ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ВЕЗИКУЛЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК Российский патент 2023 года по МПК C12N5/775 A61K35/28 A61P3/10 A61P1/16 A61P7/06 A61P17/02 

Область изобретения

В настоящем изобретении раскрыта композиция, содержащая внеклеточные везикулы (EV, от англ. extracellular vesicles), происходящие из CD106^{высокая}CD151^{+нестин+} мезенхимальных стволовых клеток (MSC) плацентарной ткани.

Согласно первому аспекту изобретение относится к конкретному способу получения этих EV.

Согласно второму аспекту изобретение относится к терапевтической, диагностической, ветеринарной или косметической композиции, содержащей внеклеточные везикулы, полученные указанным конкретным способом.

Согласно третьему аспекту изобретение относится к композиции, содержащей эти EV, для применения в качестве лекарственного средства для лечения субъектов, страдающих от ишемической болезни, расстройства системы кровообращения, иммунопаталогии, повреждения органов или нарушения функций органов.

Предшествующий уровень техники

Всесторонние исследования терапевтического потенциала мезенхимальных стволовых клеток (MSC, от англ. mesenchymal stem cells) для репарации и регенерации пораженных тканей были проведены как на доклинических, так и на клинических стадиях. MSC опосредуют иммуномодулирование, а также прорегенеративное действие. Например, для MSC показано, что они улучшают заживление ран у мышей с диабетом посредством стимулирования эпителизации, ангиогенеза и образования грануляционной ткани. В других исследованиях показано, что происходящие из костного мозга MSC эффективны в лечении ран, в том числе хронических ран, посредством стимулирования ангиогенеза и удаления рубцов. Непосредственное применение MSC, происходящих из костного мозга или пуповины, в случае пациентов с хроническими незаживающими ранами приводит к закрытию ран и восстановлению кожи.

В частности, РСТ/ЕР 2017/082316 относится к способу получения СD106^{высокая}СD151⁺нестин⁺ MSC для различных терапевтических применений, таких как, например, в случае заболеваний сосудов и наличия ран. Эти MSC демонстрируют повышение проангиогенных активностей среди других активностей.

Были изучены механизмы, лежащие в основе целебных свойств MSC, связанных с заживлением. Интересно, что предыдущие результаты Shabbir и др., полученные согласно анализам заживления ран, не позволили сделать вывод о том, что сами MSC дифференцируются, чтобы заменить поврежденные ткани (фибробласты). Вместо этого было показано, что MSC способствуют миграции фибробластов, что является неотъемлемой частью процесса заживления, даже без прямого контакта (Shabbir и др., 2015). Это подчеркивает важность паракринной передачи сигналов между MSC и пораженными клетками. Считается, что этот паракринный эффект является результатом секреции этими MSC различных факторов и внеклеточных везикул (EV). Эти везикулы содержат двухслойную липидную мембрану, подобную таковой у исходных MSC, и несут различные белки, матричные РНК и микроРНК (карго), происходящие из этих MSC, факторы, которые усиливают эндогенные механизмы репарации и регенерации.

Внеклеточные везикулы (EV), такие как экзосомы и микровезикулы, действительно ранее были идентифицированы как основные медиаторы этих паракринных эффектов клеток, действующие в качестве медиаторов передачи сигнала в иммунных биологических процессах (Raposo и др., 1996). С тех пор было обнаружено, что EV опосредуют взаимодействие между иммунными клетками различных типов и также между опухолевыми и иммунными клетками. В зависимости от источника клеток EV могут стимулировать или подавлять провоспалительные реакции.

Клетки и особенно MSC могут высвобождать множество везикул различных типов в окружающую их внеклеточную среду. В совокупности названные как EV, они включают экзосомы (30-150 нм), микровезикулы, которые образуются в виде отростков плазматической мембраны, (100-1000 нм) и апоптотические тельца (более 500 нм). Они содержат липиды, белки и РНК. Они опосредуют целенаправленную межклеточную передачу сигнала в процессах физиологической и патофизиологической коммуникации.

EV, выделенные из MSC, набирают популярность в качестве новой стратегии достижения терапевтических эффектов стволовых клеток без рисков и трудностей, отмечаемых при введении клеток пациентам. EV, происходящие из MSC, действительно имеют несколько ключевых преимуществ по сравнению с клеточными продуктами, что оправдывает усилия по внедрению EV в клинику:

- введение EV, происходящих из MSC, может быть безопасным.

EV, происходящие из MSC, были применены на возрастающем количестве различных животных моделей и были протестированы в случае пациента, страдающего от плохо поддающейся лечению стероидами острой формы болезни "трансплантат против хозяина" (острой формы GVHD - (от англ. graft-versus-host disease - болезни "трансплантат против хозяина")), а также в группе пациентов с хроническим заболеванием почек (Giebel и др., 2017). К настоящему времени введение EV, происходящих из MSC, по-видимому является безопасным для людей и во всех протестированных животных моделях.

В отличие от клеточных продуктов EV не способны к самовоспроизведению и поэтому лишены какого-либо потенциала эндогенного образования опухолей.

Известно, что биологические свойства и функции клеток могут подвергаться влиянию и перепрограммироваться под действием факторов окружающей среды. Поскольку у EV отсутствуют подробно описанные метаболические активности, то маловероятно, что их функция может быть перепрограммирована окружающей средой. Таким образом, биологическая активность и функциональные свойства EV можно определять и контролировать с большей точностью, чем в случае клеток.

При средних размерах меньше 200 нм EV можно стерилизовать путем фильтрования. Благодаря этому ощутимо снижается риск биологического загрязнения соответствующих терапевтических средств.

- С EV намного проще работать, чем с клетками.

По-видимому, условия замораживания, размораживания и хранения менее критичны для EV, чем для клеток. Чтобы приготовить клеточные трансплантаты у постели больного, необходимо иметь специально обученный персонал, без которого можно обойтись в случае приготовления терапевтических средств на основе EV y постели больного.

Терапевтические EV могут быть получены из супернатантов клеточных линий, клетки которых не должны быть использованы для способов терапии с применением самих этих клеток. Таким образом, масштабирование получаемых EV может быть проведено намного проще, чем в случае терапевтических средств на основе клеток.

Применение EV, полученных из MSC, для бесклеточной терапии набирает популярность (Phinney & Pittenger, Stem Cells, 2017), и в нескольких исследованиях продемонстрирована роль EV, секретируемых MSC, в ангиогенезе:

- экзосомы, секретируемые MSC, стимулируют ангиогенез эндотелиальных клеток посредством переноса микроРНК-125а (Liang et al., J. Cell Sci., 2016),

- экзосомы, высвобождаемые из MSC, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, способствуют заживлению ран на коже посредством стимулирования синтеза коллагена и ангиогенеза (Zhang J. и ДР., 2015),

- полученные из MSC экзосомы вызывают пролиферацию и миграцию фибробластов в случае обычных и хронических ран и усиливают ангиогенез in vitro (Shabbir и др., 2015),

- экзосомы, полученные из MSC пуповины человека, усиливают ангиогенез посредством пути WNT4/катенин (Zhang В. и др., 2015).

В обзоре Than UTT и др. от 2017 г. описаны другие исследования, в которых действительно показано, что EV вовлечены в регуляцию ряда клеточных процессов, необходимых для заживления ран. В частности, EV могли оказывать влияние на процесс коагуляции, клеточную пролиферацию, миграцию, ангиогенез, образование коллагена и ремоделирование внеклеточного матрикса. Помимо передачи информации от исходных секретирующих клеток, матричная РНК (мРНК) и микроРНК из EV также могут стимулировать биологические процессы, включая пролиферацию, ангиогенез и апоптоз.

EV-опосредованная регуляция пролиферации клеток, важного для заживления ран процесса, была продемонстрирована с использованием EV, происходящих из клеток множества типов, таких как MSC, фибробласты, мышиные эмбриональные стволовые клетки и пропредшественники эндотелиальных клеток человека. В частности, в результате интернализации EV, происходящих из MSC, фибробластами достигается дозозависимое усиление пролиферации и миграции этих фибробластов независимо от того, произошли ли они от обычных доноров или от пациентов с хроническими ранами.

EV могут стимулировать пролиферацию клеток посредством активации не только сигнальных путей, непосредственно вовлеченных в стимуляцию клеточного цикла, но также сигнальных путей, вовлеченных в регуляцию экспрессии факторов роста. Кроме того, такая сверхэкспрессия факторов роста может действовать, в свою очередь, в качестве паракринного или аутокринного сигналов для стимулирования пролиферации клеток.

Также было показано, что EV, высвободившиеся из таких клеток, как кератиноциты или MSC человека, оказывают влияние на миграцию эндотелиальных клеток, что является важнейшим фактором для репарации и регенерации сосудов.

Все типы EV (микровезикулы и экзосомы) в той или иной степени способствуют регуляции образования сосудов посредством усиления экспрессии проангиогенных факторов. Например, экзосомы, высвобождаемые под действием человеческих эмбриональных MSC и человеческих эндотелиальных клеток, усиливают ангиогенез посредством стимулирования пролиферации и миграции эндотелиальных клеток к месту раны. На участках, обработанных экзосомами, наблюдали большее количество кровеносных сосудов по сравнению с контрольной обработкой.

На основании всех этих анализов можно предположить, что EV, происходящие из MSC, можно с безопасностью применять в лечении ран и в регенеративной медицине сосудистых патологий.

Dongdong Ti и др. (Journal of translational medicine, 2015) описали внеклеточные везикулы, очищенные из MSC, полученных из пуповины, которые предварительно обрабатывают провоспалительным фактором липополисахаридом (LPS).

Yunbing Wu и др. (BioMed Research International, 2017) описывали противовоспалительные свойства внеклеточных везикул, происходящих из нестимулированных мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповины человека.

Ни в одной из этих двух публикаций не предлагается добавлять интерлейкин(IL)1β и/или IL4 для стимулирования MSC с целью получения EV, обогащенных по ангиогенному маркеру CD106.

В более широком смысле, ни в одном из документов предшествующего уровня техники даже не предполагается лечение с применением MSC вместе с IL4, не говоря уже об улучшении их проангиогенных свойств. В этом контексте авторы настоящего изобретения показали в WO 2018/108859, что культивирование MSC вместе с IL4 и IL1β приводит к значительному и неожидаемому повышению на поверхности уровня проангиогенных поверхностных маркеров, таких как CD106. В частности, как показано в примере 4 из WO 2018/108859, усиление экспрессии CD106, наблюдаемое в случае комбинации IL1β и IL4, в 3 раза превышает такое усиление, наблюдаемое в случае применения только IL1β, а усиление экспрессии CD106, наблюдаемое в случае комбинации IL1β и IL4, в 5 раз превышает такое усиление, наблюдаемое в случае применения только IL4. Такой эффект ранее никогда не наблюдали.

В представленной в данном описании работе продемонстрировано, что проангиогенная и противовоспалительная активности СD106^{высокая}СD151⁺нестин⁺ MSC, полученных согласно способу, описанному в РСТ/ЕР 2017/082316 (WO 2018/108859), по существу обуславливаются EV, происходящими из этих MSC. Поэтому авторы изобретения предлагают использовать биологический продукт, содержащий эти EV, поскольку, - вследствие их выработки благодаря MSC, - они демонстрируют повышенный уровень проангиогенных/провоспалительных поверхностных белков. Соответственно, этот биологический продукт проявляет такую же повышенную проангиогенную активность, что и исходные MSC, без ограничений в отношении их применения в клинической практике и в промышленности.

Помимо наличия у них терапевтического потенциала EV можно использовать в качестве биомаркеров, в частности, при диагностике рака. Среди 35 проводимых в настоящее время клинических испытаний, относящихся к использованию экзосом при раке, приблизительно две три относятся к диагностическим средствам, а остальные к терапевтическим средствам (Roya и др., 2018).

Подробное описание изобретения

Таким образом, согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к композиции, содержащей внеклеточные везикулы (EV) из СD106^{высокая}СD151⁺нестин⁺ MSC, которые были получены согласно способу, описанному в заявке РСТ/ЕР 2017/082316 (опубликованной как WO 2018/108859).

Этот способ получения включает две приведенные ниже общие стадии:

(1) культивирование мезенхимальных стволовых клеток, полученных из биологической ткани или жидкости, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,

и

(2) приведение в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей провоспалительные факторы роста или воспалительные медиаторы, в результате чего происходит образование представляющих интерес СD106^{высокая}СD151⁺нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток, которые будут использованы для получения EV по изобретению.

Указанная "популяция недифференцированных MSC" может быть получена посредством сбора мононуклеарных клеток, присутствующих в биологической ткани или жидкости, и выращивания их в первой культуральной среде. Эти мононуклеарные клетки могут быть получены любым традиционным способом, например, посредством ферментативного расщепления или культивирования эксплантата в виде кусочков ткани перинатального происхождения (Otte и др., 2013), или выделения из биологических жидкостей (Van Pham и др., 2016).

Культивирование эксплантата представляет собой особо предпочтительный способ получения таких MSC из пуповины, как показано ниже в примере 3.

Обычно для осуществления этого способа необходимо извлечь образец из раствора для транспортировки, разрезать на секции (длиной ориентировочно 2-3 см), дезинфицировать их антибиотиками и противогрибковыми агентами, которые затем отмывают, чтобы восстановить ткань и избавиться от кусочков указанной ткани в колбах, к которым будет происходить прикрепление (предпочтительно без среды, при комнатной температуре), после чего на прикрепившиеся эксплантаты осторожно добавить полную среду и инкубировать при 37°С в течение нескольких суток. В конечном итоге мигрирующие клетки собирают, используя соответствующие приспособления, и поддерживают в культуре в соответствующей первой среде (см. ниже), пока они не достигнут намеченной конфлюентности.

Указанная "первая культуральная среда" может представлять собой любую классическую среду, обычно используемую, чтобы благоприятствовать росту живых первичных клеток. Предпочтительно, она не содержит ни каких-либо факторов роста, ни каких-либо факторов дифференцировки.

Специалисту хорошо известно, культуральные среды какого типа можно использовать в качестве "первой культуральной среды". Ими являются, например, DMEM, DMEM/F12, MEM (минимальная поддерживающая среда), MEM в альфа-модификации (α-МЕМ), IMDM (модифицированная по методу Исков среда Дульбекко) или RPMI (среда от Мемориального института Розуэлла Парка). Предпочтительно, указанной первой культуральной средой является DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла) или DMEM/F12 (модифицированная Дульбекко среда Игла с питательной смесью Хэма F12).

Более предпочтительно, указанная первая культуральная среда содержит 2-20% или 2-10% фетальной телячьей сыворотки. Альтернативно, указанная первая культуральная среда может содержать 1-5% тромбоцитарного лизата. Наиболее предпочтительная среда содержит 2-20% или 2-10% фетальной телячьей сыворотки и 1-5% тромбоцитарного лизата.

Кроме того, в качестве первой культуральной среды возможно применение среды, которая не содержит сыворотки крови или тромбоцитарного лизата, при условии, что она содержит другие соответствующие агенты, благоприятствующие росту первичных живых клеток.

В предпочтительном воплощении указанная "биологическая ткань" представляет собой какую-либо часть плацентарной ткани или пуповины. В частности, она может включать в себя котиледоны плаценты, амниотическую мембрану или хориальную оболочку плаценты или состоять из них. Кроме того, может присутствовать вартонов студень, обнаруженный в пуповине. Она может включать в себя вены и/или артерии или не иметь их.

В другом воплощении указанная "биологическая жидкость" представляет собой образец пуповинной крови, плацентарной крови или амниотической жидкости, которые в целом без причинения вреда были отобраны у женщины или млекопитающего. Например, эти ткани и жидкости могут быть получены после рождения ребенка или произведения потомства без каких-либо инвазивных процедур.

Указанная популяция недифференцированных MSC предпочтительно представляет собой высеянную на пластиковую поверхность популяцию мезенхимальных стволовых клеток, которая была культивирована в указанной первой культуральной среде, не содержащей какого-либо фактора роста, до достижения клетками конфлюентности 85-90%.

Систематически клетки характеризуют фенотипически методом сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) или любым традиционным способом, чтобы определить уровень поверхностных маркеров CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 и HLA-DR (человеческие лейкоцитарные антигены, сублокус DR).

Если 95% клеток экспрессируют положительные поверхностные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и меньше 2% экспрессируют отрицательные поверхностные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR, то клетки подвергают трипсинизации и вновь высевают с низкой плотностью, например, с плотностью 1000-5000 MSC на один см², во вторую культуральную среду.

Предпочтительно, чтобы указанная "вторая культуральная среда" представляла собой любую классическую среду, обычно используемую, чтобы благоприятствовать росту живых первичных клеток. Это может быть та же среда, что и "первая культуральная среда", или это может быть другая среда, выбранная, например, среди DMEM, DMEM/F12, MEM, альфа-MEM (α-МЕМ), IMDM или RPMI. Более предпочтительно, указанной второй культуральной средой является DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла) или DMEM/F12 (модифицированная Дульбекко среда Игла с питательной смесью Хэма F12).

Еще более предпочтительно, чтобы указанная вторая культуральная среда содержала сыворотку крови или тромбоцитарный лизат, например, в диапазоне 2-20% фетальной телячьей сыворотки и/или 1-5% тромбоцитарного лизата. Наиболее предпочтительной второй средой является DMEM, содержащая 2-20% фетальной телячьей сыворотки и 1-5% тромбоцитарного лизата. Кроме того, в качестве второй культуральной среды возможно применение среды, которая не содержит сыворотки крови или тромбоцитарного лизата, при условии, что она содержит другие соответствующие агенты, благоприятствующие росту первичных живых клеток.

Когда клетки достигают конфлюентности 40-50%, во вторую культуральную среду добавляют провоспалительные факторы роста или воспалительные медиаторы и клетки культивируют в указанной среде до тех пор, пока они не достигнут конфлюентности 90-95%.

Указанными "провоспалительными факторами роста" обычно являются интерлейкины или хемокины, которые, как известно, оказывают провоспалительный эффект. Примеры интерлейкинов, которые могут быть добавлены во вторую культуральную среду, включают альфа-фактор некроза опухоли (TNFα), IL1, IL4, IL12, IL18 и интерферон-гамма (IFNγ). Примеры хемокинов, которые могут быть добавлены во вторую культуральную среду, включают хемокины СХС-типа CXCL8, CXCL10, CXCL1, CXCL2, CXCL3, хемокины СС-типа CCL2 и CCL5. Можно использовать другие участвующие в воспалении медиаторы (такие как противовоспалительные агенты).

В предпочтительном воплощении по меньшей мере два провоспалительных фактора роста добавляют во вторую культуральную среду, определенную выше. Эти по меньшей мере два провоспалительных фактора роста выбраны из группы, состоящей из: TNFα, IL1, IL4, IL12, IL18 и IFNγ. В более предпочтительном воплощении указанные провоспалительные факторы роста выбраны среди IL1, IL4, IL12, IL18. Еще более предпочтительно они представляют собой IL1 и IL4.

Типичная концентрация фактора(ов) роста, который(ые) может(могут) быть добавлен(ы) к MSC, находится в диапазоне 1-200 нг/мл, предпочтительно в диапазоне 1-100 нг/мл, более предпочтительно в диапазоне 10-80 нг/мл. Предпочтительно, продолжительность стадии культивирования MSC вместе с фактором(ами) роста составляет по меньшей мере одни сутки, более предпочтительно двое суток.

Термин "IL1" в данном описании означает любую изоформу интерлейкина 1, в частности, IL1α и IL1β. Изоформы IL1 могут происходить из различных источников, в зависимости от предполагаемого применения. Например, для применений в ветеринарии можно использовать IL1 животного происхождения. Предпочтительно, во вторую культуральную среду по изобретению добавляют только IL1β. В этом конкретном воплощении концентрация добавленного интерлейкина 1β может находиться в диапазоне 1-100 нг/мл, предпочтительно в диапазоне 1-50 нг/мл, более предпочтительно в диапазоне 10-40 нг/мл.

Человеческий IL1-бета (IL1β или IL1b) снабжен ссылкой на номер доступа NP_000567.1. В продаже имеется рекомбинантный белок, соответствующий условиям GMP (надлежащая производственная практика) (RnD Systems, Thermofisher, Cellgenix, Peprotech).

Термин "IL4", использованный в данном описании, означает любую изоформу интерлейкина 4. IL4 может происходить из различных источников, в зависимости от предполагаемого применения. Например, для применений в ветеринарии можно использовать IL4 животного происхождения.

Человеческий IL4 снабжен ссылкой на номер доступа ААА59149. В продаже имеется рекомбинантный белок, соответствующий условиям (RnD Systems, Thermofisher, Cellgenix, Peprotech).

В указанной второй среде можно использовать любую смесь разных провоспалительных факторов роста. В частности, предпочтительным воплощением является применение смеси IL1 и IL4, более конкретно, IL1β и IL4, как описано ниже в экспериментальной части.

В этом конкретном воплощении добавленный интерлейкин 1β имеет концентрацию, находящуюся в диапазоне 1-100 нг/мл, предпочтительно в диапазоне 1-50 нг/мл, более предпочтительно в диапазоне 10-40 нг/мл, и добавленный IL4 имеет концентрацию, находящуюся в диапазоне 1-100 нг/мл, предпочтительно в диапазоне 1-50 нг/мл, более предпочтительно в диапазоне 10-40 нг/мл во второй культуральной среде. Предпочтительно, продолжительность стадии культивирования вместе с интерлейкином 1β и IL4 составляет по меньшей мере одни сутки, более предпочтительно двое суток. Обычно, концентрация добавленного интерлейкина 1β составляет 10 нг/мл, и концентрация добавленного интерлейкина IL4 составляет 10 нг/мл. Поэтому клетки предпочтительно культивируют в культуральной среде, содержащей интерлейкин как 1β, так и IL4 в концентрации 10 нг/мл, при этом продолжительность этой стадии культивирования составляет, например, двое суток.

Чтобы определять уровень поверхностных маркеров CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 и HLA-DR в ходе их продуцирования, можно оценивать фенотипические характеристики клеток любыми общепринятыми способами. Эти маркеры хорошо известны в данной области техники. Все антитела, полезные для определения уровня экспрессии этих маркеров, имеются в продаже.

В первую очередь экспрессию этих маркеров клеточной поверхности можно оценить, применяя хорошо известные технологии, такие как окрашивание клеточных мембран с использованием биотинилирования или других эквивалентных методов с последующей(им) и ммуно преципитацией специфическими антителами, проточной цитометрией, вестерн-блоттингом, иммуноферментным твердофазным анализом (ELISA) или проведением метода иммуноферментных пятен (ELISPOT), использованием антительных микрочипов или тканевых микрочипов в сочетании с иммуногистохимией. Другие подходящие методы включают метод резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) или резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET), методы микроскопии или гистохимии на одиночных клетках с использованием одной или нескольких длин волн возбуждения и применением любого из адаптированных оптических методов, а также электрохимические методы (методы вольтаметрии и амперометрии), методы атомно-силовой микроскопии и радиочастотные методы, например, многополюсную резонансную спектроскопию, конфокальную и не конфокальную, определение сигнала флуоресценции, люминесценции, хемилюминесценции, поглощения, отражения, пропускания и двойного лучепреломления или показателя преломления (например, методом поверхностного плазмонного резонанса, эллипсометрией, методом резонансного зеркала, методом волновода с решетчатым устройством (англ. grating coupler waveguide method) или интерферометрией), магнитно-резонансную томографию, анализ посредством электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE); фракционирование с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC); времяпролетную масс-спектроскопию с ионизацией посредством лазерной десорбции ионов из матрицы (MALDI-TOF); жидкостную хроматографию/масс-спектрометрию/масс-спектрометрию (LC-MS/MS). Предпочтительно, уровни маркеров на поверхности клетки оценивают посредством FACS.

Конкретно, для получения представляющих интерес MSC обычно необходимо:

а) собрать мононуклеарные клетки, содержащиеся в биологической ткани или жидкости перинатального происхождения,

b) обеспечить условия для роста указанных мононуклеарных клеток в первой культуральной среде до достижения ими конфлюентности 85-90%, предпочтительно на пластиковой поверхности,

c) после того, как 95% клеток станут экспрессировать положительные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и меньше 2% станут экспрессировать отрицательные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR, высеять клетки при плотности 1000-5000 MSC на один см² во вторую культуральную среду,

d) добавить воспалительные медиаторы или провоспалительные факторы роста в диапазоне концентрации 1-100 нг/мл после того, как клетки достигнут конфлюентности 40-50%,

e) собрать клетки, когда они достигнут конфлюентности 90-95%.

Затем собранные клетки можно охарактеризовать фенотипически посредством FACS или любым традиционным способом, чтобы определить уровень поверхностных маркеров CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 и HLA-DR. Указанные первая и вторая культуральные среды описаны выше.

На стадии d) указанного способа типичная концентрация добавленного(ых) фактора(ов) роста находится в диапазоне 1-200 нг/мл, предпочтительно в диапазоне 1-100 нг/мл, более предпочтительно в диапазоне 10-80 нг/мл. Предпочтительно, продолжительность стадии культивирования вместе с фактором(ами) роста составляет по меньшей мере одни сутки, более предпочтительно двое суток.

На стадии d) указанного способа концентрация добавленного интерлейкина 1β или IL4 может находиться в диапазоне 1-100 нг/мл, предпочтительно в диапазоне 1-50 нг/мл, более предпочтительно в диапазоне 10-40 нг/мл. Предпочтительно, продолжительность стадии культивирования вместе с интерлейкином 1β и IL4 составляет по меньшей мере одни сутки, более предпочтительно двое суток. Обычно, концентрация добавленного интерлейкина 1β составляет 10 нг/мл, и концентрация добавленного интерлейкина IL4 составляет 10 нг/мл. Поэтому клетки предпочтительно культивируют в культуральной среде, содержащей оба интерлейкина 1β и IL4 в концентрации 10 нг/мл, причем продолжительность этой стадии культивирования составляет, например, двое суток.

Окончательно собранные клетки будут представлять собой "MSC по изобретению", "представляющую интерес клеточную культуру", или "представляющие интерес СD106^{высокая}СD151⁺нестин⁺ MSC", или "EV-продуцирующие клетки". В этой клеточной культуре обычно содержится свыше 60%, предпочтительно от 60 до 70%, предпочтительно свыше 70%, предпочтительно свыше 80%, более предпочтительно свыше 90% и еще более предпочтительно свыше 95% клеток, экспрессирующих CD106. Кроме того, в ней содержится свыше 98%, предпочтительно свыше 99% клеток, экспрессирующих CD151. Кроме того, в ней содержится свыше 98%, предпочтительно свыше 99% клеток, экспрессирующих нестин. И наконец, в ней содержится свыше 95%, предпочтительно свыше 96%, предпочтительно свыше 97%, предпочтительно свыше 98% клеток, экспрессирующих положительные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и содержится меньше 2% клеток, экспрессирующих отрицательные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR.

Известно, что CD106 (также известный как VCAM-1, что расшифровывается как "молекула 1 адгезии сосудистых клеток") имеет три изоформы. Последовательностями этих изоформ a, b и с являются NP_001069.1, NP_542413.1 и NP_001186763.1, соответственно. Антитела для детектирования уровня экспрессии этого конкретного биомаркера имеются в продаже (например, производимые Thermofisher, Abcam, OriGen и т.д.). Экспрессия этого маркера на поверхности MSC является очень важным свойством, поскольку он запускает проангиогенные активности, которые играют существенную роль для их терапевтического применения.

Биомаркер нестин у людей зарегистрирован под номером NP_006608.1. Антитела для детектирования уровня экспрессии этого конкретного биомаркера имеются в продаже (например, производимые Thermofisher, Abcam и т.д.).

Биомаркер CD151 у людей зарегистрирован под номером NP_620599. Антитела для детектирования уровня экспрессии этого конкретного биомаркера имеются в продаже (например, производимые Invitrogen, Sigma-Aldrich, Abeam и т.д.).

Более конкретно, для получения представляющих интерес MSC обычно необходимо:

a) осуществить сбор, возможно по отдельности, плацентарных тканей от нескольких доноров;

b) возможно выполнить с использованием 1х PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) трехкратную промывку плацентарной ткани, нарезанной на кубики размером 1 мм³, и промывку этих кубиков ткани вновь для удаления большей части крови из ткани;

c) возможно провести процесс переваривания коллагеназой плацентарной ткани от каждого донора по отдельности, центрифугирование подвергнутой перевариванию ткани и сбор мононуклеарных клеток;

d) высеять собранные мононуклеарные клетки в культуральную среду;

e) провести трипсинизацию и пересев клеток после того, как они достигнут конфлюентности 85-90%;

f) охарактеризовать клетки с учетом процентной доли клеток, которые экспрессируют положительные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR;

g) высеять клетки в культуральную среду, содержащую 90% модифицированной Дульбекко среды Игла/F12-KnockOut (DMEM/F12-KO) и 10% FBS (фетальная телячья сыворотка) и факторы роста, с плотностью посева 1000-5000 MSC на один см², когда среди них содержатся по меньшей мере 95%, экспрессирующих положительные маркеры, и не больше 2%, экспрессирующих отрицательные маркеры;

h) осуществить добавление интерлейкина 1β в диапазоне 1-100 нг/мл и возможно IL4 в диапазоне 1-100 нг/мл, как только клетки достигнут конфлюентности 40-50%,

i) провести трипсинизацию и сбор клеток после того, как они достигнут конфлюентности 90-95%; и

j) возможно охарактеризовать клетки с учетом процентной доли клеток, которые экспрессируют положительные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR.

Клетки, полученные посредством этих способов, далее используют для получения EV по изобретению.

Термин "внеклеточные везикулы" (EV) представляет собой общий термин для обозначения клеточных везикул, размер которых изменяется в диапазоне от приблизительно 30 нм до нескольких мкм. Экзосомы среди них составляют наиболее полно описанные классы EV. Экзосомы имеют диаметр меньше примерно 150 нм и являются производными эндосомного компартмента. EV содержат цитозольные и мембранные белки, происходящие из родительских клеток. Содержание белка в EV зависит от их клеточного происхождения, и EV обогащены определенными молекулами, особенно эндосома-ассоциированными белками (например, CD63) и белками, вовлеченными в образование мультивезикулярных телец, а также содержат направляющие молекулы/молекулы адгезии. Примечательно, что EV содержат не только белки, но также функционально активную мРНК, длинные некодирующие РНК и микроРНК, и показано, что в некоторых случаях они доставляют этот генетический материал в реципиентные клетки.

Под "внеклеточными везикулами" или "EV" понимают мембранные везикулы, высвобождаемые клетками в свое микроокружение из своей плазматической мембраны, или внутриклеточные везикулы, извлеченные после разрушения клеточной мембраны. В контексте настоящего изобретения EV обычно имеют диаметр меньше или равный примерно 500 нм, в частности, от примерно 30 до примерно 500 нм, или от примерно 40 до примерно 500 нм, или от примерно 50 до примерно 250 нм. EV окружены фосфолипидной мембраной, которая предпочтительно содержит холестерин, сфингомиелин и церамид с относительно высокими уровнями и также предпочтительно содержит устойчивые к детергентам мембранные домены (липидные рафты).

Состав белков в мембранах EV аналогичен таковому в мембранах клеток. Обычно EV характеризуются наличием актина β, белков, вовлеченных в мембранный транспорт и слияние мембран (таких как Rab, ГТФазы (гуанозинтрифосфатазы), аннексины и флотиллин), компонентов эндосомального комплекса сортировки, необходимого для транспорта (ESCRT, от англ. endosomal sorting complexes required for transport) (таких как Alix), гена 101 восприимчивости к опухоли (TSG101), белков теплового шока (HSP, таких как HSPA8, HSP90AA1, HSC70 и HSC90), интегринов (таких как CD62L, CD62E или CD62P) и тетраспанинов (в частности, CD63, CD81, CD82, CD53, CD9 и/или CD37). В приведенных ниже примерах их присутствие определяют по комбинации маркеров CD9 и CD81 и по отсутствию калнексина.

Кроме того, в объеме изобретения рассматривается применение секретома клеток СD106^{высокая}СD151⁺нестин⁺ MSC, которые были получены согласно способу, описанному в РСТ/ЕР 2017/082316. Использованный в данном описании термин "секретом" обозначает все факторы, которые секретируются клеткой, включая EV, белки (факторы роста, хемокины, цитокины, молекулы адгезии, протеазы и т.д.), липиды, микроРНК, мРНК. Полагают, что секретом клеток СD106^{высокая}СD151⁺нестин⁺ MSC, которые были получены согласно способу, описанному в РСТ/ЕР 2017/082316, оказывает те же проангиогенные биологические эффекты, что и CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ MSC, описанные в РСТ/ЕР 2017/082316.

EV могут быть очищены от представляющих интерес MSC клеток различными методами, такими как методы, описанные в работах Konoshencko и др., 2018 или Lai и др., 2010.

Дифференциальное центрифугирование

Метод включает несколько стадий, в том числе по меньшей мере следующие три стадии от 1) до 3):

1) центрифугирование на малых оборотах для удаления клеток и клеточного дебриса (меньше 10000 × g),

2) центрифугирование на более высоких оборотах для устранения более крупных везикул и, окончательно

3) высокоскоростное центрифугирование для осаждения EV (выше 100000 × g).

Полученный препарат EV далее очищают и выделенные везикулы отбирают в соответствии с их размером, используя микрофильтрацию суспензии. Центрифугирование в градиенте плотности

Этот подход сочетает ультрацентрифугирование и применение градиента плотности сахарозы. Более конкретно, центрифугирование в градиенте плотности используют для отделения EV от не являющихся везикулами частиц, таких как белки и агрегаты белок/РНК. Таким образом, этот метод позволяет осуществлять отделение везикул от частиц, обладающих другой плотностью. Очень важным является надлежащее время центрифугирования, в противном случае во фракциях EV могут все еще присутствовать загрязняющие частицы, если они характеризуются близкой плотностью. Согласно результатам недавних исследований, для проведения центрифугирования в градиенте плотности сахарозы рекомендуется использовать EV в виде осадка после ультра центрифугирования.

Гельпроникающая хроматография

Гельпрон икающую хроматографию используют для разделения макромолекул на основании их размера и формы, а не молекулярной массы. В этом методе применяется колонка, заполненная пористыми полимерными шариками, содержащими многочисленные поры и каналы. Прохождение молекул через эти шарики зависит от диаметра молекул. Молекулам небольшого радиуса требуется больше времени для миграции через поры в шариках колонки, в то время как макромолекулы элюируются из колонки раньше. Гельпроникающая хроматография позволяет осуществить точное разделение молекул большого и малого размера. Кроме того, в этом методе могут быть применены разные элюирующие растворы.

Ультрафильтрация

Для выделения EV также можно использовать ультрафильтрационные мембраны. В зависимости от размера микровезикул этот метод позволяет осуществлять отделение EV от белков и других макромолекул с большой молекулярной массой. Кроме того, EV можно выделять посредством их захвата при прохождении через пористую структуру. Наиболее распространенные фильтрационные мембраны имеют размеры пор 0,8 мкм, 0,45 мкм или 0,22 мкм, и их можно использовать для сбора EV размером выше 800 нм, 400 нм или 200 нм. В частности, для выделения EV размером 40-100 нм была разработана реснитчатая структура на основе микростолбиков из пористого кремния (англ. micropillar porous silicon ciliated structure). На начальной стадии удаляются более крупные везикулы. На следующей стадии совокупность EV концентрируют на фильтрационной мембране. Стадия выделения является относительно короткой, но для осуществления этого метода требуется предварительная инкубация кремниевой структуры с буфером на основе PBS. На следующей стадии совокупность EV концентрируют на фильтрационной мембране.

Осаждение с использованием полимеров

Метод осаждения, основанного на использовании полимеров, обычно включает смешивание биологической жидкости с содержащим полимер раствором, предназначенным для осаждения, инкубирование при 4°С и ультрацентрифугирование. Одним из наиболее распространенных полимеров, применяемых для основанного на использовании полимеров осаждения, является полиэтилен гликоль (ПЭГ), предпочтительно ПЭГ 6000 или ПЭГ 8000. Осаждение с использованием этого полимера имеет ряд преимуществ, включая умеренное воздействие на выделяемую EV и использование нейтральных рН. Разработано несколько коммерческих наборов, в которых для выделения EV применяется ПЭГ. Наиболее часто используемым набором является ExoQuick™ (System Biosciences, Mountain View, CA, USA). В недавних исследованиях было продемонстрировано, что самый высокий выход EV получали, используя метод ультрацентрифугирования совместно с набором ExoQuick™.

Иммунологическое выделение

Разработано несколько методов иммунологического выделения EV, основанных на использовании внешних или внутренних по отношению к поверхности мембраны EV белков либо внутриклеточных белков EV. Однако эти методы обычно применяют для обнаружения, анализа и количественного определения белков EV.

В приведенных ниже примерах использована ультрафильтрация.

EV, полученные путем очистки от клеток MSC, полученных согласно вышеупомянутому способу получения, в дальнейшем именуются как "EV по изобретению". Они проявляют повышенную проангиогенную активность (как и производящие их клетки MSC) по сравнению с EV предшествующего уровня техники.

Как показано в приведенном ниже примере 8, эти EV характеризуются, в частности, тем, что они демонстрируют наличие:

(1) CD106 на детектируемом уровне, и

(2) CD200 на детектируемом уровне.

Важно отметить, что они демонстрируют наличие проангиогенных маркеров CD106/VCAM и CD200 на более высоком уровне, чем EV предшествующего уровня техники (см. Фиг. 3). Они также демонстрируют наличие ряда других ангиогенных маркеров, таких как фактор 7 роста фибробластов (FGF7), CCL2 и ангиопоэтин 1 (см. Фиг. 4).

Эти маркеры хорошо известны в данной области техники, и детектирующие их антитела имеются в продаже. Их присутствие можно оценить любым традиционным методом, таким как вестерн-блоттинг.

Согласно настоящему изобретению EV "демонстрирует наличие маркера на детектируемом уровне", если уровень присутствия указанного маркера оказывается значительным, т.е. если сигнал, связанный с окрашиванием указанного маркера (обычно полученный с использованием антитела, распознающего указанный маркер, причем антитело, например, связано с флуоресцентным красителем), который измеряют для указанного EV, превосходит сигнал, соответствующий окрашиванию EV, которые известны как не демонстрирующие наличие указанного маркера. Специалист хорошо осведомлен в том, как идентифицировать указанные клетки/маркеры, поэтому нет необходимости подробно описывать эти протоколы в данном документе.

Композиция по изобретению в основном содержит внеклеточные везикулы (EV) по изобретению, образованные MSC клетками, описанными в РСТ/ЕР 2017/082316.

В контексте настоящего изобретения количество EV, присутствующих в композиции, предпочтительно определяют, используя устройство NanoSight (выпускаемое фирмой Malvern), и в этом случае количество EV обозначают как "рр", что соответствует количеству частиц, обнаруживаемых устройством NanoSight.

Обычно композиция по изобретению содержит от 1×10⁸ до 1×10¹⁴ ppEV в одном мл, более предпочтительно от 1×10¹¹ до 1×10¹² ppEV в одном мл.

Согласно второму аспекту настоящее изобретение также относится к способу приготовления композиции, содержащей EV из MSC, полученных вышеупомянутым способом, включающему:

a) культивирование указанных MSC в не содержащей EV культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и

b) очистку EV от этих клеток.

Термин "не содержащая EV культуральная среда", который может быть использован в данном описании, относится, например, к классической базовой среде без добавок (такой как альфа-MEM, DMEM, DMEM/F12…) или к классической базовой среде, дополненной не содержащим везикул тромбоцитарным лизатом в количестве от 1 до 10%, предпочтительно 5%, более предпочтительно 8%. Перед приведением в контакт с MSC по изобретению она не содержит какой-либо экзогенной EV (после контакта с MSC по изобретению в этой среде начнут присутствовать EV, которые продуцируются MSC по изобретению). Таким образом, она не содержит ни сыворотки крови, ни тромбоцитарного лизата, которые могут содержать экзогенные везикулы.

Указанная не содержащая EV культуральная среда предпочтительно дополнена добавленным(ыми) фактором(ами) роста, концентрация которого(ых) находится в диапазоне 1-200 нг/мл, предпочтительно в диапазоне 1-100 нг/мл, более предпочтительно в диапазоне 10-80 нг/мл. Более предпочтительно, указанная культуральная среда дополнена интерлейкином 1β и/или IL4, концентрация которых находится в диапазоне 1-100 нг/мл, предпочтительно в диапазоне 1-50 нг/мл, более предпочтительно в диапазоне 10-40 нг/мл. Обычно, концентрация добавленного интерлейкина 1β в указанной среде составляет 10 нг/мл, и концентрация добавленного интерлейкина IL4 в указанной среде составляет 10 нг/мл. Поэтому клетки предпочтительно культивируют в не содержащей EV культуральной среде, которая содержит оба интерлейкина 1β и IL4 в концентрации 10 нг/мл, причем продолжительность этой стадии культивирования составляет, например, двое суток.

Условия, допускающие размножение MSC клеток, были описаны выше. Важный момент заключается в том, что клетки должны быть в удовлетворительном состоянии, поскольку вследствие гибели клеток и наличия апоптотических телец препарат EV может оказаться загрязненным. Таким образом, следует применять условия, допускающие амплификацию MSC клеток и поддержание их экспоненциального роста, и очистку EV необходимо проводить до окончания экспоненциальной фазы роста, т.е. до выхода на плато, когда гибель клеток становится значительной. В случае сред, содержащих компоненты из сырья животного происхождения (например, сыворотку крови), следует проводить истощение среды по EV. Для этого можно осуществить центрифугирование культуральной среды при 100000 × g в течение 8-16 часов (например, в течение ночи) при примерно 4°С.

Культивирование MSC в указанных условиях обычно продолжается от 1 до 7 суток, предпочтительно от 1 до 5 суток, более предпочтительно от 2 до 3 суток, еще более предпочтительно в течение 72 ч.

Для терапевтических целей данный способ в полном объеме предпочтительно следует проводить в стерильных условиях.

Очистка EV может быть проведена любым из вышеупомянутых методов (предпочтительно посредством ультрафильтрации, как показано в приведенном ниже экспериментальном разделе).

Описанные ниже результаты также показывают, что применение способов по изобретению обеспечивает возможность образования EV, демонстрирующих высокий уровень мембранного белка CD106/VCAM1. Важно отметить, что этот белок ассоциирован с экспрессией проангиогенных цитокинов и провоспалительных белков (Han Z.C., et al., Bio-medical Materials and Engineering, 2017, и Du W. et al., Stem Cell research & therapy, 2016). Таким образом, EV no изобретению, которые демонстрируют высокий уровень белка CD106, можно использовать вследствие наличия у них проангиогенной/провоспалительной эффективности.

Katoh & Katoh [Stem Cell Investig., 2019, 6: 10) упоминают, что CD200 участвует во множестве физиологических и патологических процессов на стыке ремоделирования сосудов и иммунной регуляции. CD200 представляет собой трансмембранный белок, который экспрессируется в ряде клеток, таких как В- и Т-лимфоциты, эндотелиальные клетки, нейроны и островковые клетки поджелудочной железы, и экспрессия которого усиливается под действием IL4. CD200 передает сигналы через рецептор CD200 (CD200R), трансмембранный белок. Опосредуемая CD200-CD200R передача сигнала играет критическую роль в случаях рака и нераковых заболеваний посредством регуляции иммунитета и ангиогенеза. Например, по сравнению с CD200- клетками меланомы В16, CD200+ клетки меланомы В16 демонстрируют усиленный онкогенез вследствие размножения клеток этой миелоидной линии и повышенного опухолевого ангиогенеза, что показано на мышах с нокаутом гена Cd200r.

В связи с этим, согласно третьему аспекту настоящее изобретение относится к композиции, содержащей внеклеточные везикулы, происходящие из СD106^{высокая}СD151⁺нестин⁺ MSC, полученных согласно способу, описанному в РСТ/ЕР 2017/082316, для применения для лечения субъектов, страдающих от ишемической болезни, расстройства системы кровообращения, иммунопаталогии, повреждения органов или нарушения функций органов. Другими словами, изобретение относится к применению указанных EV для приготовления лекарственного средства, предназначенного к использованию для лечения субъектов, страдающих от ишемической болезни или от расстройства системы кровообращения. Кроме того, лекарственное средство по изобретению можно применять в отношении капиллярной сети сосудов кожи и можно включать в состав наносимых на кожу дерматологических и косметических композиций.

Предпочтительно, композиция по изобретению не содержит каких-либо клеток; в частности, она не содержит каких-либо MSC клеток. Обычно в качестве единственного действующего начала она содержит только EV по изобретению. Кроме того, она может содержать фармацевтический носитель или адъювант, указанный ниже.

Композицию, содержащую EV по изобретению, вводят в терапевтически эффективных количествах.

Использованный в данном описании термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству, достаточному для предполагаемого применения. В случае проангиогенных композиций по изобретению он относится к количеству, достаточному, чтобы вызвать миграцию и/или пролиферацию эндотелиальных клеток.

Вводимая доза может варьировать в зависимости от возраста субъекта, площади поверхности тела или массы тела либо от пути введения и связанной с ним биодоступности. Такая адаптация дозы хорошо известна специалистам в данной области техники.

Лечению композициями/EV по изобретению может быть подвергнуто любое млекопитающее. Указанным млекопитающим может быть домашнее животное (собака, кошка, лошадь и т.д.) или животное - представитель крупного рогатого скота (овца, коза, корова и т.д.). Специалисту очевидно, что, если животное получает лечение согласно способу по изобретению, то изначальные недифференцированные MSC будут получены из биологического образца от того же вида животных (аллогенного трансплантата) или от схожего вида (гетерологичного трансплантата), и факторы роста, которые используются во второй культуральной среде, будут соответствовать факторам роста животного того же вида. Например, если получает лечение кошка, то изначальные MSC будут получены из ткани перинатального происхождения или биологической жидкости кошки, и во вторую культуральную среду будет добавлен IL1β кошки (рекомбинантный или нет), возможно наряду с IL4 кошки.

В предпочтительном воплощении указанным млекопитающим является человек. В этом случае изначальные MSC будут получены из ткани перинатального происхождения или биологической жидкости, полученной от женщины, и во вторую культуральную среду будет добавлен человеческий IL1β (рекомбинантный или нет), возможно наряду с человеческим IL4.

С этой целью указанному субъекту можно вводить или применять местно композицию по изобретению любым общепринятым способом. В этом случае, настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта, страдающего от ишемической болезни, расстройства системы кровообращения, иммунопаталогии, повреждения органов или нарушения функций органов, причем указанный способ включает стадию введения описанной выше композиции указанному субъекту. Такое введение может быть осуществлено посредством использования имплантируемого резервуара, или путем инъекции EV in situ в мышцу, или посредством внутривенных инъекций, или с использованием любой соответствующей системы доставки. Кроме того, введение можно выполнить местно путем непосредственного приведения в контакт EV с кожей или слизистой оболочкой, либо путем нанесения EV на кожу или на любую слизистую оболочку с использованием устройства, либо путем доставки EV с использованием любой соответствующей системы доставки в кожу или любую слизистую оболочку.

Предпочтительно, указанное заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из: сахарного диабета 1 типа, диабета II типа, GVHD, апластической анемии, рассеянного склероза, мышечной дистрофии Дюшенна, ревматоидного артрита, мозгового инсульта, идиопатического легочного фиброза, дилатационной кардиомиопатии, остеоартрита, цирроза, печеночной недостаточности, почечной недостаточности, окклюзионного заболевания периферических артерий, критической ишемии конечностей, заболевания периферических сосудов, сердечной недостаточности, диабетической язвы или любого дегенеративного заболевания, синехии, патологии эндометрия или фиброзного поражения желудочно-кишечного тракта, такого как свищ прямой кишки. Более предпочтительно, указанное заболевание или расстройство представляет собой окклюзионное заболевание периферических артерий, критическую ишемию конечностей, заболевание периферических сосудов или диабетическую язву. В конкретном воплощении указанное заболевание или расстройство представляет собой заболевание кожи или слизистой оболочки, включая (но не ограничиваясь этим) диабетическую язву, язву, травму, ожог, ожог паром или жидкостью, рану или проблему с заживлением ран, пролежень, бородавку и так далее.

EV по изобретению более конкретно можно использовать в дерматологическом препарате, цель создания которого заключается в лечении таких кожных патологий, как ожоги, раны, язвы, рубцы, бородавки или другие заболевания, такие как синехия или фиброзные поражения желудочно-кишечного тракта (например, свищ прямой кишки).

В другом конкретном воплощении указанное заболевание или расстройство представляет собой свищ прямой кишки или повреждение эндометрия.

Настоящей заявкой охватываются и другие применения. В частности, существует возможность применения EV и композиций по изобретению для решения диагностических, дерматологических и косметических задач, например, для регенерации клеток кожи или слизистой оболочки, улучшения внешнего вида кожи или слизистой оболочки, исправления дефекта кожи или слизистой оболочки либо для заживления обожженного участка кожи или слизистой оболочки.

Чтобы повысить эффективность и облегчить введение лекарственного средства по изобретению, EV по изобретению можно смешивать с любым агентом, композицией агентов или сочетать с другим биологически совместимым материалом или устройством. Кроме того, EV по изобретению могут быть инкапсулированы или включены в любую соответствующую систему доставки или любой соответствующий биосовместимый материал. EV или композиции, содержащие их, можно применять вместе с медицинским устройством, таким как эндоскоп, стент или шприц, например. Его также можно наносить местно путем приведения в контакт EV с кожей или слизистой оболочкой.

В случае внутривенного, внутриопухолевого или интраназального введения могут быть использованы водные суспензии, изотонические физиологические растворы или стерильные инъекционные растворы, которые содержат фармакологически совместимые диспергирующие агенты и/или увлажняющие агенты. В качестве эксципиента можно использовать, воду, спирты, пол иолы, глицерин, растительные масла и так далее.

В случае местного введения композиции могут быть представлены в форме геля, пасты, мази, крема, лосьона, водной или водной-спиртовой жидкой суспензии, масляного раствора, дисперсии типа лосьона или сыворотки, безводного или липофильного геля, эмульсии жидкой или полутвердой консистенции типа молока, приготовленной путем диспергирования жировой фазы в водной фазе или наоборот, суспензий или эмульсий мягкой или полутвердой консистенции типа крема или геля либо, альтернативно, микроэмульсий, микрокапсул, микрочастиц или везикулярных дисперсий ионного и/или неионного типа. Эти композиции готовят согласно стандартным способам. Кроме того, в композицию можно включить поверхностно-активное вещество, чтобы обеспечить более глубокое проникновение EV. Агент, обеспечивающий улучшенное проникновение, может быть выбран, например, из минерального масла, этанола, триацетина, глицерина и пропиленгликоля; агенты когезии выбраны, например, из группы, содержащей полиизобутилен, поливинилацетат, поливиниловый спирт и загустители.

Подходящие составы для перорального введения, предназначенные для введения стандартных доз, в первую очередь включают таблетки, таблетки, покрытые оболочкой, пилюли, капсулы и мягкие желатиновые капсулы, пероральные порошки, гранулы, растворы и суспензии.

В случае приготовления твердой композиции в форме таблетки основной активный ингредиент можно смешивать с фармацевтическим разбавителем, таким как желатин, крахмал, лактоза, стеариновая кислота или стеарат магния, тальк, аравийская камедь или аналоги. Таблетки могут быть покрыты оболочкой из сахарозы или других подходящих материалов или даже быть обработаны таким образом, чтобы они оказывали пролонгированное или замедленное действие и непрерывно высвобождали определенное заранее количество активного ингредиента.

Препарат в форме капсулы может быть приготовлен путем смешивания активного ингредиента с разбавителем и заливки полученной смеси в мягкие или твердые капсулы вместе с такими эксципиентами, как растительные масла, воски, жиры, полутвердые или жидкие полиолы и так далее.

Препарат в форме сиропа или эликсира может содержать активный ингредиент вместе с подсластителем, антисептиком, а также придающим вкус агентом и подходящим красителем. Можно использовать такие эксципиенты, как вода, полиолы, сахароза, инвертированный сахар, глюкоза и так далее.

Порошки или диспергируемые в воде гранулы могут содержать активный ингредиент в смеси с диспергирующими агентами, увлажняющими агентами и суспендирующими агентами вместе с корректорами вкуса и подсластителями.

В случае подкожного введения можно использовать любой подходящий фармацевтически приемлемый разбавитель. В частности, можно использовать фармацевтически приемлемый масляный разбавитель, такой как кунжутное масло.

Настоящее изобретение также направлено на разработку медицинского устройства назначения, содержащего EV по изобретению. Под "медицинским устройством" в данном описании понимается любой инструмент, прибор, приспособление, машина, оборудование, имплантат, реагент для введения терапевтической композиции. В контексте данного изобретения указанным медицинским устройством является, например, пластырь, стент, эндоскоп или шприц.

Настоящее изобретение также направлено на разработку системы доставки, содержащей EV по изобретению. Под "системой доставки" в данном описании понимается любая система (среда или носитель) для введения фармацевтического продукта пациенту. Это может быть система для пероральной доставки или система с регулируемым высвобождением. В контексте изобретения указанной системой доставки являются, например, липосомы, пролипосомы, микросферы, микро- или нановезикулы из биополимеров, липиды или наночастицы.

В предпочтительном воплощении изобретения EV по изобретению включены в гидрогель или другой биосовместимый материал или эксципиент.Указанный гидрогель в первую очередь может включать гидрогель на основе альгината натрия, гидрогель на основе гиалуроновой кислоты, гидрогель на основе хитозана, гидрогель на основе коллагена, гидрогель на основе гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМС), гидрогель на основе поли-L-лизина, гидрогель на основе поли-L-глутаминовой кислоты, гидрогель на основе поливинилового спирта (PVA), гидрогель на основе полиакриловой кислоты, гидрогель на основе полиметилакриловой кислоты, гидрогель на основе полиакриламида (РАМ) и гидрогель на основе поли-N-акриламида (PNAM).

Настоящее изобретение также относится к гидрогелю, содержащему EV по изобретению и возможно другой биосовместимый материал или эксципиент. В данном изобретении предпочтителен гидрогель на основе альгината, такой как гидрогель на основе альгината, описанный в CN 106538515.

В контексте настоящего изобретения "биосовместимые материалы" представляют собой материалы, традиционно используемые в биомедицинских приложениях. Ими являются, например, металлы (такие как нержавеющая сталь, кобальтовые сплавы, титановые сплавы), керамика (оксид алюминия, диоксид циркония, фосфаты кальция), полимеры (силиконы, полиэтилен, поливинилхлорид, полиуретаны, полилактиды) или природные полимеры (альгинат, коллаген, желатин, эластин и т.д.). Эти материалы могут быть синтетическими или натуральными. Биосовместимые эксципиенты хорошо известны в данной области техники, и поэтому нет необходимости в их подробном описании.

Такой гидрогель можно использовать для косметических или терапевтических целей.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической или ветеринарной композиции, содержащей EV по изобретению, а также к ее применению для лечения заболеваний и расстройств, упомянутых выше. Оно также относится к дерматологической или косметической композиции, содержащей EV по изобретению.

Такая фармацевтическая, ветеринарная или косметическая композиция может дополнительно содержать другие биосовместимые агенты (например, гидрогель), которые описаны выше.

Указанная композиция предпочтительно содержит от 1×10⁸ до 1×10¹⁴ ppEV на один мл; более предпочтительно от 1×10¹¹ до 1×10¹² ppEV на один мл.

Описание фигур

На Фиг. 1 представлены результаты вестерн-блоттинга, демонстрирующие наличие/отсутствие маркеров CD9, CD81 и калнексина во внеклеточных везикулах, очистка которых описана в разделе Примеры. Дорожка А - клеточный лизат MDA клеток; дорожка В - клеточный лизат MSC по изобретению в альфа-MEM; дорожка С - EV по изобретению в альфа-МЕМ.

На Фиг. 2 представлены результаты анализа хемотаксической миграции в камере Бойдена, демонстрирующие паракринный эффект клеток, использованных для получения EV по изобретению, в отношении ECFC (от англ. endothelial colony forming cells - эндотелиальных колониеобразующих клеток) в присутствии или в отсутствие сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF). Столбец Т - уровень миграции в контрольной среде в отсутствие (-)/присутствии (+) VEGF (50 нг/мл). Столбец 1 - уровень миграции клеток из партии 1 в отсутствие (-)/присутствии (+) VEGF (50 нг/мл). Столбец 2 - уровень миграции клеток из партии 2 в отсутствие (-)/присутствии (+) VEGF (50 нг/мл). Столбец 3 - уровень миграции клеток из партии 3 в отсутствие (-)/присутствии (+) VEGF (50 нг/мл).

На Фиг. 3 представлены результаты вестерн-блоттинга, демонстрирующие содержимое EV, происходящих из MSC, предварительно обработанных в трех разных условиях: дорожка А - EV, происходящие из нестимулированных MSC, дорожка В - EV, происходящие из MSC, стимулированных IL1β и IL4 (EV по изобретению), и дорожка С - EV, происходящие из MSC, стимулированных LPS, как описано в примере 8. Протестировано шесть маркеров (CD9, CD81, Alix (от англ. ALG-2-interacting protein X - белок X, взаимодействующий с ALG-2), калнексин, VCAM (англ. vascular cell adhesion molecule - васкулярная молекула клеточной адгезии) и CD200). В лунку добавлено 20 мкг EV.

На Фиг. 4 демонстрируется различное содержание разных, связанных с ангиогенезом белков, определенное с использованием набора белков для EV, происходящих из MSC, предварительно обработанных в трех разных условиях (из нестимулированных, IL-стимулированных и LPS-стимулированных). Для каждого белка приводится средняя пиксельная интенсивность.

На Фиг. 5 представлены результаты вестерн-блоттинга, демонстрирующие содержимое MSC, предварительно обработанных в трех разных условиях: дорожка А - нестимулированные MSC, дорожка В - MSC, стимулированные IL1β и IL4 (MSC по изобретению), и дорожка С - MSC, стимулированные LPS, как описано в примере 8. Протестировано шесть маркеров (CD9, CD81, Alix, калнексин, VCAM и CD200). В лунку добавлен лизат в количестве, соответствующем 20 мкг белка.

Примеры

Для простоты и в иллюстративных целях настоящее изобретение описывается со ссылкой на свои типичные воплощения. Однако, специалисту средней квалификации в данной области техники будет очевидно, что настоящее изобретение может быть реализовано на практике без ограничения этими конкретными подробностями. В других случаях хорошо известные способы подробно не описаны, чтобы излишне не затруднять понимание настоящего изобретения.

Все приведенные ниже стадии 1-4 проведены так, как описано в разделе Примеры заявки РСТ/ЕР 2017/082316, которая тем самым включена посредством ссылки.

1. Выделение проангиогенных происходящих из пуповины мезенхимальных стволовых клеток (UCMSC)

Пуповину извлекали из раствора для транспортировки и разрезали на секции длиной 2-3 см. Каждый сегмент, содержащий сгусток крови, который невозможно было удалить, отбрасывали, чтобы избежать загрязнения прикрепившимися клетками крови. Затем эти секции дезинфицировали, промывая в ванне с антибиотиками и противогрибковыми агентами, содержащей αМЕМ плюс ванкомицин (1 г/л) плюс амоксициллин (1 г/л) плюс амикацин (500 мг/л) плюс амфотерицин В (50 мг/л), в течение 30 мин при комнатной температуре (КТ). Антибиотики растворяли в стерильной воде для инъекций экстемпорально.

Секции пуповины извлекали из ванны и быстро промывали в 1× PBS при комнатной температуре (КТ). Делали легкие надрезы на поверхностном слое эпителия, не затрагивая сосуды. Затем секцию разделяли на более мелкие срезы толщиной 0,5 см и помещали на дно площадью 150 см² пластиковой колбы с крышкой. Срезы в количестве от 6 до 10 на одну колбу размещали так, чтобы вокруг каждого среза оставалось свободное пространство радиусом по меньшей мере 1 см, и оставляли прикрепляться в течение 15 мин при КТ без добавления среды.

После прикрепления осторожно добавляли полную среду (аМЕМ плюс 5% тромбоцитарного лизата для клинического применения плюс гепарин (2 ед./мл)) для удержания эксплантатов в прикрепленном ко дну колбы состоянии. Затем содержимое колб инкубировали при 37°С, влажности 90% и 5% СО₂.

Культуральную среду меняли через 5-7 суток.

На 10-е сутки после выделения миграцию клеток из эксплантатов контролировали с использованием инвертированного микроскопа. Если вокруг большинства эксплантатов отмечали ореол прикрепленных клеток, то их осторожно извлекали, вынимая их из колбы через крышку с помощью стерильного, находящегося в распоряжении пинцета, предназначенного для одноразового использования.

Начиная с этого этапа, конфлюентность клеток визуально проверяли через сутки и при необходимости на 17-е сутки выполняли замену среды.

Когда клетки достигали конфлюентности 70-90% или значения D20, среду удаляли, клетки промывали, используя по 30 мл 1× PBS из расчета на одну колбу. Затем клетки открепляли с помощью трипсина, собирали вместе со старой средой и центрифугировали в течение 10 мин при 300×g. Супернатант отбрасывали, далее клетки суспендировали в растворе для криоконсервации, содержащем αМЕМ плюс сывороточный альбумин человека (HSA; 100 мг/мл) плюс 10% диметилсульфоксида (DMSO), и подвергали криоконсервации.

2. Размораживание и культивирование MSC клеток

Клетки размораживали, следуя классическому протоколу. Кратко, криопробирки извлекали из жидкого азота и быстро погружали в водяную баню с температурой 37°С. Как только в пробирке не оставалось льда, клетки разбавляли в предварительно нагретой (37°С) полной среде (αМЕМ плюс 0,5% (об./об.) ципрофлоксацина плюс гепарин (2 ед./мл) плюс 5% (об./об.) тромбоцитарного лизата (PL)) и быстро центрифугировали (300×g КТ, 5 мин).

После центрифугирования клетки суспендировали в предварительно нагретой полной среде и оценивали на предмет количества и жизнеспособности (используя трипановый синий/гемоцитометр Малассе).

Клетки рассевали при плотности 4000 клеток/см² в пластиковую колбу для культивирования, содержащую полную среду, и инкубировали (при влажности 90%, 5% CO₂, 37°С).

3. Стимуляция MSC клеток

После нескольких дней размножения выполняли проверку клеток на предмет конфлюентности. Когда конфлюентность достигала 30-50%, старую среду отбрасывали и заменяли либо на свежую полную среду для условий роста без стимуляции, либо на свежую среду, дополненную IL-1β (10 нг/мл) и IL-4 (10 нг/мл).

Затем клетки инкубировали в течение по меньшей мере 2 суток, после чего проводили эксперимент с использованием проточной цитометрии.

Эта стадия стимуляции была важна в плане придания MSC проангиогенного фенотипа, как описано в РСТ/ЕР 2017/082316.

Ангиогенную активность клеток из несколько партий тестировали в анализе с использованием камеры Бойдена (см. Фиг. 2).

Кратко, миграцию ECFC в ответ на градиент проангиогенных веществ оценивали в 24-луночной модифицированной камере Бойдена, на поликарбонатном мембранном фильтре с диаметром пор 8 мкм (BD Biosciences), покрытом фибронектином (20 мкг/мл) из плазмы крови крупного рогатого скота (Sigma-Aldrich - F1141). Перед проведением эксперимента дно лунок 24-луночного планшета засевали MSC клетками при плотности 6000 клеток/см² в шести повторах и клетки культивировали в течение 4 суток в αМЕМ плюс 1% SVF (стромально-васкулярная фракция). Готовили ряд лунок с контрольной средой, заполненных αМЕМ плюс 1% FBS.

После голодания в течение ночи в базовой среде ЕВМ-2 (базовой среде-2 для роста эндотелиальных клеток) (Lonza - СС-3156), дополненной 0,2% FBS, проводили загрузку ECFC в среде для голодания в верхнюю часть микрокамеры в количестве 200000 клеток/лунка.

В качестве положительного контроля для каждого из условий в три лунки из шести добавляли VEGF (Miltenyi - 130-109-383) в концентрации 50 нг/мл.

Через 5 ч инкубирования осуществляли удаление клеток с верхней поверхности мембранного фильтра посредством протирания ватным тампоном. Затем все мембраны окрашивали по методу Май-Грюнвальда-Гемза (MGG), монтировали и фотографировали.

На Фиг. 2 во всех колонках со знаком (-) представлено количество мигрировавших ECFC в отсутствие VEGF, тогда как во всех колонках со знаком (+) представлено количество мигрировавших ECFC в присутствии VEGF. Для контрольных условий (Т- и Т+) показано, что ECFC способны усиливать свою миграцию в присутствии VEGF. В условиях проведения испытаний (1, 2, 3) показано, что хотя партия 1, по-видимому, не оказывает влияния на поведение ECFC, обе партии 2 и 3 усиливают влияние VEGF на ECFC, и кроме того, партия 3 даже усиливает миграцию ECFC в отсутствие VEGF.

Поскольку в камерах Бойдена предотвращается контакт клетки с клеткой, этот эффект безусловно опосредован растворимыми внеклеточными медиаторами, либо растворимыми белками, либо внеклеточными везикулами.

4. Сбор и криоконсервация MSC клеток

Через 2-3 суток размножения/стимуляции выполняли проверку клеток на предмет конфлюентности. Если конфлюентность составляла до 80% включительно, то проводили сбор клеток. Кратко, старую среду отбрасывали и клетки промывали 1× DPBS (забуференный фосфатом физиологический раствор по Дульбекко). Добавляли трипсин-EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) и клетки инкубировали в течение 5 мин при 37°С. Действие трипсина нейтрализовали добавлением по меньшей мере двукратного объема среды, клеточную суспензию собирали и оценивали на предмет количества и жизнеспособности.

Клетки центрифугировали в течение 10 мин при 300×g. Супернатант отбрасывали, далее клетки суспендировали в растворе для криоконсервации, содержащем αМЕМ плюс HSA (100 мг/мл) плюс 10% DMSO, и подвергали криоконсервации.

5. Размораживание MSC клеток и приготовление кондиционированной среды

Клетки размораживали, следуя классическому протоколу. Кратко, криопробирки или криопакеты извлекали из жидкого азота и быстро погружали в водяную баню с температурой 37°С. Как только в пробирке не оставалось льда, клетки разбавляли в предварительно нагретой (37°С) αМЕМ и быстро центрифугировали (300×g, КТ, 5 мин).

После центрифугирования клетки суспендировали в предварительно нагретой полной среде и оценивали на предмет количества и жизнеспособности (используя трипановый синий/гемоцитометр Малассе).

Клетки рассевали при плотности 2000 клеток/см² в необходимом количестве пластиковых колб для культивирования площадью 300 см² для получения требуемого количества кондиционированной среды (1 (одна колба) Т300 соответствует 30 мл кондиционированной среды). Клетки инкубировали при влажности 90%, 5% CO₂, 37°С в αМЕМ, дополненной 0,5% (об./об.) циплофлоксацина, гепарином (2 ед./мл) и 8% (об./об.) подвергнутого центрифугированию PL. Подвергнутый центрифугированию PL получали путем центрифугирования PL в течение 1 ч при 6000×g и 10°С и извлечения супернатанта.

Через 5 суток среду заменяли. Когда клетки достигали конфлюентности 80% (на 6-е сутки), среду удаляли и клетки 3 раза промывали PBS. Добавляли не содержащую добавок αМЕМ из расчета 50 мл/Т300 и выдерживали в течение 24 ч. Через 24 ч среду заменяли на 30 мл либо не содержащей добавок αМЕМ, либо αМЕМ, дополненной везикулами в количестве 8% без PL (тромбоцитарного лизата).

Клетки оставляли для протекания секреции в течение 36 ч, среду извлекали, центрифугировали в течение 5 мин при 400×g и КТ в Heraeus Multifuge 3 S-R. Супернатант извлекали и замораживали при -80°С.

Клетки подвергали трипсинизации и анализировали на предмет их количества и жизнеспособности.

6. Выделение и определение характеристик внеклеточных везикул

Внеклеточные везикулы, происходящие из таких MSC, могут быть выделены любыми методами, известными в данной области техники, такими как, но не ограничиваясь этим, ультрацентрифугирование, ультрафильтрация, центрифугирование в градиенте плотности, гель-проникающая хроматография, использование набора для осаждения, иммуноаффинный захват, применение микрофлюидных устройств.

В этом эксперименте фракцию, обогащенную внеклеточными везикулами, отделяли посредством ультра фильтрации кондиционированной среды с последующей гель-проникающей жидкостной хроматографией (SEC).

Анализ количества и распределения внеклеточных везикул по размерам проводили с использованием метода анализа траекторий движения наночастиц (Nanosight).

Кроме того, содержимое EV по изобретению можно оценить посредством вестерн-блоттинга, используя приведенные далее условия.

Материалы и реагенты

Буфер для лизиса (RIPA) (от англ. radioimmunoprecipitation assay buffer - радиоиммуннопреципитационный анализ):

- дезоксихолат натрия 1%;

- SDS 0,1%;

- трис⋅Cl, рН 7,4 20 мМ;

- EDTA 1 мМ;

- NaCl 150 мМ;

- Тритон х-100 1%;

- коктейль ингибиторов протеаз (CIP, 100х), номер по каталогу Sigma Р8340.

Лизис клеток

К MSC клеткам в количестве 1×10⁶ добавляли 100 мкл холодного RIPA-буфера, содержащего CIP в 1× конечной концентрации.

Полученную смесь инкубировали в течение 10 мин на льду, центрифугировали в течение 15 мин при 4°С в течение 20 мин и затем извлекали супернатант.

Определение концентрации белков осуществляли с использованием набора для анализа микроколичеств белков с бицинхониновой кислотой (ВСА), номер по каталогу Pierce 23235.

Электрофорез проводили в используемых для разделения белков 4-12%-ных бис-трис-гелях с толщиной слоя 1,5 мм, имеющих 10 лунок, Novex Nosex (Life Technologies, NP0335PBOX) или NuPAGE® (рабочий буфер на основе 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты (MOPS) с SDS (20х)) (Life Technologies, NP0001). Образцы подвергали денатурации в течение 10 мин при 70°С, используя ¼ объема буфера, содержащего додецилсульфат лития (LDS) (Invitrogen, NP0007, 4х) с добавлением или без добавления 500 мМ дитиотреита (DTT). Перенос осуществляли электрофоретически с использованием мембранной системы Mini Trans-Blot, номер по каталогу: 170-3930, на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) (Amersham, номер по каталогу: RPN303LFP), активированную абсолютным этанолом и подвергнутую промывке.

Для выявления белков использовали следующие вещества:

забуференный трисом физиологический раствор (TBS), 10х, номер по каталогу BioRad 1706435;

блокирующий буфер (TBS-молоко): 1х TBS_0,1% твина_5% обезжиренного молока;

буфер для промывки (TBS): 1х TBS_0,1% твина;

АС-буфер (TBS_AC): 1х TBS_0,1% твина_0,3% молока.

Анализ наличия мембранных белков CD9 (Biolegend - 312102) и CD81 (Biolegend - 349501) проводили с использованием вестерн-блоттинга (Фиг. 1). Оба маркера, CD9 и CD81, присутствовали во фракции очищенных EV (дорожка С), а также в лизате клеток MDA (дорожка А - положительный контроль) и в исходном клеточном лизате (колонка В). Маркер ретикулума калнексин (Elabscience - Е-АВ-30723) отсутствовал, и это свидетельствует о том, что данная фракция была очищена корректно.

Флуориметрический анализ проводили с использованием антитела, меченного Alexa Fluor 680, GAM (от англ. goat anti-mouse - антитело козы к IgG мыши; номер по каталогу: А21058) или GAR (от англ. goat anti-rabbit - антитело козы к IgG кролика; номер по каталогу: А21076) от Thermofisher, при разведении 1/10000.

Анализ хемилюминесценции проводили с использованием конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) антитела, GAM (номер по каталогу: 170-6516) или GAR (номер по каталогу: 170-6515) от BioRad, при разведении 1/5000.

7. Сравнение EV, происходящих из UCMSC, стимулированных LPS, и EV, происходящих из UCMSC, стимулированных комбинацией IL1β и IL4 (EV по изобретению)

Dongdong Ti и др. (Journal of translational medicine, 2015) описывают внеклеточные везикулы, очищенные из MSC, полученных из пуповины, которые предварительно обрабатывают провоспалительным фактором LPS.

Yunbing Wu и др. (BioMed Research International, 2017) описывают противовоспалительные свойства внеклеточных везикул, происходящих из нестимулированных мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповины человека.

Ни в одной из этих публикаций не предлагается добавлять IL1β и/или IL4 для стимулирования MSC, из которых происходят EV по изобретению.

Цель представленного примера заключается в демонстрации того, что EV, происходящие из СD106^{высокая}СD151⁺нестин⁺ MSC по изобретению, отличаются от таковых, описанных в документах предшествующего уровня техники, тем, что они секретируются клетками, которые культивировали в конкретной среде для кондиционирования, содержащей провоспалительные факторы роста, такие как IL1β и IL4.

Сравнение EV по изобретению с EV, происходящими из нестимулированных MSC или из MSC, стимулированных LPS, продемонстрировало, что EV по изобретению проявляют свойства молекул, которые действительно отличают их от EV предшествующего уровня техники, например, в плане содержания белка или поверхностных маркеров.

7.1. Получение кондиционированных сред (культуральных супернатантов) MSC, происходящих из пуповины, культивированных в 3-х разных средах для кондиционирования

7.1.1. Получение 3-х сред для кондиционирования

Три среды для кондиционирования готовили так, как приведено ниже.

NS обозначает контрольную среду (без обработки провоспалительным фактором).

Для пакета с 675 мл αМЕМ (конечная концентрация: 10 нг/мл).

1. Поместить устройство для введения в один из выходных портов.

2. Ввести, используя иглу, 290 мкл раствора гепарина (5000 ед./мл; конечная концентрация 2 ед./мл). Убедиться путем отсасывания/сливания в отсутствии гепарина в устройстве для введения.

3. Поместить устройство для введения в выходной порт пакета с тромбоцитарным лизатом для клинического применения (CPL) и отобрать 56,8 мл подвергнутого центрифугированию CPL с помощью шприца объемом 50 мл с креплением иглы типа Луер-Лок (LL).

S1 обозначает среду для кондиционирования, содержащую IL1β и IL4 ("вторую среду" в способе, описанном в WO 2018/108859).

Для пакета с 675 мл αМЕМ (конечная общая концентрация интерлейкинов: 10 нг/мл).

4. Поместить устройство для введения в один из выходных портов.

5. Ввести, используя иглу, 290 мкл раствора гепарина (5000 ед./мл; конечная концентрация 2 ед./мл). Убедиться путем отсасывания/сливания в отсутствии гепарина в устройстве для введения.

6. Поместить устройство для введения в выходной порт пакета с CPL и отобрать 56,8 мл подвергнутого центрифугированию CPL с помощью LL шприца объемом 50 мл.

7. Ввести CPL в пакет с аМЕМ и выполнить гомогенизацию с помощью шприца.

8. Осуществить добавление цитокинов:

1) разморозить аликвоту (73,2 мкл) каждого из интерлейкинов (IL) (С = 100 мкг/мл);

2) для отбора 400 мкл полной среды и перемешивания ее с IL использовать оснащенный иглой шприц объемом 1 мл;

3) взять среду, содержащую IL, и добавить ее в пакет с полной средой.

Среда для кондиционирования, содержащая LPS

Для пакета с 675 мл αМЕМ (конечная концентрация LPS: 100 нг/мл).

1. Поместить устройство для введения в один из выходных портов.

2. Ввести, используя иглу, 290 мкл раствора гепарина (5000 ед./мл; конечная концентрация 2 ед./мл). Убедиться путем отсасывания/сливания в отсутствии гепарина в устройстве для введения.

3. Поместить устройство для введения в выходной порт пакета с CPL и отобрать 56,8 мл подвергнутого центрифугированию CPL с помощью LL шприца объемом 50 мл.

4. Ввести CPL в пакет с аМЕМ и выполнить гомогенизацию с помощью шприца.

5. Осуществить добавление LPS:

1) разморозить аликвоту (73,2 мкл) LPS (С = 1 мг/мл);

2) для отбора 400 мкл полной среды и перемешивания ее с LPS использовать оснащенный иглой шприц объемом 1 мл;

3) взять среду, содержащую LPS, и добавить ее в пакет с полной средой.

Подготовка центрифугированного тромбоцитарного лизата для клинического применения (CPL)

Чтобы начать "очистку" клеток от экзогенных EV, происходящих из CPL, на стадии стимуляции использовали подвергнутый центрифугированию CPL.

1. Поместить устройство для введения в выходной порт.

2. Перенести CPL в пластиковые пробирки емкостью 50 мл.

3. Провести центрифугирование при 6000×g и 4°С в течение 1 часа.

4. Перенести супернатант в новый контейнер. 7.1.2. Размораживание и амплификация

Происходящие из пуповины мезенхимальные стволовые клетки, хранящиеся в газообразном азоте после выделения и 1-ого пересева, размораживали, следуя классическому протоколу. Кратко, пакет извлекали из места хранения и быстро погружали в водяную баню с температурой 37°С. Как только в пакете не оставалось льда, клетки разбавляли в предварительно нагретой (37°С) полной среде (αМЕМ плюс 0,5% (об./об.) ципрофлоксацина плюс гепарин (2 ед./мл) плюс 5% (об./об.) PL) и быстро центрифугировали (300×g, КТ, 5 мин).

После центрифугирования клетки суспендировали в предварительно нагретой полной среде и оценивали на предмет количества и жизнеспособности клеток (используя трипановый синий/гемоцитометр Малассе).

Клетки рассевали при плотности 2000 клеток/см² в двух 1-слойных камерах для культивирования клеток CellSTACK-1 (CS1) в полной среде и инкубировали (при влажности 90%, 5% CO₂, 37°С) в течение семи суток.

Через семь суток CS1 промывали, используя 100 мл PBS, и для сбора клеток добавляли Trypzean из расчета по 25 мл на одну CS1. По истечении 10 мин нахождения в инкубаторе Trypzean нейтрализовали, добавляя в общей сложности 100 мл полной среды (из расчета по 50 мл на одну CS1). Клетки объединяли и оценивали на предмет количества и жизнеспособности.

7.1.3. Стимуляция

Посев в Т300 осуществляли при плотности 6000 клеток/см².

Через одни сутки среду заменяли на соответствующую кондиционированную среду. Стимуляцию клеток проводили в течение 2 суток без замены среды.

7.1.4. Голодание и секреция EV

После стимуляции среду отбрасывали и клетки три раза промывали PBS. Затем клетки подвергали голоданию в течение 24 ч в условиях αМЕМ плюс/минус провоспалительный фактор (комбинация IL1β (10 нг/мл) и IL4 (10 нг/мл) или LPS (100 нг/мл)).

По прошествии периода голодания клетки еще раз трижды промывали PBS, затем в каждую колбу на 72 часа загружали по 30 мл αМЕМ плюс/минус провоспалительный фактор (IL или LPS).

Супернатант собирали в пластиковые пробирки емкостью 50 мл и центрифугировали в течение 5 мин при 400×g при комнатной температуре. Супернатант для каждого из условий объединяли в бутылки емкостью 500 мл и вместе с бутылками отдельно замораживали при -80°С небольшую аликвоту объемом 1 мл.

Чтобы оценить количество клеток для каждого из условий, проводили трипсинизацию для 3-х колб Т300, и клетки подвергали криоконсервации в криопробирках.

Культура клеток и применяемые для обработки реагенты

7.2. Фенотипическая характеристика клеток, содержащихся в 3-х кондиционированных средах

Для оценки эффективности стимуляции с применением цитометрического анализа выполняли фенотипическую характеристику клеток, культивированных с использованием 3-х кондиционированных сред.

Как и ожидалось, клетки, предварительно обработанные в среде S1 и в среде с LPS, демонстрировали разный фенотип, при этом проангиогенный маркер CD106 экспрессировался на более высоких уровнях в кондиционированной среде S1 (благодаря стимуляции клеток под действием IL, как описано в WO 2018/108859).

Реагенты для цитометрии, использованные для проведения цитометрического анализа:

7.3. Очистка EV

В этом эксперименте фракции, обогащенные внеклеточными везикулами, выделяли посредством ультрафильтрации 3-х кондиционированных сред.

Анализ количества и распределения внеклеточных везикул по размерам проводили с использованием метода анализа траекторий движения наночастиц (Nanosight 300 от Malvern-Panalytical).

Результаты очистки EV представлены ниже.

Выход

Размер

Выход/клетки

7.3. Характеристика EV, полученных из MSC, предварительно обработанных NS/S1/LPS

7.3.1. Анализ содержания белков в EV и MSC с применением вестерн-блоттинга

Содержимое EV и MSC, полученных в 3-х условиях (NS/S1/LPS), оценивали посредством вестерн-блоттинга, используя приведенные далее условия.

Материалы и реагенты

Буфер для лизиса (для RIPA):

- дезоксихолат натрия 1%;

- SDS 0,1%;

- трис⋅Cl, рН 7,4 20 мМ;

- EDTA 1 мМ;

- NaCl 150 мМ;

NP40 (от англ. nonyl phenoxypolyethoxyethanol - нонилфеноксиполиэтоксиэтанол) 1%;

- коктейль ингибиторов протеаз (CIP, 100х), номер по каталогу Sigma Р8340.

Лизис клеток (в случае MSC)

К MSC клеткам в количестве 1х10⁶ добавить 100 мкл холодного RIPA-буфера, содержащего CIP в 1х конечной концентрации.

Инкубировать в течение 10 мин на льду, провести центрифугирование при 4°С в течение 20 мин при 10000×g и затем извлечь супернатант.

Содержащую EV фракцию солюбилизировали после добавления равного объема охлажденного во льду 2х RIPA-буфера для лизиса.

Определение концентрации белков осуществляли с использованием набора для анализа белков Micro ВСА, номер по каталогу Pierce 23235.

Электрофорез проводили в используемых для разделения белков 4-12%-ных бис-трис-гелях с толщиной слоя 1,5 мм, имеющих 10 лунок, Novex Nosex (Life Technologies, NP0335PBOX) или NuPAGE® (рабочий буфер на основе MOPS с SDS (20х)) (Life Technologies, NP0001). Образцы подвергали денатурации в течение 10 мин при 70°С, используя ¼ объема буфера для образцов, содержащего LDS (Invitrogen, NP0007, 4×) с добавлением или без добавления DTT (500 мМ). Перенос осуществляли электрофоретически с использованием мембранной системы Mini Trans-Bio, номер по каталогу: 170-3930, на мембрану из PVDF (Amersham, номер по каталогу: RPN303LFP), активированную абсолютным этанолом и подвергнутую промывке.

Для выявления белков использовали следующие вещества: TBS, 10х, номер по каталогу BioRad 1706435;

блокирующий буфер (TBS-молоко): 1х TBS_0,1% твина_5% обезжиренного молока;

буфер для промывки (TBS): 1х TBS_0,1% твина;

АС-буфер (TBS_AC): 1х TBS_0,1% твина_0,3% молока.

Флуориметрический анализ проводили с использованием антитела, меченного Alexa Fluor 680, GAM (номер по каталогу: А21058) или GAR (номер по каталогу: А21076) от Thermofisher, при разведении 1/10000.

Анализ хемилюминесценции проводили с использованием конъюгированного с HRP антитела, GAM (номер по каталогу: 170-6516) или GAR (номер по каталогу: 170-6515) от BioRad, при разведении 1/5000.

Антитела к CD9: Biolegend - 312102.

Антитела к CD81: Biolegend - 349501.

Антитела к калнексину: Elabscience - Е-АВ-30723.

Антитела к VCAM: Bio-Rad - VMA00461.

Антитела к CD200: Bio-Techne - 2AF2724.

Результаты

Как и ожидалось, проангиогенный маркер CD106/VCAM обнаруживали на дорожке В (MSC по изобретению), и он полностью отсутствовал на дорожке С (MSC в среде с LPS) и на дорожке А (отрицательный контроль). Мембранный гликопротеин CD200, второй проангиогенный маркер, присутствовал в MSC из фракции S1, и не присутствовал ни в MSC из фракции LPS, ни на дорожке А (отрицательный контроль) (см. Фиг. 5).

В очищенных EV (Фиг. 3) оба мембранных белка CD9 и CD81 присутствовали во всех фракциях (дорожки А, В и С), а также в лизате клеток MDA (положительный контроль) (Фиг. 3).

Маркер ретикулума калнексин не обнаруживали, и это свидетельствует о том, что фракция EV была очищена корректно.

Проангиогенный маркер CD106/VCAM обнаруживали на дорожке В (EV по изобретению), и он полностью отсутствовал на дорожке С (EV в среде с LPS) и на дорожке А (отрицательный контроль), и это свидетельствует о том, что мембранные маркеры MSC по изобретению переносятся на EV (Фиг. 3).

Мембранный гликопротеин CD200, второй проангиогенный маркер, присутствовал в EV из фракции S1, и не присутствовал ни в EV из фракции LPS, ни на дорожке А (отрицательный контроль) (см. Фиг. 3).

7.3.2. Набор белков, участвующих в ангиогенезе

EV, происходящие из MSC, культивированных в кондиционированных NS, S1 и LPS средах, сравнивали с набором для протеомных исследований ангиогенеза (R&D Systems - ARY007).

Буфер для лизиса готовили так, как приведено ниже.

1. Из расчета на 50 мл: растворить 157,6 мг трис-HCl в 10 мл воды; 400,3 мг NaCl в 10 мл воды и 37,2 мг EDTA в 10 мл воды.

2. Подвести значение рН до 8.

3. Добавить 0,5 мл тритона Х-100, 5 мл глицерина, 50 мкл раствора апротинина (10 мг/мл), 50 мкл раствора леупептина (10 мг/мл) и 500 мкл раствора пепстатина (1 мг/мл).

4. Добавить стерильную воду в достаточном количестве (QSP) до 50 мл.

EV, происходящие из MSC, полученных в NS, S1 и LPS средах, солюбилизировали в буфере для лизиса:

- NS: 150 мкл EV суспендировали в 1 мл буфера для лизиса;

- S1: 130,4 мкл EV суспендировали в 1 мл буфера для лизиса;

- LPS: 125 мкл EV суспендировали в 1 мл буфера для лизиса.

С использованием ВСА-анализа было определено общее содержание белка (300 мкг) в лизатах, что тем самым подтвердило эффективность лизиса.

Лизаты EV далее ресуспендировали, перемешивая с использованием пипетки вверх и вниз, и осторожно встряхивали при 2-8°С в течение 30 минут, затем центрифугировали с применением микроцентрифуги при 14000×g в течение 5 минут. Супернатант переносили в чистую пробирку и анализировали, следуя инструкциям производителя.

Реагенты набора для протеомных исследований ангиогенеза

На графике, представленном на Фиг. 4, показаны результаты для белков, которые значительно различались по уровню экспрессии в 3 образцах. Для 28 проангиогенных белков из 59 проанализированных в указанном наборе, представлены различия в экспрессии в образцах S1 и LPS, и это подтверждает, что EV по изобретению демонстрируют характеристики, отличающиеся от таковых для EV предшествующего уровня техники, в частности, в отношении содержания проангиогенных белков.

Библиографические ссылки

Shabbir, А.; Сох, A.; Rodriguez-Menocal, L.; Salgado, М.; Badiavas, E.V. Mesenchymal stem cell exosomes induce proliferation and migration of normal and chronic wound fibroblasts, and enhance angiogenesis in vitro. Stem Cells Dev., 2015, 24, 1635-1647.

Uyen Thi Trang Than, Dominic Guanzon, David Leavesley and Tony Parker -Association of Extracellular Membrane Vesicles with Cutaneous Wound healing - Int. John Mol. Sci., 2017, 18, 956.

Graca Raposo, HansW. Nijman, Willem Stoorvogel, Richtje Leijendekker, Clifford V. Harding, Cornelis J.M. Melief and Hans J. Geuze - В Lymphocytes Secrete Antigen-presenting Vesicles - J. Exp.Med., Объем 183, March 1996, 1161-1172.

Bernd Giebel, Lambros Kordelas, Verena Borger - Clinical potential of mesenchymal stem/stromal cell-derived extracellular vesicles - Stem Cell Investig., 2017, 4: 84.

Donald. G. Phinney, Mark Pittenger - Concise Review: MSC-Derived Exosomes for Cell-Free Therapy - Stem Cells, 2017, 35: 851-858.

Liang, X.; Zhang, L.; Wang, S.; Han, Q.; Zhao, R.C. Exosomes secreted by mesenchymal stem cells promote endothelial cell angiogenesis by transferring miR-125a. J. Cell Sci., 2016, 129, 2182-2189.

Zhang, В.; Wu, X.; Zhang, X.; Sun, Y.; Yan, Y.; Shi, H.; Zhu, Y.; Wu, L; Pan, Z.; Zhu, W. Human umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes enhance angiogenesis through the WNT4/_-catenin pathway. Stem Cells Trans. Med., 2015, 4, 513-522.

Uyen Thi Trang Than, Dominic Guanzon, David Leavesley и Tony Parker -Association of Extracellular Membrane Vesicles with Cutaneous Wound healing - Int. J. Mol. Sci., 2017.

Sabrina Roya, Fred H. Hochberg b and Pamela S. Jonesc - Extracellular vesicles: the growth as diagnostics and therapeutics; a survey - J. of Extracellular Vesicles, 2018.

Anna Otte, Vesna Bucan, Kerstin Reimers и Ralf Hass. Mesenchymal Stem Cells Maintain Long-Term In Vitro Sternness During Explant culture. Tissue Engineering Part C: Methods. November 2013, 19(12): 937-948.

Van Pham, P., Truong, N.C., Le, P.TB. et al. Isolation and proliferation of umbilical cord tissue derived mesenchymal stem cells for clinical applications. Cell Tissue Bank, 2016, 17: 289.

Konoshenko MY, Lekchnov EA, Vlassov AV, Laktionov PP. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. Biomed. Res. Int., 2018.

Ruenn Chai Lai, Fatih Arslan May May Lee, Newman Siu Kwan Sze, Andre Choo, Tian Sheng Chen, Manuel Сольо-Tellez, Leo Timmers, Chuen Neng Lee, Reida Menshawe El Oakley, Gerard Pasterkamp, Dominique P.V. de Kleijn, Sai Kiang Lia -Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/re perfusion injury - Stem Cell Research, 2010, 4, 214-222.

Han Z.C., et al. New insights into the heterogeneity and functional diversity of human mesenchymal stem cells. Bio-medical Materials and Engineering, 28 (2017), S29-S45.

Du W. et al. VCAM-1+ placenta chorionic villi-derived mesenchymal stem cells display potent pro-angiogenic activity. Stem Cell research & therapy (2016) 7: 49.

Dongdong Ti et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of translational medicine, 2015, vol. 13, №1.

Yunbing Wu et al. Exosomes derived from Human Umbilical cord Mesenchymal Stem Cells relieve Inflammatory Bowel Disease in Mice. BioMed Research International, 2017, pages 53566760-12.

Katoh M. & Katoh M. CD157 and CD200 at the crossroads of endothelial remodeling and immune regulation. Stem CellInvestig, 2019, 6: 10.

Изобретение относится к терапевтическим, диагностическим, ветеринарным или косметическим композициям, содержащим внеклеточные везикулы, происходящие из СD106^{высокая}СD151⁺нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC) плацентарной ткани, для применения в качестве лекарственного средства для лечения субъектов, страдающих от ишемической болезни, расстройства системы кровообращения, иммунопатологии, повреждения органов или нарушения функций органов. Также изобретение относится к конкретному способу получения этих внеклеточных везикул. 27 н. и 14 з.п. ф-лы, 5 ил., 7 пр.

1. Композиция для лечения цирроза печени, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:

(1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,

(2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь интерлейкина (IL)-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки,

(3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и

(4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).

2. Композиция для лечения диабета, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:

(1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,

(2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь интерлейкина (IL)-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки,

(3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и

(4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).

3. Композиция для лечения апластической анемии, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:

(1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,

(2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь интерлейкина (IL)-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки,

(3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и

(4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).

4. Композиция для индуцирования ангиогенеза, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:

(1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,

(2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь интерлейкина (IL)-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки,

(3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и

(4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).

5. Композиция по любому из пп. 1-4, где указанные внеклеточные везикулы получены из недифференцированных MSC, происходящих из перинатальной ткани, выбранной из плаценты, пуповины или оболочек плаценты или их компонентов, либо из перинатальной жидкости.

6. Композиция по любому из пп. 1-5, где указанные внеклеточные везикулы получены из недифференцированных MSC, происходящих из пуповинной крови, плацентарной крови или амниотической жидкости.

7. Композиция по любому из пп. 1-6, где указанные внеклеточные везикулы получены из недифференцированных MSC, происходящих из пуповины, предпочтительно посредством выделения клеток из эксплантата фрагмента пуповины.

8. Композиция по любому из пп. 1-7, где указанные внеклеточные везикулы получены из недифференцированных MSC, происходящих из плаценты, предпочтительно посредством выделения клеток из фрагмента плацентарной ткани.

9. Фармацевтическая композиция для лечения цирроза печени, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:

(1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,

(2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки,

(3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и

(4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).

10. Фармацевтическая композиция для лечения диабета, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:

(1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,

(2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки,

(3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и

(4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).

11. Фармацевтическая композиция для лечения апластической анемии, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:

(1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,

(2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки,

(3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и

(4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).

12. Фармацевтическая композиция для индуцирования ангиогенеза, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:

(1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,

(2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки,

(3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и

(4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).

13. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 9-12, где указанный биологически совместимый материал представляет собой гидрогель.

14. Косметическая композиция для регенерации клеток кожи, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106^{высокая}CD151⁺нестин^{+ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:}

(1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,

(2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки,

(3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и

(4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).

15. Косметическая композиция для регенерации клеток слизистой оболочки, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:

(1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,

(2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106^ысокаяCD151⁺нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки,

(3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и

(4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).

16. Косметическая композиция для улучшения внешнего вида кожи, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:

(1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,

(2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки,

(3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и

(4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).

17. Косметическая композиция улучшения внешнего вида слизистой оболочки, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:

(1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,

(2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки,

(3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и

(4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).

18. Косметическая композиция для исправления дефекта кожи, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:

(1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,

(2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки,

(3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и

(4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).

19. Косметическая композиция для исправления дефекта слизистой оболочки, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:

(1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,

(2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺мезенхимальные стволовые клетки,

(3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и

(4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).

20. Косметическая композиция для заживления кожного повреждения или расстройства, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:

(1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,

(2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки,

(3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и

(4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).

21. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для коррекции пигментных пятен.

22. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для коррекции пятен.

23. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для коррекции акне.

24. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для коррекции морщин.

25. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для коррекции сухости.

26. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для заживления ожога.

27. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для заживления рубца.

28. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для заживления ангиомы.

29. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для заживления невуса.

30. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для заживления бородавки.

31. Система для введения внеклеточных везикул (EV), происходящих из CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), пациенту, где указанные внеклеточные везикулы получены посредством:

(1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,

(2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки,

(3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и

(4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3),

и где указанная система представляет собой липосомы, пролипосомы, микросферы, микро- или нановезикулы из биополимеров, липиды или наночастицы, включающие указанные EV.

32. Система по п. 31, представляющая собой микро- или нановезикулы из биополимеров, липиды или наночастицы.

33. Способ получения внеклеточных везикул, при этом указанный способ включает стадии, на которых:

(1) культивируют мезенхимальные стволовые клетки, полученные из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,

(2) приводят в контакт указанную популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106^{высокая}CD151⁺нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки,

(3) культивируют указанные MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и

(4) очищают внеклеточные везикулы от клеток, полученных на стадии (3).

34. Способ по п. 33, где указанные недифференцированные MSC происходят из перинатальной ткани, выбранной из плаценты, пуповины или оболочек плаценты или их компонентов, либо из перинатальной жидкости.

35. Способ по п. 33, где указанные недифференцированные MSC получают посредством выделения клеток из эксплантата перинатальных тканей.

36. Способ по п. 33, где указанные недифференцированные MSC происходят из пуповины, предпочтительно посредством выделения клеток из эксплантата фрагмента пуповины.

37. Способ по п. 33, где указанные недифференцированные MSC происходят из плаценты, предпочтительно посредством выделения клеток из фрагмента плацентарной ткани.

38. Способ по любому из пп. 33-37, где указанная вторая культуральная среда содержит интерлейкин 1β в диапазоне от 1 до 100 нг/мл.

39. Способ по любому из пп. 33-38, где указанная вторая культуральная среда содержит интерлейкин 4 в диапазоне от 1 до 100 нг/мл.

40. Способ по любому из пп. 33-39, где указанная не содержащая внеклеточных везикул культуральная среда дополнена смесью IL1 и IL4, предпочтительно IL1β и IL4.

41. Способ по любому из пп. 33-40, где внеклеточные везикулы очищают ультрафильтрацией.