Область техники изобретения

Настоящее изобретение относится к способу отбора неоэпитопов для индивидуума путем отбора связывающих МНС I и/или МНС II неоэпитопов и их ранжирования с точки зрения их клинической применимости. Настоящее изобретение также относится к противораковым вакцинам, полученным описанными в данном документе способами.

Уровень техники изобретения

Хотя в лечении рака, в частности, благодаря раннему выявлению и диагностике, и были достигнуты улучшения за последние несколько десятилетий, что значительно увеличило выживаемость, только около 60% пациентов, у которых диагностирован рак, живы через 5 лет после постановки диагноза.

Большинство используемых способов лечения рака представляют собой хирургические процедуры, лучевую терапию и цитотоксическую химиотерапию. Однако все они имеют серьезные побочные эффекты. В последнее время также применяют лечение с использованием антител, направленных против известных связанных с раком антигенов или иммуномодулирующих молекул.

В течение последних нескольких лет привлекает интерес противораковая иммунная терапия, нацеливаемая на раковые клетки с помощью собственной иммунной системы пациента, например, противораковые вакцины, поскольку такие способы лечения могут уменьшить или даже устранить некоторые из побочных эффектов, наблюдаемых при традиционном лечении раковых заболеваний.

В основе иммунологии лежит различение «своего» и «несвоего». Большинство патогенов, вызывающих инфекционные заболевания, содержат молекулярные сигнатуры, которые могут распознаваться хозяином и запускать иммунные ответы. Однако опухолевые клетки происходят из нормальных клеток и обычно не экспрессируют каких-либо посторонних молекулярных сигнатур, из-за чего труднее отличать их от нормальных клеток.

Тем не менее, большинство опухолевых клеток экспрессируют разные типы опухолевых антигенов. Один класс опухолевых антигенов представляет собой так называемые ассоциированные с опухолью антигены, например, антигены, с низкими уровнями экспрессии в нормальных тканях и с гораздо более высоким уровнем экспресии в опухолевой ткани. Такие ассоциированные с опухолью антигены были мишенью противораковых вакцин в последнее десятилетие. Однако иммунологическое лечение, направленное на ассоциированные с опухолью антигены, сопряжено с рядом проблем, поскольку опухолевые клетки могут уклоняться от иммунной системы, подавляя действие рассматриваемого антигена, и лечение также может приводить к токсичности из-за разрушения нормальных клеток.

Недавно был идентифицирован другой класс опухолевых антигенов, так называемые опухолевые неоантигены, которые являются опухолеспецифическими антигенами. Опухолевые неоантигены возникают из-за одной или нескольких мутаций в опухолевом геноме, приводящих к изменению аминокислотной последовательности рассматриваемого белка. Поскольку данные мутации не присутствуют в нормальной ткани, побочные эффекты лечения, направленного на опухолеспецифические неоантигены, не возникают при иммунологическом лечении, направленном против опухолевых неоантигенов.

Однако для создания эффективных вакцин важно, чтобы для вакцины были отобраны и использованы наиболее иммуногенные неоэпитопы.

Краткое изложение изобретения

Авторы настоящего изобретения разработали способ отбора неоэпитопов для отбора неоэпитопов, обладающих доказанными свойствами важности для иммуногенности. Используя данный способ, высокоиммуногенные неоэпитопы с предсказанной способностью связывать главный комплекс гистосовместимости (МНС) могут отбираться для вакцин, обеспечивая вакцины, способные вызывать сильный и устойчивый иммунный ответ.Таким образом, могут быть созданы вакцины, подходящие для персонализированной противораковой терапии. Таким образом, в данном документе представлены способы ранжирования неоэпитопов в соответствии с их клинической применимостью, которые особенно подходят в контексте производства персонализированных вакцин для противораковой терапии.

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу отбора неоэпитопов в числе А для индивидуума, причем указанный способ включает следующие стадии:

a. Получение одного или нескольких неоэпитопов от указанного индивидуума, где каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере один минимальный эпитоп, причем каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере одну мутацию, такую как иммуногенная мутация, по сравнению с эталонной последовательностью;

b. Определение аффинности связывания МНС I и/или МНС II по меньшей мере для одного минимального эпитопа, например, по меньшей мере для двух, трех или четырех минимальных эпитопов в каждом из указанных неоэпитопов;

c. Отбор неоэпитопов, содержащих по меньшей мере один минимальный эпитоп с предсказанной способностью связываться с МНС I и/или с МНС II, с получением таким образом связывающих МНС неоэпитопов;

d. Ранжирование связывающих МНС неоэпитопов в отношении вероятности их клинической применимости;

e. Отбор А неоэпитопов из связывающих МНС неоэпитопов с наивысшим рангом, таким самым отбирая А неоэпитопов, имеющих клиническое применение.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ отбора числа А неоэпитопов для индивидуума, причем указанный способ включает следующие стадии:

a. Получение одного или нескольких неоэпитопов от указанного индивидуума, где каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере один минимальный эпитоп, причем каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере одну мутацию, такую как иммуногенная мутация, по сравнению с эталонной последовательностью;

b. Определение аффинности МНС I-связывания для каждого из указанных неоэпитопов и определение числа минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, для каждого из указанных неоэпитопов;

c. Ранжирование неоэпитопов следующим образом:

i. приоритизация неоэпитопов, содержащих большое число минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I и/или II МНС, и отбор первой группы неоэпитопов, имеющих высокую оценку;

ii. необязательно, приоритизация неоэпитопов из первой группы неоэпитопов следующим образом:

1) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа равен или больше 20, минимальный эпитоп имеет наивысшую оценку;

2) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа равен или больше 20, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка для минимальных эпитопов, равная 1;

3) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа ниже 20 и равен или больше 3, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 2);

4) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа ниже 20 и равен или больше 3, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 3);

5) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа меньше 3 и равен или больше 1, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 4);

6) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа меньше 3 и равен или больше 1, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 5);

7) если минимальный эпитоп имеет мутацию с дифференциальным показателем связывания ниже 1, независимо от позиции мутации, минимальный эпитоп имеет самую низкую оценку; где дифференциальный показатель МНС I-связывания дается формулой (% ранговая оценка (МНС I) для контроля)/(% ранговая оценка (МНС I) для минимального эпитопа); и отбор второй группы неоэпитопов, имеющих высокую оценку;

iii. необязательно, приоритизация неоэпитопов из второй группы на основе их % ранговой оценки в отношении МНС I и отбор третьей группы неоэпитопов, имеющих низкую % ранговую оценку в отношении МНС I;

iv. необязательно, отбор четвертой группы неоэпитопов из второй или третьей группы, включающей минимальные эпитопы с высоким сходством с эпитопами, о которых известно, что они распознаются Т-клетками,

v. необязательно, приоритизация неоэпитопов из второй группы, из третьей группы или из четвертой группы на основе их оценки по BLOSUM, при этом оценка по BLOSUM меньше заранее определенного порогового значения ранжируется выше, чем оценка по BLOSUM, равная или превышающая указанное пороговое значение, и отбор пятой группы неоэпитопов, имеющих оценку по BLOSUM меньше указанного порогового значения, причем указанное пороговое значение предпочтительно равно 1.

vi. необязательно, отбор неоэпитопов из первой, второй, третьей, четвертой или пятой группы неоэпитопов на основе неоэпитопов, обнаруженных в двух или более образцах, и отбор шестой группы неоэпитопов, обнаруженных в двух или более образцах;

vii. необязательно, отбор неоэпитопов из первой, второй, третьей, четвертой, пятой или шестой группы неоэпитопов на основе идентификации мутации по меньшей мере двумя различными определителями вариантов и отбор седьмой группы неоэпитопов, включающей мутацию, идентифицированную по меньшей мере двумя различными определителями вариантов, при этом первая, вторая, третья, четвертая, пятая, шестая или седьмая группа неоэпитопов включает указанные А неоэпитопов.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения противораковой вакцины, содержащей неоэпитопы, причем указанный способ включает стадию отбора указанных неоэпитопов с использованием описанных в данном документе способов.

В данном документе также описана противораковая вакцина, которую можно получить описанными в данном документе способами.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ отбора числа А неоэпитопов для индивидуума, причем указанный способ включает следующие стадии:

a. Получение одного или нескольких неоэпитопов от указанного индивидуума, где каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере один минимальный эпитоп, причем каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере одну мутацию, такую как иммуногенная мутация, по сравнению с эталонной последовательностью;

b. Определение аффинности связывания МНС I и/или МНС II для каждого из указанных неоэпитопов;

c. Отбор неоэпитопов, содержащих по меньшей мере один минимальный эпитоп, например, по меньшей мере два, три или четыре минимальных эпитопа с предсказанной способностью связываться с МНС I и/или с МНС II, с получением таким образом связывающих МНС неоэпитопов;

d. Ранжирование связывающих МНС неоэпитопов с точки зрения вероятности их клинического применения;

e. Отбор А неоэпитопов из связывающих МНС неоэпитопов с наивысшим рангом, где А представляет собой целое число и А равно по меньшей мере 3, например, по меньшей мере 4, например, по меньшей мере 5,

тем самым отбирая А неоэпитопов, способных вызывать CD8+ Т-клеточный ответ при введении индивидууму в иммунологически активном количестве.

Описание чертежей

Фигура 1. Предсказанный с помощью NetMHCpan/NetMHC IIpan % ранг аффинности связывания для молекул МНС класса I (А) и класса II (В) для иммуногенных (слева) и неиммуногенных (справа) неоэпитопов (оценка на вакцинированных VB10.NEO мышах).

Фигура 2. Оценка по BLOSUM для отобранных неоэпитопов с низким % рангом для молекул МНС класса I (А) и класса II (В). Иммуногенные пептиды: слева; неиммуногенные пептиды: справа.

Фигура 3. Накопленное количество IFN-γ пятен для 20 лучших неоэпитопов, выбранных с помощью NeoSELECT на наборе данных моделей СТ26 (А), В16 (В) и LL2 (С). Среднее накопленное количество пятен IFN-γ для 1000 случайно отобранных неоэпитопов для каждого набора данных показано черной линией.

Фигура 4. Накопленное количество IFN-γ пятен для 20 лучших неоэпитопов (мутант) и последовательности дикого типа данных неоэпитопов (WT) из набора данных СТ26 (А), В16 (В) и LL2 (С), полученных с использованием стратегии NeoSELECT. Среднее накопленное количество пятен IFN-γ для 1000 случайно отобранных неоэпитопов из СТ26 (А), В16 (В) и LL2 (С) показано черной линией.

Фигура 5. Оценки по BLOSUM показаны для иммуногенных и неиммуногенных неоэпитопов с уменьшенной аффинностью связывания МНС I (дифференциальный показатель МНС I-связывания ниже 1), увеличенной аффинностью связывания МНС I (дифференциальный показатель МНС I-связывания выше 3) и без каких-либо изменений в аффинности связывания МНС I. На фигуре показано, что иммуногенные неоэпитопы (светло-серый) имеют более низкую оценку по BLOSUM, чем неиммуногенные неоэпитопы (темно-серый), когда изменяется аффинность МНС I-связывания (левая и средняя панели), тогда как для неоэпитопов, для которых аффинность МНС I-связывания не изменилась, изменений в оценке по BLOSUM не наблюдается.

Фигура 6. 10 различных неоэпитопов (pep 1-10), все из которых, как предсказано, связываются с МСН класса I (CD8+ Т-клеточный ответ), были исследованы Kreiter et al., 2015 и Castle et al., 2012, чтобы выяснить, могут ли они индуцировать CD8+ Т-клеточные ответы на модели опухоли меланомы мыши B16-F10. Ответы, индуцированные 6 неоэпитопами при введении в виде вакцитела, как описано в данном документе («VB10.NEO»), показаны на верхней панели. CD4 и CD8 ответы, при введении в виде пептид плюс поли ICLC адъювант, РНК и вакцитело, суммированы в нижней панели, где белый указывает на отсутствие ответа, светло-серый указывает на слабый ответ, умеренно-серый указывает на средний ответ и темно-серый указывает на сильный ответ.

Фигура 7. Обзор способа отбора неоэпитопов.

Фигура 8. Общее число предсказанных минимальных эпитопов для MHCI класса I и II в неоэпитопах длиной 27 аминокислот (оценено на вакцинированных VB10.NEO мышах). Иммун: иммуногенный; Неиммун: неиммуногенный.

Фигура 9. Сравнение между иммуногенными и неиммуногенными неоэпитопами в отношении их дифференцитального показателя связывания между WT и МТ для молекул МНС класса I для неоэпитопов с мутацией в якорной позиции.

Фигура 10. Оценка по BLOSUM для отобранных неоэпитопов с низким % рангом для молекул МНС класса I (А) и класса II (В).

Подробное описание

Определения

Термин «опухолевый неоантиген» или «неоантиген» в контексте настоящего описания относится к любому опухолеспецифическому антигену, содержащему одну или несколько мутаций по сравнению с экзомом здоровой ткани хозяина. Опухолевый неоантиген используется как синоним термина раковый неоантиген. Указанная одна или несколько мутаций также могут называться «неоэпитопными мутациями». Мутация может быть любой мутацией, приводящей к изменению по меньшей мере одной аминокислоты. Соответственно, мутация может быть одной из следующих:

- несинонимичная мутация, приводящая к изменению в аминокислоте

- мутация, приводящая к сдвигу рамки считывания и, следовательно, к совершенно другой открытой рамке считывания в направлении после мутации

- мутация сквозного прочитывания, в которой стоп-кодон изменен или удален, что приводит к более длинному белку с опухолеспецифическим неоэпитопом

- сплайс-мутации, которые приводят к уникальной последовательности опухолеспецифического белка

- хромосомные перестройки, которые приводят к химерному белку с опухолеспецифическим неоэпитопом в месте соединения двух белков.

Мутация в контексте настоящего описания не обязательно относится к мутации одного остатка, но в более общем смысле относится к различию между данной последовательностью (например, потенциального неоэпитопа) и эталонной последовательностью. Мутация может, таким образом, относиться к мутации более чем одного аминокислотного остатка. В некоторых вариантах осуществления мутация представляет собой иммуногенную мутацию.

Термин «опухолевый неоэпитоп» или «неоэпитоп» в контексте настоящего описания относится к любой иммуногенной мутации в опухолевом антигене и используется как синоним термина раковый неоэпитоп.Наличие мутации определяют путем сравнения последовательности неоэпитопа, полученного из образца опухоли, с эталонной последовательностью, присутствующей в эталонном образце, таком как здоровая ткань того же человека. Обычно это пептид длиной 27 аминокислот. Неоэпитоп может содержать один или несколько минимальных эпитопов, как определено в данном документе. Мутация обычно присутствует в центре или около центра неоэпитопа, то есть в позиции 14 в 27-мере, но не обязательно в центре минимального эпитопа(ов).

Используемый в данном документе термин «последовательность опухолевого неоэпитопа» или «последовательность неоэпитопа» относится к последовательности, содержащей неоэпитоп в антигенной субъединице, и используется как синоним термина «последовательность ракового неоэпитопа».

Термин «опухолевый неоэпитопный пептид», «неоэпитопный пептид» в контексте настоящего описания относится к пептидной последовательности неоэпитопа, где указанная пептидная последовательность содержит мутацию.

Термин «минимальный эпитоп» относится к субпоследовательности неоэпитопа с предсказанной способностью связываться с МНС I или МНС II, причем указанная субпоследовательность включает мутацию, которая может быть иммуногенной. Другими словами, минимальный эпитоп может быть иммуногенным, то есть способным вызывать иммунный ответ, например, если он содержит мутацию, которая придает иммуногенность минимальному эпитопу или которая повышает иммуногенность минимального эпитопа. Такая мутация в данном документе называется иммуногенной мутацией. Таким образом, термин минимальный эпитоп может относиться к коротким субпоследовательностям неоэпитопа с предсказанной способностью связываться с МНС I или МНС II, и которые содержат мутацию, обнаруженную в неоэпитопе. 27-мерный неоэпитоп, содержащий мутацию в позиции 14, может, таким образом, включать несколько минимальных связывающих эпитопов, то есть минимальных связывающих эпитопов, имеющих длину короче чем 27 аминокислот, но каждый из которых содержит мутацию. Например, минимальный эпитоп может состоять из первых 14 аминокислот неоэпитопа при условии, что предсказано, что он связывается с МНС I или МНС II, или он может состоять из аминокислот от 9 до 18 неоэпитопа или из аминокислот от 7 до 22.

Используемый в данном документе термин «молекула МНС» включает молекулы как МНС класса I (МНС I), так и МНС класса II (МНС II). МНС I представлен несколькими локусами: например, HLA-A (Human Leukocyte Antigen-А, человеческий лейкоцитарный антиген-А), HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J, HLA-K, HLA-L, HLA-P и HLA-V, тогда как МНС II представлен такими локусами, как HLA-DRA, HLA-DRB 1-9, HLA-, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA и HLA-DOB. Термины «молекула МНС» и «молекула HLA» используются в данном документе взаимозаменяемо.

Используемые в данном документе термины «неоэпитоп выбран» или «отбор неоэпитопа» относятся к выбору неоэпитопа для потенциального клинического или терапевтического применения, предпочтительно для применения в противораковой вакцине. Таким образом, когда неоэпитоп выбран, он является потенциальным кандидатом для клинического применения или для применения в противораковой вакцине. Выбранные неоэпитопы ранжируются выше или приоритизируются над неоэпитопами, которые не выбраны.

Нуклеотид в данном документе определяется как мономер РНК или ДНК. Нуклеотид представляет собой рибозное или дезоксирибозное кольцо, присоединенное как к основанию, так и к фосфатной группе. Моно-, ди- и трифосфатные нуклеозиды называются нуклеотидами.

Используемый в данном документе термин «геном» относится к общему количеству генетической информации в хромосомах организма или клетки.

Используемый в данном документе термин «экзом» относится к части генома, образованной экзонами, последовательностями, которые при транскрибировании остаются в зрелой РНК после удаления интронов путем сплайсинга РНК. Он состоит из всей ДНК, которая транскрибируется в зрелую РНК в клетках любого типа, в отличие от транскриптома, который представляет собой РНК, которая была транскрибирована только в определенной популяции клеток.

Используемый в данном документе термин «мутация» включает транслокации, инверсии, делеции, дупликации и точечные мутации, предпочтительно присутствующие в нуклеотиде, кодирующем неоэпитоп. В одном предпочтительном варианте осуществления мутация представляет собой аминокислотную замену, предпочтительно присутствующую в неоэпитопе.

Используемый в данном документе термин «противораковая вакцина» относится к вакцине, которая либо лечит существующее раковое заболевание, либо предотвращает развитие ракового заболевания. Вакцины, которые лечат существующее раковое заболевание, известны как терапевтические противораковые вакцины.

Идентификация неоэпитопов

Способ согласно настоящему изобретению может включать стадию идентификации одного или нескольких неоэпитопов путем идентификации опухолеспецифических мутаций в последовательностях нуклеиновых кислот из образца, полученного от индивидуума, как описано в настоящем документе. Указанный один или несколько неоэпитопов предпочтительно представляет собой множество неоэпитопов; однако в некоторых случаях даже один неоэпитоп может быть применим в контексте персонализированной терапии, например, персонализированной противораковой терапии, при условии, что он способен вызывать желаемый иммунологический ответ.

Предпочтительно указанный индивидуум является больным раком. Один или несколько образцов могут быть получены от больного раком для идентификации неоэпитопов, которые могут быть потенциальными кандидатами для клинического применения, таких как, например, персонализированная иммуногенная противораковая вакцина.

Предпочтительно опухолеспецифические мутации идентифицируют путем сравнения нуклеотидных последовательностей, полученных из образца опухоли от указанного индивидуума, с нормальными нуклеотидными последовательностями. Нормальные нуклеотидные последовательности могут быть получены путем секвенирования нуклеиновых кислот, полученных из образца жидкости организма или любой неопухолевой ткани указанного индивидуума. Предпочтительно нормальные нуклеотидные последовательности получают из здоровой ткани одного и того же человека. Нормальные нуклеотидные последовательности также можно получить из базы данных. Термин «нормальная», применяемый к последовательности, будь то пептидная последовательность или нуклеотидная последовательность, будет в данном документе использоваться взаимозаменяемо с термином «эталонная» или «дикий тип». Таким образом, термин может применяться к соответствующей последовательности, обнаруженной при «нормальных» обстоятельствах у одного и того же человека или в пределах нормальной здоровой популяции. Сравнение опухолеспецифических последовательностей с соответствующей последовательностью, обнаруженной в другой, неопухолевой ткани, выделенной от того же человека, может, таким образом, уменьшить количество ложно положительных результатов, потому что неоэпитопы, возникающие в результате генетической вариации между отдельными лицами, например, содержащие однонуклеотидный полиморфизм (single-nucleotide polimorphism, SNP), которые могут быть специфическими для индивидуума, но не опухолеспецифическими, будут отфильтрованы из результатов. Эталонная последовательность, выделенная от индивидуума, может быть из образца здоровых клеток, полученных от того же индивидуума до постановки диагноза. Образец также может быть получен до начала терапии или после ее начала.

Используемый в данном документе термин «образец опухоли» относится к образцу, содержащему опухолевые клетки. Образец опухоли может быть получен путем взятия биопсии от указанного индивидуума или онкопациента. Биопсия может представлять собой небольшой образец опухолевой ткани, взятый с помощью иглы или небольшой хирургической операции. Образец также может быть биопсией лимфатического узла. Также может быть выполнено несколько биопсий или биопсий опухоли.

Эталонный образец может представлять собой образец жидкости организма. Образец жидкости организма может быть, например, образцом мочи, фекальной пробой, образцом сыворотки или образцом слюны. В предпочтительном варианте осуществления образец жидкости организма представляет собой образец крови. Предпочтительно эталонный образец получают из здоровой ткани человека, нуждающегося в лечении.

Нуклеиновые кислоты, полученные из образцов, можно секвенировать с использованием любого известного способа секвенирования. Например, можно использовать секвенирование следующего поколения. В некоторых вариантах осуществления последовательности нуклеиновых кислот из опухолевых клеток индивидуума сравнивают с последовательностями нуклеиновых кислот из нормальных клеток, таких как здоровые клетки того же индивидуума или эталонные клетки, для выявления различий в последовательностях.

Аффинность связывания МНС I и МНС II

Для отбора и приоритизации неоэпитопов, являющихся наиболее сильными кандидатами для персонализированных противораковых вакцин, авторы настоящего изобретения разработали способ ранжирования и отбора неоэпитопов, которые вызывают сильный иммунный ответ.

Чтобы инициировать иммунный ответ, неоэпитопы должны быть нацелены на эпитопы, ограниченные главным комплексом гистосовместимости (major histocompatibility complex, МНС), поскольку только пептиды, которые могут связывать молекулы МНС, обеспечивают подходящие мишени для Т-клеток. Таким образом, первым шагом для отбора наиболее многообещающих неоэпитопов может быть определение их аффинности МНС-связывания.

МНС I находится на поверхности всех ядросодержащих клеток в организме. Одна из функций МНС I состоит в том, чтобы отображать пептиды, находящиеся внутри клетки, цитотоксическим Т-клеткам. Комплекс МНС I-пептид встраивается в плазматическую мембрану клетки, презентируя пептид цитотоксическим Т-клеткам, посредством чего запускается активация цитотоксических Т-клеток, направленная против конкретного комплекса МНС-пептид. Пептид расположен в бороздке в молекуле МНС I, что позволяет пептиду обычно иметь длину около 8-10 аминокислот.Понятие МНС I может использоваться взаимозаменяемо с МНС класса I.

Молекулы МНС II представляют собой семейство молекул, обычно обнаруживаемых только на антигенпрезентирующих клетках, таких как дендритные клетки, мононуклеарные фагоциты, некоторые эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки тимуса и В-клетки. Понятие МНС II может использоваться взаимозаменяемо с МНС класса II.

В отличие от МНС I, антигены, презентируемые пептидами МНС класса II, происходят из внеклеточных белков. Внеклеточные белки подвергаются эндоцитозу, перевариваются в лизосомах, и полученные антигенные пептиды загружаются на молекулы МНС класса II и затем презентируются на поверхности клетки. Антигенсвязывающая бороздка молекул МНС класса II открыта с обоих концов и может презентировать более длинные пептиды, как правило, длиной от 15 до 24 аминокислотных остатков. Кроме того, экзогенные антигены, которые обычно презентируются МНС II на поверхности дендритных клеток, могут презентироваться через путь МНС I посредством перекрестной презентации. Перекрестная презентация необходима для иммунитета против большинства опухолей и вирусов.

Молекулы МНС класса I распознаются Т-клеточными рецепторами (Т cell receptors (TCR)) и корецепторами на CD8+ Т-клетках, тогда как молекулы МНС класса II распознаются TCR и корецепторами на CD4+ Т-клетках.

Авторы настоящего изобретения установили способ отбора неоэпитопов, при котором неоэпитопы ранжируются по отношению к их клинической применимости, и где выбраны неоэпитопы, обладающие аффинностью к МНС, например, МНС I и/или МНС II.

Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к способу выбора числа А неоэпитопов для индивидуума, причем указанный способ включает следующие стадии:

a. Получение одного или нескольких неоэпитопов от указанного индивидуума, где каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере один минимальный эпитоп, причем каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере одну мутацию, такую как иммуногенная мутация, по сравнению с эталонной последовательностью;

b. Определение аффинности связывания МНС I и/или МНС II по меньшей мере для одного минимального эпитопа, например, по меньшей мере для двух, трех или четырех минимальных эпитопов в каждом из указанных неоэпитопов;

c. Отбор неоэпитопов, содержащих по меньшей мере один минимальный эпитоп с предсказанной способностью связываться сМНС I и/или с МНС II, с получением таким образом МНС-связывающих неоэпитопов;

d. Ранжирование МНС-связывающих неоэпитопов с точки зрения вероятности их клинического применения;

e. Отбор числа А неоэпитопов среди МНС-связывающих неоэпитопов наивысшего ранга,

тем самым отбирая число А неоэпитопов, которые могут иметь клиническое применение.

Неоэпитопы с высокой вероятностью клинического применения представляют собой неоэпитопы, которые являются иммуногенными и могут быть подходящими для применения в противораковой вакцине. Таким образом, способ настоящего изобретения представляет собой способ отбора наиболее иммуногенных неоэпитопов, наиболее подходящих для применения в противораковой вакцине.

МНС-аллели в человеческой популяции демонстрируют крайний полиморфизм. Каждый генетический локус включает большое количество гаплотипов, содержащих различные аллели, кодирующие разные пептиды. Следовательно, аффинности связывания МНС I и МНС II предпочтительно определяют между последовательностями неоэпитопов и последовательностями МНС I и/или МНС II, полученными от одного и того же индивидуума.

Для определения аффинности МНС-связывания для неоэпитопа, идентифицированного у индивидуума, необходимо выполнить HLA-типирование указанного индивидуума. Таким образом, способ настоящего изобретения может также включать стадию, на которой аффинность МНС-связывания определяют путем определения генотипа HLA указанного индивидуума. Например, указанный генотип HLA определяют по образцу крови указанного индивидуума.

Способы определения HLA-типа человека хорошо известны. HLA-типирование можно выполнить с помощью любого подходящего способа секвенирования. Предпочтительно использовать секвенирование следующего поколения.

Например, ДНК, выделенная из образцов крови указанного человека, может быть секвенирована на платформе секвенирования следующего поколения, такой как, например, платформа Illumina.

Аффинности связывания с МНС I и МНС II могут быть определены или предсказаны с использованием компьютерных программ, которые предсказывают аффинности связывания между пептидом и молекулами МНС I и МНС II.

Таким образом, в одном варианте осуществления аффинность МНС-связывания определяется предсказанием in silico. Предпочтительно, указанное предсказание in silico выполняют с использованием компьютерной программы, которая предсказывает связывание пептидов с молекулами МНС класса I и/или МНС класса II. Прогнозируемые значения аффинности связывания переводятся в процентильную оценку путем сравнения их с предсказанными аффинностями связывания набора из 100000 случайных природных 9-мерных пептидов. Предпочтительно, % (процентильная) ранговая оценка, используемая для прогнозирования аффинности связывания неоэпитопов с молекулами МНС I и МНС II, рассчитывается с использованием программного обеспечения NetMHCpan, описанного в Nielsen et al, 2016 (Nielsen, M. et al. (2016) «NetMHCpan-3.0: improved prediction of binding to MHC class I molecules integrating information from multiple receptor and peptide length data sets." Genome Medicine: 8:33) и Vannessa, J. et al (2017) "NetMHCpan-4.0: Improved Peptide MHC Class I Interaction Predictions Integrating Eluted Ligand and Peptide Binding Affinity Data." Vanessa Jurtz, Sinu Paul, Massimo Andreatta, Paolo Marcatili, Bjoern Peters and Morten Nielsen. The Journal of Immunology (2017)), и компьютерных программ NetMHC IIpan, как описано в Andreatta et al. 2015 (Andreatta M et al. Accurate pan-specific prediction of peptide-МНС class II binding affinity with improved binding core identification, hnmunogenetics. 2015; 67(11-12):641-650). % Ранговая оценка, как упомянуто в данном документе, рассчитывается с использованием вышеуказанных баз данных от 30.03.2016 для NetMHCpan и 29.09.2015 для NetMHCIIpan.

Низкая % ранговая оценка указывает на сильную аффинность связывания, тогда как более высокая % ранговая оценка указывает на более слабую аффинность связывания. Таким образом, неоэпитопы с низкой % ранговой оценкой предпочтительно ранжируются выше неоэпитопов с более высокой % ранговой оценкой.

% Ранговая оценка (МНС I) относится к % ранговой оценке, предсказывающей аффинность МНС I-связывания для пептида, минимального эпитопа или неоэпитопа.

% Ранговая оценка (МНС II) относится к % ранговой оценке, предсказывающей аффинность МНС II-связывания для пептида, минимального эпитопа или неоэпитопа.

Как объяснялось выше, каждый неоэпитоп может содержать один или несколько минимальных эпитопов. Также может быть определена % ранговая оценка (МНС I) или % ранговая оценка (МНС II) для каждого минимального эпитопа в пределах данного неоэпитопа. Предпочтительно, чтобы % ранговая оценка неоэпитопа тогда была равна % ранговой оценке минимального эпитопа, который он включает, которая является самой низкой, то есть аффинность связывания неоэпитопа считается такой же, как и аффинность связывания лучшего связывающего среди минимальных эпитопов, которые он включает.

В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы или минимальные эпитопы, имеющие % ранговую оценку (МНС I) меньше или равную 2, считаются связывающими МНС I. Как правило, более низкая % ранговая оценка (МНС I) указывает на более высокую аффинность связывания. Например, неоэпитоп или минимальный эпитоп, имеющий низкую % ранговую оценку (МНС I) от 0,5 до 2 (0,5 < % ранговая оценка (МНС I) ≤ 2), в некоторых вариантах осуществления может считаться слабо связывающим МНС I, в то время как % ранговая оценка (МНС I), равная или ниже 0,5, указывает на то, что неоэпитоп или минимальный эпитоп прочно связывает МНС I. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы или минимальные эпитопы, имеющие % ранговую оценку > 2, считаются не способными связываться с МНС I. В предпочтительных вариантах осуществления неоэпитопы, не содержащие каких-либо минимальных эпитопов с предсказанной способностью связываться с МНС I, считаются не имеющими клинического применения и исключены или имеют пониженный приоритет.Другими словами, стадия е настоящих способов может включать или состоять из стадии исключения или снижения приоритета неоэпитопов, которые, как предсказано, не связываются с МНС I. Понижение приоритета неоэпитопа означает, что неоэпитоп считается имеющим отдаленное отношение к клиническому применению. Исключение неоэпитопа означает, что неоэпитоп не выбран для клинического применения и/или что неоэпитоп не выбран для применения в вакцине.

В целом, неоэпитопы, включая минимальные эпитопы с высокой аффинностью связывания с МНС I, то есть с низкой % ранговой оценкой (МНС I), ранжируются выше неоэпитопов, содержащих минимальные эпитопы с более низкой аффинностью связывания с МНС I, то есть с более высокой % ранговой оценкой (МНС I). Неоэпитопы, содержащие минимальные эпитопы с высокой аффинностью связывания с МНС I, то есть с низкой % ранговой оценкой (МНС I), ранжируются выше неоэпитопов, содержащих минимальные эпитопы с более низкой аффинностью связывания с МНС I, то есть с более высокой % ранговой оценкой (МНС I).

В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы или минимальные эпитопы с % ранговой оценкой (МНС II), меньше или равной 10, считаются связывающими МНС I. Например, неоэпитоп или минимальный эпитоп с % ранговой оценкой (МНС II), которая составляет от 2 до 10 (2 < % ранговая оценка (МНС II) ≤ 10), в некоторых вариантах осуществления можно рассматривать как слабо связывающий МНС II, в то время как % ранговая оценка (МНС II), равная или ниже 2, указывает на то, что неоэпитоп или минимальный эпитоп прочно связывает МНС П. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы или минимальные эпитопы, имеющие % ранговую оценку > 10, считаются не способными связываться с МНС II. В предпочтительных вариантах осуществления неоэпитопы, не содержащие никаких связывающих минимальных эпитопов, считаются не имеющими клинического применения и исключены или имеют пониженный приоритет.Другими словами, стадии настоящих способов, например, стадия с или е настоящих способов, могут включать или состоять из стадии исключения неоэпитопов, содержащих только минимальные эпитопы, которые, как предсказано, не связываются с МНС II. Снижение приоритета неоэпитопа означает, что неоэпитоп считается имеющим отдаленное значение для клинического применения. Исключение неоэпитопа означает, что неоэпитоп не выбран для клинического применения и/или что неоэпитоп не выбран для применения в вакцине.

В целом, неоэпитопы или минимальные эпитопы с высокой аффинностью МНС II-связывания, то есть с низкой % ранговой оценкой (МНС II), ранжируются выше неоэпитопов или минимальных эпитопов с более низкой аффинностью связывания с МНС I, то есть с более высокой % ранговой оценкой (МНС II). Неоэпитопы, содержащие минимальные эпитопы с высокой аффинностью МНС II-связывания, то есть с низкой % ранговой оценкой (МНС II), ранжируются выше неоэпитопов, содержащих минимальные эпитопы с более низкой аффинностью МНС II-связывания, то есть с более высокой % ранговой оценкой (МНС II).

В одном предпочтительном варианте осуществления минимальные эпитопы, связывающие МНС II, имеют % ранговую оценку (МНС II) ниже 10. Таким образом, минимальные эпитопы, связывающие МНС II, содержащиеся в неоэпитопах, выбранных на стадии b способа согласно настоящему изобретению, предпочтительно имеют % ранговую оценку (МНС II) ниже 10. Это означает, что неоэпитопы, содержащие минимальные эпитопы, которые, как предсказано или определено, связывают МНС II с % ранговой оценкой ниже 10, выбираются для потенциального клинического применения и составляют потенциальные вакцины-кандидаты. Неоэпитопы, содержащие минимальные эпитопы, которые, как предсказано, связывают МНС II с % ранговой оценкой (МНС II) более 10, предпочтительно имеют пониженный приоритет или исключаются.

В целом, МНС II-связывающие неоэпитопы, содержащие минимальные эпитопы, имеющие высокую аффинность МНС II-связывания, ранжируются над неоэпитопами, содержащими минимальные эпитопы, имеющие более низкую аффинность МНС II-связывания.

Число минимальных эпитопов

Можно ожидать, что неоэпитопы, содержащие более одного минимального эпитопа, будут иметь более высокую клиническую ценность, чем неоэпитопы, содержащие только один минимальный эпитоп.Соответственно, в некоторых вариантах осуществления число минимальных эпитопов, содержащих иммуногенную мутацию и способных связываться с молекулами МНС, является наиболее важным параметром на стадии d описанного выше способа. Однако также возможно, что неоэпитопы, которые могут иметь клиническое применение и отобраны с помощью настоящих способов, содержат только один минимальный эпитоп; такие неоэпитопы могут иметь клиническое значение, если другие недоступны и/или если минимальный эпитоп обеспечивает связывание или сильное связывание с молекулами МНС.

В одном варианте осуществления неоэпитопы, содержащие большее число минимальных эпитопов, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие меньшее число минимальных эпитопов. Неоэпитопы, содержащие меньшее число минимальных эпитопов, включают неоэпитопы, содержащие только один минимальный эпитоп.

Таким образом, в одном варианте осуществления способ по настоящему изобретению дополнительно включает стадию определения числа минимальных эпитопов, содержащихся в неоэпитопах, связывающих МНС I, где МНС I-связывающие неоэпитопы, содержащие большее число связывающих минимальных эпитопов, ранжируются выше МНС I-связывающих неоэпитопов, содержащих меньшее число связывающих минимальных эпитопов.

В другом варианте осуществления способ по настоящему изобретению включает или дополнительно включает стадию определения числа минимальных эпитопов, присутствующих в неоэпитопах, связывающих МНС II, где МНС II-связывающие неоэпитопы, содержащие большее число связывающих минимальных эпитопов, ранжируются выше МНС II-связывающих неоэпитопов, содержащих меньшее число связывающих минимальных эпитопов.

В некоторых вариантах осуществления настоящий способ включает стадию определения как числа минимальных эпитопов, которые способны связывать молекулы МНС I, так и числа минимальных эпитопов, которые способны связывать молекулы МНС II.

Для того, чтобы ранжировать неоэпитопы в зависимости от общего числа минимальных эпитопов, которые они включают, число минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, в некоторых вариантах осуществления превышает, например, вдвое, число минимальных эпитопов, связывающихся с МНС II. Это означает, что оценка числа минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, выше, чем оценка числа минимальных эпитопов, связывающихся с МНС II, например, вдвое выше. Например, неоэпитоп с 14 минимальными эпитопами, связывающими МНС I, и 13 минимальными эпитопами, связывающими МНС II, будет более иммуногенным, чем неоэпитоп, содержащий 12 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, и 15 минимальных неоэпитопов, связывающихся с МНС II.

Таким образом определяется оценка связывания для каждого неоэпитопа. На практике определяют число минимальных (связывающих) эпитопов, содержащихся в неоэпитопе, тем самым идентифицируя х минимальных эпитопов, связывающихся с MHCI, и/или у минимальных эпитопов, связывающихся с MHCII.

Подходящая схема подсчета оценок для определения оценки связывания неоэпитопа может быть следующей:

а*2х+b*у

где более высокая оценка связывания указывает на более высокую вероятность клинического применения, как объяснено выше.

Например, а = 1, если у > 0, и а = 0, если у = 0, и b = 1, если х > 0, и b = 0, если х = 0. Другой подходящей схемой оценивания может быть:

а*х+b*у

где более высокая оценка связывания указывает на более высокую вероятность клинического применения, как объяснено выше.

Например, а = 2 и b = 1, или а = 2, если у > 0, и а = 0, если у = 0, и b = 1, если х > 0, и b = 0, если х = 0.

В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере один минимальный эпитоп, связывающийся с МНС I, и по меньшей мере один минимальный эпитоп, связывающийся с МНС II, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие только минимальные эпитопы, связывающие МНС I, или только минимальные эпитопы, связывающие МНС II. В других вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере один минимальный эпитоп, связывающийся с МНС I, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие только минимальные эпитопы, связывающие МНС II. В других вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере один минимальный эпитоп, связывающийся с МНС II, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие только минимальные эпитопы, связывающие МНС I.

В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 2 минимальных эпитопа, связывающихся с МНС, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие только один минимальный эпитоп, связывающийся с МНС. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 3 минимальных эпитопа, связывающихся с МНС, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 3 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 4 минимальных эпитопа, связывающихся с МНС, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 4 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 5 минимальных эпитопов, связывающих МНС, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 5 минимальных эпитопов, связывающих МНС. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 6 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 6 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 7 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 7 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 8 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 8 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 9 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 9 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 10 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 10 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС. МНС-связывающий минимальный эпитоп может представлять собой минимальные эпитопы, связывающие МНС I, или минимальный эпитоп, связывающий МНС II.

В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 2 минимальных эпитопа, связывающихся с МНС I, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие только один минимальный эпитоп, связывающийся с МНС I, или неоэпитопы, содержащие только минимальные эпитопы, связывающие МНС II. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 3 минимальных эпитопа, связывающихся с МНС I, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 3 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, или неоэпитопы, содержащие только минимальные эпитопы, связывающие МНС II. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 4 минимальных эпитопа, связывающихся с МНС I, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 4 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, или неоэпитопы, содержащие только минимальные эпитопы, связывающие МНС II. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 5 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 5 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, или неоэпитопы, содержащие только минимальные эпитопы, связывающие МНС П. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 6 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 6 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, или неоэпитопы, содержащие только минимальные эпитопы, связывающие МНС II. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 7 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 7 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, или неоэпитопы, содержащие только минимальные эпитопы, связывающие МНС II. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 8 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 8 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, или неоэпитопы, содержащие только минимальные эпитопы, связывающие МНС II. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 9 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 9 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, или неоэпитопы, содержащие только минимальные эпитопы, связывающие МНС II. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 10 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 10 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, или неоэпитопы, содержащие только минимальные эпитопы, связывающие МНС II.

В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 2 минимальных эпитопа, связывающихся с МНС II, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие только один минимальный эпитоп, связывающийся с МНС II. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 3 минимальных эпитопа, связывающихся с МНС II, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 3 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС II. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 4 минимальных эпитопа, связывающихся с МНС II, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 4 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС II. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 5 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС II, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 5 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС II. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 6 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС II, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 6 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС II. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 7 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС II, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 7 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС II. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 8 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС II, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 8 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС II. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 9 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС II, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 9 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС II. В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере 10 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС II, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие менее 10 минимальных эпитопов, связывающихся с МНС II.

Дифференциальный показатель связывания

В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие минимальные эпитопы, которые обладают аффинностью связывания с МНС I, которая выше или намного выше по сравнению с аффинностью связывания с МНС I соответствующего эталонного пептида, имеют приоритет над неоэпитопами, содержащими минимальные эпитопы, для которых аффинность МНС I-связывания только немного улучшена по сравнению с соответствующей эталонной аффинностью связывания с МНС I.

Следовательно, соотношение % ранговых оценок (МНС I) между неоэпитопом и соответствующим эталонным пептидом можно использовать для отбора неоэпитопов для потенциального клинического применения. В данном документе соотношение % ранговых оценок для МНС I-связывания также упоминается как дифференциальный показатель МНС I-связывания.

Аналогичным образом, в некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, которые обладают аффинностью связывания с МНС II, которая выше или намного выше по сравнению с аффинностью связывания с МНС II соответствующего эталонного пептида, имеют приоритет над неоэпитопами, экспрессирующими пептиды, для которых аффинность связывания с МНС II только немного улучшена по сравнению с соответствующей эталонной аффинностью связывания с МНС II.

Следовательно, соотношение % ранговых оценок (МНС II) между неоэпитопом и соответствующим эталонным пептидом можно использовать для отбора неоэпитопов для потенциального клинического применения. В данном документе соотношение % ранговых оценок для МНС II-связывания также упоминается как дифференциальный показатель МНС II-связывания.

Дифференциальный показатель МНС I-связывания между эталонным пептидом и неоэпитопом задается следующей формулой: (% ранговая оценка (МНС I) для эталона) / (% ранговая оценка (МНС I) для неоэпитопа), где % ранговая оценка (МНС I) для эталона представляет собой предсказанную аффинность связывания между эталонным пептидом и молекулами МНС I и % ранговая оценка (МНС I) для неоэпитопа представляет собой предсказанную аффинность связывания между неоэпитопным пептидом и молекулами МНС I.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения стадия b или с способа, описанного выше, дополнительно включает определение дифференциального показателя связывания МНС I, заданного формулой (% ранговая оценка (МНС I) для эталона) / (% ранговая оценка (МНС I) для неоэпитопа), где неоэпитопы с большим дифференциальным показателем связывания МНС I ранжируются выше, чем неоэпитопы с более низким дифференциальным показателем связывания МНС I.

В одном варианте осуществления неоэпитопы имеют более низкий приоритет, если дифференциальный показатель МНС I-связывания, (% ранговая оценка (МНС I) для эталона) / (% ранговая оценка (МНС I) для неоэпитопа), ниже 2.

В одном варианте осуществления неоэпитопы имеют пониженный приоритет, если дифференциальный показатель МНС I-связывания, (% ранговая оценка (МНС I) для эталона) / (% ранговая оценка (МНС I) для неоэпитопа), ниже 20, например, ниже 3, например, ниже 1. Неоэпитопы считаются потенциально клинически значимыми, если дифференциальный показатель связывания равен или больше 1, например, равен или больше 3, например, равен или больше 20.

Подобным образом, дифференциальный показатель МНС I-связывания между эталонным пептидом и минимальным эпитопом определяется по следующей формуле: (% ранговая оценка (МНС I) для эталона) / (% ранговая оценка (МНС I) для минимального эпитопа), где % ранговая оценка (МНС I) для эталона представляет собой предсказанную аффинность связывания между эталонным пептидом и молекулами МНС I и % ранговая оценка (МНС I) для минимального эпитопа представляет собой предсказанную аффинность связывания между минимальным эпитопом пептидом и молекулами МНС I.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения стадия b или с способа, описанного выше, дополнительно включает определение дифференциального показателя связывания МНС I, заданного формулой (% ранговая оценка (МНС I) для эталона) / (% ранговая оценка (МНС I) для минимального эпитопа), где неоэпитопы, содержащие минимальные эпитопы с большим дифференциальным показателем связывания МНС I, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие минимальные эпитопы с более низким дифференциальным показателем связывания МНС I.

В одном варианте осуществления неоэпитопы имеют пониженный приоритет, если дифференциальный показатель МНС I-связывания, (% ранговая оценка (МНС I) для эталонной последовательности минимального эпитопа) / (% ранговая оценка (МНС I) для минимального эпитопа), ниже 20, например, ниже 3, например, ниже 1. Неоэпитопы считаются потенциально клинически значимыми, если дифференциальный показатель связывания минимальных эпитопов равен или больше 1, например, равен или больше 3, например, равен или больше 20.

Если неоэпитоп содержит только один минимальный эпитоп, связывающийся с МНС I, дифференциальный показатель МНС I-связывания неоэпитопа равен дифференциальному показателю МНС I-связывания указанного минимального эпитопа. Если неоэпитоп содержит два или более минимальных эпитопа, связывающихся с МНС I, дифференциальный показатель МНС I-связывания неоэпитопа считается равным наивысшему дифференциальному показателю МНС I-связывания среди указанных двух или более минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I. Аналогичным образом, если неоэпитоп содержит только один минимальный эпитоп, связывающийся с МНС II, дифференциальный показатель МНС II-связывания неоэпитопа равен дифференциальному показателю МНС II-связывания указанного минимального эпитопа. Если неоэпитоп содержит два или несколько минимальных эпитопов, связывающихся с МНС II, дифференциальный показатель МНС II-связывания неоэпитопа считается равным наивысшему дифференциальному показателю МНС II-связывания среди указанных двух или более минимальных эпитопов, связывающихся с МНС II. Это верно и в отношении эталонных пептидов.

В некоторых вариантах осуществления также учитывается положение мутации. Другими словами, клиническая применимость неоэпитопа или минимального эпитопа определяется не только в свете вышеизложенного, но также как функция позиции мутации. В предпочтительных вариантах осуществления мутация является иммуногенной. Пептид-связывающая бороздка молекул МНС вмещает пептиды или фрагменты пептидов, обычно длиной 9 аминокислот, то есть минимальные эпитопы. Контакт между минимальным эпитопом и молекулой МНС опосредуется боковыми цепями якорных остатков. Принимая в качестве примера минимальный эпитоп длиной 9 аминокислот, якорными позициями минимального эпитопа для молекулы МНС I являются позиции 2 и 9. Для связывания с молекулами МНС II якорными позициями являются позиции 1, 4 и 9.

В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы, содержащие минимальные эпитопы, в которых мутация находится в неякорной позиции, исключены или имеют пониженный приоритет независимо от их дифференциального показателя связывания. Для минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, это означает, что в некоторых вариантах осуществления неоэпитопы исключены или имеют пониженный приоритет, если мутация находится в позиции 1, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 минимального эпитопа или части минимального эпитопа, который размещается внутри связывающей бороздки молекулы МНС, независимо от того, насколько велик дифференциальный показатель связывания. Предпочтительные неоэпитопы содержат минимальные эпитопы с мутацией в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания равен или больше 2, например, равен или больше 4, например, равен или больше 6, например, равен или больше 8, например, равен или больше 10, например, равен или больше 12, например, равен или больше 14, например, равен или больше 16, например, равен или больше 18, наиболее предпочтительно, например, равен или больше 20.

Дифференциальный показатель связывания MHCII также может использоваться в качестве критерия выбора. Дифференциальный показатель связывания MHCII между эталонным пептидом и неоэпитопом задается следующей формулой: (% ранговая оценка (МНС II) для эталонной последовательности минимального эпитопа) / (% ранговая оценка (МНС II) для минимального эпитопа), в которой % ранговая оценка (МНС II) для минимального эпитопа представляет собой прогнозируемую аффинность связывания для минимального эпитопа с лучшим рангом в неоэпитопе, и % ранговая оценка (МНС II) для эталона представляет собой прогнозируемую аффинность связывания для соответствующего пептида в эталонной последовательности.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения стадия b или с способа, описанного выше, дополнительно включает определение дифференциального показателя МНС II-связывания, заданного формулой (% ранговая оценка (МНС II) для эталонной последовательности минимального эпитопа) / (% ранговая оценка (МНС II) для минимального эпитопа), где неоэпитопы с большим дифференциальным показателем МНС II-связывания ранжируются выше, чем неоэпитопы с более низким дифференциальным показателем МНС II-связывания.

Подобным образом, дифференциальный показатель МНС П-связывания между эталонным пептидом и минимальным эпитопом определяется по следующей формуле: (% ранговая оценка (МНС II) для эталона) / (% ранговая оценка (МНС II) для минимального эпитопа), в которой % ранговая оценка (МНС II) для эталона представляет собой предсказанную аффинность связывания между эталонным пептидом и молекулами МНС II и % ранговая оценка (МНС II) для минимального эпитопа представляет собой предсказанную аффинность связывания между минимальным эпитопом пептидом и молекулами МНС II.

Способы определения аффинности связывания с МНС II описаны выше.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения неоэпитопы, содержащие минимальные эпитопы, связывающие МНС II, которые предположительно связываются с МНС II с % ранговой оценкой (МНС II) ниже 20, такой как ниже 15, такой как ниже 14, такой как, например, ниже 13, ниже 12 или, например, ниже 11, исключены или имеют пониженный приоритет.

В предпочтительном варианте осуществления неоэпитопы, содержащие минимальные эпитопы, связывающие МНС II, с % ранговой оценкой (МНС II) ниже 10, исключены или имеют пониженный приоритет.

В другом варианте осуществления неоэпитопы, содержащие минимальные эпитопы, связывающие МНС II, с % ранговой оценкой (МНС II) на уровне 9 или ниже, например, на уровне 8 или ниже, таком как, например, на уровне 7 или ниже, на уровне 6 или ниже, таком как на уровне 5 или ниже, таком как, например, на уровне 4 или ниже, на уровне 3 или ниже или, например, на уровне 2 или ниже, исключены или имеют пониженный приоритет.

Пример схемы подсчета, которую можно использовать на стадии описанного выше способа, например, на стадии d, приведен ниже:

• минимальный эпитоп, имеющий мутацию с дифференциальным показателем связывания <1 независимо от позиции мутации: оценка равна 1;

• минимальный эпитоп, имеющий мутацию в неякорной позиции, и 1 ≤ дифференциальный показатель связывания <3: оценка равна 2;

• минимальный эпитоп, имеющий мутацию в якорной позиции и 1 ≤ дифференциальный показатель связывания <3: оценка равна 3;

• минимальный эпитоп, имеющий мутацию в неякорной позиции и 3 ≤ дифференциальный показатель связывания <20: оценка равна 4;

• минимальный эпитоп, имеющий мутацию в якорной позиции и 3 ≤ дифференциальный показатель связывания <20: оценка равна 5;

• минимальный эпитоп, имеющий мутацию в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания >20: оценка равна 6;

• минимальный эпитоп, имеющий мутацию в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания >20: оценка равна 7.

Дифференциальный показатель связывания может быть дифференциальным показателем связывания MHCI или MHCII.

Следует понимать, что приведенные выше оценки являются произвольными значениями и могут быть заменены другими произвольными значениями, если оценка увеличивается, как проиллюстрировано выше. В целом, как можно видеть, минимальные эпитопы или эпитопы, имеющие низкий дифференциальный показатель связывания (например, менее 1), имеют самый низкий ранг, независимо от позиции мутации. Для минимальных эпитопов или эпитопов, имеющих дифференциальный показатель связывания в одном и том же диапазоне (например, 1 ≤ дифференциальный показатель связывания <3; или 3 ≤ дифференциальный показатель связывания < 20; или дифференциальный показатель связывания > 20), минимальные эпитопы или неоэпитопы, содержащие мутацию в якорной позиции, оцениваются выше, чем минимальные эпитопы или неоэпитопы, содержащие мутацию в неякорной позиции. Как правило, чем выше дифференциальный показатель связывания, тем выше оценка. Для аналогичных оценок мутация в неякорной позиции дает более высокую оценку, чем мутация в неякорной позиции.

В приведенной выше схеме подсчета минимальные эпитопы с наименьшим рангом либо имеют мутацию в неякорной позиции, либо имеют мутацию в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания < 1.

Длина неоэпитопов

Последовательность неоэпитопа предпочтительно имеет длину, подходящую для процессинга и представления минимальных эпитопов, содержащихся в неоэпитопе, на молекулах МНС.Таким образом, в одном варианте осуществления неоэпитопы имеют длину от 7 до 40 аминокислот, например, от 10 до 35 аминокислот, или более предпочтительно от 15 до 30 аминокислот, например, от 25 до 30 аминокислот.В предпочтительном варианте осуществления неоэпитоп состоит из 27 аминокислот.Длины неоэпитопов включают длины неоэпитопов, связывающих как МНС I, так и МНС II.

Предпочтительно, чтобы мутация располагалась по существу в середине последовательности неоэпитопа.

В некоторых вариантах осуществления минимальные эпитопы для данного неоэпитопа состоят из числа аминокислот, меньшего или равного числу аминокислот неоэпитопа. В случаях, когда неоэпитоп является минимальным эпитопом, неоэпитоп и минимальный эпитоп имеют одинаковую длину. В таких вариантах осуществления минимальный эпитоп имеет длину от 7 до 40 аминокислот, например, от 10 до 35 аминокислот, или более предпочтительно от 15 до 30 аминокислот, например, от 25 до 30 аминокислот.В одном варианте осуществления длина минимального эпитопа составляет 27 аминокислот.Длины минимальных эпитопов включают длины неоэпитопов, связывающих как МНС I, так и МНС II.

В других вариантах осуществления минимальные эпитопы, содержащиеся в неоэпитопе, короче неоэпитопа. Например, неоэпитоп имеет длину от 7 до 40 аминокислот и соответствующий минимальный эпитоп(ы) имеет длину от 6 до 39 аминокислот или имеет длину короче, чем длина неоэпитопа, по меньшей мере на одну аминокислоту, например, по меньшей мере на 2 аминокислоты, например, по меньшей мере на 3 аминокислоты, например, по меньшей мере на 4 аминокислоты, например, по меньшей мере на 5 аминокислот, например, по меньшей мере на 6 аминокислот, например, по меньшей мере на 7 аминокислот, например, по меньшей мере на 8 аминокислот, например, по меньшей мере на 9 аминокислот, например, по меньшей мере на 10 аминокислот, например, по меньшей мере на 11 аминокислот, например, по меньшей мере на 12 аминокислот, например, по меньшей мере на 13 аминокислот, например, по меньшей мере на 15 аминокислот, например, по меньшей мере на 16 аминокислот, например, по меньшей мере на 17 аминокислот, например, по меньшей мере на 18 аминокислот, например, по меньшей мере на 19 аминокислот, например, по меньшей мере на 20 аминокислот. В предпочтительном варианте неоэпитоп состоит из 27 аминокислот и минимальный эпитоп имеет длину в 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления минимальный эпитоп связывается или, как предсказано, связывается с МНС I, и минимальный эпитоп имеет длину от 5 до 20 аминокислот, например, от 6 до 19 аминокислот, например, от 7 до 18 аминокислот, например, от 7 до 17 аминокислот, например, от 7 до 16 аминокислот, например, от 8 до 15 аминокислот, например, от 8 до 14 аминокислот. Обычно такие минимальные эпитопы имеют длину от 8 до 14 аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления минимальный эпитоп связывается или, как предсказано, связывается с МНС II, и минимальный эпитоп имеет длину от 5 до 20 аминокислот, например, от 6 до 19 аминокислот, например, от 7 до 18 аминокислот, например, от 7 до 17 аминокислот, например, от 8 до 16 аминокислот, например, от 9 до 15 аминокислот. Обычно такие минимальные эпитопы имеют длину от 9 до 15 аминокислот.

Сходство с известными эпитопами, распознаваемыми Т-клетками

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию отбора группы неоэпитопов, которые содержат минимальные эпитопы с высоким сходством с эпитопами, о которых известно, что они распознаются Т-клетками. Специалист знает, где найти списки таких эпитопов. Например, эпитопы, о которых известно, что они распознаются Т-клетками, можно получить из базы данных иммунных эпитопов и ресурса для анализа (Immune Epitope Database and Analysis Resource, база данных IEDB), где перечислены инфекционные эпитопы человека (https://www.iedb.org/). Для последовательностей минимальных эпитопов, содержащихся в неоэпитопах, которые, как считается, могут иметь клиническое применение, может быть проведено сравнение с базой данных с тем, чтобы определить, имеют ли минимальные эпитопы высокое сходство с эпитопами, о которых известно, что они распознаются Т-клетками.

Термин «высокая степень сходства» в применении к двум последовательностям означает, что последовательности имеют значительное сходство, то есть сумма идентичных и похожих совпадений высока. Сходство может быть определено путем вычисления оценки выравнивания, например, с помощью BLOSUM62. Специалист в данной области техники знает, какое пороговое значение оценок выравнивания можно использовать для определения того, имеют ли две последовательности большое сходство друг с другом. К примеру, для 9-мерных эпитопов, оценка выравнивания > 26 может точно использоваться в качестве порогового значения для отбора эпитопов с высоким сходством.

Нормированные оценки выравнивания также можно использовать для оценки того, имеют ли две пептидные последовательности высокую степень сходства друг с другом. Например, нормированная оценка выравнивания может быть оценкой выравнивания по BLOSUM62, полученной для заданного минимального эпитопа и заданного эпитопа в базе данных IEDB, деленной на оценку выравнивания между указанным минимальным эпитопом и им самим (что соответствует максимальной оценке выравнивания для данного минимального эпитопа). Для того, чтобы получить меру сходства, результат затем вычитают из 1. Другими словами, может быть выполнено следующее вычисление:

Сходство с известным эпитопом = 1 - (оценка выравнивания минимального эпитопа) / (оценка выравнивания известного эпитопа)

Чем выше оценка, тем выше сходство с известным эпитопом.

Число всех минимальных эпитопов

Применимые неоэпитопы содержат по меньшей мере один минимальный эпитоп, содержащий мутацию, например, иммуногенную мутацию, и имеющий длину от 5 до 20 аминокислот, предпочтительно от 6 до 19 аминокислот, например, от 7 до 18 аминокислот, например, от 8 до 17 аминокислот, например, от 9 до 16 аминокислот, например, от 10 до 15 аминокислот, например, от 11 до 14 аминокислот, например, 12 или 13 аминокислот, например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот. Предпочтительно минимальный эпитоп имеет длину от 8 до 14 аминокислот. Неоэпитоп может включать несколько минимальных эпитопов, которые могут перекрываться. Таким образом, неоэпитоп может содержать от 1 до 100 минимальных эпитопов, например, от 1 до 90 минимальных эпитопов, например, от 1 до 80 минимальных эпитопов, например, от 1 до 70 минимальных эпитопов, например, от 1 до 60 минимальных эпитопов, например, от 1 до 50 минимальных эпитопов, например, от 1 до 40 минимальных эпитопов, например, от 1 до 30 минимальных эпитопов, например, от 1 до 20 минимальных эпитопов, например, от 2 до 19 минимальных эпитопов, например, от 3 до 18 минимальных эпитопов, например, от 4 до 17 минимальных эпитопов, например, от 5 до 16 минимальных эпитопов, например, от 6 до 15 минимальных эпитопов, например, от 7 до 14 минимальных эпитопов, например, от 8 до 13 минимальных эпитопов, например, от 9 до 12 минимальных эпитопов, например, 10 или 11 минимальных эпитопов, все из которых содержат иммуногенную мутацию. Минимальный эпитоп обладает аффинностью к молекуле МНС, такой как молекула МНС I или молекула МНС II. Мутация, содержащаяся в неоэпитопе, не обязательно сосредоточена в минимальном эпитопе, но в некоторых вариантах осуществления может быть сосредоточена в минимальном эпитопе. Таким образом, мутация может относиться к первому или последнему остатку минимального эпитопа или любому другому остатку между ними. Как описано выше, в предпочтительных вариантах осуществления мутация находится в якорной позиции. В некоторых вариантах осуществления минимальные эпитопы, имеющие мутацию в неякорной позиции, исключены или имеют пониженный приоритет.

В целом, неоэпитоп может содержать п различных минимальных эпитопов, имеющих длину к аминокислот, все из которых содержат мутацию. Данный неоэпитоп может содержать минимальные эпитопы разной длины.

Вероятность возникновения мутации в природе

В предпочтительном варианте осуществления способ по настоящему изобретению дополнительно включает стадию определения вероятности того, что мутация, присутствующая в неоэпитопах, встречается в природе. Изменение аминокислоты в белке может снизить его способность выполнять свою функцию или даже изменить функцию. Изменения белков, имеющие важные функции в клетке, потенциально могут привести к ее гибели. И наоборот, изменение может позволить клетке продолжать функционировать, хотя и иным образом, и может даже привести к эффективным/выгодным модификациям по сравнению с исходным белком, позволяя передать мутацию потомству организма. Если изменение не приводит к какому-либо значительному физическому ущербу для потомства, вероятность того, что мутация сохранится в популяции, тем не менее существует. Поскольку аминокислоты сильно различаются по физическим и химическим свойствам, они делятся на группы со схожими свойствами. Замена одной аминокислоты другой аминокислотой из той же группы с большей вероятностью окажет меньшее влияние на структуру и функцию белка, чем замена аминокислотой из другой категории. Таким образом, неоэпитопы, содержащие мутантную аминокислоту, которая принадлежит к иной физико-химической группе, чем эталонная аминокислота, в некоторых вариантах осуществления имеют приоритет над неоэпитопами, содержащими мутантную аминокислоту, которая принадлежит к той же физико-химической группе, что и эталонная аминокислота.

Предпочтительно мутация приводит к замене аминокислоты. Термин «пара замещения» в контексте настоящего описания относится к паре, состоящей из заменяемой аминокислоты и аминокислоты, которая ее замещает.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения стадия d способа, описанного в данном документе здесь и выше, дополнительно включает определение показателя, отражающего сходство между мутированной аминокислотной последовательностью и эталонной аминокислотной последовательностью.

Чтобы вычислить показатель для конкретной аминокислотной замены, можно использовать матрицы замен. Матрицы замен содержат вероятность или логарифмический показатель, основанные на наблюдаемых частотах мутаций во всех доступных белковых последовательностях. Чем ниже логарифмическая оценка шансов (log odds score), тем меньше вероятность наблюдать данную аминокислотную замену при сравнении встречающихся в природе аминокислотных последовательностей друг с другом. Также было показано, что низкая логарифмическая оценка шансов хорошо коррелирует с большими различиями в физико-химических свойствах пары аминокислотных замен. Например, замена с низкой логарифмической оценкой шансов или более низкой вероятностью/частотой возникновения данной мутации с эволюционной точки зрения имеет более шансов быть обнаруженной Т-клеточным рецептором, чем замена с высокой логарифмической оценкой шансов из-за больших различий в физико-химических свойствах вновь образованного мутантного пептида (эпитопа) по сравнению с эталонным пептидом. Т-клеточные рецепторы обладают способностью толерировать не только собственные пептиды, но также пептиды с высоким сходством с собственными пептидами, то есть пептиды, имеющие мутации с высоким показателем логарифмических различий. Данный механизм известен как центральная толерантность.

Вероятности, использованные при расчете матрицы рассчитываются путем просмотра «блоков» консервативных последовательностей, обнаруженных при множественном выравнивании белковых последовательностей. Предполагается, что данные консервативные последовательности имеют функциональное значение в родственных белках и, следовательно, будут иметь более низкие скорости замены, чем менее консервативные области. Чтобы уменьшить систематическую ошибку в отношении скоростей замен, обусловленную близкородственными последовательностями, сегменты блоках с идентичностью последовательностей выше определенного порога были сгруппированы, уменьшая статистический вес каждого такого кластера (Henikoff, S; Henikoff, JG (1992). «Amino acid substitution matrices from protein blocks». Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (22): 10915-9.). Для матрицы BLOSUM62 данный порог был установлен на уровне 62%. Затем подсчитывались частоты пар между кластерами, следовательно, пары считались только между сегментами, идентичными менее чем на 62%. Можно использовать матрицу BLOSUM с большим цифровым показателем для выравнивания двух близкородственных последовательностей и меньшим цифровым показателем для более дивергирующих последовательностей.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения оценка, отражающая вероятность того, что аминокислотная замена, присутствующая в неоэпитопах, происходит случайным образом, определяется с использованием матрицы оценок на основе эволюционной модели. В более предпочтительном варианте осуществления упомянутая матрица оценок представляет собой логарифмическую матрицу шансов. В особенно предпочтительном варианте осуществления указанная матрица представляет собой матрицу BLOSUM, предпочтительно матрицу BLOSUM62.

Для вычисления матрицы BLOSUM используется следующее уравнение:

Sij=(1/λ)*log(ρ_ij/(q_i*q_j))

ри представляет собой вероятность того, что две аминокислоты i и j заменят друг друга в гомологичной последовательности, и q_i и q_j представляют собой фоновые вероятности обнаружения аминокислот i и j в любой белковой последовательности. Коэффициент λ представляет собой коэффициент масштабирования, установленный таким образом, чтобы матрица содержала легко вычисляемые целочисленные значения.

Неоэпитопы, содержащие мутацию, в которой пара аминокислотных замен имеет низкую оценку по BLOSUM62, ранжируются выше неоэпитопов с парой аминокислотных замен с более высокой оценкой по BLOSUM62.

В одном варианте осуществления неоэпитопы, не содержащие мутаций, связанных с парой аминокислотных замен с оценкой по BLOSUM62 ниже 3, такой как, например, ниже 2, имеют пониженный приоритет или исключаются.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения неоэпитопы, не содержащие пары аминокислотных замен с оценкой по BLOSUM62 ниже 1, имеют пониженный приоритет или исключаются. Таким образом, предпочтительно неоэпитопы, содержащие по меньшей мере одну пару аминокислотных замен с оценкой по BLOSUM62 ниже 1, являются приоритетными или выбираются для клинического применения.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения неоэпитопы, не содержащие пары аминокислотных замен с оценкой по BLOSUM62 ниже 1, имеют пониженный приоритет или исключаются. Таким образом, в одном варианте осуществления неоэпитопы, содержащие по меньшей мере одну пару аминокислотных замен с оценкой по BLOSUM62 ниже 1, являются приоритетными или выбираются для клинического применения.

Для отбора МНС I-связывающих неоэпитопов для потенциального клинического применения предпочтительно, чтобы неоэпитоп соответствовал по меньшей мере одному из следующих двух критериев i и ii:

i. высокий дифференциальный показатель МНС I-связывания

ii. низкая оценка по BLOSUM62.

В одном варианте осуществления МНС I-связывающие неоэпитопы, соответствующие по меньшей мере одному из следующих двух критериев i и ii:

i. дифференциальный показатель МНС I-связывания для неоэпитопа выше 1;

ii. неоэпитоп содержит аминокислотную замену с оценкой по BLOSUM62 ниже 3, например, ниже 2, предпочтительно ниже 1

ранжируются выше, чем МНС I-связывающие неоэпитопы, не соответствующие ни одному из критериев i и ii.

В предпочтительном варианте осуществления МНС I-связывающие неоэпитопы, соответствующие по меньшей мере одному из следующих двух критериев i и ii:

i. дифференциальный показатель МНС I-связывания для неоэпитопа выше 3;

ii. неоэпитоп содержит аминокислотную замену с оценкой по BLOSUM62 ниже 3, например, ниже 2, предпочтительно ниже 1 ранжируются выше, чем МНС I-связывающие неоэпитопы, не соответствующие ни одному из критериев i и ii.

В еще более предпочтительном варианте осуществления МНС I-связывающие неоэпитопы, соответствующие по меньшей мере одному из следующих двух критериев i и ii:

i. дифференциальный показатель МНС I-связывания для неоэпитопа выше 2;

ii. неоэпитоп содержит пару аминокислотных замен с оценкой по BLOSUM62 ниже 3, например, ниже 2, предпочтительно ниже 1 ранжируются выше, чем неоэпитопы, связывающие МНС I, не соответствующие ни одному из критериев i и ii.

В некоторых вариантах осуществления МНС I-связывающие неоэпитопы, не соответствующие ни одному из критериев i и ii, указанных выше, предпочтительно исключены или имеют пониженный приоритет. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления МНС I-связывающие неоэпитопы, соответствующие критерию i, но в которых мутация не находится в якорной позиции, исключены или имеют пониженный приоритет, как описано в данном документе выше.

Для отбора МНС II-связывающих неоэпитопов для потенциального клинического применения предпочтительно, чтобы неоэпитоп соответствовал по меньшей мере одному из следующих двух критериев i и ii:

i. высокий дифференциальный показатель МНС II-связывания

ii. низкая оценка по BLOSUM62.

В одном варианте осуществления МНС II-связывающие неоэпитопы, соответствующие по меньшей мере одному из следующих двух критериев i и ii:

i. дифференциальный показатель МНС II-связывания для неоэпитопа выше 2;

ii. неоэпитоп содержит пару аминокислотных замен с оценкой по BLOSUM62 ниже 3, например, ниже 2, предпочтительно ниже 1

ранжируются выше, чем МНС II-связывающие неоэпитопы, не соответствующие ни одному из критериев i и ii.

В предпочтительном варианте осуществления МНС II-связывающие неоэпитопы, соответствующие по меньшей мере одному из следующих двух критериев i и ii:

i. дифференциальный показатель МНС II-связывания для неоэпитопа выше 3;

ii. неоэпитоп содержит пару аминокислотных замен с оценкой по BLOSUM62 ниже 3, например, ниже 2, предпочтительно ниже 1

ранжируются выше, чем МНС II-связывающие неоэпитопы, не соответствующие ни одному из критериев i и ii.

В еще более предпочтительном варианте осуществления МНС II-связывающие неоэпитопы, соответствующие по меньшей мере одному из следующих двух критериев i и ii:

i. дифференциальный показатель МНС II-связывания для неоэпитопа выше 2;

ii. неоэпитоп содержит пару аминокислотных замен с оценкой по BLOSUM62 ниже 1

ранжируются выше, чем МНС II-связывающие неоэпитопы, не соответствующие ни одному из критериев i и ii.

МНС II-связывающие неоэпитопы, не соответствующие ни одному из критериев i и ii, указанных выше, предпочтительно исключены или имеют пониженный приоритет. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления МНС II-связывающие неоэпитопы, соответствующие критерию i, но в которых мутация не находится в якорной позиции, исключены или имеют пониженный приоритет, как описано в данном документе выше.

Уровень экспрессии РНК

Уровень экспрессии РНК исходного гена, в котором обнаружена мутация, может быть важным фактором иммуногенности неоэпитопа. Более высокий уровень экспрессии РНК обычно приводит к более высокой экспрессии белка и презентации неоэпитопа на молекулах МНС на опухолевой клетке и, таким образом, к более высокому потенциалу индукции онкоспецифической иммуногенности.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления способ по настоящему изобретению дополнительно включает стадию определения уровней экспрессии РНК неоэпитопов.

В общем, неоэпитопы с высоким уровнем экспрессии РНК получает более высокий ранг, чем неоэпитопы с более низким уровнем экспрессии РНК.

В конкретном варианте осуществления на стадии d настоящих способов МНС I-связывающие неоэпитопы с высоким уровнем экспрессии РНК ранжируются выше, чем МНС I-связывающие неоэпитопы с более низким уровнем экспрессии РНК. В другом конкретном варианте осуществления МНС II-связывающие неоэпитопы с высоким уровнем экспрессии РНК ранжируются выше, чем МНС II-связывающие неоэпитопы с более низким уровнем экспрессии РНК.

Предпочтительно неоэпитопы, для которых не обнаруживается РНК исходного гена, исключены или имеют пониженный приоритет. В частности, неоэпитопы, имеющие нормализованную экспрессию на уровне транскриптов, равную 0 транскриптов на миллион (ТРМ), исключены или имеют пониженный приоритет. Транскрипты, имеющие детектируемую нормализованную экспрессию на уровне транскриптов, например, экспрессию на уровне транскриптов выше 0 ТРМ, не исключаются.

Уровни экспрессии РНК можно определить путем секвенирования РНК нуклеиновых кислот, полученных из образцов опухоли, как определено выше. Секвенирование РНК может быть выполнено способами, известными в данной области техники. Способы определения уровней экспрессии РНК хорошо известны специалисту. Например, уровни экспрессии РНК могут быть определены с использованием технологий секвенирования следующего поколения, таких как, например, платформа Illumina.

Риск аутоиммунитета

Чтобы свести к минимуму риск перекрестной реактивности, предпочтительно, чтобы неоэпитопы, содержащие встречающийся в природе коровый пептид (такой как пептид длиной 9 аминокислот, включая мутацию), который соответствует пептидной последовательности в протеоме человека, были исключены или имели пониженный приоритет.Таким образом, способы по настоящему изобретению могут дополнительно включать стадию сравнения пептидных последовательностей неоэпитопа с пептидными последовательностями протеома человека.

Под протеомом человека в данном документе понимаются все продукты трансляции, происходящие от известных генов человеческого генома. Известные гены опубликованы на сайте www.ensembl.org. Таким образом, с целью определения, совпадает ли пептидная коровая последовательность неоэпитопа с пептидной последовательностью в протеоме человека, последовательности можно сравнивать с пептидными последовательностями генома человека, полученными из базы данных.

Последовательности коровых пептидов неоэпитопов содержатся в неоэпитопах, как описано выше. Неоэпитопы, содержащие пептидную последовательность, включая мутацию, которая соответствует природной пептидной последовательности в протеоме человека, предпочтительно будут исключены или их приоритет будет понижен.

Это связано с тем, что, не ограничиваясь теорией, ожидается, что мутации, соответствующие природной пептидной последовательности, подвергаются большему риску переносимости Т-клеточными рецепторами как результат центральной толерантности и, таким образом, считаются менее иммуногенными, чем мутации, которые не соответствуют встречающейся в природе последовательности.

В одном варианте осуществления последовательность корового пептида неоэпитопа, которая сравнивается с пептидными последовательностями генома человека, содержит или состоит из от 9 до 27 аминокислот, например, от 10 до 25 аминокислот, например, от 11 до 15 аминокислот или например, из 12, 13 или 14 аминокислот.

В одном варианте осуществления пептидная последовательность неоэпитопа, которую сравнивают с пептидными последовательностями генома человека, содержит или состоит из от 5 до 15 аминокислот, например, от 6 до 12 аминокислот, предпочтительно от 7 до 11 аминокислот или более предпочтительно от 8 до 10 аминокислот.

В предпочтительном варианте осуществления указанная пептидная последовательность неоэпитопа, которую сравнивают с пептидными последовательностями генома человека, содержит или состоит из 9 аминокислот.

В другом варианте осуществления указанная пептидная последовательность неоэпитопа, которую сравнивают с пептидными последовательностями генома человека, включает или состоит из 15 аминокислот, 14 аминокислот, 13 аминокислот, 12 аминокислот, 11 аминокислот или, например, 10 аминокислот.

Пептидная последовательность неоэпитопа содержит мутацию неоэпитопа. В предпочтительном варианте осуществления указанная мутация представляет собой аминокислотную замену. Специалисту будет ясно, что вместо сравнения последовательности данного неоэпитопа с пептидными последовательностями генома человека, можно сравнить последовательность минимальных эпитопов, содержащихся в указанном неоэпитопе, с пептидными последовательностями генома человека.

Чтобы дополнительно минимизировать риск органоспецифического аутоиммунитета, неоэпитопы, которые обнаруживаются в генах, которые имеют высокий уровень экспрессии в конкретных органах/тканях, будут исключены или будут иметь пониженный приоритет в некоторых вариантах осуществления.

В одном варианте осуществления неоэпитопы или минимальные эпитопы, присутствующие в генах, где указанные гены демонстрируют по меньшей мере в 3 раза, например, по меньшей мере в 4 раза более высокий уровень экспрессии РНК в любом органе по сравнению с другими тканями, исключены или имеют пониженный приоритет.

В предпочтительном варианте неоэпитопы или минимальные эпитопы, такие как МНС I- и/или МНС II-связывающие неоэпитопы, присутствующие в генах, где указанные гены демонстрируют по меньшей мере в 5 раз более высокий уровень экспрессии РНК в любом органе по сравнению с другими тканями, исключены или имеют пониженный приоритет.

В другом варианте осуществления неоэпитопы или минимальные эпитопы, такие как МНС I- и/или МНС II-связывающие неоэпитопы, присутствующие в генах, где указанные гены демонстрируют по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз или, например, по меньшей мере в 8 раз более высокий уровень экспрессии РНК в любом органе по сравнению с другими тканями, исключены или имеют пониженный приоритет.

Предпочтительно, чтобы орган и ткань принадлежали к одному виду, например, человеку. Уровни экспрессии РНК можно, например, получить из таких баз данных, как, например, www.gtexportal.org. Уровни экспрессии РНК также описаны в М. et al. (2015) ( М. et al. (2015) "Proteomics. Tissue-based map of the human proteome." Science; 347(6220)). В качестве альтернативы, уровни экспрессии РНК получают от индивидуума, от которого происходят неоэпитопы.

Например, орган может быть выбран из сердца и мозга. В другом варианте осуществления указанный орган выбран из печени, легких, желудка, почек, селезенки, толстой кишки и кишечника.

Частота аллелей

В одном варианте осуществления способы по настоящему изобретению включают в себя стадию определения частоты аллеля по мутации, присутствующей в каждом неоэпитопе. Термин «частота аллелей», используемый в данном документе, относится к относительной частоте последовательности аллелей, содержащей конкретную геномную мутацию в конкретном локусе, по сравнению с общим числом последовательностей для всех аллелей в данной конкретной области генома. Термин «частота мутантного аллеля» относится к частоте аллелей, содержащих мутацию или мутацию неоэпитопа, и используется в данном документе взаимозаменяемо с термином «частота вариантного аллеля» (variant allele frequency (VAF)). В целом, высокая частота мутантных аллелей или VAF указывает на более высокую клиническую применимость. Высокая частота мутантных аллелей или VAF указывает на более высокую долю раковых клеток, содержащих ту же мутацию. Таким образом, не ограничиваясь теорией, можно ожидать, что неоэпитопы, имеющие высокую частоту аллелей или VAF, будут присутствовать в более высокой доле раковых клеток, чем неоэпитопы, имеющие низкую частоту мутантных аллелей или VAF.

В конкретном варианте осуществления МНС I-связывающие неоэпитопы с высокой частотой мутантных аллелей или VAF, ранжируются выше, чем МНС I-связывающие неоэпитопы с более низкой частотой мутантных аллелей или VAF. В другом конкретном варианте осуществления МНС II-связывающие неоэпитопы с высокой частотой мутантного аллеля или VAF ранжируются выше, чем МНС II-связывающие неоэпитопы с более низкой частотой мутантного аллеля или VAF.

Частоту мутантного аллеля можно, например, определить путем анализа данных секвенирования из образцов опухоли и сравнения частоты мутантного аллеля с другими аллелями, присутствующими в том же гене.

В некоторых вариантах осуществления частота мутантного аллеля или VAF более 0,05 указывает на клиническую применимость минимального эпитопа или неоэпитопа, содержащего указанную мутацию. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления неоэпитоп или минимальный эпитоп, содержащий мутацию, имеющую VAF более 0,05, например, более 0,06, например, более 0,07, например, более 0,08, например, более 0,09, например, более 0,1, например, более 0,15, например, более 0,20, оценивается выше, чем неоэпитоп или минимальный эпитоп, содержащий мутацию, имеющую VAF, равную или менее 0,05, например, равную или менее 0,06, например, равную или менее 0,07, например, равную или менее 0,08, например, равную или менее 0,09, например, равную или менее 0,1, например, равную или менее 0,15, например, равную или менее 0,20, соответственно.

Определитель вариантов

В данной области техники доступно множество типов программного обеспечения для идентификации соматических мутаций (определители вариантов, «variant callers»). В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы или минимальные эпитопы считаются имеющими клиническое применение, если содержащиеся в них мутации идентифицированы по меньшей мере двумя различными определителями вариантов. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления неоэпитопы или минимальные эпитопы ранжируются в зависимости от того, сколько определителей вариантов идентифицируют мутацию (мутации), которые они содержат.Неоэпитопы или минимальные эпитопы, содержащие мутацию (мутации), которые идентифицированы по меньшей мере двумя различными определителями вариантов, ранжируются выше, чем неоэпитопы или минимальные эпитопы, содержащие мутацию (мутации), которые идентифицируются только одним определителем вариантов. В некоторых вариантах осуществления мутация идентифицируется по меньшей мере 3 различными определителями вариантов, такими как по меньшей мере 4 различными определителями вариантов, например, по меньшей мере 5 различными определителями вариантов, например, по меньшей мере 6 различными определителями вариантов, например, по меньшей мере 7 различными определителями вариантов, например, по меньшей мере 8 различными определителями вариантов, например, по меньшей мере 9 различными определителями вариантов, например, 10 различными определителями вариантов или более.

Сходство с известным, связанным с раком геном

В некоторых вариантах осуществления приоритет отдается неоэпитопам, которые возникают из известного, связанного с раком гена.

Связанный с раком ген определяется как ген, который участвует в развитии рака. Связанные с раком гены можно найти, например, в базе данных «Каталог соматических мутаций при раке» (Catalogue Of Somatic Mutations in Cancer, COSMIC) или в других базах данных, содержащих тщательно подобранный список связанных с раком мутаций и/или генов, как известно квалифицированному специалисту. Таким образом, совпадение с известным, связанным с раком геном может быть обнаружено путем сравнения исходного гена неоэпитопа, положения в геноме или положения варианта (HGVS-номенклатура) с соответствующей информацией в базе данных COSMIC.

В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы считаются имеющими клиническое применение, если ген, в который они входят, является геном, который, как известно, связан с раком. Таким образом, такие неоэпитопы имеют приоритет над неоэпитопами, содержащимися в генах, которые, как известно, не связаны с раком.

Клональность

Используемый в данном документе термин «клональность» относится к появлению неоэпитопа в образцах опухоли. Если, например, неоэпитоп или минимальный эпитоп обнаруживается в более чем одной биопсии опухоли, это свидетельствует о высокой клональности и, следовательно, более высокой вероятности присутствия в большинстве раковых клеток и, следовательно, более высокой вероятности их клинического применения.

Клональность неоэпитопа может быть определена путем получения по меньшей мере двух образцов опухоли от одного и того же индивидуума и определения наличия мутации более чем в одной биопсии. Предпочтительно неоэпитопы, обнаруженные в более чем одном образце опухоли, имеют приоритет над неоэпитопами, обнаруженными только в одной биопсии. Под «более чем одним образцом опухоли» понимается несколько образцов, происходящих от одного и того же индивидуума, либо из одного и того же поражения, либо из различных поражений.

В некоторых вариантах осуществления минимальные эпитопы или неоэпитопы, имеющие мутацию, обнаруженную по меньшей мере в двух различных образцах от одного и того же индивидуума, вероятно, будут иметь более высокую клиническую ценность, чем минимальные эпитопы или неоэпитопы, имеющие мутацию, обнаруженную только в одном образце опухоли. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два различных образца представляют собой образцы из:

одной и той же опухоли или опухолевого поражения, например, биопсия под разными углами из одной и той же опухоли или опухолевого поражения по меньшей мере двух различных опухолей или опухолевых поражений по меньшей мере одной опухоли или опухолевого поражения и по меньшей мере одного архивного опухолевого материала, такого как архивная биопсия или архивный резецированный материал из опухоли или опухолевого поражения, где обнаружение минимальных эпитопов или неоэпитопов, содержащих мутацию, по меньшей мере в двух различных образцах указывает на более высокую клиническую ценность. Термин «архивный опухолевый материал» относится к материалу, взятому в более ранние моменты времени из опухолевой ткани у того же индивидуума, например, архивной биопсии или архивному резецированному материалу из опухоли или опухолевого поражения.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два различных образца составляет по меньшей мере три различных образца, например, по меньшей мере четыре различных образца, например, по меньшей мере пять различных образцов, например, по меньшей мере шесть различных образцов, например, по меньшей мере семь различных образцов, например, по меньшей мере восемь различных образцов, например, по меньшей мере, девять различных образцов, например, по меньшей мере, десять различных образцов или больше. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из по меньшей мере двух различных образцов представляет собой архивный опухолевый материал от индивидуума и по меньшей мере один из по меньшей мере двух различных образцов представляет собой образец опухоли или опухолевого поражения.

Жидкие биопсии

При выборе неоэпитопов, содержащих минимальные эпитопы, которые могут иметь клиническое применение, может быть полезным определить, обнаруживаются ли также неоэпитопы или минимальные эпитопы в плазме индивидуума. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления способы включают секвенирование последовательностей нуклеиновых кислот из внеклеточной ДНК, например, циркулирующей опухолевой ДНК в плазме из жидкой биопсии, полученной от индивидуума. Это может быть полезно для идентификации, подтверждения и/или отслеживания неоэпитопов и может быть выполнено, например, путем секвенирования внеклеточной ДНК.

В некоторых вариантах осуществления неоэпитоп, который обнаруживается в циркулирующей опухолевой ДНК в образце плазмы от индивидуума, имеет более высокий ранг, чем неоэпитоп, который не обнаруживается в указанном образце.

Индивидуум

Индивидуум согласно способу настоящего изобретения предпочтительно является человеком. Предпочтительно индивидуум или человек является больным раком. Таким образом, индивидуум предпочтительно является человеком, больным раком. Рак может быть любым типом рака. Предпочтительно у индивидуума есть по меньшей мере одна опухоль.

Раком может быть любой рак, при котором раковые клетки содержат по меньшей мере одну мутацию. Рак может быть первичной опухолью, метастазом или и тем, и другим. Опухоль, исследуемая на мутации, может быть первичной опухолью или метастазом. Подлежащий лечению рак может быть раком, который, как известно, имеет высокую мутационную нагрузку, например, меланомой или раком легких. Подлежащий лечению рак также может быть раком, характеризующимся только одной онкоспецифической мутацией.

Дополнительные критерии

Предпочтительно, чтобы МНС I-связывающие и/или МНС II-связывающие неоэпитопы удовлетворяли по меньшей мере одному из следующих критериев i-vii:

i. высокий уровень экспрессии РНК

ii. высокая частота аллелей

iii. высокая клональность

iv. соответствуют известному, связанному с раком гену

v. содержат мутацию, идентифицированную по меньшей мере двумя различными определителями вариантов

vi. также обнаруживаются в плазме индивидуума, что определяется, например, путем секвенирования внеклеточной ДНК.

vii. обнаруживаются по меньшей мере в двух образцах от одного и того же индивидуума, например, в двух образцах из одного и того же поражения или из двух различных поражений, или по меньшей мере в одной опухоли или поражении и по меньшей мере в одном архивном образце опухолевого материала из опухоли или опухолевого поражения.

Уровень экспрессии РНК, частота аллелей, клональность, соответствие известному, связанному с раком гену, идентификация по меньшей мере двумя различными определителями вариантов, присутствие в плазме индивидуума и присутствие по меньшей мере в двух образцах от одного и того же индивидуума определены в данном описании выше.

В более предпочтительном варианте осуществления МНС I-связывающие и/или МНС II-связывающие неоэпитопы удовлетворяют по меньшей мере двум из следующих критериев i-vii:

i. высокий уровень экспрессии РНК

ii. высокая частота аллелей

iii. высокая клональность

iv. соответствуют известному, связанному с раком гену

v. содержат мутацию, идентифицированную по меньшей мере двумя различными определителями вариантов

vi. также обнаруживаются в плазме индивидуума, что определяется, например, путем секвенирования внеклеточной ДНК.

vii. обнаруживаются по меньшей мере в двух образцах от одного и того же индивидуума, например, в двух образцах из одного и того же поражения или из двух различных поражений, или по меньшей мере в одной опухоли или поражении и по меньшей мере в одном архивном образце опухолевого материала из опухоли или опухолевого поражения.

В еще более предпочтительном варианте осуществления МНС I-связывающие и/или МНС II-связывающие неоэпитопы удовлетворяют по меньшей мере трем из следующих критериев i-vii:

i. высокий уровень экспрессии РНК

ii. высокая частота аллелей

iii. высокая клональность

iv. соответствуют известному, связанному с раком гену

v. содержат мутацию, идентифицированную по меньшей мере двумя различными определителями вариантов

vi. также обнаруживаются в плазме индивидуума, что определяется, например, путем секвенирования внеклеточной ДНК.

vii. обнаруживаются по меньшей мере в двух образцах от одного и того же индивидуума, например, в двух образцах из одного и того же поражения или из двух различных поражений, или по меньшей мере в одной опухоли или поражении и по меньшей мере в одном архивном образце опухолевого материала из опухоли или опухолевого поражения.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения МНС I-связывающие и/или МНС II-связывающие неоэпитопы удовлетворяют по меньшей мере четырем из следующих критериев i-vii:

i. высокий уровень экспрессии РНК

ii. высокая частота аллелей

iii. высокая клональность

iv. соответствуют известному, связанному с раком гену

v. содержат мутацию, идентифицированную по меньшей мере двумя различными определителями вариантов

vi. также обнаруживаются в плазме индивидуума, что определяется, например, путем секвенирования внеклеточной ДНК.

vii. обнаруживаются по меньшей мере в двух образцах от одного и того же индивидуума, например, в двух образцах из одного и того же поражения или из двух различных поражений, или по меньшей мере в одной опухоли или поражении и по меньшей мере в одном архивном образце опухолевого материала из опухоли или опухолевого поражения.

В другом предпочтительном варианте осуществления МНС I-связывающие и/или МНС II-связывающие неоэпитопы удовлетворяют по меньшей мере пяти из следующих критериев i-vii:

i. высокий уровень экспрессии РНК

ii. высокая частота аллелей

iii. высокая клональность

iv. соответствуют известному, связанному с раком гену

v. содержат мутацию, идентифицированную по меньшей мере двумя различными определителями вариантов

vi. также обнаруживаются в плазме индивидуума, что определяется, например, путем секвенирования внеклеточной ДНК.

vii. обнаруживаются по меньшей мере в двух образцах от одного и того же индивидуума, например, в двух образцах из одного и того же поражения или из двух различных поражений, или по меньшей мере в одной опухоли или поражении и по меньшей мере в одном архивном образце опухолевого материала из опухоли или опухолевого поражения.

В другом предпочтительном варианте осуществления МНС I-связывающие и/или МНС II-связывающие неоэпитопы удовлетворяют по меньшей мере шести из следующих критериев i-vii:

i. высокий уровень экспрессии РНК

ii. высокая частота аллелей

iii. высокая клональность

iv. соответствуют известному, связанному с раком гену

v. содержат мутацию, идентифицированную по меньшей мере двумя различными определителями вариантов

vi. также обнаруживаются в плазме индивидуума, что определяется, например, путем секвенирования внеклеточной ДНК.

vii. обнаруживаются по меньшей мере в двух образцах от одного и того же индивидуума, например, в двух образцах из одного и того же поражения или из двух различных поражений, или по меньшей мере в одной опухоли или поражении и по меньшей мере в одном архивном образце опухолевого материала из опухоли или опухолевого поражения.

В другом предпочтительном варианте осуществления МНС I-связывающие и/или МНС П-связывающие неоэпитопы удовлетворяют по меньшей мере всем следующим критериям i-vii:

i. высокий уровень экспрессии РНК

ii. высокая частота аллелей

iii. высокая клональность

iv. соответствуют известному, связанному с раком гену

v. содержат мутацию, идентифицированную по меньшей мере двумя различными определителями вариантов

vi. также обнаруживаются в плазме индивидуума, что определяется, например, путем секвенирования внеклеточной ДНК.

vii. обнаруживаются по меньшей мере в двух образцах от одного и того же индивидуума, например, в двух образцах из одного и того же поражения или из двух различных поражений, или по меньшей мере в одной опухоли или поражении и по меньшей мере в одном архивном образце опухолевого материала из опухоли или опухолевого поражения.

Вышеупомянутые критерии i-vii не перечислены в каком-либо предпочтительном порядке и могут иметь любой приоритет.Уровень экспрессии РНК, частота аллелей, клональность, соответствие известному, связанному с раком гену, идентификация по меньшей мере двумя различными определителями вариантов, присутствие в плазме индивидуума и присутствие по меньшей мере в двух образцах от одного и того же индивидуума определены в данном описании выше.

Таким образом, предпочтительно, МНС I-связывающие и/или МНС II-связывающие неоэпитопы с более высоким уровнем экспрессии РНК ранжируются выше неоэпитопов с более низким уровнем экспрессии РНК.

Предпочтительно, МНС I-связывающие и/или МНС II-связывающие неоэпитопы с более высокой частотой аллелей ранжируются выше неоэпитопов с более низкой частотой аллелей.

Предпочтительно, МНС I-связывающие и/или МНС II-связывающие неоэпитопы с более высокой клональностью ранжируются выше неоэпитопов с более низкой клональностью.

Предпочтительно, МНС I-связывающие и/или МНС II-связывающие неоэпитопы, соответствующие известному, связанному с раком гену, ранжируются выше неоэпитопов, не соответствующих известному, связанному с раком гену.

Предпочтительно, МНС I-связывающие и/или МНС II-связывающие неоэпитопы, содержащие мутации, идентифицированные по меньшей мере двумя различными определителями вариантов, ранжируется выше неоэпитопов, содержащих мутацию, идентифицированную только один определителем вариантов.

Предпочтительно, МНС I-связывающие и/или МНС II-связывающие неоэпитопы, которые найдены в плазме индивидуума, ранжируются выше неоэпитопов, которые не найдены в плазме индивидуума.

Предпочтительно, МНС I-связывающие и/или МНС II-связывающие неоэпитопы, которые находятся в двух или более образцах от того же индивидуума, ранжируются выше неоэпитопов, которые находятся только в одном образце, полученном от индивидуума. Два или более образцов могут быть образцами из одного и того же поражения или из различных поражений, или из по меньшей мере одной опухоли или опухолевого поражения и по меньшей мере одного архивного образца опухолевого материала из опухоли или опухолевого поражения.

Число отобранных неоэпитопов

Неоэпитопы, отобранные для индивидуума, предпочтительно используются в противораковой вакцине, такой как конструкция противораковой вакцины, предпочтительно конструкция нуклеотидной вакцины. Вакцина также называется персонализированной вакциной против рака. Вакцина является иммуногенной.

В способе по настоящему изобретению отбирают А неоэпитопов, имеющих клиническое применение. А неоэпитопов предпочтительно используются в противораковой вакцине или в конструкции противораковой вакцины. Таким образом, А неоэпитопов предпочтительно включены в одну и ту же конструкцию вакцины. Вакцинная конструкция предпочтительно представляет собой нуклеотидную конструкцию. Нуклеотидная конструкция может быть РНК конструкцией и/или ДНК конструкцией. Предпочтительно вакцина представляет собой ДНК конструкцию, также называемую ДНК вакциной, представляющей собой вакцинное антитело (вакцитело, англ. vaccibody).

А представляет собой целое число. Например, А равно по меньшей мере 1, например, по меньшей мере 3, например, по меньшей мере 5, например, по меньшей мере 7, или, например, по меньшей мере 10, например, по меньшей мере 20, например, по меньшей мере 30, например, 40 или более. А может быть заранее определенным числом.

Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что увеличение числа неоэпитопов в конструкциях вакцины от 1 до 3 неоэпитопов или от 3 неоэпитопов до 10 неоэпитопов приводит к неожиданному усилению иммунного ответа. Кроме того, было обнаружено, что увеличение числа неоэпитопов в конструкциях вакцины от 10 неоэпитопов до 15 или 20 неоэпитопов приводит к дальнейшему усилению иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления число неоэпитопов в конструкции вакцины составляет от 20 до 40, например, 30. В некоторых вариантах осуществления число неоэпитопов в конструкции вакцины составляет 40 или более.

В одном варианте осуществления А представляет собой целое число от 3 до 100, такое как от 3 до 75, такое как от 3 до 50, такое как от 3 до 30, такое как от 3 до 20, такое как от 3 до 15 или такое как, например, от 3 до 10 неоэпитопов.

В другом варианте осуществления А представляет собой целое число от 5 до 50, такое как от 5 до 30, такое как, например, от 5 до 25, такое как от 5 до 20, такое как от 5 до 15, такое как от 5 до 10.

В дополнительном варианте осуществления А представляет собой целое число от 10 до 50, такое как от 10 до 40, такое как от 10 до 30, такое как от 10 до 20, такое как от 10 до 25, такое как от 10 до 20 или такое как, например, от 10 до 15.

Неоэпитопы, выбранные настоящими способами, можно использовать для создания вакцин типа «вакцитело», которые подробно описаны ниже. Вакцины, представляющие собой вакцитело, содержат по меньшей мере одну антигенную единицу, нацеливающую единицу и единицу димеризации. Неоэпитопы предпочтительно содержатся в антигенной единице.

Авторы настоящего изобретения показали, что ДНК-вакцины типа «вакцитело» (vaccibody), содержащие 10 неоэпитопов, вызывают более сильный и широкий общий иммунный ответ, чем ДНК-вакцины типа «вакцитело», содержащие только 3 неоэпитопа. Точно так же ДНК-вакцины типа «вакцитело», содержащие 20 неоэпитопов, вызывают более сильный и широкий общий иммунный ответ, чем вакцины, содержащие только 10 неоэпитопов. Однако рак, подлежащий лечению, может быть связан только с одним злокачественным неоэпитопом, и может оказаться невозможным сконструировать вакцину на основе ДНК вакцины, содержащую более одного эпитопа.

В предпочтительном варианте осуществления А представляет собой целое число от 10 до 20.

В другом варианте осуществления А представляет собой целое число от 15 до 50, такое как от 15 до 30 или такое как от 15 до 20.

В конкретном варианте осуществления А равно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40.

В одном варианте осуществления антигенная единица содержит одну копию каждого ракового неоэпитопа, так что, когда в вакцину включены 10 неоэпитопов, может быть вызван клеточно-опосредованный иммунный ответ против 10 различных неоэпитопов.

В способе по настоящему изобретению х неоэпитопов выбраны из числа связывающих МНС I неоэпитопов с наивысшим рангом, тогда как у неоэпитопов выбраны из числа МНС II-связывающих неоэпитопов с наивысшим рангом, где х+у=А. А представляет собой общее число отобранных неоэпитопов. А имеет значение, определенное в данном документе выше.

х и у представляют собой целые числа.

В предпочтительном варианте осуществления х>у. Например, х≥2у. В другом варианте осуществления х>2,5у. В одном варианте осуществления х≥3у.

В одном варианте осуществления 0,5А <х <А, где А такое, как определено выше. Предпочтительно А представляет собой целое число от 10 до 20.

В другом варианте осуществления 0,6А <х <А, например, 0,7А <х <А, например, 0,8А <х <А, где А такое, как определено выше. Предпочтительно А представляет собой целое число от 10 до 20.

Конкретные способы

В конкретном варианте осуществления способ представляет собой способ отбора числа А неоэпитопов для индивидуума, причем указанный способ включает стадии:

a. Получение одного или нескольких неоэпитопов от указанного индивидуума, где каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере один минимальный эпитоп, причем каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере одну иммуногенную мутацию по сравнению с эталонными последовательностями;

b. Определение аффинности МНС I-связывания по меньшей мере с одним минимальным эпитопом, например, по меньшей мере с двумя, тремя или четырьмя минимальными эпитопами в каждом из указанных неоэпитопов, и определение числа минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, для каждого из указанных неоэпитопов; тем самым идентифицируя х неоэпитопов, связывающих МНС I;

c. Ранжирование неоэпитопов следующим образом:

i. приоритизация неоэпитопов, содержащих большое число минимальных эпитопов и отбор первой группы неоэпитопов, имеющих высокую оценку;

ii. необязательно, приоритизация неоэпитопов из первой группы неоэпитопов следующим образом:

1) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа равен или больше 20, минимальный эпитоп имеет наивысшую оценку;

2) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа равен или больше 20, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка для минимальных эпитопов из 1);

3) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа ниже 20 и равен или больше 3, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 2);

4) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа ниже 20 и равен или больше 3, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 3);

5) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа меньше 3, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 4);

6) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа меньше 3, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 5);

7) если минимальный эпитоп имеет мутацию с дифференциальным показателем связывания ниже 1, независимо от позиции мутации, минимальный эпитоп имеет самую низкую оценку,

где дифференциальный показатель МНС I-связывания дается формулой (% ранговая оценка (МНС I) для эталона) / (% ранговая оценка (МНС I) для минимального эпитопа); и отбор второй группы неоэпитопов, имеющих высокую оценку;

iii. необязательно, приоритизация неоэпитопов из второй группы на основе их % ранговой оценки в отношении МНС I и отбор третьей группы неоэпитопов, имеющих низкую % ранговую оценку в отношении МНС I;

iv. необязательно, отбор четвертой группы неоэпитопов, включающей минимальные эпитопы с высоким сходством с эпитопами, о которых известно, что они распознаются Т-клетками;

v. необязательно, приоритизация неоэпитопов из третьей группы или из четвертой группы, основанная на их оценке по BLOSUM, где оценка по BLOSUM меньше, чем заданное пороговое значение, получает более высокий ранг, чем оценка по BLOSUM, равная указанному пороговому значению или превышающая его, и отбор пятой группы неоэпитопов, имеющих оценку по BLOSUM меньше указанного порогового значения, причем указанное пороговое значение предпочтительно равно 1;

где первая, вторая, третья, четвертая или пятая группа неоэпитопов включает указанные А неоэпитопов.

В конкретном варианте осуществления способ представляет собой способ отбора числа А неоэпитопов для индивидуума, причем указанный способ включает стадии:

a. Получение одного или нескольких неоэпитопов от указанного индивидуума, где каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере один минимальный эпитоп, причем каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере одну иммуногенную мутацию по сравнению с эталонными последовательностями;

b. Определение аффинности МНС I-связывания по меньшей мере с одним минимальным эпитопом, например, по меньшей мере с двумя, тремя или четырьмя минимальными эпитопами в каждом из указанных неоэпитопов, и определение числа минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, для каждого из указанных неоэпитопов; тем самым идентифицируя х неоэпитопов, связывающих МНС I;

с. Ранжирование неоэпитопов следующим образом:

i. приоритизация неоэпитопов, содержащих большое число минимальных эпитопов и отбор первой группы неоэпитопов, имеющих высокую оценку;

ii. необязательно, приоритизация неоэпитопов из первой группы неоэпитопов следующим образом:

1) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа равен или больше 20, минимальный эпитоп имеет наивысшую оценку;

2) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа равен или больше 20, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка для минимальных эпитопов из 1);

3) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа ниже 20 и равен или больше 3, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 2);

4) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа ниже 20 и равен или больше 3, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 3);

5) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа меньше 3, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 4);

6) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания

минимального эпитопа меньше 3, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 5);

7) если минимальный эпитоп имеет мутацию с дифференциальным показателем связывания ниже 1, независимо от позиции мутации, минимальный эпитоп имеет самую низкую оценку, где дифференциальный показатель МНС I-связывания дается формулой (% ранговая оценка (МНС I) для эталона) / (% ранговая оценка (МНС I) для минимального эпитопа); и отбор второй группы неоэпитопов, имеющих высокую оценку;

iii. необязательно, приоритизация неоэпитопов из второй группы на основе их % ранговой оценки в отношении МНС I и отбор третьей группы неоэпитопов, имеющих низкую % ранговую оценку в отношении МНС I;

iv. необязательно, отбор четвертой группы неоэпитопов, включающей минимальные эпитопы с высоким сходством с эпитопами, о которых известно, что они распознаются Т-клетками;

v. необязательно, приоритизация неоэпитопов из третьей группы или из четвертой группы, основанная на их оценке по BLOSUM, где оценка по BLOSUM меньше, чем заданное пороговое значение, получает более высокий ранг, чем оценка по BLOSUM, равная указанному пороговому значению или превышающая его, и отбор пятой группы неоэпитопов, имеющих оценку по BLOSUM меньше указанного порогового значения, причем указанное пороговое значение предпочтительно равно 1;

vi. необязательно, отбор неоэпитопов из первой, второй, третьей, четвертой или пятой группы неоэпитопов на основе неоэпитопов, обнаруженных в двух или более образцах, и отбор шестой группы неоэпитопов, обнаруженных в двух или более образцах;

vii. необязательно, отбор неоэпитопов из первой, второй, третьей, четвертой, пятой или шестой группы неоэпитопов на основе идентификации мутации по меньшей мере двумя различными определителями вариантов и отбор седьмой группы неоэпитопов,

включающей мутацию, идентифицированную по меньшей мере двумя различными определителями вариантов,

при этом первая, вторая, третья, четвертая, пятая, шестая или седьмая группа неоэпитопов включает указанные А неоэпитопов.

Способ также может дополнительно включать ранжирование неоэпитопов в соответствии с любым из дополнительных параметров, описанных в данном документе, таким как клональность, уровни экспрессии РНК и частота аллелей.

В некоторых вариантах осуществления вторая группа является подгруппой первой группы. В некоторых вариантах осуществления третья группа является подгруппой второй группы и/или первой группы. В некоторых вариантах осуществления четвертая группа представляет собой подгруппу третьей группы, и/или второй группы, и/или первой группы. В некоторых вариантах осуществления пятая группа является подгруппой четвертой группы, и/или третьей группы, и/или второй группы, и/или первой группы. В некоторых вариантах осуществления шестая группа представляет собой подгруппу пятой группы, и/или четвертой группы, и/или третьей группы, и/или второй группы, и/или первой группы. В некоторых вариантах осуществления седьмая группа представляет собой подгруппу шестой группы, и/или пятой группы, и/или четвертой группы, и/или третьей группы, и/или второй группы, и/или первой группы. Подгруппы могут быть одинакового размера.

В одном варианте осуществления способ включает вышеописанную стадию i. В другом варианте осуществления способ включает вышеописанные стадии i. и ii. В другом варианте осуществления способ включает вышеописанные стадии i. и iii. В другом варианте осуществления способ включает вышеописанные стадии i. и iv. В другом варианте осуществления способ включает вышеописанные стадии i., ii. и iii. В другом варианте осуществления способ включает вышеописанные стадии i., ii. и iv. В другом варианте осуществления способ включает вышеописанные стадии i., iii. и iv. В другом варианте осуществления способ включает вышеописанные стадии i, ii, iii. и iv. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию v. и/или стадию vi. и/или стадию vii.

В одном варианте осуществления способ отбора числа А неоэпитопов для индивидуума, страдающего или подозреваемого в заболевании раком, включает следующие стадии:

a. Получение одного или нескольких неоэпитопов от указанного индивидуума, где каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере один минимальный эпитоп, причем каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере одну мутацию, такую как иммуногенная мутация, по сравнению с эталонной последовательностью, где минимальный эпитоп состоит из количества аминокислот, равного или меньше, чем количество аминокислот неоэпитопа, и содержит указанную по меньшей мере одну мутацию; где предпочтительно получение неоэпитопов включает стадию идентификации мутаций в последовательностях нуклеиновых кислот, которые специфичны для опухоли;

b. Определение аффинности связывания МНС I и/или МНС II по меньшей мере для одного минимального эпитопа, например, по меньшей мере для двух, трех или четырех минимальных эпитопов в каждом из указанных неоэпитопов, необязательно при этом аффинность связывания определяется предсказанием in silico;

c. Отбор неоэпитопов, содержащих по меньшей мере один минимальный эпитоп с предсказанной способностью связываться с МНС I и/или с МНС II, с получением таким образом МНС-связывающих неоэпитопов;

d. Ранжирование МНС-связывающих неоэпитопов с точки зрения вероятности их клинического применения, как описано в данном документе;

e. Отбор А неоэпитопов из МНС-связывающих неоэпитопов наивысшего ранга,

тем самым отбирая А неоэпитопов, которые могут иметь клиническое применение, при этом стадия d дополнительно включает ранжирование неоэпитопов следующим образом:

i) определение того, находится ли мутация в якорной или неякорной позиции минимального неоэпитопа для каждого минимального эпитопа, содержащегося в неоэпитопе;

ii) приоритизация неоэпитопов,

необязательно при этом приоритизация неоэпитопов на стадии ii) осуществляется путем присвоения каждому неоэпитопу наивысшей оценки минимальных эпитопов, которые они включают, и при этом приоритизация неоэпитопов осуществляется следующим образом:

1) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа равен или больше 20, минимальный эпитоп имеет наивысшую оценку;

2) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа равен или больше 20, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка для минимальных эпитопов из 1);

3) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа ниже 20 и равен или больше 3, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 2);

4) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа ниже 20 и равен или больше 3, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 3);

5) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа меньше 3 и равен или больше 1, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 4);

6) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа меньше 3 и равен или больше 1, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 5);

7) если минимальный эпитоп имеет мутацию с дифференциальным показателем связывания ниже 1, независимо от позиции мутации, минимальный эпитоп имеет самую низкую оценку.

В одном варианте осуществления способ отбора числа А неоэпитопов для индивидуума, страдающего или подозреваемого в заболевании раком, включает следующие стадии: а. Получение одного или нескольких неоэпитопов от указанного индивидуума, где каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере один минимальный эпитоп, причем каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере одну мутацию, такую как иммуногенная мутация, по сравнению с эталонной последовательностью, где минимальный эпитоп состоит из количества аминокислот, равного или меньше, чем количество аминокислот неоэпитопа, и содержит указанную по меньшей мере одну мутацию; где предпочтительно получение неоэпитопов включает стадию идентификации мутаций в последовательностях нуклеиновых кислот, которые специфичны для опухоли;

b. Определение аффинности связывания МНС I и/или МНС II по меньшей мере для одного минимального эпитопа, например, по меньшей мере для двух, трех или четырех минимальных эпитопов в каждом из указанных неоэпитопов, необязательно при этом аффинность связывания определяется предсказанием in silico;

c. Отбор неоэпитопов, содержащих по меньшей мере один минимальный эпитоп с предсказанной способностью связываться с МНС I и/или с МНС II, с получением таким образом МНС-связывающих неоэпитопов;

d. Ранжирование МНС-связывающих неоэпитопов с точки зрения вероятности их клинического применения, как описано в данном документе;

e. Отбор А неоэпитопов из МНС-связывающих неоэпитопов наивысшего ранга, тем самым отбирая А неоэпитопов, которые могут иметь клиническое применение, при этом стадия d включает ранжирование неоэпитопов по числу минимальных эпитопов, которые они включают, где большее число минимальных эпитопов дает более высокий ранг.

В другом варианте осуществления способ отбора числа А неоэпитопов для индивидуума, страдающего или подозреваемого в заболевании раком, включает стадии:

а. Получение одного или нескольких неоэпитопов от указанного индивидуума, где каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере один минимальный эпитоп, причем каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере одну мутацию, такую как иммуногенная мутация, по сравнению с эталонной последовательностью, где минимальный эпитоп состоит из количества аминокислот, равного или меньше, чем количество аминокислот неоэпитопа, и содержит указанную по меньшей мере одну мутацию; где предпочтительно получение неоэпитопов включает стадию идентификации мутаций в последовательностях нуклеиновых кислот, которые специфичны для опухоли;

b. Определение аффинности связывания МНС I и/или МНС II по меньшей мере для одного минимального эпитопа, например, по меньшей мере для двух, трех или четырех минимальных эпитопов в каждом из указанных неоэпитопов, необязательно при этом аффинность связывания определяется предсказанием in silico;

c. Отбор неоэпитопов, содержащих по меньшей мере один минимальный эпитоп с предсказанной способностью связываться с МНС I и/или с МНС II, с получением таким образом МНС-связывающих неоэпитопов;

d. Ранжирование МНС-связывающих неоэпитопов с точки зрения вероятности их клинического применения, как описано в данном документе;

e. Отбор А неоэпитопов из МНС-связывающих неоэпитопов наивысшего ранга, тем самым отбирая А неоэпитопов, которые могут иметь клиническое применение, при этом стадия d включает ранжирование неоэпитопов по числу образцов, в которых они обнаружены, причем неоэпитопы, обнаруженные в большем числе образцов, ранжируются выше, чем неоэпитопы, обнаруженные в меньшем числе образцов, предпочтительно, когда образцы являются образцами из различных опухолевых поражений.

Каждая из вышеперечисленных стадий конкретных способов, описанных в данном разделе, может быть такой, как описано в другом месте данного документа.

Вакцина

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения противораковой вакцины, содержащей неоэпитопы, причем указанный способ включает стадию отбора указанных неоэпитопов с использованием способов отбора неоэпитопов, как определено в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления отобрано от 10 до 40 неоэпитопов. То есть, А представляет собой целое число от 10 до 40. В другом варианте осуществления изобретения, отобрано от 10 до 30 или от 10 до 20 неоэпитопов.

В одном варианте осуществления указанная противораковая вакцина содержит нуклеотидную конструкцию, содержащую:

- единицу нацеливания

- единицу димеризации

- первый линкер

- антигенную единицу, где указанная антигенная единица включает А-1 антигенных субъединиц, причем каждая субъединица содержит последовательность, кодирующую по меньшей мере один из указанных неоэпитопов и второй линкер, и указанная антигенная единица дополнительно содержит финальную последовательность, кодирующую один из указанных неоэпитопов, где А представляет собой целое число от 1 до 100, например, от 3 до 50.

где указанная нуклеотидная конструкция применяется в противораковой вакцине в иммунологически эффективном количестве.

Целое число А такое, как описано в данном документе здесь и выше. Вышеупомянутая ДНК-вакцина также называется ДНК-вакциной типа вакцитело.

Настоящее изобретение относится к вакцине, полученной описанным выше способом.

Таким образом, неоантигенные вакцины, полученные с помощью описанных в данном документе способов, могут содержать полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий три единицы, то есть нацеливающую единицу, единицу димеризации и антигенную единицу. Благодаря единице димеризации, полипептид образует димерный белок, называемый вакцителом (vaccibody).

Гены, кодирующие три единицы, генетически сконструированы так, чтобы экспрессироваться как один ген. При экспрессии in vivo полипептиды/димерные белки нацелены на антигенпрезентирующие клетки (АРС), что приводит к повышению эффективности вакцины по сравнению с идентичными нецелевыми антигенами.

Антигенная единица

Антигенная единица включает множество опухолевых неоэпитопов, причем каждый неоэпитоп соответствует мутации, идентифицированной в неоантигене опухоли. Указанная мутация может представлять собой одну или несколько мутаций, как объяснено выше.

В антигенной единице все опухолевые неоэпитопы, кроме последнего, расположены в антигенных субъединицах, где каждая субъединица состоит из последовательности опухолевого неоэпитопа и второго линкера, тогда как последняя субъединица содержит только неоэпитоп, то есть такой второй линкер отсутствует. Благодаря разделению последовательностей опухолевого неоэпитопа указанным вторым линкером каждый неоэпитоп оптимальным образом презентируется иммунной системе, благодаря чему обеспечивается эффективность вакцины, как обсуждается ниже.

Последовательность опухолевого неоэпитопа предпочтительно имеет длину, подходящую для презентации молекулами МНС, описанными выше. Предпочтительная длина неоэпитопа описана выше.

Чтобы избежать уклонения опухолями от иммунной системы за счет прекращения экспрессии мутированного гена, если вакцина направлена на продукт экспрессии указанного гена, предпочтительно включать в антигенную единицу множество различных неоэпитопов. В целом, чем больше генов должна «выключать» опухоль, тем меньше вероятность того, что опухоль способна выключить их все и при этом еще быть способной размножаться или хотя бы выживать. Кроме того, опухоль может быть гетерогенной, поскольку не каждый неоантиген экспрессируется всеми опухолевыми клетками. Соответственно, в соответствии с настоящим изобретением подход состоит в том, чтобы включить в вакцину множество неоэпитопов, с тем чтобы эффективно атаковать опухоль. Предпочтительно множество неоэпитопов нацелено на экспрессию множества генов. Кроме того, чтобы гарантировать, что все неоэпитопы эффективно «загружаются» в одну и ту же антигенпрезентирующую клетку, они организованы как одна аминокислотная цепь, а не как отдельные пептиды.

Число неоэпитопов, которые выбраны и включены в конструкцию вакцины, таково, как описано выше.

В одном варианте осуществления антигенная единица содержит одну копию каждого ракового неоэпитопа, так что ответ может быть вызван против такого числа различных неоэпитопов, которое включено в вакцину. Например, когда в вакцину включены 10 неоэпитопов, может быть вызван клеточно-опосредованный иммунный ответ против 10 различных неоэпитопов, или когда в вакцину включены 20 неоэпитопов, может быть вызван клеточно-опосредованный иммунный ответ против 20 различных неоэпитопов. В некоторых вариантах осуществления вакцина может содержать более 20 неоэпитопов, тем самым вызывая ответ против такого же числа неоэпитопов.

Однако если идентифицировано только несколько релевантных антигенных мутаций, то антигенная единица может включать по меньшей мере две копии по меньшей мере одного неоэпитопа для усиления иммунного ответа на данные неоэпитопы. Также по причинам производства и регулирования может быть преимуществом сохранение длины плазмиды и, то есть, антигенной единицы постоянной или аналогичной длины, и поэтому может быть преимущественным включение более одной копии одного и того же неоэпитопа в антигенную единицу.

Как обсуждалось выше, может быть преимуществом сохранение длины антигенной единицы постоянной, и поэтому в одном варианте осуществления предпочтительно, чтобы все последовательности ракового неоэпитопа имели одинаковую длину. Однако, если один или несколько неоэпитопов являются результатом мутации, приводящей к сдвигу рамки считывания или мутации стоп-кодона, неоэпитоп может иметь значительную длину, например, состоять по меньшей мере из мутированной части белка, наиболее антигенной части мутированного белка или, возможно, всего мутированного белка, в результате чего длина по меньшей мере одного из неоэпитопов существенно больше, чем длина неоэпитопов, возникающих в результате несинонимичной точечной мутации.

Длина антигенной единицы, в первую очередь, определяется длиной неоэпитопов и числом неоэпитопов, расположенных в антигенной единице, и составляет от около 21 до 1500, предпочтительно от около 30 аминокислот до около 1000 аминокислот, более предпочтительно от около 50 до около 500 аминокислот, например, от около 100 до около 400 аминокислот, от около 100 до около 300 аминокислот.

Последовательность ракового неоэпитопа, встроенная в вакцину, может содержать мутацию, фланкированную с обеих сторон аминокислотной последовательностью. Предпочтительно мутация расположена по существу в середине последовательности ракового неоэпитопа, чтобы гарантировать, что иммуногенная мутация представлена антигенпрезентирующими клетками после процессинга. Аминокислотные последовательности, фланкирующие мутацию, предпочтительно представляют собой аминокислотные последовательности, фланкирующие мутацию в неоантигене, при этом последовательность ракового неоэпитопа является истинной субпоследовательностью аминокислотной последовательности ракового неоэпитопа.

Второй линкер разработан, чтобы быть неиммуногенным и представляет собой предпочтительно также гибкий линкер, в результате чего опухолевые неоэпитопы, несмотря на высокие количества антигенных субъединиц, присутствующих в антигенной единице, представлены оптимальным образом на Т-клетках. Предпочтительно длина второго линкера составляет от 4 до 20 аминокислот для обеспечения гибкости. В другом предпочтительном варианте осуществления длина второго линкера составляет от 8 до 20 аминокислот, например, от 8 до 15 аминокислот, например, от 8 до 12 аминокислот или, например, от 10 до 15 аминокислот. В конкретном варианте осуществления длина второго линкера составляет 10 аминокислот.

В конкретном варианте осуществления вакцина по настоящему изобретению содержит 10 неоэпитопов, при этом вторые линкеры имеют длину от 8 до 20 аминокислот, например, от 8 до 15 аминокислот, например, от 8 до 12 аминокислот или такую, как, например, от 10 до 15 аминокислот. В конкретном варианте осуществления вакцина по настоящему изобретению содержит 10 неоэпитопов, и вторые линкеры имеют длину 10 аминокислот.

Второй линкер предпочтительно представляет собой серин-глициновый линкер, такой как гибкий линкер GGGGS, такой как GGGSS, GGGSG, GGGGS, или их множественные варианты, такие как GGGGSGGGGS или (GGGGS)m, (GGGSS)m, (GGGSG)m, где m представляет собой целое число от 1 до 5, от 1 до 4 или от 1 до 3. В предпочтительном варианте осуществления m равно 2.

Единица нацеливания

Благодаря единице нацеливания, полипептид/димерный белок приводит к привлечению дендритных клеток (ДК), нейтрофилов и других иммунных клеток. Таким образом, полипептид/димерный белок, содержащий нацеливающий модуль, будет не только нацеливать антигены на конкретные клетки, но, кроме того, способствовать усилению ответа (эффект адъюванта) путем привлечения специфических иммунных клеток к месту введения вакцины. Данный уникальный механизм имеет большое значение в клинических условиях, где пациенты могут получать вакцину без каких-либо дополнительных адъювантов, поскольку сама вакцина дает адъювантный эффект.

Используемый в данном документе термин «единица нацеливания» относится к единице, которая доставляет полипептид/белок с его антигеном в антигенпрезентирующую клетку для МНС класса II-ограниченного представления CD4+ Т-клеткам или для обеспечения перекрестного представления CD8+ Т-клеткам ограничением МНС класса I.

Единица нацеливания соединена через единицу димеризации с антигенной единицей, причем последняя находится либо на СООН-терминальном, либо на NH₂-терминальном конце полипептида/димерного белка. Предпочтительно, чтобы антигенная единица находилась на СООН-терминальном конце полипептида/димерного белка.

Единица нацеливания предназначена для нацеливания полипептида/димерного белка по изобретению на поверхностные молекулы, экспрессируемые на соответствующих антигенпрезентирующих клетках, например, молекулы, экспрессируемые исключительно на подмножествах дендритных клеток (DC).

Примерами таких молекул-мишеней на поверхности АРС являются человеческий лейкоцитарный антиген (human leukocyte antigen (HLA)), кластер дифференцировки 14 (CD 14), кластер дифференцировки 40 (CD40), хемокиновые рецепторы и Toll-подобные рецепторы (TLR). HLA представляет собой главный комплекс гистосовместимости (major histocompatibility complex (МНС)) у человека. Toll-подобные рецепторы могут, например, включать TLR-2, TLR-4 и/или TLR-5.

Полипептид/димерный белок по изобретению может быть нацелен на указанные поверхностные молекулы с помощью единиц нацеливания, содержащих, например, связывающие антитела области со специфичностью в отношении CD14, CD40 или Toll-подобного рецептора; лиганды, например, растворимый лиганд CD40; природные лиганды, подобные хемокинам, например, RANTES или MIP-1а; или бактериальные антигены, такие как, например, флагеллин.

В одном варианте осуществления единица нацеливания обладает аффинностью к белку МНС класса II. Таким образом, в одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая единицу нацеливания, кодирует вариабельные домены антитела (VL и VH) со специфичностью в отношении белков МНС класса II, выбранных из группы, состоящей из анти-HLA-DP, анти-HLA-DR и анти-HLA-II.

В другом варианте осуществления единица нацеливания обладает аффинностью к поверхностной молекуле, выбранной из группы, состоящей из CD40, TLR-2, TLR-4 и TLR-5. Таким образом, в одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая единицу нацеливания, кодирует вариабельные домены антитела (VL и VH) со специфичностью в отношении анти-CD40, анти-TLR-2, анти-TLR-4 и анти-TLR-5. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая нацеливающую единицу, кодирует флагеллин. Флагеллин обладает аффинностью к TLR-5.

Предпочтительно единица нацеливания обладает аффинностью к хемокиновому рецептору, выбранному из CCR1, CCR3 и CCR5. Более предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая единицу нацеливания, кодирует хемокин hMIP-1альфа (LD78beta), который связывается с родственными ему рецепторами CCR1, CCR3 и CCR5, экспрессируемыми на клеточной поверхности АРС. hMIP-1 alpha (человеческий MIP-1 alpha) также известен как хемокиновый (СС-мотив) лиганд 3 (CCL3), который у человека кодируется геном CCL3. CCL3, также известный как воспалительный белок макрофагов-1α (MIP-1α), представляет собой цитокин, принадлежащий к семейству хемокинов СС, который участвует в остром воспалительном состоянии в рекрутинге и активации полиморфно-ядерных лейкоцитов. В то время как CCL3 мыши является однокопийным геном, кодирующим зрелый хемокин из 69 аминокислот, человеческий гомолог был продублирован и мутирован с образованием двух неаллельных вариантов, LD78α (CCL3) и LD78β (CCL3-L1), оба из которых имеют 74% гомологии с мышиным CCL3.

Связывание полипептида/димерного белка по изобретению с его родственными рецепторами приводит к интернализации в АРС и деградации белков до небольших пептидов, включая минимальные эпитопы - и, следовательно, мутацию - которые загружаются в молекулы МНС и представляются CD4+ и CD8+ Т-клеткам для индукции опухолеспецифических иммунных ответов. После стимуляции и с помощью активированных CD4+ Т-клеток CD8+ Т-клетки будут нацеливаться и убивать опухолевые клетки, экспрессирующие те же неоантигены.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения единица нацеливания содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью 5-70 SEQ ID NO: 1. В предпочтительном варианте осуществления единица нацеливания содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью 5-70 SEQ ID NO: 1, например, по меньшей мере 86%, например, по меньшей мере 87%, например, по меньшей мере 88%, например, по меньшей мере 89%, например, по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 91%, например, по меньшей мере 92%, например, по меньшей мере 93%, например, по меньшей мере 94%, например, по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 96%, например, по меньшей мере 97%, например, по меньшей мере 98%, например, по меньшей мере 99% идентичности последовательностей.

В более предпочтительном варианте осуществления единица нацеливания состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью 5-70 SEQ ID NO: 1, например, по меньшей мере 85%, например, по меньшей мере 86%, например, по меньшей мере 87%, например, по меньшей мере 88%, например, по меньшей мере 89%, например, по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 91%, например, по меньшей мере 92%, например, по меньшей мере 93%, например, по меньшей мере 94%, например, по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 96%, например, по меньшей мере 97%, например, по меньшей мере 98%, например, по меньшей мере 99%, например, по меньшей мере 100% идентичности последовательностей с аминокислотной последовательностью 5-70 SEQ ID NO: 1.

Единица димеризации

Используемый в данном документе термин «единица димеризации» относится к аминокислотной последовательности между антигенной единицей и единицей нацеливания. Таким образом, единица димеризации служит для соединения антигенной единицы и единицы нацеливания и облегчает димеризацию двух мономерных полипептидов в димерный белок. Кроме того, единица димеризации также обеспечивает гибкость в полипептиде/димерном белке, чтобы позволить оптимальное связывание единицы нацеливания с поверхностными молекулами на антигенпрезентирующих клетках (antigen presenting cells (АРС)), даже если они находятся на переменных расстояниях. Единица димеризации может быть любой единицей, которая удовлетворяет данным требованиям.

Соответственно, в одном варианте осуществления единица димеризации может содержать шарнирную область и, необязательно, другой домен, который способствует димеризации, и шарнирная область и другой домен могут быть связаны через третий линкер.

Термин «шарнирная область» относится к пептидной последовательности димерного белка, которая облегчает димеризацию. Шарнирная область функционирует как гибкий спейсер между единицами, позволяя двум единицам нацеливания связываться одновременно с двумя целевыми молекулами на АРС, даже если они экспрессируются с переменными расстояниями. Шарнирная область может быть получена из Ig, например, из IgG3. Шарнирная область может способствовать димеризации за счет образования ковалентной связи(ей), например, дисульфидного мостика(ов). Таким образом, в одном варианте осуществления шарнирная область может образовывать одну или несколько ковалентных связей. Ковалентная связь может быть, например, дисульфидным мостиком.

В одном варианте осуществления другой домен, который способствует димеризации, представляет собой домен иммуноглобулина, такой как карбоксиконцевой домен С, или последовательность, которая по существу идентична домену С или его варианту. Предпочтительно, другой домен, который способствует димеризации, представляет собой карбокситерминальный С-домен, полученный из IgG.

Иммуноглобулиновый домен способствует димеризации за счет нековалентных взаимодействий, например, гидрофобных взаимодействий. Например, иммуноглобулиновый домен обладает способностью образовывать димеры посредством нековалентных взаимодействий. Предпочтительно нековалентные взаимодействия представляют собой гидрофобные взаимодействия.

Предпочтительно, чтобы единица димеризации не содержала домена СН2, способного связываться с рецепторами F-клеток. В некоторых вариантах осуществления единица димеризации полностью лишена домена СН2. В других вариантах осуществления домен СН2 мутирован так, что он потерял способность связываться с рецепторами F-клеток.

В предпочтительном варианте осуществления единица димеризации состоит из шарнирных экзонов h1 и h4, соединенных через третий линкер с доменом СН3 человеческого IgG3.

CD8+ Т-клеточный ответ

Описанные в данном документе вакцины, полученные с помощью представленных способов ранжирования, могут вызывать сдвиг иммунного ответа с CD4+ Т-клеточного ответа на CD8+ Т-клеточный ответ для данного неоэпитопа. Таким образом, в одном аспекте обеспечивается способ отбора числа А неоэпитопов для индивидуума, причем указанный способ включает следующие стадии:

a. Получение одного или нескольких неоэпитопов от указанного индивидуума, где каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере один минимальный эпитоп, причем каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере одну мутацию, такую как иммуногенная мутация, по сравнению с эталонной последовательностью;

b. Определение аффинности связывания МНС I и/или МНС II для по меньшей мере одного минимального эпитопа, например, для по меньшей мере двух, трех или четырех минимальных эпитопов в каждом из указанных неоэпитопов;

c. Отбор неоэпитопов с предсказанной способностью связываться с МНС I и/или с МНС II, с получением таким образом МНС-связывающих неоэпитопов;

d. Ранжирование МНС-связывающих неоэпитопов с точки зрения вероятности их клинического применения;

e. Отбор А неоэпитопов из МНС-связывающих неоэпитопов наивысшего ранга, где А представляет собой целое число и А равно по меньшей мере 3, например, по меньшей мере 4, например, по меньшей мере 5,

тем самым отбирая А неоэпитопов, способных вызывать CD8+ Т-клеточный ответ при введении в качестве вакцины, как описано в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления вакцины, содержащие неоэпитопы, выбранные описанными в данном документе способами, таким образом, способны вызывать CD8+ Т-клеточный ответ. В конкретных вариантах осуществления такие вакцины способны вызывать доминантный CD8+ Т-клеточный ответ в отличие от других форматов вакцин. Например, неоэпитоп, который индуцирует CD4+ Т-клеточный ответ при введении в виде пептидной вакцины и/или в виде вакцины РНК, может индуцировать CD8+ Т-клеточный ответ при введении в виде вакцитела-ДНК вакцины, как описано в данном документе. В частности, ранее не было обнаружено, что неоэпитопы, выбранные с помощью настоящих способов, способны индуцировать CD8+ Т-клеточный ответ. Авторы изобретения обнаружили, что это справедливо для нескольких неоэпитопов, как показано в примере 13 и на фигуре 6.

В некоторых вариантах осуществления А представляет собой целое число, как иначе описано в данном документе.

Примеры

Пример 1 - Источник, история и создание линий клеток-хозяев VB10.NEO, специфичных для пациента

Конструкция неоэпитопного антигенного модуля (Neoepitope Antigenic Module) основана на уникальных опухолеспецифических последовательностях, определенных для каждого пациента. Для того, чтобы предсказать наиболее иммуногенные неоэпитопы, установлен оптимизированный рабочий способ, как суммировано ниже и показано на фигуре 7.

1) Первая стадия отбора неоэпитопов представляет собой идентификацию всех опухолеспецифических мутаций. Неоэпитопы, которые не экспрессируются в опухоли или могут, например, содержать 9 аминокислотных (аа) пептидов (включая сайт мутации), которые имеют идентичное совпадение последовательностей в другом месте протеома, исключены или имеют пониженный приоритет.Кроме того, неоэпитопы в генах, которые показывают по меньшей мере в пять раз более высокий уровень экспрессии РНК в конкретном органе/ткани по сравнению со всеми другими тканями, также исключены или имеют пониженный приоритет.

2) Следующей стадией является конструирование неоэпитопов (длиной 27 аминокислот, мутация находится в середине) и их ранжирование на основе оптимальной комбинации аффинности связывания пептида с молекулами HLA и свойств их остатков.

3) В некоторых вариантах осуществления завершение составления набора неоэпитопов включает оценку неоэпитопов на основе тщательно отобранных критериев оценки, состоящих из свойств неоэпитопов и/или их исходных генов, которые, как сообщается, потенциально важны для определения иммуногенных неоэпитопов. Данная оценка выполняется комиссией по целевому отбору, состоящей из клинициста (СМО), иммунолога (CSO) и биоинформатика.

Пример 2 - Сбор тканей пациента и обращение с ними

Ткани солидных опухолей, а также образцы крови собираются от подходящих пациентов во время скрининга.

Для секвенирования экзома и секвенирования РНК берут по меньшей мере одну толстоигольную биопсию. Криоконсервация идеальна для поддержания целостности образца для секвенирования экзома и транскриптома, поэтому данный материал предпочтительно используется для целей секвенирования. В случае, если свежий опухолевый материал не может быть получен при скрининге, опухолевый материал, сохраненный в FFPE перед скринингом, может быть принят для секвенирования.

Собирают образцы крови. Для криоконсервированных образцов биопсии опухоли образцы погружают в жидкий азот для мгновенного замораживания и хранят в жидком азоте. В случае опухолевого материала FFPE образцы ткани фиксируют в 4-10% нейтральном забуференном формалине. Затем образцы обезвоживают перед заливкой и хранением при комнатной температуре.

Пример 3 - Экзом пациента, секвенирование РНК и HLA-типирование Данные экзома и секвенирования РНК получают из крови и опухоли, а также HLA-типа пациента. Секвенирование образцов опухоли и крови выполняется с использованием длины считывания не менее 2×100 п.н. Выходные необработанные данные составляют не менее 24 гигабайт (Гбит/с).

Секвенирование РНК выполняется из образцов опухоли с длиной считывания не менее 2×100 п.н. Общий вывод данных составляет не менее 100 миллионов чтений.

Для HLA-типирования ДНК, выделенную из образцов крови, секвенируют с длиной считывания не менее 2×150 п.н. на платформе Illumina с более чем 100-кратным охватом.

Пример 4 - Биоинформатическая обработка и идентификация мутаций в опухоли Данные по экзому и экспрессии РНК предоставляются в виде FASTQ-файлов для загрузки с внутреннего защищенного сервера провайдера секвенирования. Анализ необработанных последовательностей экзома, прошедших контроль качества (quality control, QC) (FASTQ-файлы), осуществляется в соответствии с наиболее передовыми известными из практики рабочими схемами, определенными новейшими технологиями и оптимизированными алгоритмами для fastq обработки и определения вариантов для пары опухолевых и нормальных образцов (например, Miller et al., 2015; Van der Auwera etal., 2013).

Необработанные FASTQ-файлы из секвенирования РНК отображаются с использованием самых передовых способов анализа секвенирования РНК (например, Dobin et al., 2013; Dutton G. 2016).

HLA-аллели пациента идентифицируются по содержащему EDTA образцу крови с использованием платформы для секвенирования Illumina.

Все мутации (варианты, идентифицированные в файлах vcf), обнаруженные в генах, кодирующих белок, для которых экспрессия РНК обнаружена в опухолевой ткани (ТРМ > 0, как определено в Gubin et al., 2015), исследуются на предмет их потенциальной применимости в качестве неоэпитопа.

Пептидная последовательность, охватывающая 13 аминокислот с каждой стороны мутации, извлекается, образуя последовательность неоэпитопа с общей длиной 27 аминокислот.Для несинонимичных мутаций, расположенных ближе, чем 13 аминокислот к С-концу или N-концу белка, последовательность, фланкирующая мутацию с одной стороны, короче чем 13 аминокислот, таким образом, общая длина последовательности неоэпитопа будет короче, чем 27 аминокислот.

Пример 5 - Критерии исключения для минимизации риска аутоиммунитета

Чтобы свести к минимуму риск перекрестной реактивности, все неоэпитопы с коровым пептидом из 9 аминокислот (включая мутацию), которые соответствуют любой пептидной последовательности в нормальном протеоме человека, предпочтительно исключены или имеют пониженный приоритет на данной стадии. Кроме того, неоэпитопы в генах, которые показывают по меньшей мере в пять раз более высокий уровень экспрессии РНК в определенной ткани или органе по сравнению со всеми другими тканей или органов (как определено с помощью Human Proteome Atlas, Uhlen и др., 2015), также исключены или имеют пониженный приоритет.

Пример 6 - Разработка вычислительной модели для приоритизации неоэпитопов в моделях опухолей мышей

Чтобы идентифицировать наиболее иммуногенные неоэпитопы, данные и результаты от двух in vivo моделей опухолей мышей были использованы для разработки вычислительной модели для прогнозирования приоритета неоэпитопов.

Используя множество наборов данных из доклинических экспериментов in vivo на мышах, были собраны признаки, относящиеся к предсказанию иммуногенных неоэпитопов, и был оценен их потенциал предсказания. Неоэпитопы, идентифицированные в модели карциномы толстой кишки СТ26, и их иммуногенность, наблюдаемая у вакцинированных VB10.NEO мышей BALB/c (H-2d), были использованы для разработки стратегии определения приоритета неоэпитопов на основе предсказанной иммуногенности. Предсказывающая способность данной стратегии была подтверждена с использованием данных по иммуногенности, собранных для неоэпитопов, идентифицированных в модели меланомы В16 и в модели рака легких LL2, и их иммуногенности, наблюдаемой у вакцинированных VB10.NEO мышей С57 В1/6 (Н-2b). Неоэпитопы классифицировались как иммуногенные, если количество IFN-β> отрицательного контроля + 2×SD и количество пятен > 25, проанализированных с помощью анализов IFN-β ELISpot, проводимых собственными силами. Аффинность связывания (% ранг) для молекул МНС класса I и II с использованием инструментов предсказания NetMHCpan (Nielsen et al., 2016) и NetMHCIIpan (Andreatta et al., 2015), общее число связывающих минимальных эпитопов, разница между аффинностью связывания для мутантного эпитопа и эпитопа дикого типа (дифференциальный показатель связывания) и оценка с использованием BLOcks Substitution Matrix (BLOSUM) (Henikoff et al., 1992) продемонстрировали четкую закономерность между иммуногенными и неиммуногенными неоэпитопами.

Пример 7 - Аффинность связывания (% ранг), общее число связывающих эпитопов. дифференциальный показатель связывания и оценка по BLOSUM.

У мышей только пептиды, имеющие аффинность к МНС класса I или II (у людей HLA класса I или II), обеспечивают подходящие мишени для Т-клеток. Одна из стратегий отбора мишеней для вакцины состоит в выборе неоэпитопов-кандидатов на основе их предсказанной аффинности к молекулам МНС класса I и II с использованием NetMHCpan и NetMHCIIpan, соответственно. Для всех неоэпитопов из 27 аминокислот данные серверы предоставляют оценки аффинности связывания для выбранных молекул МНС. Серверы предсказания аффинности связывания предоставляют несколько значений оценки аффинности МНС, из которых настоятельно рекомендуется % (процентильный) ранг (Nielsen et al., 2016 и Andreatta. et al., 2015). Низкая % ранговая оценка указывает на сильную аффинность связывания.

Фигура 2 иллюстрирует распределение % ранга для иммуногенных и неиммуногенных неоэпитопов, протестированных на вакцинированных VB10.NEO мышах, для МНС класса I и МНС класса II.

В неоэпитопе длиной 27 аминокислот может быть более одного минимального эпитопа (от 8 до 14 аминокислот для МНС класса I и от 9 до 15 аминокислот для МНС класса II, соответственно) с предсказанной способностью связываться с соответствующей молекулой МНС. Неоэпитопы, содержащие наибольшее число предсказанных минимальных эпитопов, имеют повышенную вероятность процессинга и представления одного или нескольких иммуногенных пептидов на молекуле(ах) МНС пациента и, таким образом, вызывают более эффективный опухолеспецифический иммунный ответ. На фигуре 8 показано сравнение общего числа минимальных эпитопов между иммуногенными и неиммуногенными неоэпитопами в данных В16 и СТ26.

Если неоэпитоп имеет более высокую аффинность связывания с молекулами МНС, чем соответствующая последовательность дикого типа (высокий дифференциальный показатель связывания), вероятно, что дикий тип плохо представлен или не представлен в здоровой ткани, и, следовательно, неоэпитоп-специфические Т-клетки должны иметь низкую вероятность распознавания здоровых клеток и высокий потенциал для распознавания раковых клеток, экспрессирующих неоэпитоп.Чтобы измерить дифференциальный показатель связывания между эталонной и мутантной последовательностями неоэпитопа, можно использовать соотношение между их % ранговыми значениями (эталон/мутант) и сгруппировать их по типу остатка: якорный (Р2 или Р8/Р9) и неякорный (все остальные остатки). На фигуре 9 показано, что если эпитоп имеет мутацию в якорной позиции и высокий дифференциальный показатель связывания, он имеет более высокий шанс быть иммуногенным.

Оценка по BLOSUM описывает вероятность возникновения попарной аминокислотной замены. В данном случае аминокислоты, обнаруженные в белках, экспрессируемых в здоровой ткани, были заменены мутированной аминокислотой. Чем ниже оценка, тем меньше вероятность того, что такая замена произойдет в выравнивании родственных белков. Оценка по BLOSUM для неоэпитопов в наборе данных модели меланомы СТ26 с высокой аффинностью связывания в целом ниже для иммуногенных неоэпитопов (фигура 10).

Для предсказания наиболее иммуногенных неоэпитопов учитывается комбинация всех пяти факторов: % ранговые значения для MHCI и MHCII, число минимальных эпитопов в неоэпитопе, дифференциальный показатель связывания в якорной позиции и оценка по BLOSUM. Стратегия приоритизации неоэпитопов, называемая NeoSELECT, «взвешивает» данные пять факторов и генерирует ранжированный список неоэпитопов. Ранжирование по NeoSELECT было протестировано на неоэпитопах из опухолевых моделей LL2, СТ26 и В16, и их наблюдаемая иммуногенность показана на фигуре 3.

Наблюдаемая перекрестная реактивность 20 лучших неоэпитопов, предсказанных стратегией NeoSELECT, против эталонной пептидной последовательности показана вместе с ответом на мутированную пептидную последовательность на фигуре 4 для моделей (А) СТ26, (В) В16 и (С) LL2. Для модели СТ26 измерения перекрестной реактивности были получены для 12 из 20 неоэпитопов; для модели В26 измерения перекрестной реактивности были получены для 17 из 20 неоэпитопов. Для модели LL2 измерения перекрестной реактивности были получены для всех 20 неоэпитопов. Таким образом, при использовании стратегии NeoSELECT риск индукции перекрестно-реактивных Т-клеток ограничен.

Пример 8 - Способ предсказания неоэпитопов. использованный в клиническом исследовании VB N-01

Если у пациента обнаружено более 20 потенциальных неоэпитопов, они ранжируются в соответствии со стратегией определения приоритетов NeoSELECT для предсказания неоэпитопов, описанной выше. Для данных пациента специфичные для пациента аллели HLA используются в процессе получения ранговых значений для эталона и неоэпитопа WT из NetMHCpan и NetMHCIIpan. Рассчитываются дифференциалы связывания и определяются якорные позиции. Число минимальных эпитопов для МНС классов I и II рассчитывается с использованием полного списка предсказанных минимальных эпитопов для всех аллелей HLA. Оценка по BLOSUM для каждой мутации извлекается из матрицы оценок BLOSUM. Данные факторы впоследствии используются в стратегии NeoSELECT для получения ранжированного списка предсказанных иммуногенных неоэпитопов. Аффинность связывания, измеренная как % ранг, дифференциальный показатель связывания, число минимальных эпитопов, а также оценка по BLOSUM являются стандартизованными значениями, на которые не влияет организм, в котором был идентифицирован неоэпитоп.Таким образом, модель предсказания, разработанная на основе данных, полученных от мышей, не требует дополнительной настройки для использования для предсказания неоэпитопа у людей.

Пример 9 - Окончательный контроль качества и отбор неоэпитопов

Наконец, дополнительная информация для всех неоэпитопов, прошедших отбор по данным критериям исключения, собирается, чтобы служить в качестве критериев отбора. Данные критерии включают:

• Клональность (то есть неоэпитоп, обнаруженный в более чем одном образце биопсии пациента, имеет приоритет, например, неоэпитоп обнаруживается в архивном опухолевом материале, в многоугольных биопсиях из одного и того же поражения или в бесклеточной ДНК)

• высокий уровень экспрессии РНК (в ТРМ)

• низкий % ранг (высокая аффинность связывания) в отношении МНС класса I и II для неоэпитопа

• Высокий дифференциальный показатель связывания (% ранг неоэпитопа по сравнению с эталоном)

• низкая оценка по BLOSUM: характеристики остатков замещенной аминокислоты в неоэпитопе по сравнению с диким типом

• высокие частоты аллелей (allele frequencies (AF)) или частоты вариантов аллелей (variant allele frequencies (VAF)) в месте мутаций, оцененные из файлов VCF

• исходный ген известен как связанный с раком ген в базе данных Каталог соматических мутаций при раке (Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer (COSMIC))

• неоэпитопы имеют большое сходство с эпитопами, о которых известно, что они распознаются Т-клетками, например, полученные из базы данных иммунных эпитопов и ресурсов анализа (база данных IEDB, Immune Epitope Database and Analysis Resource)

• большое число минимальных эпитопов (от 8 до 15 аминокислот) в неоэпитопе из 27 аминокислот

• позиция мутации в комплексе HLA-TCR, как описано в Fritsch et al., 2014

• высокий показатель стабильности связывания с молекулами МНС класса I/MHC класса II, оцененный с использованием NetMHCstabpan (Rasmussen et al., 2016) или аналогичный

• высокий показатель расщепления протеасомами, предсказанный NetChop (Nielsen et al., 2005) или аналогичный.

Данные критерии, в дополнение к прогнозируемой приоритизации стратегии NeoSELECT, образуют основу для отбора окончательного набора из от 10 до 20 неоэпитопов и оцениваются комиссией по целевому отбору. Критерии принятия решений записываются и анализируются в отношении иммунного ответа пациента на каждый неоэпитоп в вакцине и клинического ответа пациента.

Рекомендуемый набор неоэпитопов объединяется, будучи разделен гибкими неиммуногенными линкерами, обогащенными глицином/серином (см пример 11). Порядок неоэпитопов зависит от стыковочных последовательностей между каждым неоэпитопом и линкером, при этом избегаются все стыковочные последовательности длиной 9 аминокислот с идентичными совпадениями в другом месте протеома.

Пример 10 - Хранение и анализ данных

Хранение необработанных данных, а также результатов анализа экзома и последовательности РНК выполняется в безопасной управляемой платформе компьютерной кластерной среды, отвечающей требованиям обработки и хранения конфиденциальных данных пациента. Всем пациентам при регистрации выдается уникальный d-цифровой код, чтобы гарантировать защиту личности пациента.

Пример 11 - Синтез неоэпитопного антигенного модуля

Каждый специфичный для пациента неоэпитопный антигенный модуль (Neoepitope Antigenic Module) разработан с помощью Vaccibody AS на основе неоэпитопов длиной от 10 до 27 аминокислот, связанных с линкерами, обогащенными глицином/серином, длиной 10 аминокислот.Неоэпитопный антигенный модуль синтезируется de novo поставщиком синтеза ДНК и клонируется в плазмиду для создания VB10.NEO.

Пример 12 - Вакцитело индуцирует сильные доминантные CD8+ Т-клеточные ответы по сравнению с другими форматами вакцин.

10 различных неоэпитопов (pep 1-10), которые, как предсказано, связывают МСН класса I (CD8+ Т-клеточный ответ), были исследованы Kreiter et al., 2015 и Castle et al., 2012, чтобы выяснить, могут ли они индуцировать CD 8+ Т-клеточные ответы на модели опухоли меланомы мыши B16-F10. Ответы, индуцированные 6 из 10 неоэпитопов при введении в виде пептида, в виде РНК или в виде вакцитела, как описано в данном документе («VB10.NEO»), показаны на фигуре 6.

Когда неоэпитопы вводили в виде синтетических пептидов, 1 из 6 индуцировал CD8+ Т-клеточный ответ и 2 из 6 мРНК вызывали CD8+ Т-клеточный ответ.

Однако при доставке тех же 6 неоэпитопов в виде вакцитела, нацеленного на человеческий MlPla, все неоэпитопы индуцировали CD8+ Т-клеточный ответ, ясно демонстрируя важность формата вакцины для индукции сильных ответов CD8+ киллерных Т-клеток против неоэпитопов.

Пример 13 - Иммуногенность отобранных неоэпитопов

Неоэпитопы были отобраны описанными способами у 4 пациентов, страдающих почечно-клеточным раком или плоскоклеточным раком головы и шеи. Были сконструированы и введены пациентам персонализированные вакцины. Иммуногенность измеряли в мононуклеарных клетках периферической крови, собранных от 3 до 9 месяцев после введения первой дозы персонализированной вакцины. Ответы Т-клеток измеряли с помощью 10-дневного анализа ELISPOT перед стимуляцией (фон вычитали). Ответ, индуцированный вакциной: > 30 SFU повышенный ответ после вакцинации. Иммуногенные неоэпитопы: > 30 SFU по меньшей мере за один момент времени.

RCC: почечно-клеточная карцинома (renal cell carcinoma); SCCHN: плоско клеточный рак головы и шеи (squamous cell carcinoma of the head and neck).

В среднем, 95% неоэпитопов, отобранных способом у данных 4 пациентов, были иммуногенными, то есть способными активировать Т-клеточный ответ у пациентов, несущих соответствующие мутированные последовательности в их опухоли. Когда выбранные неоэпитопы были включены в персонализированную вакцину и введены пациентам, был индуцирован повышенный Т-клеточный ответ по сравнению с уровнем до вакцинации, направленный в среднем против 78% неоэпитопов.

Пример показывает, что способ отбора неоэпитопов приводит к отбору неоэпитопов, которые способны увеличивать Т-клеточные ответы при введении пациенту.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

SEQ ID NO: 1

Предшественник хемокина 3-подобного 1 с мотивом СС, включая сигнальный пептид и зрелый пептид (1Т)78-бета), аминокислотные остатки 24-93:

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKEL

ССЫЛКИ

Andreatta, М. et al. (2015) "Accurate pan-specific prediction of peptide-МНС class II binding affinity with improved binding core identification." Immunogenetics. 2015. 67(11-12): 641-50. Castle, J.C. et al (2012) "Exploiting the Mutanome for Tumor Vaccination." Cancer Res; 72(5): 1081-91.

Dobin, A. et al. (2013) "STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner." Bioinformatics. 1; 29(1): 15-21.

Dutton, G. (2016) "From DNA to Diagnosis without Delay. Purpose-Built for Genomics, Dragen Processor Could Form Core of Clinic-Ready Data Systems." Genet Eng Biotechn N. 36 (5): 8-9.

Fritsch, E.F. et al. (2014) "HLA-binding properties of tumor neoepitopes in humans." Cancer Immunol Res.;2(6): 522-9.

Gubin, M.M. et al. (2015) "Tumor neoantigens: building a framework for personalized cancer immunotherapy."J Clin. Invest. 125(9): 3413-21.

Henikoff, S. et al. (1992) "Amino acid substitution matrices from protein blocks." Proc Natl Acad Sci U S A; 89(22): 10915-10919.

Jurtz, V. et al (2017) "NetMHCpan-4.0: Improved Peptide-МНС Class I Interaction Predictions Integrating Eluted Ligand and Peptide Binding Affinity Data." Vanessa Jurtz, Sinu Paul, Massimo Andreatta, Paolo Marcatili, Bjoern Peters and Morten Nielsen. The Journal of Immunology (2017))

Kreiter S et al. Mutant MHC class II epitopes drive therapeutic immune responses to cancer. Nature. 2015 Apr 30;520(7549):692-6

Kreiter, S. et al. (2015) "Erratum: Mutant MHC Class 2 Epitopes Drive Therapeutic Immune Responses To Cancer." Nature 523.7560:370-370.

Miller, N.A. et al. (2015) "26-hour system of highly sensitive whole genome sequencing for emergency management of genetic diseases". Genome Med. 7:100.

Nielsen, M. et al. (2005) "The role of the proteasome in generating cytotoxic T cell epitopes: Insights obtained from improved predictions of proteasomal cleavage." Immunogenetics., 57(1-2):33-41.

Nielsen, M. et al. (2016) "NetMHCpan-3.0: improved prediction of binding to MHC class I molecules integrating information from multiple receptor and peptide length data sets." Genome Medicine: 8:33.

Rasmussen, M. (2016) "Pan-Specific Prediction of Peptide-МНС Class I Complex Stability, a Correlate of T Cell Immunogenicity." J Immunol.;197(4):1517-24.

Uhlén M. et al. (2015) "Proteomics. Tissue-based map of the human proteome."

Science; 347(6220)

Van der Auwera G.A. et al. (2013) "From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline." Curr Protoc Bioinformatics. 43.

Пункты

1. Способ отбора числа А неоэпитопов для индивидуума, при этом указанный способ включает следующие стадии:

a. Получение одного или нескольких неоэпитопов от указанного индивидуума, где каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере один минимальный эпитоп, причем каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере одну мутацию, такую как иммуногенная мутация, по сравнению с эталонной последовательностью;

b. Определение аффинности связывания с МНС I и/или с МНС II по меньшей мере для одного минимального эпитопа, такого как по меньшей мере два, три или четыре минимальных эпитопа в каждом из указанных неоэпитопов;

c. Отбор неоэпитопов, содержащих по меньшей мере один минимальный эпитоп с предсказанной способностью связываться с МНС I и/или с МНС II, с получением таким образом МНС-связывающих неоэпитопов;

d. Ранжирование МНС-связывающих неоэпитопов с точки зрения вероятности их клинического применения;

e. Отбор А неоэпитопов из МНС-связывающих неоэпитопов наивысшего ранга, тем самым отбирая А неоэпитопов, которые могут иметь клиническое применение.

2. Способ по пункту 1, при котором некоторые или все из А неоэпитопов связываются по меньшей мере с МНС I.

3. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором по меньшей мере один минимальный эпитоп составляет от 1 до 50 минимальных эпитопов, например от 1 до 40 минимальных эпитопов, например от 1 до 30 минимальных эпитопов, например от 1 до 20 минимальных эпитопов.

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором каждый минимальный эпитоп содержит мутацию.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором стадия b выполняется путем определения аффинности связывания МНС I и/или МНС II для каждого из указанных минимальных эпитопов, тем самым идентифицируя х минимальных эпитопов связывания МНС I и/или у минимальных эпитопов связывания МНС II.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором аффинность связывания МНС I и МНС II для каждого из указанных неоэпитопов рассчитывается как наивысшая аффинность МНС I- и МНС II-связывания минимальных эпитопов, содержащихся в каждом из указанных неоэпитопов.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором стадия с включает или состоит из отбора неоэпитопов, содержащих по меньшей мере один минимальный эпитоп с предсказанной способностью связываться с МНС I и/или по меньшей мере один минимальный эпитоп с предсказанной способностью связываться с МНС II, с получением таким образом МНС-связывающих неоэпитопов.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором стадия с включает отбор неоэпитопов, содержащих по меньшей мере один минимальный эпитоп с предсказанной способностью связываться с МНС I и по меньшей мере один минимальный эпитоп с предсказанной способностью связываться с МНС II.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором стадия d включает стадию определения числа связывающихся с МНС I и/или МНС II минимальных эпитопов в каждом из указанных неоэпитопов, и где большее количество числа связывающихся с МНС I и/или МНС II минимальных эпитопов указывают на более высокую вероятность клинического применения неоэпитопа.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором стадия d включает стадию определения оценки связывания для неоэпитопа, при котором оценка связывания составляет а * 2х+b * у, где предпочтительно а = 0, если у = 0. и b = 0, если х = 0, и где а = 1, если у > 0, и b = 1, если х > 0, и где более высокая оценка связывания указывает на более высокую вероятность клинического применения неоэпитопа.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором стадия d включает стадию определения оценки связывания для неоэпитопа, при котором оценка связывания представляет собой а * х+b * у, где предпочтительно а = 2 и b = 1, или а = 0, если у = 0, и b = 0, если х = 0, и где а = 1, если у > 0, и b = 1, если х > 0, и где более высокая оценка связывания указывает на более высокую вероятность клинической применимости неоэпитопа.

12. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором стадия d дополнительно включает стадию определения дифференциального показателя МНС I-связывания связывающего МНС I неоэпитопа стадии с, где дифференциальный показатель МНС I-связывания дается формулой (% ранговая оценка (МНС I) для эталона) / (% ранговая оценка (МНС I) для неоэпитопа), где неоэпитопы с высоким дифференциалом связывания МНС I ранжируются выше, чем неоэпитопы с более низким дифференциальным показателем связывания МНС I.

13. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором стадия d включает стадию определения дифференциального показателя МНС I-связывания связывающего МНС I минимального эпитопа стадии с, при котором дифференциальный показатель МНС I-связывания дается формулой (% ранговая оценка (МНС I) для эталона) / (% ранговая оценка (МНС I) для минимального эпитопа), где неоэпитопы, содержащие минимальный эпитоп с высоким дифференциалом связывания МНС I, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие минимальный эпитоп с более низким дифференциальным показателем связывания МНС I.

14. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором дифференциальный показатель МНС I-связывания каждого неоэпитопа равен наибольшему дифференциалу связывания МНС I минимальных эпитопов, которые он включает.

15. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором стадия d дополнительно включает стадию определения дифференциального показателя МНС II-связывания связывающего МНС II неоэпитопа стадии с, при котором дифференциальный показатель МНС II-связывания дается формулой (% ранговая оценка (МНС II) для эталона) / (% ранговая оценка (МНС II) для неоэпитопа), где неоэпитопы с высоким дифференциалом МНС II-связывания ранжируются выше, чем неоэпитопы с более низким дифференциальным показателем МНС II-связывания.

16. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором стадия d дополнительно включает стадию определения дифференциального показателя МНС II-связывания связывающего МНС II неоэпитопа стадии с, при котором дифференциальный показатель МНС II-связывания задается формулой (% ранговая оценка (МНС II) для эталона) / (% ранговая оценка (МНС II) для минимального эпитопа), где неоэпитопы, содержащие минимальный эпитоп с высоким дифференциальным показателем МНС II-связывания, ранжируются выше, чем неоэпитопы, содержащие минимальный эпитоп с более низким дифференциальным показателем МНС II-связывания.

17. Способ по любому одному из предшествующих пунктов, при котором дифференциальный показатель МНС II-связывания каждого неоэпитопа равен наибольшему дифференциалу МНС II-связывания минимальных эпитопов, которые он включает.

18. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором неоэпитопы, выбранные на стадии с, связываются с МНС II.

19. Способ по любому одному из предшествующих пунктов, при котором неоэпитопы, связывающиеся с МНС I, выбраны на стадии е только тогда, когда множество неоэпитопов не содержит никакого неоэпитопа, связывающегося с МНС II.

20. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором стадия d дополнительно включает ранжирование неоэпитопов следующим образом:

i) определение того, находится ли мутация в якорной или неякорной позиции минимального неоэпитопа для каждого минимального эпитопа, содержащегося в неоэпитопе;

ii) приоритизация неоэпитопов, предпочтительно, когда неоэпитопы с более высоким потенциалом связывания имеют приоритет над неоэпитопами с более низким дифференциалом связывания.

21. Способ по пункту 20, при котором приоритизация неоэпитопов на стадии ii) выполняется путем присвоения указанным неоэпитопам наивысшей оценки минимальных эпитопов, которые они включают.

22. Способ по любому из пунктов 20 или 21, при котором неоэпитопы с более высоким дифференциалом связывания оцениваются выше, чем неоэпитопы с более низким дифференциалом связывания, и где неоэпитопы, содержащие мутацию в якорной позиции, оцениваются выше, чем неоэпитопы, содержащие мутацию в неякорной позиции.

23. Способ по любому из пунктов 19-21, при котором приоритизация неоэпитопов выполняется следующим образом:

1) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа равен или больше 20, минимальный эпитоп имеет наивысшую оценку;

2) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа равен или больше 20, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 1);

3) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа ниже 20 и равен или больше 3, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 2);

4) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа ниже 20 и равен или больше 3, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 3);

5) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа меньше 3 и равен или больше 1, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 4);

6) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа меньше 3 и равен или больше 1, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 5);

7) если минимальный эпитоп имеет мутацию с дифференциальным показателем связывания ниже 1, независимо от позиции мутации, минимальный эпитоп имеет самую низкую оценку.

24. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором стадия d дополнительно включает стадию приоритизации неоэпитопов по отношению к их МНС I рангу.

25. Способ по пункту 24, при котором % ранговая оценка (МНС I) неоэпитопа, содержащего один или несколько минимальных эпитопов с предсказанной способностью связываться с МНС I, равна самой низкой ранговой оценке (МНС I) указанного одного или нескольких минимальных эпитопов.

26. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором стадия е включает отбор неоэпитопов, имеющих % ранговую оценку (МНС I) ниже 2,0, например, ниже 1,5, например, ниже 1, предпочтительно равную или ниже 0,5.

27. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором МНС I-связывающие неоэпитопы, имеющие % ранговую оценку (МНС I) выше 2, исключены или имеют пониженный приоритет.

28. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором стадия d дополнительно включает стадию приоритизации неоэпитопов по отношению к их МНС II рангу.

29. Способ по любому из пунктов 24-28, при котором % ранговая оценка (МНС II) неоэпитопа, содержащего один или несколько минимальных эпитопов с предсказанной способностью связываться с МНС II, равна самой низкой ранговой оценке (МНС II) указанного одного или нескольких минимальных эпитопов.

30. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором стадия е включает отбор неоэпитопов, имеющих % ранговую оценку (МНС II) ниже 10, например, ниже 2.

31. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором МНС I-связывающие неоэпитопы, имеющие % ранговую оценку (МНС I) выше 10, например, выше 2, исключены или имеют пониженный приоритет.

32. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором стадия d дополнительно включает стадию приоритизации неоэпитопов по отношению к их оценке по BLOSUM в порядке убывания, причем оценка по BLOSUM неоэпитопа равна оценке по BLOSUM минимального эпитопа с лучшим рангом, который он включает, при этом минимальный эпитоп с оценкой по BLOSUM < 1 оценивается выше, чем минимальный эпитоп с оценкой по BLOSUM ≥ 1.

33. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором стадия d согласно пункту 1 дополнительно включает определение вероятности того, что аминокислотная замена, присутствующая в неоэпитопе, происходит случайным образом, и где неоэпитопы, содержащие аминокислотную замену, которая происходит случайным образом с низкой вероятностью, оцениваются выше, чем неоэпитопы, содержащие аминокислотную замену, которая происходит случайным образом с более высокой вероятностью.

34. Способ по пункту 33, при котором указанная вероятность того, что аминокислотная замена, присутствующая в неоэпитопах, происходит случайным образом, определяется с использованием оценочной матрицы на основе модели эволюции.

35. Способ по пункту 34, при котором указанная матрица оценок представляет собой логарифмическую матрицу шансов.

36. Способ по пункту 35, при котором указанная логарифмическая матрица шансов представляет собой матрицу BLOSUM.

37. Способ по пункту 36, при котором указанная матрица BLOSUM представляет собой матрицу BLOSUM62.

38. Способ по пункту 37, при котором неоэпитопы, лишенные мутаций, связанных с парой аминокислотных замен с оценкой по BLOSUM62 ниже 1, исключены или имеют пониженный приоритет.

39. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий определение уровней экспрессии РНК указанных неоэпитопов, при этом неоэпитопы, для которых экспрессия РНК не обнаруживается, исключены или имеют пониженный приоритет.

40. Способ по пункту 39, при котором неоэпитопы с высоким уровнем экспрессии РНК ранжируются выше, чем неоэпитопы с более низким уровнем экспрессии РНК.

41. Способ по любому из пунктов 39 или 40, при котором указанные уровни экспрессии РНК определяют для МНС-связывающих неоэпитопов I и/или МНС II.

42. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий стадию сравнения пептидных последовательностей неоэпитопа с пептидными последовательностями протеома человека, при этом неоэпитопы, содержащие пептидную последовательность, которая соответствует пептидной последовательности в протеоме человека, исключены или имеют пониженный приоритет.

43. Способ по п. 42, при котором указанный неоэпитопный пептид содержит от 5 до 15 аминокислот или состоит из них.

44. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий стадию идентификации указанного множества неоэпитопов путем идентификации одной или нескольких опухолевых специфических мутаций у указанного индивидуума.

45. Способ по пункту 44, при котором указанную одну или несколько опухолеспецифических мутаций идентифицируют путем секвенирования экзома опухолевой ДНК указанного индивидуума.

46. Способ по любому из пунктов 44-45, при котором указанные одна или более опухолевые специфические мутации приводят к аминокислотным заменам.

47. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором указанная аффинность МНС-связывания включает определение генотипа HLA у указанного индивидуума.

48. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором указанный генотип HLA определяют по образцу крови указанного индивидуума.

49. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором указанную аффинность МНС I-связывания и/или МНС II определяют предсказанием in silico.

50. Способ по пункту 49, при котором указанное предсказание in silico выполняется с использованием компьютерной программы, которая предсказывает связывание пептидов с молекулами МНС класса I и/или МНС класса II.

51. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором неоэпитопы, присутствующие в генах, показывающих по меньшей мере в 5 раз более высокий уровень экспрессии РНК в данном органе или ткани по сравнению с другими органами или тканями, исключены или имеют пониженный приоритет.

52. Способ по пункту 51, при котором указанный орган выбран из сердца и мозга.

53. Способ по пункту 52, при котором указанный орган выбран из печени, легких, желудка, почки, селезенки, толстой кишки и кишечника.

54. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором стадия d дополнительно включает стадию определения частоты аллелей мутаций, присутствующих в неоэпитопах, связывающих МНС, при этом МНС-связывающие неоэпитопы с высокой частотой аллелей ранжируются выше МНС-связывающих неоэпитопов с более низкой частотой аллелей.

55. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором МНС-связывающие неоэпитопы, содержащие мутацию, обнаруженную в более чем одной биопсии, ранжируются над МНС-связывающими неоэпитопами, содержащими мутацию, обнаруженную только в одной биопсии.

56. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором указанные неоэпитопы имеют длину от 7 до 40 аминокислот.

57. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором указанные неоэпитопы имеют длину от 15 до 30 аминокислот.

58. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором указанные неоэпитопы имеют длину от 25 до 30 аминокислот, такую как от 27 аминокислот.

59. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором указанная мутация расположена по существу в середине последовательности неоэпитопа.

60. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором указанный индивидуум является больным раком.

61. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором неоэпитопы, отобранные для указанного индивидуума, используются в противораковой вакцине.

62. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором А представляет собой целое число от 1 до 100, такое как от 5 до 50, такое как от 5 до 30.

63. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором А представляет собой целое число от 10 до 20.

64. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором х > у.

65. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором х ≥ 2у.

66. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором х > 2,5у.

67. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором А ≥ 3.

68. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором по меньшей мере некоторые из А неоэпитопов, например, А/2 из А неоэпитопов, например, от А/2 до А из А неоэпитопов способны индуцировать CD8+ Т-клеточный ответ.

69. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем указанный способ включает следующие стадии:

a. Получение множества неоэпитопов от указанного индивидуума, где каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере 3 минимальных эпитопа, причем каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере одну иммуногенную мутацию по сравнению с эталонными последовательностями;

b. Определение аффинности связывания МНС I и МНС II для каждого из указанных неоэпитопов, тем самым идентифицируя х МНС I-связывающих неоэпитопов и у МНС II-связывающих неоэпитопов, где х + у ≥ 3;

c. Отбор неоэпитопов с предсказанной способностью связываться по меньшей мере с МНС I и необязательно с МНС II, с получением таким образом МНС-связывающих неоэпитопов;

d. Ранжирование МНС-связывающих неоэпитопов с точки зрения вероятности их клинического применения; при этом ранжирование осуществляется следующим образом:

i. Неоэпитопы ранжируются в соответствии с числом МНС I- и необязательно МНС II-связывающих минимальных эпитопов, которые они включают, где большее число дает более высокий ранг;

e. Отбор А неоэпитопов из МНС I-связывающих неоэпитопов наивысшего ранга, тем самым отбирая неоэпитопы А, которые могут иметь клиническое применение.

70. Способ по пункту 69, при котором число минимальных МНС I-связывающих эпитопов, содержащихся в неоэпитопе, превышает число минимальных МНС II-связывающих эпитопов, содержащихся в указанном неоэпитопе, например, вдвое больше.

71. Способ по любому из пунктов 69-70, при котором после стадии i. стадии d следует стадия ii, где:

ii. Определяется дифференциальный показатель связывания МНС I и/или МНС II для неоэпитопа, где дифференциальный показатель МНС I-связывания дается формулой (% ранговая оценка (МНС I) для эталона) / (% ранговая оценка (МНС I) для неоэпитопа) и дифференциальный показатель МНС II-связывания дается формулой (% ранговая оценка (МНС II) для эталона) / (% ранговая оценка (МНС II) для неоэпитопа); где неоэпитопы с высоким дифференциалом связывания имеют более высокий ранг, чем неоэпитопы с более низким дифференциалом связывания.

72. Способ по пункту 70, при котором неоэпитопы ранжируются в убывающем порядке следующим образом:

1) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа равен или больше 20, минимальный эпитоп имеет наивысшую оценку;

2) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа равен или больше 20, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 1);

3) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа ниже 20 и равен или больше 3, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 2);

4) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа ниже 20 и равен или больше 3, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 3);

5) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа меньше 3 и равен или больше 1, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 4);

6) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа меньше 3 и равен или больше 1, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 5);

7) если минимальный эпитоп имеет мутацию с дифференциальным показателем связывания ниже 1, независимо от позиции мутации, минимальный эпитоп имеет самую низкую оценку.

73. Способ по любому из пунктов 69-72, при котором после стадии i. или стадии ii. стадии d следует стадия iii, на которой:

iii. Неоэпитопы ранжируются в соответствии с их % ранговой оценкой, при этом неоэпитопы с низкой % ранговой оценкой ранжируются выше, чем неоэпитопы с высокой % ранговой оценкой.

74. Способ по пункту 73, при котором % ранговая оценка неоэпитопа равна самой низкой % ранговой оценке минимальных эпитопов, которые он включает.

75. Способ по любому из пунктов 73-74, при котором предсказано, что неоэпитоп или минимальный эпитоп:

- сильно связывает МНС I, если его % ранговая оценка (МНС I) ≤ 0,5;

- слабо связывает МНС I, если 0,5 < % ранговая оценка (МНС I) ≤ 2;

- не связывает МНС I, если его % ранговая оценка (МНС I) > 2.

76. Способ по любому из пунктов 73-75, при котором предсказано, что неоэпитоп или минимальный эпитоп:

- сильно связывает МНС I, если его % ранговая оценка (МНС II) ≤ 2;

- слабо связывает МНС I, если 2% ранговая оценка (МНС II) ≤ 10;

- не связывает МНС I, если его % ранговая оценка (МНС II) > 10.

77. Способ по любому из пунктов 69-76, при котором после стадии i., ii. или iii. следует стадия iv, на которой:

iv. Неоэпитопы оцениваются в соответствии с их оценкой по BLOSUM, при котором низкая оценка по BLOSUM дает более высокую оценку.

78. Способ по любому из пунктов 69-77, при котором неоэпитопы с оценкой по BLOSUM <3, такой, как оценка по BLOSUM <2, такой, как оценка по BLOSUM <1, такой, как оценка по BLOSUM <0, являются приоритизированными.

79. Способ отбора числа А неоэпитопов для индивидуума, причем указанный способ включает следующие стадии:

a. Получение одного или нескольких неоэпитопов от указанного индивидуума, причем каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере один минимальный эпитоп, причем каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере одну мутацию, такую как иммуногенная мутация, по сравнению с эталонной последовательностью;

b. Определение аффинности МНС I-связывания по меньшей мере для одного минимального эпитопа, такого как по меньшей мере два, три или четыре минимальных эпитопа в каждом из указанных неоэпитопов, и определение числа минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, для каждого из указанных неоэпитопов;

c. Ранжирование неоэпитопов следующим образом:

i. приоритизация неоэпитопов, содержащих большое число минимальных эпитопов и отбор первой группы неоэпитопов, имеющих высокую оценку;

ii. необязательно, приоритизация неоэпитопов из первой группы неоэпитопов следующим образом:

1) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа равен или больше 20, минимальный эпитоп имеет наивысшую оценку;

2) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа равен или больше 20, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка для минимальных эпитопов из 1);

3) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа ниже 20 и равен или больше 3,

оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 2);

4) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа ниже 20 и равен или больше 3, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 3);

5) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа меньше 3 и равен или больше 1, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 4);

6) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа меньше 3 и равен или больше 1, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 5);

7) если минимальный эпитоп имеет мутацию с дифференциальным показателем связывания ниже 1, независимо от позиции мутации, минимальный эпитоп имеет самую низкую оценку.

где дифференциальный показатель МНС I-связывания дается формулой (% ранговая оценка (МНС I) для эталона) / (% ранговая оценка (МНС I) для минимального эпитопа); и отбор второй группы неоэпитопов, имеющих высокую оценку;

iii. необязательно, приоритизация неоэпитопов из второй группы на основе их % ранговой оценки в отношении МНС I и отбор третьей группы неоэпитопов, имеющих низкую % ранговую оценку в отношении МНС I;

iv. необязательно, отбор четвертой группы неоэпитопов из второй или третьей группы, включающей минимальные эпитопы с высоким сходством с эпитопами, о которых известно, что они распознаются Т-клетками;

v. приоритизация неоэпитопов из второй группы, третьей группы или

из четвертой группы, основанная на их оценке по BLOSUM, где оценка по BLOSUM меньше, чем заданное пороговое значение, получает более высокий ранг, чем оценка по BLOSUM, равная указанному пороговому значению или превышающая его, и отбор пятой группы неоэпитопов, имеющих оценку по BLOSUM меньше указанного порогового значения, причем указанное пороговое значение предпочтительно равно 1;

где первая, вторая, третья, четвертая или пятая группа неоэпитопов включает указанные

А неоэпитопов.

80. Способ по пункту 79, при котором стадия с включает стадии i. и ii., или i. и iii., или i. и iv., или i. и v., или i., ii. и iii., или i., ii. и iv. или i., iii. и iv. или i., ii. и v., или i., iii. и v., или i., iv. и v., или i., ii., iii. и iv., или i., ii., iii. и v., или i., ii., iv. и v., или i., iii., iv. и v., или i., ii., iii., iv. и v.

81. Способ по любому из пунктов 79-80, при котором способ дополнительно включает в себя любые признаки способа по любому из пунктов 1-78.

82. Способ отбора числа А неоэпитопов для индивидуума, причем указанный способ включает следующие стадии:

a. Получение одного или нескольких неоэпитопов от указанного индивидуума, где каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере один минимальный эпитоп, причем каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере одну мутацию, такую как иммуногенная мутация, по сравнению с эталонной последовательностью;

b. Определение аффинности МНС I-связывания для каждого из указанных неоэпитопов и определение числа минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, для каждого из указанных неоэпитопов;

c. Ранжирование неоэпитопов следующим образом:

i. приоритизация неоэпитопов, содержащих большое число

минимальных эпитопов, связывающихся с МНС I, и отбор первой группы неоэпитопов, имеющих высокую оценку;

ii. необязательно, приоритизация неоэпитопов из первой группы неоэпитопов следующим образом:

1) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа равен или больше 20, минимальный эпитоп имеет наивысшую оценку;

2) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа равен или больше 20, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка для минимальных эпитопов, равная 1;

3) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа ниже 20 и равен или больше 3, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 2);

4) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа ниже 20 и равен или больше 3, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 3);

5) если мутация находится в якорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа меньше 3 и равен или больше 1, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 4);

6) если мутация находится в неякорной позиции и дифференциальный показатель связывания минимального эпитопа меньше 3 и равен или больше 1, оценка минимального эпитопа ниже, чем оценка минимальных эпитопов из 5);

7) если минимальный эпитоп имеет мутацию с дифференциальным показателем связывания ниже 1,

независимо от позиции мутации, минимальный эпитоп

имеет самую низкую оценку; где дифференциальный показатель МНС I-связывания дается формулой (% ранговая оценка (МНС I) для контроля)/(% ранговая оценка (МНС I) для минимального эпитопа); и отбор второй группы неоэпитопов, имеющих высокую оценку;

iii. необязательно, приоритизация неоэпитопов из второй группы на основе их % ранговой оценки в отношении МНС I и отбор третьей группы неоэпитопов, имеющих низкую % ранговую оценку в отношении МНС I;

iv. необязательно, отбор четвертой группы неоэпитопов из второй или третьей группы, включающей минимальные эпитопы с высоким сходством с эпитопами, о которых известно, что они распознаются Т-клетками,

v. необязательно, приоритизация неоэпитопов из второй группы, из третьей группы или из четвертой группы на основе их оценки по BLOSUM, при этом оценка по BLOSUM меньше заранее определенного порогового значения ранжируется выше, чем оценка по BLOSUM, равная или превышающая указанное пороговое значение, и отбор пятой группы неоэпитопов, имеющих оценку по BLOSUM меньше указанного порогового значения, причем указанное пороговое значение предпочтительно равно 1.

vi. необязательно, отбор неоэпитопов из первой, второй, третьей, четвертой или пятой группы неоэпитопов на основе неоэпитопов, обнаруженных в двух или более образцах, и отбор шестой группы неоэпитопов, обнаруженных в двух или более образцах;

vii. необязательно, отбор неоэпитопов из первой, второй, третьей, четвертой, пятой или шестой группы неоэпитопов на основе идентификации мутации по меньшей мере двумя различными определителями вариантов и отбор седьмой группы неоэпитопов, включающей мутацию, идентифицированную по меньшей мере двумя различными определителями вариантов,

при этом первая, вторая, третья, четвертая, пятая, шестая или седьмая группа неоэпитопов включает указанные А неоэпитопов.

83. Способ по пункту 82, при котором стадия с включает стадии i. и ii., или i. и iii., или i. и iv., или i. и v., или i. и vi., или i. и vii., или i., ii. и iii., или i., ii. и iv., или i., ii. и v., или i., ii. и vi., или i., ii. и vii., или i., iii. и iv., или i., iii. и v., или i., iii. и vi., или i., iii. и vii., или i., iv. и v., или i., iv. и vi., или i., iv. и vii., или i., v. и vi., или i., v. и vii., или i., vi. и vii., или ii., iii. и iv., или ii., iii. и v., или ii., iii. и vi., или ii., iii. и vii., или ii., iv. и v., или ii., iv. и vi., или ii., iv. и vii., или ii., v. и vi., или ii., v. и vii., или ii., vi. и vii., или iii., iv. и v., или iii., iv. и vi., или iii., iv. и vii., или iii., v. и vi., или iii., v. и vii., или iii., vi. и vii., или iv., v. и vi., или iv., v. и vii., или iv., vi. и vii., или v., vi. и vii.

84. Способ по любому из пунктов 82-83, при котором способ дополнительно включает любой из признаков способа по любому из пунктов 1-78.

85. Способ получения противораковой вакцины, включающей неоэпитопы, причем указанный способ включает стадию отбора указанных неоэпитопов с применением способа по любому по любому из пунктов 1-78 или 79-84.

86. Способ по пункту 85, при котором выбраны от 10 до 20 неоэпитопов.

87. Способ по любому из пунктов 85-86, при котором указанная вакцина содержит нуклеотидную конструкцию, содержащую:

- единицу нацеливания

- единицу димеризации

- первый линкер

- антигенную единицу, где указанная антигенная единица включает А-1 антигенных субъединиц, причем каждая субъединица содержит последовательность, кодирующую по меньшей мере один из указанных неоэпитопов и второй линкер, и указанная антигенная единица дополнительно содержит финальную последовательность, кодирующую один из указанных неоэпитопов, где п представляет собой целое число от 1 до 100, например, от 3 до 50,

где указанная нуклеотидная конструкция применяется в противораковой вакцине в иммунологически эффективном количестве.

88. Способ по любому из пунктов 85-87, при котором второй линкер представляет собой серин-глициновый линкер.

89. Способ по любому из пунктов 85-88, при котором единица нацеливания обладает аффинностью к хемокиновому рецептору, выбранному из CCR1, CCR3 и CCR5.

90. Способ по пункту 89, при котором единица нацеливания содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с аминокислотами 5-70 из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 (MIP1a).

91. Противораковая вакцина, которую можно получить с помощью способа по любому из пунктов 85-90.

92. Противораковая вакцина по пункту 91, где указанная противораковая вакцина содержит нуклеотидную конструкцию, содержащую:

- единицу нацеливания

- единицу димеризации

- первый линкер

- антигенную единицу, где указанная антигенная единица включает п-1 антигенных субъединиц, причем каждая субъединица содержит последовательность, кодирующую по меньшей мере один из указанных неоэпитопов и второй линкер, и указанная антигенная единица дополнительно содержит финальную последовательность, кодирующую один из указанных неоэпитопов, где п представляет собой целое число от 1 до 100, такое как от 3 до 50.

где указанная нуклеотидная конструкция применяется в противораковой вакцине в иммунологически эффективном количестве.

93. Противораковая вакцина по любому из пунктов 91-92, где второй линкер представляет собой серин-глициновый линкер.

94. Противораковая вакцина по любому из пунктов 91-93, где единица нацеливания обладает аффинностью к хемокиновому рецептору, выбранному из CCR1, CCR3 и CCR5.

95. Противораковая вакцина по любому из пунктов 91-94, где единица нацеливания содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с аминокислотами 5-70 из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 (MIP1a).

96. Способ отбора числа А неоэпитопов для индивидуума, при этом указанный способ включает следующие стадии:

a. Получение одного или нескольких неоэпитопов от указанного индивидуума, где каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере один минимальный эпитоп, причем каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере одну мутацию, такую как иммуногенная мутация, по сравнению с эталонной последовательностью;

b. Определение аффинности связывания МНС I и/или МНС II для каждого из указанных неоэпитопов;

c. Отбор неоэпитопов, содержащих по меньшей мере один минимальный эпитоп с предсказанной способностью связываться с МНС I и/или с МНС II, с получением таким образом МНС-связывающих неоэпитопов;

d. Ранжирование МНС-связывающих неоэпитопов по отношению к их вероятности клинического применения;

e. Отбор А неоэпитопов из МНС-связывающих неоэпитопов наивысшего ранга, при котором А представляет собой целое число и А равно по меньшей мере 3, например, по меньшей мере 4, например, по меньшей мере 5,

тем самым отбирая А неоэпитопов, способных вызывать CD8+ Т-клеточный ответ при введении индивидууму в иммунологически активном количестве.

97. Способ по пункту 96, при котором способ дополнительно включает любой из признаков способа по любому из пунктов 1-78.

98. Способ отбора числа А неоэпитопов для индивидуума, страдающего или подозреваемого в заболевании раком, причем указанный способ включает стадии:

a. Получение одного или нескольких неоэпитопов от указанного индивидуума, где каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере один минимальный эпитоп, причем каждый неоэпитоп содержит по меньшей мере одну мутацию, такую как иммуногенная мутация, по сравнению с эталонной последовательностью, причем минимальный эпитоп состоит из количества аминокислот, равного или меньше, чем количество аминокислот неоэпитопа, и содержит указанную по меньшей мере одну мутацию; где предпочтительно получение неоэпитопов включает стадию идентификации мутаций в последовательностях нуклеиновых кислот, которые специфичны для опухоли;

b. Определение аффинности связывания МНС I и/или МНС II по меньшей мере для одного минимального эпитопа, например, по меньшей мере для двух, трех или четырех минимальных эпитопов в каждом из указанных неоэпитопов, необязательно при этом аффинность связывания определяется предсказанием in silico;

c. Отбор неоэпитопов, содержащих по меньшей мере один минимальный эпитоп с предсказанной способностью связываться с МНС I и/или с МНС II, с получением таким образом МНС-связывающих неоэпитопов;

d. Ранжирование МНС-связывающих неоэпитопов с точки зрения вероятности их клинического применения;

e. Отбор А неоэпитопов из МНС I-связывающих неоэпитопов наивысшего ранга, тем самым отбирая А неоэпитопов, которые могут иметь клиническое применение, при этом стадия d дополнительно включает ранжирование неоэпитопов следующим образом: