Рекомбинантная плазмида pVEAL3-XBB.1.5, обеспечивающая синтез и секрецию рецептор-связывающего домена RBD S белка SARS-CoV-2 варианта XBB.1.5, и рекомбинантный штамм CHO-XBB.1.5 - продуцент рецептор-связывающего домена RBD S белка SARS-CoV-2 варианта XBB.1.5, предназначенного для создания иммунобиологических препаратов Российский патент 2025 года по МПК A61K39/215 C12N15/00 

Изобретение относится к рекомбинантной плазмиде pVEAL3-XBB.1.5, обеспечивающей синтез и секрецию рецептор-связывающего домена RBD S белка SARS-CoV-2 вариант ХВВ.1.5, и рекомбинантному штамму СНО-ХВВ.1.5 - продуценту рецептор-связывающего домена RBD S белка SARS-CoV-2 вариант ХВВ.1.5 и может быть использовано в биотехнологии и генетической инженерии для создания иммунобиологических препаратов, к которым относятся средства диагностики и профилактические вакцины против SARS-CoV-2 вариант ХВВ.1.5.

Уровень техники. Вариант ХВВ.1.5 SARS-CoV-2 является примером межлинейной рекомбинации подвариантов линии ВА.2 Омикрона. Он обладает высокой контагиозностью вследствие большого количества произошедших мутаций в S-белке ХВВ.1.5. Первичные структуры S-белка уханьского варианта и варианат ХВВ.1.5 различаются примерно по 45 аминокислотам [1]. Из-за большого количества мутаций в белке-шипе вариант Омикрон и его потомки, в частности ХВВ. 1.5, антигенно отличаются от других вариантов SARS-CoV-2, что требует обновления существующих вакцин [1, 2].

Большинство эффективных и широко нейтрализующих антител нацелены на рецептор-связывающий домен (RBD), который опосредует присоединение к человеческому ангиотензинпревращающему ферменту 2 (АСЕ2), рецептору SARS-CoV-2 на клетках человека. Поэтому субъединичные вакцины на основе RBD обладают высокой иммуногенностью. Стоит отметить, что вакцины на основе RBD более безопасны, чем вакцины на основе полноразмерного спайкового белка или инактивированные вакцины [3], относительно просты и недороги в производстве, устойчивы при хранении. Из вышесказанного следует, что для создания новых вакцинных препаратов, индуцирующих иммунитет против новых вариантов SARS-CoV-2, может быть использован RBD соответствующего варианта SARS-CoV-2.

Ближайшие аналоги

В патенте RU 2723008 С1 [5] описан способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD-продуцента RBD, культивирование штамма CHO-S-RBD и способ очистки RBD, а также тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека. В указанном изобретении используется плазмидный вектор для эписомальной экспрессии в клеточных линиях млекопитающих, а штамм-продуцент позволяет получить белок RBD в количестве от 5 мг/л до 10 иг/л.

В патенте RU 2802825 С2 [6] описана антигенная композиция, позволяющая вызвать индукцию специфического гуморального и клеточного иммунного ответа к SARS-CoV-2. В составе антигенной композиции в качестве адъюванта выступил бетулин, в качестве активного компонента -рекомбинантный белок RBD разных вариантов, конъюгированный с Fc фрагментом IgG. В клетках СНО в режиме транзиентной экспрессии осуществлен биосинтез рекомбинантных белков RBD-SD1-Fc. Продукция указанного белка составляла от 5 мг/л до 10 мг/л.

Патент RU 2772904 С1 [7] описывает получение экспрессионной генетической конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность домена RBDdelta с оптимизированными кодонами и обеспечивающей экспрессию белка RBD линии В. 1.617.2 SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих. Авторами изобретения разработан способ получения белка RBD, включающий культивирование клеток эукариот и экспрессию целевого белка, выделение белка с помощью аффинной хроматографии и скрининг экспрессии. Концентрация белка в культуральной жидкости составила от 5 мг/л до 10 мг/л.

К недостаткам вышеуказанных изобретений следует отнести относительно низкий уровень экспрессии целевого белка (до 10 мг/л), что связано, прежде всего, с особенностями проведенного дизайна молекулярно-генетических векторных конструкций, а также в случае RU 2772904 С1 с особенностями культивирования продуцента.

Наиболее близким аналогом (прототипом) по назначению и сущности к заявленному изобретению является патент RU 2816175 [4], в котором описывается интегративный плазмидный вектор pVEAL3-RBDdel, обеспечивающий синтез и секрецию рекомбинантного белка RBDdelta SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих, и рекомбинантный штамм клеточной линии СНО-К1-RBDdelta. В этом патенте продуцент СНО-К1-RBDdelta позволяет получить белок RBD варианта delta, обладающий иммуногенностью.

Однако известные аналоги и прототип не обеспечивают получение белка RBD варианта ХВВ.1.5, являющимся одним из последних вариантов SARS-CoV-2, что относится к более актуальным в данный момент задачам.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание такого плазмидного вектора и штамма клеток-продуцента белка, которые обеспечивают более высокую и стабильную экспрессию рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 варианта ХВВ.1.5.

Указанный технический результат достигается тем, что создана рекомбинантная плазмидная генетическая конструкция pVEAL3-ХВВ.1.5, обеспечивающая синтез и секрецию рецептор-связывающего домена RBD S белка SARS-CoV-2 варианта ХВВ.1.5 в клетках млекопитающих СНО-К1, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 и содержащая в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 2, следующие элементы:

- 5'ITR_SB, имеющие координаты 88-317 п.н.; 3'ITR_SB, имеющие координаты 3229-3458 п.н. и являющиеся инвертированными концевыми повторами, обеспечивающими связывание с транспозазой SB;

- 5'IFR, имеющие координаты 318-368 п.н.; 3'IFR, имеющие координаты 3181-3228 п.н. и являющиеся областями, фланкирующими ITR;

- CMV enhancer, имеющий координаты 369-733 п.н., CMV promoter, имеющий координаты 734-937 п.н. и являющийся сильным промотером, обеспечивающим высокий выход рекомбинантного белка в клетках млекопитающих;

- ХВВ.1.5-последовательность, кодирующая рецептор-связывающий домен S белка SARS-CoV-2 варианта ХВВ.1.5 и имеющая координаты 1065-1766 п.н.;

- 10 his-последовательность, необходимая для очистки рекомбинантного белка и имеющая координаты 1767-1796 п.н.;

- EMCV IRES-участок внутренней посадки рибосомы, имеющий координаты с 1818 по 2392 п.н.;

- Puro R-ген устойчивости к антибиотику пуромицину, имеющий координаты (2405-3004 п.н.);

- SV40 poly(A) signal-последовательность, обеспечивающая стабилизацию мРНК-транскриптов, имеющая координаты 3039-3160 п.н.;

- KanR-ген устойчивости к антибиотику канамицину, имеющий координаты 3645-4460 п.н.;

- участок начала репликации ori, имеющий координаты 4523-5110 п.н.

Указанный технический результат достигается также тем, что создан рекомбинантный штамм СНО-ХВВ.1.5, полученный совместной трансфекцией рекомбинантной плазмидной генетической конструкции pVEAL3-ХВВ.1.5 по п. 1 и плазмидой pCMV(CAT)T7-SB100, кодирующей транспозазу SB100 и являющийся продуцентом рецептор-связывающего домена RBD S белка SARS-CoV-2 варианта ХВВ.1.5, предназначенного для создания иммунобиологических препаратов.

Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка СНО-ХВВ.1.5, включает:

- получение генетической конструкции, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1;

- введение указанной генетической конструкции в клетки животных путем трансфекции PEI;

- селекцию клеток на антибиотике пуромицин (Puromycin).

Способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 ХВВ.1.5 содержит:

- культивирование штамма клеток яичника китайского хомячка СНО-ХВВ.1.5;

- хроматографическую очистку рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 ХВВ.1.5 из культуральной среды штамма клеток яичника китайского хомячка СНО-ХВВ.1.5;

- подтверждение получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 ХВВ.1.5.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг. 1 приведена нуклеотидная последовательность рекомбинантной плазмиды pVEAL3-ХВВ.1.5. На фиг. 2 представлена физическая и генетическая карта плазмиды pVEAL3-ХВВ.1.5. Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже приведены примеры (1-4) его осуществления.

Пример 1. Получение рекомбинантной плазмиды pVEAL3-XBB.1.5

Для конструирования вектора pVEAL3-ХВВ.1.5 (фиг. 2), содержащего нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена RBD S белка SARS-CoV-2 варианта ХВВ.1.5, брали плазмиду pVEAL3-10H10 full, полученную сотрудниками отдела биоинженерии ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Ранее плазмида на основе вектора pVEAL3 показала свою эффективность (патент РФ №2816175). Ген рецептор-связывающего домена RBD S белка SARS-CoV-2 варианта ХВВ.1.5 был синтезирован фирмой ООО «ДНК-Синтез». Для амплификации указанного гена также были синтезированы праймеры (таблица 1) F_XBB.1.5_AsuNHI_1, R_XBB.1.5_SalI_1 (ООО «ДНК-Синтез»), в которых заложены сайты гидролиза AsuNHI, Sail.

Для амплификации гена RBD ХВВ.1.5 использовали ДНК-полимеразу Q5 Hot Start HF (New England Biolabs Inc.) Температурный профиль ПЦР-реакции и состав реакционной смеси подобраны в соответствии с инструкцией производителя. ГЩР-продукт RBD ХВВ.1.5 804 п.н. выделяли из агарозного геля с помощью набора Cleanup Mini (ЗАО Евроген) в соответствии с инструкцией производителя. ПЦР-продукт RBD ХВВ. 1.5 и плазмиду pVEAL3-10Н10 full подвергали ферментативному гидролизу эндонуклеазами рестрикции AsuNHI, SalI (НПО «СибЭнзим») в соответствии с инструкцией производителя. Фрагмент вектора pVEAL3 4345 п.н. и RBD ХВВ.1.5 786 п.н. выделяли из агарозного геля с помощью набора Cleanup Mini (ЗАО Евроген) в соответствии с инструкцией производителя. Лигирование фрагментов проводили лигазой фага Т4 (НПО «СибЭнзим») в соответствии с инструкцией производителя. Далее методом Heat shock трансформировали клетки Escherichia coli штамм Neb Stable лигазной смесью и высевали на агаризованную питательную среду в чашку Петри. На следующий день клоны с чашки Петри инокулировали в питательную среду LB, культивировали при 37°С в качалке в течение ночи. Затем с помощью набора QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) выделяли плазмидную ДНК в соответствии с инструкцией производителя. Подтверждали нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 (фиг. 1) плазмиды pVEAL3-ХВВ.1.5 секвенированием по методу Сэнгера.

Пример 2. Получение рекомбинантного штамма СНО-ХВВ.1.5

Для получения штамма-продуцента чистую суспензионную культуру клеток яичника китайского хомячка СН0-К1 совместно транс фецировали плазмидами pVEAL3-ХВВ.1.5 и pCMV(CAT)T7-SB 100 (Addgene). Для этого объем суспензионной культуры СНО-К1, содержащий 5x10⁶ живых клеток, центрифугировали при 800 об/мин в течение 5 мин. После центрифугирования удаляли ростовую питательную среду, клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл среды для трансфекции HyClone HyCell TransFx-C transfec-tion media (Cytiva). Добавляли к суспензии клеток плазмиды pVEAL3-ХВВ.1.5 и pCMV(CAT)T7-SB100 в соотношении 10:1, перемешивали. Добавляли 10 мкг PEI (PEI 25К, Polysciences, Inc.), перемешивали. Культивировали 6 часов на шейкере 200 об/мин, (37±1)°С во влажной атмосфере 5% CO₂. По истечении времени добавляли в пробирку 4 мл теплой ростовой среды для суспензионного культивирования HyClone HyCell СНО cell culture media (Cytiva). Культивировали 48 часов после трансфекции на шейкере 200 об/мин, (37±1)°С во влажной атмосфере 5% СО₂. По истечении 48 часов считали концентрацию клеток в суспензионной культуре. Отбирали объем культуры, содержащий 2×10⁶ живых клеток, добавляли ростовой среды для суспензионного культивирования до 2 мл, добавляли селективный антибиотик пуромицин (InvivoGen) в соотношении 0,25 мкл пуромицина на 1 мл клеточной суспензии. Продолжали культивирование трансформированных клеток в течение 2х недель при прежних условиях, постепенно повышая концентрацию пуромицина до 1 мкл на 1 мл клеточной суспензии. Пересев клеток проводился при достижении плотности клеток ≈ 6-8×10⁶ живых клеток/мл.

Далее из полученной суспензии клеток отбирали наиболее продуктивные клоны-продуценты СНО-ХВВ.1.5. Для этого методом предельного разведения рассаживали клетки в лунки 96-луночного планщета в концентрации 1 клетка/лунка в присутствии пуромицина. Отбор клонов проводили на среде DMEM F12 (Gibco) с добавлением сыворотки крови плодов коровы (Gibco) в количестве 10% от общего объема. Помещали планшет в СО₂-инкубатор. Культивировали при температуре (37±1)°С во влажной атмосфере 5% СО₂ в течение 14 суток. Через 14 суток под микроскопом анализировали наличие клеточного роста в лунках. Из "положительных" лунок отбирали кондиционированную среду и анализировали наличие белка RBD ХВВ.1.5 в ней методом иммуноферментного анализа (ИФА). Клетки из лунок с наибольшим сигналом в ИФА пересаживали в 6-луночные планшеты, а после смыкания монослоя-в фальконы для дальнейшего суспензионного культивирования. Таким образом из всего пула клеток-продуцентов СНО-ХВВ.1.5 отбирали 10 наиболее продуктивных клонов.

Отобранные клоны СНО-ХВВ.1.5 культивировали на шейкере 200 об/мин, (37±1)°С во влажной атмосфере 5% СО₂. Начальная концентрация клеток при культивировании составляла 0,3×10⁶ живых клеток/мл. После 2-4 суток культивирования в суспензии считали концентрацию клеток. Отбирали объем суспензии, соответствующий концентрации 2×10⁶ живых клеток/мл в микроцентрифужные пробирки. Центрифугировали 800 об/мин, 5 мин, удаляли супернатант, клеточный осадок ресуспендировали в 2 мл свежей ростовой среды для суспензионного культивирования, переносили в фалькон. Культивировали на шейкере 200 об/мин, (31±1)°С во влажной атмосфере 5% СО₂ в течение 10 суток. По истечении времени центрифугировали клеточную суспензию для отделения культуральной жидкости от клеточного дебриса при 4000 об/мин, 15 мин, +4°С. Культуральную жидкость от каждого моноклона СНО-ХВВ.1.5 анализировали с помощью электрофореза белков в полиакриламидном геле (SDS-ПААГ) на наличие целевого белка RBD ХВВ.1.5. Сравнивали моноклоны по продуктивности и оставляли для дальнейшей работы 3 моноклона.

Пример 3. Культивирование рекомбинантного штамма СНО-ХВВ.1.5

Штамм СНО-ХВВ.1.5 культивировали в среде HyClone HyCell СНО cell culture media (Cytiva) с периодической подпиткой 40%-ным раствором глюкозы. Концентрацию глюкозы в среде поддерживали на уровне 40 мМ. Начальная концентрация клеток 0,35×10⁶ живых клеток/мл. Культивирование проводили на шейкере при скорости вращения 200 об/мин, (37±1)°С во влажной атмосфере 5% СО₂ до достижения плотности ≈ 8×10⁶ живых клеток/мл и жизнеспособности ≥95%. При достижении указанной плотности отбирали необходимый объем культуры для следующего пассажа, а оставшийся объем культуры культивировали на шейкере 200 об/мин, (31±1)°С во влажной атмосфере 5% СО₂ в течение 14 суток.

Пример 4. Выделение и очистка RBD ХВВ.1.5

По истечении 14 суток центрифугировали клеточную суспензию для отделения культуральной жидкости от клеточного дебриса при 15000 об/мин, 15 мин, +4°С.

Очистку белка осуществляли на Ni-сефарозе 6FF. Скорость нанесения 5 мл/мин и промывки 3 мл/мин, скорость элюции - 1,5 мл/мин. Уравновешивали колонку 5 объемами буфера А (20 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 200 мМ KCl, 5 мМ имидазол). Наносили культуральную жидкость на колонку. Промывали колонку 5 объемами буфера С (20 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 1 М Kl 5 мМ имидазол). Элюцию проводили буфером В (20 мМ Tris-HCl, рН 8,0,20 мМ KCl, 0,5 М имидазол).

Проводили диализ очищенного белка RBD ХВВ.1.5, используя буфер 20 мМ TrisHCl, рН 8,0, 150 мМ KCl.

Препарат белка RBD ХВВ.1.5 анализировали с помощью электрофореза белков в SDS-ПААГ.

Источники научно-технической и патентной информации

1. Харченко Е. П. Коронавирус ХВВ.1.5 как индикатор длительного продолжения пандемии Covid-19. Что дальше с вакцинацией? Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2023;22(2): 12-22. https://doi: 10.31631/2073-3046-2023-22-2-12-22

2. Holmes Е. С. The emergence and evolution of SARS-CoV-2 // Annual review of virology. - 2024. - Т. 11.

3. Sun Y. et al. Development of an RBD-Fc fusion vaccine for COVID-19 // Vaccine: X. - 2024. - T. 16. - C. 100444.

4. Патент РФ №2816175. Интегративный плазмидный вектор pVEAL3-RBDdel, обеспечивающий синтез и секрецию рекомбинантного белка рецепторсвязывающего домена RBDdelta коронавируса SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих, рекомбинантный штамм клеточной линии CHO-Kl-RBDdelta и рекомбинантный белок RBDdelta SARS-CoV-2, продуцируемый штаммом клеточной линии / Несмеянова B.C., Меркульева Ю.А., Исаева А.А., Щербаков Д.Н., Волкова Н.В., Беленькая С.В., Боргоякова М.Б., Волосникова Е.А., Есина Т.И., Зайковская А.В., Пьянков О.В., Ильичев А.А. Бюл №2, 26.03.2024.

5. Патент РФ №2723008 С1 Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение / Щебляков Д.В., Есмагамбетов И.Б., Логунов Д.Ю., Деркаев А.А., Симакин П.В., Ижаева Ф.М., Джаруллаева А.Ш., Зубкова О.В., Ожаровская Т.А., Должикова И.В., Тухватулин А., Тухватулина Н.М., Фаворская И.А., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Бюл. №16, 08.06.2020.

6. Патент РФ №2802825 С2. Генная конструкция для экспрессии рекомбинантных белков на основе участка S-белка SARS-CoV-2, включающего RBD и SD1, слитого с Fc фрагментом IgG, способ получения рекомбинантных белков, антигены и антигенные композиции для индукции длительного антительного и клеточного иммунитета против вируса SARS-CoV-2 / Исаев А.А., Кудрявцев А.В., Фролова М.Е., Вахрушева А.В., Иванов А.В., Джонович М, Иванишин Т.В., Красильников И.В. Бюл. №19, 30.06.2023.

7. Патент РФ №2772904 С1. Рекомбинантная плазмида pVBL-RBDdelta, обеспечивающая синтез и секрецию рекомбинантного рецептор-связывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2 линии В. 1.617.2 в клетках млекопитающих / Тороповский А. Н., Викторов Д.А., Щербаков Д.Н., Никитин А.Г. Бюл. №15, 26.05.2022.

8. Kulemzin S.V., Sergeeva M.V., Baranov K.О., et al. VH3-53/66-Class RBD-Specific Human Monoclonal Antibody iB20 Displays Cross-Neutralizing Activity against Emerging SARS-CoV-2 Lineages // Journal of personalized medicine. - 2022. - V. 12. - №6. - P. 895.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Приложение.

Последовательность плазмиды pVEAL3-XBB.1.5 для синтеза RBD S белка

SARS-CoV-2.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2024-10-31">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>123456</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-10-31</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1234</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>1234567</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-10-19</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение

науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии

«Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Роспотребнадзора)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federalnoe byudzhetnoe uchrezhdenie nauki

&quot;Gosudarstvennyj nauchnyj tsentr virusologii i biotekhnologii

&quot;Vektor&quot; Federalnoj sluzhby po nadzoru v sfere zashchity

prav potrebitelej i blagopoluchiya cheloveka (FBUN GNTS VB

&quot;Vektor&quot; Rospotrebnadzora) (RU)</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Рекомбинантная плазмида

pVEAL3-XBB.1.5, обеспечивающая синтез и секрецию

рецептор-связывающего домена RBD S белка SARS-CoV-2 варианта XBB.1.5,

и рекомбинантный штамм СНО-XBB.1.5 – продуцент рецептор-связывающего

домена RBD S белка SARS-CoV-2 варианта XBB.1.5, предназначенного для

создания иммунобиологических препаратов </InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>5131</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..5131</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgaagaaaggcccacccgtgaaggtgagccagtgagttgattgcagtcc

agttacgctggagtctgaggctcgtcctgaatggatccctatacagttgaagtcggaagtttacatacac

ttaagttggagtcattaaaactcgtttttcaactactccacaaatttcttgttaacaaacaatagttttg

gcaagtcagttaggacatctactttgtgcatgacacaagtcatttttccaacaattgtttacagacagat

tatttcacttataattcactgtatcacaattccagtgggtcagaagtttacatacactaagttcgactcc

tctgcagaatgcggcgatgtttcggtaaggggtccgctactagttattaatagtaatcaattacggggtc

attagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccg

cccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttcc

attgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgcc

aagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctta

tgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggc

agtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaa

tgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacg

caaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaaccca

ctgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcatgtttgttt

ttcttgttttattgccactagtctctagtcagtgtgtggaaaagggcatctaccagaccagcaacttccg

ggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttccacgaggtgttc

aatgccaccacattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactact

ccgtgatctacaactttgcccccttcttcgccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacga

cctgtgcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggaaacgaagtgagccagattgcccct

ggacagacaggcaacatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcct

ggaacagcaacaagctggactccaaaccctccggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtc

caagctgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcaacaagccttgtaacggc

gtggccggccccaactgctactccccactgcagtcctacggctttcggcccacatacggcgtgggccacc

agccctacagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaa

aagcaccaatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttccatcaccaccatcatcaccatcaccaccactaa

gtcgaccgagcggttcccgcccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaata

aggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccgg

aaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtc

tgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccct

ttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagataca

cctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctca

cctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggg

gcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacgggg

acgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaaccatgaccgagtacaagcccacggtgc

gcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgc

cacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacg

cgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgc

cggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccg

gctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctg

gccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtgg

aggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacga

gcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgc

aagcccggtgcctgattcgcatatgggttaatgcttcgagcagacatgataagatacattgatgagtttg

gacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatt

tgtaaccattataagctgcaataaacaagttcctcgacctctagctagagctactcgggaccccttaccg

aaacatcgccgcattctgcagaggagtcgagtgtatgtaaacttctgacccactgggaatgtgatgaaag

aaataaaagctgaaatgaatcattctctctactattattctgatatttcacattcttaaaataaagtggt

gatcctaactgacctaagacagggaatttttactaggattaaatgtcaggaattgtgaaaaagtgagttt

aaatgtatttggctaaggtgtatgtaaacttccgacttcaactgtatagggatccgctcaatactgacca

tttaaatcatacctgacctccatagcagaaagtcaaaagcctccgaccggaggcttttgacttgatcggc

acgtaagaggttccaactttcaccataatgaaataagatcactaccgggcgtattttttgagttatcgag

attttcaggagctaaggaagctaaaatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctcgaggccgcgatta

aattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcga

caatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgc

caatgatgttacagatgagatggtcaggctaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaag

cattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatcccagggaaaacagcattccagg

tattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgca

ttcgattcctgtttgtaattgtccttttaacggcgatcgcgtatttcgtctggctcaggcgcaatcacga

atgaataacggtttggttggtgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtct

ggaaagaaatgcataagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttga

taaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccga

taccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttc

aaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcacttgatgctcgatgagtttttcta

atgagggcccaaatgtaatcacctggctcaccttcgggtgggcctttctgcgttgctggcgtttttccat

aggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgatgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggac

tataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttac

cggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctc

agttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcg

ccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccac

tggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactac

ggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttacctcggaaaaagagttgg

tagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacg

cgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgattttctac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Описана рекомбинантная плазмидная генетическая конструкция pVEAL3-XBB.1.5, обеспечивающая синтез и секрецию рецептор-связывающего домена RBD S белка SARS-CoV-2 варианта ХВВ.1.5 в клетках СНО-К1, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, содержащая элементы в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 1. Рекомбинантный штамм клеток яичника китайского хомячка СНО-ХВВ.1.5 - продуцент рецептор-связывающего домена RBD S белка SARS-CoV-2 варианта ХВВ.1.5 - получен совместной трансфекцией указанных клеток рекомбинантной плазмидой pVEAL3-ХВВ.1.5 по п. 1 и плазмидой pCMV(CAT)T7-SB100, кодирующей транспозазу SB 100. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Рекомбинантная плазмида pVEAL3-XBB.1.5, обеспечивающая синтез и секрецию рецептор-связывающего домена RBD S белка SARS-CoV-2 варианта ХВВ.1.5 в клетках млекопитающих СНО-К1, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:l и содержащая в соответствии с физической и генетической картой следующие элементы:

- 5'ITR_SB, имеющие координаты 88-317 п.н.; 3TTR_SB, имеющие координаты 3229-3458 п.н. и являющиеся инвертированными концевыми повторами, обеспечивающими связывание с транспозазой SB;

- 5'IFR, имеющие координаты 318-368 п.н.; 3'IFR, имеющие координаты 3181-3228 п.н. и являющиеся областями, фланкирующими ITR;

- CMV enhancer, имеющий координаты 369-733 п.н., CMV promoter, имеющий координаты 734-937 п.н. и являющийся сильным промотером, обеспечивающим высокий выход рекомбинантного белка в клетках млекопитающих;

- ХВВ.1.5 - последовательность, кодирующая рецептор-связывающий домен S белка SARS-CoV-2 варианта ХВВ.1.5 и имеющая координаты 1065-1766 п.н.;

- 10 his - последовательность, необходимая для очистки рекомбинантного белка и имеющая координаты 1767-1796 п.н.;

- EMCV IRES - участок внутренней посадки рибосомы, имеющий координаты с 1818 по 2392 п.н.;

- Puro R - ген устойчивости к антибиотику пуромицину, имеющий координаты 2405-3004 п.н.;

- SV40 poly(A) signal - последовательность, обеспечивающая стабилизацию мРНК-транскриптов, имеющая координаты 3039-3160 п.н.;

- KanR - ген устойчивости к антибиотику канамицину, имеющий координаты 3645-4460 п.н.;

- участок начала репликации ori, имеющий координаты 4523-5110 п.н.

2. Рекомбинантный штамм клеток яичника китайского хомячка СНО-ХВВ.1.5, полученный совместной трансфекцией указанных клеток рекомбинантной плазмидой pVEAL3-ХВВ.1.5 по п. 1 и плазмидой pCMV(CAT)T7-SB 100, кодирующей транспозазу SB 100, и являющийся продуцентом рецептор-связывающего домена RBD S белка SARS-CoV-2 варианта ХВВ.1.5, предназначенного для создания иммунобиологических препаратов.