Способ получения мутантных растений табака со сниженным содержанием никотина Российский патент 2023 года по МПК C12N15/00 C12N15/113 A01H6/82 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической инженерии высших растений, и касается способа получения низконикотиновых мутантных растений табака путем нокаута генов семейства хинолинат фосфорибозилтрансфераз (QPT).

Табак является перспективной культурой в качестве системы синтеза рекомбинантных белков для фармацевтики, промышленности и ветеринарии, а никотин является загрязняющим веществом для таких систем. Снижение содержания никотина в растениях табака является актуальной задачей, поскольку в настоящее время нарастает тренд на отказ от никотина в курительном табаке, что порождает спрос на низконикотиновые сорта.

Известен способ получения растений табака со сниженным содержанием никотина путем инактивации генов семейства хинолинат фосфорибозилтрансфераз при помощи антисенс-супрессии (Xie J. et al. Biotechnology: A tool for reduced risk tobacco products - The nicotine experience from test tube to cigarette pack // Rev Adv Tob Sci. 2004. Vol. 30, №January 2004. P. 17-37).

Недостатком способа является нестабильность подавления активности генов семейства QPT при помощи антисенс-супрессии, поскольку замолкание генов редко бывает полным и может быть нестабильным с течением времени.

Наиболее близким к заявленному способу - прототипом, является способ получения растений табака со сниженным содержанием никотина путем супрессии генов семейства хинолинат фосфорибозилтрансфераз при помощи РНК-интерференции, заключающийся в дизайне последовательности интерферирующей РНК, которая содержит смысловой и антисмысловой фрагменты генов семейства QPT, клонировании созданной последовательности под контролем конститутивного промотора 35S из вируса мозаики цветной капусты в бинарный вектор, внесении полученной рекомбинантной плазмиды pART-QPT в штамм агробактерии (Agrobacterium tumefaciens) и получении трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum) с помощью отбора и регенерации на селективной среде с канамицином. Было показано, что благодаря использованию метода РНК-интерференции для генов семейства QPT можно добиться пониженного содержания никотина и анабазина в листьях табака. Количественная ПЦР в реальном времени показала снижение уровня транскрипта генов исследуемого семейства в корнях трансгенных растений на 60-70% (Khan S. et al. Cloning and functional characterization of quinolinic acid phosphoribosyl transferase (QPT) gene of Nicotiana tabacum // Physiol. Plant. 2017. Vol. 160, №3. P. 253-265).

Основными недостатками прототипа являются возможность неточного связывания малых РНК, что приводит к уничтожению нецелевых мРНК и нежелательным побочным эффектам, а также нестабильность целевого эффекта, так как эффективность подавления активности генов семейства QPT при помощи РНК-интерференции, как правило, меньше ста процентов и непостоянна во времени.

Задачей настоящего изобретения является получение генетически-стабильных линий растений табака с нокаутом генов семейства хинолинат-фосфорибозилтрансфераз путем использования технологии геномного редактирования.

Технический результат: повышение эффективности способа получения табака со сниженным содержанием никотина за счет нокаута генов семейства QPT, обеспечивающего получение стабильных линий.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Осуществляют подбор (дизайн) специфических направляющих РНК (нРНК_1 и нРНК_2), имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 6 соответственно.

Фрагмент ДНК, кодирующий нРНК_1, синтезируют с помощью гибридизации пары специфических F (прямой) и R (обратный) олигонуклеотидов: QPT_EX2_RGEN1_F, имеющего последовательность SEQ ID NO 1 и QPT_EX2_RGEN1 R, имеющего последовательность SEQ ID NO 2.

Фрагмент ДНК, кодирующий нРНК_2 синтезируют с помощью гибридизации пары специфических F и R олигонуклеотидов: QPT_EX5_RGEN1_F, имеющего последовательность SEQ ID NO 4 и QPT_EX5_RGEN1_R, имеющего последовательность SEQ ID NO 5.

В табл. 1 представлена структура используемых олигонуклеотидов и направляющих РНК. В перечне последовательностей представлены нуклеотидные последовательности используемых олигонуклеотидов и направляющих РНК.

Далее конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК (pSAl и pSA2) путем клонирования фрагментов ДНК, кодирующих специфичные направляющие РНК (нРНК_1 и нРНК_2) в вектор, содержащий систему для редактирования генома, pSI57 (Костина Н.Е., и др. Биотехнология и селекция растений. 2020;3(1):24-30). В результате получают рекомбинантные плазмидные ДНК pSAl (размером 9264 п. н.) и pSA2 (размером 9265 п. н.), обеспечивающие мутагенез.

Каждая плазмида состоит из следующих элементов:

- фрагмента ДНК векторной плазмиды (pSI57) размером 9244 п.н.;

- фрагмента ДНК, содержащего последовательность направляющей РНК размером 20 п.н. (нРНК_1) или 21 п.н. (нРНК_2).

Созданные генетические конструкции используют для мутагенеза генов семейства хинолинат фосфорибозилтрансфераз. Для этого смешивают полученные плазмиды pSAl и pSA2 с плазмидой pBil21 (Chen P.-Y. et al. Mol. Breeding. 2003. Vol. 11, №4. P. 287-293.), несущей ген устойчивости к канамицину и ген-репортер β-глюкуронидазы (GUS) Е. coli. Далее иммобилизуют смесь плазмид на золотых частицах и проводят трансформацию листовых эксплантов табака {Nicotiana tabacum) путем бомбардировки золотыми частицами при помощи генной пушки. Получают растения-регенеранты путем селекции на средах с добавлением канамицина. Отбор трансформантов осуществляют при помощи метода гистохимического окрашивания с реактивом X-Gluc.

Определяющими отличительными признаками заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

- вместо интерферирующей РНК для подавления функции генов хинолинат фосфорибозилтрансфераз используют мутагенез методом геномного редактирования, что позволяет получить генетически-стабильные низконикотиновые растения табака.

- трансформацию растений табака осуществляют при помощи генной пушки (вместо агробактериальной трансформации), что позволяет использовать сразу несколько плазмид (pSA1 и pSA2 для внесения направленных мутаций и pBil21 для осуществления селективного отбора растений-регенерантов);

- отбор растений-регенерантов осуществляют при помощи метода гистохимического окрашивания с реактивом X-Gluc, что позволяет быстро обнаружить функциональную встройку трансгена.

- конструкции для селективного отбора и конструкции для геномного редактирования собирают в разных плазмидах. При использовании данного метода, конструкции для геномного редактирования экспрессируются транзиентно, что существенно снижает вероятность получения генетических химер, и развития нежелательных побочных эффектов.

Предлагаемый способ позволяет в поколениях от самоопыления получить нетрансгенные стабильные мутантные линии табака со стабильно сниженным содержанием никотина.

Изобретение поясняется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1. Конструирование генетических конструкций pSA1 и pSA2.

Клонирование фрагментов ДНК, кодирующих сайт-специфические последовательности нРНК, в составе вектора pSI57 осуществляли в один этап посредством лигирования.

В конструкцию собирали два фрагмента: фрагмент ДНК, кодирующий специфичную нРНК, и фрагмент плазмиды pSI57, содержащий ген нуклеазы Cas9, ген каркаса нРНК и ген устойчивости к ампициллину. Полученные плазмиды обозначали как pSAl и pSA2 (с нРНК_1 и нРНК_2 соответственно).

Для синтеза фрагментов ДНК, кодирующих специфичные нРНК, производили реакцию гибридизации пары соответствующих F и R олигонуклеотидов, структура которых представлена в таблице 1.

Программа: Денатурация (95°С, 5 мин), отжиг (95-85°С - 2°С/сек, 85-25°С - 0,1°С/сек). Параллельно с гибридизацией олигонуклеотидов обрабатывали плазмиду pSI57 рестриктазой BstV2I (2 часа при температуре 55°С). Очищали набором для очистки ДНК от реакционной смеси (БиоСилика).

Следующим этапом проводили реакцию лигирования. Состав реакционной смеси: 50 нг порезанной и очищенной плазмиды pSAl (или pSA2), 10 пмоль соответствующих гибридизованных олигонуклеотидов (см. Таблицу 1), 1 мкл 10х лигазного буфера (СибЭнзим), 0,5 мкл Т4 лигазы, вода (H₂O) до V=10 мкл. Инкубировали смесь 3 ч при температуре 16°С.

Полученной лигазной смесью трансформировали хемокомпетентные клетки Е. coli DH10B стандартным способом (Мазин А.В. Методы молекулярной генетики и генной инженерии: научное издание /А.В. Мазин, К.Д. Кузнеделов, А. С.Краев: АН СССР. Сиб. отд-е. Ин-т цитологии и генетики. - Новосибирск: Наука. Сиб. отд-е, 1990.-247 с.).

Трансформированные бактерии выращивали в чашках Петри на агаризованной среде LB с добавлением антибиотика ампициллина (200 мкг/мл) в течение 12 часов при температуре 37°С. Далее полученные колонии переносили в жидкую среду LB (с ампициллином 200 мкг/мл) и выращивали ночную культуру в термостатируемом шейкере при температуре 37°С.

После выделения плазмид pSAl и pSA2 из ночной культуры клеток проводили их скрининг на наличие встройки методом рестрикционного анализа. Для рестрикционного анализа проводили гидролиз исходного вектора и всех выделенных плазмид по сайтам рестрикции BstV2I и Sfr274I. После рестрикционного анализа проверяли наличие встройки секвенированием по Сэнгеру (Sanger, F., S. Nicklen, and A.R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12:5463-5467).

Пример 2. Получение мутантных растений табака со сниженным содержанием никотина.

Полученные по примеру 1 конструкции pSA1 и pSA2, несущие фрагменты, кодирующие направляющие РНК, которые нацеливают нуклеазу Cas9 на гены семейства хинолинат фосфорибозилтрансфераз, были использованы для трансформации растений табака (Nicotiana tabacum L. сорта Petit Havana линии SRI) с помощью генной пушки. Для биобаллистики брали крупные, здоровые листья растений табака из культуры in vitro без признаков некроза. Готовили смесь из трех генетических векторов, содержащую плазмиды pSA1 и pSA2 и вектор pBil21, несущий ген устойчивости к канамицину и ген-репортер β-глюкуронидазы (GUS) Е. coli. Полученную смесь наносили на золотые частицы и доставляли в клетки эпидермиса нижней стороны листьев растений табака при помощи генной пушки (Bio-Rad PDS-1000 Не) при следующих условиях: размер золотых частиц 1 мкм, разрывной диск 1100 пси, расстояние 6 см, вакуум при выстреле 27 мм рт.ст.

Трансформированные экспланты инкубировали на каллусообазующей среде с добавлением селектирующего агента канамицина (100 мг/л) до каллусообразования. Полученные каллусы перемещали на среду без канамицина для органогенеза и регенерации, затем получали первичные растения-регенеранты. Полученные растения были пересажены на среду MS (Murashige and Skoog) без гормонов и проанализированы на наличие мутаций в целевых локусах генов семейства хинолинат фосфорибозилтрансфераз. Трансгенность полученных каллусов и регенерантов проверяли методом гистохимического окрашивания с реактивом X-Gluc для выявления активности гена β-глюкуронидазы. Ткани каллусов и регенерантов помещали в раствор, содержащий 950 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) и 50 мкл X-Gluc и осуществляли инфильтрацию при помощи шприца. Далее инкубировали образцы (ткани каллусов) в течение 24 ч при температуре 37°С. После инкубирования образцы промывали 70% этанолом три раза и проводили визуальную оценку окрашивания тканей каллусов и регенерантов.

Было получено несколько независимо образованных трансгенных каллусов, из трех из них получили популяцию растений-регенерантов, которые в дальнейшем дали начало трем независимым клональным линиям, поддерживаемым in vitro.

Данные линии были проанализированы методом ПЦР-секвенирования по Сэнгеру на предмет мутаций в генах QPT, и показано присутствие мутаций, приводящих к нокауту генов QPT во всех трех линиях.

Растения трех мутантных клональных линий были проанализированы на содержание никотина в листовой ткани при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для измерения использовали растения одного возраста (19-20 недель), выращенные стерильно в условиях климатокамеры, с каждого растения отбирали листья среднего уровня (4-й, 5-й). Собранные листья растений табака мелко нарезали, удаляли жилки, помещали во флаконы и замораживали в жидком азоте. Высушивание листьев табака проводили в лиофильной сушилке ИНЕИ-4, производительность 40 г воды/час, вакуум 7 Па, температура - 30°С. Время высушивания составляло от 6 до 16 часов. Лиофильно высушенное сырье измельчали, навеску (0.2-0.5 г) заливали 0.1% HCl в 40% водном метаноле и экстрагировали на качалке с перемешиванием в течение 24 ч при температуре 25°С. Осадок отделяли центрифугированием, экстракт анализировали с использованием системы ВЭЖХ Agilent Infinity 1260. Результаты измерений приведены в таблице 2.

В качестве контрольных растений использовалась исходная линия табака Nicotiana tabacum L. сорта Petit Havana линии SRI.

Из представленных в таблице 2 данных видно, что полученные мутантные трансгенные растения табака имеют пониженный в несколько раз уровень содержания никотина, по сравнению с контрольными растениями.

На Фиг.1 представлен способ получения мутантных растений табака со сниженным содержанием никотина.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать стабильные линии мутантных трансгенных растений табака со сниженным содержанием никотина, в которых в дальнейшем (в поколениях от самоопыления) можно избавиться от трансгенности, что упрощает использование табака в производстве рекомбинантных белков, где никотин и подобные ему алкалоиды нежелательны.

Способ получения мутантных растений табака со сниженным содержанием никотина

--->

Перечень последовательностей

<110>

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный

исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского

отделения Российской академии наук» (ИЦиГ СО РАН)

<120> Способ получения мутантных растений табака со сниженным содержанием

никотина

<160> Номер SEQ ID NO 1

<210> 1

<211> 25

<212> Олигонуклеотид

<213> Искусственная последовательность

<400> 1

attgatacaagagtggagtcattag

<160> Номер SEQ ID NO 2

<210> 2

<211> 25

<212> Олигонуклеотид

<213> Искусственная последовательность

<400> 2

aaacctaatgactccactcttgtat

<160> Номер SEQ ID NO 3

<210> 3

<211> 21

<212> Олигонуклеотид

<213> Искусственная последовательность

<400> 3

atacaagagtggagtcattag

<160> Номер SEQ ID NO 4

<210> 4

<211> 24

<212> Олигонуклеотид

<213> Искусственная последовательность

<400> 4

attgacaacattgttatagctgag

<160> Номер SEQ ID NO 5

<210> 5

<211> 24

<212> Олигонуклеотид

<213> Искусственная последовательность

<400> 5

aaacctcagctataacaatgttgt

<160> Номер SEQ ID NO 6

<210> 6

<211> 20

<212> Олигонуклеотид

<213> Искусственная последовательность

<400> 6

acaacattgttatagctgag

<---

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения мутантных растений табака со сниженным содержанием никотина путем мутагенеза генов семейства хинолинат фосфорибозилтрансфераз. Изобретение позволяет эффективно получать растения табака со сниженным содержанием никотина. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 ил., 2 пр.

1. Способ получения мутантных растений табака со сниженным содержанием никотина путем мутагенеза генов семейства хинолинат фосфорибозилтрансфераз, включающий подбор специфических РНК, клонирование последовательностей, кодирующих специфические РНК, в вектор, последующую трансформацию растений табака сконструированной плазмидой, регенерацию их на селективной среде с канамицином и отбор трансформантов, отличающийся тем, что осуществляют подбор специфических направляющих РНК (нРНК) нРНК_1 и нРНК_2, имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 6, далее синтезируют фрагмент ДНК, кодирующий нРНК_1, с помощью гибридизации пары специфических олигонуклеотидов, имеющих последовательность SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2 соответственно, синтезируют фрагмент ДНК, кодирующий нРНК_2 с помощью гибридизации пары специфических олигонуклеотидов, имеющих последовательность SEQ ID NO 4 и SEQ ID NO 5 соответственно, далее конструируют плазмиду pSAl размером 9264 п.н. и плазмиду pSA2 размером 9265 п.н. путем клонирования фрагментов ДНК, кодирующих специфические направляющие нРНК_1 и нРНК_2 в вектор, содержащий фрагмент ДНК векторной плазмиды pSI57 размером 9244 п.н., включающий ген нуклеазы Cas9 и ген направляющей РНК, далее готовят смесь из трех генетических векторов, содержащую плазмиды pSAl и pSA2 и вектор pBil21, несущий ген устойчивости к канамицину и ген-репортер β-глюкуронидазы Е. coli, полученную смесь наносят на золотые частицы и доставляют в клетки эпидермиса нижней стороны листьев растений табака при помощи генной пушки, а отбор трансформантов выполняют при помощи гистохимического окрашивания реактивом X-Gluc.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что бомбардировку проводят золотыми частицами размером 1 мкм, разрывной диск 1100 пси, расстояние 6 см, вакуум при выстреле 27 мм рт. ст.