СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ ИЗ PTEROCARPUS MARSUPIUM И ИХ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ Российский патент 2023 года по МПК A61K36/48 B01D11/02 A61P3/08 A61P3/10 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТ

Изобретение представляет собой непредварительную подачу предварительной заявки на патент США № 62700446, поданной 19 июля 2018 г.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[001] Изобретение в целом относится к активным молекулам из Pterocarpus marsupium. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу выделения новых C-гликозидов из Pterocarpus marsupium и их терапевтическим эффектам.

ОПИСАНИЕ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

[002] Pterocarpus marsupium представляет собой лиственное дерево, произрастающее в некоторых частях Индии, Непала и Шри-Ланки. Оно содержит множество флавоноидов, гликозидов, катехинов, стильбеноидов и таннинов, обладающих терапевтическими свойствами. Сообщается, что Pterocarpus marsupium обладает положительным эффектом при лечении диареи, зубной боли, лихорадки, инфекций мочевыводящих путей и кожи. (S. S. Handa et al., Pterocarposide, an isoaurone C-glycoside from Pterocarpus marsupium, Tetrahedron Letters 41 (2000) 1579-1581). Сообщается, что С-гликозиды, выделенные из Pterocarpus marsupium, обладают антигипергликемической активностью. Однако большинство С-гликозидов из этого растения еще предстоит идентифицировать, чтобы полностью раскрыть его терапевтический потенциал.

[003] Аденозинмонофосфат-активируемая протеинкиназа (AMPK) уже много лет известна как центральный метаболический регулятор для ингибирования энергоемких путей, а также для активации компенсирующих программ выработки энергии. Фермент AMPK активируется при изменении энергетического статуса клетки, например, при сокращении мышц и гипоксии. AMPK можно фармакологически активировать с помощью соединения 5-аминоимидазол-4-карбоксамид рибонуклеозид (AICAR) и антидиабетического агента метформина. AMPK играет важную роль в стимуляции поглощения глюкозы мышцами с помощью этих физиологических и фармакологических стимулов. Активация AMPK во время ишемии миокарда увеличивает поглощение глюкозы и гликолиз, а также увеличивает окисление жирных кислот во время реперфузии. Следующие статьи раскрывают роль активации AMPK.

1. Ha J, Guan KL, Kim J, AMPK and autophagy in glucose/glycogen metabolism, Mol Aspects Med. 2015 Dec; 46:46-62.

2. N. Musi and L. J. Goodyear, AMP-activated protein kinase and muscle glucose uptake, Acta Physiol Scand 2003, 178, 337-345.

3. Sambandam N, Lopaschuk GD, AMP-activated protein kinase (AMPK) control of fatty acid and glucose metabolism in the ischemic heart, Prog Lipid Res. 2003 May; 42(3):238-56.

[004] В настоящее время AMPK представляет собой терапевтическую мишень для лечения метаболических расстройств, таких как диабет, ожирение и т.д. Ингибирование глюконеогенеза также важно для снижения образования кетоновых тел у людей с диабетом, что в противном случае может оказаться пагубным (Blackshear et al., The effects of inhibition of gluconeogenesis on ketogenesis in starved and diabetic rats, Biochemical Journal 1975, 148 (3): 353-362).

[005] В предыдущих исследованиях были успешно идентифицированы флавоноиды и гликозиды из Pterocarpus marsupium (Bezuidenhoudt et al., Flavonoid Analogues from Pterocarpus Species Phytochemistry. Vol. 26. № 2 pp. 531-535. 1987), однако не удалось выделить некоторые из C-гликозидов в их чистой форме для того, чтобы выяснить их биологическую активность. Настоящее изобретение раскрывает способ идентификации новых С-гликозидов из Pterocarpus marsupium и их терапевтический эффект.

[006] Основная цель изобретения состоит в раскрытии способа выделения С-гликозидов, представляющих собой птерокарпозид (номер CAS 264876-26-8) и сабиозид (номер CAS 108351-24-2), из Pterocarpus marsupium.

[007] Другой целью изобретения является раскрытие композиции, содержащей С-гликозиды птерокарпозид (STR#1) и сабиозид (STR#2), выделенные из Pterocarpus marsupium, и ее терапевтического потенциала в отношении активации AMPK и ингибирования глюконеогенеза.

[008] Настоящее изобретение решает указанные выше задачи и обеспечивает связанные с этим преимущества.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[009] В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение раскрывает способ выделения C-гликозидов птерокарпозида (STR#1) и сабиозида (STR#2) из Pterocarpus marsupium.

[0010] В связанном варианте осуществления изобретение раскрывает композицию, содержащую не менее 5 мас.% экстракта Pterocarpus marsupium, стандартизованную так, чтобы она содержала не менее 0,5 мас.% птерокарпозида (STR#1) и не менее 0,5 мас.% сабиозида (STR#2).

[0011] В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение раскрывает способ активации AMPK в клетках млекопитающих, включающий стадию приведения клеток млекопитающих в контакт с композицией, содержащей не менее 5 мас.% экстракта Pterocarpus marsupium, стандартизованной так, чтобы она содержала не менее 0,5 мас.% птерокарпозида (STR#1) и не менее 0,5 мас.% сабиозида (STR#2), чтобы вызвать эффект активации AMPK.

[0012] В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение раскрывает способ ингибирования глюконеогенеза в клетках млекопитающих, где указанный способ включает стадии приведения клеток млекопитающих в контакт с композицией, содержащей не менее 5 мас.% экстракта Pterocarpus marsupium, стандартизованной так, чтобы она содержала не менее 0,5 мас.% птерокарпозида (STR#1) и не менее 0,5 мас.% сабиозида (STR#2), чтобы вызвать эффект снижения образования глюкозы.

[0013] Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего ниже более подробного описания изобретения, рассматриваемого в сочетании с сопроводительными графическими материалами, иллюстрирующими, в качестве примера, принцип изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0014] Фиг. 1 представляет собой изображение вестерн-блоттинга, показывающее активацию AMPK в клетках H4IIE при использовании композиции на основе птерокарпозида.

[0015] Фиг. 2 представляет собой графическое изображение, демонстрирующее увеличение экспрессии pAMPK в клетках HepG2 при использовании композиции на основе птерокарпозида.

[0016] Фиг. 3 представляет собой графическое изображение, демонстрирующее снижение образования глюкозы в клетках H4IIE при использовании композиции на основе птерокарпозоида.

ОПИСАНИЕ НАИБОЛЕЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0017] В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретение раскрывает способ выделения С-гликозидов из Pterocarpus marsupium, причем указанный способ включает стадии:

a) загрузки порошка дерева Pterocarpus marsupium в экстрактор,

b) экстракции растворителем для получения олеосмолы,

c) растворения олеосмолы со стадии b) в воде и экстракции растворителем для получения водного слоя и слоя растворителя,

d) дополнительной промывки слоя растворителя со стадии c) водой для дополнительного получения водной фракции и фракции растворителя,

e) смешивания водных фракций со стадии c) и стадии d) и сушки распылением для получения водного экстракта,

f) фракционирования водной фракции со стадии е) растворителем для получения водной фракции и фракции растворителя,

g) пропускания фракции растворителя со стадии f) через колонку с градиентом растворителя с применением силикагеля 60-120 меш для получения обогащенной фракции 1 и фракции 2,

h) пропускания обогащенной фракции 1 со стадии g) через изократическую колонку с силикагелем RP-18, затем через колонку LH-20 (Sephadex^®), и кристаллизации с использованием растворителя при температуре от -5 до 0°C для получения соединения, которое идентифицируют как птерокарпозид, представленный STR#1,

i) пропускания обогащенной фракции 2 со стадии g) через изократическую колонку с силикагелем RP-18, затем через колонку LH-20 (Sephadex^®), и кристаллизации с использованием растворителя при комнатной температуре для получения соединения, которое идентифицируют как сабиозид, представленный STR#2.

[0018] В связанном варианте осуществления изобретения растворитель выбран из группы, состоящей, но не ограничивающейся перечисленным, из метанола, этанола, бутанола, этилацетата, хлороформа, толуола, ацетона и гексана.

[0019] В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение раскрывает композицию, содержащую не менее 5 мас.% экстракта Pterocarpus marsupium, стандартизованную так, чтобы она содержала не менее 0,5 мас.% птерокарпозида (STR#1) и не менее 0,5 мас.% сабиозида (STR#2), где указанная композиция получена способом, включающим стадии:

a) загрузки порошка дерева Pterocarpus marsupium в экстрактор,

b) экстракции растворителем для получения олеосмолы,

c) растворения олеосмолы со стадии b) в воде и экстракции растворителем для получения водного слоя и слоя растворителя,

d) дополнительной промывки слоя растворителя со стадии c) водой для дополнительного получения водной фракции и фракции растворителя,

e) смешивания водных фракций со стадии c) и стадии d) и сушки распылением для получения водного экстракта,

f) фракционирования водной фракции со стадии е) растворителем для получения водной фракции и фракции растворителя,

g) пропускания фракции растворителя со стадии f) через колонку с градиентом растворителя с применением силикагеля 60-120 меш для получения обогащенной фракции 1 и фракции 2,

h) пропускания обогащенной фракции 1 со стадии g) через изократическую колонку с силикагелем RP-18, затем через колонку LH-20 (Sephadex^®), и кристаллизации с использованием растворителя при температуре от -5 до 0°C для получения соединения, которое идентифицируют как птерокарпозид, представленный STR#1,

i) пропускания обогащенной фракции 2 со стадии g) через изократическую колонку с силикагелем RP-18, затем через колонку LH-20 (Sephadex^®), и кристаллизации с использованием растворителя при комнатной температуре для получения соединения, которое идентифицируют как сабиозид, представленный STR#2,

j) загрузки водного экстракта Pterocarpus marsupium со стадии е) в экстрактор,

k) добавления деминерализованной воды к экстракту и перемешивания в течение 3-4 часов при температуре от 65 до 70°C и оставления раствора на 8-10 часов для осаждения нерастворимых веществ,

l) фильтрации раствора со стадии k) для удаления нерастворимых веществ и получения чистого фильтрата,

m) проверки нерастворимых веществ со стадии l) на присутствие птерокарпозида (STR#1) или сабиозида (STR#2), отбрасывая их, если они присутствуют в незначительных количествах,

n) сбора фильтрата со стадии l) и экстракции растворителем два раза для получения водного слоя и слоя растворителя,

o) концентрирования слоя растворителя со стадии n) для извлечения растворителя,

p) экстракции водного слоя со стадии n) растворителем три раза и объединения фракций растворителя,

q) концентрирования фракций растворителя и растворения в воде для стандартизации до раствора с общим содержанием растворенных твердых веществ 30 %,

r) сушки распылением раствора со стадии q) для получения композиции, содержащей не менее 5 мас.% экстракта Pterocarpus marsupium, стандартизованной так, чтобы она содержала не менее 0,5 мас.% птерокарпозида и не менее 0,5 мас.% сабиозида, представленных STR#1 и STR#2, соответственно.

[0020] В связанном варианте осуществления изобретения растворитель выбран из группы, состоящей, но не ограничивающейся перечисленным, из метанола, этанола, бутанола, этилацетата, хлороформа, толуола, ацетона и гексана.

[0021] В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение раскрывает композицию, содержащую не менее 5 мас.% экстракта Pterocarpus marsupium, стандартизованную так, чтобы она содержала не менее 0,5 мас.% птерокарпозида (STR#1) и не менее 0,5 мас.% сабиозида (STR#2).

[0022] В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение раскрывает способ активации AMPK в клетках млекопитающих, включающий стадию приведения клеток млекопитающих в контакт с композицией, содержащей не менее 5 мас.% экстракта Pterocarpus marsupium, стандартизованной так, чтобы она содержала не менее 0,5 мас.% птерокарпозида (STR#1) и не менее 0,5 мас.% сабиозида (STR#2), чтобы вызвать эффект активации AMPK. В связанном варианте осуществления клетки млекопитающих представляют собой клетки человека.

[0023] В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение раскрывает композицию, содержащую не менее 5 мас.% экстракта Pterocarpus marsupium, стандартизованную так, чтобы она содержала не менее 0,5 мас.% птерокарпозида (STR#1) и не менее 0,5 мас.% сабиозида (STR#2), для применения для активации AMPK в клетках млекопитающих.

[0024] В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение раскрывает способ ингибирования глюконеогенеза в клетках млекопитающих, где указанный способ включает стадии приведения клеток млекопитающих в контакт с композицией, содержащей не менее 5 мас.% экстракта Pterocarpus marsupium, стандартизованной так, чтобы она содержала не менее 0,5 мас.% птерокарпозида (STR#1) и не менее 0,5 мас.% сабиозида (STR#2), чтобы вызвать эффект снижения образования глюкозы. В связанном варианте осуществления клетки млекопитающих представляют собой клетки человека.

[0025] В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение раскрывает композицию, содержащую не менее 5 мас.% экстракта Pterocarpus marsupium, стандартизованную так, чтобы она содержала не менее 0,5 мас.% птерокарпозида (STR#1) и не менее 0,5 мас.% сабиозида (STR#2), для применения для ингибирования глюконеогенеза в клетках млекопитающих.

[0026] Следующие разделы этого описания состоят из иллюстративных примеров наиболее предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения.

[0027] ПРИМЕРЫ

[0028] Пример 1: C-гликозидная композиция и способ ее получения

[0029] С-гликозиды из Pterocarpus marsupium выделяют и идентифицируют с помощью следующих стадий:

a) загрузки порошка дерева Pterocarpus marsupium в экстрактор,

b) экстракции метанолом для получения олеосмолы,

c) растворения олеосмолы со стадии b) в воде и экстракции толуолом для получения водного слоя и слоя толуола,

d) дополнительной промывки слоя толуола со стадии c) водой для дополнительного получения водной фракции и фракции толуола,

e) смешивания водных фракций со стадии c) и стадии d) и сушки распылением для получения водного экстракта,

f) фракционирования водной фракции со стадии е) этилацетатом для получения водной фракции и фракции этилацетата,

g) пропускания фракции этилацетата со стадии f) через колонку с градиентом растворителя с применением силикагеля 60-120 меш для получения обогащенной фракции 1 и фракции 2,

h) пропускания обогащенной фракции 1 со стадии g) через изократическую колонку с силикагелем RP-18, затем через колонку LH-20 (Sephadex^®) и кристаллизацию с использованием метанола при температуре от -5 до 0°C для получения соединения, которое идентифицируют как птерокарпозид, представленный STR#1,

i) пропускания обогащенной фракции 2 со стадии g) через изократическую колонку с силикагелем RP-18, затем через колонку LH-20 (Sephadex^®) и кристаллизацию с использованием ацетона при комнатной температуре для получения соединения, которое идентифицируют как сабиозид, представленный STR#2.

[0030] Стереохимия выделенного птерокарпозида (STR#1) и сабиозида (STR#2) представлена ниже:

[0031] Птерокарпозид

номер CAS 264876-26-8

Молекулярная формула: C₂₁ H₂₀ O₉

Химическое название: (3E)-7-β-D-глюкопиранозил-6-гидрокси-3-[(4-гидроксифенил)метилен]-2(3H)-бензофуранон.

[0032] Сабиозид

номер CAS 108351-24-2

Молекулярная формула: C₂₁ H₂₀ O₁₀

Химическое название: 8-β-D-глюкопиранозил-3,7-дигидрокси-2-(4-гидроксифенил)-4H-1-бензопиран-4-он.

[0033] Кроме того, получали водорастворимую композицию, содержащую не менее 5 мас.% экстракта P. marsupim, и стандартизовали ее так, чтобы она содержала не менее 0,5 мас.% птерокарпозида (STR#1) и не менее 0,5 мас.% сабиозида (STR#2). Стадии получения композиции приведены ниже:

a) загрузка водного экстракта Pterocarpus marsupium в экстрактор,

b) добавление деминерализованной воды к экстракту, и перемешивание в течение 3-4 часов при температуре от 65 до 70°C, и оставление раствора на 8-10 часов для осаждения нерастворимых веществ,

c) фильтрация раствора со стадии b) для удаления нерастворимых веществ и получения чистого фильтрата,

d) проверка нерастворимых веществ со стадии c) на присутствие птерокарпозида (STR#1) или сабиозида (STR#2), отбрасывая их, если они присутствуют в незначительных количествах,

e) сбор фильтрата со стадии c) и экстракция растворителем два раза для получения водного слоя и слоя растворителя,

f) концентрирование слоя растворителя со стадии e) для извлечения растворителя,

g) экстракция водного слоя со стадии е) бутанолом три раза и объединение фракций бутанола,

h) концентрирование фракций бутанола и растворение в воде для стандартизации до раствора с общим содержанием растворенных твердых веществ 30 %,

i) сушка распылением раствора со стадии h) для получения композиции, содержащей не менее 5 мас.% экстракта P. marsupim, содержащего птерокарпозид и сабиозид, представленные STR#1 и STR#2, соответственно.

[0034] Пример 2: Активация AMPK

[0035] Проводили несколько экспериментов на клетках гепатомы крысы H4IIE и клетках гепатомы человека HepG2. Сливающиеся чашки клеток H4IIE или HepG2 обрабатывали композицией, содержащей птерокарпозид (STR#1) и сабиозид (STR#2) (композиция на основе птерокарпозида), или положительным контролем, 5-аминоимидазол-4-карбоксамид рибонуклеотидом (AICAR), в следующих дозах.

[0036] Дозы композиции на основе птерокарпозида: 0,05, 0,1, 0,5 и 1 мкМ.

[0037] AICAR (положительный контроль): 2 мМ.

[0038] Клетки лизировали и белки разделяли на 4-20% SDS-PAGE геле и переносили в нитроцеллюлозу. Активацию AMPK детектировали с помощью вестерн-блоттинга с pAMPK (Thrl72) и pACC (Ser79). AMPK и GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) использовали в качестве контроля.

[0039] Результаты: Композиция, содержащая птерокарпозид (STR#1) и сабиозид (STR#2), дозозависимо увеличивала статус фосфорилирования AMPK (Thr172) с максимальным фосфорилированием, наблюдаемым между концентрациями 0,1-0,5 мкМ (фиг. 1). Композиция также дозозависимо увеличивала фосфорилирование ацетил-КоА-карбоксилазы (АСС). Это первая демонстрация того, что композиция, содержащая птерокарпозид (STR#1) и сабиозид (STR#2), активирует AMPK. Повышенное фосфорилирование АСС может указывать на то, что композиция может ингибировать синтез жирных кислот и потенциально активировать окисление жирных кислот. Аналогичные результаты также наблюдали в клетках HepG2 (фиг. 2).

[0040] Пример 2: Ингибирование образования глюкозы

[0041] Сливающиеся чашки с H4IIE обрабатывали 0,1 мкМ или 0,5 мкМ композиции, содержащей птерокарпозид (STR#1) и сабиозид (STR#2), для изучения ее влияния на индуцированное дексаметазоном образование глюкозы. Клетки H4IIE обрабатывали 500 нМ дексаметазона и 0,1 мМ 8-CTP-cAMP (Dex/cAMP), различными концентрациями композиции на основе птерокарпозида или 5 нМ инсулина в буфере для образования глюкозы (среда DMEM (модифицированая по способу Дульбекко среда Игла) без глюкозы, pH 7,4, содержащая 20 мМ лактата натрия и 2 мМ пирувата натрия, без фенолового красного) в течение 5 часов.

[0042] Клетки промывали PBS Дульбекко (фосфатно-солевой буферный раствор Дульбекко), а затем инкубировали в течение 3 часов в буфере для образования глюкозы с такими же концентрациями Dex/cAMP, инсулина и композиции на основе птерокарпозида. Образование глюкозы оценивали путем измерения концентрации глюкозы в среде, как описано в публикации Wang et al (2000) с модификациями, с использованием набора для анализа глюкозы (HK) (Sigma Chemicals).

[0043] Результаты: Обработка композицией на основе птерокарпозида (0,1 и 0,5 мкМ) ингибировала индуцированное дексаметазоном образование глюкозы в клетках H4IIE в той же степени, что и инсулин (100 нМ). Результаты представлены в виде мг образованной глюкозы ± SEM (фиг. 3). Поправки на количество клеток делали на основе концентрации белка, которую оценивали с использованием реагента для анализа белков методом Брэдфорда от компании Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). (Wang, J. C., Stafford, J. M., Scott, D. K., Sutherland, C., Granner, D. K. (2000). The molecular physiology of hepatic nuclear factor 3 in the regulation of gluconeogenesis. The Journal of Biological Chemistry 275: 14717-14721).

[0044] Хотя изобретение было описано со ссылкой на предпочтительный вариант осуществления, специалистам в данной области должно быть очевидно, что изобретение им не ограничено. Напротив, объем изобретения должен интерпретироваться только в сочетании с прилагаемой формулой изобретения.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к композиции для активации аденозинмонофосфат-активируемой протеинкиназы (AMPK) и для ингибирования глюконеогенеза в клетках млекопитающих. Композиция для активации аденозинмонофосфат-активируемой протеинкиназы (AMPK) и для ингибирования глюконеогенеза в клетках млекопитающих, содержащая не менее 5 мас. % экстракта Pterocarpus marsupium, стандартизированная так, чтобы она содержала не менее 0,5 мас. % птерокарпозида (STR#1) и не менее 0,5 мас. % сабиозида (STR#2), причем композиция получена способом, включающим стадии: a) загрузки порошка дерева Pterocarpus marsupium в экстрактор, b) экстракции метанолом для получения олеосмолы, c) растворения олеосмолы со стадии b) в воде и экстракции толуолом для получения водного слоя и слоя толуола, d) дополнительной промывки слоя толуола со стадии c) водой для дополнительного получения водной фракции и фракции толуола, e) смешивания водных фракций со стадии c) и стадии d) и сушки распылением для получения водного экстракта, f) фракционирования водной фракции со стадии e) этилацетатом для получения водной фракции и фракции этилацетата, g) пропускания фракции этилацетата со стадии f) через колонку с градиентом растворителя с применением силикагеля 60-120 меш для получения обогащенной фракции 1 и фракции 2, h) пропускания обогащенной фракции 1 со стадии g) через изократическую колонку с силикагелем RP-18, затем через колонку LH-20 (Sephadex^®), и кристаллизации с использованием растворителя при температуре от -5 до 0°C для получения соединения, которое идентифицируют как птерокарпозид, представленный STR#1, i) пропускания обогащенной фракции 2 со стадии g) через изократическую колонку с силикагелем RP-18, затем через колонку LH-20 (Sephadex^®) и кристаллизации с использованием метанола при комнатной температуре для получения соединения, которое идентифицируют как сабиозид, представленный STR#2, j) загрузки водного экстракта Pterocarpus marsupium со стадии e) в экстрактор, k) добавления деминерализованной воды к экстракту, перемешивания в течение 3-4 часов при температуре от 65 до 70°C и оставления раствора на 8-10 часов для осаждения нерастворимых веществ, l) фильтрования раствора со стадии k) для удаления нерастворимых веществ и получения чистого фильтрата, m) проверки нерастворимых веществ со стадии l) на присутствие птерокарпозида (STR#1) или сабиозида (STR#2), отбрасывая их, если они присутствуют в незначительных количествах, n) сбора фильтрата со стадии l) и экстракции растворителем два раза для получения водного слоя и слоя растворителя, o) концентрирования слоя растворителя со стадии n) для извлечения растворителя, p) экстракции водного слоя со стадии n) бутанолом три раза и объединения фракций бутанола, q) концентрирования фракций бутанола и растворения в воде для стандартизации до раствора с общим содержанием растворенных твердых веществ 30 %, r) сушки распылением раствора со стадии q) для получения композиции, содержащей не менее 5 мас. % экстракта Pterocarpus marsupium, стандартизированной так, чтобы она содержала не менее 0,5 мас. % птерокарпозида и не менее 0,5 мас. % сабиозида, представленных STR#1 и STR#2 соответственно. Вышеописанная композиция эффективна для активации аденозинмонофосфат-активируемой протеинкиназы (AMPK) и для ингибирования глюконеогенеза в клетках млекопитающих. 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.

1. Композиция для активации аденозинмонофосфат-активируемой протеинкиназы (AMPK) и для ингибирования глюконеогенеза в клетках млекопитающих, содержащая не менее 5 мас. % экстракта Pterocarpus marsupium, стандартизированная так, чтобы она содержала не менее 0,5 мас. % птерокарпозида (STR#1) и не менее 0,5 мас. % сабиозида (STR#2):

причем композиция получена способом, включающим стадии:

a) загрузки порошка дерева Pterocarpus marsupium в экстрактор,

b) экстракции метанолом для получения олеосмолы,

c) растворения олеосмолы со стадии b) в воде и экстракции толуолом для получения водного слоя и слоя толуола,

d) дополнительной промывки слоя толуола со стадии c) водой для дополнительного получения водной фракции и фракции толуола,

e) смешивания водных фракций со стадии c) и стадии d) и сушки распылением для получения водного экстракта,

f) фракционирования водной фракции со стадии e) этилацетатом для получения водной фракции и фракции этилацетата,

g) пропускания фракции этилацетата со стадии f) через колонку с градиентом растворителя с применением силикагеля 60-120 меш для получения обогащенной фракции 1 и фракции 2,

h) пропускания обогащенной фракции 1 со стадии g) через изократическую колонку с силикагелем RP-18, затем через колонку LH-20 (Sephadex^®) и кристаллизации с использованием растворителя при температуре от -5 до 0°C для получения соединения, которое идентифицируют как птерокарпозид, представленный STR#1,

i) пропускания обогащенной фракции 2 со стадии g) через изократическую колонку с силикагелем RP-18, затем через колонку LH-20 (Sephadex^®) и кристаллизации с использованием метанола при комнатной температуре для получения соединения, которое идентифицируют как сабиозид, представленный STR#2,

j) загрузки водного экстракта Pterocarpus marsupium со стадии e) в экстрактор,

k) добавления деминерализованной воды к экстракту, перемешивания в течение 3-4 часов при температуре от 65 до 70°C и оставления раствора на 8-10 часов для осаждения нерастворимых веществ,

l) фильтрования раствора со стадии k) для удаления нерастворимых веществ и получения чистого фильтрата,

m) проверки нерастворимых веществ со стадии l) на присутствие птерокарпозида (STR#1) или сабиозида (STR#2), отбрасывая их, если они присутствуют в незначительных количествах,

n) сбора фильтрата со стадии l) и экстракции растворителем два раза для получения водного слоя и слоя растворителя,

o) концентрирования слоя растворителя со стадии n) для извлечения растворителя,

p) экстракции водного слоя со стадии n) бутанолом три раза и объединения фракций бутанола,

q) концентрирования фракций бутанола и растворения в воде для стандартизации до раствора с общим содержанием растворенных твердых веществ 30 %,

r) сушки распылением раствора со стадии q) для получения композиции, содержащей не менее 5 мас. % экстракта Pterocarpus marsupium, стандартизированной так, чтобы она содержала не менее 0,5 мас. % птерокарпозида и не менее 0,5 мас. % сабиозида, представленных STR#1 и STR#2 соответственно.

2. Композиция по п. 1, где растворитель выбран из группы, состоящей из метанола, этанола, бутанола, этилацетата, хлороформа, толуола, ацетона и гексана.

3. Композиция по п. 1, где клетки млекопитающих представляют собой клетки человека.