Штамм "O/Kiruhura/EA-2/2023" вируса ящура Aphtae epizooticae серотипа O для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура Российский патент 2024 года по МПК C12N7/00 A61K39/135 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для разработки и изготовления средств диагностики, специфической профилактики ящура серотипа O и контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.

Самым высококонтагиозным заболеванием парнокопытных и мозоленогих животных является ящур, возбудитель которого – РНК(+)-содержащий вирус со следующей таксономией: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus. Длина нуклеиновой кислоты составляет около 8500 н.о. и кодирует 4 структурных белка: VP₁, VP₂, VP₃, VP₄ и множество неструктурных протеинов [1, 2, 3]. Выделяют 7 различных серотипов вируса ящура: O, А, Азия-1, C и SAT-1, SAT-2, SAT-3, причем в странах Азиатского и Африканского континента широко распространяются представители серотипа O [1].

Генетически штаммы вируса ящура разделены на топотипы. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP₁), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [1, 2, 3]. Данный белок вируса ящура является наиболее изменчивым по своему аминокислотному составу, поскольку на него приходится не менее 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями считаются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [4, 5]. Филогенетический анализ на основе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP₁) широко используется для вывода эволюционной динамики, эпидемиологических отношений между генетическими линиями и для отслеживания происхождения и перемещения штаммов вируса ящура [6].

Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием поверхностных вирусных белков и факторов клеток-хозяев [5, 6].

Серотип О вируса ящура является наиболее изученным и распространенным во всем мире. Данный серотип разделен на 11 следующих топотипов: EAST AFRICA 1 - 4 (Восточная Африка) (EA-1-4), SOUTHEAST ASIA (Юго-Восточная Азия) (SEA), EUROPE-SOUTH AMERICA (Европа-Южная Америка) (EURO-SA), INDONESIA-1 и 2 (Индонезия-1 и 2) (ISA-1 и ISA-2), CATHAY (Китай), MIDDLE EAST-SOUTH ASIA (ME-SA) (Ближний Восток-Южная Азия) и WEST AFRICA (Западная Африка) (WA) [1, 6, 7].

Генетическое и антигенное разнообразие вируса ящура серотипа O приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа O и, в частности, генотипа O/EA-2, представители которого распространяются на территории Азии и Африки [3].

На территории Восточной Африки, в частности, в Нигерии, Кении, Танзании, Эфиопии вспышки ящура генотипа O/EA-2 имеют спорадический характер.

Учитывая наличие серьезных торгово-экономических взаимоотношений между Российской Федерацией и странами Африканского континента, высоки риски заноса изолятов серотипа О на территорию нашей страны, что угрожает биологической безопасности России по ящуру [6].

Анализируя вспышки, которые регистрировались на территории Африки, обнаружено, что в Нигерии, Кении, Танзании, Эфиопии были выявлены изоляты вируса ящура, которые принадлежат к серотипу О, в частности, в 2009, 2010 гг. отмечали вспышки ящура генотипа O/EA-1, в 2010 г. – O/EA-4, в 2010, 2011, 2017, 2020, 2021 гг. – O/EA-2. При этом следует отметить, что представители генотипа O/EA-2 вируса ящура встречались в единичном количестве, а с 2021 г. стали массово регистрироваться в странах Восточной Африки и на прилегающих территориях, что является опасным и требует исследования штаммов данного генотипа для создания средств диагностики и специфической профилактики ящура генотипа O/EA-2.

Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа О, которые применяются для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «О/Тайвань/1997» (генотип O/CATHAY/CAM 94),

- штамм «О/Приморский/2014» (генотип O/SEA/Mya-98),

- штамм «О/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia),

- штамм «О/Саудовская Аравия/2008» (генотип O/ME-SA/PanAsia2),

- штамм «О/Забайкальский/2016» (генотип O/ME-SA/Ind-2001).

- штамм «О/Кения/2018» (генотип O/EA-2) (прототип) [8].

В 2023 г. на территории Республики Уганда из патологического материала от крупного рогатого скота в результате лабораторно-диагностических исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» был выделен изолят вируса ящура. При проведении научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» штамм был охарактеризован и получил название - штамм «O/Kiruhura/EA-2/2023».

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм вируса ящура принадлежит к генотипу O/EA-2, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа O, в том числе, от штамма «О/Кения/2017» (прототип).

Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал производственных штаммов вируса ящура серотипа O, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, пригодный для изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем и высоко иммуногенных вакцинных препаратов путем получения штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура серотипа O.

Штамм вируса ящура «O/Kiruhura/EA-2/2023» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №523 - деп / 24-03 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура для изготовления средств диагностики и профилактики ящура серотипа O.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1. – Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического серотипа O. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VР₁.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена белка VР₁ штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура серотипа O;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот 1D-гена белка VР₁ штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура серотипа O.

Штамм «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура имеет следующую таксономию: семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus, серотип О, генотип O/EA-2. Штамм возбудителя обладает следующими морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 27 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP₄, VP₂, VP₃, VP₁.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой, не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются специфические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP₁ штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура принадлежит к генотипу O/EA-2 (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура изучено в реакции микронейтрализации вируса с помощью перекрестного исследования данного штамма возбудителя ящура со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура.

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа O, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7, 9, 10].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥ 0,3 – исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;

при < 0,3 – исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.

Максимальное родство отмечается при значении r₁ в РМН, стремящимся к 1,0.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» составили r₁ от 0,01 до 0,24 со следующими производственными штаммами вируса ящура: генотип O/CATHAY/CAM 94 – 0,01; генотип O/SEA/Mya-98 – 0,05; генотип O/ME-SA/PanAsia – 0,07; генотип O/ME-SA/PanAsia2 – 0,06; генотип O/ME-SA/Ind-2001 – 0,08 и генотип O/EA-2 (прототип) – 0,24, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа O.

Гено- и хемотаксономические характеристики

Штамм «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура является РНК(+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 8,08×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,88×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех структурных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса, в том числе такой важный фермент как РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,47×10^-18 г. Плавучая плотность 1,48 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при pH 7,44-7,69. Сдвиги pH в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,2°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных – крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Исследование биологических свойств штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных линиях.

При выделении изолята вируса ящура с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [7].

Биологические и вирусологические методы включали в себя метод выделения в клеточной линии и адаптацию изолята вируса ящура к ним.

Процесс выделения возбудителя ящура проводили в монослойных перевиваемых клеточных линиях ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 с последующей адаптацией в течение 5 последовательных пассажей. Культуры клеток выращивали в соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25,0 см², отмывали от ростовой среды и заражали 33%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в среде Игла DMEM с 1,0% гидролизата лактальбумина. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов вирусную суспензию предварительно обрабатывали 10%-ным раствором хлороформа. После 30-минутного контакта вируса с клеточной культурой во флаконы вносили поддерживающую среду и инкубировали при температуре 37,0±0,1°C до появления цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток, которое представлено в виде округления клеток, повышения их оптической плотности, дегенерации и отделении клеток от поверхности субстрата. При ЦПД не менее 95% клеток, флаконы подвергали процессу «замораживание-оттаивание», очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 1500 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение не менее 24 часов проявлялось 95-100% ЦПД в монослое клеточных культур. Адаптация эпизоотического изолята к различным клеточным линиям наступала на уровне пятого пассажа. Титр инфекционной активности вируса ящура определяли с помощью разработанной ранее методики [11].

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 1, данные которой свидетельствуют о высокой адаптационной способности изолята вируса ящура к использованным клеточным линиям. В монослойной культуре клеток ПСГК-30 за 14 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:32 и титром инфекционной активности 7,45±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток IB-RS-2 за 13 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,15±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток ВНК-21 за 18 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:32 и титром инфекционной активности 7,30±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. Каждое исследование и культивирование проводили 10 раз. В итоге получен штамм «O/Kiruhura/EA-2/2023» с охарактеризованными биологическими культуральными свойствами, который далее использовали для исследования его свойств. Таким образом, наибольший титр инфекционной активности вируса ящура указанного штамма достигнут при культивировании в монослойной клеточной линии ПСГК-30.

Пример 2. Исследование биологических свойств штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура на крупном рогатом скоте.

Заражение КРС исходным штаммом вируса ящура проводили интрадермолингвально (I пассаж). Адаптацию и наработку штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура на КРС проводили в течение двух последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт на этапе второго пассажа на КРС получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР). Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили интрадермолингвально в 4 точки по 0,1 см³ двум головам КРС. Учёт результатов титрования на животных проводили спустя 24 ч по наличию афт на месте введения разведений вируса ящура штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023». Титр инфекционной активности на КРС данного штамма вируса ящура на стадии первого пассажа на КРС составил 5,50 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго пассажа – 6,00 lg ИД₅₀/0,1 см³. Таким образом, была получена 10%-ная афтозная суспензия вируса ящура штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» (2 пассаж на КРС) с титром инфекционной активности 6,00 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 3. Исследование биологических свойств штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура на свиньях.

Заражение свиней исходным штаммом «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура проводили внутрикожно на стадии первого пассажа в область венчика передних конечностей. Адаптацию и наработку указанного штамма вируса ящура на свиньях вели в течение двух последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт второго пассажа на свиньях получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения с использованием в качестве растворителя 1/15 М ФБР. Подготовленные разведения с 10^-2
по 10^-6 вводили внутрикожно в венчики копытец по 0,1 см³ в 4 точки на каждый палец конечности одного разведения, из расчета 1 разведение на 2 копытца 1 конечности каждому из 2 подопытных подсвинков.

Учёт результатов титрования проводили через 24 ч по наличию афт на месте введения разведений. Титр инфекционной активности на свиньях для штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура на свиньях на стадии первого пассажа составил 5,75 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго – 6,00 lg ИД₅₀/0,1 см³. Таким образом, была получена 10%-ная афтозная суспензия вируса ящура штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» (2 пассаж на подсвинках) с титром инфекционной активности 6,00 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 4. Исследование биологических свойств штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Штамм «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH. В качестве поддерживающей среды использовали среду Игла, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,44-7,69. Клеточную линию заражали вирусом из расчета 0,005 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура осуществляли при температуре 37,0±0,1°С до достижения ЦПД вируса, соответствующего не менее 95%. Полученную вируссодержащую суспензию контролировали на стерильность и содержание 146S компонента и общего вирусного белка (ОВБ). Полученные суспензии были стерильными. Концентрация ОВБ в суспензии составляла 3,22±0,08 мкг/см³. Значения титра инфекционной активности вируса, а также процентное содержание 146S компонента штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура отражены в таблице 2, из данных которой видно, что при средней концентрации клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH, равной 3,93±0,05 млн клеток/см³, дозе заражения 0,005 ТЦД₅₀/клетку и продолжительности репродукции вируса 12,80±0,26 ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура был равен 10,07±0,06 lg ТЦД₅₀/см³. Концентрацию 146S компонента вируса ящура определяли с помощью ранее разработанной методики [12]. Содержание данного компонента составило 65,80±0,40 % (2,12±0,05 мкг/см³).

Пример 5. Определение типовой специфичности и активности штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура.

Исследование типовой специфичности и активности штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура проводили в реакции связывания комплемента (РСК). К полученному антигену штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура, взятому в объеме 0,4 см³ в цельном виде и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 добавляли по 0,1 см³ гомологичной и гетерологичных гипериммунных сывороток, полученных на вирус ящура в рабочем (удвоенном) титре и 0,1 см³ комплемента в рабочем разведении. Смесь выдерживали в водяной бане в течение 20 мин при температуре 37,0±0,1°С. Затем вносили по 0,2 см³ гемолитической системы и выдерживали 30 мин при температуре 37,0±0,1°С. Положительный результат реакции соответствовал 100%-ной задержке гемолиза эритроцитов барана («4 креста»). Параллельно проводили контрольные реакции без сыворотки, без комплемента и компонентов реакции.

В качестве реагентов в РСК использовали ящурные типоспецифические гипериммунные сыворотки крови морских свинок, полученные на производственные штаммы вируса ящура «O/Kiruhura/EA-2/2023» (предлагаемое изобретение), «О/Кения/2017» «А №2029/Турция/06», «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/XIV/2023», комплемент сухой для РСК, гемолизин (сыворотка гемолитическая), эритроциты барана 2% (взвесь на физиологическом растворе, рН = 7,05-7,15). В качестве контроля использовали антигены вируса ящура штаммов «O/Kiruhura/EA-2/2023», «О/Кения/2017» «А №2029/Турция/06», «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/XIV/2023».

Результаты исследования отражены в таблице 3, из которой следует, что штамм «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура обладает выраженной типовой специфичностью, относится к вирусу ящура серотипа O и активен в РСК в разведении 1:64.

Пример 6. Получение, контроль качества и применение антигена штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура серотипа O.

Для получения антигена штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура как компонента для диагностики и специфической профилактики ящура серотипа O проводили суспензионное культивирование вируса в перевиваемой клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли за счет полигексаметиленгуанидина (ПГМГ, 0,025%).

Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 40 мин при 5000 об/мин и 4±2⁰С на центрифуге типа Bekman J2-21 (Beckman Coulter, USA) или аналоге. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Да (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 8% и хлорид натрия (сухой) до конечной концентрации 0,85%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 18±1 ч. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин, осадок растворяли в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе, концентрируя в 8 раз (1/8 от первоначального объёма).

К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура. Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле.

Для получения очищенного антигена штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50%. Инактивированную суспензию вируса ящура наливали по 10 мл в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы, начиная с 10%-го и заканчивая 50%-м раствором. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания центрифугировали при скорости 40 000 об/мин и температуре 4±2°С в течение 4 часов. Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1 мл в отдельные пробирки. Опалесцирующий слой, содержащий очищенный антиген вируса ящура, располагается приблизительно в 30%-м слое сахарозы. Данную фракцию переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 40 000 об/мин и температуре 4±2°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура как компонента для диагностики и специфической профилактики ящура серотипа O представлены в таблице 4. Анализ проводили для всех фракций, высокие значения оптической плотности наблюдали для 5-11 фракции с максимальными значениями для фракции № 8 (2,988±0,002 о.е.).

Проведен электрофорез полученных фракций в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях для отобранной фракции. Полученные результаты свидетельствовали, что 8-кратный антиген вируса ящура не содержал примесных белков.

С помощью реакции связывания комплемента определили концентрацию 146S компонента в полученном антигене, которая составила 16,96±0,05 мкг/см³ (n = 3, p<0,005), что достаточно для использования при изготовлении диагностических наборов для выявления антигена и антител против вируса ящура, а также для изготовления специфических препаратов для профилактики данного заболевания.

Таким образом, получен и проведен контроль качества антигена штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура серотипа O.

Полученный антиген использовали в качестве биопрепарата для проведения реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» в исследуемых пробах при изготовлении вакцинных препаратов. Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 320 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 320 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 200 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК, что из 200 отрицательных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 98,36-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) – 98,30-100,00%, k-критерий – 1,000; общая точность (DAc) – 99,35-100,00%.

Таким образом, полученный антиген штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура применим для использования в качестве биопрепарата в диагностических тест-системах.

Пример 7. Получения и применение сывороток крови кролика против антигена штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура.

Для получения сыворотки крови кролика против антигена штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура серотипа O применяли 20 клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.

Для гипериммунизации животных применяли антиген вируса ящура, полученный как описано в примере 6, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-201 VG («Seppic», Р. Франция) (в соотношении адъювант/антиген = 70/30 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 21 и 42 дни в объеме 0,5 см³. Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови, содержащую антитела против антигена штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура.

Полученные 20 сывороток крови кроликов проверяли в реакции связывания комплемента и определили, что их активность составила 1:8500-1:9000. Данные показатели являются высокими и достаточными для изготовления диагностических наборов по выявлению антигена и антител против вируса ящура.

Изготовленные сыворотки крови объединили в общий пул, провели лиофильную сушку, хранили при температуре 2-8°С и, таким образом, получили биопрепарат, который использовали для проведения реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023». Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 388 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 388 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 222 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК, что из 222 отрицательных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,05-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) – 98,35-100,00%, k-критерий – 1,000; общая точность (DAc) – 99,40-100,00%.

Таким образом, полученный антиген вируса ящура штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» применен для иммунизации животных как биопрепарат. Получен и проведен контроль качества сывороток крови кролика против антигена штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура, а также показано применение полученной сыворотки крови как биопрепарата для диагностики ящура генотипа O/EA-2.

Пример 8. Применение антигена вируса ящура штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» для получения вакцины.

Из полученного антигена (пример 6) приготовили сорбированную вакцину для крупного рогатого скота. Провели иммунизацию вакциной в цельном виде 5 голов КРС. На 21 сутки после иммунизации отобрали кровь, получили сыворотки крови, которые исследовали на наличие антител к структурным белкам вируса ящура штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» в реакции микронейтрализации (РМН) и ИФА. Результаты исследования отражены в таблице 5, из которой следует, что среднее значение титра вируснейтрализующих антител в РМН составило 7,43±0,12 log₂ SN₅₀ (положительно, ≥5,5 log₂ SN₅₀). В ИФА процент ингибиции был более 50%, что свидетельствует о том, что все сыворотки крови были положительными. Таким образом, по двум реакциям получили согласованные результаты о наличии защитного количества антител против заражения вирусом ящура гомологичным штаммом «O/Kiruhura/EA-2/2023». Следовательно, антиген данного штамма можно применять для создания вакцины, обеспечивающей защиту от ящура указанного штамма.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура Aphtae epizooticae серотипа O для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура».

1. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th еd. Paris, 2022. – Ch. 3.1.8.

2. Poonsuk K, Giménez-Lirola L, Zimmerman JJ. A review of foot-and-mouth disease virus (FMDV) testing in livestock with an emphasis on the use of alternative diagnostic specimens. Anim Health Res Rev. 2018 Dec;19(2):100-112.

3. Alexandersen, S. The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease / S. Alexsandersen, Z. Zhang, A.L. Donaldson // J. Compr. Pathol. - 2003. - V. 129. – P. 268-282.

4. Жильцова М.В. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: Автореф… дис. кан. наук. – Владимир: 2008. – 23 с.

5. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. / Под ред. А.Н. Бурдова. – М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

6. Omondi GP, Gakuya F, Arzt J, Sangula A, Hartwig E, Pauszek S, Smoliga G, Brito B, Perez A, Obanda V, VanderWaal K. The role of African buffalo in the epidemiology of foot-and-mouth disease in sympatric cattle and buffalo populations in Kenya. Transbound Emerg Dis. 2020 Sep;67(5):2206-2221.

7. Методические рекомендации по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации /С. Р. Кременчугская, М. В. Жильцова, Т. К. Майорова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2012. – 36 с.

8. Методические рекомендации по выделению и идентификации штаммов вируса ящура /А. А. Гусев, В. М. Захаров, Ж. А. Шажко и др.; ФГУ «ВНИИЗЖ». – Владимир. 2002. – 31 с.

9. Патент РФ № 2793828, 06.04.2023. Штамм «О/Кения/2017» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа O/EA-2 для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа O/EA-2 // Заявка № 2022132950 / Доронин М.И., Михалишин Д.В., Борисов А.В., Елькина Ю.С., Будина О.О.

10. Эпизоотологические особенности ящура типа А, вызванного гетерологичными штаммами вируса / А. В. Мищенко, В. А. Мищенко, В. В. Дрыгин [и др.] // Ветеринария. – 2014. - № 11. – С. 20-24.

11. Патент № 2674076 C1 Российская Федерация, МПК А61К 39/135 С12Q 1/68. Способ определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: № 2017145889: заявл. 25.12.2017: опубл. 04.12.2018 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

12. Патент № 2712769 C1 Российская Федерация, МПК G01M 33/58, C12Q 1/68. Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов: № 2019116272: заявл. 27.05.2019: опубл. 31.01.2020 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

Таблица 1

Биологические свойства штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура при культивировании в клеточных линиях

Наименование клеточной линии Время проявления
биологической
активности, ч Количество адаптационных пассажей Характеристика адаптированного материала Активность в РСК Титр инфекционной активности вируса, lg ТЦД₅₀/см³ ПСГК-30 14 5 1:32 7,45±0,10 IB-RS-2 13 5 1:16 7,15±0,10 ВНК-21 18 5 1:32 7,30±0,10

Таблица 2

Оценка стабильности репродукции штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура (предлагаемое изобретение) в суспензионной перевиваемой культуре клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH

№ п/п Концентрация клеток, млн/см³ Доза заражения, ТЦД₅₀/кл. Длительность репродукции, ч Титр инфекционной активности вируса,
lg ТЦД₅₀/см³ Концент-рация ОВБ, мкг/см³ Концентрация
146S компонента, мкг/см³ Содержание 146S компонента, % 1 3,9 0,005 12,5 10,05 3,21 2,12 66,0 2 3,9 0,005 13,0 10,05 3,19 2,09 65,5 3 3,9 0,005 13,0 9,98 3,08 2,03 66,0 4 3,9 0,005 13,0 10,00 3,15 2,08 65,9 5 4,0 0,005 13,0 10,15 3,34 2,18 65,3 6 3,9 0,005 12,5 10,04 3,21 2,14 66,6 7 3,9 0,005 12,5 10,06 3,22 2,12 65,9 8 3,9 0,005 12,5 10,05 3,18 2,08 65,3 9 4,0 0,005 13,0 10,15 3,31 2,18 66,0 10 4,0 0,005 13,0 10,14 3,30 2,16 65,5 M±m 3,93±0,05 0,005 12,80±0,26 10,07±0,06 3,22±0,08 2,12±0,05 65,80±0,40

Примечание: ОВБ – общий вирусный белок,

146S – иммуногенный компонент,

ТЦД – тканевая цитопатическая доза.

Таблица 3

Оценка типовой специфичности и активности штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура (предлагаемое изобретение) в РСК

Штаммы
вируса ящура

Сыворотки Штамм «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура Контрольные штаммы вируса ящура 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 O/Kiruhura/EA-2/2023 О/Кения/2017 А №2029/Турция/06 Азия-1/Таджикистан/
2011 SAT-1 №96/62 SAT-2/XIV/2023 O/Kiruhura/
EA-2/2023 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ - ++++ - - - - - О/Кения/2017 ++++ - - - - - - - ++++ - - - - А №2029/
Турция/06 - - - - - - - - - ++++ - - - Азия-1/
Таджикистан/
2011 - - - - - - - - - - ++++ - - SAT-1 №96/62 - - - - - - - - - - - ++++ - SAT-2/XIV/2023 - - - - - - - - - - - - ++++ б/с - - - - - - - - - - - - б/а - - - - - - - - - - - -

Примечания: «++++» – четыре креста – 100%-ная задержка гемолиза;

«-» - полный гемолиз;

б/с – без сыворотки;

б/а – без антигена.

Таблица 4

Спектрометрическое исследование полученных фракций штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура (предлагаемое изобретение) как компонента биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура серотипа O

(n = 3, p<0,005)

№ фракции п/п Значение оптической плотности, у.е. 1 0,009±0,001 2 0,178±0,001 3 0,412±0,001 4 0,856±0,001 5 1,322±0,001 6 1,865±0,001 7 2,144±0,002 8 2,988±0,002 9 2,018±0,001 10 1,455±0,001 11 1,023±0,001 12 0,522±0,002 13 0,212±0,001 14 0,010±0,001

Таблица 5

Определение антител против структурных белков вируса ящура штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» после однократной иммунизации КРС через 21 сутки в реакции микронейтрализации и ИФА

(n = 3, p<0,005)

№ животного Титр вируснейтрализующих антител против вируса ящура штамма «O/Kiruhura/EA-2/2023» в РМН* Результаты ИФА процент ингибиции, % интерпретация 1 7,25 74,56 положительно 2 7,55 78,20 положительно 3 7,45 76,33 положительно 4 7,50 78,02 положительно 5 7,40 76,01 положительно M±m 7,43±0,12 76,62±1,51 5/5

Примечание: * - при дозе вируса, равной 2,0 lg ТЦД₅₀/мл.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMDV O Kiruhura

EA-2 2023.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2024-02-09">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-02-09</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>573</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-02-09</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Штамм «O/Kiruhura/EA-2/2023»

вируса ящура Aphtae epizooticae серотипа O для изготовления

биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики

ящура</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacctccccgggtgagtcggctgaccctgtgactgccactgtggaga

actacggtggcgcaactcaggcccagagacgccaacacacggatgtctcgttcattctggacagatttgt

gaaggttacaccccaagaccaaatcaatgttctggacctgatgcagatccctgcccacacactggtgggc

gcgctcttgcgcgcatccacttactactttgctgatttggaagtggcagtgaaacacgagggcaacctca

cttgggtcccgaacggagcacccgaagttgcactggataacaccaccaacccaacagcataccacaaggc

acctctcactcgccttgcattgccttacacggcaccacaccgcgtgttggcaaccgtgtacaacgggaac

tgcaagtacagtggctcctcagtgactaacgtgaggggtgaccttcaagtgttggcccagaaggctgcga

gagcgctgcccacctccttcaactacggtgccgtcaaggccactcgggtgacagaactgctttaccgcat

gaagagggctgaaacatactgcccccggcccctcttggccatccacccgagtgatgctagacacaaacaa

aagattgtggcacctgtcaaacccttgttt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSPGESADPVTATVENYGGATQAQRRQHTDVSFILDRFVKVTPQDQIN

VLDLMQIPAHTLVGALLRASTYYFADLEVAVKHEGNLTWVPNGAPEVALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPY

TAPHRVLATVYNGNCKYSGSSVTNVRGDLQVLAQKAARALPTSFNYGAVKATRVTELLYRMKRAETYCPR

PLLAIHPSDARHKQKIVAPVKPLF</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной вирусологии. Предложен штамм «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа O/EA-2, семейства Picornaviridae, рода Aphthоvirus, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №523 - деп / 24-03 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», предназначенный для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа O/EA-2. Изобретение может быть использовано для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа O/EA-2 и для контроля антигенной активности противоящурных вакцин. 1 ил., 5 табл., 8 пр.

Штамм «O/Kiruhura/EA-2/2023» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа O/EA-2, семейства Picornaviridae, рода Aphthоvirus, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №523 - деп / 24-03 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», предназначенный для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа O/EA-2.