридин-2-ил)дисульфанилалкилкарбаматного пептида 8, который используют на следующей стадии синтеза без дополнительной очистки.

Стадия 2: Реакция дисульфидного обмена с образованием дисульфидсодержащего пептида 10.

Как описано на схеме выше, неочищенный 4-нитрофенил-(5-нитропиридин-2-ил)дисульфанилалкилкарбаматный пептид 8 (где R¹ и R² имеют значения, указанные в настоящем изобретении) подвергают дисульфидному обмену с желаемой тиолсодержащей молекулой 9 (где G¹ и j имеют значения, указанные в настоящем изобретении). Более конкретно, 4-нитрофенил-(5-нитропиридин-2-ил)дисульфанилалкилкарбаматный пептид 8 (0,05 ммоль) растворяют в диметилформамиде (1 мл), затем добавляют раствор желаемого тиолсодержащего соединения 9 (0,05 ммоль) в 1:1 диметилформамиде-1М Tris буфере. Полученный желтый раствор перемешивают в течение 2 часов, очищают на колонке с обращенной фазой С18 с градиентом ацетонитрила и воды, содержащей 0,05% ТФК. Желаемые фракции объединяют и лиофилизируют с получением дисульфидсодержащего пептида 10 (выход ~10-30%, чистота >95%, анализ УЭЖХ-МС/УФ при 220 нм, начиная с твердофазного синтеза пептида).

Пример 5 - Синтез пептида, содержащего PABC (13)

Как описано на схеме выше, N-конец пептидной смолы 6 ацилируют с использованием Fmoc-AA-AA-PAB-PNP 11 вручную, или соответствующим образом программируют на автоматическом синтезаторе пептидов. Более конкретно, смолу 6 (0,05 ммоль) оставляют набухать в диметилформамиде в течение 5 минут и осушают. Соответствующий Fmoc-AA-AA-PAB-PNP 11 (0,2 ммоль) и Oxyma Pure Novabiochem® (также известный как Oxyma Pure, 0,3 ммоль) растворяют в 1 мл диметилформамида, добавляют к смоле 6, и затем добавляют N, N'-диизопропилэтиламин (0,3 ммоль). Полученную суспензию смолы перемешивают в течение 3 часов, осушают и полученную защищенную Fmoc смолу 12 затем промывают диметилформамидом (5x, 5 мл). Конечный N-концевой α-Fmoc удаляют с помощью 20% пиперидина в диметилформамиде (2x, 5 минут). На этом этапе промежуточное соединение 12 со снятой защитой необязательно подвергают взаимодействию с дополнительными аминокислотными остатками на N-конце 12 с использованием стандартных твердофазных пептидных синтезов Fmoc с последующим снятием защиты с N-концевого α-Fmoc с использованием аналогичной процедуры, как обсуждалось сразу выше. После завершения желаемого снятия защиты Fmoc, смолу 12 (или аналоги с удлиненными аминокислотами) промывают диметилформамидом (5x, 5 мл), дихлорметаном (5x, 5 мл) и затем метанолом (2x, 5 мл). Связанную с пептидом смолу 12 сушат при пониженном давлении в течение 1 часа и расщепляют с использованием 3 мл 70% трифторуксусной кислоты (ТФК), 10% фенола, 10% триизопропилсилана (TIPS) и 10% тиоанизола при комнатной температуре в течение 30 минут с образованием раствора для расщепления («А»), содержащего и несвязанный пептид 13, и отщепленную смолу из 12. Этот раствор для расщепления A затем фильтруют и осушают с получением отфильтрованного раствора пептида («B») в 50 мл конической пробирке. Отщепленную смолу из 12 промывают 95:5 ТФК:водным раствором (1 мл), фильтруют, осушают и объединяют с фильтрованным раствором пептида B. Несвязанный пептид 13 выделяют из отфильтрованного раствора пептида В осаждением ледяным диэтиловым эфиром, центрифугируют при 3600 об/мин в течение 5 минут и диэтиловый эфир отгоняют. Полученный пептидный пеллет затем промывают 20 мл ледяного диэтилового эфира с получением суспензии, которую затем встряхивают и снова центрифугируют при 3600 об/мин в течение 3 минут. Это повторяют всего 3 промывками для тщательной промывки пеллета с получением соединения 13 (выход ~10-30%, чистота >95%, УЭЖХ-МС/УФ анализ при 220 нм, начиная с твердофазного пептидного синтеза).

Пример 6 - Оценка процессинга эпитопа TMPRSS2::ERG

Клетки, трансдуцированные Т-клеточным рецептором (TCR), используют для оценки процессинга и презентации эпитопа TMPRSS2::ERG на HLA-A02:01 in vitro. Сконструированные клетки Jurkat, экспрессирующие CD8 вместе с проверенными TCR, получают в качестве эффекторных клеток. Для клеток-мишеней, клетки 293T, которые в природе экспрессируют HLA-A02:01, i) нагружают пептидами, содержащими эпитоп TMPRSS2::ERG, только в течение 24 часов или ii) стабильно трансдуцируют плазмидой, которая кодирует пептид, содержащий эпитоп TMPRSS2::ERG в различных контекстах (эпитоп в природном контексте т.е. пептид дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая в природе фланкируют последовательность эпитопа на N- и/или С-конце эпитопа, в не природном контексте т.е. пептид дополнительно содержит аминокислоту или аминокислотную последовательность, которая в природе не фланкирует последовательность эпитопа (например, последовательность CMVpp65), или плазмидой, кодирующей пептид, содержащий нерелевантный эпитоп в не природном контексте (в качестве контроля). Сконструированные клетки Jurkat и клетки 293T совместно культивируют в течение 24 часа, и уровень IL-2, секретируемый сконструированными клетками Jurkat, измеряют как показатель распознавания пептидов TCR. Результаты показаны на фиг. 10.

Пример 7 - Сравнение усиленного расщепления и процессинга и иммуногенности полипептидов

Клетки, трансдуцированные Т-клеточным рецептором (TCR), используют для сравнения in vitro процессинга эпитопа RAS-G12V-HLA-A11:01 из пептидов, содержащих только эпитоп RAS-G12V, эпитоп RAS-G12V и дополнительную фланкирующую аминокислотную последовательность эпитопа только на N-конце, или эпитоп RAS-G12V и дополнительные аминокислотные последовательности, фланкирующие эпитоп как на N-, так и на C-конце, для процессинга и презентации эпитопа. Сконструированные клетки Jurkat, экспрессирующие CD8 вместе с проверенными TCR, получают в качестве эффекторных клеток. Для клеток-мишеней, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) со специфическими аллелями HLA стимулируют FLT3-лигандом в течение ночи, нагружают полипептидами, содержащими эпитоп RAS-G12V в различных контекстах в течение часа и позволяют созревать с цитокинами. Сконструированные клетки Jurkat и РВМС совместно культивируют в течение 48 часов, и уровень IL-2, секретируемый сконструированными клетками Jurkat, измеряют как показатель распознавания пептидов TCR. Результаты показаны на фиг. 11.

Пример 8 - Оценка иммуногенности мутантных пептидов RAS с различными контекстами вокруг эпитопов

Материалы:

Среда AIM V (Invitrogen)

FLT3L человека, доклинический CellGenix #1415-050 Stock 50 нг/мкл

TNF-α, доклинический CellGenix # 1406-050 Stock 10 нг/мкл

IL-1β , доклинический CellGenix #1411-050 Stock 10 нг/мкл

PGE1 или Алпростадил - Cayman из Czech republic Stock 0,5 мкг/мкл

Среда R10 - RPMI 1640 глутамакс+10% сыворотка человека+1% PenStrep

20/80 Среда - 18% AIM V+72% RPMI 1640 глутамакс+10% сыворотка человека+1% PenStrep

IL7 Stock 5 нг/мкл

IL15 Stock 5 нг/мкл

Процедура:

Стадия 1. Высевают по 5 миллионов PBMC (или представляющих интерес клеток) в каждую лунку 24-луночного планшета с FLT3L в 2 мл среды AIMV.

Стадия 2: Загрузка пептидов и созревание - в AIMV

1. Смешивают представляющий интерес пул пептидов (за исключением условий отсутствия пептидов) с РВМС (или представляющими интерес клетками) в соответствующих лунках.

2. Инкубируют в течение 1 часа.

3. Смешивают коктейль для созревания (включая TNF-α, IL-1β , PGE1 и IL-7) в каждую лунку после инкубации.

Стадия 3: Добавляют сыворотку человека в каждую лунку до конечной концентрации 10% по объему и перемешивают.

Стадия 4. Заменяют среду свежей средой RPMI+10% HS с добавлением IL7+IL15.

Стадия 5: Заменяют среду свежей средой 20/80 с добавлением IL7+IL15 в течение периода инкубации каждые 1-6 дней.

Стадия 6. Высевают по 5 миллионов PBMC (или представляющих интерес клеток) в каждую лунку нового 6-луночного планшета с FLT3L в 2 мл среды AIM V.

Стадия 7: Загружают и оставляют созревать пептиды для повторной стимуляции (новые чашки)

1. Смешивают пул представляющих интерес пептидов (за исключением отсутствия пептидов) с PBMC (или представляющими интерес клетками) в соответствующих лунках.

2. Инкубируют в течение 1 часа.

3. Добавляют коктейль для созревания в каждую лунку после инкубации.

Стадия 8: Повторная стимуляция:

1. Считают культуры FLT3L после первой стимуляции и добавляют 5 миллионов культивированных клеток в новые планшеты для повторной стимуляции.

2. Доводят объем культуры до 5 мл (AIM V) и добавляют 500 мкл сыворотки человека (10% по объему).

Стадия 9: Удаляют 3 мл среды и добавляют 6 мл среды RPMI+10% HS с добавлением IL7+IL15.

Стадия 10: Меняют 75% среды на свежую среду 20/80 с добавлением IL7+IL15.

Стадия 11: При необходимости повторяют повторную стимуляцию.

Анализ антиген-специфической индукции

Тетрамеры MHC покупают или производят на месте и используют для измерения размножения пептид-специфичных Т-клеток в анализах иммуногенности. Для оценки, тетрамер добавляют к 1 х 10⁵ клеткам в PBS, содержащем 1% FCS и 0,1% азида натрия (буфер FACS) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки инкубируют в темноте в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем добавляют антитела, специфичные для маркеров Т-клеток, таких как CD8, до конечной концентрации, рекомендованной производителем, и клетки инкубируют в темноте при 4°C в течение 20 минут. Клетки промывают холодным буфером FACS и ресуспендируют в буфере, содержащем 1% формальдегида. Данные клеток собирают на приборе LSR Fortessa (Becton Dickinson) и анализируют с использованием программного обеспечения FlowJo (Becton Dickinson). Для анализа тетрамер-положительных клеток, ворота лимфоцитов берут из графиков прямого и бокового рассеяния. Данные представлены как доля клеток, которые CD8 +/Ттерамер+.

Технологический процесс иммуногенности пептидов (т.е. индукции Т-клеток и анализа тетрамеров) используют для оценки относительной иммуногенности трех конструкций пептидов, описанных на фиг. 11. Типовые данные, показывающие повышенную иммуногенность пептида с эпитопом на С-конце по сравнению с пептидом с эпитопом в середине, основанные на коэффициенте попаданий у 3 доноров, показаны на фиг. 12, верх. Те же три конструкции пептидов также оценивают с использованием стратегии вакцинации мышей in vivo, как описано в примере 2. Типовые данные, показывающие повышенную иммуногенность пептида с эпитопом на С-конце по сравнению с пептидом с эпитопом в середине, показаны на фиг. 12, низ.

Пример 9 - Высокий коэффициент попаданий CD8 при стимулировании APC пептидами, кодирующими иРНК

Шортмеры (9-10 аминокислот) или лонгмеры (25 аминокислот) конструируют в форме срединенной неоантигенной нити, как показано графически на фиг. 13А. Последовательности антигенов представлены цветными прямоугольниками. Последовательности линкера (K, QLGL (SEQ ID NO: 385) или GVGT(SEQ ID NO: 386) - представленные в виде синих кругов) добавляют между последовательностями антигенов, как спрогнозировано NetChop (алгоритм для прогнозирования расщепления протеома человека). Если спрогнозировано, что последовательность будет расщепляться внутри последовательности антигена, добавляют сайты расщепления, чтобы способствовать расщеплению между последовательностями антигена. Затем PBMC подвергают нуклеофекции вышеупомянутыми мульти-антигенами, кодирующими иРНК конструкции, и используют их для стимуляции Т-клеток. Параллельное сравнение проводят с пулами конгруэнтных пептидов, и их длина и последовательность оказываются такими же, как и те, которые кодированы в цепочках РНК. Короткие и длинные последовательности РНК повышают аналогичные CD8+ Т-клетки, отвечающие на мультимеры (Таблица 15). Примечательно, что устойчивые ответы CD8 наблюдают при использовании иРНК, кодирующей лонгмеры и шормеры.

Таблица 15. Сравнение активации опосредованной лонгмером и шортмером пептида и РНК Коэффициент попаданий CD8 (%) Средняя частота неоантигена+ (% CD8 клеток) Разнообразие ответов (из 6) CD4 ответы Донор 1 Пептид короткий 7 0,03% 1 н.д. Пептид длинный 19 0,09% 2 0 РНК короткая 11 1,50% 2 н.д. РНК длинная 8 0,36% 2 0 Донор 2 Пептид короткий 11 0,03% 2 н.д. Пептид длинный 17 0,21% 3 1 РНК короткая 19 0,39% 2 н.д. РНК длинная 20 0,05% 2 0

Как показано на фиг. 13B, эпитоп Gli3 хорошо представлен и презентируется пептидами, а также иРНК, однако РВМС, кодируемые иРНК, нагруженные более коротким эпитопом Gli3, дают более высокие Gli3-специфические CD8+ Т-клетки (по данным мультимерного анализа). Типовые результаты проточной цитометрии для мультимерного анализа показаны на фиг. 13C. В этой нити, последовательность, предшествующая последовательности Gli3, взята из не природного контекста. Она может иметь улучшенный процессинг и презентацию Gli3 из полипептидной нити и увеличенный ответ по сравнению с пептидом. Кроме того, более короткая нить иРНК вызывает Т-клеточный ответ ME-1, который не присутствует в пуле конгруэнтных коротких пептидов. В наших нитях, ME-1 имеет сайты расщепления до и после последовательности эпитопа, и такой усиленный процессинг и презентация на эпитопе может привести к превосходным Т-клеточным ответам.

Параграфы вариантов осуществления

[0492] Полипептид, содержащий эпитоп, презентируемый MHC класса I или MHC класса II антигенпрезентирующей клетки (APC), полипептид имеет структуру формулы (I):

Y_n-B_t-A_r-Х_m-A_s-C_u-Z_p

Формула (I),

или его фармацевтически приемлемая соль,

(i) где Х_mявляется эпитопом, где каждый Х независимо является аминокислотой непрерывной аминокислотной последовательности, кодированной последовательностью нуклеиновой кислоты в геноме субъекта,

и где (а) MHC является MHC класса I и m является целым числом от 8 до 12, или

(b) MHC является MHC класса II и m является целым числом от 9 до 25;

(ii) где каждый Y независимо является аминокислотой, ее аналогом или производным, и где:

(А) если переменная r из A_r в Формуле (I) равна 0, Y_nне кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует B_t-A_r-Х_m,

(В) если переменная r из A_r в Формуле (I) равна 1, и переменная t из B_t в Формуле (I) равна 0, Y_nне кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m, или

(С) если переменная r из A_r в Формуле (I) равна 1 и переменная t из B_t в Формуле (I) равна 1 или более, Y_nне кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует B_t; и

дополнительно, где n является целым числом от 0 до 1000;

(iii) где каждый Z независимо является аминокислотой, ее аналогом или производным, и где:

(А) если переменная s из A_s в Формуле (I) равна 0, Z_pне кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m-A_s-C_u,

(В) если переменная s из A_s в формуле (I) равна 1, и переменная u из C_u в формуле (I) равна 0, Z_pне кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m, или

(С) если переменная s из A_s в формуле (I) равна 1, и переменная u из C_u в формуле (I) равна 1 или более, Z_pне кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует C_u; и

дополнительно, где p является целым числом от 0 до 1000;

и также где

если n равно 0, p является целым числом от 1 до 1000; и

если p равно 0, n является целым числом от 1 до 1000;

(iv) где A_r является линкером, и r равно 0 или 1;

(v) где A_s является линкером, и s равно 0 или 1;

и где t является целым числом от 0 до 1000; и

и где u является целым числом от 0 до 1000;

и также где

(а) полипептид не состоит из четырех разных эпитопов, презентированных MHC класса I;

(b) полипептид содержит по меньшей мере две различные полипептидные молекулы;

(d) Y_nи/или Z_pотщепляются от эпитопа, если полипептид процессируется APC.

[0493] Полипептид по параграфу [0487], где эпитоп презентируется МНС класса II.

[0494] Полипептид по параграфу [0487] или [0488], где m является целым числом от 9 до 25.

[0495] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0489], где t равно 1, 2, 3, 4 или 5 или более, и r равно 0.

[0496] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0490], где u равно 1, 2, 3, 4 или 5 или более, и s равно 0.

[0497] Полипептид по любому из параграфов [0487] -[0491], где t равно 1 или более, r равно 0 и n равно от 1 до 1000.

[0498] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0492], где u равно 1 или больше, s равно 0, и p равно 1-1000.

[0499] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0493], где t равно 0.

[0500] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0494], где u равно 0.

[0501] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0495], где t равно по меньшей мере 1, и B_t содержит лизин.

[0502] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0496], где u равно по меньшей мере 1, и C_u содержит лизин.

[0503] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0497], где B_t отщепляется от эпитопа, если полипептид процессируется APC.

[0504] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0498], где C_u отщепляется от эпитопа, если полипептид процессируется APC.

[0505] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0499], где n является целым числом от 1 до 5 или от 7 до 1000.

[0506] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0500], где p является целым числом от 1 до 4 или от 6 до 1000.

[0507] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0501], где полипептид не состоит из четырех разных эпитопов, презентированных MHC класса I.

[0508] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0502], где полипептид не содержит четыре разных эпитопа, презентированных MHC класса I.

[0509] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0503], где полипептид содержит по меньшей мере две разные полипептидные молекулы.

[0510] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0504], где эпитоп содержит по меньшей мере одну мутантную аминокислоту.

[0511] Полипептид по параграфу [0505], где по меньшей мере одна мутантная аминокислота кодируется вставкой, делецией, сдвигом рамки считывания, неоORF или точечной мутацией в последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта.

[0512] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0506], где Y_nи/или Z_pотщепляются от эпитопа, если полипептид процессируется APC.

[0513] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0507], где m из Х_m равно не менее 8 и где Х_m является AA₁AA₂AA₃AA₄AA₅AA₆AA₇AA₈AA₉AA₁₀AA₁₁AA₁₂AA₁₃AA₁₄AA₁₅AA₁₆AA₁₇AA₁₈AA₁₉AA₂₀AA₂₁AA₂₂AA₂₃AA₂₄AA₂₅, где каждая AA является аминокислотой, и где одна или несколько из AA₉, AA₁₀, AA₁₁, AA₁₂, AA₁₃, AA₁₄,AA₁₅, AA₁₆, AA₁₇, AA₁₈, AA₁₉, AA₂₀, AA₂₁, AA₂₂, AA₂₃, AA₂₄ и AA₂₅ необязательно присутствуют, и, кроме того, по меньшей мере одна AA является мутантной аминокислотой.

[0514] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0508], где r равно 1.

[0515] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0509], где s равно 1.

[0516] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0510], где r равно 1, и s равно 1.

[0517] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0511], где r равно 0.

[0518] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0512], где s равно 0.

[0519] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0513], где r равно 0 и s равно 0.

[0520] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0514], где A_r и/или A_s является не полипептидным линкером.

[0521] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0515], где A_r и/или A_s являются химическим линкером.

[0522] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0516], где A_r и/или A_s содержат не природную аминокислоту.

[0523] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0517], где A_r и/или A_s не содержат аминокислоту.

[0524] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0518], где A_r и/или A_s не содержат природную аминокислоту.

[0525] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0519], где A_r и/или A_s содержат связь, отличную от пептидной связи.

[0526] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0520], где A_r и/или A_s содержат дисульфидную связь.

[0527] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0521], где A_r и/или A_s разные.

[0528] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0522], где A_r и/или A_s одинаковые.

[0529] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0523], где полипептид содержит гидрофильный хвост.

[0530] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0524], где Y_n-B_t-A_rи/или A_s-C_u-Z_p увеличивает растворимость полипептида по сравнению с соответствующим пептидом, который не содержит Y_n-B_t-A_rи/или A_s-C_u-Z_p.

[0531] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0525], где каждый Х из Х_m является природной аминокислотой.

[0532] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0526], где эпитоп высвобождается из Y_n-B_t-A_r и/или A_s-C_u-Z_p, если полипептид процессируется APC.

[0533] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0527], где полипептид расщепляется на A_r и/или A_s.

[0534] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0528], где полипептид расщепляется с более высокой скоростью, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида такой же длины, который содержит Х_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m; и/или

где полипептид расщепляется с более высокой скоростью, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида такой же длины, который содержит Х_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m.

[0535] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0528], где полипептид расщепляется с более высокой скоростью, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида такой же длины, который содержит B_t-Х_m, где t равно по меньшей мере единице, и r из переменной A_r в Формуле (I) равна 0; и/или

[0536] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0530], где полипептид расщепляется на A_r с более высокой скоростью, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида такой же длины, который содержит Х_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m; и/или

где полипептид расщепляется на A_s с более высокой скоростью, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида такой же длины, который содержит Х_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую непосредственно последовательностью нуклеиновой кислоты ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m.

[0537] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0531], где презентация эпитопа с помощью APC усиливается, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с презентацией эпитопа соответствующего полипептида той же длины, который содержит Х_mи по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше транскрипцией последовательность нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m; и/или

где презентация эпитопа APC усиливается, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с презентацией эпитопа соответствующего полипептида той же длины, который содержит Х_mи по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m.

[0538] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0531], где презентация эпитопа APC усиливается, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с презентацией эпитопа соответствующего полипептида той же длины, который содержит B_t-Х_m, где t равно по меньшей мере единице, и r из переменной A_r в Формуле (I) равно 0; и/или

где презентация эпитопа с помощью APC усиливается, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с презентацией эпитопа соответствующего полипептида той же длины, который содержит Х_m-C_u, где u равно по меньшей мере единице, и s из переменной A_s в формуле (I) равно 0.

[0539] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0533], где APC презентирует эпитоп к иммунной клетке.

[0540] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0534], где APC презентирует эпитоп к фагоцитарной клетке.

[0541] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0535], где APC презентирует эпитоп к дендритной клетке, макрофагу, тучной клетке, нейтрофилу или моноциту.

[0542] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0536], где APC презентирует эпитоп преимущественно или специфически к иммунной клетке, фагоцитарной клетке, дендритной клетке, макрофагу, тучной клетке, нейтрофилу или моноциту.

[0543] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0537], где иммуногенность увеличивается, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с иммуногенностью соответствующего полипептида такой же длины, который содержит Х_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m; и/или

где иммуногенность повышается, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с иммуногенностью соответствующего полипептида той же длины, который содержит Х_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геном субъекта, которая кодирует Х_m.

[0544] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0537], где иммуногенность повышается, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с иммуногенностью соответствующего полипептида той же длины, который содержит B_t-Х_m, где t равно по меньшей мере единице, и r из переменной A_r в формуле (I) равно 0; и/или

где иммуногенность повышается, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с иммуногенностью соответствующего полипептида той же длины, который содержит Х_m-C_u, где u равно по меньшей мере единице, и s из переменной A_s в формуле (I) равно 0.

[0545] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0539], где противоопухолевая активность усиливается, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с противоопухолевой активностью соответствующего полипептида той же длины, который содержит Х_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m; и/или

где противоопухолевая активность усиливается, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с противоопухолевой активностью соответствующего полипептида той же длины, который содержит Х_m и по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m.

[0546] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0539], где противоопухолевая активность увеличивается, если n является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с противоопухолевой активностью соответствующего полипептида той же длины, который содержит B_t-Х_m, где t равно по меньшей мере единице, и r из переменной A_r в Формуле (I) равно 0; и/или

где противоопухолевая активность увеличивается, если p является целым числом от 1 до 1000, по сравнению с противоопухолевой активностью соответствующего полипептида такой же длины, который содержит Х_m-C_u, где u равно по меньшей мере единице, и s из переменной A_s в Формуле (I) равно 0.

[0547] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0541], где Y_nи/или Z_pсодержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из поли-Lys (полиK) и поли-Arg (полиR).

[0548] Полипептид по параграфу [0542], где Y_nи/или Z_pсодержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из полиK-AA-AA и полиR-AA-AA, где каждая AA является аминокислотой, ее аналогом или производным.

[0549] Полипептид по параграфу [0542] или [0543], где полиК содержит поли-L-Lys.

[0550] Полипептид по параграфу [0542] или [0543], где полиR содержит поли-L-Arg.

[0551] Полипептид по любому из параграфов [0542]-[0545], где полиК или полиR содержат по меньшей мере три или четыре последовательных лизиновых (SEQ ID NO: 1) или аргининовых (SEQ ID NO: 2) остатка, соответственно.

[0552] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0546]где A_r и/или A_s выбран из группы, состоящей из дисульфида; п-аминобензилоксикарбонила (РАВС); и AA-AA-PABC, где каждая AA является аминокислотой, ее аналогом или производным.

[0553] Полипептид по параграфу [0547], где AA-AA-PABC выбран из группы, состоящей из Ala-Lys-PABC, Val-Cit-PABC и Phe-Lys-PABC.

[0554] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0546], где A_r и/или A_s является

Формула (II).

[0555] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0546], где A_r и/или A_s является

Формула (III) или

Формула (IV),

где,

R₁ и R₂ независимо являются H или (C₁-C₆) алкилом;

j равно 1 или 2;

G₁ является H или COOH; и

i равно 1, 2, 3, 4 или 5.

[0556] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0550], где полипептид убиквитинирован.

[0557] Полипептид по параграфу [0551], где полипептид убиквитинирован перед расщеплением.

[0558] Полипептид по параграфу [0551] или [0552], где полипептид убиквитинирован на лизиновом остатке.

[0559] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0553], где полипептид не расщепляется перед процессингом APC или перед интернализацией APC у субъекта.

[0560] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0554], где полипептид не расщепляется в крови у субъекта перед процессингом APC или перед интернализацией APC.

[0561] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0555], где полипептид не расщепляется протеазой крови.

[0562] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0556], где полипептид не расщепляется плазмином, калликреином плазмы, калликреином ткани, тромбином или фактором свертывания крови.

[0563] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0557], где полипептид стабилен в плазме человека.

[0564] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0558], где период полужизни полипептида в плазме человека составляет от 1 часа до 5 дней.

[0565] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0559], где полипептид расщепляется в лизосоме, эндолизосоме, эндосоме или эндоплазматическом ретикулуме (ER).

[0566] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0560], где полипептид расщепляется аминопептидазой.

[0567] Полипептид по параграфу [0561], где аминопептидазой является регулируемая инсулином аминопептидаза (IRAP) или аминопептидаза эндоплазматического ретикулума (ERAP).

[0568] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0560], где полипептид процессируется трипсиноподобным доменом протеасомы и/или иммунопротеасомы.

[0569] Полипептид по параграфу [0563], где трипсиноподобный домен обладает трипсиноподобной активностью, химотрипсиноподобной активностью или активностью пептидилглутамилпептидгидролазы (PGPH).

[0570] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0560], где полипептид расщепляется протеазой.

[0571] Полипептид по параграфу [0565], где протеазой является трипсиноподобная протеаза, химотрипсиноподобная протеаза или пептидилглутамилпептидгидролаза (PGPH).

[0572] Полипептид по параграфу [0565], где протеаза выбрана из группы, состоящей из аспарагинпептидлиазы, аспарагиновой протеазы, цистеиновой протеазы, глутаминовой протеазы, металлопротеазы, сериновой протеазы и треониновой протеазы.

[0573] Полипептид по параграфу [0567], где протеазой является цистеиновая протеаза, выбранная из группы, состоящей из кальпаина, каспазы, катепсина B, катепсина C, катепсина F, катепсина H, катепсина K, катепсина L1, катепсина L2, катепсина O, катепсина S, катепсина W и катепсинп Z.

[0574] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0568], где субъектом является млекопитающее.

[0575] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0569], где субъектом является человек.

[0576] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0570], где эпитоп связывается с HLA MHC класса I.

[0577] Полипептид по параграфу [0571], где эпитоп связывается с HLA MHC I класса со стабильностью от 10 минут до 24 часа.

[0578] Полипептид по параграфу [0571], где эпитоп связывается с HLA MHC I класса с аффинностью от 0,1 нМ до 2000 нМ.

[0579] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0570], где эпитоп связывается с HLA MHC класса II.

[0580] Полипептид по параграфу [0574], где эпитоп связывается с HLA MHC класса II со стабильностью от 10 минут до 24 часа.

[0581] Полипептид по параграфу [0574], где эпитоп связывается с HLA MHC класса II с аффинностью от 0,1 нМ до 2000 нМ, от 1 нМ до 1000 нМ, от 10 нМ до 500 нМ или менее 1000 нМ.

[0582] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0576], где n является целым числом от 1 до 20 или от 5 до 12.

[0583] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0577], где p является целым числом от 1 до 20 или от 5 до 12.

[0584] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0578], где эпитоп содержит опухолеспецифический эпитоп.

[0585] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0579], где полипептид содержит по меньшей мере два полипептида, где два или более из по меньшей мере двух полипептидов имеют одинаковую формулу Y_n-B_t-A_r-Х_m-A_s-C_u-Z_p.

[0586] Полипептид по параграфу [0580], где полипептид содержит по меньшей мере две полипептидных молекулы.

[0587] Полипептид по параграфу [0580] или [0581], где Х_m двух или нескольких из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул одинаковые.

[0588] Полипептид по любому из параграфов [0580]-[0582], где Y_n двух или нескольких из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул одинаковые.

[0589] Полипептид по любому из параграфов [0580]-[0583], где Z_p двух или нескольких из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул одинаковые.

[0590] Полипептид по любому из параграфов [0580]-[0584], где A_r и/или A_s двух или нескольких из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул разные.

[0591] Полипептид по любому из параграфов [0580]-[0585], где r=0 для первого из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул, и r=1 для второго из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул.

[0592] Полипептид по любому из параграфов [0580]-[0586], где s=0 для первого из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул и s=1 для второго из по меньшей мере двух полипептидов или полипептидных молекул.

[0593] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0587], где полипептид содержит по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более полипептидов или полипептидных молекул.

[0594] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0588], где эпитопом является RAS эпитоп.

[0595] Полипептид по параграфу [0589], где эпитоп содержит последовательность мутантного RAS пептида, которая содержит по меньшей мере 8 непрерывных аминокислот мутантного RAS белка, содержащего мутацию в G12, G13 или Q61 и мутацию в G12, G13 или Q61.

[0596] Полипептид по параграфу [0590], где по меньшей мере 8 непрерывных аминокислот мутантного RAS белка, содержащего мутацию в G12, G13 или Q61, включают G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K или Q61R мутацию.

[0597] Полипептид по параграфу [0590] или [0591], где мутация G12, G13 или Q61 содержит G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K или Q61R мутацию.

[0598] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0592], где Y_n и/или Z_p содержат аминокислотную последовательность белка CMV, такого как pp65, HIV или MART-1.

[0599] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0593], где n и/или p равно 1, 2, 3 или целому числу больше 3.

[0600] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0594], где эпитоп связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, с аффинностью менее 10 мкМ, менее 1 мкМ, менее 500 нМ, менее 400 нМ, менее 300 нМ, менее 250 нМ, менее 200 нМ, менее 150 нМ, менее 100 нМ или менее 50 нМ.

[0601] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0595], где эпитоп связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, со стабильностью более 24 часа, более 12 часов, более 9 часов, более 6 часов, более 5 часов, более 4 часов, более 3 часов, более 2 часов, более 1 часа, более 45 минут, более 30 минут, более 15 минут или более 10 минут.

[0602] Полипептид по параграфу [0595] или [0596], где аллель HLA выбран из группы, состоящей из аллеля HLA-A02:01, аллеля HLA-A03:01, аллеля HLA-A11:01, аллеля HLA-A03:02, аллеля HLA-A30:01, аллеля HLA-A31:01, аллеля HLA-A33:01, аллеля HLA-A33:03, аллеля HLA-A68:01, аллеля HLA-A74:01 и/или аллеля HLA-C08:02 и любых их комбинаций.

[0603] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0597], где эпитоп содержит аминокислотную последовательность GADGVGKSAL (SEQ ID NO: 4), GACGVGKSAL (SEQ ID NO: 5), GAVGVGKSAL (SEQ ID NO: 6), GADGVGKSA (SEQ ID NO: 7), GACGVGKSA (SEQ ID NO: 8), GAVGVGKSA (SEQ ID NO: 9), KLVVVGACGV (SEQ ID NO: 10), FLVVVGACGL (SEQ ID NO: 11), FMVVVGACGI (SEQ ID NO: 12), FLVVVGACGI (SEQ ID NO: 13), FMVVVGACGV (SEQ ID NO: 14), FLVVVGACGV (SEQ ID NO: 15), MLVVVGACGV (SEQ ID NO: 16), FMVVVGACGL (SEQ ID NO: 17), YLVVVGACGV (SEQ ID NO: 18), KMVVVGACGV (SEQ ID NO: 19), YMVVVGACGV (SEQ ID NO: 20), MMVVVGACGV (SEQ ID NO: 21), DTAGHEEY (SEQ ID NO: 22), TAGHEEYSAM (SEQ ID NO: 23), DILDTAGHE (SEQ ID NO: 24), DILDTAGH (SEQ ID NO: 25), ILDTAGHEE (SEQ ID NO: 26), ILDTAGHE (SEQ ID NO: 27), DILDTAGHEEY (SEQ ID NO: 28), DTAGHEEYS (SEQ ID NO: 29), LLDILDTAGH (SEQ ID NO: 30), DILDTAGRE (SEQ ID NO: 31), DILDTAGR (SEQ ID NO: 32), ILDTAGREE (SEQ ID NO: 33), ILDTAGRE (SEQ ID NO: 34), CLLDILDTAGR (SEQ ID NO: 35), TAGREEYSAM (SEQ ID NO: 36), REEYSAMRD (SEQ ID NO: 37), DTAGKEEYSAM (SEQ ID NO: 38), CLLDILDTAGK (SEQ ID NO: 39), DTAGKEEY (SEQ ID NO: 40), LLDILDTAGK (SEQ ID NO: 41), ILDTAGKE (SEQ ID NO: 42), ILDTAGKEE (SEQ ID NO: 43), DTAGLEEY (SEQ ID NO: 44), ILDTAGLE (SEQ ID NO: 45), DILDTAGL (SEQ ID NO: 46), ILDTAGLEE (SEQ ID NO: 47), GLEEYSAMRDQY (SEQ ID NO: 48), LLDILDTAGLE (SEQ ID NO: 49), LDILDTAGL (SEQ ID NO: 50), DILDTAGLE (SEQ ID NO: 51), DILDTAGLEEY (SEQ ID NO: 52), AGVGKSAL (SEQ ID NO: 53), GAAGVGKSAL (SEQ ID NO: 54), AAGVGKSAL (SEQ ID NO: 55), CGVGKSAL (SEQ ID NO: 56), ACGVGKSAL (SEQ ID NO: 57), DGVGKSAL (SEQ ID NO: 58), ADGVGKSAL (SEQ ID NO: 59), DGVGKSALTI (SEQ ID NO: 60), GARGVGKSA (SEQ ID NO: 61), KLVVVGARGV (SEQ ID NO: 62), VVVGARGV (SEQ ID NO: 63), SGVGKSAL (SEQ ID NO: 64), VVVGASGVGK (SEQ ID NO: 65), GASGVGKSAL (SEQ ID NO: 66), VGVGKSAL (SEQ ID NO: 67), VVVGAGCVGK (SEQ ID NO: 68), KLVVVGAGC (SEQ ID NO: 69), GDVGKSAL (SEQ ID NO: 70), DVGKSALTI (SEQ ID NO: 71), VVVGAGDVGK (SEQ ID NO: 72), TAGKEEYSAM (SEQ ID NO: 73), DTAGHEEYSAM (SEQ ID NO: 74), TAGHEEYSA (SEQ ID NO: 75), DTAGREEYSAM (SEQ ID NO: 76), TAGKEEYSA (SEQ ID NO: 77), AAGVGKSA (SEQ ID NO: 78), AGCVGKSAL (SEQ ID NO: 79), AGDVGKSAL (SEQ ID NO: 80), AGKEEYSAMR (SEQ ID NO: 81), AGVGKSALTI (SEQ ID NO: 82), ARGVGKSAL (SEQ ID NO: 83), ASGVGKSA (SEQ ID NO: 84), ASGVGKSAL (SEQ ID NO: 85), AVGVGKSA (SEQ ID NO: 86), CVGKSALTI (SEQ ID NO: 87), DILDTAGK (SEQ ID NO: 88), DILDTAGREEY (SEQ ID NO: 89), DTAGHEEYSAMR (SEQ ID NO: 90), DTAGKEEYS (SEQ ID NO: 91), DTAGKEEYSAMR (SEQ ID NO: 92), DTAGLEEYS (SEQ ID NO: 93), DTAGLEEYSA (SEQ ID NO: 94), DTAGLEEYSAMR (SEQ ID NO: 95), DTAGREEYS (SEQ ID NO: 96), DTAGREEYSAMR (SEQ ID NO: 97), GAAGVGKSA (SEQ ID NO: 98), GACGVGKSA (SEQ ID NO: 8), GACGVGKSAL (SEQ ID NO: 5), GADGVGKS (SEQ ID NO: 99), GAGDVGKSA (SEQ ID NO: 100), GAGDVGKSAL (SEQ ID NO: 101), GASGVGKSA (SEQ ID NO: 102), GCVGKSAL (SEQ ID NO: 103), GCVGKSALTI (SEQ ID NO: 104), GHEEYSAM (SEQ ID NO: 105), GKEEYSAM (SEQ ID NO: 106), GLEEYSAMR (SEQ ID NO: 107), GREEYSAM (SEQ ID NO: 108), GREEYSAMR (SEQ ID NO: 109), HEEYSAMRD (SEQ ID NO: 110), KEEYSAMRD (SEQ ID NO: 111), KLVVVGASG (SEQ ID NO: 112), LDILDTAGR (SEQ ID NO: 113), LEEYSAMRD (SEQ ID NO: 114), LVVVGARGV (SEQ ID NO: 115), LVVVGASGV (SEQ ID NO: 116), REEYSAMRDQY (SEQ ID NO: 117), RGVGKSAL (SEQ ID NO: 118), TAGLEEYSA (SEQ ID NO: 119), TEYKLVVVGAA (SEQ ID NO: 120), VGAAGVGKSA (SEQ ID NO: 121), VGADGVGK (SEQ ID NO: 122), VGASGVGKSA (SEQ ID NO: 123), VGVGKSALTI (SEQ ID NO: 124), VVVGAAGV (SEQ ID NO: 125), VVVGAVGV (SEQ ID NO: 126), YKLVVVGAC (SEQ ID NO: 127), YKLVVVGAD (SEQ ID NO: 128), YKLVVVGAR (SEQ ID NO: 129) или DILDTAGKE (SEQ ID NO: 130).

[0604] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0598], где Y_n содержит аминокислотную последовательность IDIIMKIRNA (SEQ ID NO: 131), FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFIIFFIFFWMC (SEQ ID NO: 132), FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFAAFWFW (SEQ ID NO: 133), IFFIFFIIFFFFFFFFFFFFIIIIIIIWEC (SEQ ID NO: 134), FIFFFIIFFFFFIFFFFFIFIIIIIIFWEC (SEQ ID NO: 135), TEY, TEYKLV (SEQ ID NO: 136), WQAGILAR (SEQ ID NO: 137), HSYTTAE (SEQ ID NO: 138), PLTEEKIK (SEQ ID NO: 139), GALHFKPGSR (SEQ ID NO: 140), RRANKDATAE (SEQ ID NO: 141), KAFISHEEKR (SEQ ID NO: 142), TDLSSRFSKS (SEQ ID NO: 143), FDLGGGTFDV (SEQ ID NO: 144), CLLLHYSVSK (SEQ ID NO: 145), KKKKIIMKIRNA (SEQ ID NO: 146) или MTEYKLVVV (SEQ ID NO: 147).

[0605] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0599], где Z_р содержит аминокислотную последовательность KKNKKDDI (SEQ ID NO: 148), KKNKKDDIKD (SEQ ID NO: 149), AGNDDDDDDDDDDDDDDDDDKKDKDDDDDD (SEQ ID NO: 150), AGNKKKKKKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 151), AGRDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD (SEQ ID NO: 152), SALTI (SEQ ID NO: 153), SALTIQL (SEQ ID NO: 154), GKSALTIQL (SEQ ID NO: 155), GKSALTI (SEQ ID NO: 156), QGQNLKYQ (SEQ ID NO: 157), ILGVLLLI (SEQ ID NO: 158), EKEGKISK (SEQ ID NO: 159), AASDFIFLVT (SEQ ID NO: 160), KELKQVASPF (SEQ ID NO: 161), KKKLINEKKE (SEQ ID NO: 162), KKCDISLQFF (SEQ ID NO: 163), KSTAGDTHLG (SEQ ID NO: 164), ATFYVAVTVP (SEQ ID NO: 165), LTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDG (SEQ ID NO: 166) или TIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGE (SEQ ID NO: 167).

[0606] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0588], где эпитоп не является RAS эпитопом.

[0607] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0601], где полипептид не является KKKKKPKRDGYMFLKAESKIMFAT (SEQ ID NO: 168), KKKKYMFLKAESKIMFATLQRSS (SEQ ID NO: 169), KKKKKAESKIMFATLQRSSLWCL (SEQ ID NO: 170), KKKKKIMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 171) или KKKKMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 172).

[0608] Полипептид по любому из параграфов [0487]-[0588], где эпитопом является GATA3 эпитоп.

[0609] Полипептид по параграфу [0603], где GATA3 эпитоп содержит аминокислотную последовательность MLTGPPARV (SEQ ID NO: 173), SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 174), VLPEPHLAL (SEQ ID NO: 175), KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 176), KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 177), ESKIMFATL (SEQ ID NO: 178), KRDGYMFL (SEQ ID NO: 179), PAVPFDLHF (SEQ ID NO: 180), AESKIMFATL (SEQ ID NO: 181), FATLQRSSL (SEQ ID NO: 182), ARVPAVPFD (SEQ ID NO: 183), IMKPKRDGY (SEQ ID NO: 184), DGYMFLKA (SEQ ID NO: 185), MFLKAESKIMF (SEQ ID NO: 186), LTGPPARV (SEQ ID NO: 187), ARVPAVPF (SEQ ID NO: 188), SMLTGPPAR (SEQ ID NO: 189), RVPAVPFDL (SEQ ID NO: 190) или LTGPPARVP (SEQ ID NO: 191).

[0610] Клетка, содержащая полипептид по любому из параграфов [0487]-[0604].

[0611] Клетка по параграфу [0605], где клеткой является антигенпрезентирующая клетка.

[0612] Клетка по параграфу [0606], где клеткой является дендритная клетка.

[0613] Клетка по параграфу [0605], где клеткой является зрелая антигенпрезентирующая клетка.

[0614] Способ расщепления полипептида, включающий контакт полипептида по любому из параграфов [0487]-[0604] с АРС.

[0615] Способ по параграфу [0609], где способ осуществляется in vivo.

[0616] Способ по параграфу [0609], где способ осуществляется ex vivo.

[0617] Способ производства полипептида, включающий связывание Y_n-A_r и/или A_s-Z_p с последовательностью, содержащей последовательность эпитопа, где последовательность эпитопа представлена MHC класса I или MHC класса II антигенпрезентирующей (АРС); и где

(i) каждый Y независимо является аминокислотой, ее аналогом или производным и где Y_n не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп,

и где n является целым числом от 0 до 1000;

(ii) каждый Z независимо является аминокислотой, ее аналогом или производным и где Z_p не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует эпитоп,

и где p является целым числом от 0 до 1000; и

(iii) A_r является линкером, и A_s является линкером, где по меньшей мере один из r и s равен 1;

и дополнительно где

(а) полипептид не состоит из четырех разных эпитопов, презентированных MHC класса I;

(b) полипептид содержит по меньшей мере две разные полипептидные молекулы;

(d) Y_nи/или Z_pотщепляются от эпитопа, если полипептид процессируется APC.

[0618] Способ получения полипептида, включающий связывание Y_nс B_t-Х_mи/или Z_pс Х_m-C_u, где Х_mявляется последовательность эпитопа, представленная МНС класса I или МНС класса II антигенпрезентирующей клетки (APC); и где

(i) каждый B независимо является аминокислотой, кодированной последовательностью нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая находится непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m,

и где t является целым числом от 0 до 1000;

(ii) каждый C независимо является аминокислотой, кодированной последовательностью нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая находится непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m,

и где u является целым числом от 0 до 1000;

(iii) каждый Y независимо является аминокислотой, ее аналогом или производным и где Y_nне кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует B_t-Х_m,

и где n является целым числом от 0 до 1000; и

(4) каждый Z независимо является аминокислотой, ее аналогом или производным и где Z_pне кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m-C_u,

и где p является целым числом от 0 до 1000;

и дополнительно где

(а) полипептид не состоит из четырех разных эпитопов, презентированных MHC класса I;

(b) полипептид содержит по меньшей мере две разные полипептидные молекулы;

(d) Y_n-B_tи/или C_u-Z_pотщепляются от эпитопа, если полипептид процессируется APC.

[0619] Способ по параграфу [0612] или [0613], где, если n равно 0, p является целым числом от 1 до 1000; и если p равно 0, n является целым числом от 1 до 1000.

[0620] Способ по любому из параграфов [0612]-[0614], где каждый Х независимо является аминокислотой пептидной последовательностью, содержащей любую непрерывную аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, и где (a) MHC является MHC класса I, и m является целым числом из от 8 до 12 или (b) MHC является MHC класса II, и m является целым числом от 9 до 25.

[0621] Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по любому из параграфов [0487]-[0604] и фармацевтически приемлемый наполнитель.

[0622] Фармацевтическая композиция по п. [0616], дополнительно содержащая иммуномодулирующее средство или адъювант.

[0623] Фармацевтическая композиция по п. [0617], где иммуномодулирующий агент или адъювант выбран из группы, состоящей из поли-ICLC, 1018 ISS, солей алюминия, ампливакса, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, ARNAX, агонистов STING, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Имиквимода, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, монофосфориллипида A, Монтанида IMS 1312, Монтанида ISA 206, Монтанида ISA 50V, Монтанида ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel®, векторной системы, микрочастиц PLGA, резиквимода, SRL172, виросом и других вирусоподобных частиц, YF-17D, ловушки VEGF, R848, бета-глюкана, Pam2Cys, Pam3Cys, Pam3CSK4 и стимулона Aquila QS21.

[0624] Фармацевтическая композиция по п.[0617] или [0618], где иммуномодулирующее средство или адъювант содержит поли-ICLC.

[0625] Фармацевтическая композиция по любому из параграфов [0616]-[0619], где фармацевтической композицией является вакцинная композиция.

[0626] Фармацевтическая композиция по любому из параграфов [0616]-[0620], где фармацевтическая композиция является водной или жидкой.

[0627] Фармацевтическая композиция по любому из параграфов [0616]-[0621], где эпитоп присутствует в фармацевтической композиции в количестве от 1 нг до 10 мг или от 5 мкг до 1,5 мг.

[0628] Фармацевтическая композиция по любому из параграфов [0616]-[0622], дополнительно содержащая ДМСО.

[0629] Фармацевтическая композиция по любому из параграфов [0616]-[0623], где фармацевтически приемлемый эксципиент содержит воду.

[0630] Фармацевтическая композиция по любому из параграфов [0616]-[0624], где фармацевтическая композиция содержит модификатор pH, присутствующий в концентрации менее 1 мМ или более 1 мМ.

[0631] Фармацевтическая композиция по параграфу [0625], где модификатором рН является дикарбоксилат или трикарбоксилат.

[0632] Фармацевтическая композиция по параграфу [0625], где модификатором pH является дикарбоксилат янтарной кислоты или дисукцинат.

[0633] Фармацевтическая композиция по параграфу [0625], где модификатором pH является трикарбоксилат лимонной кислоты или трицитрат.

[0634] Фармацевтическая композиция по параграфу [0625], где модификатором pH является сукцинат динатрия.

[0635] Фармацевтическая композиция по параграфу [0627], где дикарбоксилат янтарной кислоты или дисукцинат присутствует в фармацевтической композиции в концентрации 0,1 мМ - 1 мМ.

[0636] Фармацевтическая композиция по параграфу [0627], где дикарбоксилат янтарной кислоты или дисукцинат присутствует в фармацевтической композиции в концентрации 1 мМ - 5 мМ.

[0637] Фармацевтическая композиция по любому из параграфов [0616]-[0631], где иммунный ответ на эпитоп усиливается при введении субъекту.

[0638] Способ лечения заболевания или состояния, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по любому из параграфов [0616]-[0632] субъекту, нуждающемуся в этом.

[0639] Способ по параграфу [0633], где заболеванием или состоянием является рак.

[0640] Способ по параграфу [0634], где рак выбран из группы, состоящей из рака легких, немелкоклеточного рака легкого, рака поджелудочной железы, колоректального рака, рака матки и рака печени.

[0641] Способ по любому из параграфов [0633]-[0635], где введение включает внутрикожную инъекцию, интраназальный спрей, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, внутривенную инъекцию, пероральное введение или подкожную инъекцию.

[0642] Способ профилактики субъекта, включающий контакт клетки субъекта с полипептидом, клеткой или фармацевтической композицией по любому из параграфов [0487]-[0608] или [0616]-[0632].

[0643] Способ, включающий идентификацию эпитопа, экспрессируемого опухолевыми клетками субъекта, и получение полипептида, содержащего эпитоп, где полипептид имеет структуру формулы (I):

Y_n-B_t-A_r-Х_m-A_s-C_u-Z_p

Формула (I),

или его фармацевтически приемлемая соль,

(i) где Х_m является эпитопом, где каждый Х независимо является аминокислотой непрерывной аминокислотной последовательности, кодированной последовательностью нуклеиновой кислоты в геноме субъекта,

и где (а) MHC является MHC класса I и m является целым числом от 8 до 12, или

(b) MHC является MHC класса II и m является целым числом от 9 до 25;

(ii) где каждый Y независимо является аминокислотой, ее аналогом или производным, и где:

(В) если переменная r из A_r в Формуле (I) равна 1, и переменная t из B_t в Формуле (I) равна 0, Y_nне кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m, или

(С) если переменная r из A_r в Формуле (I) равна 1 и переменная t из B_t в Формуле (I) равна 1 или более, Y_nне кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует B_t; и

дополнительно, где n является целым числом от 0 до 1000;

(iii) где каждый Z независимо является аминокислотой, ее аналогом или производным, и где:

(А) если переменная s из A_s в Формуле (I) равна 0, Z_pне кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m-A_s-C_u,

(В) если переменная s из A_s в формуле (I) равна 1, и переменная u из C_u в формуле (I) равна 0, Z_pне кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m, или

дополнительно, где p является целым числом от 0 до 1000;

и также где

если n равно 0, p является целым числом от 1 до 1000; и

если p равно 0, n является целым числом от 1 до 1000;

(iv) где A_r является линкером, и r равно 0 или 1;

(v) где A_s является линкером, и s равно 0 или 1;

и где t является целым числом от 0 до 1000; и

и где u является целым числом от 0 до 1000;

и также где

(а) полипептид не состоит из четырех разных эпитопов, презентированных MHC класса I;

(b) полипептид содержит по меньшей мере две различные полипептидные молекулы;

(d) Y_nи/или Z_pотщепляются от эпитопа, если полипептид процессируется APC.

[0644] Способ по параграфу [0638], при этом идентификация включает выбор множества последовательностей нуклеиновых кислот из пула последовательностей нуклеиновых кислот, секвенированных из опухолевых клеток субъекта, которые кодируют множество кандидатных пептидных последовательностей, содержащих одну или несколько различных мутаций, не присутствующих в пуле последовательностей нуклеиновых кислот, секвенированных из не опухолевых клеток субъекта, где пул последовательностей нуклеиновых кислот, секвенированных из опухолевых клеток субъекта, и пул последовательностей нуклеиновых кислот, секвенированных из не опухолевых клеток субъекта, секвенированы путем полногеномного секвенирования или полноэкзомного секвенирования.

[0645] Способ по параграфу [0638] или [0639], где идентификация дополнительно включает прогнозирование или измерение того, какие кандидатные пептидные последовательности из множества кандидатных пептидных последовательностей образуют комплекс с белком, кодируемым аллелем HLA того же субъекта, с помощью анализа связывания HLA пептида.

[0646] Способ по любому из параграфов [0638]-[0640], где идентификация дополнительно включает выбор множества выбранных опухолеспецифических пептидов или одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих множество выбранных опухолеспецифических пептидов, из кандидатных пептидных последовательностей на основе анализа связывания HLA пептидов.

[0647] Способ по любому из параграфов [0638]-[0641], дополнительно включающий введение полипептида субъекту.

[0648] Способ по параграфу [0642], где введение включает внутрикожную инъекцию, интраназальный спрей, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, внутривенную инъекцию, пероральное введение или подкожную инъекцию.

[0649] Способ по любому из параграфов [0638]-[0643], где у субъекта вызывается иммунный ответ.

[0650] Способ по любому из параграфов [0638]-[0644], где эпитопом, экспрессируемым опухолевыми клетками субъекта, является неоантиген, опухолеассоциированный антиген, мутантный опухолеассоциированный антиген, и/или где экспрессия эпитопа выше в опухолевых клетках субъекта по сравнению с экспрессией эпитопа в нормальной клетке субъекта.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> BIONTECH US INC.

<120> НЕОАНТИГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

<130> 50401-737.601

<140> PCT/US2020/037019

<141> 2020-06-10

<150> 62/860,493

<151> 2019-06-12

<160> 395

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 1

Lys Lys Lys Lys

<210> 2

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 2

Arg Arg Arg Arg

<210> 3

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 3

Lys Lys Lys Lys Lys

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 4

Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5 10

<210> 5

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 5

Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5 10

<210> 6

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 6

Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5 10

<210> 7

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 7

Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser Ala

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 8

Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys Ser Ala

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 9

Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser Ala

1 5

<210> 10

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 10

Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val

1 5 10

<210> 11

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 11

Phe Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Leu

1 5 10

<210> 12

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 12

Phe Met Val Val Val Gly Ala Cys Gly Ile

1 5 10

<210> 13

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 13

Phe Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Ile

1 5 10

<210> 14

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 14

Phe Met Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val

1 5 10

<210> 15

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 15

Phe Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val

1 5 10

<210> 16

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 16

Met Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val

1 5 10

<210> 17

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 17

Phe Met Val Val Val Gly Ala Cys Gly Leu

1 5 10

<210> 18

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 18

Tyr Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val

1 5 10

<210> 19

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 19

Lys Met Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val

1 5 10

<210> 20

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 20

Tyr Met Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val

1 5 10

<210> 21

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 21

Met Met Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val

1 5 10

<210> 22

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 22

Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr

1 5

<210> 23

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 23

Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala Met

1 5 10

<210> 24

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 24

Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly His Glu

1 5

<210> 25

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 25

Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly His

1 5

<210> 26

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 26

Ile Leu Asp Thr Ala Gly His Glu Glu

1 5

<210> 27

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 27

Ile Leu Asp Thr Ala Gly His Glu

1 5

<210> 28

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 28

Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr

1 5 10

<210> 29

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 29

Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser

1 5

<210> 30

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 30

Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly His

1 5 10

<210> 31

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 31

Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu

1 5

<210> 32

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 32

Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg

1 5

<210> 33

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 33

Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu

1 5

<210> 34

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 34

Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu

1 5

<210> 35

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 35

Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg

1 5 10

<210> 36

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 36

Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met

1 5 10

<210> 37

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 37

Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp

1 5

<210> 38

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 38

Asp Thr Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ser Ala Met

1 5 10

<210> 39

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 39

Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Lys

1 5 10

<210> 40

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 40

Asp Thr Ala Gly Lys Glu Glu Tyr

1 5

<210> 41

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 41

Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Lys

1 5 10

<210> 42

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 42

Ile Leu Asp Thr Ala Gly Lys Glu

1 5

<210> 43

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 43

Ile Leu Asp Thr Ala Gly Lys Glu Glu

1 5

<210> 44

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 44

Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr

1 5

<210> 45

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 45

Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu

1 5

<210> 46

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 46

Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu

1 5

<210> 47

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 47

Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu

1 5

<210> 48

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 48

Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr

1 5 10

<210> 49

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 49

Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu

1 5 10

<210> 50

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 50

Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu

1 5

<210> 51

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 51

Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu

1 5

<210> 52

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 52

Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr

1 5 10

<210> 53

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 53

Ala Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5

<210> 54

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 54

Gly Ala Ala Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5 10

<210> 55

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 55

Ala Ala Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5

<210> 56

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 56

Cys Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5

<210> 57

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 57

Ala Cys Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5

<210> 58

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 58

Asp Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5

<210> 59

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 59

Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5

<210> 60

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 60

Asp Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile

1 5 10

<210> 61

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 61

Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys Ser Ala

1 5

<210> 62

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 62

Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val

1 5 10

<210> 63

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 63

Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val

1 5

<210> 64

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 64

Ser Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5

<210> 65

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 65

Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val Gly Lys

1 5 10

<210> 66

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 66

Gly Ala Ser Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5 10

<210> 67

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 67

Val Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5

<210> 68

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 68

Val Val Val Gly Ala Gly Cys Val Gly Lys

1 5 10

<210> 69

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 69

Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Cys

1 5

<210> 70

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 70

Gly Asp Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5

<210> 71

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 71

Asp Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile

1 5

<210> 72

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 72

Val Val Val Gly Ala Gly Asp Val Gly Lys

1 5 10

<210> 73

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 73

Thr Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ser Ala Met

1 5 10

<210> 74

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 74

Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala Met

1 5 10

<210> 75

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 75

Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala

1 5

<210> 76

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 76

Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met

1 5 10

<210> 77

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 77

Thr Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ser Ala

1 5

<210> 78

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 78

Ala Ala Gly Val Gly Lys Ser Ala

1 5

<210> 79

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 79

Ala Gly Cys Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5

<210> 80

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 80

Ala Gly Asp Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5

<210> 81

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 81

Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg

1 5 10

<210> 82

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 82

Ala Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile

1 5 10

<210> 83

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 83

Ala Arg Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5

<210> 84

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 84

Ala Ser Gly Val Gly Lys Ser Ala

1 5

<210> 85

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 85

Ala Ser Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5

<210> 86

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 86

Ala Val Gly Val Gly Lys Ser Ala

1 5

<210> 87

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 87

Cys Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile

1 5

<210> 88

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 88

Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Lys

1 5

<210> 89

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 89

Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr

1 5 10

<210> 90

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 90

Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg

1 5 10

<210> 91

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 91

Asp Thr Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ser

1 5

<210> 92

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 92

Asp Thr Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg

1 5 10

<210> 93

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 93

Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser

1 5

<210> 94

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 94

Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala

1 5 10

<210> 95

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 95

Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg

1 5 10

<210> 96

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 96

Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser

1 5

<210> 97

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 97

Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg

1 5 10

<210> 98

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 98

Gly Ala Ala Gly Val Gly Lys Ser Ala

1 5

<210> 99

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 99

Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser

1 5

<210> 100

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 100

Gly Ala Gly Asp Val Gly Lys Ser Ala

1 5

<210> 101

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 101

Gly Ala Gly Asp Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5 10

<210> 102

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 102

Gly Ala Ser Gly Val Gly Lys Ser Ala

1 5

<210> 103

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 103

Gly Cys Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5

<210> 104

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 104

Gly Cys Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile

1 5 10

<210> 105

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 105

Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala Met

1 5

<210> 106

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 106

Gly Lys Glu Glu Tyr Ser Ala Met

1 5

<210> 107

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 107

Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg

1 5

<210> 108

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 108

Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met

1 5

<210> 109

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 109

Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg

1 5

<210> 110

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 110

His Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp

1 5

<210> 111

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 111

Lys Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp

1 5

<210> 112

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 112

Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ser Gly

1 5

<210> 113

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 113

Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg

1 5

<210> 114

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 114

Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp

1 5

<210> 115

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 115

Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val

1 5

<210> 116

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 116

Leu Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val

1 5

<210> 117

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 117

Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr

1 5 10

<210> 118

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 118

Arg Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5

<210> 119

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 119

Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala

1 5

<210> 120

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 120

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ala

1 5 10

<210> 121

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 121

Val Gly Ala Ala Gly Val Gly Lys Ser Ala

1 5 10

<210> 122

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 122

Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys

1 5

<210> 123

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 123

Val Gly Ala Ser Gly Val Gly Lys Ser Ala

1 5 10

<210> 124

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 124

Val Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile

1 5 10

<210> 125

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 125

Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val

1 5

<210> 126

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 126

Val Val Val Gly Ala Val Gly Val

1 5

<210> 127

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 127

Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys

1 5

<210> 128

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 128

Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp

1 5

<210> 129

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 129

Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg

1 5

<210> 130

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 130

Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Lys Glu

1 5

<210> 131

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 131

Ile Asp Ile Ile Met Lys Ile Arg Asn Ala

1 5 10

<210> 132

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 132

Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe

1 5 10 15

Phe Phe Phe Phe Ile Ile Phe Phe Ile Phe Phe Trp Met Cys

20 25 30

<210> 133

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 133

Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe

1 5 10 15

Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Ala Ala Phe Trp Phe Trp

20 25 30

<210> 134

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 134

Ile Phe Phe Ile Phe Phe Ile Ile Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe

1 5 10 15

Phe Phe Phe Phe Ile Ile Ile Ile Ile Ile Ile Trp Glu Cys

20 25 30

<210> 135

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 135

Phe Ile Phe Phe Phe Ile Ile Phe Phe Phe Phe Phe Ile Phe Phe Phe

1 5 10 15

Phe Phe Ile Phe Ile Ile Ile Ile Ile Ile Phe Trp Glu Cys

20 25 30

<210> 136

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 136

Thr Glu Tyr Lys Leu Val

1 5

<210> 137

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 137

Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg

1 5

<210> 138

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 138

His Ser Tyr Thr Thr Ala Glu

1 5

<210> 139

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 139

Pro Leu Thr Glu Glu Lys Ile Lys

1 5

<210> 140

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 140

Gly Ala Leu His Phe Lys Pro Gly Ser Arg

1 5 10

<210> 141

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 141

Arg Arg Ala Asn Lys Asp Ala Thr Ala Glu

1 5 10

<210> 142

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 142

Lys Ala Phe Ile Ser His Glu Glu Lys Arg

1 5 10

<210> 143

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 143

Thr Asp Leu Ser Ser Arg Phe Ser Lys Ser

1 5 10

<210> 144

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 144

Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 145

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 145

Cys Leu Leu Leu His Tyr Ser Val Ser Lys

1 5 10

<210> 146

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 146

Lys Lys Lys Lys Ile Ile Met Lys Ile Arg Asn Ala

1 5 10

<210> 147

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 147

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val

1 5

<210> 148

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 148

Lys Lys Asn Lys Lys Asp Asp Ile

1 5

<210> 149

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 149

Lys Lys Asn Lys Lys Asp Asp Ile Lys Asp

1 5 10

<210> 150

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 150

Ala Gly Asn Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp

1 5 10 15

Asp Asp Asp Asp Lys Lys Asp Lys Asp Asp Asp Asp Asp Asp

20 25 30

<210> 151

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 151

Ala Gly Asn Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Asn Asn Asn Asn Asn Asn

1 5 10 15

Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn

20 25 30

<210> 152

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 152

Ala Gly Arg Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp

1 5 10 15

Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp

20 25 30

<210> 153

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 153

Ser Ala Leu Thr Ile

1 5

<210> 154

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 154

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

1 5

<210> 155

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 155

Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

1 5

<210> 156

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 156

Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile

1 5

<210> 157

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 157

Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln

1 5

<210> 158

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 158

Ile Leu Gly Val Leu Leu Leu Ile

1 5

<210> 159

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 159

Glu Lys Glu Gly Lys Ile Ser Lys

1 5

<210> 160

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 160

Ala Ala Ser Asp Phe Ile Phe Leu Val Thr

1 5 10

<210> 161

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 161

Lys Glu Leu Lys Gln Val Ala Ser Pro Phe

1 5 10

<210> 162

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 162

Lys Lys Lys Leu Ile Asn Glu Lys Lys Glu

1 5 10

<210> 163

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 163

Lys Lys Cys Asp Ile Ser Leu Gln Phe Phe

1 5 10

<210> 164

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 164

Lys Ser Thr Ala Gly Asp Thr His Leu Gly

1 5 10

<210> 165

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 165

Ala Thr Phe Tyr Val Ala Val Thr Val Pro

1 5 10

<210> 166

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 166

Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro

1 5 10 15

Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly

20 25 30

<210> 167

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 167

Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr

1 5 10 15

Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly Glu

20 25 30

<210> 168

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 168

Lys Lys Lys Lys Lys Pro Lys Arg Asp Gly Tyr Met Phe Leu Lys Ala

1 5 10 15

Glu Ser Lys Ile Met Phe Ala Thr

<210> 169

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 169

Lys Lys Lys Lys Tyr Met Phe Leu Lys Ala Glu Ser Lys Ile Met Phe

1 5 10 15

Ala Thr Leu Gln Arg Ser Ser

<210> 170

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 170

Lys Lys Lys Lys Lys Ala Glu Ser Lys Ile Met Phe Ala Thr Leu Gln

1 5 10 15

Arg Ser Ser Leu Trp Cys Leu

<210> 171

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 171

Lys Lys Lys Lys Lys Ile Met Phe Ala Thr Leu Gln Arg Ser Ser Leu

1 5 10 15

Trp Cys Leu Cys Ser Asn His

<210> 172

<211> 21

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 172

Lys Lys Lys Lys Met Phe Ala Thr Leu Gln Arg Ser Ser Leu Trp Cys

1 5 10 15

Leu Cys Ser Asn His

<210> 173

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 173

Met Leu Thr Gly Pro Pro Ala Arg Val

1 5

<210> 174

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 174

Ser Met Leu Thr Gly Pro Pro Ala Arg Val

1 5 10

<210> 175

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 175

Val Leu Pro Glu Pro His Leu Ala Leu

1 5

<210> 176

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 176

Lys Pro Lys Arg Asp Gly Tyr Met Phe

1 5

<210> 177

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 177

Lys Pro Lys Arg Asp Gly Tyr Met Phe Leu

1 5 10

<210> 178

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 178

Glu Ser Lys Ile Met Phe Ala Thr Leu

1 5

<210> 179

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 179

Lys Arg Asp Gly Tyr Met Phe Leu

1 5

<210> 180

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 180

Pro Ala Val Pro Phe Asp Leu His Phe

1 5

<210> 181

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 181

Ala Glu Ser Lys Ile Met Phe Ala Thr Leu

1 5 10

<210> 182

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 182

Phe Ala Thr Leu Gln Arg Ser Ser Leu

1 5

<210> 183

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 183

Ala Arg Val Pro Ala Val Pro Phe Asp

1 5

<210> 184

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 184

Ile Met Lys Pro Lys Arg Asp Gly Tyr

1 5

<210> 185

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 185

Asp Gly Tyr Met Phe Leu Lys Ala

1 5

<210> 186

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 186

Met Phe Leu Lys Ala Glu Ser Lys Ile Met Phe

1 5 10

<210> 187

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 187

Leu Thr Gly Pro Pro Ala Arg Val

1 5

<210> 188

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 188

Ala Arg Val Pro Ala Val Pro Phe

1 5

<210> 189

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 189

Ser Met Leu Thr Gly Pro Pro Ala Arg

1 5

<210> 190

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 190

Arg Val Pro Ala Val Pro Phe Asp Leu

1 5

<210> 191

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 191

Leu Thr Gly Pro Pro Ala Arg Val Pro

1 5

<210> 192

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 192

Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val Gly Lys

1 5 10

<210> 193

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 193

Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val Gly

1 5

<210> 194

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 194

Val Val Gly Ala Ala Gly Val Gly Lys

1 5

<210> 195

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 195

Val Val Gly Ala Ala Gly Val Gly

1 5

<210> 196

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 196

Val Gly Ala Ala Gly Val Gly Lys

1 5

<210> 197

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 197

Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys

1 5 10

<210> 198

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 198

Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly

1 5

<210> 199

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 199

Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val

1 5

<210> 200

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 200

Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys

1 5

<210> 201

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 201

Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly

1 5

<210> 202

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 202

Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys

1 5

<210> 203

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 203

Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys

1 5 10

<210> 204

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 204

Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly

1 5

<210> 205

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 205

Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val

1 5

<210> 206

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 206

Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys

1 5

<210> 207

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 207

Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly

1 5

<210> 208

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 208

Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys

1 5 10

<210> 209

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 209

Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly

1 5

<210> 210

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 210

Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys

1 5

<210> 211

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 211

Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly

1 5

<210> 212

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 212

Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys

1 5

<210> 213

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 213

Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val Gly

1 5

<210> 214

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 214

Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val

1 5

<210> 215

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 215

Val Val Gly Ala Ser Gly Val Gly Lys

1 5

<210> 216

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 216

Val Val Gly Ala Ser Gly Val Gly

1 5

<210> 217

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 217

Val Gly Ala Ser Gly Val Gly Lys

1 5

<210> 218

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 218

Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys

1 5 10

<210> 219

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 219

Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly

1 5

<210> 220

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 220

Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys

1 5

<210> 221

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 221

Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly

1 5

<210> 222

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 222

Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys

1 5

<210> 223

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 223

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys

1 5

<210> 224

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 224

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys

1 5

<210> 225

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 225

Lys Thr Glu Tyr

<210> 226

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 226

Lys Thr Glu Tyr Lys

1 5

<210> 227

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 227

Lys Thr Glu Tyr Lys Leu

1 5

<210> 228

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 228

Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val

1 5

<210> 229

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 229

Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val

1 5

<210> 230

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 230

Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val

1 5

<210> 231

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 231

Lys Lys Thr Glu Tyr

1 5

<210> 232

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 232

Lys Lys Thr Glu Tyr Lys

1 5

<210> 233

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 233

Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu

1 5

<210> 234

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 234

Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val

1 5

<210> 235

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 235

Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val

1 5

<210> 236

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 236

Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val

1 5 10

<210> 237

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 237

Lys Lys Lys Thr Glu Tyr

1 5

<210> 238

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 238

Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys

1 5

<210> 239

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 239

Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu

1 5

<210> 240

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 240

Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val

1 5

<210> 241

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 241

Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val

1 5 10

<210> 242

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 242

Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val

1 5 10

<210> 243

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 243

Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr

1 5

<210> 244

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 244

Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys

1 5

<210> 245

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 245

Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu

1 5

<210> 246

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 246

Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val

1 5 10

<210> 247

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 247

Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val

1 5 10

<210> 248

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 248

Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val

1 5 10

<210> 249

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 249

Thr Glu Tyr Lys

<210> 250

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 250

Thr Glu Tyr Lys Leu

1 5

<210> 251

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 251

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val

1 5

<210> 252

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 252

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val

1 5

<210> 253

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 253

Ser Ala Leu Thr Ile Lys

1 5

<210> 254

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 254

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys

1 5

<210> 255

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 255

Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys

1 5 10

<210> 256

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 256

Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Lys

1 5

<210> 257

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 257

Ser Ala Leu Thr Ile Lys Lys

1 5

<210> 258

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 258

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys

1 5

<210> 259

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 259

Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys

1 5 10

<210> 260

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 260

Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Lys Lys

1 5

<210> 261

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 261

Ser Ala Leu Thr Ile Lys Lys Lys

1 5

<210> 262

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 262

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys

1 5 10

<210> 263

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 263

Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys

1 5 10

<210> 264

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 264

Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Lys Lys Lys

1 5 10

<210> 265

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 265

Ser Ala Leu Thr Ile Lys Lys Lys Lys

1 5

<210> 266

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 266

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys Lys

1 5 10

<210> 267

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 267

Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys Lys

1 5 10

<210> 268

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 268

Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

<210> 269

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 269

Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

<210> 270

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 270

Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

<210> 271

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 271

Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

<210> 272

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 272

Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly

1 5 10 15

Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

<210> 273

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 273

Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly

1 5 10 15

Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

<210> 274

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 274

Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly

1 5 10 15

Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

<210> 275

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 275

Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly

1 5 10 15

Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

<210> 276

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 276

Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val

1 5 10 15

Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

20 25

<210> 277

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 277

Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val

1 5 10 15

Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

20 25

<210> 278

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 278

Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val

1 5 10 15

Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

20 25

<210> 279

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 279

Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val

1 5 10 15

Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

20 25

<210> 280

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 280

Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly

1 5 10 15

Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

20 25

<210> 281

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 281

Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly

1 5 10 15

Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

20 25

<210> 282

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 282

Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly

1 5 10 15

Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

20 25

<210> 283

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 283

Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly

1 5 10 15

Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

20 25

<210> 284

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 284

Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly

1 5 10 15

Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys

20 25

<210> 285

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 285

Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly

1 5 10 15

Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys

20 25

<210> 286

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 286

Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly

1 5 10 15

Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys

20 25

<210> 287

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 287

Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly

1 5 10 15

Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys

20 25

<210> 288

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 288

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys

<210> 289

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 289

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys

<210> 290

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 290

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys

<210> 291

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 291

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys

<210> 292

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 292

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys

<210> 293

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 293

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys

<210> 294

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 294

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys

<210> 295

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 295

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys

<210> 296

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 296

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys

20 25

<210> 297

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 297

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys

20 25

<210> 298

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 298

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys

20 25

<210> 299

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 299

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys

20 25

<210> 300

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 300

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys Lys

20 25

<210> 301

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 301

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys Lys

20 25

<210> 302

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 302

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys Lys

20 25

<210> 303

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 303

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys Lys

20 25

<210> 304

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 304

Ala Leu Asn Ser Glu Ala Leu Ser Val

1 5

<210> 305

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК

<222> (1)..(10)

<223> Эта область может охватывать 5-10 остатков

<220>

<223> См. поданную спецификацию для подробного описания замен и

предпочтительных вариантов осуществления

<400> 305

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys

1 5 10

<210> 306

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК

<222> (1)..(7)

<223> Эта область может охватывать 4-7 остатков

<220>

<223> См. поданную спецификацию для подробного описания замен и

предпочтительных вариантов осуществления

<400> 306

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 307

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 307

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 308

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК

<222> (1)..(7)

<223> Эта область может охватывать 5-10 остатков

<220>

<223> См. поданную спецификацию для подробного описания замен и

предпочтительных вариантов осуществления

<400> 308

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 309

<211> 62

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 309

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr

20 25 30

Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly

35 40 45

Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu

50 55 60

<210> 310

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 310

Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val

1 5

<210> 311

<211> 62

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 311

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr

20 25 30

Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly

35 40 45

Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu

50 55 60

<210> 312

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 312

Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val

1 5 10

<210> 313

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 313

Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val

1 5

<210> 314

<211> 62

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 314

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr

20 25 30

Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly

35 40 45

Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu

50 55 60

<210> 315

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 315

Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val

1 5 10

<210> 316

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 316

Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val

1 5

<210> 317

<211> 101

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 317

Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn

1 5 10 15

His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys

20 25 30

Gln Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr

35 40 45

Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr

50 55 60

Gly Glu Gly Phe Leu Cys Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe

65 70 75 80

Glu Asp Ile His His Tyr Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser

85 90 95

Glu Asp Val Pro Met

100

<210> 318

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 318

Ile Leu Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr

1 5 10

<210> 319

<211> 101

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 319

Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn

1 5 10 15

His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys

20 25 30

Gln Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr

35 40 45

Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr

50 55 60

Gly Glu Gly Phe Leu Cys Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe

65 70 75 80

Glu Asp Ile His His Tyr Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser

85 90 95

Glu Asp Val Pro Met

100

<210> 320

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 320

Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr

1 5 10

<210> 321

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 321

Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu

1 5 10

<210> 322

<211> 101

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 322

Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn

1 5 10 15

His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys

20 25 30

Gln Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr

35 40 45

Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr

50 55 60

Gly Glu Gly Phe Leu Cys Val Phe Ala Ile Asn Asn Ser Lys Ser Phe

65 70 75 80

Ala Asp Ile Asn Leu Tyr Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser

85 90 95

Asp Asp Val Pro Met

100

<210> 323

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 323

Ile Leu Asp Thr Ala Gly Lys Glu Glu Tyr

1 5 10

<210> 324

<211> 101

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 324

Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn

1 5 10 15

His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys

20 25 30

Gln Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr

35 40 45

Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr

50 55 60

Gly Glu Gly Phe Leu Cys Val Phe Ala Ile Asn Asn Ser Lys Ser Phe

65 70 75 80

Ala Asp Ile Asn Leu Tyr Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser

85 90 95

Asp Asp Val Pro Met

100

<210> 325

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 325

Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr

1 5 10

<210> 326

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 326

Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser

1 5 10 15

Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met

<210> 327

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 327

Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala Met

1 5

<210> 328

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 328

Leu Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr

1 5

<210> 329

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 329

Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala

1 5 10

<210> 330

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 330

Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser

1 5 10 15

Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met

<210> 331

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 331

Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr

1 5

<210> 332

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 332

Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met

1 5

<210> 333

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 333

Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala

1 5

<210> 334

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 334

Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg

1 5 10

<210> 335

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 335

Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg

1 5 10

<210> 336

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 336

Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr

1 5

<210> 337

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 337

Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ser

1 5 10 15

Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met

<210> 338

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 338

Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ser Ala Met

1 5

<210> 339

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 339

Leu Asp Thr Ala Gly Lys Glu Glu Tyr

1 5

<210> 340

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 340

Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser

1 5 10 15

Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met

<210> 341

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 341

Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met

1 5 10

<210> 342

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 342

Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu

1 5 10

<210> 343

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 343

Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr

1 5

<210> 344

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 344

Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met

1 5

<210> 345

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 345

Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg

1 5 10

<210> 346

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 346

Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met

1 5

<210> 347

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 347

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

<210> 348

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 348

Leu Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val

1 5

<210> 349

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 349

Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val

1 5 10

<210> 350

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 350

Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ala

1 5

<210> 351

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 351

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

<210> 352

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 352

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

<210> 353

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 353

Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser Ala

1 5 10

<210> 354

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 354

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

<210> 355

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 355

Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5 10

<210> 356

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 356

Arg Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile

1 5 10

<210> 357

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 357

Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg

1 5

<210> 358

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 358

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

<210> 359

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 359

Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val

1 5 10

<210> 360

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 360

Ser Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile

1 5 10

<210> 361

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 361

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

<210> 362

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 362

Ala Val Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu

1 5

<210> 363

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 363

Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val

1 5

<210> 364

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 364

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Cys Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

<210> 365

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 365

Val Val Gly Ala Gly Cys Val Gly Lys

1 5

<210> 366

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 366

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Asp Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

<210> 367

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 367

Val Val Gly Ala Gly Asp Val Gly Lys

1 5

<210> 368

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 368

Ala Leu Asn Ser Glu Ala Leu Ser Val Val

1 5 10

<210> 369

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 369

Met Ala Leu Asn Ser Glu Ala Leu Ser Val

1 5 10

<210> 370

<211> 71

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 370

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr

20 25 30

Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly

35 40 45

Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Val Val

50 55 60

Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys

65 70

<210> 371

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 371

ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc 30

<210> 372

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 372

ggcggcagcc tgggcggcgg cggcagcggc 30

<210> 373

<211> 12

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 373

ggcgtcggca cc 12

<210> 374

<211> 12

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 374

cagctgggcc tg 12

<210> 375

<211> 12

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 375

caactgggat tg 12

<210> 376

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая

6xHis метка

<400> 376

His His His His His His

1 5

<210> 377

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 377

Ala Val Gly Ile Thr Tyr Thr Trp Thr Arg Leu Tyr Ala Ser Val Leu

1 5 10 15

Thr Gly Ser Leu Val Ser Lys Thr Lys Lys

20 25

<210> 378

<211> 29

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 378

Ile Gln Lys Ile Ser Phe Phe Asp Gly Phe Glu Val Gly Phe Asn Phe

1 5 10 15

Arg Thr Leu Gln Pro Asn Gly Leu Leu Phe Tyr Tyr Thr

20 25

<210> 379

<211> 28

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 379

Gly Ile Pro Val His Leu Glu Leu Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu

1 5 10 15

Met Ser Ser Ile Val His Gln Gln Val Phe Pro Thr

20 25

<210> 380

<211> 28

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 380

Gly Arg Val Leu Glu Leu Phe Arg Ala Ala Gln Leu Ala Asn Asp Val

1 5 10 15

Val Leu Gln Ile Met Glu Leu Cys Gly Ala Thr Arg

20 25

<210> 381

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 381

Lys Ala Arg Asp Glu Thr Ala Ala Leu Leu Asn Ser Ala Val Leu Gly

1 5 10 15

Ala Ala Pro Leu Phe Val Pro Pro Ala Asp

20 25

<210> 382

<211> 27

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 382

Arg Glu Gly Val Glu Leu Cys Pro Gly Asn Lys Tyr Glu Met Arg Arg

1 5 10 15

His Gly Thr Thr His Ser Leu Val Ile His Asp

20 25

<210> 383

<211> 27

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 383

Pro Ser Lys Pro Ser Phe Gln Glu Phe Val Asp Trp Glu Asn Val Ser

1 5 10 15

Pro Glu Leu Asn Ser Thr Asp Gln Pro Phe Leu

20 25

<210> 384

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Cit

<400> 384

Lys Lys Lys Lys Val Xaa

1 5

<210> 385

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 385

Gln Leu Gly Leu

<210> 386

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 386

Gly Val Gly Thr

<210> 387

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 387

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile

<210> 388

<211> 29

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 388

Lys Lys Lys Lys Ile Ile Met Lys Ile Arg Asn Ala Val Val Gly Ala

1 5 10 15

Val Gly Val Gly Lys Lys Lys Asn Lys Lys Asp Asp Ile

20 25

<210> 389

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 389

Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu

1 5 10 15

<210> 390

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 390

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

<210> 391

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 391

Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly

1 5 10 15

Lys Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln

20 25

<210> 392

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 392

His Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ile Leu Gly Val Leu Leu Leu Ile

<210> 393

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 393

Pro Leu Thr Glu Glu Lys Ile Lys Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly

1 5 10 15

Lys Glu Lys Glu Gly Lys Ile Ser Lys

20 25

<210> 394

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 394

Gln Leu Gly Leu Lys

1 5

<210> 395

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 395

Lys Gln Leu Gly Leu

1 5

<---

Иллюстрации к изобретению RU 2 832 574 C2

Реферат патента 2024 года НЕОАНТИГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к иммунотерапевтическим полипептидам, содержащим неоэпитопы, кодирующим их полинуклеотидам и способу получения антигенспецифических Т-клеток. Изобретение предлагает дополнительные противораковые терапевтические вакцины для обеспечения эффективного и достаточного процессинга и презентации эпитопов. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 13 ил., 15 табл., 9 пр.

Формула изобретения RU 2 832 574 C2

1. Полипептид для получения антигенспецифических T-клеток, содержащий эпитоп, причем указанный эпитоп презентируется МНС класса I или МНС класса II антигенпрезентирующей клетки (АРС), имеющий структуру Формулы (I):

Y_n-B_t-A_r-Х_m-A_s-C_u-Z_p

Формула (I),

или его фармацевтически приемлемая соль,

где X_mпредставляет собой указанный эпитоп, где каждый X независимо представляет собой аминокислоту непрерывной аминокислотной последовательности, кодируемой последовательностью нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, и где X_m представляет собой мутантный белок RAS, включающий мутацию в G12,

где X_m выбран из группы, состоящей из VVGAVGVGK (SEQ ID NO: 220), VVGADGVGK (SEQ ID NO: 206), VVGARGVGK (SEQ ID NO: 210) и VVGACGVGK (SEQ ID NO: 200), где подчеркнутый аминокислотный остаток представляет собой мутантную аминокислоту в G12;

где каждый Y независимо представляет собой аминокислоту, и где:

Y_nне кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует B_t-A_r-Х_m,

причем дополнительно n равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12;

где каждый Z независимо представляет собой аминокислоту, и где:

Z_p не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует Х_m-A_s-C_u, и

p равно 0;

где A_rпредставляет собой линкер, и r равно 0;

где A_sпредставляет собой линкер, и s равно 0;

где каждый B независимо представляет собой аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая находится непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m,

и где t равно 1, 2, 3, 4 или 5, или более; и

где каждый C независимо представляет собой аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая находится непосредственно ниже последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m,

и где u равно 1, 2, 3, 4 или 5, или более;

и дополнительно причем,

(а) полипептид не состоит из четырех различных эпитопов, презентируемых МНС класса I; и/или

(b) Y_nи/или Z_p отщепляется от указанного эпитопа, когда полипептид процессируется APC;

где субъектом является человек, и где Y_n-B_t-A_rи/или A_s-C_u-Z_pповышает растворимость полипептида по сравнению с соответствующим пептидом, который не содержит Y_n-B_t-A_rи/или A_s-C_u-Z_p.

2. Полипептид по п.1, где (а) полипептид расщепляется с более высокой скоростью, когда n равно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12, по сравнению с расщеплением соответствующего полипептида той же длины, который содержит X_mи по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m;

(b) презентация APC эпитопа усиливается, когда n равно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12, по сравнению с презентацией эпитопа соответствующего полипептида той же длины, который содержит X_mи по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m; и/или

(с) иммуногенность повышается, когда n равно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12, по сравнению с иммуногенностью соответствующего полипептида той же длины, который содержит X_mи по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты непосредственно выше последовательности нуклеиновой кислоты в геноме субъекта, которая кодирует X_m.

3. Полипептид по любому из пп. 1 или 2, где Y_nсодержит поли-Lys (polyK), где полиK содержит по меньшей мере два, три или четыре последовательных остатка лизина соответственно; необязательно где поли-К включает поли-L-Lys.

4. Полипептид по любому из пп. 1-3, где указанный эпитоп связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, причем аллель HLA выбран из группы, состоящей из аллеля HLA-A02:01, аллеля HLA-A03:01, аллеля HLA-A11:01, аллеля HLA-A03:02, аллеля HLA-A30:01, аллеля HLA-A31:01, аллеля HLA-A33:01, аллеля HLA-A33:03, аллеля HLA-A68:01, аллеля HLA-A74:01 и/или аллеля HLA-C08:02 и любой их комбинации.

5. Полипептид по любому из пп. 1-4, где Y_n представляет собой поли-Lys (polyK), который имеет три или четыре последовательных остатка лизина.

6. Полипептид по любому из пп. 1-5, где X_m представляет собой VVGAVGVGK (SEQ ID NO: 220).

7. Полипептид по любому из пп. 1-5, где X_m представляет собой VVGADGVGK (SEQ ID NO: 206).

8. Полипептид по любому из пп. 1-5,где X_m представляет собой VVGARGVGK (SEQ ID NO: 210).

9. Полипептид по любому из пп. 1-5, где X_m представляет собой VVGACGVGK (SEQ ID NO: 200).

10. Полипептид по любому из пп. 1-5, где полипептид содержит аминокислотную последовательность KTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL, KTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL, KTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL, KTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL, KKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL, KKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL, KKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL, KKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL, KKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL, KKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL, KKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL, KKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL, KKKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL, KKKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL, KKKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL или KKKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL.

11. Полипептид по любому из пп. 1-5, где полипептид содержит аминокислотную последовательность KKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL, KKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL, KKKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL или KKKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL.

12. Полинуклеотид для получения антигенспецифических T-клеток, содержащий последовательность, кодирующую полипептид по любому из пп. 1-11; необязательно, где полинуклеотид представляет собой мРНК.

13. Способ получения антигенспецифических Т-клеток, включающий стимуляцию Т-клеток антигенпрезентирующими клетками, содержащими полипептид по любому из пп. 1-11 или полинуклеотид по п. 12, где способ осуществляют ex vivo.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2024 года RU2832574C2

WO 2018208856 A1, 15.11.2018
YARCHOAN M
et al., Targeting neoantigens to augment antitumour immunity, Nat Rev Cancer, 2017, v
Печь для сжигания твердых и жидких нечистот	1920	Евсеев А.П.	SU17A1
Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды	1921	Богач Б.И.	SU4A1
Парный рычажный домкрат	1919	Устоев С.Г.	SU209A1
БАРЫШНИКОВА М.А
и др., Неоантигены в иммунотерапии опухолей, Российский биотерапевтический журнал, 2018, т
Печь для сжигания твердых и жидких нечистот	1920	Евсеев А.П.	SU17A1
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов	1917	Гордон И.Д.	SU2A1
Приспособление для точного наложения листов бумаги при снятии оттисков	1922	Асафов Н.И.	SU6A1

RU 2 832 574 C2

Авторы

Джунеджа, Викрам

Донг, Чжэнсинь

Изерт, Робин Джессика

Кхейрабад, Махбубех

Даты

2024-12-25—Публикация

2020-06-10—Подача

название	год	авторы	номер документа
НЕОАНТИГЕНЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ	2019	Джунеджа, Викрам	RU2805196C2
НЕОАНТИГЕНЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ	2019	Джунеджа, Викрам Донг, Чжэнсинь Изерт, Робин Джессика	RU2813924C2
КОНСТРУКТЫ Т-КЛЕТОЧНОГО РЕЦЕПТОРА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ	2019	Джунеджа, Викрам Чой, Дзаевон	RU2785954C2
ИММУНОГЕНЫ ДЛЯ ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВ ВИЧ	2013	Бранде Кристиан Моте Пухадас Беатрис Льяно Ануска	RU2721274C2
ИСКУССТВЕННЫЕ АНТИГЕНПРЕЗЕНТИРУЮЩИЕ КЛЕТКИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ	2018	Уикхэм, Томас, Джозеф Чэнь, Тиффани, Фэнь-И Эллоул, Сиван Сэлвет, Реджина, София Дауден, Натан, Дж.	RU2763798C1
Выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа	2021	Руденко Лариса Георгиевна Исакова-Сивак Ирина Николаевна Степанова Екатерина Алексеевна Матюшенко Виктория Аркадьевна Нисканен Сергей Андреевич Нетеребский Богдан Олегович Владимирова Анна Константиновна Яковлев Павел Андреевич Устюгов Яков Юрьевич Шеуджен Тимур Мугдинович Доронин Александр Николаевич Остроухова Татьяна Юрьевна Александров Алексей Александрович Морозов Дмитрий Валентинович	RU2813150C2
ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ПРОТИВОРАКОВАЯ НЕОЭПИТОПНАЯ ВАКЦИНА	2017	Гранум Стайн Стубсруд Элизабет Фредриксен Агнете Брунсвик	RU2782422C2
НЕОАНТИГЕНЫ И СПОСОБЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ	2017	Руни, Майкл Стивен	RU2773273C2
АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧЕСКИЕ В ОТНОШЕНИИ CD70, И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ	2019	Пановски, Силер Сай, Тао Сасу, Барбра Джонсон Сриватса Сринивасан, Сурабхи Ван Бларком, Томас Джон	RU2801093C2
АНТИТЕЛА ПРОТИВ ИНТЕРФЕРОНА БЕТА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ	2017	Гулла, Стефано, В. Хуард, Кристин Булманн, Джанет, Элизабет Альмагро, Хуан, Карлос Кодангаттил, Срикумар, Р. Гринберг, Стивен, А. Лавалли, Эдвард, Роланд Беннетт, Эрик, М. Мосяк, Лидия Холл, Джеймс, Перри Койл, Энтони, Джон	RU2750454C2

НЕОАНТИГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C07K14/82 C12N15/52 A61K35/15

Описание патента на изобретение RU2832574C2

Похожие патенты RU2832574C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 832 574 C2

Реферат патента 2024 года НЕОАНТИГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

Формула изобретения RU 2 832 574 C2

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2024 года RU2832574C2

RU 2 832 574 C2